Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Молекулярная генетика и биотехнология пыльцы покрытосемянных растений

ВАК РФ 03.00.26, Молекулярная генетика

Автореферат диссертации по теме "Молекулярная генетика и биотехнология пыльцы покрытосемянных растений"

АКАДЕМИЯ НАУК РЕСПУБЛИКИ УЗБЕКИСТАН ИНСТИТУТ ГЕНЕТИКИ И ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ БИОЛОГИИ РАСТЕНИЙ

На правах рукописи УДК: 577.21

ТУ РАЕ В Алишер

МОЛЕКУЛЯРНАЯ ГЕНЕТИКА И БИОТЕХНОЛОГИЯ ПЫЛЬЦЫ ПОКРЫТОСЕМЯННЫХ РАСТЕНИЙ

Специальность: 03.00.26-Молекулярная генетика.

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

ТАШКЕНТ-1338

Работа выполнена в Институте микробиологии и генетики при Венском университете (Австрия) и в Институте Генетики и экспериментальной биологии растений Академии наук Республики Узбекистан.

Официальные оппоненты:

МУХАМЕДОВ Р. С.— доктор биологических наук.

ЮСУПОВ Т. — доктор биологических наук. Prof., Dr. Ch. DUMAS ~ CNRS, France.

Ведущее учреждение: Ташкентский Государственный университет

им. Мирги Улугбгка, биологический факультет.•

Защита диссертации состоится '. » . ^f^P^J? ..Л998 г.

в часов на заседании Специализированного Совета

Д 015.80.01 при Институте генетики и экспериментальной биологии растений АН Республики Узбекистан по адресу: 702151, Ташкентская область, Кибрайский район, п/о Юкори-Юз.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института генетики и экспериментальной биологии растений АН Республики Узбекистан.

Автореферат разослан « . » . '. . , 1998 г.

Ученый секретарь Специализированного Совета, доктор биологических наук ./} , Ш- ЮНУСХАНОВ

ОБЩЛЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

АКТУАЛЬНОСТЬ ТЕМЫ. Соплеменная биология находится в периоде бурного расцвета благодаря прогрессу молекулярной биологии, генетики, физиологии и смежных дисциплин. Успехи современной биологам и ее авангарда - генетической инженерии - важны не только для фундаментальной науки, но также для решения целого ряда практических задач, среди которых лечение наследственных болезней человека, создание новых медицинских препаратов, улучшение пищевого рациона человека, очищение окружающей среды от вредных веществ путем оыведения новых-штаммов микроорганизмов и сортов растений. "'-'-■

Современную селекцию растении невозможно представить без новых молекулярно-генетических технологий. Возникла новая отрасль биотехнология растешт, включающая в себя наряду с классическими методами селекции растений современные технологии, такие как генетическая инженерия, молекулярное картирование и выделение хозяйственно ценных генов, культура клеток, тканей и многие другие. С помощью биотехнологии растений уже созданы и культивируются сорта хлопчатника, кукурузы, картофеля, устойчивые к гербицидам, вирусам и насекомым, сорта пшеницы с повышенными хлебопекарными свойствами.

Мужской гаметофит высших растений всегда привлекал внимание селекционеров рядом свойств, позволяющих его применять при создании новых сортов растений. Пыльца является продуктом рекомбинации в мсиозе микроспорогенеза и следовательно имеет неповторимый геном. Из одного цветка табака можно собрать около 40 ООО пыльцевых зерен, имеющих уникальную 'комбинацию генов. Таким образом, пыльца -идеальный материм для отбора уникальных рекомбннагггоа. Пыльцевые зерна можно подвергнуть обработке мутагенами и получить интересные мутанты, как это сделано, например, на кукурузе. Селекция позих признаков из уровне пыльцы - очень перспективная технология.

Наряду с использованием мужского гаметофита в селекции растедай с сохранением гпметофитного развитая, можно из культивируемы* микроспор iti vitro получать 'гаплоидные растения.- Гяштолды и гомозиготные растения, созданные на их базе путем -джшиишзацпп хромосом, чрезвычайно полезны для селекции растенлй. На базе гаплоидов и с их использованием созданы многие сорта риса, пшеницы, ячменя я других важных культур.

К сожаленкек», более широкое применение пдаловдоч и гомозиготных р«ст-"№"!, полученных ю шгкроспер путем эмйриегтгзз, затруднено низкой эффективностью метода, зависимостью от генотипа сорта растений. Пока очень мало известно о . механизме а факторах, контролирующих индукцию эмбриогенеза m микроспор высших растений.

ЦЕЛЬ Н ЗАДАЛИ ИССЛЕДОВАНИЙ. Основная цель работы - изучите биологии развития пыльцы in vitro и использование мужского гаметофлта в биотехнологии растений.

Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:

Я оптимизация условий развития мнкроспор in vitro; 3 изучение факторов, влияющих на прорастание пыльцы а) роль флавоноидов и стероидов

б) роль MAP киназ (mitogen activated protein kinases) В разработка системы развития пыльцы in vitro с целью селекции пыльцы in vitro;

И создание генов-маркеров для селекции пыльцы in vitro; И трансформация мужского гаметофита табака - MAGEL1TR (male gem; line transformation);

В исследование влияния рааличных стрессовых факторов на индукцию эмбриогенеза в культуре изолированных микроспор табака, пшеницы н хлопчатника.

ОБЪЕКТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ. Объектами исследований служили растения табака (Nicotiana tabacum cv. Petit Havana SRI), пшеницы Triticum aestivuin L. (различные озимые сорта) и хлопчаника Oossypium hirsitum L. (различные сорта и генетические лишш).

МЕТОДИКА ЦССЛВДОВА1ШЙ. Методы, используемые в данной работе подробно описаны в соответствующих главах диссертации и автореферата.

ТЕОРЕТИЧЕСКИЙ ВКЛАД И НАУЧНАЯ НОВИЗНА. На основе полученных данных разработана принципиально новая технология -биотехнология пыльцы, где мужской гаметофит высших растений предложен как объект генетических манипуляций с целью улучшения или выведения новых сортов и линий растений.

Впервые показано, что флавоноиды и стероиды являются важнейшими компонентами пыльцы при ее прорастании и в процессе развития пыльцевой трубки. Эти дашпле можно использовать в управлении мужской стерильностью путем ингибирования синтеза флавоноидов и стероидов в аотисеис-системс. Роль MAP киназ при прорастании пыльцы показана впервые в мировой литературе, что указывает на новый сигнальный ругь в процессе прорастания пыльцы, регулируемый или контролируемый MAP кишзами.

Эффективная система созревания пыльцы табака из изолированных н культивированных in vitro микроспор была успешно использована для се.кхшш и трансформации пыльцы.

Впервые, используя трансгенную технологию, показана возможность селскцпи.пильцы in vitro. Эта система может быть использована для отбора пыльцы, pí3HCT£i¡THoií к патогенам, соллм и вредным вещестьам.

Трансформация мужского гаметофита bi vítio - принципиально новая технология в генной инженерии растении. Эта методика иозаоляет трансформировать любые сорта или виды растений с половым циклом в их развитии независимо от генотипа. Она простая, быстрая и не имеет технических недостатков., что характерно для существующих методов трансформации растений, которые '' основаны на использовании недифференцированных клеток, тканей или органов.

В данной paúojÉ впгрьиг ебсувда^тся и деталях роль стрессовых факторов п индукции эмбирогеиеза из изолированных микроспор табака, пшеницы и хлопчатника. Описываются ноше стрессы, такие как высокая температура и углеводное голодание, которые эффективны для табака и пшеницы. Эти данные позволяют получать гаплоиды и гомозиготные растения в Солыпмх количествах у табяка и пшеницы. Первичные данные, плчучгкиые на хлопчпгникс, позволяют предположив положительный

эффект голодания и высоких температур на индукцию эмбирогенеза в изолированных микроспора* хлопчатника.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЦЕННОСТЬ РАБОТЫ. Результаты, полученные в данной работе, открывают новые перспективы в биотехнологии» растений. Автором предложена система, основанная на развитии мужского гаметофита растений in vitro для генетических манипуляций. Данная система и теоретическая база, разработанная в настоящей работе, может быть применима для широкого круга растений,

АПРОБАЦИЯ. Основные положения данной работы докладывались на VII Конгрессе "Plant Tissue and Cell Culture" (Amsterdam, Netherlands, June 24-29, 1990); VIII Конгрессе "Plant Tissue and Cell Culture" (Firenze, Italy, June 12-17, 1994); International Workshop "Molecular Control of Flower Development and Plant Reproduction" (Amsterdam, Netherlands, 12-16 April,

1992); XV Botanical Congress (Yokohama, Japan, August 28-September 3,

1993); 3th International Congress of Plant Molecular Biology (Amsterdam, Netherlands, June 19-24, 1994); 13lh International Congress on Sexual Plant Reproduction (Vienna, Austria, July 10-14, 1994); I" Congresso Nazionale Biotechnologia (Bologna, Italy, 6-9 September, 1995); 14th International Congress on Sexual Plant Reproduction (Lome, Austalia, February 18-23, 1996); Plant Embryogenests Workshop (Hamburg, Germany, September 12-14, 1996); 1997 Annual Meeting of ASPS and CBPC (Vancouver, Canada, August 2-6, 1997), а также в докладах на семинарах в ETH (Zuerich, Switzerland, 1995), Nunhems Zaden (Netherlands, May, 1997), CPRO-DLO (Wageningen, Netherlands, May, 1997), Monsanto Ltd. (St.Louis, USA, November, 1997). Результаты работ также были представлены на конференциях ЕС "COST" н "EPEN" и на ежегодных конференциях Австрийского общества генетиков и биохимиков.

ПУБЛИКАЦИИ. По материалам диссертации опубликовано около 40 работ, в том числе 15 статен и 3 обзора. Все работы опубликованы в зарубежных изданиях.

СТРУКТУРА И ОБЪЕМ ДИССЕРТАЦИИ. Диссертация напнсгна на английском языке и разделена на 10 глав. Объем диссертации 254 страниц машинописного текста. Работа иллюстрирована 19 таблицами и 33 рисунками. Список литературы приводится для каждой главы.

МЕСТО ПРОВЕДЕНИЯ РАБОТЫ. Работа выполнена в Институте микробиологии и генетики при Венском университете (Австрия), где актор руководит научной группой. Часть исследований на хлопчатнике проведена в Институте генетики и экспериментальной биологии растений АН Республики Узбекистан. Результаты исследований являются плодом сотрудничества автора с многими коллегами из разных стран и лабораторий.

ГЛАВА I.

СТИМУЛИРОВАНИЕ РАЗВИТИЯ И ПРОРАСТАНИЯ ПЫЛЬЦЫ ТАБАКА IN VITRO.

Материал и методика

РАСТЕНИЕ-ДОНОР. Растения Nicotiana tabacuui cv.Petit Havana SRI выращивал» в климатической камере при температуре +25°С и световом дне 16 часов. Продолжительное цветение растений поддерживали периодическим удалением раскрывающихся цып ков и образовавшихся плодов.

КУЛЬТИРОВАННЕ МИКРОСПОР И НЕЗРЕЛЫХ ПШЬЦЕВЫХ ЗЕРЕН.

Одноядерные микроспоры n/iuiu двуклегочные незрелые пыльцевые зерна изолировали и культивировали in -vitro согласно Benito-Moreno et al. (1S88) с незначительными изменениями. Для созревания пыльцы in vitro изолированные микроспоры культивировали на среде Ml (Тиру et al. 1991) в течение 5 дней.

Гомогенная фракция незрелых двуклеточных пыльцевых зерен была подучена центрифугированием популяции незрелых пыльцевых зерен в градиенте Перколла, согласно Kyo&Haratla (1985). Созревание пыльцевых зерен in vitro из незрелой двуклеточной пыльцы проводилось на среде AMGlu согласно Benito-Moreno et al. (1988).

ПРОРАСТАНИЕ ПЫЛЬЦЫ И РОСТ ПЫЛЬЦЕВОЙ ТРУВКИ JN VITRO. Пыльцевые зерна, созревшие in vitro из микроспор или двуклеточных незрелых пыльцевых зерен, культивировали на среде GV для прорастания пыльцы и дальнейшего роста пыльцевой трубки. Частоту проросших пыльцевых зерен определяли с помощью инвертированного микроскопа. В среднем было, подсчитано 500-600 пыльцевых зерен в каждом эксперименте. Каждый опыт повторяли минимум три раза.

ФЛАВОНОИДЫ H СТЕРОИДЫ. Нарипгешш халкон, наринпш и карпнгешш выделяли из цветков петунии. Кверцшш, камферол и ыерицепш Сыли получены от Sigma (USA). Все флавоцовды были растворены в DMSOнепосредственно перед употреблением. Стероиды « стероидные гормоны: прогестерон, тликолевая кислота, 4-андростсн диои, ситостерол, эстрадная, тестостерон (Sigma (USA)), а также синтетический гомолог тестостерона - К1Ш, гомо-брасеинолкд и эпибрассииолид (полученные от Dr.Backer, Univ. San Diego, CA, USA) растворяли в этаноле до конечной концентрации 0.1 М. В контрольных экспериментах этанол или DM SO в концентрациях меньше 0.3% не влияли отрицательно на прорастание пыльцы in vitro.

ПРИГОТОВЛЕНИЕ КОНДИЦИОНИРОВАННОЙ СГВДЫ. Зрелые пыльиеше зерна били собраны из раскрывшихся цветков табака и культивированы 15 часов на среде GV при ¡ùîiotïiocth i05 пыльцевых зерен на 1 мл среды. После этого пыльцевые зерна удаляли центрифугированием и супгршшгг стерилизовали фильтрованием. В некоторых огшггах зрелые пилшевыг зерна были собраны из нераскрыьшихся цветков перед рлсггескнмписм пыльников. Пыльники из эти;; цзсткоа разрушали

стеклянной палочкой о среде GV для выделения пыльцевых зерен. Суспензию пыльцевых зерен встряхивали п течение 5 минут, после чего пыльцевые зерна удаляли центрифугированием и супернатант стерилизовали фильтрованием.

ОБРАБОТКА КОНДИЦИОНИРОВАННОЙ СРВДЫ. Сильно основную анионную смолу Dowex (Dowex anion exchange resin, Sigma, USA) добавляли в кондиционированную среду и смешивали в течение 10 минут острожным встряхиванием. После этого смола была удалена центрифугированием и среда стерилизовалась фильтрованием. В отдельных опытах кондиционированная среда была подвергнута диализу дважды по 8 часов или температурной обработке при 80"С в течение 10 минут.

ОПРВДЕЛЕНИЕ ФЛАВОНОИДОВ. Для определения флавоноидов была использована тонкослойная хроматография на бумаге. После окончания хроматографии тонкослойные пластинки проявляли под ультрафиолетом (312 пм) м фотографировали.

РЕЗУЛЬТАТЫ.

Часть 1. Флавопвли стимулируют развитие и прорастание пыльцы табака in vitro.

ДИФФУЗАТ ПЫЛЬЦЫ СТИМУЛИРУЕТ ПРОРАСТАНИЕ ПЫЛЬЦЫ И ПОВЫШАЕТ ОБРАЗОВАНИЕ СЕМЯН. В. предварительных опытах кондиционированная среда, добавленная в среду GV для прорастания пыльцевых зерен, созревших in vitro, стимулировала прорастание и дальнейший рост пыльцевой трубки, а также повышала образование семян, •когда эти згрна использовались для опыления квигоз).' Сходный эффект был получен кондиционированием среды GV пыльцой из пыльников, выделенных из нераскрытых цветков. Пыльцевые трубки табака прорастали п 2,5 раза быстрее по сравнению с контролем.

ФЛАВОНОЛЫ СТИМУЛИРУЮТ ПРОРАСТАНИЕ ПЫЛЬЦЬ! IN VITRO. Для определения соединения в зрелой пыльце, которое стимулировало прорастание пыльцы и рост пыльцевой трубки, кондиционированную среду GV подвергали различной обработке. Кондиционированная среда, предобработанная при высоких температурах, не теряла стимулирующего эффекта,что говорит о стабильности соединения к высоким температурам и что оно не имеет белковую природу. Снижение эффекта кондиционированной среды было обнаружено после диализа, что указывает на ннзкомолекуляриость соединения. Наконец, удалеш!е флавонолов из коидициоиированой среды обработкой Dowex resin, которая специфически связывает фенольные соединения, снизило эффект до контрольного уровня свежей, некоиднционировлнной среды GV, что позволяет предположить участие феиольных соединений в стимуляции прорастания пыльцы (рис.1).

Для более детального определения соединений была использована тонкослойная хроматография. Она выявила соединения, сходные по цвету и по расположению на хроматографе с кверцетином и камферочом, использованным как контроли (рис.2).

Прямое доказательство влияния флавоноидов на прорастание и рост пыльцевой трубки было получено добавлением различных флавонолов в

сроду GV для прорастания пыльцы, созревшей in vitro из микроспор табака. Все флгшонолы (кверцегин, каифсрол, мерицетин) оказали сильное стимулирующее влияние на прорастание и дальнейший рост пыльцевой трубки пра концентрации от 0.15 до 1.5 цМ (рис.3).

у. pr«c№dttier>e<t u.»iysH fcttli&o'CI Tre,tnent

g* i'jar.Uo'i prtca . ноли prcCMxlKion«!

1rt»m*r»t

Pub. 1. Влияние кондиционированной среды на

прорастание пыльцы iaC-акд

quefceiin

3 4

tidies

Гис, 2. Разделение флаиоиолои а

тонкослойной хроматографии.

Рис. 3. Влияние флавоиолов на прорастание пыльцы табака in vitro.

Другие флапононды (нэрннгеннн, нарннгнн) не дали значимого эффекта,

ФЛАБОНОЛЫ СТИМУЛИРУЮТ РАЗВИТИЕ ПЫЛЬЦЫ >71 VITRO. Исследовали также влияние фданонолов на разчнтие пыльцы табака in vitro. Гомогенную популяцию незрелых двуклеточных пыльцевых зерен табака культпвироаалн па среде AMGlu с добавлением или без добавления флавонолов. Через определенное гремя их переносили в среду GV для прорастания. Эта опыты показали, что в котрольных культурах без флавонолоз пыльца созревает в течение 72 часов, тогда как добавление флавонолов значительно сокращает срок созревашгя пыльцы табака in vitro.

Часть 2. Ст?*садныг гормоны епптулируюгя npopiumame а рост пыльцевой трубки табака /» vitro,

ТЕСТОСТЕРОН СТИМУЛИРУЕТ ПРОРАСТАНИЕ И ДАЛЬНЕЙШИЙ РОСТ "МИНИМАЛЬНОЙ" ПЫЛЬЦЫ ТАБАКА. Для изучения эффекта стероидов на прорастание и рост пыльцевой трубки в среду GV добавляли рахтнчшле концеггтращш аидрогениого гормона - тестостерона и затем проращивали пыльцу табака, созревшую in vitro. Наличие в среде 10 цМ тестостерона привело к значительному повышению частоты проргсташя пыльцы я увеличению размера пыльцевой тр><5ки по сравнению с контролем. Стимулирующий эффект был обнаружен при концентрациях от 2 цМ до 20 цМ.

В следующем опыте тестостерон в концентрации 10 (iM был добавлен вместе с 1 цМ кверцетином в среду GV. Результаты показали значимое повышение частоты прорастания пыльцы в этом варианте по сравнению с контролем к когда добавляли каждое соединение отдельно. Длина пыльцевой трубки в этих вариантах также была выше, чем в контрольных опытах (рис.4).

А

i п

HL

V;

wmQ Т КО

0

* "

1 1„ I

omiji

y%too » «О»«.«

О Centre»

OTeiTosiftrooe (T0i>M) & Ou*<c«iin (5 >'М) ft ?■>«*.& Ouorootin

Tube I^mi

Рис. 4. Влияние тееяютерона ¡¡/шш кверцетмна на прорастание пыльцы и рост пыльцевой трубки в созревших in vitro пыльцевых зернах табака; А -частота прарзегзтш; В - длина пыльцевой трубки.

¡ы

ТОЛЬКО НЕКОТОРЫЕ СПЕЦИФИЧНЫЕ СТЕРОИДЫ СТИМУЛИРУЮТ ПРОРАСТАНИЕ И РОСТ ПЫЛЬЦЕВОЙ ТРУБКИ.

Различные стероиды были анализированы добавлением их в среду GV для прорастания пыльцы табака in vitro. Результаты этих экпериментов показали, что стероиды животного происхождения, такие как тестостерон, прогестерон и эстроген стимулируют прорастание и развитие пыльцевой трубки при концентрациях ¡0 цМ, когда добавляли отдельно или в сочетании с кверцетяном (1 цМ). Сходный эффект был получен также при использовании синтетического стероида 11-1881, что исключает возможность загрязнения природных стероидов другими неизвестными соединениями. Эти данные позволяют сделать вывод, что животные стероиды стимулируют рост и развитие пыльцевой трубки табака.

К сожалению, мы не смогли обнаружить разницу влияния женехих и мужских гормонов на этот процесс.

Были также проанализированы многие растительные соединения, схожие со стероидами: ситостерол, брассинолиды и т.д. Ни одно из этих соединений не показало стимулирующего эффекта, а 2В-гоыабрасс1Шолид полностью иигибировал прорастание пыльцы при концентрации 10 |jM и выше.

Часть 3. Активация MAP ки/rn ара гидратация пыльцы тйбаха.

Выявлен новый сигнальный путь в пыльце табака, активированный MAP киназами (mitogen activated protein láñase). Показана регуляция этого пути в процессе развития и последующая активация, при гидратации нылыщ табака (рис.5) Анализ различных стадий развития пыльцы показал, что транскрлпционлая и трансляционная индукция синтеза MAP юшазы происходит на стадии двукл сточных пыльцевых зерен (рис.6). Однако, MAP кнназа хранится в неактивной форме в зрелых пыльцевых зернах. Активация юшазы наблюдается очень скоро после гидратации сухих пыльцевых зерен, достигая максимума через 5 минут, после чего она постепенно снижается. Кинетика активации позволяет предположить, что MAP кшиза играет рель в активации пыльцевых зерен в процессе гидратации.

«э О

123*56789

_9 О I 5

маг. germ.

Dty H¡0 CK

Рис. 5. Гидратация активирует MAP киназу.

J&Í1

М14 ÍIt/5 ntí3

rRNA

Рис. 6. Транскрнпт ntf 4 индуцируется на стадии двуклеточной пыльцы.

It

ГЛАВА И. СЕЛЕКЦИЯ ПЫЛЬЦЫ ТЛБЛКЛ IN VÍTRO.

Материал и методика

РЛСТЕНИЯ-ДОНОГЫ. Растения Nicotina tabaciim cv. Petit Havana SRI выращивали в условиях, описанных в главе Í. Трансгенные растения табака были получены трансформацией листовых дисков с помощью Agrobacterium tumefaciens согласно методике Horsch et al. (19S5). Семена трансгенных растений, содержащие DC3-GUS конструкцию, были получены от Prof.T.Thomas (Texas А&М University, USA). Первичные трансформанты самоопыляли и гомозиготные растения Т2 были отселектированы на среде с канамишшом.

КУЛЬТУРА МИКРОСПОР И НЕЗРЕЛЫХ ПЫЛЬЦЕВЫХ ЗЕРЕН.

. Методика культивирования одноядерных микроспор и незрелых двуклеточных пыльцевых зерен описана в главе I.

КЛОНИРОВАНИЕ ПЛАЗМНД. Два бинарных вектора, сконструированные на базе плазмнды pBlN19, были использованы в экспериментах ло клонированию. Плазмида рВ1РА2 состояла из гена ß-глюкуронидазы (GUS геи) под контррлгм рА2 промотора, специфичного для пыльников. GUS ген в этой плазмиде был замещен геном гигромицин-фосфотрансферазы (НРТ) и была получена конструкция pBIPA2Hg. Обе плазмнды: pBIPA2GUS и pBIPA2Hg содержали дополнительно ген неомицинфосфотранеферазы (N РТ) под конгрил ем промотора нопалинсинтетазы (NOS), что приводит к резистентности к антибиотику канамииииу. Плазмида pBIDC3Hg была сконструирована заменой промотора РА2 в плазмиде pBIPA2Hg :.<х промотор DC3, хоторый был выделен из зародышей моркови. DCÎ промотор был предоставлен в плазмиде SF16 Prof. T.Thomas (Texas А&М University, USA).

ТРАНСФОРМАЦИЯ МИКРОСПОР 11 НЕЗРЕЛЫХ ПЫЛЬЦЕВЫХ ЗЕРЕН БОМБАРДИРОВКОЙ, Микроспоры и незрелые пыльцевые зерна бомбардировали сразу после их изолирования. Клеточную суспензию (0.7 мл), содержащую приблизительно 5x101 клеток, равномерна распределяли на поверхности стерильной фильтровальной бумаги, которую помещали в чашки Петри диаметром 10 см. Для бомбардировки использовали аппарат PDS-1000 Не (BIORAD, USA). Бомбардировка производилась согласно методике Sanford et al. (1993). Плазмидная ДНК осаждалась на поверхности золотых частиц диаметром 1 микрон. Реакция осаждения включала смешивание 25 мкл суспензии золотых частиц с 5 мкл ДНК, 2,5 M CaClj и 0,1 M спермидина при непрерывном встряхивании в течение 5 минут, после чего смесь инкубировали в течение 30 минут при 4*С. Смесь после этого промывали два раза 96% этанолом с помощью центрифугирования при 7000 rpm в минуту. Образовавшийся осадок частиц с ДНК был ресуспендирован в 20 мкл 100% этанола и 7 мкл суспензии использовали на одну бомбардировку. Каждую чашку с клетками бомбардировали два раза, после чего их промывали с поверхности фильтровальной бумаги и культивировали на среде для созревания микроспор.

ТЕСТ НА р-ПНОКУРОННДАЗУ (GUS ТЕСТ). Гистохимический или флуориметрический анализ экспрессии GUS гена проводили согласно Jefferson et al. (1987) с некоторыми модификациями (Stoeger et al. (1992)). Количество пыльцевых зерен, окрашенных субстратом x-Gluc, подсчитывали с помощью инвертированного микроскопа.

ОПЫЛЕНИЕ ЦВЕТКОВ ТАЕАКА IN SITU ПЫЛЬЦОЙ, СОЗРЕВШЕЙ IN VITRO. Цветки табака кастрировали за день до проведения in situ опыления. Пыльцевые зерна, созревшие in vitro, промывали два раза средой GV и ресуслецдировали на этой же среде. Для опыления одного цветка было использовано 3 мкл суспензии пыльцевых зерен. Все цветки были покрыты прозрачной белой бумагой после in situ опыления, чтобы не допустить перекрестного опыления нежелательной пыльцой. Созревшие плоды с семенами собирали через 3-4 недели после опыления.

АНАЛИЗ ПРОРАСТАНИЯ СЕМЯН. Семена, поверхностно простерилизованные а растворе гипохлорида натрия (NaOCi), проращивали на среде MS без канамицина или с добавлением 50 мг/л канамицина на свету при 25*С. Процентное соотношение семян, резистентных или чувствительных к канамицину, определяли через 3-4 недели, когда резистентные растения образовывали листья.

ВЫДЕЛЕНИЕ ДНК И САУЗЕРН СЛОТ АНАЛИЗ. Саузерн блот анализ был проведен согласно стандартной методике, описанной в Sambrook&Maniatis (1989). Геномную ДНК расщепляли рестриктазами, разделяли в 0.8% агарозном геле, переносили на мембраны Hybond-H н гибридизовала с ДНК пробой, меченой диоксигенином (Boehringer-Maiuiheim, Germany).

РЕЗУЛЬТАТЫ.

ВСЗ ПРОМОТОР АКТИВЕН В ПРОЦЕССЕ РАЗВИТИЯ ПЫЛЬЦЫ ТАБАКА. Экспрессия четырех промоторов LAT52, РА2, 35S и DC3 с GUS генами была анализирована в процессе развития пыльцы табака in vivo и in vitro. DC3 промотор оказался наиболее активным rio сравнению с остальными промоторами. Его активность была определена сразу после митоза в микроспорах и достигла максимума в зрелых пыльцевых зернах (15 ООО pmoi/niin/ßr). Активность и регуляция этого промотора была одинаковой в процессе развития мужскогр гаметофита табака in vivo и in vitro. Исходя из этих результатов, DC3 промотор был выбран для дальнейших экспериментов по селекции пыльцы in vitro.

ГНП'ОМИШШ В ПОЛНОСТЬЮ ИНГИБИРУЕТ РАЗВИТИЕ ПЫЛЬЦЫ ТАБАКА IN VITRO И ЕЕ ПРОРАСТАНИЕ. Несколько антибиотиков (гигромишш В, канамищш, стрептомицин,'меготрексат) добавляли в среду для созревания микроспор табака in vitro для анализа их цяшбирующего эффекта. По сравнению с другими добавление гкгромншша В полностью блокировало развитие микроспор или незрелой пыльцы in vitro (табл. 1 и 2).

n

Таблица l. Влияние гигромицина В на созревание и прорастание микроспор табака в условиях in vitro. Различное количество гшромициня В добавляли в среду после инкубации в течение 3 (А) и 4 (В) дней. Шестидневную пыльцу, выращенную in vitro, проращивали п соответствующей среде (GV + ]р,М кпсрпеттш) в течение 9-10 часов. Данные одного из типичных экспериментов показаны в таблице.

Концентрация . Частота прорастания

гигромицина В (ng.mH) пыльцы (%)

А В

0 20.0 20.0.

50 2.0 6.5

100 0.3 4.0

150 0.04 1.Я

200 0.01 1.2

Ингибирутощий эффект зависел от времени добавления и от концентрации гигромицина В. Добавление на ранних этапах в. концентрации 200 или 250 мг/л полностью блокировало развитие пыльцы п последующее ее прорастание. Пыльца, выращенная в присутствии гигромишшп, отличалась по морфологии от нормальной пыльиы, имея темные гранулы крахмала, которые, по-видимому, не превращались в растворимую форму, как это наблюдается при нормальном развитии. Такие зерна никогда не прорастали, когда их инкубировали п среде для прорастания.

Ткблиаа 2. Воздействие гигромицина В на созревзтге п прорасташе средней двуядерной пыльцы табака. Гигрс. шипи В добавляли в различном количестве п среду созрепания через 0 (А), 24 (В) и 48 (С) часов, после 72 часов зрелая пыльца прорастала в среде без гигромицина (СУ + 1цМ кверцетшш) в течение 4-5 часов.

Концентрации гигромицина В (pg-ml-1) Чг стога прорастания пыльцм

А В С

0 54.6+1.1

25 13.0*1.6 43.410.8 50.7+6.9

50 З.Ш.1 3!).1±0,2 33.010.5

100 0 5.6±1.3 Зб.б±М

200 0 0,8±0.1 34.6+1.7

250 0 0 28.2±1.0

СЕЛЕКЦИЯ ПЫЛЬЦЫ РЕЗИСТЕНТНОЙ К ПИ ¡'ОМНЦШ1У НОСЖ БОМБАРДИРОВКИ. Микроспоры к незрелые пыльцевые зерна табака были бомбардированы плазмндой SF-16, содержащей GUS ген под контролем DC3 промотора, и экспрессию GUS гена анализировали путем окрашивания пыльцевых зерен в субстрате x-Gluc.

Частота транзнентнон трансформации для микроспор была от 0.01% до 1%, тогда как для незрелой пыльцы эффективность трансформации достигала 3%. Незрелая пыльца была использована для дальнейших экспериментов из-за высокой частоты трансформации.

Две разные плазмнды были использованы в экспериментах по котрансформации: pBIDC3Hg, содержащая гигромишш В ген под хотролем DC3 промотора, была бомбардирована либо с pSF16 (DC3-GUS), либо с pBIPA2 GUS, и суспензия пыльцы культивнроиалась in vitro 3 дня в присутствии 200 мг/л гитромицина. Результаты экспериментов показаны в таблице 3. Через 3 дня инкубации на среде для созревания только 2-3% пыльцевых зерен имели нормальную морфологи ю н могли прорастать на среде GV для прорастания, тогда как остальная популяция имела черное содержимое, состоящее из крахмальных гранул. Гистохимический анализ на эспрессию гена показал, что 2-3% пыльцевых зерен, которые были резистентными к гнгромнцину вследствие интеграции DC3-HPT гена, также имели положительную окраску на GUS ген, что говорит об эффективности селекции пыльцевых зерен резистентных к гигромицину после внедрение в них гена гигромицинфосфотрансфераэы (табл.3).

Таблица 3. Устойчивость к гигромицину и GUS-экспрессия пыльцы табака, созревающей i« vitro, ^трансформированной с помощью одной из двух пдазмид рВ1РА2 или SF16 (DC3), содержащих uidA-гек, находящийся под контролем РА2 или DC3 пыльцеспецифичных промоторов, соответственно, и плазмидой pBJHDC3, содержащей ген устойчивости к гигромицину, находящейся иод контролем DC3 промотора. Средняя двуядерная пыльца была бомбардирована двумя различными плазмидами и выращена in Vitro до созревания в условиях селекции с гигромицином В (200 ng.ml"'). Окрашивание на. GUS проводили через 4 часа после перенесения пыльцы на среду для прорастания.

■ Частота Частота прорастающей прорастающей гигромицин GUS устойчивой положительной пыльцы (а)__пыльцы (Ь)

Коэффициент коэксирессии

(Ь:а)

р81РА2 рВШСЗ

+

2.94

2.1

0.71

SF 16 (DC3) + рШОСЗ

1.8S

, 0.96

0.52

не бомбардированная культура

0

0

СШШШИЯ ПЫЛЬЦЫ IN VITRO ИЗ СТАБИЛЬНО ТРАНСФОРМИРОВАННЫХ РАСТЕНИЙ НА РЕЗИСТЕНТНОСТЬ К ГИГРОМ1Щ1ШУ. Несколько независимых трансгенных растений табака, содержащие в рамках Т-ДНК DC3-HPT и NOS-NPT, были получены трансформацией л пекших дисков с помощью Agrobacterium tamefacietis.

Только те растения, которые имели один локус трансгена, что было показано Саузерк блот анализом, были использованы а дальнейших экспериментах. Дополнительно отобранные растения расщеплялись в поколении F 1 по типу моногешгого наследования (табл.4).

Двуклеточную незрелую пыльцу выделяли из этих растений и культивировали in vitro п среде AMGIu в присутсвии 200 мг/л гигромишша В. Через 2 дни инкубации суспензию пыльцевых зерен промывали два раза средой GK и проращивали ее в среде GK без гигромнцнна В. Приблизительно 50% пыльцевых зерен имели нормальную морфологам и прорастали хорошо, тогда как остальные 50% ие прорастали. В контрольной культуре без гшромищша В все пыльцевые зерна созревали и прорастали in vitro. Незрелая пыльца из растений дикого типа Не созревала и не прорастала о присутствии гагромкигша вообще.

Таблица 4. Анализ семян, полученных в результате экспериментов по селекции пыльцы. Пыльцу растений дикого типа (W) и расгеиий-трансформаито», культивируемую в присутствии (+S) или отсутствии (-S) гигромицинк В (200 pg.ml1), использовали для опылешш кастрированных цветков растений дикого типа. Полученные семена выращивали на среде, содержащей канамицин (50 pg.ml"1). •

(*) самоопыление и возвратное с- пыльцой

трансформация, взятой in vivo

Типы скрещивания пыльца х псстик Число нррросткоз Устойчивость Расщепление no фенстипу

чувствительные kanr: kan"

Тг (-s) х Тг 4 И7 53 3:1

Tr (-s) х V»' * 125 132 1:1

W (-S) х W 0 270 Ü:l

W <+s) x'W егмон нет

Tr. (-s) х W 147 155 1:1

Tr. (+s) x W 317 0 1:0

Пыльца из этих экспериментов была использована для опыления цветков дикого типа. Семена не были получены, когда дая опьщения использовали пыльцевые зерна из дикого тина, выращенные в присутствии гигромицшм В, тогда как 100% нормальное формировать семян наблюдали после опыления пыльцой из культур без шгромищша В. Все эти семена были чувствительны к капам ищи ¡у, когда их проращивали на селективной среде MS с канамицином, что полностью согласуется с предположением (табл. 4).

Семена были получены также после опыления дикого типа суспензией пыльцы из трансгенных растений, выращенных в присутствии или отсутствии гшромицина В. Только в случае, где были использованы пыльцевые зерна, отсслектированные на резистентность к гшромицину, все полученные семена были резистентными к каламицину, тогда как семена неселектировашшх зерен дали расщепление 1:1, нерезистентных »! чувствительных (табл. 4).

Эти результаты ясно показали, что селекция «а уровне пыльцы эффективна и может быть использована для отбора наиболее интересных рекомбинантов.

ГЛАВА IV.

ТРАНСФОРМАЦИЯ МУЖСКОГО ГАМЕГГОФИТА РАСТЕНИЙ (MAGELITR).

Материал и методы

КУЛЬТУРА МИКРОСПОР I! НЕЗРЕЛЫХ ПЫЛЬЦЕВЫХ ЗЕРЕН. Выделение, культивирование и прорастание микроспор и незрелых пыльцевых зерен проводили согласно методике, описанной а главе I.

ИСПОЛЬЗОВАННЫЕ ПЛАЗМИДЫ. Две плазмдщше конструкции были использованы в экспериментах по трансформации микроспор и незрелых пыльцевых зерен: pA2Hg и рВП21: Структура pA2Hg плазмиды описана в главе III. рВ!121 содержала GUS ген под контролем 35S промотора и NFTII ген под контролем NOS промотора. Нлазмида была получена ■ от Clontech Ltd. (USA). Плазмида pLAT52-GUS была использована для оптимизации параметров бомбардировки. Все плазмиды были выделены и очищены на Quiagen колонке согласно инструкции производителя.

БОМБАРДИРОВКА МИКРОСПОР К НЕЗРЕЛЫХ ПЫЛЬЦЕВЫХ ЗЕРЕН. Выделение клеток ц бомбаридировка производилась согласно методике, описанной в глзде ! и III.

IN SITU ОПЫЛЕНИЕ С IN ViTRÖ СОЗРЕВАЮЩЕЙ ПЫЛЬЦОЙ. Проводилось, как описано в главе III.

'ГЕСТ ПА ЭКСПРЕССИЮ GUS ГЕНА. Гистохимический анализ экспрессии GUS гена в пыльцевых зернах проводили согласно методике, описанной в главе Ш.

ir

ПРОРАСТАНИЕ СЕМЯН. Было проделано, как описано в главе HI.

САУЗЕРН БЛОТ ГИБРИД ИЗАЦМОННЫЙ АНАЛИЗ. Геномную ДНК выделяли согласно Dellaporta et al. (1980). Радиоактивный Саузерн Слот проводили согласно методике, описанной у Sambroo); et al. (1989). Нерадиоактивный Саузерн блот проводился согласна методике производителя (Boelmngei-Mamiheim, Germany). Геномную ДНК (10 fig расщепленная иди нсрасщепленная) разделяли в 0.8% агарозном геле, переносили на Hybond-N мембранные фильтры и гнбриднзовали с ДИК пробами, мечеными дпоксигснипом п случае иерадлоактивной гибридизации и (ct)32P-dATP - в случае с радиоактивной гибридизацией. Гибридизация была выявлена экспозицией мембран с Kodak XAR фильма в течение 12 часов при -70°С. Нерадиоактивиые мембраны были проявлены я течение 1-2 часов согласно инструкции производителя.

РЕЗУЛЬТАТЫ.

ОПТИМИЗИРОВАННЫЙ ПРОТОКОЛ СОЗРЕВАНИЯ МИКРОСПОР IN VITRO И IN SITU ОПЫЛЕНИЕ. Во всех стап.пх, опубликованных до настоящего времени, созревание микроспор табака in vitro получали из поздних микроспор или даже из ранней дауядерной незрелой пыльиы. Трансформация ДНК в этих микроспорах в G2 фазе клеточного цикла может привести к ситуации, когда чужеродная ДНК интегрируется в одну из дочерних хроматнд, в результате чего только одна нэ дочерних клеток, генеративная или вегетативная, будут трансформированы. .

Чтобы преодолеть эти проблемы, мы оптимизировали in vitra созревание микроспор табака, которые были на G1 илп S фазах клеточного цикла, что было определено окраской DAP1 и анализом микроспор с помощью проточно« цитофотометрии. Микроспоры культивировали в среде Т1 4 дня при 25"С, после чеТо суспензию разбавляли два раз*, каждый день средой Р в том же объеме, что и исходная среда. После б дней культивирования приблизительно 70% микроспор созревали и' около 33% прорастали в среде G К.

Добавление кверцетина в среду GK повысило частоту Прорастания до 50%. Для in situ опыления капли (3 мкл) суспензии, состоящей из 10.000-20.000 пыльцевых зерен, наносили на поверхность пестика цветков дикого типа, эмаскудированных за день до проведения эксперимента по опылению. К-лроСгчки с семенами собирали через 3-4 неделя после опыления. В среднем 530 семян было получено на одну коробочку, ко редко количество семян на коробочку достигало даже ЮОО, что приближается к контролю, где in vivo пыльца использовалась для опыления. В экспериментах по бомбардировке было получено а среднем 420 семян us коробочку.

ТРАПЗНЕ1ГГНАЯ ЭКСПРЕССИЯ GU3 ГЕНА В IN VITRO СОЗРЕВШИХ ПЫЛЬЦЕВЫХ ЗЕРНАХ. Ранее нами было показано (глава Ш), что около ОЛ-1% одноклеточных микроспор и около 3%. двуклеточных незрелых пыльцевых зерен экепрессирует GUS ген, после бомбардировки илазмияами pA2GUS и LAT52GUS.

Чтобы повысить частоту транзиептиой трансформации, одноядерные микроспоры в G1/S фазах клеточного цикла и незрелые пыльцевые зерна бомбардировали в растворе маннигола, Mg и 12% PEG8000. Приблизительно 1 х 10° клеток равномерно распределяли на поверхности фильтровальной бумаги и бомбардировали 2 раза при давлении 1100 psi и дистанции между клетками и блокирующей железной сеткой 10 см. Приблизительно 1-2% GUS положительных микроспор и незрелых пыльцевых зерен можно было наблюдать лсд микроскопом после окраски с x-Gluc.

СТАБИЛЬНО TPAI1СФОРМИ POIIAIШ Ы Е СЕМЕНА, ПОЛУЧЕННЫЕ ПОСЛЕ ОМЫЛЕНИЯ БОМБАРДИРОВАННЫМИ И IN VITRO СОЗРЕВШИМИ МИКРОСПОРАМИ. Чтобы подучить стабильные трансгенные растения, одноклеточные микроспоры были бомбардированы двумя плазмиднмн pA2l ig и pßll21 в отдельных экспериментах. Приблизительно 1 х 106 микроспор, выделенных из 20-25 цветков, были использованы в каждом эксперименте. В среднем 3000-12000 семян было получено в одном эксперименте и в сумме около 40000 семян было проанализировано (табл.5). В экспериментах с длуклеточиоП незрелой пыльцой было проанализировано приблизительно 70000 семян. После прорастания этих семян на среде MS с 50 мг/л катшнщша ни одно семя не проросло, тогда как среди 40000 семян, полученных после бомбардировки микроспор, 5 семян показали резистентность к канамншшу, что показывает успешную трансформацию микроопор чужеродной ДНК.

Таблица 5. Краткое содержание MAGELITR экспериментов.

Стадия пыльцы Плазм н ды Число семян в эксперименте Общее число проанализированных семян Устойчивость проростков к ка-намицниу Анализ проростков по Саузерну

мпкра-спсры рВП21 5-8000 12000 1 1

микроспоры рА2Нуц 5-8000 30000 4 4

двукле-точнаи пыльца pA211yg 12-15000 70000 0 0

МОЛЕКУЛЯРНЫЙ АНАЛИЗ ТРЛИСФОРМАНТОЙ. Саузерн блот аиалпз с использованием в качестве пробы фрагмент N1411 гена, вырезанною как Psil фрагмент tu плазмиды рШ 121, подтвердило трансгснную природу всех 5 "П-раскшШ, резистентных к кашшицину (рис.7а). NPfll «îi'.'.rHcsti сначала гибрид»зовали к геномной ЛПК, расшсиленнп» pcctpittaawit Psll. Выпи получены полоски одинакового

размера (рис.7). В дальнейшем NPTII проба была прогпбридизована к нерасщеплеиной • геномной ДНК из »сек трансформантов. Проба гибрндпзовалась высокомолекулярной хромосомальной ДНК, что показывает интеграцию NPTH гена в геном растений-трапсформантоя. Шкснсц, геномную ДНК всех трансформистов обрзтывали рестриктазой Sac I, которая расщепляет NPT II ген только в одном песте, я рестриктазой EcoRV, которая расщепляет геном на фрагменты разных размеров, я гпбридизовали с Pst I фрагментом NPT II гена. Расположите полосок на Геле показало, что все трзнсформаиты имеют независимое происхождетю и в некоторых случаях Достаточно сложный характер интеграции гена(-ов) в геном табака. Схожая картина расположения полос была получена я в Т1 и Т2 потомстаах первичных трансформантов (рис. 7 Ъ,с)..

Четыре трансформанта были получены с использованием в качестве вектора pA2Hg и один - с использованием рВИ2!. СаузерП блот анализ, где пробы НРГ и О US генов были гибридизопаны к геномной ДНК четырех трансформантов показал, что все трансформации имеют в геноме НРТ ген, тогда как только один из них имеет, как и предполагалось, OUS ген (рис.7 d).

В заключение Саузерн блот анализ показал, что:

а) NPT II ген стабильно интегрирован в геном растения;

б) все пять трансформантов имеют независимое происхождение, что исключает возможность засорения пыльцой извне;

в) существует положительная корреляция между генами, которые были введены в геном с результатами Саузерн блот анализа.

(а)

> - » 9 С О В ггч г и it > г!г1 гл1 ггз

•а

<*

п tn *

а

I 1 Г i ill

■ (b)

♦ • а в с о е __________ГТЗ ГТЪ сп гт> р>п->

а в я в 9

•5

'5

* в

Л D C D П -

"* ~

-t-ii

Рис.7. Саузерн блот анализ полученных трпнеформпнто» 11 ИХ поколений.

2U

ГЕНЕТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ТРАИСФОРМАШОВ. Чтобы определить стабильность наследования трансгеноа в последующих поколениях н исключить возможность трансформации через бактерии-эндофпты, был проведен генетический анализ Т2 потомства трансформантов после самоопыления и обратного скрещивания с диким типом табака. Семена Т2 потомства проращивали в среде MS с канамицином и считали канамицин резистентные и чувствительные растеньица. Все пять трансформантов дали грансгенные потомства, которые различались расщеплением призиака-гена. Трансформант Р20.1 расщепляется на кап+ и кап* группы согласно моногенному наследованию, тогда как растение Р13 расщепляется по промежуточному варианту между моногенным и дигенным наследованием, вероятнее всего, вследствие интеграции двух генов NPT II в одной хромосоме. Остальные три трансформата показали меньше резистентных растеньиц, чем предполагалось, возможно, вследствие частичной стерильности пыльцы или яйцеклеток (табл. 6).

. Нами также был проведен анализ расщепления GUS гена в потомстве трансформанта Р5. Листочки от Т1 и Т2 растении инкубировали в субстрате x-Gluc и окраску наблюдали под бинокулярной лупой. Было показано, что GUS ген также передается стабильно по наследству (табл.7).

Растения Т2, резистентные к канзмншшу, выращивали до цветения, самоопыляли и ТЗ семена анализировали путем проращивания на среде MS с канамицином или пугем окрашивания в x-Gluc. Наследование NPT Н и GUS генов было показано в потомствах всех «яти трансформантов (табл. 7,8). Один трансформант Р20.1 показал четкое моиогеиное наследование, тогда как остальные трансформанты наследовали NPT II не согласно Мевделевским законам. Во всех этих случаях мы наблюдали меньше резистентных растений, чем ожидалось.

Таблица 6. Анализ расщепления в поколении Т2, полученного от Р13, Р17, Р20.1, Р20.2, трансформированных с помощью плазмиды pA2Hß.

Самоопыление /(Т) х m (SRI) /(SRI) х m (Т)

npt И*: iipt 11* отношение npt 11+: npt II- отно-uieiiiie npt 1Г: npt II* отношение

Р13 227:32 6:1* 199:149 1:0.7 204:132 1:0.6

Р17 57:147 1:3* и.о. . и.о. 62:203 1.3*

Р20.1 240:82 3:1" н.о. и.о. 97:106 1:1*

Р20.2 1E7:1S4 1:1* 108:194 0.6:1 72:304 0.2:1

f и m - женское н мужское рястение-родшель, соответственно; все отношении, ошмшние "•" - значимы, получены по методу Хи-квадрат (при 0,05%) для NPT Hf и NI'T IP, устойчивых и чувствительных к канашшину проростков; и.о. - не определялись.

Таблица 7. Анализ расщепления поколений Т2 и ТЗ, полученных от Р5 расгашй, трансформированных плазмидой р!!1121.

Потомство Скрещивания Проростки Отношения

npt Ц+: Eus+: npt II+: gus+:

npt II- gus- npt II" BUS"

Р5.Т2 . self 163:346 160:350 0.4:1 0.4:1

/(Т5) х т (SR1) 83:285 90:291 1:3* 0.3:1

/(SR1) х т (Т5) 116:295 110:287 1:3* 0.4:1

Р5.ТЗ 14:72 40:142 0.2:1 0.3:1

self 8:48 41:127 0.2:1 1:3*

Г и ш - женское и мужское растение-родитель, соответственно; КРТ , Н+ и МРТ II- - устойчивые и чувствительные к кагтмтшну проростки; все отношения, отмеченные "*" - значимы, получены по методу Хи-квадрат (при 0,05%).

Таблица 3. Анализ ТЗ поколения, полученного от Р13, Р17, Р20.1, Р20.2, трансформированных плазмидой pA2Hg.

Трансфор- .Проанали- Проростки ' Отношение

маты зирован-

ные

растения

npt И+: npt II" полу- ожидае-

ченное мое

1 93 : 93 1: I* 3 : 1 или

P13 г 203 : 210 I : 1« 100%

npt 1Г

3 т: 3 100%

! 5G: 117 0. 5: к 3:1 t'.iü

P17 2 57 : 219 0.5 : I №№

r.rt II*"

3 60: 184 1 : 3*

P20.1 1 145 : 50 3: г 3 : Е

P20.2 1 75:92 1 : 1* 3:1 или

2 88: 77 1:1* 100!«

3 79 : 101 1 : 1* npt 1Г

4 95 : 81 I : 1«

ГЛАВА V.

ПРОДОЛЖЕНИЕ ГАМЕТОФИТНОГО РАЗВИТИЯ ПОСЛЕ СИММЕТРИЧНОГО ДЕЛЕНИЯ й КУЛЬТУРЕ МИКРОСПОР ТАБАКА.

Материал и методы

ПРИГОТОВЛЕНИЕ ЭКСТРАКТА ИЗ ПЫЛЬНИКОВ. Приблизительно 500 незрелых пыльников, начиная со стадии тетрад до дауклеточной пыльцы, были заморожены в жидком азоте и размельчены в фарфоровой ступке до порошкообразного состояния. Порошок был рееуспендирован в 40 мл Т1 среды и центрифугирован при 15000 rpm 15 минут в Sorwall 5534 роторе. Супернатант был собран в пробирку и центрифугирован 1 час при тех же условиях, после чего супернатант опять был собран и, разделенный на части, хранился при -80'С до использования.

ВЫДЕЛЕНИЕ II КУЛЬТУРА МИКРОСПОР. Микроспоры выделяли в стерильных условиях из 8 мм, 9 мм, 10 мм и 11 мм бутонов табака согласно методике, описанной в главе I. Изолированные микроспоры промывали три раза в среде Ml, осаждали центрифугированием при 600 х g 2 минуты и полученный осадок ресусисндировали в среде Ml при плотности 4 х 10s клеток на 1 мл и культивировали 3 дня при 25°С в темноте. В часть культур добавляли экстракт пыльника (200 мкл/мл).

Через 3 дия в культуры добавляли среду Р в равном объеме, что и исходная среда и инкубировали еще 2 дня. После этого микроспоры и созревшие пыльцевые зерна собирали и анализировали под микроскопом. В некоторых экспериментах созревшие in vitro зрелые пыльцевые зерна прорастали в среде G К..

ОКРАШИВАНИЕ МИКРОСПОР. Окраску ядра красителем DAP1 (4,6-diajnidino-2-phenylindole) проводили согласно методике Vergne et al. (1987), чтобы определить стадию микроспор и характер деления ядра. Для определения жизнеспособности микроспор клетки были окрашены красителем FDA (fluorescine diacetatc) согласно методике Hestop-Harrison (1970), Calcofluor White краситель был использован для окрашивания клеточной стенки микроспор и зрелых пыдьцовых зерен.

СТАТИСТИЧЕСКАЯ ОБРАБОТКА РЕЗУЛЬТАТОВ. Нрнблнз!!Тельио 500 клеток было подсчитано для каждого эксперимента. Все эксперименты проводили минимум а трех повторностях. Для сравнения различных вариантов обработок были использованы X2 тест и Newman- Kouls тесты.

РЕЗУЛЬТАТЫ.

СТАДИЯ РАЗВИТИЯ МИКРОСПОР. Микроспоры, выделенные из бугоно» размером 8 мм и 9 мм, находились на ранней одноядерной стадии сразу поме освобождения из камтнои оболочки тетрад. Следовательно они были и О! фазе кчеюнюю цикла. Они пмолн шарообразную форму.

ядро находилось в центре клетки, заполняя большую часть клетки. Микроспоры, изолированные из бутонов размером 11 мм, имели позднюю одноядерную стадию. Они больше по размеру, и ядро расположено близко к стенке микроспор. Микроспоры на этой стадии имеют большую вакуоль.

РАЗВИТИЕ МИКРОСПОР В КОНТРОЛЬНЫХ КУЛЬТУРАХ. Микроскопический анализ показал, что созревшие in vitro без экстракта пыльцы зрелые пыльцевые зерна являются результатом нормального, зссимметрнчного митоза (табл.9,10). Они имеют все характеристики in vivo пыльцевого зерна: маленькая генеративная клетка с конденсированным ядром, которая находится в цитоплазме большой вегетативной клетки, аккумулирующая крахмал в процессе созревания in vitro. Ядро вегетативной клетки менее кондененровано, Изначальная стадия развития микроспор имела большое значение в отношении жизнеспособности клеток in vitro, что показала окраска с FDA.

В некоторых экспериментах около 80% поздних микроспор созревали нормально при культировании in vitro. В среднем около 50% микроспор, выделенных из бутонов размером 10 мм и 11 мм, сохраняли жизнеспособность после 6 дней созревания in vitra (табл.10). Однако, молодые микроспоры, изолированные из бутонов размером 8 мм к 9 мм, в основном, теряли жизнеспособность, и только 20% микроспор показывали положительную реакцию на FJDA тест. Часто в этих культурах можно было наблюдать аномалии митотического деления и дальнейшего развития. Видимо, среда, использованная а этих экспериментах, не оптимальна для созревания молодых микроспор in vitro.

Жизнеспособные, созревшие in vitro пыльцевые зерна прорастали в среде GV и также при опылении in situ. Семена, полученные в этих экспериментах, доказывают, что пыльца табака, созревшая in vitro, сохраняет все биологические функции.

Таблица 9. Влияние экстракта пыльников на митоз микроспор табака. Поздние'одноядерные микроспоры (цветочные бутоны размером 11 мм) изолировали и выращивали в культуре in vitro и течение 5-6 дней и затем использовали в эксперименте. Значения со стандартным отклонением определены по 4-м независимым пробам, взятым из каждого эксперимента. Подсчитано 500 тгыльцевых зерен на каждую пробу.

Эхстракт пыльников (мкл на мл культуры) Жизнеспособность пыльцы® , (%) Жизнеспособность пыльцы", (%)

0 83.3 ±7.7 3.9 ± 2.3

100 72.2 ± 2.9 46.1 ±6.8

200 80.0 ± 7.6 52.0 ± 11.3

300 77.3 ± 6.4 44.9 ± 3.3

а-фракция начальной популяции микроспор, положительная окраска FDA nv-сле созревания in vitro.

b-фракция жизнеспособной двуядерной пыльцы, не имеющей генеративной клетги внутри вегетативной клетки.

влияние ЭКСТРАКТА. ПЫЛЬНИКА НА МИТОЗ В МИКРОСПОРАХ, в

предварительных экспериментах было показано, что добавление экстрактов пыльника увеличивает частоту аномальных митозов и возникновения пыльцевых зерен с аномалиями в размере вегетативных и генеративных клеток.

Тяблш» 10; Влияние экстракта пыльников на симметрию первого митоза пыльцы. В эксперименте исполыовалк микроспоры табака, изолированные на разных стадиях развития, выращенные в культуре in vitro в течение 5-6 дней. Подсчитано боле: 500 пыльцевых зерен в каждой пробе.

Размер бутона Экстракт Жизнеспособ- Симметричные

(мм) пыльников ность пыльцы", деленияъ,

(200 мкл мл'1) т (%)

8 19.6 3.9

+ 3.8 18.4

9 - 19.9 5.5

+ 3.6 63.9

10 - 56.6 2.7

. + 37.2 11.8

П - 50.6 2.2

+ 50.2 13.3

а-фракция начальной популяции микроспор с хорошей жизнеспособностью (положительная окраска FDA) пос;.; созревания в условиях in viiro.

b-фрпкш'ч жизнеспособной двуклеточной пыльцы с клетками, одинаковыми по размеру и цитологическим характеристикам.

Эти аномалии заключались в формировании двух одинаковых клеток после первого митоза в микроспорах, разнице аккумуляции крахмальных зерен в дочерних клетках и конденсация хроматина. Но во всех случаях наблюдалась потеря типичной характеристики нормального пыльцевого зерна: генеративная клетка находилась внутри (в цитоплазме) гсгетатсвноЯ клетки.

При оптимальной концентрации экстракта пыльника 250 pl/m! более, чем 50% популяции живых микроспор показали сходные аномалии деления, где клетки, формирующиеся после первого митоза микроспор, имели приблизительно одинаковые размеры и были разделены клеточной стенкой. Пыльцевые зерна, созревшие in vitro, были результатом симметричного деления микроспор и имели две клетки одинакового размера. Как показано в табл. 10, во всех случаях и па всех стадиях развитая микроспор добавление экстракта пыльника в среду для созрсвпння вызывало симметричное деление микроспор.

МОРФОЛОГИЯ и цитология ПЫЛЬЦЫ - ПРОДУКТА СИММЕТРИЧНОГО ДЕЛЕНИЯ МИКРОСПОР. В пыльцевых зернах, формирующихся после симметричного деления микроспор, обе дочерние (слетки похожи на вегетативные клетки: обе аккумулируют крахмальные зерна и обе имеют ядра одинакового размера с низким уровнем конденсации хроматина, что было показано окрашиванием с DAPJ. Но часто можно было наблюдать формирование двух дочерних клеток разного размера и с разным уровнем содержания крахмала. Однако, во всех случаях образовавшиеся дочерние клетки были разделены клеточной стенкой, что было показано окрашиванием с Calcofluor White, которая красит клеточную стенку, содержащую тюканы.

Когда популяции созревших in vitro пыльцевых зерен прорастали в среде G К, пыльцевая трубка образовывалась только в одной из дочерних клеток. Видимо, несмотря на одинаковость в размере, клетки в пыльневом зерне после симметричного деления сохраняют соответственно функции генеративной и вегетативной клетки.

В заключение, эти эксперименты показали, что гаметофитный путь развития микроспор табака не зависит ог типа деления микроспор. Вне зависимости от симметричного или ассимметричного деления микроспор гаметофитный путь сохраняется в оптимальных условиях.

ГЛАВА VI.

ИНДУКЦИЯ.ЭМБРИОГЕНЕЗА В ИЗОЛИРОВАННЫХ МИКРОСПОРАХ ТАБАКА.

Материм и метопы.

ВЫДЕЛЕНИЕ МИКРОСПОР. Для каждого экперимента использовали приблизительно 20 бутонов размером 11-12 мм. Методика изолирования микроспор описана в главе I. Культуры состояли из сравнительно гетерогенной популяции клеток, от средних микроспор до митотических, или ранних двуклеточных незрелых пыльцевых зерен (5-10% от общей популяции).

Для индукции эмбриогенеза голоданием микроспоры выделяли в среде для голодания (среда В), состоящей из 300 тМ манннтола, 20 шИ КС!, 1 mM MaSOi , 1 гаМ СаСЬ и I тМ фосфатного буфера, pli =6.8 (Kyo&Harada, Planta, 1986). Изолированные микроспоры культивировали в ',-редг В при различных температурах от 1 до 10 дней в темноте. После этого микроспоры собирали центрифугированием и ресуспевдировали в среде для эмбирногенезз (MIS), содержащей MS макро- и мнкросолн, 0.1 тМ Fe-EDTA и 250 тМ сахарозы, pli « 6.5, и культивировали при 25'С в темноте. Через 6-8 недель хорошо развитые торпедовкдные эмбриоиды переносили на упрощенную среду MS с 1% сахарозы, 1Я> активированного угля и 0.75% агара и культивировали при 25"С и световом освещении 3000 люкс для формирования растеньиц.

Микроспоры, которые предварительно обрабатывались холодом или Euccxoft температурой, выделяли прямо на среде для эмбриогенеза (MIS), и куэттуры держал!! от 1 до б шей при различных температурах, после чего

чашки с микроспорами переносили на 25'С в темноту и культивировали б-8 недель. В некоторых экспериментах микроспоры культивировали на средах С или МI.

СТАТИСТИЧЕСКАЯ ОБРАБОТКА. Проводили, как описано в главе IV.

РЕЗУЛЬТАТЫ.

ИИДУКИИЯ ЭМБРИОГЕНЕЗА В МИКРОСПОРАХ ТАБАКА ВЫСОКИМИ ТЕМПЕРАТУРАМИ. Первоначально мы изучали, может ли низкотемпературная или высокотемпературная обработка микроспор в присутствии сахарозы в среде индуцировать эмбриогенез. Для этого изолированные микроспоры культивировали в среде для эмбриогенеза (MIS) либо продолжительно при 25*С, либо при 4'С, ЗЗ'С или 37*С от одного до шести дней и потом культуры переносили на 25°С и инкубировали 3-4 недели. Процент микроспор, формирующих глобулярные эмбриоиды, был подсчитан по отношению к общей популяции после окраски DAPI. Приблизительно 20% микроспор делились и формировали проэмбриогенные структуры при температурной обработке микроспор в течение 3 дней на ЗЗ'С или 37"С, тогда как обработка холодом или инкубация при 25'С оказалась неэффективной (табл.11).

Таблица П. Влияние сред с различным содержанием сахарозы на эмбриогенез микроспор табака. Микроспоры, направленные на развитие по пути эмбриогенеза с помощью культивирования в течение 6 дней в среде юлодания (среда Б) при температуре, затем были переведены на

среда с различным содержанием сахарозы для образования эмбриоидов. Продолжительность выращивания на данных средах ирк температуре 25'С составлял? 4 недош. Частоту индукции развития эмбриоидов определяла окрашиванием DAP1, Средние величины со ставдартныму. отклонениями определяли по 4-м независимым пробам для каждого эксперимента.

Температура на Частота появления (%) эмбриоидов для различных

стадии голодания сред

в среде В

сс> MIS С М1

4 ' 13.3±0.7а 0.040.0 O.fttO.O

25 53.0±5.8 П.3±1.6а 13.9±0.2»

33 • 73.4±0.9 12.710.9° 20.И1.5*

а - спорофитнос развитие, остановившееся после 3-4 циклов деления.

Из трех сред: С, М1 и MIS, использованных для индукции эмбриогенеза, только MIS оказалась оптимальной средой. Большинство

микроспор гибли lia срсде С при всех температурах, использованных в этом эксперименте. На среде для созревания М1 микроспоры аккумулировали крахмал и развивались в зрелые пыльцевые зерна.

Эти результаты показали, что, как и в случае с Brassica napus, высокотемпературная предобработка эффективно индуцирует эмбриогенез микроспор табака.

ИНДУКЦИЯ ЭМБРИОГЕНЕЗА ГОЛОДАНИЕМ МИКРОСПОР. Микроспоры табака культивировали при 25'С в среде дли голодании В, которая не содержит сахарозу или другие источники углеводов и азот. Эта среда была использована ранее для эффективного формирования эмбрцогепиых клеток из незрелой двукяеточной пыльцы табака. После голодания микроспоры переносили в среду для эмбриогенеза MIS. Частоту «{юрмирования глобулярных эмбриоидов подсчитывали через 3-4 недели инкубации микроспор при 25*С и темноте.

Голодание микроспор при нормальной температуре 25°С индуцирует эмбриогенез с большей частотой, чем высокотемпературная обработка в присутствии сахарозы. При голодании микроспор в течение 6 дней частота эмбриогенеза достигает 50%.

ИНДУКЦИЯ ЭМБРИОГЕНЕЗА МИКРОСПОР ТАБАКА КОМБИНАЦИЕЙ ГОЛОДАНИЯ 1) ВЫСОКОТЕМПЕРАТУРНОЙ ОБРАБОТКИ. Для изучения аддитивного эффекта голодания и высоких температур на повышение частоты эмбриогенеза микроспоры культивировали в среде В при ЗЗ'С различное время до переноса клеток и среду для эмбриогенеза MIS. Было показано, что голодание и высокая температура действительно имеют аддитивный эффект. При голодании микроспор в среде В при ЗЗ'С в течение шести дней мы наблюдали частоту эмбриогенеза больше, чем 70ÎS от исходной популяции клеток (табл.И).

Следует отметить, что чем выше температура предобработки, тем меньше требуется времени для формирования эмбриогекных микроспор. Культивирозание микроспор в среде В на ЗЗ'С только в течение двух дней давало индукцию около 40%, тогда как при нормальной температуре такая частота наблюдается только через 4 дня голодания. Голодание микроспор при низких температурах (4*С) продолжительное время не давало никакого положительного эффекта.

Лимитирующим фактором для ицаухции эмбриогенеза является отсутствие сахарозы в' среде В. Все среды, содержащие сахарозу, оказались неэффективными для индукции эмбриогенеза при нормальной температуре, также как и фосфатное или азотное голодание в присутствии сахарозы. Концентрация сахарозы в среде MIS играет важную роль. Мы проверяли концентрации сахарозы от 1 шМ до 500 шМ и нашли, что 250 гаМ сахароза является оптимальной для эмбриогенеза из микроспор табака.

РАЗВИТИЕ ЭМБРИОИДОВ ИЗ МИКРОСПОР ТАБАКА. Популяция микроспор, использованная в этих экспериментах, состояла из клеток, находящихся на разных стадиях развития. Основная популяция состояла из одноядерных микроспор, но 5-10% клеток были на стадии митоза или рзшше двуклеточные пыльцевые зерна. При культивировании этих клеток в течение 6 дней в среде В при ЗЗ'С можно было наблюдать морфологические изменения микроспор, характерные для эмбриогекных клеток. Они не имели крахмальных зерен, цитоплазма находилась в центре

клетки, окаймленная вакуолями. Эти клетки слабо красятся ацетокармином по сравнению с микроспорами до голодания.

Несмотря на то, что начальная популяция была гетерогенной, индукция эмбриогенеза достигала в оптимальных условиях 70%. Остальные 30% микроспор либо гибли при голодании, либо после голодания в процессе эмбриогенеза. Не было обнаружено микроспор, которые продолжали развиваться, в зрелую пыльцу в этих условиях.

Первые спорофитные деления эмбриогениых микроспор наблюдали через 5-7 дней культивирования в среде MIS. Дальнейшее развитие этих микроспор привело к формированию глобулярных эмбриоидов через 5-6 недель инкубации культур в темноте.

Глобулярные эмбриоиды развивались в торпедообразные структуры. Поздние торпедообразные структуры регенерировали в гаплоидные растения, когда их пересаживали на агаризованную среду MS с активированным углем и 1% сахарозой. Высокая синхронность наблюдалась до образования глобулярных структур, но в дальнейшем многие эмбриоиды останавливались в развитии.

В случае о эмбриогенезом, индуцированным высокотемпературной предобработкой, наблюдалась схожая картина. Многоклеточные структуры, сформированные из микроспор, развивались асинхронно н останавливались в развитии, достигну!! глобулярной стадии. Мы us смогли получить растения из таких культур.

ГЛАВА VII.

СТРЕСС КАК ОСНОВНОЙ СИГНАЛ, КОНТРОЛИРУЮЩИЙ ПУТИ РАЗВИТИЯ МИКРОСПОР ТАБАКА IN VITRO: ВОЗМОЖНАЯ УНИВЕРСАЛЬНАЯ МОДЕЛЬ ИНДУКЦИИ ЭМБРИОГЕНЕЗА МИКРОСПОР.

Материал а методы .

. ИЗОЛИРОВАНИЕ И КУЛЬТИВИРОВАНИЕ МИКРОСПОР. Как

описано в главах I, VI,

МЕЧЕНИЕ ТИМИДННОМ ('И) И АВТОРАДИОГРАФИЯ. 1 jlCi (6-JH) тимидин (Amerhsam, USA) добавляли в I мл культуры микроспор регулярно, начиная с первого по четвертый день. После каждого добавления тимидина и мечения микроспоры промывали в среде три раза и фиксировали в растворе Кариуа (3:1). Дм микроавтораднографни микроспоры "вмонтировали" в желатннизированные предметные стекла. Стекла покрывали Itford К-2 эмульсией и проявляли одну неделю при 4'С. После проявления слайдов проявителем Kodak D19 они были окрашены DAP1 и меченые микроспоры наблюдали под флуоресцентным микроскопом.

ПРОТОЧНАЯ ЦИТОМСТРИЯ. Для определения стадии клеточного цикла микроспоры фиксировали в фиксаторе этанол : эфир (1 : 1 часть) в течение ночи. После трехкратной промывки в растворе D-2 tnM Tns-HCl,

pli = 7.5, 4 шМ MgClj, 0.5% Тритон X-JOO ir 4 mg DAPI (Partee раствор) микроспоры ресуспегщировали в 200 ml раствора и добавляли сходный объем стеклянных шариков (300 микрон размер) и интенсивно встряхивали при очень высоких оборотах для разрушения оболочки микроспор и освобождения ядер. Супернатант, состящий из ядер и других мелких частиц пыльцы использовали для измерения клеточного цикла с помощью проточной цнтометрии. Проточный цитометр, оснащенный PAS 2 arc лампой (Partee, Germany), был использован в этих экспериментах. Измерения проводили, используя комбинацию фильтров, оптимизированных для определения DAP1 окраски. В каждом эксперименте было измерено минимум 105 ядер.

ОКРАШИВАНИЕ МИКРОСПОР. Проводили, как описано в главе VI.

СТАТИСТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ. Как описано в главе VI.

РЕЗУЛЬТАТЫ.

ГОЛОДАНИЕ ПРИ НОРМАЛЬНЫХ II ВЫСОКИХ ТЕМПЕРАТУРАХ НЕОБРАТИМО БЛОКИРУЕТ ГАМЕТОФНТНОЕ РАЗВИТИЕ МИКРОСПОР ТАБАКА. Изолированные микроспоры, культивированные в богатой среде, продолжают нормальное развитие и формируют зрелые фертнльные пыльцевые зерна при 25'С. Голодание микроспор при высоких температурах блокирует нормальное развитие и микроспоры развиваются по спорофитному пути с формированием эмбриоидов и гаплоидных растений (глава VI).

Для изучения необратимости блокирования нормального развития микроспоры, инкубированные при разных температурах в среде В в течение 2 дней, переносили в среду М1 для нормального гаметофитного развития и через 5 дней культивирования анализировали под инвертированным микроскопом. Почти все микроспоры, голодавшие при 4°С от 2 до 6 дней, продолжали нормальное развитие, когда их переносили в среду М1, т.е. голодание яри низких температурах не блокировало гаметофитную программу развития микроспор. Пыльцевые зерна могли прорастать в среде GV (среде прорастании). Оциако, когда микроспоры голодали в среде В при 25°С или ЗЗ'С два дня и потом были перенесены в среду М1, наблюдали две субпопуляции клеток: зрелые пыльцевые зерна и маленькие вакуолизнрованные клетки без крахмала, что является характерной чертой эмбриогенных микроспор. С продолжением времени и повышением температуры голодания частота возникновения таких микроспор увеличивалась (табл. 12).

Эти результаты показали, что индукция эмбриогенеза в изолированных микроспорах табака голоданием является необратимым процессом. Индуцированные микроспоры не могут продолжать гяметофитный путь развития, но развиваются по спорофитному пути с образованием эмбриоидоз в оптимальных условиях. Эти данные также показали, что, хотя необратимое ингабирование гаметофитной программы и является обязательным, но оно недостаточно для реализации эмбриогенного потенциала микроспор, для чего необходимы оптимальные условия.

Таблица 12. Блокирование гаметофитного развития микроспор углеволным голоданием.

Голодание (среда В) Частота образования эмбрноидов в среде MIS (% ± ст.ошибка) Змбриогенная пыльца в среде М i <%)

температура ('С) время (дни)

4 2 10.9 ± 0.4 7.0

6 13.3 ± 0.7 11.9

25 2 7.7 ± 1.5 25.7

6 53.0 ± 5.8 65.9

33 2 42.5 ± 1.6 64.5

6 73.4 ±0.9 77.9

ПУТИ ДЕЛЕНИЯ МИКРОСПОР ПРИ ИНДУКЦИИ ЭМБРИОГЕНЕЗА. Популяция микроспор, использованная в этих экспериментах, состояла из клеток разных стадий развития. Основная популяция состояла из одноядерных микроспор, хотя мнтотические и ранние двуклеточные пыльцевые зерна также присутствовали в небольших количествах. Когда эта популяция культивировалась in vitro в среде Ml, почти все микроспоры делились асснммстрична в течение первых суток и развивались в нормальные пыльцевые зерна. Однако, когда микроспоры культивировали 6 дней в среде В при 25"С или ЗЗ'С, приблизительно 50% микроспор делились, что показала окраска с DAPi. Большинство делений было ассимметричным с образованием вегетативной и генеративной клеток, но с низкой частотой встречались также клетки с двумя ядрами одинакового размера, что является продуктом симметричного деления. Все эти процессы наблюдаются первые два дня голодания в среде В, и в последующие дни картина не меняется.

ИЗМЕНЕНИЯ В КЛСТО'ШОМ ЦИКЛЕ Б ПРОЦЕССЕ ФОРМИРОВАНИЯ ЭМИРИОГЕИНЫХ МИКРОСПОР. Результаты, полученные выше, позволяют предположить, что мы имели две субпопуляции в начале голодания микроспор. Около 50?» микроспор, возможно, прошли контрольную точку в G2 фазе клеточного цикла и в процессе голодания заканчивал» клеточный цикл митотическим делением о первые дни культнвнрования in vitro. Остальная популяция была заблокирована п определенных точках клеточного цикла до митоза и, следовательно, не могла делиться даже после продолжительной иикуЗашш в среде В.

Для более тонкого исследования клеточного цикла в процессе формирования эмбркогенных микроспор использовали единичные бутоны размером 10-11 мм, состоящие только из гомогенных микроспор на G1 «¡»азе клеточного цикла, что было определено с использованием проточного интофотомстра (ркс.8). Эти микроспоры инкубировали п среде В при ЗЗ'С.

Каждый день в чашки Петри с микроспорами добавляли РН| тнмндин в Течение четырех дней инкубации, после чего клетки фиксировали и проявляли. Меченые ттццжоы микроспоры считали под микроскопом (табл.13).

Таблица 13. Радиоактивное мечение тимндином микроспор, культивируемых в условиях голодания. Высокогомогенную популяшно микроспор табака изолировали на G1 фазе клеточного никла, культивировали в среде В при ЗЗ'С в течение различного времени. [3Н| тнмидин (время распада 24 часа) добавляли в среду изначально и каждый следующий день для радиоактивного мечения ядер микроспор.

Жизнеспособность Мечение (3Н| Двуклеточная пыльца

микроспор» тимидином

(%) (% от жизнеспособ- (%)

нах клеток)

день О день 1 день 2 день 3 день 4

n.d. 82.7±0.6 8б.2±1.3 79.3+1.6 87.5±1.9

71.9± «.5 10.5 ± 0.5 8.3 ± 1.1 0.3 ± 0.3

0.4 ± 0.2 7.0 ± 0.3 * 6.2 ± 1.2 7.3 ± 0.9 10.5 ± 2.Q

а - визуально оценивали с помощью микроскопа

i „ . ■> i .jlja

О О 100 >0« »«» «ее »»о СЫА HUATHt FtUOStSCfHCi WTVXStrf

Рас. S. Профессия клеточного цикла в изолированных микроспорах табака процессе голодания.

Часть микроспор, ¡иктых в начале и в процессе голодания, красили также ОЛР1 и использовали для анализа под флуоресцирующим микроскопом, а также для определения количества ДНК в ядрах с помощью проточной цитометрии. Эти эксперименты показали, что все живые микроспоры прошли Б фазу клеточного цикла в первые два дня культивирования, но были заблокированы на 02 фазе, т.е. голодание микроспор на 01 фазе клеточного цикла приводит к их синхронизации на 02 в конце пернола голодания.

НУТ» ВОЗНИКНОВЕНИЯ ЭМБРИОВДОВ ИЗ МИКРОСПОР. Как

было отмечено выше, начальная популяция микроспор для культивирования всегда состоит из клетск на разных стадиях клеточного цикла. После шести дней голодания микроспор в среде В можно было наблюдать одноядерные микроспоры и микроспоры с двумя разными (вегетативного и генеративного типа) или 'одинаковыми (вегетативного типа) ядрами. Частота эмбриогенеза из таких культур превышала 70%, что выше, чем любая субпопуляция микросопр. Это говорит о том, что эмбрноиды формируются из всех типов эмбриогенных микроспор, независимо от количества и типа ядер и них.

Микроскопический анализ эмбриогенных культур через пять дней показал, что все типы микроспор мо!уг делиться и формировать, по крайней мсое. ыиогак-леточные структуры.

ГЛАВА VIH.

ЭМБРИОГЕНЕЗ В МИКРОСПОРАХ ПШЕНИЦЫ, ИНДУЦИРОВАННЫЙ ГОЛОДАНИЕМ И ВЫСОКОЙ ТЕМПслАТУРОЙ.

Мстс, нал и методы,

РАСТЕНИЯ-ДОНОРЫ. Семена нескольких сортов (Capo, Julius, Pokal, Aurus, Ferdinand, Uxpert, Extrem) и FI-гнбридои Capo x Super И Super х Capo, полученных от австрийской компании Probsdorfer Saatzucht Gcs.m.b.H., выращивали в климатических камерах при 15"С с длиной дня 16 часов и интенсивности света SOO ME. Все семена были яровизированы 2 месяца при 4'С до пересадки на 15'С.

ПРЕДОБРАБОТКА ПЫЛЬНИКОВ Ц КОЛОСЬЕВ. Свежесрезанные колосья, содержащие микроспоры на поздней одиоядреной стадии, были поверхностно простерилизованы опрыскиванием 70% этанолом. Для предобработки колосьев два-три колоса помещали внутрь 10 см чашек Петри, куда помещали также открытую чашку Петри диаметром 3 см со стерильной водой, чгобы поддерживать влажность. Чашки Пегри заклеивали парафильмом и инкубировали при разных температурах в темноте.

Пыльники, изолированные в стерильных условиях из каждых двух колосьев, помещали в 1,5 мл среды В для голодания и культивировали при различных температурах с разной продолжительностью.

ИЗОЛИРОВАНИЕ И КУЛЬТИВИРОВАНИЕ МИКРОСПОР.

Микроспоры изолировали из предобра бота иных или свежих пыльников встряхиванием пыльников в среде В с помощью магнитной мешалки 2-3 минуты при высоких оборотах. Суспенизию микроспор пропивали 3 раза в среде В центрифугированием 5 минут при 100 х g, после чего культивировали в 1 мл среды А2 для индукции эмбриогенеза при плотности 1-2 х 104 клеток на 1 мл среды.

Среда А2 была кондиционирована кокультивацией с 3-4 завязями, выделенными из тех же колосьев, которые использовали для изолирования микроспор.

Образовавшиеся эмбриоиды' были перенесены через 28-30 дней на среду А2Я для регенерации, и чашки с культурами инкубировали на свету (3000 люкс) при 25*С.

Для центрифугирования по градиенту Перколла по 1 мл суспензии микроспор осторожно наслаивали на поверхность градиента Перколла (10%/20%/30% Перколл в 3,3 х конденсированной среде В, 2 мл каждый слон) н центрифугировали 5 минут при 450 х Каждую полоску, образовавшуюся после центрифугирования осторожно собирали, ресуспензировали в среде В, промывали 2 раза ■ центрифугированием (5 мин. при 100 х в) И культивировали в 1 мл среды А2 с завязями при 25'С в темноте. Частоту образования многоклеточных структур и глобулярных эмбриоидов определяли через 14 и 28 дней культивирования микроспор в среде А2 с помощью окраски в красителе ОАР1.

РЕЗУЛЬТАТЫ.

ГОЛОДАНИЕ И КУЛЬТИВИРОВАНИЕ МИКРОСПОР, СВЕЖЕИЗОЛНРОВАННЫХ ИЗ РАСТЕНИЙ-ДОНОРОВ. Начальные эксперименты проводились с микроспорами, выделенными прямо из растений-доноров без всякой предобработки. Для этих опытов были использованы три сорта и один Р1 гибрид. Проверяли эффекты различных факторов, включая температуру при голодании, продолжительность голодания и среду для голодания. Во всех вариантах микроспоры гибли через несколько дней, за исключением условий, когда они голодали при 4°С. В этом случае микроспоры не изменялись по морфологическим и цитологическим характеристикам и после переноса на среду с сахарозой продолжали нормальное развитие с аккумуляцией крахмала. Несколько делений наблюдали в микроспорах, голодавших при ЗЗ'С, но эти структуры не развивались дальше.

ГОЛОДАНИЕ ПЫЛЬНИКОВ ДО ВЫДЕЛЕНИЯ МИКРОСПОР. Из литературы известно, что при культивировании изолированных пыльников ячменя и пшеницы в жидкой среде наблюдается спонтанное высвобождение микроспор в среду и частота эмбриогенеза коррелирует с частотой высвобожденных клеток.

В начальных опытах мы исследовали влия!гае голодания и температуры на частоту высвобождения микроспор из пыльников пяти сортов пшеницы. Спонтанное высвобождение микроспор, увеличенных в размере, было значительно выше из пыльников, кульгиварованных 4 дня в среде В при ЗЗ'С по сравнению с 25'С у всех сортов, тогда как очень низкую частоту наблюдали у пыльников, инкубированных при 4*С,

Максимальное количество и> 234 микроспор, увеличенных в размере, высвобождалось у сорта Julius, где в одном пылышке находится 1420 микроспор. При оптимальных условиях: голодание пыльников о течение 4 дней в среде В при ЗЗ'С, частота высвобождении микроспор не отличается сильно от сорта к сорту. Микроспоры, увеличенные в размере, были одноядерными или диумдернымм, имели позитивную окраску на жизнеспособность, были вакуолизиропаиы н не имели крахмальных зерен. Цитоплазма микроспор с ядром или ядрами находилась при этом в центре клетки, окаймленная вакуолями. Эга характерная черта ранее наблюдалась в микроспорах табака (глава VI и VII) и является типичной для эмбрногекных микроспор,

Тиблици 14. Влияние температуры, среды и голодания при кулътиииронашш пыльников на индукцию эмбриогенеза микроспор пшеницы. Изолнроиаиные пылышки культивировали в среде голодания В при различной температуре. После 4 или 8 дней микроспоры механически изолировали и культивировали и срсдс А2, содержащей завязи в течение 14 дней до начала формирования многоклеточных структур, определяемых путем окрашивания DAPJ. Средние значения со стандартным отклонением определяли в 4-х независимых экспериментах.

Сорт Температура в процессе голодания ОС) Многоклеточные структуры (%) в среде А2

4 дня голодания 8 дней голодания

Capo 4 0.4±0.2 0.1±0.1

25 0.9±0.4 3.9±2.0

33 8.7±0.7 0.2±0.2

Julius 4 1.0±0.5 1.0±0.4

25 5.8±3.3 8.4±2.4

33 10.2±0.9 2.4±1.2

Pokal • .4 1.7Ю.2 1.4±0.1

25 2.1±0.6 7.2±1.3

33 9.9±2.1 2.610.3

В последующих экспериментах исследовали образование эмбриоидов из этих микроспор. Изолированные пыльники сортов Capo, Julius и Pokal культивировали в среде В для голодания 4 или 8 дней при температурах 4'С, 25'С или ЗЗ'С, после чего микроспоры выделяли встряхиванием пыльников в среде А2. В дополнение к спонтанно высвободившимся микроспорам этот меюд позволяет эффективно выделять все микроспоры из пыльников. Изолированные микроспоры культивировали при 25"С в среде А2 с заиязью и через 28-30 дней анализировали частоту индукции мюгоклеточнмх сгруктур и эмбриоидов окраской с DAPI. Как было

показано ранее, голодание пыльников 4 или 8 дней при 4'С не ингибнровало нормальное гаметофитиое развитие микроспор. Они аккумулировали крахмал и гибли через несколько дней инкубации в среде А2 (табл. 14). Похожая ситуация наблюдалась после голодания пыльников в течение 4 дней при 25"С, за исключением сорта Julius, который формировал сравнительно высокий процент эмбриоидов. Индукция эмбриогенеза повышалось во всех случаях, когда голодание пыльников продлевалось до 8 дней при 25'С. Голодание пыльников в течение 4 дней при 33'С повысило индукцию эмбриогенеза значительно для всех сортов с низкой вариацией этого показателя от сорта к сорту (9-10%). Таким образом, голодание пыльников в течение 4 дней а среде В при . ЗЗ'С является самым оптимальным для формирования эмбриогенных микроспор пшеницы (табл.14).

ГОЛОДАНИЕ КОЛОСЬЕВ. Третью серию эксперименте!! проводили с целью изучения эффекта голодания при разной температуре на колос. Повсрхиостностерилизованныо колосья на разных стадиях развития микроспор от одноядерной до ранней двуядерной пыльцы помещали в чашки Петри диаметром 10 см, сохраняя влажность и инкубировали при 4'С, 25°С и ЗЗ'С четыре или восемь дней. После каждой предобработки выделяли пыльники из колосьев и микроспоры изолировали встряхиванием пыльников с помощью магнитных мешалок.

Частоту деления микроспор, определяли через две недели культивирования окрашиванием DAPI. Образовавшиеся эмбрноиды переносили через 28-30 дней на среду для регенерации.

Как н в случае с предобработкой пыльников, эмбрноиды формировались у всех генотипов. Индукция эмбриогенеза строго зависела от стадии развитая микроспор.

Эмбрноиды были получены из поздних одноядерных микроспор или ранних двуядерных пыльцевых зерен, но никогда из ранних или средних микроспор. ■

Как и в экспериментах с пыльниками, температура и время голодания оказались очень важными факторами для блокирования гаметофитного развития (определенного наличием крахмала в клетках) и формирования эмбриогенных микроспор.

Микроспоры, изолированные из колосьев при 4°С, не были способны к спорэфиткому делению и гибли через несколько дней в среде А2. Низкая частота образовать эыбркоидоэ наблюдалась в микроспорах, выделенных из колосьев, предобработанных в течение 8 дней при 25*С. Однако, наиболее высокая частота индукции эмбриогенеза была получена из микроспор, изолированных из колосьев после предобработки в течение 4 дней при ЗЗ'С.

Хотя эмбрионды были получены у всех сортов, их частота различалась ст сорта к сорту. В оптимальных условиях у сорта Julius было получено около 32% индукции эмбриогенеза через 14 дней а среде А2, кондиционированной завязями, тогда как у сорта Capo только 7% микроспор делились и формировали эмбрноиды (табл. 15),

Зй

Таблица 15. Влияние температуры, поддерживаемой в процессе голодания колосьев, на индукцию эмбриогенеза микроспор пшеницы. Свежесрезанные колосья выдерживали при различной температуре в течение 4 н 8 дней. Затем изолировали микроспоры, культивировали вместе с завязями в течение 14 дней в среде А2. Многоклеточные структуры определяли путем окрашивания ОАР1. Средние значения со стандартным отклонением определены но 4-м независимым экспериментам.

Сорт Температура в процессе голодания СС) Многоклеточные структуры (%) в средс А2

4 дня голодания 8 дней голодания

Capo 4 1.2±0.9 0.5±0.4

. 25 0 4.6+0.2

33 6.7±5.1 0

Julius 4 0 2.Ш.1

25 0 8.4±2.4

33 32.5±3.6 1.8±1.2

Capo х Super 4 0.3±0.2 0.6±0.4

25 1.3±0.6 7.8±2.0

- 33 17.1±2.7 0.9±0.б

ФРАКЦИОНИРОВАНИЕ ЭМБРНОШ1НЫХ МИКРОСПОР ЦЕНТРИФУГИРОВАНИЕМ В ГРАДИЕНТЕ ПЕРКОЛЛА. Две субпопуляции микроспор наблюдали после голодания пыльников через 4 дня культивирования вереде В при ЗЗ'Сг мелкие клетки с плазмолизнрованной цитоплазмой н большие клетки с цитоплазмой в центре, окаймленной вакуолью, что характерно для змбриогенных микроспор. Мы предположили, что такая большая разница в размерах позволит использовать фракционирование центрифугированием г граднегче Перколла. Три фракции били получены после центрифугирования в градиентах Перколла 10%, 20% и 30%. Все фракции, образующие четкие полоски между 0/10%, 10%/20%, 20%/30% были осторожно собраны в отдельные пробирки и после двукратной промнзки культивировались в среде А2 с завязям» при 25'С в темноте. Чаг. оту многоклеточных структур и эмбриоидов определяли соотиетственно через 14 и 28 дней культивирования. Контрольную популяцию микроспор без фракционирования культивировали в сходных условиях (табл. 16).

Тя?лицз 16. Индукция эмбриогенеза у микроспор пшеницы, отобранных с помощью градиента Перколла. Изолированные пыльники культивировали и условиях голодания в среде В при ЗЗ'С в течение 4-х дней. Из полученных пыльников изолировали микроспоры и очищали с помощью градиента Перколла (10, 20, 30% РегсоН в З.ЗХВ среде) и переносили в среду А2, содержащую завязи. Частоту появления многоклеточных структур н зародышей на стадии глобулы определяли по истечении 14 и 30 дней культивирования, соответственно. Средние значения со стандартным отклонением определены по 4-м независимым экспериментам.

Сорт Фракция в Перколле Многоклеточные структуры {%) Зародыши на стадии глобулы (%>

Capo 0/10 10/20 20/30 неочищенные 32.5 ± 3.4 1.2 ±0.9 0 2.4 10,4 + 3,5 0 0 0.1 ± 0.1

Julius 0/10 10/20 20/30 носчшцсннне 49.2 ± 4.7 0.5 ± 0.4 0 7.9 ± 3.2 21.9 + 3.8 0 0 0.7 ± 0.3

Pokal 0/10 10/20 20/30 неочищенные 29.8 ±2.9 0.7 ± 0.5 0 3.7+ 1.2 9,8 + 2.5 0.1 ±0.1 0 0.1 ±0.1

Высокогомогенная популяция жизнеспособных больших микроспор была получена у всех' видов а фаз? между средой к' 10% Перко,1том, тогда как другие полоски содержали з основном нежизнеспособные маленькие клетки. При культивировании в среде А2 около 44% микроспор сорта Julius делились ?! образовывали многоклеточные структуры. У двух других сортов частота слорофитога деления достигала около 3096, что в десять раз выше, чем и контроле *гз фракционирования. Спустя 20-30 дней тясячи (22% хультивириеашгах микроспор) эмбрчоидов были получены в каждой чашке Петри у сорта Julius, тогда гак у двух других видов 10% микроспор формировали эмбрлооды.

Опыты, проведении!' с другими сортами (Extrem, Ferdinand, Aurus, Expejt), дали сходные результат.^. После переноса эмбриоидсв на среду дня регенерации около 60% зчбриоилов развились в растения. Частота регенерации не orntviv.sch значительно от сорта к сорту, но отношешм зеленых растений к альбиносам здр-чсгло от генотипа. Около 70'о растений, пслучгк-чх г.з микросьср сорта Ferdinand, были зелеными, тогда как только альбиносы были получены у с-рта Julius.

ВЫВОДЫ

1. Показан стимулирующий эффект флаванолов и стероидов на развитие пыльцы и пыльцевой трубки табака. Ннгибированйе флавонолов путем генетических манипуляций приводит к регулируемой мужской стерильности табака и петунии.

2. Впервые описан новый сигнальный путь при прорастании пыльцы табака, регулируемый и активируемый MAP (mitogen activated protein kinase) киназами.

3. На основе системы созревания микроспор табака в условиях in vitro до зрелой фертилыюй пыльцы разработана новая технология трансформации цветковых растеннй - mate germ line transformation (MAGELITR). Эта технология имеет огромный потенциал и может быть применима для широкого круга цветковых растений.

4. Впервые показана возможность селекции пыльцы в процессе развития мужского гаметофита in vitro с использованием генной инженерии. Эта система можег использована для создания сортов, устойчивых к солям, тяжелым металлам и др.

5. Выдвинута гипотеза об универсальности стрессовых факторов в регуляции развития микроспор высших растений. Детально изучены эффекты различных стресс-факторов.

6. Впервые разработана эффективная система эмбриогенеза из изолированных микроспор табака, что позволяет использовать эту модель для изучения механизма эмбриогенеза высших растений.

7. Показано, что первое гаплоидное деление микроспор не определяет программу развитии K:;fcjiocnop. Зрелая пыльца табака может формироваться даже после первого симметричного гаплоидного митоза.

8. Впервые показана стимулирующая роль высокотемпературной обработки в комбинации с голоданием для индукции эмбриогенеза из микроспор пшеницы. .

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Биотехнология пыльцы, описанная в данной работе, может быть применима ко всем важнейшим сельскохозяйственным культурам, имеющим половой цикл размножения.

2. Комплексное применение методов, разработанных в данном труде, позволит эффективное манипулирование геномом растений и значительно сократит время для выведения улучшенных сортов и видов.

3. Новый метод трансформации растений MAGELITR запатентован во многих странах мира и в настоящее время с успехом применяется в генетической инженерии растеннй.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ НО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:

Обзорные статьи

1. Heberle-Bors, Е., Stoeger, Е., Toaraev. A.. Zarsky V. and Vicente, О. In vitro pollen cultures: //Progress and perspectives ( a review) In: I'ollen Biotechnology, eds.: Mohapatra S.S., Knox B.R., (Chapman & Hall), -1996, --P.85-I09.

2. Touraev. A.. Vicente, O. and Heberle-Bors, E. Initiation of microspore embrvogenesis by stress ( a review). //Trends in Plant Sciences, -1997, -V.2, -P.28S-323

3. Touraev, A. and Shamina, Z. Cotton pollen culture in vitro (a review). II In. "Biotechnology in Agriculture and Forestry'", ed.Y.P.S.Bajaj. ( Springer Int.), (in press)

Ci-i n.u ft »ypretnax

4. Touraev, A.M.. Moon, A.N., Shamina, Z.B., and Butenko R.G. The isolation, fractionation and culture of cotton microspores in vitro. //Dok.Acad.Nauk.SSSR, -1990, -T.311, -C.371-373

5. Ylstra, B., Touraev. A- Benito-Moreno, R-M., Stoeger, E., van Tunen, A.J..Vicente, O., Mol, J.N.M. and Heberle-Bors, E. Flavonols stimulate development, germination artd tube growth of tobacco pollen. //Plant physiol., -1992, -V.100, -P.902-907

6. Touraev. A.M.. and Shamina, Z.B. Cotton microspore culture in agarose. //Sov. Plant Physiology,-1993, -T.40, -C.319-322

7. Touraev. A., Lezin, P., Heberle-Bors, E., and Vicente, O. The maintenance of gamctophytic development after symmetrical division from in vitro cultured tobacco microspores.//Sex. Plant Reprod. ,-1995,-V.8, 70-76

8. Ylstra, B., Touraev. A.. Brinkmann, A., Heberle-Bors, E. and van Tunen A.J. Steroid hormones stimulate germination and tube growth of in vitro matured tobacco pollen. //Plant Physiol., -1995,-V.107,-P. 639-643

9. Touraev. A.. Ilham, A., Vicente, O. and Heberle-Bors, E; Stress treatments efficiently induce microspore embryogenesis in tobacco: a model system for molecular studies, //in: "Recent Advances in Plant Biotechnology". Proceed.Symp., Mitra, Slovak Rep. October 2-6, -1995,-P.. 27-31

10. Ipjiraey^A., Fink, Ch., Stoeger, E. and Heberle-Bors, E. Pollen selection: a transgenic-reeonslnietion approach. //Proc.Natl.Acad.Sci.USA, -1995,-V,92,-P. 12165-12169

11. Tpjjniev,_A., Ilham, A., Vicente, O. an<l Heberle-Bors, B. Stress induced microspore embryogenesis from tobacco microspores: an optimized system for molecular studies. //Plant Cell Repts.,-1996,-V.15, -P.561-565

12. Toaraev, A.. Indrianto, A., Wratscko, I., Vicente, O. and Heberle-Bors,E. Efficient microspore embryogenesis in wheat (Triticum afstivum L.) induced by starvation at high temperatures. //Sex.Plant Repr. -1996, -V.9, -P.209-215

13. Touraev, A.. Pfosser, M., Vicente, O. and Heberle-Bors, E. Stress as the major signal controlling the developmental fate of tobacco microspores: towards 3 unified model of induction of pollen embryogenesis. //Planta, -I9S6,-V.200,-P.144-152

14. TorcrHsy1_A., Stoeger, E., Voronin, V. and Heberle-Bors, E. Plant male germ iine transformation. //Plant J., -1997, -V.I2, -P.949-956.

15. Wilson, K., Voronin, V., Touraevj A,, Vicente, O. and Heberle-Bors, E. A developmentally regulaled MAP kinase activated by hydration in tobacco pollen.//Plant Cell,-1997,-V.9.-P.2043-2I00.

16. Touraev. A. and Heberle-Bors, E. Microspore embryogenesis and in vitro pollen maturation in tobacco.//In: " Plant Cell Culture Protocols", Humana Press,-1997 (in press)

Тезисы

17. Toiiraevj-A^ Shamina, Z.B. and Butenko, R. C. Cotton pollen culture in vitro. //Abst. Ylith Intern.Congr. on Plant Tiss. and Celt Culture, Amsterdam, Netherlands, June 24-29,-1990, -P. 202.

18. Touruej^A. and Shamina, Z. B. The regulation of male gemetophyte development iti vitro. // In: Proceed, of 2-All-Union Symposia on developmental genetics, Tashkent, August 29-31,-1990,-P.24-25

19. Ylslra, В., Touraev. A- Benito-Moreno, R-M., Stoeger, E., van Tunen. A.J., Vicente, O., Mol, J.N.M. and Heberle-Bors, E. Flavonols stimulate development, germination and tube growth of tobacco pollen. //Abst. Intern. Workshop ''Molecular Conlrol of Flower Development & Plant Reproduction. Amsterdam, The Netherlands, 12-16 April 1992, -1992, -L.29

20. Heberle-Bors, E., Garrido, D., Eiiwenberger, E., Fuckercider, В., Eller, N., Tourney, A.. Pfosser, N1., Wilson, C„ Zarsky, V. and Vicente, O. Pollen culture for in ritra pollen development and in vitro pollen embryogenesis. / /Abst. XV International Botanical Congress, Yokohama, Japan, Aug.28-Sc-pt.3.-S933, -P.I87.

21. Toiiraeyj_Aj, Fink, Ch., Stoeger, E., Vicente, О and Heberle-Bors, E. Tobacco microspore maturation, embryogenesis and transformation: news for an old story. //Abst. Intern, Congress Plant Tiss. and Cell Culture., Fircnze, Italy, .June 12-17. -1994 -P.35

22. Touraev, A. (1994) Improved embryogenesis from tobacco microspores. //Agriccll Reports. -1994,-V.7, -P.4.

23. Touraev. A.. Fink, Ch., Stoeger, E. and Heberle-Bors, E. Germ line transformation in plants. //Abst. 3-Inl. Cong, of Plait Mol. Biol. Amsterdam, Netherlands, June 19-24,-1994,-P.452.

24. Touraev. Д.М. llham, A. , Heberle-Bors, E. and Vicente, O. Highly efficient tobacco microspore embryogenesis induced by sugar starvation or heat shock. Abstr. of 13lfc Intern.Congress on Sexual Plant Reproduction, Vienna. Austria, July 10-14,-1994,-P.17.

25. Stoeger, E., Fink, Clt., Touraev. A. and Heberle-Bors, E. Pollen Biotechnology. Abstracts of!3th Intern.Congress on Sexual Plant Reproduction , Vienna, Austria, July 10-14,-1994,-P. 71.

26. Fink, Ch., Touraev, A.. Stoeger, E. and Heberle-Bors, E. In vitro pollen selection. Abstracts o03th Intern.Congress on Sexual Plant Reproduction, Vienna, Austria, July i 0-14, -1994, -P. 151.

27. Touraev. A.. Stoeger, E., Fink, Ch. and Heberle-Bors, E., Germ line transformation in plants. Abst. oft 3th Intern.Congress on Sexual Plant Reproduction, Vienna, Austria, July 10-14,-1994,-P.J53.

28. Vanzini, A., Amien, S., Touraev. A. and Heberle-Bors, E. Transformation of isolated winter wheat microspore by particle bombardment. //Abst. of "lACongresso nazionale Biotechnologia", Bologna, 6-9 September. -1995, -P.2.2.

4L

29. Heberle-Bors, E., Touraev. A.. Stoeger, E. and Fink, Ch. Microspores as targets for transformation and selection. //Abst. of the I4'1' International Congress ofSexual Plant Reproduction, Lome, Victoria, Australia, February 18-23, -1996, -P.20.

30. Touraev. A.. Iridrianto, A., Vicente, O. and Heberle-Bors, E. Efficient embryogenesis from isolated tobacco and wheat microspores. Abstracts of the 141" International Congress of Sexual Plant Reproduction, Lome, Victoria, Australia, February 18-23,-1996, -P.U5.

31. Touraev. A. Stress induced microspore embryogenesis. //Agricell Reports, -1996 -V.12.-P.3

32. Indrianto, A. Heberle-Bors, E. and Tomraev, A. Wheat microspore embryogenesis. //Plant embryogenesis workshop. Hamburg, September 12-14,-1996,.

33. Touraev, A, and Heberle-Bors, E. Stress induced microspore embryogenesis in higher plants. Plant Embryogenesis Workshop, Hamburg. September 12-14,-1996.

34. Weingarter, M., Boegre, L., Tourgevj^Aj and HeberJe-Bors, E. Ectopic expression of a truncated mitotic cyclin during microspore development in tobacco plants. //Abstract N1252 of 1997 Annual meeting of ASPS and CSPC, Vancouver, BC, Canada, August 2-6, -1997, -P. 244.

35. Tourney. A.. Ottenshlager, I., Dahl, M. and Heberle-Bors, E. Green fluorescent protein as a marker to study pollen development. //Abstract N1235 1997 Annual meeting of ASPS and CSPC, Vancouver, BC, Canada, August 2-6,-1997, -P. 241.

Тураев Алпшер

"Ënnrç уруглп yciiM.'üiK.iup чаипшинг молекуляр iwermcacii ва биотехнологняси"

Ушбу диссертацияда усимликлар бнртехнологиясида япги булгай йупалиш - уснмлик чанги биотехнологняси назарии асосланган ва амалий ишлаб чнцилган. Тажриба маълумотлари флаваиоллар, стероидлар ва МЛП-кииазанииг тамаки эркаклнк гаметофитишшг ривожланишндаги.ижобии ролини курсатди.

Ушбу ишда ёзилган in vitro шароитида чатнинг ривожланиш тизями, эркаклик гаметофитн даражасида мухпм бедгиларга эга булган уникал рекомбинаитларни яизда эффективрок таплашга нмкон бериши геи-мархерлар ёрдамида курсагиб берилди. Бу система усимликларни трансформация килишнинг янгн усулларнии яратишда, айникса эркаклик г аметофи riiHit трансформация килишда (MAGELITR) му,%ш>< хнсобланадн. Бу усул маьлум техиологияларга ннсбэтаи бир >çaiop уиикзя устунлпкларгл эга, яъни MAGELITR генотип! a sa регенерация жараёнига богл-.щ змас, сомаклоиал вярнацияларга олиб келмапди »а ампяда !$длаш учуй »¡улайдир. Усул асосий rçmimorç хужалиги усимлшгляринн трансформация Ь'илишда ^ухтапиши мумкин.

Олдинрок, Ю!;орн уснмтшкларшшг аи;ратиб олинган микроснораларкии in vitro шароитида устириш лапомида эибрногеиезиинг индукцияси имкомиятлпри курсатилган эди. Ушбу йу.ч билаи олиягян tаилоидяар в? уляриннг асосидя олши ли липлоидлар

гомгозиготали купгииа ицтасодий му^им усимликларни танлашда асосий роль уйнайди. Бу ишда тамакинииг ажратиб олинган микроспораларида эмбриогеиезнинг индукциясини чегараловчи факторлар топилган. Углеводларнинг етишмаслиги ва ало}ида юцори температура таъепр 1{нддлрнш еки уларшшг комбинация»! микроспора ривожланишиии батамом тухТатади ва эмбриогенез индукцияси жараёиига эффектив таъсир курасатади. Ушбу стресс-факторларшшг универсаллиги бутдон ва туза усимликларида утказилган кейинги тажрнбаларда курсатилди,

Усимлик чанги биотехнологиясига богашлангаи бу диссертация, яиги ва прогрессив технология булиб, иктисодий мухим цлшлоц хужалик уснмликларини тубдан жшилашда кеиг фойдаланилишн мумкин.

Touraev AUslier "Molecular genetics and biotechnology of angiosperm pollen"

The new system of plant biotechnology - pqJJen biotechnology is established and described in great detail. The isolated microsp[ores of higher plants can be cultured in vitro until maturity and seeds can be obtained after pollination of the receptive stigmas with in vitro matured pollen. Several compounds namely flavonols and steroids have been shown to play an important role during the development and germination of tobacco pollen. The efficient in vitro maturation system established for tobacco microspores has been used for in vitro selection and plant transformation, which is called male germ line transformation (MAGELITR). MAGELfTH is fast, genotype and regeneration independent method which should be applicable for the wide range of important crop ipecies.

The second unit of pollen biotechnology is the induction of cmbryogenesis and haploid plant formation from isolated microspores cultured *д vitro. Using tobacco as a model object is was shown that stress factors - starvation and/or heat shock efficiently block the gametophytic pathway and induce cmbryogenesis in isolated uninucleate microspores. Further studies using important species - wheat and cotton have shown the university of these triggers.

Pollen biotechnology described in this thesis is the new and advanced technology which can be of great use in improving economically important crops.

Подписано к печати Л.О.

05.1998 г. .

Формат 60X61'/к- Бумага типографская.

Печать «РОТАПРИНТ» Объем т„раж 100 экх

Заказ № 855

Типография издательства «Фан* ресиуб.шки Узбскчсм».

700170. Ташкент, пр. академика X. ДОдуллаева, 7i).