Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Андроклиния и ее особенности у пшеницы

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Суханов, Вячеслав Михайлович

ЕВВДЕНИЕ.;.

1. ШШВДИЯ В ГЕНЕТИКЕ И СЕЛЕКЦИИ,

I.I. Гаплоиды и их использование. . ^

Г;2. Получение гаплоидов in vivo .II

1.3. Получение гаплоидов in vitro • . . т.

1.3.Iv Получение гаплоидов в культуре завязей и семяпочек.

1.3 ;2; Получение андроклинных гаплоидов в культуре пыльников и микроспор. . . •

1.4. Андроклиния как система размножения.

I.4vl. Цитоэмбриологические основы. . . . . • . . 25 Г.4;2. Генотипическая детерминация андроклинии. . 31 Г;4.3. Онтогенетические, генетические и популяционно-генетические последствия 37 андроклинии.

1.5. Использование андроклинного цикла в селекции.' . .' 47 1.6; Нерешенные вопросы и пути дальнейших исследований.

2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЩШАНИЯ.

2.1. Исходные объекты.'

2.2. Организация эксперимента, методы культивирования и анализа.

2 .3. Цито эмбриологические методы.

3. ЩШсМБРИОЛОГШЕЕКИЕ ОСОБЕННОСТИ АНДРОКЛИНИИ. . 76 3.1; Пространственно-временная асишфонность микроспоро- и микрогаметогенеза in vivo . • • 3.2. Фенотипическая изменчивость пыльцы в начальный период культивирования.

3.2.I.' Индукция и пути развития пыльцы. !.

3;2£2. Эффект местоположения пыльника на колосе»

3.2.3. Влияние низкой положительной температуры. ; 92 3;3. Основной путь развития андроклинных структур. . 98 3.4. Морфологическая и морфогенетическая гетерогенность андроклинных структур. . v 102 3.4.1 Типы структур и динамика их развития. . . . .102 3.4.2. Сопряженность процессов каллусо- и эмбриоидогенеза. . ;.•

4. ПУТИ ПОЛУЧЕНИЯ АВДРОКЛИННЫХ РАСТЕНИЙ. ;

4.1'; Эмбриоидогенез.

4ri2v Создание органогенных штаммов.' . i

5. КРИТЕРИЙ ОЦЕНКИ ЧАСТОТЫ АВДРОКЛИНИИ. . v . . . 133 5^1. Анализ эмпирических и теоретических распределении 133 5.2. Применимость различных критериев оценки. . . . '. Д

6. ИЗМЕНЧИВОСТЬ ЧАСТОЙ АНДРОКПИНИИ.

6;1; Влияние паратипических факторов,

6.1.1. Условия культивирования.'. ¿

6.1.2. Предобработка температурой. .;

6.1^3. Физиологическое состояние донорных растений.

Влияние влагообеспечения;. v

6.2. Роль эпигенетических факторов.

6.2¿1. Стадия развития и состояние пыльцы. . . . . 149 6.2.2. Локализация пыльника на колосе. ; . . . . ? 151 6.3; Генотипическая детерминация. • .••••••

6^3.1. Межвидовые и межсортовые различия.

6.3.2. Генотипическая обусловленность модификаци-онной изменчивости частоты андроклинии. . tj 6.3'.3. Внутрисортовая изменчивость.

6.3.4.- Пути отбора на повышение частоты андроклинии.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Андроклиния и ее особенности у пшеницы"

Для познания биологической сущности различных систем размножения, их генетического и эволюционного значения эффективным методологическим приемом является использование моделей in vi-tro Среди них особое место занимает андроклиния - явление развития спорофитов из пыльцы в культуре изолированных пыльников и микроспор.

Андроклиния традиционно рассматривается, главным образом,как метод получения гаплоидов, и до сих пор отсутствуют попытки ее анализа как особой системы размножения, имещей наряду со своими специфическими особенностями общие черты с другими системами размножения. Так, способность растительной клетки к развитию зародыша проявляется не только в случае андроклинии, но и при соматическом эмбриоидогенезе, полиэмбрионии, амфи- и апомиксисе, причем в самой феноменологии эмбриогенеза сохраняется сходство.

Для выявления закономерностей морфогенеза и систем размножения, с использованием андроклинии в качестве модели, назревает необходимость в обобщении и осмыслении уже имевшихся фактов, а также дальнейшего развития исследований, касавджхся цито эмбриологических предпосылок, механизмов индукции ж путей реализации андроклинии, генотипической детерминации клеток к гаметофитному и спорофитному развитию.

С открытием явления андроклинии впервые для высших растений появилась возможность осуществления искусственного отбора по мужской линии, очевидное преимущество которого заключается в использовании избыточного, по сравнению с яйцеклетками, генофонда мужских половых клеток; Однако вопросы о формах, специфических особенностях и эффективности такого отбора остаются открытыми.

Андроклиния - явление уникальное, которое хотя и имеет определенные предпосылки in vivo но полностью реализуется только вусловиях эксперимента, и следовательно, в процессе эволюции оно не подвергалось действию естественного отбора, В связи с этим особую остроту и актуальность приобретает проблема онтогенетических, генетических и популяционно-генетических последствий андроклинии.

Фундаментальные открытия в молекулярной генетике, успехи в генетической инженерии L 2], промышленном синтезе белка и других биологических соединений [19] в значительной степени обусловлены использованием в качестве объектов прокариотов и одноклеточных гаплоидных организмов J В настоящее время, благодаря прогрессу в развитии методов культивирования изолированных клеток и протопластов in vitro появляется возможность перенесения принципов микробиологических исследований в область генетики высших растений L5, 8, 12, 35] ; В связи с этим культуры пыльников и микроспор могут найти применение как источник гаплоидных клеточных линий,Андроклинные гаплоиды представляют интерес и для селекции. Возможность использования гаплоидии в селекционном процессе обоснована теоретическим анализом эволюционно-генетического значения этого явления, как одного из механизмов смены уровней плоидности, приводящего к вскрытию депо генетической информации [lOO-IOl]. Исходя из этих представлений развивается новое направление в селекции - аналитическая селекция [105|. В основе ее лежит процесс расчленения генотипа особи путем гаплоидизации, Такой путь селекции имеет три этапа: I) получение гаплоидов; 2) селекция на гаплоидном уровне; 3) ресинтез полиплоидов. Эти идеи успешно реализуются в селекции некоторых полиплоидных растений [27] Путем ди-плоидизации гаплоидов может сразу же достигаться гомозиготность по всем признакам и в случае удачной комбинации хромосом в гаметах гибридов полученные константные формы у самоопылителей могут стать непосредственно родоначальниками новых сортов, а у перекрестников - линий, необходимых для производства высокогетерозисных гибридов.

Многие теоретические ж методические вопросы андроклинии решались на модельных объектах, однако ожидаемый экономический эффект требует сосредоточения усилии на важнейших сельскохозяйственных культурах. Особое значение это приобретает в современных условиях, когда важнейшей задачей является сокращение пути и времени от фундаментальных разработок к решению конкретных практических вопросов.

Цель настоящей работы - выявление закономерностей андроклинии и создание технологии получения гаплоидов у пшеницы.

Решались следушцие задачи.

1. Разработать технологию андроклинного цикла и определить эффективные пути получения растений.

2. Исследовать цито эмбриологические основы андроклинии: фе-нотшшческую изменчивость пыльцы и ее причины, условия индукции, пути и особенности развития пыльцы.

3. Разработать подходы к проведению генетических исследований; выявить фенотипические признаки-маркеры и 1фитерий оценки частоты андроклинии.

4. Установить роль и значение паратшшческих, эпигенетических, генотипических факторов в изменчивости частоты андроклинии.

5. Оценить пути, особенности и генетические последствия отбора по признаку "частота андроклинии".

Г? ГАШЮВДИЯ В ГЕНЕТИКЕ И СЕЛЕКЦИИ Г.Г. Гаплоиды и их использованиеУ высших растений гаплоиды - особи с редуцированным гамети-ЧеСКИМ ЧИСЛОМ ХРОМОСОМ впервые бЫЛИ ПОЛучеНЫ В 1922 ГОДУ У Datura stramonium [I3l] • Открытие явления гаплоидии имело важное методологическое значение, поскольку было доказано, что генетическая информация, представленная только одним набором хромосом, полностью обеспечивает реализацию программы онтогенеза эукариоти-ческого растения. Возможность получения гаплоидных спорофитов у высших растений сразу же привлекла большое внимание исследователей и стимулировала интенсивное развитие работ в этом направлении» За истекшие 60 лет в области гаплоидии накоплен богатый фактический материал, появилось немало новых идей и разработок, важных для теории и практики. Пополняются сведения, позволявшие судить о распространении явления гаплоидии в системе покрытосеменных растений; По данным профессора С.С.Хохлова, гаплоиды обнаружены у представителей 33 семейств, включавших 86 родов, 171 вид и 21 гибридную форму [105].

Теоретические основы гаплоидии, эмбриологические и генетические закономерности возникновения гаплоидов, методы их получения, классификация, цитогенетические и физиолого-биохимические особенности, а также эволюционно-генетическое значение и пути использования гаплоидии в селекции неоднократно обсуждались в ряде специальных работ и монографий [23,102,105,195,201].

Накопленные факты позволяют судить о гаплоидии как о сложном и многогранном явлении. По генетической конституции, определяемой ядром и цитоплазмой, гаплоиды подразделяются на несколько типов [102] : I) матроклинные - развившиеся из редуцированной клетки зародышевого мешка; 2) андроклинные - развившиеся из клеток мужскойполовой сферы (пыльцевого зерна); 3) андрогенные - развившиеся из клетки зародышевого мешка, в которой собственные хромосомы замещены хромосомами спермин* Андрогенные гаплоиды имеют двойственную природу: цитоплазму от одной особи, а ядро - от другой, в отличие от гаплоидов 1-го и 2-го типов, имевдих цитоплазму и ядро от одной особи»Исследования, связанные с гаплоидией и гаплоидами, весьма многоплановые Мы попытаемся выделить и охарактеризовать лишь главные из них. Что же касается непосредственного предмета изучения -явления андроклинии, то учитывая предыдущий опыт собственных исследований в этой области, мы, наряду с традиционным обобщением достижений, преследуем цель дать критический анализ имевшихся фактов с более широких позиций, выходящих за рамки специфических проблем культивирования in vitro. В частности, мы будем стремиться показать, какое значение имеет изучение андроклинии для разработки общих проблем гаплоидии, апомиксиса, систем полового и бесполого размножения, а также морфогенеза. Кроме того, особое внимание будет уделено и тем специфическим проблемам андроклинии, которые в современной литературе освещены не достаточно полно, либо вообще еще не поставлены на повестку дня, но которые, с нашей точки зрения, представляют большую теоретическую и практическую значимость.

Гаплоидии отводится важная роль в эволюции растений; Яо мнению С.С.Хохлова, гаплоидизация - это тот механизм, который обеспечивает смену уровней плоидности, вскрывает "депо генетической информации" и переводит эволюцию на более низкий и более эффективный уровень плоидности, увеличивает диапазон изменчивости за счет фенотшшческого проявления генов, ранее скрытых в полиплоидном состоянии [100,105];Гаплоиды находят все большее использование в генетическихисследованиях, в частности, для анализа цитогенетической структуры видов [195,201], изучения генетической регуляции спаривания хромосом [245] эффекта дозы генов [174,199], систем самонесовместимости [201], генетики количественных признаков [103], для получения транслокаций, анеуплоидов, серий моносомных линий [117., 195,232,246,253-254] и ядерно-плазменных гибридов [92].

Вследствие гемизиготного состояния генов, отсутствия межал-лельных взаимодействий у гаплоидов все возникащие мутации, как доминантные, так и рецессивные, становятся быстро доступными для диагностики и отбора. Это и обусловливает все более широкое привлечение гаплоидов в качестве объектов для решения проблем экспериментального мутагенеза. Возможность получения мутантов у гаплоидов показана для львиного зева [206], томата [22], табака 68,72,225], кукурузы [85,87-90] и других растений [93]. Достижения и перспективы использования гаплоидов покрытоееменных растений в мутационной селекции наш неоднократно обсуждались в обзорных работах, посвященных этой проблеме [91,93].

Еще в начале 30-х годов были высказаны идеи о значении га-плоидии для селекции и семеноводства, в частности, для быстрого создания из гаплоидов путем удвоения числа хромосом абсолютно гомозиготных линий [6,21,36,98]. Преимущество этого метода, в сравнении с традиционным способом получения гомозиготных линий путем самоопыления, состоит в значительном сокращении времени и затрат труда. Помимо этого, гаплоидный метод полностью или частично снимает ограничения, связанные с инбридингом. Во-первых, резкая депрессия, как следствие инбридинга, делает невозможным получение гомозиготного самоопыленного потомства у многих перекрестников. Во-вторых, инбридинг нельзя использовать у самонесовместимых растений и практически его нерентабельно применять у многолетних плодово-ягодных и орехоплодных растений из-за длительного периодавремени от всходов до плодоношения; В настоящее время линии из гаплоидов уже получены у многих видов растений, в том числе у пшеницы, ржи, ячменя, риса, кукурузы, сорго, картофеля, перца, табака, дурмана, спаржи и других [104-105]".

Важное значение приобретает проблема андрогенеза. Главным образом это связано с накоплением фактов о том, что цитоплазма способна оказывать существенное влияние на признаки, имещие значение в сельскохозяйственной практике: ЦМС, гетерозис, устойчивость к заболеваниям и вредителям, длина вегетационного периода, урожайность, мутабильность. Именно при андрогенезе наиболее быстрым путем, за одно-два поколения, можно достичь сочетания желаемых типов цитоплазмы и геномов [92].

Из приведенного обзора можно заключить, что уже сейчас гаплоиды широко используются при решении самых разнообразных генетических проблем и представляют интерес для селекции. Насколько эффективно гаплоидия внедрится в практическую селекционную работу, будет зависеть прежде всего от разработки методов массового получения гаплоидных растений у важнейших сельскохозяйственных культур.

1.2. Получение гаплоидов in vivoКак уже отмечалось, явление гаплоидии довольно широко распространено у покрытосеменных. Однако частота спонтанного возникновения гаплоидов очень низкая. Например, для кукурузы она составляет в среднем 1:1000 [86]; Это не удовлетворяет требования селекции. В связи с этим предпринимаются попытки увеличить частоту гаплоидии экспериментальным путем [23].

По способам происхождения все гаплоиды предложено [102] разделить на пять групп:I) возникшие спонтанно и случайно обнаруженные;2) отобранные из близнецов многозародышевых семян;3) полученные в потомстве от внутри- и межвидовых скрещиваний;4) полученные при экспериментальном воздействии на цветок и его части, или на растение и семена;5) полученные в культуре органов, тканей и клеток.

Причины и частота возникновения гаплоидов первой группы, какправило, неизвестны.

Образование гаплоидов в много зародышевых семенах происходит, по всей видимости, лишь при стимулирующем воздействии опыления и двойного или менторального оплодотворения1; Частота гашюидии при близнецовом методе также низкая: один гаплоид встречается на 40350 тысяч исследованных семян [102].

По сравнению с другими способами, путем внутри- и межвидовых скрещиваний гаплоиды получены у наибольшего числа видов растений, изученных в отношении гаплоидии. Частота образования гаплоидов во всех типах скрещиваний значительно выше, чем при выявлении гаплоидов с использованием близнецов, и колеблется от 1:10 до 1:5000 [102];.

Следует особо остановиться на способе получения гаплоидов вПОТОМСТВе МежВИДОВОГО СКреЩИВаНИЯ КУЛЬТУРНОГО ВИДа Hordeum vulgare С ДИКОраСТуЩИМ ВИДОМ H.bulbosum [l9l]. НезаВИСИМО ОТ направления скрещиваний, в процессе эмбриогенеза гибридных зародышей происходит селективная элиминация хромосом дикого вида, что приводит к возникновению гаплоидов н.vulgare. Для выращивания таких растений необходимо применять технику культивирования гибридных зародышей на искусственной питательной среде. Данный способ используется и для получения гаплоидов пшеницы путем скрещивания Triticum aestivum (6х) С H.bulbosum (4х) [1243.

В настоящее время способ получения гаплоидов, основанный наэлиминации хромосом, находит все более широкое применение [32, 112-113:191].

Гаплоиды четвертой группы получают при использовании задержанного опыления [194] опыления абортивной пыльцой или пыльцой с искусственно сниженной жизнеспособностью ЕютЗ при опылении пыльцой, облученной ионизирующими излучениями [83,131] и ультрафиолетом [84].

Помимо этого, применяют облучение пестика, цветков либо соцветий рентгеновыми лучами [1931. воздействие на растение высокими и низкими температурами [45], обработку рылец и завязей химическими препаратами [153].

Гаплоида; отнесенные к пятой группе, представляют самостоятельный интерес и являются преднетом нашего изучения,1,3. Получение гаплоидов in vitroВ жизненном цикле растений наблюдается закономерное чередование поколений, сопровождающееся сменой уровней плоидности, наличием диплоидных и гаплоидных фаз развития; Основополагающая идея известных методов получения гаплоидных растений in vitro заключается в том, что в качестве естественного источника гаплоидных клеток используются женские и мужские половые структуры, находящиеся в гаплофазе.

Учитывая способ происхождения гаплоидов in vitro мы подразделяем их на следующие основные группы:1) полученные из женской генеративной сферы при культивировании изолированных завязей, семяпочек, зародышевого мешка и его клеток;2) полученные из мужской генеративной сферы при культивировании изолированных пыльников и микроспор;3) полученные с помощью культуры изолированных зародышей.

О гаплоидах третьей группы, возникавших в результате С1фещи-ВаНИЯ ЯЧМеНЯ И ПШеНИДЫ С ДИКОраСТуЩИМ ВИДОМ ЯЧМеНЯ Hordeum bulbo sum мы уже упоминали (см. разд. 1.2). В данном случае гаплоиды образуются вследствии полной элиминации хромосом н.bulbo sum. Такая селективная элиминация хромосом дикого вида не зависит от направления скрещивания, поэтому гаплоиды ячменя в пшеницы могут быть получены как на собственной цитоплазме, так и на цитоплазме н.bulbosum. Следовательно," в зависимости от направления скрещивания такие гаплоиды могут быть отнесены, согласно классификации С.СДохлова (см.разд.1.1), либо к матроклинным, либо к андрогенным.

1.3Д. Получение гаплоидов в культуре завязей и семяпочекПервые попытки культивирования неоплодотворенных завязей и семяпочек с целью получения гаплоидных растений были предприняты В 1971 ГОДУ на Solanum melongena И Zea mays • Однако Вэтой работе удалось добиться получения только гаплоидного каллуса [275]. В дальнейшем гаплоидные растения в культуре неопло до творенных семяпочек были получены У Hordeum vulgare &4ä Nico -tiana tabacum И Triticum aestivnm [289] Oryza sati va [122,144] Cerbera jamsonii [260] ¿ Как указывается в этих работах, от культивируемых семяпочек наряду с диплоидным образовывался и гаплоидный каллус. На средах для регенерации путем гем-могенеза или эмбриоидогенеза из клеток каллуса были регенерированы как диплоидные, так и гаплоидные растения. Как правило, большинство регенерантов обладало способностью к фотосинтезу, а растения-альбиносы возникали редко. Для табака и риса показана принципиальная возможность развития гаплоидных спорофитов путем эмбриоидогенеза непосредственно из клеток зародышевого мешка, минуя промежуточную стадию каллусообразования [122,288-289].

Вопросы, связанные с использованием изолированных зародышевых мешков шлфытосеменных растении в качестве модели для экспериментальной эмбриологии и для получения гаплоидных спорофитов, уже обсуждались в литературе. Имеются определенные методические успехи в технике выделения жизнеспособных зародышевых мешков ряда покрытосеменных растений [94] vГаплоиды, получаемые из неоплодотворенных семяпочек, возникают на базе цитоплазмы и ядра исходной материнской особи, поэтому их следует относить к типу матроклинных гаплоидов;I.3¿2. Получение андроклинных гаплоидов в культурепыльников и микроспорАндроклинные растения впервые были получены в 1964 году у Datura innoxia [176-177], а в дальнейшем и у других видов [134,214,217] ; Б настоящее время андроклинные гаплоиды получены более чем у 150 видов цветковых растений, в том числе у важных сельскохозяйственных культур: пшеницы, тритикале, ячменя, ржи, риса, кукурузы,' томата, перца, картофеля, капусты и др. [203] ¿Некоторые аспекты андроклинии, достижения в этой области и обзор литературы до 1975 года были нами изложены в монографии "Га-плоиддая и селекция" в главах "Получение гаплоидов in vitro из гаметических клеток" и "Культивирование гаплоидных тканей и клеток" [59-60] Теоретические, прикладные и методические вопросы получения гаплоидов из пыльцы отражены также в специальных работах обзорного характера, опубликованных в отечественной [11,24, 28,30,42,107,115] и зарубежной [116, К5,150,179,205,207,211,222-223,227,245,268,277] литературе.' Поэтому мы остановимся на характеристике наиболее важных направлений исследований, обсудим ближайшие перспективы развития метода получения андроклинных растений, его негативные стороны и нерешенные вопросы.

Б самых общих чертах суть андроклинии заключается в том, что в пыльниках растении некоторая часть пыльцевых зерен отклоняется в своем развитии от типичного гаметогенеза. При определенных условиях культивирования in vitro такие пыльцевые зерна путем эмбриоидогенеза могут непосредственно развиваться в растения, либо первоначально образуют каллус, из клеток которого в дальнейшем можно получить растения-регенеранты.

Перспективы использования андроклинных гаплоидов в селекционных программах, а также теоретический интерес к новому явлению со стороны специалистов, изучающих общие закономерности морфогенеза растений,- определили два основных направления в развитии метода культуры пыльников: I) поиск оптимальных условий культивирования и разработка методических приемов для массового получения гаплоидов у возделываемых растений; 2) изучение закономерностей явления андроклинии на модельных объектах»На первом этапе становления метода большое внимание уделялось подбору оптимальных физиологических условий культивирования изолированных пыльников. Было установлено, что минеральные соли, железо и сахароза являются обязательными компонентами питательной среды. Такая среда обеспечивает нормальное развитие андроклшшюс растений табака, дурмана [226] • Для других растений требуются среды более сложного состава, включающие дополнительно: микроэлементы, витамины, аминокислоты, регуляторы роста, а иногда и комплексные органические смеси неопределенного состава (кокосовое молоко, фруктовые соки, гидролизат казеина, дрожжевой и картофельный экстракты и др.) [42,59] • Для культивируемых пыльников многих объектов показана положительная роль активированного, древесного угля. Высказывается предположение, что уголь связывает ингибиторы фито-гормонов, токсические продукты метаболизма клеток, а также некоторые ингибирувдие соединения, присутствующие в агаре в небольшихколичествах [196,286-287].

Данные о влиянии света на процессы каллусообразования и эмб-риоидогенеза в культуре пыльников противоречивы,' Некоторые исследователи считают, что световой фактор не является обязательным для индукции эмбриоидогенеза, но оказывает благоприятное влияние на последунцее развитие эмбриоидов [1041 У дурмана перенесение культур пыльников из темноты на свет (150-200 люкс, фотопериод 12 часов) вызывало увеличение количества эмбриоидогенных пыльников исреднего числа эмбриоидов на пыльник. Постоянное освещение снижало эти показатели [261] Повышенная интенсивность освещения (3200 люкс, фотопериод 16 час) угнетала формирование каллусов из пыльников пшеницы и ржи [29], У тритикале при культивировании пыльников в темноте образовывалось в два раза больше эмбриоидов, чем на свету [129]Микроспоры, культивируемые вне пыльника, более чувствительны к свету, особенно в течение первых 10 дней. Наиболее благоприятное влияние на формирование эмбриоидов оказывали красный флюоресцентный или белый низкоинтенсивный двет (500 люкс), однако при красном освещении эмбриоиды опережали по темпу развития [222] ; Приведенные данные свидетельствуют о том, что для успешного получения андроклинных растений необходимо учитывать не только состав питательной среды, но и контролировать такие условия культивирования, как температуру, длительность фотопериода, спектральный состав и интенсивность освещения.

Другие физические факторы, такие как ионизирующее излучение, интенсивный импульсный свет, монохроматическое когерентное излучение также могут оказывать стимулирующее влияние на образование каллусов и эмбриоидов. С целью получения гаплоидных мутантов мы облучали цветочные почки табака рентгеновыми лучами в дозах от 0,1 до 2,5 кр. Доза 2,5 кр полностью подавляла развитие эмбриоидов, Доза I кр у некоторых сортов табака стимулировала эмбриодо-генез. Так, у сорта Белолист 600 количество эмбриоидогенных пыльников в контроле (,6%) было в три раза меньше, чем при облучении (20$) [68], Облучение пыльников ¿'-лучами в дозе I кр способствовало развитию многоклеточных пыльцевых зерен в культуре пыльников ржи [263]. Путем облучения пыльников на стадии одноклеточной пыльцы интенсивным импульсным светом дозой 15000 импульсов (пиковая сила одного импульса 2500 кандел/сек), а также гелий-неоновым лазером (ЛГ-75, плотность потока мощности - 1,4 мвт/сиР, экспозиция - I час) нам удалось более чем в 3 раза повысить выход гаплоидных растений из пыльцы в культуре пыльников табака [72,74].

С целью увеличения количества пыльцевых зерен, способных к образованию каллусов и эмбриоидов, был предпринят ряд удачных попыток предобработки пыльников различными химическими веществами. Положительные результаты были получены при обработке пыльников: этрелом у пшеницы [126]; триио до бензойной кислотой у ячменя [133]; абсцизовой кислотой, маннитом [189], 7-азаиндолом, -0-хлорфено-кси-изомасляной кислотой [157], колхицином Г222] у табака и кофеином у традесканции [145]*Что касается собственно методов культивирования, то в настоящее время можно выделить три основных подхода: I) культивирование пыльников на твердых агаровых средах; 2) культивирование пыльников в жидких средах; 3) культивирование изолированных микроспор.

Как подсказывает практический опыт работы, метод культуры пыльников на твердых средах имеет ряд недостатков. Во-первых, при посадке пыльников не удается в равной мере для всех пыльников обеспечить одинаковый контакт со средой. Во-вторых, если необходимо оперативно в процессе культивирования изменить состав питательной среды, то это достигается только путем пересадки пыльников, что связано со значительными затратами труда и времени. Различия в контакте пыльников со средой могут частично обусловливать неоднозначность в реакции пыльников на условия культивирования. На такую поразительную изменчивость в поведении пыльников; даже если они принадлежали к одному бутону, обращали внимание многие исследователи [267-268]. Первые попытки стандартизировать условия для всех культивируемых пыльников с использованием жидкой питательной среды были осуществлены Сандерлендом [268]; В дальнейшем при сравнительном изучении пыльников на агаровых и дадких средахНа Nicotiana tabacum $ П. sylvestris > Scopolia carnio -lica было продемонстрировано, что жидкие среды у этих видов растений обеспечивают больший выход гаплоидов [156,196,27Г,286287]. Однако при культивировании пыльников пшеницы не удалось выявить какюмшбо существенных преимуществ жидкой среды по сравнению с агаровой [181].

Для генетических манипуляций; экспериментального мутагенеза и клеточной селекции на гаплоидном уровне, а также для прижизненного изучения начальных стадий эмбриоидогенеза с помощью микрокиносъемки или других методов более приемлемой является система культивирования микроспор вне пыльника. Однако, насколько нам известно, до сих пор эмбриоиды из микроспор не удается получить на полностью синтетической питательной среде, если микроспоры были отделены от пыльника до момента индукции их к эмбриоидргенезу.; Индукция изолированных микроспор к развитию по пути эмбриоидогенеза осуществлялась благодаря использованию: I) культуры пыльников [255] или иных тканей с морфогенетической активностью [235] в качестве "няньки"; 2) экстрактов из эмбриоидогенных пыльников [228]; 3) предварительного культивирования пыльников в течение нескольких дней [220,283]. Наибольшее распространение получил прием пред-культивирования пыльников в жидкой среде. Это обеспечивает индукцию пыльцы к спорофитному развитию внутри пыльника, после чего изолированные проэмбриоиды способны развиваться на полностью синтетической среде [222].

Изложенные факты указывают на то, что среди многочисленных факторов, определяющих способность пыльцы к андроклинии, важную роль играют те условия, которые складываются в пыльнике, как в целостной морфофизиологической системе.

В связи с совершенствованием техники культивирования изолированных микроспор удачное применение нашло явление пыльцевого диморфизма, которое впервые было изучено детально в культуре пыльников ячменя [152], а затем было исследовано у табака, овса, пшеницы, а также у пиона [185-186,272-273]Диморфизм пыльцы проявляется (начиная со стадии одноклеточной или двуклеточной пыльцы) в ее дифференциации на два типа: I) нормальные пыльцевые зерна ("и"-тип), характеризущиеся крупными размерами,' густоокрашен-ной и богатой крахмалом цитоплазмой; 2) мелкие пыльцевые зерна (" б"-тип) со слабоокрашенной цитоплазмой. По крайней мере, для ячменя, табака и пиона убедительно показано;' что именно из "я типа пыльцевых зерен в культуре пыльников или изолированных микроспор образуются каллусы и эмбриоиды [152,186,244,272В настоящее время разработаны приемы разделения фракций " и " и " в " пыльцевых зерен путем центрифугирования в градиенте плотности. На питательную среду высевают фракцию, обогащенную "Б " пыльцой. Такой прием позволяет значительно увеличить частоту возникновения эмбриоидов [244,283].

Таким образом, в настоящее время достигнуты заметные успехи в разработке методических основ культивирования изолированных пыльников и микроспор. Выявлены наиболее существенные условия и факторы, которые оказывают решавдее влияние на ход развития андро клинных структур и растений, разработаны эффективные приемы повышения выхода гаплоидных растений у целого ряда культур; Все это может облегчить работу с новыми видами растений.

1.4. Андроклиния как система размноженияВозможность эффективного использования гаплоидии в селекции очевидна; И это порой сказывается на направленности научного поиска и концентрирует усилия исследователей на разработке методов получения андроклинных гаплоидов^ Этим отчасти объясняется тот факт, что многие весьма важные проблемы андроклинии на время остались без должного внимания. В частности, андроклиния до сих пор рассматривается как метод получения гаплоидов, однако, по нашему мнению, с теоретической точки зрения весьма привлекателен и анализ андроклинии как особой системы размножения растений. Такой подход оправдан хотя бы потому, что он таит в себе большие эвристические возможности ж позволяет под широким углом зрения выявить и рассмотреть параллели и аналогии андроклинии с другими системами размножения, в также использовать само это экспериментальное явление как удобную модель для познания закономерностей систем размножения и морфогенеза.

Логика дальнейшего изложения материала построена на анализе фактических данных с точки зрения основных характеристик и свойств андроклинии как системы размножения; Первоочередная задача заключается в рассмотрении цитоэмбриологических предпосылок и основ андроклинии, проблемы генотшшческой детерминации развития, а также проблемы онтогенетических, генетических и популяцшнно-ге-нетических последствий андроклинии.

1.4. Г; Цито эмбриологические основыСреди изученных видов растений представители семейства пасленовых - табак и дурман сравнительно легко поддаются культивированию пыльников и микроспор, образуя большое количество андро-клинных растений. Эти виды стали общепринятыми моделями, на которых были проведены основные исследования по выявлению некоторых закономерностей андроклинии1; Значительное внимание уделялось изучению ее цито эмбриологических основ.

Уже первооткрыватели этого явления С.Гуха и С.Магешвари подробно описали эмбриологическую картину развития пыльцы дурмана; Они выявили сходство между развитием пыльцы в культивируемых пыльниках и зиготическим эмбриогенезом. Так же как и зигота, пыльца при андроклинии проходит все последовательные стадии развития зародыша: глобулярную, сердцевидную, торпедовидную и семядольную 1176-177]; Вскоре аналогичные закономерности эмбриоидогенеза былиустановлены при изучении культуры пыльников табака Дж.Ничем, который обратил внимание на перспективы использования данного метода в экспериментальной эмбриологии [.223-224].

В дальнейшем интересы исследователей были нацелены на выяснение вопросов, на какой стадии развития пыльцы происходит переключение программы гаметогенеза на путь спорофитного развития, а такде на выявление и изучение конкретных цито эмбриологических путей такого развития.

В 1970 году Б.Норреель сообщила, что отклонения от нормального хода гаметогенеза в культивируемых пыльниках дурмана могут осуществляться уже после первого деления микроспор, когда в результате изменения ориентации веретена деления возникают пыльцевые зерна с двумя внешне сходными, диффузными ядрами, похожими на ядро вегетативной клетки пыльцевого зерна [229]> На табаке [267], райграссе и ячмене [148], дурмане [190] и тритикале [264-265] было установлено, что индукция к развитию спорофитов может иметь место и на стадии двуклеточной пыльцы. В этих случаях эмбриоиды или каллусы возникали за счет делений ядра вегетативной клетки.

Долгое время считалось, что генеративная клетка не принимает участия в образовании эмбриоида* Отмечалось, что если генеративная клетка и была способна к одному или нескольким делениям, то впоследствии продукты ее деления вытеснялись производными вегетативной клетки [267-268]С Однако, например, для белены получены убедительные цитологические доказательства возникновения эмбриои-да из генеративной клетки пыльцевого зернам Из 230 изученных эмб-риоидов: III возникли из генеративной клетки, причем в 73 случаях вегетативная клетка вообще не делилась, а в 38 случаях делилась несколько раз, образуя суспензор. В формировании 28 эмбриоидов принимали участие как генеративная, так и вегетативная клетки и только 5 эмбриоидов было получено путем деления исключительно вегетативной клетки. Происхождение остальных 86 многоклеточных эмб-риоидов установить не удалось [241];; Б последние годы опубликована серия работ, в которых показано, что у табака в образовании эмбриоидов могут принимать участие: I) только вегетативная клетка; 2) только генеративная клетка; 3) обе клетки. Б последнем случае образуются химерные эмбриоиды, которые также способны к дальнейшему развитию и образованию растений. В результате гистологического изучения на 3-м и 4-м листьях таких растений были обнаружены сектора тканей, характерные для производных вегетативной клетки (светло окрашенные) и генеративной клетки (темно окрашенные) [118119].

Обобщая результаты цитоэмбриологического изучения культивируемых пыльников разных видов растений Н.Сандерленд и Дж.Данвелл [270] пришли к выводу, что изменение программы гаметогенеза и ее переключение на спорофитный путь развития может осуществляться преимущественно тремя путями.

Первый путь (путь А) берет начало со стадии двуклеточной пыльцы с характерными вегетативной и генеративной клетками. Эмбрио-ид возникает за счет последовательных делений ядра вегетативной клетки.

Второй путь (путь В) заключается в том, что после первого митотического деления отсутствует дифференцировка ядра на вегетативное и генеративное, а оба ядра внешне сходны с ядром вегетативной клетки пыльцевого зерна.' Эмбриоид образуется путем повторных делений ядер вегетативного типа (В-ядер).

Третий путь (путь С) начинается со стадии двуклеточной пыльцы, а отличается тем, что в формировании эмбриоида принимают участие оба ядра пыльцевого зерна: вегетативное и генеративное.

Характерно, что в культивируемых пыльниках растений одного вида и даже в пределах одного пыльника и одного пыльцевого мешкапри анализе часто обнаруживаются пыльцевые зерна, представляющие разные пути развития. Возникает естественный вопрос - все ли начальные пути развития пыльцы в конечном итоге приводят к образованию андроклшшых растений? Даже для такого хорошо изученного объекта, как табак, ответить однозначно на этот вопрос не представляется возможным. К:.Нич в культуре изолированных микроспор табака установила, что 5% проэмбриоидов возникает путем В, а 2,3% развивается по пути А [221]. Другие исследователи на основании данных по частоте встречаемости эмбриоидогенных пыльцевых зерен разных классов приходят к противоположному заключению, считая, что у табака более предпочтительным является путь А, хотя путь В также имеет место [209]. Из работ, приведенных выше в связи с обсуждением вопроса об участии генеративной клетки в эмбриоидогене-зе, также следует, что у табака реализуется несколько путей развития пыльцы [118-119]. Приведенные факты наводят на мысль, что реализация того или иного пути развития в культуре пыльников или микроспор, вероятно, зависит от многих факторов.

Решение вопроса о значении и относительном вкладе выявленных путей развития пыльцы в возникновение андроклинных растений у различных видов покрытосеменных затруднено тем, что во многих исследованиях уделялось внимание лишь установлению самого факта наличия в культивируемых пыльниках пыльцевых зерен того или иного пути развития, а их количественные соотношения не определялись. В настоящее время можно с большей уверенностью утверждать, что у большинства видов покрытосеменных растений, изученных в культуре пыльников или микроспор, именно вегетативная клетка и ее производные чаще всего участвуют в эмбриоидогенезе и каллусогенезе.

Существенная информация о процессах, происходящих в пыльниках и пыльце в норме и при андроклинии, была получена с помощью электронно-микроскопических, цитохимических и физиолого-биохимических методов исследования. Изменения ултраструктурных признаков при развитии пыльцы in vivo и in vitro были описаны для Nicotiana tabacum Г162-163,278-279] И Datura innoxia [164-166,249J.

Эти исследования выявили, что переключение развития пыльцы на спорофитный путь сопровождается сначала деградацией определенных структурных элементов цитоплазмы пыльцевого зерна, а затем возникшие "пустоты" вновь заполняются многочисленными рибосомами, митохондриями, диктиосомами, а также особыми органеллами (обозначенными как липидные центры), которые характеризуются активным синтезом и связаны с везикулами. В пластидах происходит накопление крахмала. К концу этого периода усиливается функциональная активность органелл, что сопровождается увеличением их количества, а также увеличением числа крист внутри стромы митохондрий, везикул в диктиосомах и крахмальных зерен в пластидах. Эти значительные преобразования в ультраструктуре эмбриоидогенных пыльцевых зерен наблюдаются, главным образом, в течение первых 10 дней культивирования.

Б.Сангван-Ворреель установила [249], что в эмбриоидогенных пыльцевых зернах в течение периода деградации структурных элементов цитоплазмы РНК цитоплазмы окрашивается слабо, тогда как окраска нуклеогистонов сначала усиливается, а затем ослабевает. Другие исследователи [130] в соответствувдий период также наблюдали уменьшение общего содержания РНК, а также белка в цитоплазме эмбриоидогенных пыльцевых зерен и, наоборот, увеличение количества этих веществ в неэмбриоидогенных пыльцевых зернах, находящихся на различных стадиях гаметогенеза.

В период между 5-9 днями от начала культивирования в цитоплазме проэмбриоидов значительно увеличивается содержание РНК и усиливается синтез белка. В это время РНК интенсивно окрашиваетсяпиронином, в цитоплазме возникают РНК-богатые образования, связанные с эндоплазматическим ретикулшом. Предполагается, что эти образования являются местом синтеза новых структурных белков и ферментов, необходимых для развития по спорофитному пути [249].

Б течение начальной фазы эмбриоидогенеза происходят изменения в клеточном метаболизме. Так, на дурмане продемонстрированы определенные изменения в содержании свободных и связанных аминокислот в начальный период культивирования пыльников [251]. На табаке показано, что эмбриоидогенные пыльники по содержанию аминокислоты глютамина превосходят неэмбриоидогенные [187]. Знание аминокислотного состава пыльников позволяет оптимизировать питательные среды для индукции деления и развития эмбриоидов в культуре изолированных микроспор [282].

Таким образом, перепрограммирование гаметогенеза на спорофи-тный путь развития осуществляется в течение определенного периода времени и сопровождается существенными изменениями в ультраструктурной организации пыльцевого зерна и перестройкой клеточного метаболизма. Уместно обратить внимание, что дальнейшие исследования пусковых механизмов эмбриоидогенеза пыльцевого зерна с привлечением современных методов молекулярной биологии и генетики могли бы стать весьма полезными и плодотворными не только для решения частных вопросов, например, массового получения гаплоидов, но и для разработки проблем генетики эукариотической клетки и особенно генетики развития. Определенных успехов в изучении экспрессии генов в раннем развитии уже достигли зоологи, используя в качестве моделей яйцеклетки и молодые эмбрионы насекомых, амфибий, рыб и млекопитающих [ 13,33,38,108].

1.4.2, Генотипическая детерминация андроклинииПознание генетических закономерностей явления андроклинии имеет важное теоретическое и практическое значение, поэтому исследования, проведенные в данной области, заслуживают особого рассмотрения.

Известно,множество работ, в которых для получения гаплоидов из пыльцы использовался широкий спектр различных исходных объектов (селекционные формы, сорта, линии и гибриды), однако задача выявить какие-либо генетические закономерности андроклинии в этих работах не ставилась. В большинстве таких исследований наблюдались значительные колебания по выходу растений, в зависимости от исходного объекта.1 Например, в обширной работе Л.Хески и Н.ТЛеша [183] были испытаны культуры пыльников: Triticum ispahanicum Т. monociccum Т. speltа 3-Х СОРТОВ Т. durum 66-ТИ СОРТОВ Т. aestivum И 2-Х форм Triticale. Многоклеточные ПЫЛЬЦевые 3е-рна И каллус были Обнаружены у Triticum durum T.ispaha • -nicum Т. spelt а, 2-Х форм Triticale И у 13-ТИ СОРТОВ Т. aestivum • Гаплоиды же были получены из пыльцевого каллуса только одного объекта - Halle 4858/37^ Значительные различия по способности пыльников разных исходных объектов образовывать кал-лусную ткань были установлены Б.Левенко с соавторами [29] при изучении 17 сортов пшеницы, а также П.Харченко и Л.Кучеренко Г99] при испытании 31 сорта и гибрида риса, С.Лукьянюк с соавторами [31] показали, что из 79 линий и сортов гекса- и октоплоидных тритикале у 30 образовывались каллусы, а регенерация растений наблюдалась только у 6 линий?Подобных фактов накопилось достаточно много и в последние годы все чаще высказывается предположение, что способность к андроклинии определяется генотипическими особенностями исходных форм,;В связи с этим появляется все больше исследований, наделенных на изучение роли генотипических факторов в явлении андроклинии.

При изучении пыльников различных представителей рода Nico -tiana было установлено, что частота эмбриоидогенеза зависит от плоидности исходного материала. Наибольшая частота определена для тетраплоидов N.tabacum [184]. Высокую способность N. taba cum (геном ssTT) к образованию гаплоидов связывают с геномом s (N. sylvestris ), геном Т ( N. toraentosiformis ) усиливает Эту способность, хотя наличие только лишь одного генома Т не обеспечивает образование гаплоидов (цит.по [107] ). Как показала Т.Орли-ковска [233], тетраплоидная форма ржи по частоте формирования многоядерных пыльцевых зерен (21,1$) превосходит диплоидную (7,5%).

На пшенице предприняты попытки локализовать генетические факторы, контролирующие каллусогенез, с использованием анеуплоидов Chinese Spring (2n = 42,ААВВДЦ) по хромосомам генома А; Из всех изученных линий дитело-4А показала наибольшую частоту каллус о образования от соматических тканей пыльника (41,3$), затем нулли-4А (16,9$). У обоих линий отсутствует /? плечо хромосомы 4А. Предполагается, что в р плече 4А локализован генетический фактор, ингибирувдий каллусогенез. У линии нулли-2А был получен каллус из пыльцы и множество регенерантов, лишенных хлорофилла [256].

Таким образом, можно считать установленным, что способность к андроклинии определяется ядерными генами, хотя сами эти гены не выявлены, а случаи формального генетического анализа детерминант также пока неизвестны. Способность к андроклинии наследуется и может быть передана потомству путем гибридизации. Цитоплазма или ядерно-цитоплазматические взаимодействия играют определенную роль в детерминации андроклинии. Наблюдается тенденция к увеличению частоты андроклинии с возрастанием уровня гетерозиготности, а также плоидности исходных форм. Приведенные факты несомненно свидетельствуют об определенных успехах в решении ряда вопросов проблемы генотипической детерминации андроклинии, однако следует отметить и некоторые негативные стороны современного состояния исследований в данной области.

Прежде всего сама проблема генотипической детерминации андроклинии в известной нам литературе освещена недостаточно глубоко с теоретической точки зрения, без ясно очерченных направлений, задач, путей их решения и перспектив.

В контексте некоторых работ проскальзывает упрощенное понимание существа дела. К примеру, речь идет о влиянии генотипа, но не ясно, что же конкретно вкладывается в это понятие. В одних случаях ставится знак равенства между генотипом и исходным объектом,, апоследний оказывается сортом либо даже гибридной формой, т.е. в обоих ситуациях совокупность различных генотипов. В других случаях под генотипом подразумевается генотип исходного спорофита. Таким образом, зачастую отсутствует четкое представление, что при андроклинии единицей отбора является отдельное пыльцевое зерно (генотип); Она же есть элементарный объект генетического анализа й еденица количественного учета. Уже один пыльник представляет собой совокупность гаплоидных генотипов (пыльцевых зерен), пространственно ограниченных соматическими клетками, которые в свою очередь имеют генотип исходного спорофита.

Во многих работах исследование не продвигается далее установления факта различий по частоте андроклинии между исходными объектами и не проверяется наследуемость признака в потомстве индивидуальных растений. Даже в работах,непосредственно посвященных изучению генетических факторов андроклинии [136], не берется в расчет возможная изменчивость растений по частоте андроклинии внутри популяций исследуемых сортов.

Известно лишь несколько публикаций, в которых авторы обратили внимание на такую изменчивость. Так, на райграссе установлены различия в реакции пыльников, изолированных с разных растений одного и того же сорта [234]. На пшенице и тритикале выявлен так называемый "эффект колоса" ("effect of the spike ")• Он заключается в том, что отдельные группы пыльников, каждая из которых изолирована с одного соцветия (колоса), по разному реагируют на условия культивирования. Так, у пшеницы из 200 изученных колосьев пыльники 150 колосьев проявили отрицательную реакцию, хотя встречались и такие колосья, у которых до 10$ пыльников образовывали каллусы или эмбриоиды. Имелись также колосья с промежуточной частотой андроклинии [139]. Сходные результаты получены при исследовании культур пыльников различных колосьев тритикале [129].

Причинами обнаруженного "эффекта колоса", вероятно, могут быть либо модификационные различия в физиологическом состоянии колосьев, либо генотилическая изменчивость растений популяции сорта. Однако окончательно этот вопрос не решен, поскольку осталась недоказанной наследуемость признака "эффект колоса" в последущих поколениях.

Следует заметить, что выявленным фактам не всегда давалась критическая генетическая оценка. Например, выше отмечалось, что пыльца у гибридов обладает большей способностью к андроклинии,нежели у самоопыленных линий. Это связывают с эффектом гетерозиса [184]. Однако о каком гетерозисе может идти речь, если андроклин-ные особи возникают из гаплоидных клеток? Если все же принять во внимание эффект гетерозиса, то, вероятно, правильнее было бы предположить, что гетерозисный эффект, проявляющийся в онтогенезе гибридного спорофита, в том числе и в соматических тканях пыльника, повышая функциональную активность последних, более надежно в целостной системе пыльника обеспечивает формирование пыльцы, так же, как и ее развитие по спорофитному пути. С другой стороны, у гибридов по сравнению с самоопыленными линиями наблюдается всплеск комбинативной изменчивости, вследствии чего возможно увеличение вероятности возникновения гаплоидных рекомбинантов с большей склонностью к андроклинии.

Имеющиеся в настоящее время предпосылки для разработки проблемы генотипической детерминации растительной клетки к эмбриоидо-генезу с использованием различных экспериментальных систем in vitro (культура изолированных пыльников и культура соматических клеток злаков), некоторые вопросы этой проблемы и пути их решения нами уже обсуждались в литературе [69-70,73,76,78-79,95,2741.

По нашему мнению, в ряду стоящих задач выявление генетических закономерностей андроклинии является центральной и наиболееважной задачей как с точки зрения теории, так и практики.

Во-первых, следует изучить целый ряд вопросов, связанных с собственно проблемой генотипической детерминации пыльцы к эмбрио-идогенезу или иным альтернативным путям развития.

Во-вторых, необходимо выявить и изучить онтогенетические, генетические и популяционно-генетические последствия андроклиник, как явления в определенной степени предетерминированного in vi- : vo но полностью реализующегося только в специфических условияхin vitro1.4.3. Онтогенетические, генетические и популяционно-генетические последствия андроклинииАндроклинные особи удается получать только экспериментальным путем в специфических условиях культивирования пыльников и микроспор вне организма и следует полагать, что в процессе эволюции такие растения не подвергались действию естественного отбора. В связи с тем, что андроклинные растения в качестве исходного материала все чаще вовлекаются в селекционный процесс, важно рассмотреть круг вопросов, связанных с онтогенетическими, генетическими и до-пуляционно-генетическими последствиями андроклинии, как явления, не встречавшегося у растений в естественных природных условиях.

Частично мы уже касались онтогенетических последствий андроклинии, когда обсуждали вопрос об участии вегетативной и генеративной клеток в эмбриоидогенезе. Растения табака, полученные только из вегетативной клетки, а также растения-химеры отличались друг от друга по ряду гистологических признаков листа и морфологии цветка. Особенно резкие изменения наблюдались в тканях, состоящих из производных генеративной клетки [I20-I2I]. Таким образом, эпигенетические различия между вегетативной и генеративной клетками и их ядрами, закономерно возникавшие при формировании пыльцевогозерна, при андроклинии не только сохраняются в онтогенезе, но и оказывают влияние на этот процесс, вызывая различные гистологические и морфологические изменения в формировании вегетативных и генеративных органов андроклинного растения.

Другим часто наблюдавшимся (особенно у злаков) следствием андроклинии является возникновение растений-альбиносов [31,56,71, 99].

Имеются сведения, что выход альбиносов зависит от исходного объекта. Так, у пшеницы сорта Centurk ир j гибридов с его участием наблюдалось преобладание альбиносов. В большинстве каллусов образовались исключительно зеленые или белые растения, но из некоторых появлялись растения обоих типов [136]. В культуре пыльников ячменя соотношение зеленых растений к альбиносам составило 1:2 для сорта Dissa и 1:10 для сорта Amsel lI7Ö]. Некоторые гибридные комбинации у ячменя характеризовались повышенным выходом зеленых растении, причем у реципрокных гибридов различий по этому признаку не установлено [171].

С.Лукьянюк с соавторами [31] сообщили, что в 1977 году, в отличие от 1976 года, от всех испытанных форм тритикале были получены только растения-альбиносы. Предполагается, что появление альбиносов является следствием физиологической анормальности, проявившейся в результате неблагоприятных погодных условий при вегетации донорных растений.

Во многих случаях частота возникновения растений-альбиносов достаточно велика, чтобы их появление можно было бы объяснить только за счет проявления рецессивных генов на гаплоидном уровне. Если бы альбинизм являлся следствием проявления мутантных рецессивных генов, то, например, у таких объектов, как гексаплоидная пшеница и тритикале, следует ожидать снижения частоты альбиносов из-за дублирования генов в разных геномах. Однако такого снижения частоты растений-альбиносов в действительности не наблюдается.

Д.Клафам [150] высказывает ряд предложений относительно причин возникновения альбинизма у злаков. Одна из причин может быть связана с тем, что при мейозе у растений в течение лептотены-па-хитены происходят изменения в пластидах, они утрачивают значительную часть ламеллщ)ной системы и рибосом. На стадии тетрад или на более поздних стадиях развития пыльцы происходит восстановление пластид. Вероятно, во многих пыльцевых зернах полное восстановление ингибируется по каким-либо причинам, в том числе и под действием факторов культивирования in vitro Кроме того, дезорганизация пластид может индуцироваться in vitro в начальный период культивирования пыльников.

У ячменя [149] и риса [266] электронно-микроскопическое исследование выявило наличие измененных хлоропластов в клетках растений-альбиносов. У риса они содержали ДНК, но были лишены рибосом и хлорофилла.

Предполагается, что способность к развитию пластид в хлоропласта имеет прямую связь с альбинизмом. Вероятно, имеет место барьер в биосинтезе белков (барьер экспрессии гена), необходимыхдля развития ламеллярной системы пластиды [179].

Таким образом, большинство факторов говорит о том, что значительное количество растений-альбиносов возникает вследствии эпигенетических или физиологических причин. Продемонстрированная в некоторых работах возможность экспериментального восстановления фотосинтетической активности позволяет надеяться; что в будущем у злаков трудности, связанные с альбинизмом, будут преодолены,Андроклиния зачастую приводит к генетическим изменениям, что выражается в возникновении анеуплоидов, миксоплоидов и растений разной плоидности (п 2п, Зп, 4П, 5П и более).

Важным является вопрос о причинах возникновения растений разной плоидности в культуре пыльников. Одна из очевидных причин заключается в том, что образование каллуса и растений-регенерантов может происходить не только от пыльцы, но и от соматических клеток пыльника. Однако зачастую этого можно избежать путем правильного подбора состава питательной среды. Например, у табака, перца и петунии нам удалось свести к минимуму пролиферацию соматических клеток пыльника путем изменения абсолютных концентраций фитогормонов, соотношения кининов и ауксинам или путем полного исключения кининов из питательной среды [56,62-63,66-66],Наиболее частые и значительные изменения в числе хромосом, приводящие к анеуплоидии и полиплоидии, наблюдаются в том случае, когда из пыльцы первоначально образуется каллус [123,146,179,210, 218-219,257]; Такая изменчивость в числе хромосом не является исключительной только для клеток пыльцевого каллуса, а представляет собой закономерное явление для клеточных популяций in vitro [94]Однако в тех случаях, когда растения из пыльцы развиваются путем эмбриоидогенеза, также имеют место анеуплоидия и полиплоидия,1 Гаплоидные, диплоидные, триплоидные и растения более высоких уровней ПЛОИДНОСТИ были получены у Hicotiana tabacum [82,175] n. sylvestris [204] Datura metel [216] -d. innoxia [250,269] Petunia hybrida [178*198,242] Brassica napus [285] Zea raays [135] Triticum aestivum [140,142].

Установлено, что эндоредупликация и слияние ядер на начальных стадиях эмбриоидогенеза являются основными причинами появления растении, различавшихся по плоидности. В частности, показано, что при культивировании пыльников на стадии одноклеточных микроспор полиплоидность проэмбриоидов возникает в результате репликации ДНК и слияния ядер после первого митоза [270]. Иногда при инокуляции пыльников на стадии поздней одноклеточной пыльцы, ядра которой находятся в G % фазе клеточного цикла, перед митозом может происходить вторая репликация ДНК. Из таких пыльцевых зерен в дальнейшем развивались диплоидные растения [168-169].

Теоретически полиплоидные растения, возникавшие первоначально из гаплоидной пыльцы путем эмбриоидо гене за j сопровождавшегося эндоредушшкацией и слиянием ядер, должны быть гомозиготными. На этой основе может быть разработан ускоренный метод получения гомозиготных линий и полиплоидов для селекционной работы. Для этих целей необходимо изучить пути регуляции процессами эндоредушшка-ции и слияния ядер в культуре изолированных пыльников и микроспор, чтобы экспериментально усилить частоту этих явлений. В связи с этим представляет интерес, что у табака, дурмана и петунии значительное увеличение доли полиплоидных эмбриоидов наблюдалось при культивировании пыльников, изолированных от растений в поздней фазе цветения [168-169] 1Следует заметить, что диплоидизация может осуществляться и на разных этапах онтогенеза андроклинного растения. Цитологический анализ 26 белых и 62 зеленых андроклинных растений ячменя выявил, что у молодых растеньиц встречаются только гаплоидные клетки, а в более развитых обнаруживаются клетки с диплоидным и анеуплоидным наборами хромосом, В растениях, находящихся на стадии 2-6 побегов, в большинстве изученных метафаз было установлено диплоидное число хромосом. Наблюдающуюся диплоидизацию растений авторы объясняют диплонтной селекцией [173],Еще одной причиной появления диплоидных растений является их возникновение из нередуцированных микроспор, как это было установлено у ржи [284] Предполагается, что некоторые диплоидные растения кукурузы, полученные путем эмбриоидогенбза, также могли возникнуть из нередуцированных микроспор [135].

Пока не совсем ясно, какое применение в селекции могут найти гетерозиготные диплоидные растения, получаемые из нередуцированных микроспор. Мы полагаем, что такие растения могут представлять интерес для эмбриогенетических исследований в качестве исходного материала для выявления и отбора мейотических мутантов.

У андроклинных растений иногда наблюдается миксоплоидность [81,204,210,257].

Детальный цитогенетический анализ андроклинных растений осуществлен на табаке ГГ7]; У растений наряду с гаплоидными были идентифицированы и клетки иной плоидности, основную часть которых составляли анеуплоиды с окологаплоидным числом хромосом; Наличие небольшого количества анеуплоидных клеток значительно не сказывалось на жизнеспособности растений. Однако при возрастании их числа до 50$ жизнеспособность растений резко падала, что проявилось в их гибели на начальных стадиях развития'. Установлено наличие определенного количества клеток с аберрациями хромосом, частота которых у отдельных растений сорта Самсун достигала 15,6$,Обширные исследования по томе тв растений, полученных из пыль« цы у ряда важных сельскохозяйственных растений, были проведены в Китае в различных исследовательских группах. У риса, пшеницы и табака диплоидные потомства андроклинного происхождения сравнивали в полевых условиях с их исходными сортами, Коэффициент вариации по хозяйственно важным признакам был либо сходен, либо был несколько ниже у потомств андроклинных растений. Среди всех спонтанно возникших диплоидных потомств 90$ были гомозиготными и только у 10% потомств наблюдалось расщепление. Цитологическое изучение хромосом в клетках кончиков корней 54 Hj регенерантов пшеницы выявило, что Э0% из них были эуплоидами - гаплоидами, либо диплоидами. Анализ материнских клеток пыльцы у 72 Hj растений пшеницы показал, что 87,5$ были либо гаплоидами (Зх=21), либо ди-плоидами (6з?=42). Сходные результаты были получены при изучении соматического набора хромосом растений из пыльцы, растущих в' поле. Около 80% были гаплоидами и диплоидами. Цитологическое изучение Hj растений позволило определить, что приблизительно 10% из них имели иные хромосомные числа, в частности, встречались: моносомики," нуллисоиики, анеуполигаплоиды, пентаплоиды и октоплоиды. В пыльцевом каллусе наблюдали многополюсные митозы, клетки с дицен-трическими хромосомами или с фрагментами хромосом. Кроме того на ранних стадиях пыльцевого каллусогенеза имели место: асинхронное деление ядер, слияние различных ядер и эндомитоз [179].

Как стабильность, так и генетическая гетерогенность андроклинных растений важны для создания исходного селекционного материала, а также материала для генетической инженерии, в частности, для получения различных анеуплоидных линий; Так, из пыльников ги-пертетраплоидного растения табака uicotiana sylvestris (2а= 47) было получено 3 моносомика IJ37J а у it. tabacum нуллига-плсшды, нуллисомные, трисомные и тетрасомные анеуплоидные линии [151].

В результате нарушений в мейозе у андроклинных гаплоидов пшеницы возникали различные по размеру микроспоры. Наименьшие из них содержали в микроядрах от I до 5 компактных хромосом. Такие "мини-микроспоры" встречались с частотой около 10%. Установлено, что они способны к синтезу ДНК и митозу. Предполагается использовать такие "мини-микроспоры" в качестве вектора для переноса хромосом реципиенту [188,258]. При повторном культивировании пыльников ан-дроклинных гаплоидов не наблюдалось случаев развития растений из таких "мини-микроспор". Из пыльников гаплоидов дурмана [143] и пшеницы [140] были вновь получены только гаплоиды или диплоиды, имещие полноценные геномы. Культивируя пыльники гибридов, по отклонению от гаметического расщепления можно судить о существовании отбора генотипов в процессе андроклинии. Так, при культивировании пыльников мойогенных и дигенных мутантов табака частоты му-тантных генотипов, полученных из пыльцы, были меньше ожидаемых [276]. Однако наблюдается и соответствие эмпирического расщепления теоретическому, что установлено для табака [215] и риса [147].

В пользу существования отбора генотипов в культивируемых пыльниках говорит также тот факт, что при повторном культивировании пыльников диплоидных форд, полученных из андроклинных гаплоидов путем удвоения числа хромосом, или диплоидов, спонтанно возникших из пыльцы, иногда наблюдается увеличение частоты андроклинии по сравнению с исходными формами, причем эта повышенная способность пыльцы к андроклинии наследуется в ряде поколений [240] •. В -других случаях частота эмбриоидогенеза у диплоидов андроклинного происхождения была ниже, чем у исходных форм [154,184]'.

Учитывая, что андроклинные растения возникают вследствии отклонений от нормального гаметогенеза, можно было бы предположить, что у самих андроклинных растений частота подобных нарушений в пыльниках может быть повышенной. Однако, как правило, такого явления не наблюдается При изучении гомозиготных растений, полученных из пыльников различных сортов пшеницы, пыльца в пыльниках оказалась нормальной. И только у андроклинной линии "Rex " с ЦМС наблюдали [138] дополнительные деления ядер в пыльце in vivo $ обусловленные, как полагают авторы, влиянием цитоплазмы Triticum timopheevi.

Таким образом, анализ факторов, касающихся онтогенетических, генетических и популяционно-генетических последствий андроклинии, показывает, что андроклинные растения характеризуются широким спектром генотшшческой и фенотипической изменчивости. Причинами их могут быть: эндоредупликация и слияние ядер на начальных стадиях развития, возникновение растений из нередуцированных микроспор, имеющие место на различных стадиях онтогенеза полиплоиди-зация клеток, аномалии митоза, хромосомные и геномные нарушения, а также различные эпигенетические или физиологические блоки функции органелл. Генотипический и фенотипический полиморфизм анд-роклинных растений является также следствием комбинативной и мутационной изменчивости и в определенной степени подвержен действию отбора, начиная с самых ранних стадий развития,С другой стороны, потомство линии андроклинного происхождения, как правило, характеризуется выровненноетью по изученным признакам [18,179], В этом плане интересные результаты получены при сравнении самоопыленных и андроклинных линий у iiicotiana sylvestris. Было установлено, что линии андроклинного происхождения могут порождать какую-то новую генетическую изменчивость, которая отсутствовала у линий, полученных классическим путем," Эта изменчивость выявляется в результате гибридизации между андрок-линными линиями [154].

Это интересное, с точки зрения генетики и селекции, явление требует дальнейшего изучения. Важно определить, является ли такого рода изменчивость исключительно следствием андроклинии, или характерна также для линий, получаемых от гаплоидов и других типов.

Хотя некоторые причины изменчивости андроклинных растений в настоящее время ясны, это еще не означает, что сам процесс изменчивости удастся легко контролировать экспериментально. Б этом аспекте предстоит еще много работы.

Высокая частота миксоплоидии, возникновения аберраций хромосом и прочих аномалий в ходе онтогенеза особи скорее вредное явление, чем полезное. Это приводит к снижению жизнеспособности андроклинных растений и даже к их гибели на ранних стадиях развития. Также нежелательно и явление альбинизма, которое особенно часто наблюдается у злаков. Поэтому вопросы о повышении генетической стабильности в процессе онтогенеза и снятии блоков функции орга-нелл остаются открытыми.

Существует связь между конкретным методом получения андроклинных растений и их генетической стабильностью. В тех случаях, когда метод включает промежуточную стадию каллусогенеза; генетическая изменчивость, как правило, усиливается с увеличением длительности этой стадии. Эмбриоидогенез коррелирует с относительно большей генетической стабильностью. Поэтому при работе с новыми объектами целесообразно сразу же сосредотачивать усилия на создание условий для реализации эмбриоидогенеза.

Есть основания предполагать, что свойство генетической стабильности клеточных популяций и различных путей морфогенеза может определяться и генотшшческими факторами. Так, Т^Пимада [257] у пшеницы выявил сортовые различия по хромосомной стабильности получаемых каллусов и растений-регенерантов. Б.Сангван-Норреель [250] на дурмане изучила морфологию эмбрионов и число хромосом в их клетках. Оказалось, что молодые диплоидные эмбриоиды имели правильную форму и плотные ядра одного типа, тогда как гаплоидные - менее правильную форму и ядра одного типа или двух разных типов. Эти данные наводят на мысль, что генетическая стабильность в процессе осуществления программы спорофитного развития может зависеть от уровня плоидности. Это подтверждается еще и тем, что с возрастанием уровня плоидности исходных форм заметна тенденция к увеличению частоты андроклинии |J84,233].

Как генетическая стабильность, так и изменчивость должны стать по возможности более прогнозируемыми и регулируемыми экспериментально. Это является основной задачей будущих исследований.

1.5. Использование андроклинного цикла в селекцииВ настоящее время показана принципиальная возможность многопланового использования метода культуры изолированных пыльников и микроспор для получения ценного исходного селекционного материала (полиплоидов, мутантов, моносомных линий) и ускоренного создания сортов. Практическая значимость андроклинного цикла и возможность его использования в селекционном процессе подтверждается результатами, достигнутыми в различных странах на следувдих важнейших культурах.

Пшеница (Triticum aestivum)Франция. Получены гаплоиды из пыльцы и гомозиготные линии у различных сортов мягкой пшеницы, в том числе и у форм с ЦМС [238]. У 20 форм озимой пшеницы получены гаплоиды и 164 линии. Проведены экологические испытания линий в сравнении с лучшими французскими районированными сортами. Лучшие андроклинные линии превосходили лучший стандарт на 10-16$ [l4ll.

Китай. В КНР в течение одного года методом культивирования пыльников из гаплоидов получают до 600 линий, которые подвергаются производственным испытаниям [179].

США. Показана принципиальная возможность отбора форм, устойчивых К Erysiphe graminis f. sp. tritici На ПОЛИГаЛЛОИ-дах, полученных из пыльцы ряда сортов и гибридовР -J-IJ36].CGC Р. Разработаны методы получения андроклинных гаплоидов у мягкой пшеницы [52,67,71,74-75]. Получены гаплоиды из пыльцы некоторых сортов пшеницы [ 47]. Разрабатываются методы получения гаплоидов [49].

Тритикале (Triticale)СССР. Разработан метод получения андроклинных гаплоидов, который с успехом используется для создания исходного селекционного материала. В 1976 году было получено 53 гаплоида, в 1978 году -192 [31,55]. При культивировании 37630 пыльников различных исходных форм было получено: зеленых гаплоидов - 501 (I,33$)f альбиносов - 266 (0,71$, линий - 29 (0,077$) [262], Разработан метод получения гаплоидов и получено фертильное потомство от андроклинных гаплоидов [9-10].

Рис (Oryza sativa)Китай. Главным образом используется культура пыльников гибридов F J. Получены гомозиготные линии, проведены полевые испытания. По ряду признаков линии превосходили исходные формы [205]. В Институте сельскохозяйственных исследований "Shin Chou Coun -ty " каждый год реализуется программа, включающая культивирование пыльников приблизительно 70 F j гибридов от 18 родительских форм. В один год при культивировании 312000 пыльников было получено около 5000 (1,6$) каллусов и 590 (0,19$) зеленых регенеран-тов. От этого количества приблизительно 10$ линий изучается в дальнейшем. Создано 6 сортов: Hua Be 702,Hua Yu H, Hua Ж, Та Be 78, Shu Tang feng № I. На сельскохозяйственной научной станции " Chin Pu " в последние 5 лет осуществлено культивирование пыльников от 250 гибридных комбинаций. Взрослые зеленые рася Примечание: здесь и далее в круглых скобках указана частота на один высаженный пыльник, подсчитанная нами.тения получены от 1800 растеньиц. Выделено 3 линии, которые получили широкое распространение [205]. За один год было получено 5106 групп зеленых проростков от 125 комбинаций скрещивания и около 1000 линий со стабильными характеристиками [179].

Венгрия. Получены гомозиготные растения от пыльцевых гаплоидов [1821.

СССР. Разработан метод получения андроклинных гаплоидов [99].

Италия. От гибридов Fj в культуре пыльников получено около 50 линий, которые испытаны в производственных условиях [200].

Кукуруза (Zea mays )Китай; В течение двух лет на различном исходном материале 14 институтами и университетами получено 25 линий с помощью культуры пыльников, которые испытываются на комбинационную ценность. Линия Qunhua № 105, полученная от гибрида при скрещивании с 10 различными линиями в 9 гибридных комбинациях, показала превосходство над контролем [179].

Ячмень(Hordeum vulgare)Англия. Получена линия от пыльцевого гаплоида гибрида (Ра -ladin х Vada х Julia ' по урожайности превосходящая стандартный сорт Mazuka [180].Ta6aK(Mcotiana tabacum)Китай. Путем культуры пыльников созданы сорта, превосходящие стандарты, распространенные в КНР [179,205].

Япония. С помощью культуры пыльников повышена устойчивость к болезням у основного местного сорта табака МС 1610 Г213].

СССР. Получен ряд андроклинных линий, имещих практическое значение [81-82].

Болгария. Линии, полученные в культуре пыльников гибридов Fj, были высокоурожайными, обладали комплексной устойчивостью к ложной мучнистой росе и мучнистой росе. Сокращен срок создания такихлиний [1,15-16].

Спаржа(Asparagus officinalis) Франция. При культивировании пыльников мужских растений (Мм) получены гаплоиды (М). Удвоением числа хромосом получены "сверхмужские" растения с генотипом (ММ). Благодаря этому создана возможность получения гибридовр j ( дог х Ш ), состоящих исключительно из мужских особей (Мм), обладающих повышенной продуктивностью [158-160].

Приведенный обзор основных достижений в области практического использования культуры пыльников показывает, что, начиная со второй половины 70-х годов, этот метод начал внедряться в селекционный процесс и в ряде стран уже принес определенные результаты. Б перспективе от этого метода следует ожидать еще большей результативности. Наибольший прогресс достигнут в Китае, где существует около 700 научно-исследовательских групп (в каждой приблизительно по 4 сотрудника), занимающихся селекцией на основе андроклинного цикла [205].

Прохождение гаплоидного состоянии и удвоение числа хромосом обеспечивает константность, и в случае удачной комбинации хромосом родительских форм полученные линии могут непосредственно стать родоначальниками нового сорта. Это позволяет значительно сократить время на создание сортов и является наиболее существенным преимуществом использования андроклинного цикла.

Значительные успехи достигнуты и на злаках таких, как тритикале, рис, пшеница. Однако у злаков успех достигается благодаря культивированию огромного количества пыльников. Частоты каллусоге-неза, эмбриоидогенеза и конечного выхода растений и линий на один высаженный пыльник очень низкие, что является препятствием для более эффективного использования андроклинии в селекции этих важных культур. В таблице 1.1 мы приводим результаты, полученные в тех исследовательских группах, где имеются и значительный опыт работы с культурами пыльников и практические результаты от использования андроклинии. Подсчет частот осуществлен нами на один культивируемый пыльник по данным, приведенным авторами. Данные, представленные в таблице, убедительно показывают, что для злаков необходимо дальнейшее совершенствование технологии андроклинного цикла с целью увеличения выхода растений из пыльцы.

1.6. Нерешенные вопросы и пути дальнейших исследованийАнализ достижений в области гаплоидии показывает, что это явление находит все более широкое применение для решения самых разнообразных вопросов теории, а также в селекционном процессе! Среди известных типов гаплоидии важное место занимает андроклин-ная гаплоидия. За истекшие 20 лет с момента ее открытия накопленбольшой фактический материал по различным аспектам получения гаплоидов из пыльцы. В настоящее время наибольший прогресс достигнут в разработке методических основ культивирования изолированных пыльников и микроспор. Это позволило для некоторых видов растений, таких как табак, дурман, петуния, рис, тритикале,решить проблему массового получения гаплоидов для селекции. Причем уже получены обнадеживающие практические результаты - ценные селекционные формы и новые высокопродуктивные сорта. Однако, как было показано, еще у многих сельскохозяйственных растений, особенно у злаков,это достигается с большими затратами труда и времени. Причиной тому -низкая частота возникновения гаплоидов. Следовательно, разработка приемов повышения выхода гаплоидных растений остается актуальной задачей. Эффективное решение этой важной практической задачи требует дальнейшего развития фундаментальных исследований с целью выявления закономерностей андроклинии и поиска путей управления этим явлением. Это тем более важно в связи с тем, что многие исследования все еще носят методический характер, а по постановке задач и кругу обсуждаемых вопросов, как правило, не выходят за рамки специфических проблем культивирования in vitro.

Критический анализ фактических данных убедительно показывает, что андроклиния представляет интерес не только для селекции, но и для теоретических разработок в области морфогенеза, систем размножения, генетики развития и многих других.

В частности, как новое явление андроклиния привносит в экспериментальную эмбриологию нетривиальную модель исследования, выдвигая на повестку дня решение ряда проблем, которые ранее не представлялись столь очевидными.

Яри всем разнообразии эмбриологических явлений,' сопровождающих возникновение гаплоидов различных типов (матроклинных, андро-клинных и андрогенных), общим и существенным является способностьисходной гаплоидной клетки к развитию зародыша; Каковы se условия, необходимые для осуществления эмбриогенеза? Выяснение данного вопроса в случаях матроклинной гашюидии и. андрогенеза сопряжено с рядом трудностей. Прежде всего из-за редкости события, особенно при андрогенезе.- Кроме того изучение эмбриологических явлений, протекающих в женской генеративной сфере, затруднено по чисто методическим и техническим причинам. И самое главное, матроклинная гаплоидия и андрогенез являются результатом взаимодействия между женскими и мужскими половыми клетками, включая и различные химические взаимодействия, что усложняет выявление характера причинно-следственных связей. Из всех известных типов гаплоидии андро-клиния представляет собой наиболее удобную модель для изучения цитоэмбриологических предпосылок, механизмов индукции и реализации эмбриоидогенеза. В данном случае отсутствует взаимодействие между гаметами разного пола, методически легко осуществим качественный и количественный анализ процессов индукции и последувдего развития.

В общем виде андроклиния представляет собой отклонение (аномалию) от нормального хода развития пыльцы. Следует, однако, заметить, что наличие различного рода аномалий в развитии пыльцы не является исключительным атрибутом культивируемых пыльников, а зачастую имеет место в интактных пыльниках in vivo особенно при неблагоприятных условиях произрастания растений. Причем многие аномалии проявляются гораздо позже того момента, когда действовали прииины их обусловливающие, в частности, некоторые отклонения : от гаметогенеза и спермиогенеза являются следствием и отражением неправильностей мейоза Í46]. В связи с этим возникает ряд вопросов, требувдих разрешения. Соответствуют ли друг другу спектры аномалий, возникавдих в пыльниках in vivo и in vitro ? Все ли отклонения от микроспорогенеза, гаметогенеза и спермиогенезаведут к андроклинии? Существует ли специфичность у тех аномальных пыльцевых зерен, которые являются родоначальниками андроклинных растений, и обусловлена ли эта специфичность условиями культивирования in vitro ? Есеь ли связь между количеством аномалий в развитии пыльцы и конечным выходом андроклинных растений?Поскольку причинно-следственные отношения могут быть разнесены во времени, проявляться опосредованно и затрагивать, в силу приемственности определенных этапов и стадий развития, обе сферы in vivo и in vitro (нацример, микроспорогенез in vivo может предшествовать андроклинии in vitro ), то важное эвристическое значение имеет постановка вопроса о том, как и каким образом процессы и явления, осуществляющиеся invivo отражаются на характере, интенсивности и направленности, процессов, развертывающихся в культивируемых пыльниках in vitro'. В связи с этим, очевидно, цитоэмбриологические данные, касанциеся андроклинии, следовало бы рассмотреть и в системе таких понятий теории морфогенеза, как предетерминация, индукция, детерминация и собственно реализация.

Уместно подчеркнуть весьма существенное свойство пыльника как модели экспериментальной эмбриологии. Пыльник представляет собой целостную структурно-функциональную (морфо-физиологическую) систему. Значение фактора целостности в индивидуальном и историческом развитии организмов было убедительно доказано глубоким анализом проблемы, главным образом на зоологическом материале [III] у Эти идеи были также широко восприняты ботаниками. Эмбриологи придают существенную роль фактору целостности и в процессе развития пыльника [4,50]. Не вызывает сомнения, что предетерминацию, индукцию и детерминацию андроклинии правомерно рассматривать как функцию интегральных процессов, развертывакщихея в целостной системе пыльника. Безусловно, такой подход требует выявления элементарных,дискретных признаков (процессов) и их тщательного количественного анализа в динамике развития.

В литературе широко обсуждаются вопросы, как и каким образом происходит развитие растений из пыльцы, но до сих пор остается открытым вопрос почему же вообще возможно такое развитие и каковы его онто- и филогенетические основания» Многочисленными исследованиями установлено, что индукция пыльцы к эмбриоидогенезу возможна лишь в узком интервале стадий ее развития и наиболее оптимальной для этого является зрелая микроспора (одноклеточная пыльца) перед первым митотическим делением.

Однако,исходя из теоретического представления о тотипотент-ности растительной клетки, следовало бы ожидать, что получение андроклинных растений возможно в течение всего периода гаплофазы, независимо от конкретных стадий клеточных дифференцировок. Отсюда вытекают некоторые следствия. Во-первых, теория тотипотентности не всегда строго согласуется с фактическими данными. Во-вторых, андроклиния относительно момента индукции имеет явные ограничения. Этот факт до сих пор не привлекал особого внимания ни эмбриологов, ни теоретиков морфогенеза, хотя совершенно очевидно, что выявление причин, обусловливающих и снимающих подобные ограничения (в плане возможности клетки осуществить программу онтогенеза), представляет важный научный интерес, а сама проблема выходит за рамки андроклинии и имеет более общее значение. Не исключено, что и в других естественных программах клеточных дифференцировок, закономерно реализующихся в онтогенезе растения, могут существовать аналогичные "эпигенетические окна" проявления свойства клетки к определенному типу морфогенеза, что нами обсуждалось в связи с соматическим эмбриоидогенезом [76].

Все это наводит на мысль о необходимости анализа андроклинии не только с позиций онтогенетических предпосылок и ограничений,но и в эволюционном аспекте, исходя из концепции о взаимообусловленности в историческом развитии онто- и филогенеза. Одноклеточная пыльца покрытосеменных растений является образованием,аналогичным, например, спорам низших споровых растений и грибов. У них, как и у покрытосеменных, образований споры предшествует мейоз, но если у споровых растений спора дает начало новому бесполому поколению, то у покрытосеменных главная функция микроспоры состоит в образовании мужских гамет. Бесполое поколение, если следовать аналогии со споровыми растениями и грибами, представлено в данном случае всего лишь одной клеткой (вегетатичная клетка) пыльцевого зерна. В случае андроклинии гаметогенез нарушается чаще всего в самом начале, и у большинства изученных видов покрытосеменных растений новая андроклинная особь возникает либо непосредственно из зрелой микроспоры, либо из вегетативной клетки пыльцевого зерна. Следовательно, андроклинные растения, возникающие из микроспоры.или пыльцы, являются аналогами бесполого поколения споровых растений и грибов. Таким образом, есть достаточные основания рассматривать явление андроклинии у высших растений с точки зрения теории рекапитуляции. Микроспора современных покрытосеменных растений при определенных условиях проявляет свойство аналогичной структуры (споры) филогенетически более древних и менее организованных форм, которое выражается в ее способности дать начало бесполому поколению. Следует подчеркнуть, что рекапитулирует сама возможность включения морфогенетической программы развития именно на этой аналогичной стадии, тогда как по сути это развитие не является прямым и точным отражением программы морфогенеза древних форм, а повторяет программу онтогенеза современного вида растения. Приведенные факты позволяют судить, что андроклиния не является каким-либо случайным явлением, а имеет онто- и филогенетические основания и эволюционные предпосылки. С этих же позиций становится понятным,почему в культуре неоплодотворенных завязей и семяпочек непосредственно из макроспор также с успехом удается получать эмбриоиды [122,288-289],Одной из центральных задач является познание генетических закономерностей андроклинии. В этой области исследований представляют интерес два основных направления. Первое связано с разработкой проблемы генетической детерминации андроклинии. Второе - с изучением онтогенетических, генетических и популяционно-генетичес-ких последствий андроклинии. Оба эти направления в современной литературе освещены недостаточно глубоко с теоретической точки зрения, без ясно очерченных целей, задач, а также путей их решения и дальнейших перспектив. В связи с этим первоочередной задачей является анализ и приведение в систему разрозненных фактов и идей, имевших отношение к рассматриваемым проблемам.

Накоплено обилие фактов, указывающих, что разнообразные по своей природе факторы могут существенно и различным образом влиять на характер протекания процессов при андроклинии и в то же время зачастую приводят к одинаковому конечному результату. Поэтому важно определить относительную роль паратипических, эпигенетических и генотипических факторов в изменчивости частоты андроклинии, а также выявить и изучить конкретные механизмы такой изменчивости. Однако вычленение вклада геношшической изменчивости в общую изменчивость частоты андроклинии, а также в фенотипическую изменчивость андроклинных особей, представляется весьма не простым делом, и для этого необходимо проведение ряда предварительных исследований, которые подготовили бы условия для достижения поставленной цели. Поскольку методические аспекты проведения генетических исследований андроклинии, так же как и основные направления таких исследований, в литературе обсуждались не достаточно полно, мы попытаемся частично восполнить этот пробел, изложив собственную точку зрения по некоторым вопросам.

Прежде всего важно соблюдать "принцип постоянства селективного фона". Он включает стандартизацию всех операций и условий андроклинного цикла, начиная от выращивания доноров до получения взрослых андроклинных растении. Обоснованием этому является ранее установленная закономерность, что отбор генотипов в различных условиях проявления признака может приводить к существенно различным результатам [20].С другой стороны, целенаправленное использование различных градаций постоянных селективных фонов (по степени давления селективного фактора) позволило бы решать вопросы об эффективности и генетических последствиях отбора в разных условиях развития.

Предваряя генетический анализ, важно у исследуемого объекта изучить конкретные цитоэмбриологические пути эмбриоидогенеза и дальнейшее развитие андроклинной особи, выявить черты дискретности морфогенетических программ развития, их причинно-следственные связи и на этом основании определить фенотипические признаки-маркеры, наиболее стабильные по проявлению и существенные по своему функциональному и диагностическому значению. Возможность выделения именно таких стабильных признаков базируется на существовании относительной автономности и постоянства в развитии признаков с высокой адаптивной ценностью и на наличии подвижных и устойчивых коррелятивных зависимостей между развиващимися признаками в системе целостных программ онтогенеза [III]. Подобные дризнаки-мар-керы могут быть положены в основу генетического анализа.

Нужно проводить специальную подготовительную работу по созданию форм с альтернативными (контрастными) признаками, характеристиками и свойствами для последующих генетических исследований. Например, важно было бы отобрать линии: с низкой и высокой частотой андроклинии; с преобладанием каллусо- или эмбриоидогенеза,того или иного пути развития (А,В или С); со слабой и сильно выраженной тенденцией к образованию нередуцированных микроспор, эн-доредупликации, слиянию ядер и т.гг. Создание таких альтернативных линий, естественно, должно предусматривать и надежную проверку наследования признаков в ряде поколений.

Большое значение имело бы получение серий мутантов с блоками морфогенеза, маркирующих последовательные стадии развития. Особый интерес представляли бы мутации, затрагивающие механизм перепрограммирования гаметогенеза на спорофитный путь развития.

В генетических работах первостепенное значение имеет количественный анализ частот признаков в потомстве. Поэтому актуален вопрос о критериях оценки частоты андроклинии. Дело в том, что в литературе по этому вопросу нет единого мнения и разные авторы применяют различные критерии, что, несомненно, затрудняет сравнение получаемых результатов. По нашему мнению, выбор критерия оценки частоты андроклинии должен быть обоснован изучением характера распределения исследуемых признаков в выборочных совокупностях. Поскольку признак "частота андроклинии" отражает конечный результат (факт возникновения особи), то в нем, как правило, находит выражение то, что в теории систем получило название эквифиналь-ность, то есть возможность достижения одного и того же результата различными путями. Например, андроклинные особи могут возникать из пыльцевых зерен, находящихся на различных стадиях развития, и далее развиваться совершенно разными путями (А,В,С). Само развитие может осуществляться путем эмбриоидогенеза или каллусогенеза с последующей регенерацией (эмбриоидо- и геммогенез). Все это позволяет предположить, что и генетические факторы, обусловливающие один и тот же конечный результат, могут быть различными. Следует также учитывать, что степень влияния и относительное значение тех или иных факторов конкретно определяется сферой их воздействия,которая имеет естественные пространственно-временные ограничения, В связи с этим возникает необходимость анализа эффективности действия различных факторов, в том числе и генетических, в тесной связи с иерархией уровней контроля проявления признака: популяция растений-доноров, материнский спорофит, соцветие, цветок, пыльник, популяция пыльцы и отдельное пыльцевое зерно.

Выше уже обращалось внимание на то, что при андроклинии именно пыльцевое зерно (и развивающийся из него спорофит) должно стать точкой приложения генетического анализа, единицей отбора и количественного учета. Тем не менее сами исследования не должны сводиться исключительно к генетике гаплоидных клеток, а одновременно развиваться и в направлении генетики гаплоидных клеточных популяций, поскольку мы имеем дело с естественной популяцией гаплоидных клеток, поведение которых может быть подчинено как внут-рипопуляционным взаимодействиям, так и интегрируицему влиянию пыльника, как целостной функциональной системы. Нет особых оснований исключать возможность существования определенного механизма, регулирующего наследственный полиморфизм, а также возможность наличия специфических форм и направлений отбора в таких клеточных популяциях. Вопрос об изменении формы и направления отбора в популяциях гаплоидных клеток в связи с андроклинией нами уже обсуждался [70]. Следует заметить, что в области генетики соматических клеток животных и человека, которая зародилась и начала бурно развиваться примерно 25 лет тому назад, на современном этапе также ощущается необходимость переноса центра тяжести исследований к генетике клеточных популяций [ 7].

Большие перспективы следует. ожидать в области клеточной инженерии, включащей клеточную и мутационную селекцию, генетическую трансформацию и трансдукцию в сочетании с преимуществами анд-роклинного цикла. Эти преимущества очевидны и заключаются: в возможности работы с неограниченной популяцией гаплоидных клеток; в использовании спектра естественной комбинативной изменчивости; в получении растений из одной исходной клетки путем амбриоидогенеза; в возможности применения методов клеточной селекции.

В этом плане исследований нами были достигнуты некоторые успехи. На основе андроклинного цикла у табака разработаны подходы получения рентгено- и фотоиндуцированных мутантов [53-54,57-58, 61,72] и метод их перевода на диплоидный уровень с использованием культуры ткани [63]. Показана принципиальная возможность селекции соматических гаплоидных клеток табака на солеустойчивость [26], соматических клеток табака и пшеницы на резистентность к магнитным полям [25,48], а также клеток пшеницы на устойчивость к низкой отрицательной температуре [52].

Серьезной разработки требует и проблема онтогенетических и генетических последствий андроклинии. Следует заметить, что альбинизм, а также последствия возникновения растений из генеративной клетки, до сих лор рассматриваются с точки зрения трудностей, возникающих на пути получения.из пыльцы полноценных гаплоидных растений для селекционных целей. Однако.необходимо обратить внимание еще на одну сторону данных явлений.

Эти явления имеют общие черты. Во-первых, по происхождению. Специфическое состояние ядра и собственно хроматина генеративной клетки, а также эпигенетический блок развития пластид в хлоропла-сты, возникают в процессе формирования пыльцевого зерна как следствие его специализации к выполнению половой функции. Во-вторых, такое специализированное состояние органелл клетки (ядра и пластиды) может длительное время сохранять постоянство, несмотря на то, что пыльцевое зерно, развиваясь по спорофитному пути, претерпевает череду сменяющих друг друга клеточных дифференцировок (эпигенетических состояний клетки), причиной которых является дифференциальная активность генов, а следовательно, и дифференциальная активность эпигенотипа. В литературе известны факты об ограничении тотипотентности клетки в связи с ее специализацией [ 5]. В данном случае, вероятно, следует говорить об ограничении "тотипотентности" органелл клетки в связи с определенным состоянием ее специализации. Причем, сама клетка в дальнейшем восстанавливает тотипотен-тность в плане осуществления морфогенетических программ (онтогенеза), а ее органоллы сохраняют приобретенные ограничения. Каков биологический смысл данного явлений? Какова его роль в дифференциальной активности эпигенотипа клетки и каковы молекулярно-генети-ческие механизмы, обеспечивающие длительное сохранение постоянства эпигенетических состояний органелл в ряду клеточных поколений на фоне явной активности и изменчивости других внутриклеточных систем? Решение этих вопросов остается открытым.. Не исключено, что явление альбинизма, как следствие андроклинии, может представлять интерес при его рассмотрении в связи с установленными фактами о том, что наличие хлоропластов в тех или иных органах зародыша свойственно лишь определенным растениям, так называемым хлороэмбриофитам [14]. Деление покрытосеменных на хлоро эмбриофиты и лейкоэмбриофиты породило острую дискуссию, особенно по вопросу о функциональном значении хлоропластов зародыша. Альбинизм при андроклинии и отсутствие хлоропластов у лейкоэмбриофитов, вероятно, могут иметь какое-то отношение и к явлению одно-родительской передачи цитоплазматических компонентов и наследованию цитоплазматических детерминант по материнской линии, что характерно для многих видов растений Г80].

Андрогенные растения характеризуются достаточно широким спектром генотипической и фенотшшческой изменчивости, которая может быть обусловлена различными причинами. Выявление причин и закономерностей такой изменчивости, поиск эффективных путей еерегуляции имеют важное значение не только для теории, но и для разработки специальных технологий ускоренного создания генетически разнообразного селекционного материала, Б этом плане, по нашему мнению, перспективными являются следующие направления: I) разработка ускоренных методов получения растений различной плоиддас-ти, в том числе и диплоидных гомозигот, непосредственно из микроспор путем экспериментальной регуляции цитокинеза, эндоредуплика-цш и слияния ядер; 2) создание серий анеуплоидных линий для хромосомной инженерии; 3) использование "мини-микроспор" в качестве вектора для переноса хромосом реципиенту; 4) получение мутантов из пыльцы на основе методов экспериментального мутагенеза; 5) разработка принципов отбора гаплоидных рекомбинатов на различных селективных фонах,В ходе изложения и анализа фактического материала, накопленного в литературе, а также результатов собственных исследований, полученных ранее при изучении культуры пыльников табака, перца, петунии и ряда других объектов, мы стремились показать, что сфера научного и практического приложения андроклинии весьма многоплановая Главное внимание было уделено кругу тех проблем, которые еще не нашли должного освещения.

Прежде всего мы попытались обосновать точку зрения, что анд-роклиния заслуживает внимания не только как эффективный метод получения гаплоидов, но и как экспериментальная система размножения, имекщая и свою специфику и черты сходства с другими системами размножения.

Своеобразие андроклинии, как канала передачи генетической информации, находит отражение в онтогенетических и генетических последствиях данного явления. В этой области наименее изученными остаются вопросы о путях, формах и специфических особенностях отбора генотипов в условиях in vitro.

Б настоящее время уже не вызывает сомнения, что использование андроклинии в селекции позволит ускорить создание новых высокопродуктивных сортов. Однако без проведения фундаментальных исследований явления андроклинии на важнЕйших сельскохозяйственных культурах вряд ли можно ожидать быстрой разработки и внедрения новых технологий в селекционную практику. Поэтому в качестве объекта для дальнейшего изучения некоторых аспектов андроклинии мы выбрали пшеницу.

2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЗДОВАНШ 2,1. Исходные объектыВ работе использовали различные сорта, селекционные формы, гибриды твердых и мягких,пшениц, различавшиеся по своим биологическим особенностям и происхождению.

Твердые пшеницы 2п = 4х= 28 (Triticum durum L.)1) озимые сорта - Харьковская I, Одесская юбилейная;2) яровой сорт - Харьковская 46;3) озимые селекционные формы селекции Н.Н.Салтыковой (СХИ, Саратов) - Гордеиформе 427/77, Эритромелян 8/72;4) потомство гибридов,озимых форм селекции Н.Н.Салтыковой -Эритромелян 8/72 х Гордеиформе 427/77, (Леукурум 673/67 х Овеачик 65) х Харьковская I, Ш 423-454/77 (Jß 36), Ш 423-454/77 (№ 56), Гордеиформе 427¡11 х.Харьковская I (№67), Гордеиформе 427/77 х Харьковская I (№ 68), IHFg Одесской юбилейной от свободного опыления твердыми озимыми формами.

Мягкие пшеницы 2д= 6х= 42. (Triticum aestivum I.)1) озимый сорт селекции Н.Н.Салтыковой - Лютесценс 72;2) яровые,сорта селекции НШСХ Юго-Востока - Саратовская 29, Саратовская 38, Саратовская 52;3) аналог сорта Саратовская 29, созданный В.А.Крупновым (НШСХ Юго-Востока, Саратов) - АС-29.

На тепличных растениях были проведены только эксперименты по цитоэмбриологическому изучению культивируемых пыльников сорта Саратовская 38. Для решения остальных вопросов использовались полевые растения.

Структура и логика эксперимента строились на принципе постоянства селективного фона, что обеспечивалось стандартизацией всех операций андроклинного цикла, начинал от выращивания растений-доноров и кончая получением регенерантов (рис.2.1).

Донорные растения из исходной популяции изучаемого объекта выбирались произвольно.

Основной отбор побегов с колосьями проводили в период труб-кования ежедневно в утренние часы. Использовали побеги; у которых влагалище предпоследнего листа (последний лист флаговый) находилось на уровне центральной части колоса (^1 см). В колосьях, срезанных по указанному морфологическому признаку, пыльники двух нижних цветков колосков, как правило, содержали одноклеточную пыльцу.

После предобработки колосья вместе с листовой оберткой стерилизовали в течение 5-7 минут водным раствором диацида (0,33 г этанолмеркулхлорида; 0,60 г цетилпиридинийхлорида; 0,1 мл твин-20 на I л дистиллированной воды), после чего промывали тремя порциями стерильной воды.

Затем (см.рис.2.1) колосья освобождали от листовых оберток, самые нижние (I-3-й) и верхние (начиная с 15-го) колоски удаляли, а для культивирования с помощью препаровальных игл вычленяли пыльники из двух нижних цветков 4-14-х колосков средней части колоса. При этом пыльники всех первых (самых нижних по расположению в колоске) цветков нижней половины колоса (4-8-е колоски) объединяли вместе и помещали в одну пробирку (диаметр 16 мм, высота 150 мм) с 10 мл питательной среды, а пыльники всех вторых цветков тех же колосков - в другую. Соответствующим образом рассаживали пыльники верхней половины колоса (10-14-е колоски). В результате пыльники каждого колоса распределяли в 4 пробирки по 15 штук в каждой. Густота посева пыльников во всех опытах была постоянной. Центральный (9-й) колосок каждого колоса в момент посадки пыльников на питательную среду фиксировали в растворе ацетоалкоголя (1:3) для цитологического определения стадии развития пыльцы.

Состав питательных сред приведен в таблице 2.1. Все питательные среды имели pH = 5,8 - 6,0. Среды автоклавировали в течение 15-20 мин при давлении 0,7-0,9 атм.

Морфологическое изучение культивируемых пыльников проводили под стереоскопическим микроскопом МБС-2, начиная с 21-х суток культивирования и далее через каждые 7 суток в течение 1,5-2,5 месяцев.- При этом подсчитывали число пыльников с различными структурами и число этих структур в пыльнике.

Б таких условиях некоторые эмбриоиды заканчивали дифференци-ровку и прорастали. По мере развития растеньиц и появления у них 3-5 листочков и хорошо развитых корней их пересаживали в грунт и выращивали до конца вегетации.

С целью получения каллусных штаммов андроклинные структуры различных типов отделяли от пыльников и пересаживали на среды Ш, У и У1. В средах Ш и У концентрация сахарозы была снижена до 2%, концентрация 2,4-Д увеличена до 2,0 мг/л и дополнительно введен дрожжевой экстракт - 100 мг/л. Среда У1 представляла собой "кондиционированную" среду, на которой в течение месяца культивировался каллусный штамм Coix sp (2n =32), характеризующийся инТаблица 2.1 Состав питательных сред, в мг/'лКомпоненты|Среда IСреда ПСреда } Среда'УУ1Микросоли :КБ0,КС1КН2Р0,ЗШ4ЕО31%304.7Н20Са(Н03)2СаС12.2Ы20Мшфосоли:1000 1000 1000 1000 1900 190065 65 65 — — —300 300 300 170 170 1701000 1000 1000 1650 1650 165035й 35й 35й 370 370 370347 347 347 — — —440Добавки:440440Н3В03 МпЭО,,4Н20 1,6 1,6 1,6 6,2 5,2 6,24,4й 4,4й 4,4й 22,3 22,3 22,3СаС12\бН20 — — - 0,025 0,025 0,025Си30А.5Н20 ЖаМоОд.2Н20 — — — 0,025 0,025 0,0251,5 1,5 1,5 8,6 8,6 8,6— — — 0,25 0,25 0,250,8 0,8 0,8 0,83 0,83 0,83РеБ04.7Н20 1Та? ЗЛТА 27,8 13,9 27,8 27,8 27,8 27,837,3 18,65 37,3 37,3 37,3 37,3тиамин 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5пиридоксин 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5никотиновая к-та 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 5,0аскорбиновая к-та 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 —мезо-инозит 100 100 100 100 100 —2,4-дихлорфенокси- уксусная к-та 0,25 — 2,0 0,25 2,0 —:,4,5-трихлорфенокси- уксусная к-та — — — — — 1,03-индолилуксусная к-та — 0,2 — — — —Агар 7000 7000 7000 7000 7000 7000Сахароза 110000 20000 20000 ПОООО 20000 20000Дрозжевой экст-т — — 100 — 100 —к Примечание. Расчет на безводную соль.тенсивным ростом и высокой способностью к регенерации зеленых растений [39-41].

Каллусные штаммы, полученные от андроклинных структур, культивировали в темноте, а регенерацию растений осуществляли в условиях 16-часового периодического освещения.

Морфологический анализ штаммов проводили под стереоскопическим микроскопом. Рост каллуса оценивали визуально по 3-балльной системе: I балл - плохой; 2 балла - хороший; 3 балла - интенсивный рост. Для сравнения различных штаммов использовали показатель интенсивности роста каллуса (ИРК) - среднее число баллов на одну повторность (I трансплантат) в пределах штамма. Кроме того, для кавдого штамма подсчитывали число трансплантатов, в которых образовывались корни, зоны вторичной дифференцировки зачатков растений и растения. Количественную оценку морфогенеза штаммов осуществляли на основе показателей интенсивности корнеобразования (ИК) и интенсивности побегообразования (ИП), которые выражают среднее число соответствующих новообразований на одну повторность (один трансплантат).

Для количественной оценки частоты андроклинии в качестве основного показателя использовали среднюю арифметическую величину распределения Пуассона, которая в частном случае культуры изолированных пыльников подсчитывается как среднее число андроклинных структур на один высаженный пыльник:м --100% (2.1)где т - число андроклинных структур в пыльнике (0,1,2,3 и т.д.). 5 -.частота встречаемости пыльников, содержащих 0,1,2,3 и т.д. структур; N - общее число пыльников в варианте опыта.

В случае распределения Пуассона ошибка средней величины определяется следующим образом:(2.2)Для оценки достоверности разности между выборочными показателями использовали критерий Стыодента [44].

На основании анализа пыльников, культивируемых на исходных средах (среды I и 1У), подсчитывали частоту возникновения андро-клинных-структур всех типов без учета конечной морфо генетической реакции. Затем после окончательного выявления характера поведения полученных структур при их культивировании на последующих средах для каждого типа структур (каллусов, эмбриоидов или растений) частоту возникновения подсчитывали отдельно.

Частота андроклинии дана в процентах. Например, частота возникновения растений равная 2% означает, что на каждые 100 высаженных пыльников получено в среднем 2 растения.

2.3. Цито эмбриологические методыВо всех экспериментах стадию развития пыльцы в момент посадки пыльников определяли отдельно для I и П цветков, используя центральный (9-й) колосок каждого колоса. При этом 3 пыльника из одного цветка препарщювали в капле ацетокармина, после чего под микроскопом просматривали 100 пыльцевых зерен, классифицируя их по стадиям развития и стерильности.

Достоверность различий между выборочными показателями определяли по критерию "фи", предложенному Фишером [44].

Пыльники с каллусом помещали в углубление на стекле Максимова, заливали ацетокармином и слегка подогревали на спиртовке. Через 20-30 мин пыльник с каллусом переносили на обычное предметное стекло в каплю ацетокармина и под стереоскопическим микроскопом с помощью препаровальных игл отделяли каллусную массу от пыльника. Каллусную массу накрывали покровным стеклом без какого-либоспециального нажима. При этом клетки рыхлых тканей расслаивались по стеклу. Если же внутри каллусной ткани присутствовали какие-либо относительно крупные организованные структуры (меристемоиды, крупные эмбриоиды), они в таких условиях сохраняли свою целости ность. После подсчета числа таких организованных структур и изучения их морфологии путем легкого постукивания по покровному стеклу достигали дальнейшего расслоения клеток и вновь просматривали препарат, выявляя и описывая более мелкие структуры. После выявления всех типов структур добивались монослойного расположения клеток на препарате и.проводили дальнейшее изучение их формы, строения, окраски и т.д.

3. ЦИТОЭМБРИОЛОБШККИЕ ОСОБЕННОСТИ АНДРОКЛИНШ 3.1. Пространственно-временная асинхронность микроспоро- и микрогаметогенеза in vivoКак было показано, стадия развития пыльцы в момент посадки пыльников на среду является важным фактором, от которого в значительной степени зависит частота индукции клеток к эмбриоидогене-зу, а в конечном счете и выход андроклинных растений. В связи с этим на пшенице необходимо было в первую очередь выяснить, существует ли в пределах одного колоса связь между стадией развития пыльцы в пыльниках и их местоположением в колосках по длине колоса, а также в разных цветках колоска. С этой целью мы провели цитологическое изучение пыльников разных форм пшениц (Харьковская I, Лютесценс 72, Саратовская 29, Саратовская 52).

В. результате было установлено, что стадия развития пыльцы в пыльниках нижних (I-3-х) и верхних (начиная с 15-го) колосков не соответствует таковой в пыльниках средней части колоса (4-14-е колоски). В колосках, находящихся в центральной части колоса, наблюдалась асинхронность в прохождении стадий микроспоро- и гаме-тогенеза между пыльниками разных цветков, причем каждый вышерасположенный цветок запаздывает в развитии пыльцы относительно цветка, расположенного ниже. Эти результаты согласуются с данными Т.Б.Батыгиной [ 3], которая указывает, что у пшеницы "с самого начала формирования цветков в колоске можно уже отметить разные темпы развития нижних и верхних цветков. В дальнейшем этот разрыв в теше все увеличивается; недоразвитые верхние цветки отмирают" (стр.138) и, что "в верхних и нижних колосках, а также в верхних цветках колоска завязи.и пыльники отстают по развитию, нередко остаются недоразвитыми, и в них наблюдаются различные аномалии" (там же, стр.7-8).

Из полученных наш данных по цито эмбриологической характеристике микроспоро- и гаметогенеза в пределах колоса следует, что пыльники самых нижних (первых) цветков колосков центральной части колоса (4-14-е колоски) представляют собой достаточно однородную популяцию и находятся приблизительно на одинаковой стадии развития пыльцы; пыльники вторых цветков той же части колоса также сходны между собой по стадии развития пыльцы, но отличаются от первых некоторым запаздыванием ее развития. То же самое относится и к пыльникам вышерасположенных цветков. Поэтому дня цитологического контроля стадии развития пыльцы в пыльниках I, П, Ш цветков средней части колоса достаточно использовать один из центральных колосков.

Между пыльцевыми зернами, составлягацими популяцию одного пыльника, также имеет место некоторая асинхронность в развитии, однако, она менее выражена, чем между пыльцой из пыльников разных цветков.

Другим важным обстоятельством является то, что в пыльниках интактных растений уже на стадии одноклеточной пыльцы наряду с нормально развитыми и хорошо окрашенными пыльцевыми зернами иногда встречались сморщенные, прозрачные или слабоокрашенные пыльцевые зерна, которые, по-видимому, следует отнести к стерильным. Кроме того,, попадалась окрашенная, но дефектная пыльца с явными признаками дегенерации цитоплазмы, ядра, обоих. Количество стерильной и дефектной пыльцы варьировало в зависимости от конкретного объекта исследования, а также от условий выращивания донорных растений, Причем, по этому признаку наблюдались различия между колосьями, а также между пыльниками одного колоса, но принадлежащими к разным цветкам. Стерильная и дефектная пыльца чаще встречалась у тех селекционных форм, у.которых еще не закончились процессы формообразования, например, у озимой твердой пшеницы Гордеиформе427/77, а также у растений, выращиваемых в теплице, особенно в зимнее время.

Руководствуясь результатами цитоэмбриологических наблюдений, мы разработали единую для всех экспериментов систему посадки пыльников в культуральные пробирки, в основу которой были положены следующие принципы: I) пыльники каждого колоса.должны всякий раз распределяться по пробиркам по единой схеме; 2) -элементарная выборка пыльников, т.е. группа пыльников в одной пробирке, должна принадлежать к одному колосу, равноценным цветкам и иметь как можно более сходные начальные цитоэмбриологические характеристики (стадию развития пыльцы, степень стерильности и т.п.); 3) каждая элементарная выборка должна состоять из одинакового числа пыльников, чтобы исключить влияние фактора густоты посева; 4) при определении цитологических характеристик пыльников I, П, Ш цветков в момент посадки пыльников на питательную среду необходимо фиксировать один и тот же центральный колосок (9-й).

3.2. Фенотипическая изменчивость пыльцы в. начальный период культивирования 3.2.1. Индукция и пути развития пыльцыОпыты проводили на яровой мягкой пшенице сорта Саратовская 29. Для цитологического изучения было отобрано три исходных колоса, у каждого из которых в пыльниках I, П, Ш цветков пыльца находилась на одноклеточной стадии развития.

Прежде всего следует обратить внимание на качественную характеристику процессов. В начальный период (1-13-е сутки) культивирования пыльников наш было выявлено большое разнообразие пыльцевых зерен, отличающихся друг от друга по ряду фенотипических признаков. К таким признакам мы относим: число,' размер, форму, интенсивность окраски ядер, их расположение относительно поры пыльцевого зерна; размер и форму пыльцы; состояние и степень окраски цитоплазмы; наличие крахмальных зерен. Основываясь на перечисленных признаках, всю совокупность наблюдаемых пыльцевых зерен мы подразделили на 12 основных классов.

После помещения пыльников на питательную среду в течение первых суток культивирования наблюдалась наибольшая митотическая активность одноклеточной пыльцы'. Впоследствии она снижалась и уже на пятые сутки и далее не было обнаружено ни одного случая деления одноклеточной пыльцы. В результате первого деления одноклеточной пыльцы возникали пыльцевые зерна трех различных классов: типичная двуклеточная дифференцированная пыльца (класс В+Г) с большим диффузным, слабо окрашенным, вегетативным (В) ядром и более компактным, интенсивно окрашенным генеративным (Г) ядром; пыльцевые зерна с двумя морфологически идентичными диффузными ядрами, сходными с ядром вегетативной клетки пыльцевого зерна (класс 2В); и пыльцевые зерна с двумя компактными, интенсивно окрашенными ядрами, похожими на ядро генеративной клетки пыльцевого зерна (класс 2Г). Общей характерной особенностью последних двух классов пыльцевых зерен является отсутствие постмитотических различий между двумя дочерними ядрами.

Из двуклеточной пыльцы с дифференцированными ядрами (класс В+Г) образовались пыльцевые зерна трех классов в зависимости от того, какое ядро приступала к делению. Чаще делилось ядро генеративной клетки и возникала трехклеточная пыльца (класс В+2Г), характерная для обычного гаметогенеза. Впоследствии некоторые пыльцевые зерна этого класса достигали зрелости, у них наблюдалось формирование спермиев, а в цитоплазме накапливались крахмальные зерна (класс И1 - зрелая трехклеточная пыльца). Однако иногда к делению приступало не генеративное ядро, как ато имеет место в норме, а вегетативное. Продукты такого деления сохраняли сходство с ядром вегетативной клетки пыльцевого зернам В результате развивалась трехъядерная пыльца с двумя морфологически идентичными ядрами вегетативного типа и с одним генеративным ядром (класс 2В+Г).

Гораздо реже делились оба ядра одновременно, что приводило к образованию четырехьядерной пыльцы с двумя ядрами вегетативного типа и двумя ядрами генеративного типа (класс 2В+2Г). Здесь же уместно заметить, что четырехьядерная пыльца класса 2В+2Г может возникать иным путем, а именно, из трехклеточной пыльцы класса В+2Г в результате деления вегетативного ядра, однако, такие случаи встречались крайне редко.

Двуядерная пыльца класса 2В также была способна к дальнейшему развитию. В такой пыльце чаще всего делилось одно из ядер, реже оба одновременно. Вследствие этого возникали трехьядерные (класс ЗВ) или четырежьядерные (класс 4В) пыльцевые зерна с морфологически сходными диффузными ядрами вегетативного типа.

В противоположность этому у двуядерной пыльцы класса 2Г последующих делений компактных густо окрашенных ядер не наблюдалось.

Следует отметить, что наряду с пыльцевыми зернами различных классов, способных к дальнейшему развитию, начиная с самого начала культивирования в пыльниках встречалось очень много стерильных и дегенерирующих пыльцевых зерен (класс Д).

Таким образом, в начальный период культивирования 1-13 сутуки) б пыльниках пшеницы происходит разнокачественные цитологические явления. Причем, как было продемонстрировано выше, во многих случаях установлена преемственность между различными классами пыльцевых зерен. На основании этого можно выделить несколько основных процессов, осуществлявшихся в культивируемых пыльниках пшеницы, а также определить конкретные цитологические пути развития пыльцы.

Было выявлено, что значительная доля одноклеточной пыльцы детерминирована к нормальному развитию и в условиях культивирования последовательно реализует программу гаметогенеза вплоть до образования зрелых трехклеточных пыльцевых зерен, аккумулирующих крахмал (рис.П. 1.1.1-8). Исходя из этого, можно заключить, что га-метогенез является одним из процессов, имеющих место в культуре пыльников.

На разных стадиях формирования пыльцевого зерна естественный я>д дифференцировок может нарушаться и происходит переключение программы гаметогенеза на новые альтернативные программы, которые уже реализуются иными цитологическими путями. Б связи с этим необходимо специально рассмотреть вопросы о моментах индукции и возможных схемах начальных этапов морфогенетических процессов.

Полученные нами фактические данные говорят о том, что стадия одноклеточной пыльцы является уже той первой начальной точкой, с которой начинается реализация иной программы развития. Как уже отмечалось, у некоторых пыльцевых зерен после первого деления отсутствовала дифференциация между дочерними ядрами и вместо вегетативного и генеративного ядер образовывались два морфологически идентичных ядра, по всем признакам сходных с ядром вегетативной клетки пыльцевого зерна. Из таких пыльцевых зерен в дальнейшем образовывались многоядерные пыльцевые зерна (рис.П.1.2.1-8). Этот путь развития пыльцы согласно известной классификации [270]обозначен как путь В.

Некоторые исследователи [226,228-229] связывают появление пыльцы класса 2В с нарушением ориентации оси веретена деления, в результате чего оба образовавшихся ядра оказываются в сходном ци-топлазматичесном окружении, что препятствует дифференцировке ядер на вегетативное и генеративное. Наши наблюдения подтверждают это. В норме у пшеницы ось веретена деления либо совпадает, либо расположена под острым углом к гипотетической оси, проходящей через пору перпендикулярно поверхности пыльцевого зерна до противоположной его стенки (см.рис.П.1.1.2-3). При образовании пыльцы класса 2В веретено деления, как правило, перпендикулярно этой гипотетической оси (см.рис.П.1.2.3), поэтому дочерние ядра действительно оказываются в равноценных условиях относительно цитоплазмати-ческого окружения (см.рис.П.1.2.4-5).

В литературе отсутствуют сведения о возникновении у пшеницы пыльцевых зерен с двумя морфологически идентичными, но компактными и густоокрашенными ядрами, сходными с генеративным ядром. Этот путь начального развития пыльцы мы обозначили как путь Д (см.рис. П.1;2^9) ; Однако в наших исследованиях не было обнаружено последующих стадий развития таких пыльцевых зерен.

Таким образом, со стадии одноклеточной пыльцы возникают два пути развития, отклоняющиеся от типичного хода гаметогенеза. Один из них, а именно, путь Д, по-видимому, является тупиковым.

Следующей стадией развития пыльцы, на которой также возможно нарушение гаметогенеза, является стадия двуклеточной пыльцы. В большинстве случаев развитие осуществляется за счет деления вегетативного ядра и его производных (рис.П.Г.3.1-5). Этот путь известен в литературе как путь А [270]. Нами же он обозначен как путь А-1. Помимо этого на стадии двуклеточной пыльцы наблюдалось деление обоих ядер вегетативного и генеративного (рис.П. 1^4.1-3).

Этот путь известен как путь С [270].

На стадии трехклеточной пыльцы также, хотя и в редких случаях, происходило деление вегетативного ядра. Этот путь развития пыльцы нами назван путь А-Д (рис;П.1.3.6-7).

Следовательно, при культивировании изолированных пыльников пшеницы естественный ход гаметогенеза нарушается на всех трех последовательных стадиях, а именно, на стадии одноклеточной, дву-клеточной и трехклеточной пыльцы; Такое нарушение гаметогенеза является типичным для культивируемых пыльников пшеницы.

Процесс дегенерации пыльцы у пшеницы выражен достаточно сильно (рис.П.1.4.4-6). Как показали наблюдения, дегенерации подвержены пыльцевые зерна всех классов на различных этапах развития.

Анализ динамики частот встречаемости пыльцевых зерен различных классов в течение первых двух недель культивирования позволяет оценить относительный вклад описанных процессов в общий спектр фенотипической изменчивости пыльцы (табл.3.I).

Среди пыльцевых зерен, сохраняющих жизнеспособность, по количеству преобладают те, которые находятся на различных стадиях гаметогенеза, а также пыльца, развивающаяся по пути В. Путь А-1 представлен в несколько раз меньшим количеством пыльцы. Пыльцевые зерна, характеризующие пути А-П, С и Д, встречались еще реже.: Рассмотрение полученных результатов в связи со стадией развития пыльцы, на которой наблюдаются различные отклонения от нормы, позволяет прийти к заключению, что частота нарушений гаметогенеза в культуре пыльников снижается с каждым последующим этапом развития пыльцы'. Наибольшее количество нарушений имеет место на стадии одноклеточной пыльцы (пути В и Д), значительно меньше их на стадии двуклеточной пыльцы (пути А-1 и С) и совсем мало на стадии трехклеточной пыльцы (путь А-П).

Следует обратить внимание на изменение реакции цитоплазмы к окраске ацетокармином у некоторых многоклеточных пыльцевых зерен в определенный период культивирования. Б течение первой недели культивирования цитоплазма всех пыльцевых зерен окрашивалась слабо, по крайней мере, легко удавалось различать ядра. Однако через 9 суток и более на одних и тех же препаратах наряду со слабоокра-шенными многоклеточными пыльцевыми зернами встречались и такие, у которых цитоплазма окрашивалась настолько сильно, что число ядер можн^ было подсчитать только после частичного обесцвечивания цитоплазмы в 45% растворе уксусной кислоты. Такое изменение в реакции цитоплазмы на окраску ацетокармином, вероятно, обусловлено качественной перестройкой метаболизма многоклеточных пыльцевых зерен, что, в свою очередь, по-видимому, связано с вступлением их на путь эмбриоидогенеза. Последнее предположение подкрепляется тем фактом, что по степени окраски цитоплазмы густоокрашенные многоклеточные пыльцевые зерна проявляли очень большое! сходство с более развитыми эмбриоидами, которые нам удавалось наблюдать в пыльниках спустя 5 недель культивирования (рис.3.4.1-2.).

При цитологическом анализе пыльников, культивируемых на питательной среде от I до 21 суток, мы обращали внимание и на состояние соматических клеток внутренних словв пыльника,. Ни в одном пыльнике не было обнаружено пролиферации соматических клеток или развития из них каких-либо морфогенетических структур,,Таким образом, в результате данного исследования установлено, что в культивируемых пыльниках пшеницы осуществляется следующие процессы: I) гаметогенез; 2) нарушение естественного хода гаТаблица 3.2Встречаемость и динамика развития многоклеточныхпыльцевых зерен (МПЗ) в пыльниках пшеницы сорта Саратовская 29. ; 1.иВремя куль- | Общее число ; Количество (%) ПМЗ с числом ядер тлвирошшш, | 7-9 | 10 - Х2 |13 —15*9 13 15 73,3 20,0 6,7 0,0II 14 54 75,9 24,1 0,0 0,013 15 54 61,1 22,2 14,8 1,9II + 13) 42 123 69,1 22,8 7,3 0,8метогеназа на стадии одноклеточной (пути В и Д), двуклеточной (пути А-1 и С) и трехклеточной (путь А-П) пыльцы; 3) развитие из пыльцы многоклеточных андроклинных структур; 4) дегенерация пыльцы.'3.2.2. Эффект местоположения пыльника на колосеСледущей задачей было изучить характер изменения цито эмбриологических признаков в элементарных выборках пыльников при культивировании их на питательной среде и установить, существуют ли какие-либо различия между пыльниками, принадлежащими к разным цветкам, а также к нижней или верхней половине колоса.

Опыты проводили на яровой мягкой пшенице сорта Саратовская 29. Для цитологического изучения было отобрано 3 колоса, у каждого из которых в пыльниках I, П, Ш цветков 9-го колоска, в момент посадки пыльца находилась на одноклеточной стадии развития. Пыльники I, П и Ш цветков каждого колоса при посадке разделяли на две субпопуляции, одна из которых принадлежала к нижней (4-8-е) колоски, другая к верхней (10-14-е колоски) половине колоса. В процессе культивирования пыльники фиксировали через 1,2,3,5,7,9,11 и 13 суток.

Что касается спектра цитоэмбриологических признаков, то между пыльниками разных цветков различий не установлено. В пыльниках каждой изученной группы встречались одинаковые классы пыльцевых зерен, за исключением того, что в пыльниках Ш цветков мы не обнаружили пыльцы, находящейся в стадии первого митоза (смД¿2;табл.1).

Характеризуя изменения в процессе культивирования частоты встречаемости пыльцевых зерен, относящихся к различным стадиям гаметогенеза, следует отметить, что пыльники I цветков отличаются от пыльников П и Ш цветков тем, что у последних через сутки большее количество пыльцы все еще находится на одноклеточной стадии.' Помимо этого в пыльниках I цветков на 2-7 сутки чаще встречаются одноклеточные, трехклеточные пыльцевые зерна, а также трехклеточ-ная пыльца, аккумулирупцая крахмал, чем в пыльниках П, а тем более Ш цветков, у которых уже через 3 суток резко наступают процессы дегенерации, затрагивающие пыльцевые зерна всех классов.'Это, вероятно, является следствием отставания в развитии пыльцы вышерасположенных цветков; Однако это отставание, по «видимому, в значительной степени сглаживается благодаря предварительному выдерживанию колосьев при низкой температуре; За этот период пыльца в пыльниках П и даже Ш цветков также заканчивает подготовку к первому делению; Тем не менее, судя по очень интенсивной дегенерации пыльцевых зерен^в культивируемых пыльниках Ш цветков, можно заключить, что процессы, связанные с подготовкой пыльцы к делению в этих цветках при низкой температуре, происходили со значительно большими нарушениями.

С точки зрения андроклинии нас прежде всего интересуют пыльцевые зерна, отклоняющиеся в своем развитии от типичного гаметогенеза. На основании данных (см.П.2. табл.1) трудно судить о каких-либо существенных различиях между пыльниками I и П цветков по частоте возникновения нетипичных пыльцевых зерен разных классов. Для окончательною ответа на этот вопрос мы провели математическую обработку результатов, используя непараметрический критерий Волкоксона для сопряженных пар.

Как показано на табл.3.3, исходя из значений суммы рангов, по всем классам пыльцевых зерен, кроме класса дегенерирувдей пыльцы, незначительным преимуществом обладает Ъ цветок, но эти различия в подавляющем большинстве случаев статистически недостоверны или, например, для класса 2Г различие не удалось доказать.

Таким образом, на основании цитологического анализа культивируемых пыльников I и П цветков можно сделать вывод, что по частоте встречаемости пыльцевых зерен, представляющих различные цитологические пути развития, а именно, путь А (класс 2В+Г), путь В (классы 2В,ЗВ,4В) и путь С (класс 2В+2Г), существенные различияТаблица 3.3*Сравнение пыльников I и П цветков по частоте встречаемости пыльцевых зерен разных классов у сорта Саратовская 29-^.

Сумма рангов для { Различие: пыльников {достоверно (+);,Класс пыльцевых зерен} Число 'сравнивае-;мых пар,} п1-го |цветкад-;го | недостоверно С -);цветка |не доказано (+)2Г 13 78 > 13 +2В 26 221 > 130 ЗВ 22 128 > 124 —4В 9 28 > 17 —(2В+ЗВ+4В) 57 982 > 672 —2В+Г 20 106 > 104 —2В+2Г 15 64 > 56 —(2В+Г)+(2В+2Г) 35 332 > 298 —Д 26 128 < 241 —между элементарными выборками пыльников I и П цветков отсутствуют. Это дает основание рассматривать популяцию культивируемых пыльников I и П цветков как одну совокупность, обладающую в начальныйпериод культивирования (1-13-е сутки) сходными характеристиками.

Иная картина наблюдалась при сравнении пыльников двух нижних цветков с пыльниками Ш цветка (табл.3.4). Значения суммы рангов показывают, что пыльники Ш цветка значительно уступают по частоте встречаемости пыльцевых зерен всех изученных классов, но превосходят по количеству дегенерирующей пыльцы. Причем, различия недостоверны лишь по двум классам пыльцевых зерен, в четырех случаях они достоверны, а в трех случаях установлено, что сравниваемые выборки нельзя относить к одной генеральной совокупности, но в то же время осталось недоказанным, что они принадлежат к разным генеральным совокупностям.

На основании этого мы приходим к заключению, что пыльники Ш цветков нецелесообразно использовать для получения андроклинных структур, поскольку они даже в начальный период культивирования имеют низкую встречаемость пыльцевых зерен индуцированных к разТаблица 3.4Сравнение пыльников I, П цветков с пыльниками Ш цветков по частот© встречаемости пыльцевых зерен разных классову сорта Саратовская 29Класс пыльцевых зеренЧисло }Сумма рангов для | сравнивав- { пыльников {{ Различие: {достоверно (+);(2В+ЗВ+4В) 2В+Г 2В+2Г (2В+Г)+(2В+2Г)Д2Г 2В ЗВ 4В9 1615 940 13 13 261636 > 10126 > 10103 > 1640 > 6730 > 9079 > 2280 >11 312 > 3817 < 119++ + ++++витию, высокий уровень стерильности и дегенерации пыльцы.

Напротив, культивируемые пыльники двух нижних цветков по спектру цитоэмбриологических признаков и по количественным показателям представляют собой достаточно однородную популяцию, характеризующуюся более высокой частотой индукции,и могут быть использованы для получения андроклинных структур, даже при условии одновременной посадки пыльников на питательную среду,В Приложении 2 табл.2 представлены суммарные результаты ци-тоэмбриологического изучения пыльников I и П цветков, принадлежащих к нижней (4-8-е колоски) и верхней (10-14-е колоски) половине колоса.

Пыльники верхней половины колоса более синхронно осуществляют митотическое деление и в течение первых трех суток культивирования содержат почти вдвое большее количество двуклеточной, дифференцированной пыльцы, чем пыльники нижней половины колоса'.

Таблица 3.5Сравнение пыльников нижней и верхней половины колоса по частоте встречаемости пыльцевых зерен разных классов у сорта Саратовская 29Класс пыльцевых { Число {сравнивае- {Сумма рангов для ; пыльников { Различие: {достоверно (+),*зерен мых пар, } П \ 4-8-х !колосков ! 10-14-х 1колосков {недостоверно (-); {недоказано (+)2Г 16 35 < 114 2В 35 328 > 102 —ЗВ 24 102 < 198 —4В 15 52 < 68 —(2В+ЗВ+4В) 74 1241 < 1444 —2В+Г 25 151 < 174 —2В+2Г 16 48 < 88 —(2В+Г)+(2В+2Г) 41 364 < 498 Д 36 345 > 321 Математический анализ (табл.3.5) выявляет некоторую тенденцию к преобладанию пыльников верхней половины колоса над пыльниками нижней половины по большинству сравниваемых классов пыльцевых зерен. Однако везде разница по сумме рангов не столь велика и различия во всех случаях оказались статистически недостоверными.

Следовательно, по частоте возникновения пыльцевых зерен разных классов пыльники I и П цветков нижней и верхней половины колоса в начальный период культивирования (1-13-е сутки) проявляют сходство и их можно отнести к одной популяции.

Таким образом, проведенное сравнительное изучение цитоэмбриологических признаков культивируемых пыльников, составлшацих элементарные выборки, показывает, что в начальный период культивирования пыльники двух нижних цветков средней части колоса (4-14-е колоски) имеют в основном сходные качественные и количественные характеристики. Намечается лишь тенденция к незначительному увеличению частот возникновения пыльцевых зерен, индуцированных к развитию в пыльниках I цветков, по сравнению с пыльниками П цветков, а также в пыльниках верхней половины колоса по сравнению с пыльниками нижней половины. Тем не менее, эти тенденции находятся в пределах чувствительности критерия Вилкоксона, который не подтверждает достоверность различий.

Пыльники Ш цветков средней части колоса характеризуются низкой частотой индукции пыльцевых зерен всех классов и высоким уровнем дегенерации пыльцы, которая начинает проявляться уже через трое суток культивирования. В связи с этим их нецелесообразно использовать при одновременной посадке пыльников всех трех нижних цветков.

3.2.3. Влияние низкой положительной температурыРаботу проводили на яровой мягкой пшенице сорта Саратовская 38. Цитологически было изучено шесть колосьев, прошедших предобработку при низкой положительной температуре, и четыре контрольных колоса. Помимо этого, пыльники других колосьев (контрольных и предобработанных) культивировали в течение двух месяцев для подсчета андроклинных структур. Результаты цитоэмбриологического изучения пыльников в момент посадки и через 3 и 5 суток культивирования приведены в табл.3.6.

Колосья для контрольного варианта и для предобработки отбирали одновременно. При этом стремились срезать колосья в тот момент, когда в пыльниках I цветков основная масса пыльцы находилась на одноклеточной стадии развития, близкой к первому митозу^ О готовности пыльцы к делению судили по появлению в пыльнике первых делящихся клеток. В момент посадки в пыльниках контрольных колосьев присутствовали: одноклеточная, делящаяся (1-й митоз) и двуклеточная пыльца (см.табл^З.6, колосья 2-4).

Следует также отметить, что в контроле (колосья 2-4) помимо классов пыльцевых зерен, типичных для нормального гаметогенеза, при анализе пыльников, зафиксированных в момент посадки, с частотой были обнаружены пыльцевые зерна с двумя морфологически идентичными ядрами, сходными с ядром вегетативной клетки пыльцевого зерна (класс 2В).

Доля дегенерирувдей пыльцы в предо бработанных пыльниках достигает почти 70$, но она достоверно ниже, чем в контрольных,как через 3 (Ру5=99; /3 =0,999), так и через 5 суток (ру>=368; = 0,999) культивирования.'В пыльниках контрольного колоса № I процессы дегенерации были более резко выражены. Зтот колос отличался от остальных тем, что у него до культивирования большинство пыльцевых зерен находилось на дву- и трехклеточной стадии развития, приблизительно третья часть - на одноклеточной стадии и 5,3$ пыльцевых зерен имели два цитологически идентичных ядра, сходных с вегетативным.' Однако уже через 3 суток дву- и трехклеточные пыльцевые зерна, в том числе и некоторые из класса 2В, обладали явными признакамидегенерации. Через 5 суток культивирования количество дегенерирующей пыльцы в пыльниках этого колоса еще более увеличилось и достигло 96,6$.

Анализ пыльников колоса № I показывает, что культивирование пыльников, содержащих в момент посадки на среду главным образом дву- и трехклеточную пыльцу, может приводить к отрицательным результатам, причиной которых является дегенерация пыльцы в самый начальный период культивирования. Необходимо обратить внимание, что в пыльниках данного колоса процессы развития многоклеточных пыльцевых зерен по пути A-I и В не реализовывались. Следовательно, состояние и степень зрелости самого пыльника в момент его помещения на среду являются важным условием реализации спорофитного пути развития пыльцы.

Наличие в контрольных пыльниках до их культивирования некоторого количества пыльцы класса 2В говорит о том, что процессы индукции пыльцы, по крайней мере, по пути В, не обязательно связаны только с изоляцией пыльника от растения и с условиями культивирования in vitro а могут происходить также и в пыльниках интактных колосьев под воздействием других факторов.

В большинстве пыльников через 2 и 3 недели культивирования обнаруживалась только стерильная, сморщенная пыльца или же пыльца, у которой цитоплазма отошла от стенок, сжалась в комочки, а ядра, если их вообще можно было различить, представляли собойглыбки самой разнообразной формы. Лишь в некоторых пыльниках наблюдали дальнейшее развитие многоклеточных пыльцевых зерен (табл. 3.7). По сравнению с пыльцой 2В, ЗВ, 4В, а также 2В+Г такие многоклеточные образования - проэмбриоиды, все еще заключенные в экзи-ну, имели более густоокрашенную цитоплазму, разделенную на клетки. Количество ядер в них варьировало от 5 до 20.

По среднему числу проэмбриоидов на один проанализированный пыльник, учитывая суммарные результаты, полученные как на 14, так и на 21 сутки, статистически достоверных различий между контрольными и предобработанными пыльниками не было установлено ^а =0,1< •ь =0,2; А* =0,95). Тем не менее, морфологический анализ черезо и * а60 суток показал, что в пыльниках, подвергнутых температурному воздействию, визуально обнаруживаемые (андроклинные) структуры возникали с частотой 0,7%, в то время как в контрольных пыльниках таких структур не было (см.табл.3.7).

Полученные данные согласуются с ранее установленными фактами, что предварительное воздействие низкой положительной температурой на пыльники, содержищие одноклеточную пыльцу, увеличивает частоту возникновения андроклинных структур.

Насколько мы осведомлены, на пшенице нам впервые удалось проследить изменение цитоэмбриологических признаков в ответ на данное воздействие и, учитывая статистический характер наблюдаемых явлений, показать, что эффект такой предобработки заключается в синхронизации популяции пыльцы до начала культивирования на одноклеточной стадии, в увеличении частоты индукции пыльцевых зерен с двумя цитологически идентичными ядрами, сходными с ядром вегетативной клетки пыльцевого зерна, а также в снижении доли дегенери-рущей пыльцы.

Синхронизацией одноклеточной пыльцы на предмитотической стадии, главным образом, и объясняется положительный эффект предобработки пыльников низкой положительной температурой. В результате задержки первого деления происходит постепенное накопление клеток на стадии,наиболее благоприятной для индукции развития пыльцы по пути В. Полученные результаты говорят в пользу того, что у пшеницы этот путь приводит к образованию андроклинных структур.

Не исключено, что помимо синхронизации пыльцы на стадии, наиболее благоприятной для индукции развития по пути В, низкая температура сама по себе является фактором, с одной стороны, оказывающим положительное влияние на частоту индукции посредством нарушения полярности первого митоза, а с другой стороны, усиливающим способность клеток к регенерации. Повышение регенерационной способности клеток пшеницы было достигнуто в результате выдерживания тканевых культур при низких температурах [114].

3,3. Основной путь развития андроклинных структурКак было установлено, в культивируемых пыльниках пшеницы одновременно осуществляются несколько начальных путей развития пыльцы, которые по своей сути являются альтернативными типичной схеме микрогаметогенеза. Все ли эти пути в конечном итоге приводят к развитию спорофита? Этот вопрос для пшеницы, а также для многих других видов покрытосеменных растений, дискуссируется в научной литературе, но пока не имеет какого-либо определенного решения. Результаты изучения действия низкой температуры позволяют предположить, что развитие андроклинных структур происходит по пути В.

Однако для того, чтобы убедиться в справедливости выдвигаемого положения о том, что путь В играет ведущую роль, необходимо рассмотреть вопрос, в какой степени факты, установленные нами на пшенице сорта Саратовская 38, типичны для других сортов данной культуры. С этой целью было проведено сравнение распределений частот встречаемости пыльцевых зерен разных путей развития в культуре пыльников трех сортов пшеницы на пятые сутки культивирования (табл.3.8).

Для всех объектов характерным является то, что частоты встречаемости пыльцевых зерен разных путей развития убывают в следующей последовательности: В>А-1>С и А-П >Д.

У яровых пшениц Саратовской 38 и Саратовской 29 наблюдаетсязначительное сходство особенно в том, что путь В в количественном отношении является модальным, тогда как пыльцевые зерна остальных путей развития либо совсем отсутствовали, либо встречались с очень низкой частотой. Так, по количеству пыльцы у сортов Саратовская 38 и Саратовская 29 путь В в 14 и 10 раз, соответственно, превосходит путь А,Особенностью озимой пшеницы Лютесценс 72 является значительное увеличение абсолютных значений частот встречаемости пыльцы всех путей развития, причем по количеству пыльцевых зерен путь В лишь в 1,7 раза превосходит путь А.

В результате была установлена положительная связь между частотами встречаемости пыльцы всех имеющихся путей развития (табл.

Таблица 3.9Сравниваемые путиКо эффициент корреляцииразвития пыльцыА-1 - В+0,61 +0,90 +0,53 +0,36 +0,22 +0,54А-1 - (Си А-ША-1 - ДВ - (С и А-П) В - д(С и А-П) - ДЭтим и объясняется тот факт, что у Лютесценс.72 в отличие от яровых пшениц в количественном отношении отсутствует резкое преобладание пыльцы какого-либо одного пути развития, и с увеличением частоты встречаемости пыльцевых"зерен одного пути возрастают частоты встречаемости пыльцы всех остальных путей, В целом же для Лютесценс 72 характерен высокий уровень пыльцы, возникавдий в результате различных отклонений от гаметогенеза. Поэтому именно на этой форме пшеницы важно установить вклад каждого пути в формирование андроклинных структур.

Значения коэффициентов корреляции между частотами встречаемости пыльцы разных путей развития на пятые сутки культивирования и средним числом андроклинных структур на один пыльник через два месяца культивирования показывают, что положительная корреляция г = +0,31 наблюдается только для пыльцы, развивающейся по пути В (табл.3.10).

Это еще раз подтверждает справедливость предположения о том, что основным начальным путем развития спорофитов в культивируемых пыльниках пшеницы является путь В.

Даже в тех случаях, когда в пыльниках на раннем этапе культивирования имеется довольно высокое количество пыльцевых зерен,Таблица 3.10Характер связи конечного выхода андроклинных структур с частотами встречаемости пыльцы разных начальных путейразвития у Лютесценс 72Класс пыльцевых зеренПуть развитияКоэффициент корреляции, г(2-3-4) В 2Г 2В+Г 2В+2Г(С и А-П)ВдА-1+0,31 -0,34 -0,09 -0,05различавшихся по своему конкретному происхождению, все же относительно конечного морфогенетического результата можно сказать, что процесс развития спорофита запрограммирован уже с момента индукции одноклеточной пыльцы и образования двух цитологически идентичных ядер, сходных с ядром вегетативной клетки пыльцевого зерна.

3.4. Морфологическая и морфогенетическая гетерогенность андроклинных структур 3.4.1. Типы структур и динамика их развитияМорфологические наблюдения за пыльниками, культивируемыми на среде I, показали, что сразу же после посадки они незначительно увеличивались в размере за счет растяжения соматических клеток. Иногда в районе срезанных кончиков тычиночных нитей образовывался слабый первичный каллус, который тут же начинал некротизировать. Изменялась окраска пыльников. Спустя неделю они начинали постепенно утрачивать светло-зеленую окраску, а через 2-3,недели полностью обесцвечивались и становились серовато-белыми.

После трех недель культивирования из полости некоторых пыльников появлялись первые визуально различаемые новообразования, которые по морфологическим признакам можно разделить на два основных класса: эмбриоиды - плотные, структуры шаровидном или.овальной формы; каллусы - ткани рыхлой консистенции, неправильной формы, без каких-либо признаков дифференцировки (рис.3.2.1-2),Кроме того, встречались плотные или рыхлые структуры шаровидной формы и относительно небольшой величины; на этой стадии развития их невозможно было однозначно идентифицировать ни как эмбриоиды, ни как каллусы. Поэтому мы их выделили в с амо с то ят ельный класс, условно обозначенный как глобулы.

Как правило, глобулы и эмбриоиды возникали гораздо раньше, чем каллусы. Так, например, большая часть глобул и эмбриоидов вы- юз являлась в течение 4-6, а каллусов в течение 5-8 недель культивирования (рис.3;.1).

В некоторых случаях было замечено, что отдельные эмбриоиды претерпевали дедифференцировку, образуя каллус? Это явление чаще встречалось в пыльниках, которые длительное время находились на среде I, Однако как первичные каллусы, так и каллусы, возникающие вторично от эмбриоидов, при дальнейшем культивировании на среде I очень медленно увеличивались в размерах и,- как правило, прекращали рост. Мы объясняем это влиянием высокой концентрации сахарозы в данной среде;1 Эмбриоиды на среде I не прорастали.

Следовательно, для получения хорошо растущих каллусных штаммов и растений из эмбриоидов необходима своевременная пересадкастр.103ВОеоРис! 3.1. Динамика появления андроклинных структур на среде I (-- - глобулы и эмбриоиды;----- - каллусы)структур, возникающих в пыльниках на среде I, на другие среды, более благоприятные для пролиферации клеток, или же для дальнейшей дифференцировки эмбриоидов и развития из них растений.

Дальнейшую оценку морфогенетических потенций андроклинных структур осуществляли после их пересадки на другие питательные среды. Каллусы переносили на среды Ш, У и У1. Результаты их изучения мы обсудим позднее в разделе 4.2.

Глобулы и эмбриоиды пересаживали на среду П. На этой среде некоторые андроклинные структуры окончательно дифференцировались и прорастали без какого-либо периода покоя, развиваясь в растения, в то время как другие структуры прекращали свое развитие на различных стадиях.

Имелись различного рода отклонения в характере прорастания андроклинных структур на среде П. Иногда наблюдалось монополярное прорастание, когда структуры прорастали либо корневым, либо стеблевым полюсом (см.рис.3.2.3-4). Кроме того, некоторые эмбриоиды были способны к биполярному прорастанию, но впоследствии останавливались в развитии.

Нередко встречалось явление, которое мы назвали полиэмбриои-дией или многоростковостью. При прорастании эмбриоида наблюдали появление не одного, а сразу нескольких ростков (рис.3.3). Так, например, у пшеницы сорта Саратовская 52 в одном опыте из 67 полученных эмбриоидов было обнаружено: одноростковых - 56 (83,6%); двуростковых - 10 (14,9%) и трехростковый - I (1,5%).

При цитоэмбриологическом изучении пыльников ранних стадий культивирования мы иногда наблюдали многоклеточные пыльцевые зерна с двумя обособленными группами клеток (см.рис.П.1.5.3). Вероятно, полиэмбриоиды возникают именно из таких пыльцевых зерен, у которых уже в самом начале развития обособляются меристематичес-кие очаги клеток.

Считается [107], что культура пыльников может быть использована не только для получения гаплоидов, но и гаплоидных клеточных линий, которые являются удобным объектом для физиолого-биохимических и генетических исследований. Для таких целей гаплоидные клеточные линии должны прежде всего удовлетворять основному требованию - быть генетически "чистыми".

В связи с этим перед нами встал вопрос, можно ли использовать вышеописанные каллусные ткани в качестве источников таких линий?Для ответа на этот вопрос необходимо было изучить цитологические особенности тканей, развивавдихея из полости пыльника» С этой целью из культуры пыльников пшеницы сорта Саратовская 52 на 35 сутки культивирования было отобрано несколько пыльников с подобными каллусами, которые и были исследованы цитологически. Целесообразно описать эти каллусы индивидуально.

Пыльник.111. Вся полость этого пыльника была заполнены каллус ной тканью^ После окраски ацетокармином каллус просматривали под стереоскопическим микроскопом. Было установлено, что различные участки ткани окрашивались не однородно; На общем менее окрашенном фоне в разных местах каллуса выделялись более интенсивно окрашенные зоньи Такие зоны были локализованы как на периферии, так и на разной глубине каллуса. Путем последовательного просмотра каллуса с различных сторон можно было подсчитать все окрашенные зоны. В данном каллусе было обнаружено 6 таких зон. После легкого надавливания на покровное стекло верхние слои слабоокрашен-ных клеток легко распадались на агрегаты и даже отдельные клетки, в результате чего окрашенные зоны становились доступными уже для просмотра под малым увеличением светового микроскопа. По'пространственной организации, интенсивности окраски, размеру и форме клеток обнаруженные среди каллусной массы окрашенные структуры подразделялись на два основных типа: эмбриоиды и мериетемоиды.

Эмбриоиды (рис.3.4.1) находились на глобулярной стадии развития и состояли приблизительно из одинаковых по форме и размеру почти изодиаметрических мелких клеток меристематического типа, вдевдих крупное ядро и зернистую густо о крашенную цитоплазму (см. рис.3.4.2).

Мериетемоиды (см.рис.3.4.3-4) имели округлую или яйцевидную форму. Центральную область такой структуры образовывали более мелкие и однородные клетки, по мере приближения к периферии клетки увеличивались в размере и становились более удлиненными.: На- но стр. НОРис. 3.4. Строение интенсивно окрашенных структур, обнаруженных в пределах одной и той же полости пыльника №1 Саратовская 52, 35 суток культивирования 1-2 - эмбриоид и его клетки; 3-4 - меристемоид и его клеткистр.III стр.IIIстр.IIIРис. 3.5, Характеристика гетерогенной системы пыльника №2 Саратовская 52, 35 суток культивирования1 - 5-клеточное пыльцевое зерно, окруженное стерильной пыльцой;2 - 12-клеточное пыльцевое зерно и паренхимные клетки каллуса;3 - многоклеточные глобулярные эмбриоиды и 12-клеточное пыльцевое зерно (обозначено стрелкой) с четырьмя увеличенными наружными клетками.

Рис. 3.6. Характеристика гетерогенной системы гхыльшка №3 Саратовская 52, 35 суток культивирования1 - многоклеточный эмбриоид, окруженный паренхимными клетками;2 - четырехклеточное пыльцевое зерно и паренхшные клетки;3 - стерильная и слабоокрашенная пыльца;4 - паренхимные клетки каллуса.- из поверхности меристемоида часто обнаруживали крупные клетки парен-химного типа со слабоокрашенной цитоплазмой. По сравнению с эмб-риоидами клетки меристемоидов игл ели большее ядерно-плазменное соотношение, их цитоплазма менее зернистая и окрашивается слабее. Помимо этого было замечено, что меристемоиды гораздо легче распадаются на отдельные клетки, чем эмбриоиды. Эмбриоиды представляют собой плотные структуры, их клетки сцеплены между собой более прочно.

Кроме вышеописанных крупных структур на этом же препарате было обнаружено 17 многоклеточных и многоядерных пыльцевых зерен с разным числом ядер, а также стерильная пыльца и множество крупных разнообразных по форме паренхимных клеток каллуса (табл.3.12).

Пыльник $ 2. Как и в предыдущем случае, одна из полостей пыльника была заполнена каллусом. После окраски и анализа под стереоскопическим микроскопом не было замечено крупных окрашенных зон, зато в различных местах каллуса были обнаружены интенсивно окрашенные точки. Под малым увеличением микроскопа эти точки были идентифицированы как многоклеточные эмбриоиды, но гораздо меньших размеров, чем в предыдущем пыльнике. Всего их было 12. Кроме того, среди массы паренхимных клеток и стерильной пыльцы было найдено 50 многоклеточных, многоядерных пыльцевых зерен (см.табл. 3.12). Меристемоиды в данном пыльнике отсутствовали.

На рис.3.5 изображены: стерильная пыльца; ларенхимные клетки; многоклеточные пыльцевые зерна и эмбриоиды, обнаруженные в пыльнике №2.

Пыльник № 3. Этот пыльник характеризовался тем, что в нем из одного пыльцевого мешка образовалось 18 глобулярных эмбриоидов, которые были пересажены на среду П для дальнейшего развития. Помимо этого в том же пыльцевом мешке был обнаружен каллус диаметром около 1,5 мм, который мы проанализировали цитологически.

Таким образом, ни в одном из описанных примеров новообразования, возникающие внутри одного пыльцевого мешка, которые мы по внешним морфологическим признакам принимаем за каллусы, на самом деле являются "псевдокаллусами" и представляют собой гетерогенные системы разной степени сложности. Нами выявлено, по крайней мере, два вида таких систем: в первой, относительно простой, одновременно присутствуют эмбриоиды, многоклеточные и многоядерные пыльцевые зерна, а также паренхимные клетки каллуса; во второй - дополнительно к предыдущим добавляются меристемоиды.

Встречающиеся в обоих видах систем пыльцевые зерна, большинство из которых являются стерильными, вероятно, уже не играют существенной роли в происходящих событиях.

Факт присутствия в пыльцевом мешке многоядерных и многоклеточных пыльцевых зерен, а также более продвинутых в своем развитии многоклеточных глобулярных эмбриоидов,вполне объясним, исходя из ранее установленных цитоэмбриологических особенностей культуры пыльников пшеницы.

Следует лишь заметить, что подавляющее большинство многоядерных и многоклеточных пыльцевых зерен, находящихся в пыльниках поздних сроков культивирования (35 суток), вероятно, уже не способны к дальнейшему развитию по пути эмбриоидогенеза. В пользу такого предположения говорит тот факт, что через 40 суток культивирования мы наблюдаем появление лишь единичных эмбриоидов. Скорее всего, такие "запоздалые" единичные эмбриоиды развиваются из глобулярных эмбриоидов наподобие тех, которые обнаружены при цитологическом анализе пыльника № I (см.рис.3.4.I).

Возникает вопрос, из каких структур или тканей пыльника образуется каллус, клетки которого составляют большую часть биомассы описанных гетерогенных систем.

Прежде всего уместно напомнить, что при цитологическим изучении пыльников в течение 1-21 суток культивирования не было обнаружено ни одного случая пролиферации соматических клеток стенок пыльника. Также с полной уверенностью можно утверждать, что в' пыльниках этого периода культивирования отсутствовали клетки, по строению и окраске сходные с клетками паренхимного типа.

Следовательно, меристемоиды и паренхимные клетки возникали в результате процессов, происходящих в пыльниках в промежутках времени с 21 по 35 сутки культивирования.

Наиболее вероятным путем происхождения меристемоидов является путь, заключающийся в дедифференцировке уже имеющихся к этому времени многоклеточных структур, развивающихся из пыльцевых зерен. На рис.3.5.3 среди прочих структур и клеток изображено 12-клеточ-ное пыльцевое зерно, у которого восемь клеток еще находится внутри пыльцевого зерна, а четыре клетки высвободились за его пределы, но еще непосредственно связаны с остальными. Нетрудно заметить, что все четыре наружные клетки сильно увеличились в размере. По внешнему виду эти клетки напоминают мелкие клетки центральной части меристемоида (см.рис.3.4.4). Этот пример демонстрирует начальный этап возникновения меристемоида.

Паренхимные клетки каллуса возникают двумя путями. Во-первых, они образуют в результате делении внутренних клеток меристемоидов.

Как уже было отмечено выше, удлиненные клетки внешних слоев мери-стемоидов являются как бы переходными между клетками центральной зоны и паренхимными клетками. Кроме того, на самой периферии ме-ристемоида мы наблюдали типичные клетки паренхимного типа, сохраняющие физическую связь с клетками основной структуры.

Во-вторых, аморфные каллусные массы, основу которых составляют паренхимные клетки, появляются путем дедифференцировки более продвинутых в развитии многоклеточных эмбриоидов глобулярной или яйцевидной формы. Причем, как нами было установлено, чем дольше пыльники с эмбриоидами оставались на среде I, тем чаще имели место случаи, когда даже от относительно крупных структур начинал образовываться каллус.

Таким образом, каллусогенез в культивируемых пыльниках пшеницы следует рассматривать как вторичное явление. Большинство полученных фактов позволяет судить о том, что каллусные ткани так или иначе имеют пыльцевое происхождение.

Асинхронность в развитии многоклеточных пыльцевых зерен и эмбриоидов накладывает отпечаток и на процессы каллусогенеза, индукция которых может осуществляться как одновременно, так и разновременно, причем в этот процесс могут быть вовлечены многие андроклинные структуры, находящиеся на различных стадиях развития.

Первичные по времени каллусогенезы постепенно увеличивают биомассу паренхимных каллусных клеток, которые заполняют пространство пыльцевого мешка и извне охватывают другие имеющиеся в данной полости клетки и структуры: дегенерирующую пыльцу, многоклеточные и многоядерные пыльцевые зерна, более крупные многоклеточные эмбриоиды. Андроклинные структуры, окруженные паренхимными клетками, в свою очередь, либо продолжают развитие по пути эмбри-оидогенеза, либо сами становятся родоначальниками новых каллусо-генезов. В результате всех этих процессов формируются сложные вцитоанатомическом плане системы.

Вследствие комбинационной изменчивости, обусловленной мей-озом, исходная популяция пыльцы состоит из генетически разнородных гаплоидных клеток.

В связи с вышеупомянутыми особенностями процессов, совершающихся в одном пыльцевом мешке, возникновение каллуса только из одной андроклинной структуры следует считать крайне редким явлением. Как правило, ткань, новообразущаяся в полости пыльника, является суммарным результатом действия нескольких элементарных каллусогенезов, различающихся исходными источниками (производными пыльцы).

Отсюда следует, что описанные "псевдокаллусы" представляют собой сложные гетерогенные системы не только в цитоанатомическом, но и в генетическом плане. Такие системы состоят из смешанных генетически различных клеточных линий, которые являются производными отдельных каллусогенезов, а также из генетически различающихся андроклинных структур, находящихся на разных этапах развития.

Тот факт, что описанные системы являются гетерогенными в цитоанатомическом и генетическом плане, полностью не отрицает возможность получения на их основе генетически чистых гаплоидных клеточных линий. Однако для таких целей необходимо использовать метода получения клонов от отдельных клеток [127].

Тем не менее, для пшеницы существует более простой и менее трудоемкий путь выделения таких линий. Он основан на том, что в момент, когда проявляются первые визуально различимые эмбриоиды (21-25 сутки), процессы каллусогенеза только начинаются и еще не приобретают доминирующий характер. В этот период времени еще не исключена возможность выделения отдельных пространственно изолированных структурных единиц - эмбриоидов без примесей клеток иного происхождения. Поскольку эмбриоиды развиваются из индивидуальных пыльцевых зерен, то все клетки эмбриоида должны иметь сходную генетическую информацию. Б таком случае задача заключается в де-дифференцировке клеток эмбриоида и получении каллусного штамма, который должен удовлетворять требованиям, предъявляемым к генетически чистым линиям.

35 я *В результате проведенных исследований выявлены и изучены цитоэмбриологические предпосылки андроклинии у пшеницы.

Установлено, что особенности микроспорогенеза в колосе in vivo отражаются на направленности и интенсивности процессов в пыльниках in vitro Сравнительное изучение пыльников из разных элементарных выборок показало, что спектр изменчивости во всех выборках одинаков; пыльники I и П цветков нижней и верхней половины колоса характеризуются сходной в количественном отношении изменчивостью; пыльники Ш цветков по частоте пыльцевых зерен разных путей развития уступают пыльникам I и П цветков, но превосходят их по количеству дегенерирующей пыльцы. Уже на этом основании можно сделать вывод о нецелесообразности использования пыльников Ш цветков для получения гаплоидов.

Выявлены цитоэмбриологические последствия предобработки колосьев низкой положительной температурой, которые заключаются в синхронизации пыльцы перед первым митозом, в увеличении количества пыльцы, индуцированной к развитию по пути Вив снижении доли дегенерирующей пыльцы.

Полученные результаты послужили основой для разработки ряда операций андроклинного цикла (см.рис.2.1; операции 1-2 и 4-5), использование которых позволило частично преодолеть трудности, обусловленные асинхронностью и наличием аномалий в развитии пыльцы in vivo и до культивирования пыльников подвести популяцию пыльцы к состоянию минимальной гетерогенности. Особое значениеимеет прием формирования элементарных выборок пыльников по сходным начальным параметрам (положение пыльника в колосе, стадия развития, уровень стерильности пыльцы и др.), что дает возможность количественно оценивать степень влияния исходного состояния популяции пыльцы на характер ее последующего развития. В итоге была создана методическая основа для проведения последующих исследований с целью выяснения относительной роли различных факторов в изменчивости частоты андроклинии.

Новые факты получены в результате изучения фенотипической изменчивости пыльцы в культивируемых пыльниках. В самом начале культивирования наблюдается резкое усиление изменчивости пыльцы. При этом в пыльниках одновременно осуществляются: дегенерация пыльцы, гаметогенез, переключение гаметогенеза на другие пути развития. Установлено многообразие начальных путей развития пыльцы, которые фенотипически обнаруживаются как отклонения от гаметогенеза на всех последовательных стадиях развития пыльцы: одноклеточной (пути В и Д), двуклеточной (пути А-1 и С) и трехклеточной (путь А-П), причем частота таких отклонений уменьшалась с каждой последущей стадией гаметогенеза. Иными словами, вероятность возникновения альтернативных гаметогенезу путей развития пыльцы закономерно снижается по мере усиления специализации пыльцевого зерна к выполнению половой функции.

Впервые на пшенице доказано, что несмотря на многообразие начальных путей развития, путь В является основным путем спорофит-ного развития. Этот факт имеет важное значение для дальнейшего изучения андроклинии у пшеницы. Во-первых, по количеству пыльцы классов 2В, ЗВ и 4В можно из исходной популяции растений выделять наиболее перспективные доноры. Во-вторых, этот же подход может быть использован для оптимизации состава питательных сред, а также для быстрой оценки степени влияния других факторов. В-третьих, это позволит более целенаправленно подойти к разработке проблем, касагацихся изучения механизма индукции андроклинии, а также выявления закономерностей самого процесса развития спорофитов из пыльцы.

Установлено, что после фенотипически выраженной индукции многоклеточные проэмбриоиды в течение первых 7-9 суток культивирования находятся в состоянии детерминации к развитию. Только после этого периода в цитоплазме клеток проэмбриоидов происходят качественные изменения (появляется зернистость, усиливается реакция к красителю), которые связаны с их окончательным вступлением на путь спорофитного развития.

Как показали наблюдения, в культивируемых пыльниках действуют два основных процесса: эмбриоидо- и каллусогенез. Это приводит к неоднородности развития и образованию из пыльцы глобул, moho-, полиэмбриоидов, каллусов и "псевдокаллусов". Последние представлены системами двух видов: в первой одновременно присутствуют па-ренхимные клетки каллуса, многоклеточные и многоядерные пыльцевые зерна, эмбриоиды, а во второй - еще и меристемоиды (очаги каллу-согенеза). Такие системы являются результатом сопряженных процессов эмбриоидо- и каллусогенеза и представляют собой смесь генетически различающихся структур и клеточных линий. Каллусогенез в данном случае - явление вторичное, приобретающее все более доминирующий характер с увеличением времени культивирования пыльников на среде I.

В результате изучения цитоэмбриологических особенностей культивируемых пыльников созданы определенные предпосылки для проведения генетических исследований. Цитоэмбриологический анализ позволил выявить черты дискретности начальных путей развития и неоднородность на более поздних этапах развития андроклинных структур. Следует подчеркнуть, что некоторые признаки характеризуются стабильностью своего фенотипического проявления, что позволяет рекомендовать их в качестве признаков-маркеров для предварительного отбора линий с альтернативными свойствами, а также для генетического анализа. На начальном этапе развития такими фенотипическими маркерами являются: пыльцевые зерна - родоначальники альтернативных путей развития (классы 2В, 2В+Г, 2В+2Г, 2Г), а также пыльцевые зерна с наличием и отсутствием цитокинеза, слабо и интенсивно реагирующие на окраску ацетокармином, имеющие одну или несколько обособленных меристематических групп клеток. Последний признак может служить ранним маркером мою- или полиэмб-риоидии. На более поздних стадиях, когда андроклинные структуры можно уже наблюдать визуально,' альтернативными классами являются каллусы и эмбриоиды; среди последних модно выделить одно-, дву-, трех- и многоростковые, а также дающие зеленые растения и растения-альбиносы. Не исключено, что при соблюдении принципа постоянства селективного фона удастся отобрать также линии, характеризующиеся различной частотой образования "псевдокаллусов".

Следует отметить, что для проведения генетических исследований особенно важно исключить влияние исходной гетерогенности популяции пыльцы, обусловленной асинхронностью развития in vivo. В определенной мере это удалось осуществить, основываясь на результатах цитоэмбриологического изучения пыльников in vivo И in vitro.

4. ПУТИ ПОЛУЧЕНИЯ АНДРОКЛИННЫХ РАСТЕНИЙКак было установлено, для культуры пыльников пшеницы характерно многообразие и сопряженность морфогенетических процессов, предпосылки которых имеют место уже на самых начальных этапах культивирования. Результатом этих процессом является развитие различающихся по морфологии и морфогенетическим потенциям андроклинных структур (глобул, каллусов, эмбриоидов, полиэмбриоидов), а на более поздних этапах культивирования - становление в полости пыльника сложных гетерогенных систем, которые, однако, внешне выглядят как каллусы. Также показано, что с увеличением длительности культивирования пыльников возрастает частота появления таких "псевдокаллусов" и, кроме того, увеличивается вероятность дедиф-ференцировки уже достаточно сформированных эмбриоидов.

Таким образом, можно заключить, что в культуре пыльников пшеницы развертываются два основных процесса - эмбриоидогенез и кал-лусогенез, активность которых распределена во времени. Рассмотрим эти два процесса в связи с возможностью получения андроклинных растений.

4.1. ЭмбриоидогенезИндукция эмбриоидогенеза осуществляется на стадии одноклеточной пыльцы. Б результате первого митоза образуются два морфологически идентичных ядра вегетативного типа. Как установлено, такие пыльцевые зерна являются родоначальниками многоклеточных пыльцевых зерен, некоторые из которых и в дальнейшем развиваются по пути эмбриоидогенеза. В основных чертах такой путь развития сходен с зиготическим эмйриогенезом.

Наблюдения показали, что развитие андроклинных структур, в том числе и эмбриоидов, осуществляется в пыльнике асинхронно. Так,на исходной среде I некоторые эмбриоиды очень быстро (за 21-25 суток) заканчивают свое развитие и представляют собой биполярные структуры с зачатками корневого и стеблевого апексов, в то время как другие развиваются гораздо медленнее, а иногда и приостанавливаются в развитии на разных стадиях. Установлено, что нормальному развитию эмбриоидов способствует их своевременная пересадка на среду П, которая в отличие от исходной среды содержит меньшую концентрацию сахарозы (2%) и ИУК - 0,2 мг/л, вместо 2,4-Д.%и пересадке эмбриоидов на новую среду их необходимо отделять от пыльника, в противном случае развитие ухудшается, а может и совсем остановиться и смениться процессами некроза. Вероятно, в тканях пыльника на этой стадии образуются какие-то вещества, которые тормозят дальнейшее развитие эмбриоидов. После пересадки эмбриоиды культивировали при 16-часовом фотопериоде. Асинхрон-ность в развитии сказывалась и на поведении эмбриоидов после их пересадки на новую среду. Наиболее развитые из них уже через 1-2 дня без какого-либо периода покоя прорастали и образовывали маленькие растеныща. Другие же постепенно заканчивали свое развитие на среде П и только после этого прорастали.- Разница во времени от первых проросших эмбриоидов до последних исчислялась от одной до нескольких недель.

Подробности развития,и прорастания эмбриоидов наш уже описывались (см.раздел 3.4.1). Что же касается количественной оценки эффективности получения андроклинных растений путем эмбриоидо-генеза, то эти данные будут изложены в разделе 6. Следует лишь добавить, что большинство растений было нами получено путем проращивания эмбриоидов и в таблицах (см.разд.6), как правило, будет указано общая частота эмбриоидогенеза, а также частота возникновения растений из эмбриоидов.

4.2. Создание органогенных штаммовИсходя из того обстоятельства, что в пыльниках пшеницы первоначально образуются три типа структур: каллусы, глобулы и эмб-риоиды, мы испытали два основных пути получения штаммов.

Первый путь заключается в создании условий, способствующих дальнейшей пролиферации клеток первичных каллусов.

Второй путь основывался на дедифференцировке клеток глобул и эмбриоидов, находящихся на различных стадиях развития, и получение от них каллусных культур. В этих опытах использовали принципы создания органогенных штаммов, разработанные для злаков Н.ДЛапа-зян [43].

Ранее в опытах по созданию каллусных штаммов от зрелых зародышей злаков нами было установлено, что 2,4-Д (2 мг/л) и 2,4-5-Т (I мг/л) являются эффективными индукторами каллусогенеза и способствуют длительному культивированию каллусов. Дрожжевой экстракт (100 мг/л) и аскорбиновая кислота (I мг/л) заметно улучшали рост каллусов [64,77].

Поэтому для получения штаммов пыльцевые каллусы, глобулы и эмбриоиды пересаживали на среды (Ш,У,У1), содержащие эти вещества.

Всего было отсажено 142 каллуса, 50 глобул и 157 эмбриоидов. После пересадки далеко не у всех каллусов удалось стимулировать дальнейшее деление клеток, а у глобул и эмбриоидов индуцировать каллусообразование. Прежде всего это было связано с размером отсаживаемых структур. Как правило, малые по величине первичные каллусы, а также менее развитые глобулярные эмбриоиды не были способны к пролиферации. Через 7 месяцев культивирования из 349 первичных структур было выделено 29 (8,4$) хорошо.растущих штамма.

В опытах 1980 г. наибольшее количество штаммов было также получено от эмбриоидов, затем от каллусов и наименьшее - от глобул.

Таким образом, у пшеницы путь получения штаммов от эмбриоидов является более предпочтительным, чем от каллусов и глобул.

В результате всех опытов было выделено: у яровых мягких пшениц сорта Саратовская 52-9 штаммов и АС-29 - 2 штамма; у озимой твердой пшеницы Гордеиформе 427/77 - I штамм.

Штат,пи культивировали в темноте на тех же средах, на которых они были получены. Оценку роста проводили в 5 пассаже спустя 7 месяцев культивирования (табл. 4.2).

Подавляющее большинство штаммов характеризовалось хорошим или интенсивным ростом. Показатель интенсивности роста каллусов (ИРК) у многих штаммов превышает 2 балла. Медленно росли лишь штаммы 408, 434 у Саратовской 52 и штамм 448 у Лютесценс 72. Морфологические наблюдения под стереоскопическим микроскопом показали, что основу многих каллусов составляют аморфные ткани, за счет деления клеток которых идет постоянное нарастание биомассы. Штаммы 303,408,' 434,448,452 и 162 полностью состояли из таких аморфных тканей.

У остальных штаммов в той или иной степени проявлялась тенденция к.спонтанному морфогенезу: корне- или побегообразованию (см^табл.4.2), Чаще всего наблюдалось образование корней, причем, их рост зависел от того, возникают ли они на поверхности каллуса, контактирующей со средой или с воздухом. "Воздушные" корни в большинстве, случаев имели белое опущение, были короче.и развивались медленнее. Если они своими кончиками касались среды, то тогда от них вновь образовывался каллус. Корни, находящиеся внутри пита-, тельной среды, не имели опушения, быстро удлинялись и ветвились. Наиболее высокая склонность к ризогенезу отмечена у штамма 285, у которого.среднее количество корней на один каллус (ИК) достигает 6,5 штук.

Тенденция к стеблевому морфогенезу.проявилась у шести штаммов (283,444,285,429,363,368) мягких пшениц. Среди массы аморфного каллуса первоначально появлялись участки более компактных тканей с бугристой поверхностью. В дальнейшем отдельные бугорки увеличивались в размере и постепенно отпочковывались от компактной ткани все же сохраняя с ней связь. На этой стадии развития некоторыеструктуры были очень похож на дифференцированные эмбриоиды, которые возникали из пыльцы в культуре пыльников пшеницы. Встречались каллусы как с одной зоной вторичной дифференциации, так и с несколькими такими зонами.'Один из способов получения регенерантов в культуре тканей злаков заключается в снижении концентрации ауксина до полного его исключения из среды или в замене его другим ауксином. Таким путем в нашей лаборатории удалось получить растения-регенеранты,у некоторых представителей трибы маисовых [40-42. Поэтому в опытах по изучению регенерационной способности штаммов каллусы пересаживались на среды с уменьшенными концентрациями ауксинов. Было испытано 2 варианта модифицированной среды Ш. В первом варианте 2,4-Д исключалась из среды и заменялась на 2,4,5-Т (0,2 мг/л). Во втором - концентрация 2,4-Д снижалась до 0,25 мг/л.

После пересадки каллусов на среды с уменьшенными концентрациями ауксинов у всех штаммов наблюдалось значительное усиление процессов ризогенеза до такой степени, что некоторые культуры представляли собой сплошные скопления корней. Формирование зон вторичной дифференцировки листо-стеблевых структур было отмечено в тех же штаммах, в которых это явление наблюдалось при культивировании на контрольных средах (см.табл.4.2). Исключение составляет штамм 162 Гордеиформе 427/77, у которого в контроле способность к стеблевому морфогенезу не проявлялась, но выявилась на среде с низкой концентрацией 2,4-Д (0,25 мг/л).

У мягких пшениц снижение концентрации 2,4,5-Т до 0,2 мг/л не привело к увеличению количества зон вторичной дифференцировки. Замена же предшествующего ауксина 2,4,5-Т (I мг/л) на другой ауксин 2,4-Д (0,25 мг/л) способствовала усилению интенсивности стеблевого морфогенеза у штамма 283 в 8 раз, а у штамма 444 - в 9 раз.

Следует обратить внимание еще. ¿на одно важное обстоятельство.

Общий выход штаммов, способных к спонтанной и индуцированной регенерации растений, в пересчете на один первичный эксплантат дан в табл.4.I. Все 7 таких штаммов были получены от эмбриоидов, причем в двух из них(штаммы $83 и 444) постоянно образовывались растения-альбиносы, а в остальных (штаммы 162,285,429,363,368) -нормальные зеленые растения.

Для повышения выхода растений-регенерантов были применены методы ступенчатой пересадки трансплантатов, содержащих зачатки растений. При этом в течение 33 суток культивирования было сделано три пересадки (первая через 19 суток, вторая и третья через 7 суток), в каждой из которых вновь появляющиеся зачатки растеньиц отделяли друг от друга и переносили на св&жую среду в отдельные про бирки (табл.4.3).

Такая методика способствует хорошему и быстрому развитию зачатков в растения и позволяет с каждого трансплантата получать до 10 нормально развитых растений-регенерантов.

35 я йУстановлено, что для получения андроклинных растений у пшеницы можно использовать два пути: проращивание эмбриоидов и получение штаммов от,эмбриоидов с последующей регенерацией. Штаммы, получаемые от глобул и первичных каллусов, могло длительное время размножать на питательных средах, однако, их клетки утрачивают способность в регенерации растений.

Каждый из изученных путей получения андроклинных растенийимеет свои преимущества. Так, первый путь является наиболее быстрым и непосредственно ведет к развитию растения. Второй путь особенно удобен тогда, когда необходимо получить множество гаплоидов одного исходного генотипа. Следует заметить, что в обоих случаях для получения растений нужны эмбриоиды, поэтому основной задачей является повышение частоты эмбриоидогенеза.

5. КРИТЕРИИ ОЦЕНКИ ЧАСТОТЫ АНДРОКЛИНИИВопрос о критериях оценки частоты андроклинии в литературе до сих пор не являлся предметом критического обсуждения. Важность решения этого вопроса не вызывает сомнения, особенно в тех случаях, когда необходимо выявить количественный характер изменчивости и наследования признака, сопоставить частоту явления у видов растений разного систематического положения,' а также сравнить частоту андроклинии с частотой возникновения других явлений, например, таких как матроклинная гаплоидия, андрогенез, полиэмбриония и т.д. Отсутствие единства взглядов на критерии оценки частоты возникновения растений из пыльцы затрудняет сравнение результатов, получаемых разными исследователями на одних и тех же, либо на различных объектах.

Критерии оценки частоты андроклинии, наиболее часто используемые в литературе, представляют собой средние величины разных по типу статистических распределений: альтернативного, нормального и пуассоновского. Таким образом, решение вопроса о выборе адекватного критерия оценки частоты андроклинии сводится к анализу соответствия получаемых в опыте эмпирических распределении к известным в статистике теоретическим распределениям.

5.1. Анализ эмпирических и теоретических распределенийСтруктурной и функциональной единицей, в которой осуществляв ются процессы андроклинии, является пыльник, а единицей отбора -отдельное пыльцевое зерно.

При культивировании на питательных средах лишь некоторые пыльники положительно реагируют на условия культивирования образованием из пыльцы различных андроклинных структур (глобул, каллусов, эмбриоидов) и растений.

Если анализируемым элементом является пыльник, в котором осуществляются процессы андроклинии, то всю совокупность культивируемых пыльников можно представить двумя альтернативными классами. Б пыльниках первого класса происходит развитие андроклинных структур, то есть качественный признак присутствует, а в пыльниках второго класса такое развитие не наблюдается и качественный признак не проявляется. Такое распределение пыльников по качественному признаку относится к альтернативному распределению, показателем которого является доля пыльников с изучаемым признаком. Этот показатель чаще всего используется в литературе для характеристики явления андроклинии [223,236,238]. Однако, если в одном пыльнике развивается не одна, а несколько андроклинных структур, то доля пыльников с положительной реакцией не отражает реальной частоты явления.

Учитывая этот факт, некоторые исследователи [Ю] предлагают использовать показатель - частная продуктивность (среднее число ' андроклинных структур на один продуктивный пыльник) и показатель -средняя продуктивность (среднее число андроклинных структур на один культивируемый пыльник).

С точки зрения теории вероятности культуру пыльников можно рассматривать как серию повторных испытаний, причем одиночным (отдельным) испытанием следует считать один культивируемый пыльник, поскольку каждый пыльник представляет собой выборку, состоящую из достаточно большого количества пыльцевых зерен, которые в конечном счете и являются элементарными единицами количественного учета изучаемого качественного явления, возникающего с определенной вероятностью.

По нашим подсчетам в пыльнике пшеницы содержится около 4000 пыльцевых зерен, а вероятность возникновения андроклинной структуры из пыльцы в культуре пыльников пшеницы исчисляется стотысячными и милиоиными долями единицы (0,0000034-0,0000199) по сравнению с обратной вероятностью. Таким образом, в культуре пыльников пшеницы вероятность события очень мала и распределение его частоты является крайне асимметричным.

Исследуемые эмпирические распределения пыльников по числу структур наибольшее сходство проявляют с распределением Пуассона для редких событий, которое является предельным случаем биномиального распределения. Распределение Пуассона в отличие от нормального распределения характеризуется всего лишь одним показателем - средней величиной (М), поскольку она в данном случае по абсолютному значению совпадает с другим важным параметром выборочной совокупности - вариансой ( <£• ).

Как видно из табл.5.1, средняя величина выборочной совокупности пыльников мягкой пшеницы (Лютесценс 72) значительно отличается от соответствующего значения вариансы. У твердых пшениц (Харьковская I, Гордеиформе 427/77) различия между этими основными параметрами выражены в меньшей степени. Следовательно, распределение пыльников твердых пшениц по числу структур в большей мереприближается к распределению признаков по закону Пуассона.

Вычисление теоретических частот эмпирических распределений прово,цили по уравнению Пуассона [ 51]:р'хл.л!. е-м (5.1)№ !где V - ожидаемое число вариант (число случаев) редкого события в каждом отдельно взятом классе испытаний, т.е. О," I, 2, 3 и т.д.; п- - общее число случаев в данном серии испытаний; (1 -параметр уравнения, или среднее число редких событий в исследуемой совокупности;/??/ - произведение натуральных чисел: 0.1.2.3./72 ; е = 2,7183.

В нашем конкретном случае эти обозначения приобретают следующий смысл: V - ожидаемое число пыльников в каждом отдельно взятом классе испытания, т.е. число пыльников с О, I, 2, 3 и т.д.' андроклинныгли структурами; т - число андроклинных структур в пылышке (0,1,2,3 и т.д.); п. - общее число культивируемых пыльников в варианте опыта; М - среднее число андроклинных структур на один культивируемый пыльник.

Сравнение эмпирических распределений с теоретически ожидаемыми по критерию "хи-квадрат" (см.табл.5.1) показывает, что для двух объектов распределения пыльников по числу андроклинных структур не следуют закону Пуассона, причем заметна тенденция, что выборки, имеющие малые значения средаей величины, в большей степени приближаются к распределению Пуассона. Из изученных объектов только распределение пыльников у озимой твердой пшеницы сорта Харьковская I, у которой средняя величина признака имеет наименьшее значение Ш =0,014), следует закону Пуассона.

Стандартизация методики проведения эксперимента, включащая культивирование пыльников на среде I с целью индукции андроклинии и последующее доращивание андроклинных структур на среде П, позволила в 1980 году на сорте Саратовская 52 провести более детальный анализ распределения пыльников не только по суммарному количеству всех возникших на среде I структур, но и по отдельным категориям андроклинных структур с учетом их конечных морфогенетических проО ТТ оявлении на среде П, включая и развитие растении.

Как видно из табл.5.2, распределение пыльников по суммарному числу всех структур, включая и те структуры, из которых в дальнейшем развивались растения, не соответствует закону Пуассона. В противоположность этому, распределения пыльников по числу каллусов (при /з =0,95), эмбриоидов (при / < 0,95) и андроклинных растений (при уЗ < 0,95) можно считать различными формами проявления закона Пуассона.

5.2. -Применимость различных критериев оценкиТаким образом, для количественной оценки частоты возникновения каллусов, эмбриоидов и растений в культуре пыльников пшеницы показателем, наиболее точно отражающим частоту андроклинии, является средняя величина распределения Пуассона, которая вычисляется как среднее число соответствующих структур на один культивируемый пыльник и по смыслу соответствует показателю средней продуктивности пыльников, введенному Г.В.Изманом [18] для пыльников табака.

Теперь было уместно дать краткую характеристику и другим показателям, которые часто используются в литературе.

Иногда среднюю величину и вычисленную ее ошибку используют для оценки достоверности различий между выборочными совокупностями пыльников, применяя критерий Стьюдента. При этом ошибку средней подсчитывают, заведомо полагая, что вариационный ряд, составленный из полученных в опыте значений т[ можно считать формой нормального распределения [ 18].

Однако это в большинстве случаев неверно. Распределения продуктивных пыльников по числу структур резко асимметрично (см.табл. 5.1-2) и их нельзя относить к нормальному распределению. Следовательно, и использование математического аппарата нормального распределения для подсчета ошибки средней в данной ситуации мало что дает по существу.

Для выяснения вопроса о степени применимости других известных в литературе показателей количественной оценки явления андро-клинии нами был проведен корреляционный анализ с целью выявления характера связи между показателем средняя продуктивность пыльников (М) и другими показателями, такими как частная продуктивность пыльников (М^) и доля продуктивных пыльников (Р) (табл.5.3).

Установлено, что между показателями средняя продуктивность и частная продуктивность, а также между показателями средняя продуктивность и доля продуктивных пыльников в зависимости от исследуемого объекта существует прямая средняя или сильная прямолинейная связь. Между показателями частная продуктивность и доля продуктивных пыльников в двух случаях наблюдалась очень слабая прямая корреляция и в двух случаях слабая обратная корреляция.

Таким образом, поскольку между показателем средняя продуктивность и другими показателей имеет место корреляция, а не функциональная зависимость, то при использовании показателей частная продуктивность и доля продуктивных пыльников не исключена возможность ошибочной оценки частоты изучаемого явления. В связи с этимТаблица 5.3Степень корреляции между различными показателями количественной оценки явления андроклинииОбъектКоэщйшциент корреляцииМ по РМ по и.т ! Р поСаратовская 52 Лютесценс 72 Гордеиформе 427/77 Харьковская I+0,62 +0,75 +0,76 +0,43+0,69 +0,06+0,70 +0,11+0,51 -0,11+0,84 -0,10мы рекомендуем применять эти показатели лишь в качестве дополнения к основному показателю - средняя продуктивность пыльников.* к йУстановлено, что дискретные единицы реализации андроклинии (пыльник) и отбора (пыльцевое зерно) - неадекватны, поэтому критерии альтернативного (доля продуктивных пыльников) и нормального (среднее число новообразований на продуктивный пыльник) распределений не отражают частоту проявления признака в выборочной совокупности пыльцы. Эмпирические распределения пыльников по числу каллусов, эмбриоидов или растений характеризуются: резкой асимметрией, малой вероятностью события, тенденцией к совпадению значений средних арифметических с вариансами и соответствием теоретическим распределениям Пуассона. В качестве критерия частоты андроклинии предложена средняя величина распределения Пуассона. Она вычисляется как среднее число соответствующих структур на один культивируемый пыльник.

Другие критерии оценки, такие как доля продуктивных пыльников и частная продуктивность, рекомендуется применять только в качестве дополнительных к основному показателю. Следует обратить внимание еще на одну сторону разбираемого вопроса. Разные виды растении значительно отличаются друг от друга по количеству пыльцы в одном пыльнике-. Это обстоятельство необходимо также учитывать при сопоставлении частоты андроклинии у разных видов растений.

6. ИЗМЕНЧИВОСТЬ ЧАСТОТЫ АНДРОКЛИНИИ

Заключение Диссертация по теме "Генетика", Суханов, Вячеслав Михайлович

ВЫВОДЫ

1. Существенной особенностью начального этапа культивирования пыльников является усиление стенотипической изменчивости пыльцы. При этом в пыльниках осуществляются: дегенерация пыльцы, га-метогенез, другие пути развития, частота индукции которых снижается с каждой последующей стадией гаметогенеза. Установлено наличие детерминации многоклеточных пыльцевых зерен к слорофитному развитию, которая завершается после первых 7-9 суток культивирования.

2. Основным начальным путем развития является путь В. Его реализации способствуют: стабильность микрослорогенеза in vivo дестабилизация гаметогенеза посредством изоляции пыльника на стадии одноклеточной пыльцы, структурно-функциональная целостность пыльника, высокая частота индукции, компенсация функции спорофита.

3. В культивируемых пыльниках действуют два процесса: эмбри-оидо- и каллусогенез. Это приводит к неоднородности развития и образованию из пыльцы глобул, moho-, лолиэмбриоидов, каллусов и "псевдокаллусов" - сложно организованных и генетически гетерогенных систем. Показана возможность экспериментального управления морфогенезом» Для получения растении рекомендуются два пути: проращивание эмбриоидов и получение штаммов от эмбриоидов с последующей регенерацией.

4. Эпигенетические и паратипические факторы вызывают модифи-кационную изменчивость частоты андроклинии. Путем улучшения условий выращивания растений-доноров, селекции на повышенную озернен-ность верхних колосков колоса, отбора определенных пыльников для культивирования, воздействия на пыльники температурой (2°С), лазером ( Л = 0,6328 мкм, Р = 0,7-1,4 мвт/сь?, 15 мин) и изменения физиологических условий культивирования выход растений увеличен в несколько раз с максимумом до 2,2%.

5. Разработаны подходы к проведению генетических исследований. Ограничен диапазон "неконтролируемой" изменчивости частоты андроклинии, что достигается путем отбора колосьев по морфологическому признаку, синхронизацией пыльцы на нужной стадии, формированием выборок пыльников и стандартизацией всех этапов андро-клинного цикла. Определены дискретные, стабильные по проявлению признаки-маркеры альтернативных путей развития и критерий оценки частоты андроклинии - средняя величина распределения Пуассона. При оценке роли генетических факторов следует учитывать явление спорошитной предетерминации, проявляющейся в том, что воздействия на растете in vivo ведут к изменению процессов морфогенеза in vitro.

6. Частота андроклинии и пределы ее модификационной изменчивости обусловлены генотшшчески. Ее различия проявляются на межвидовом, межсортовом и внутрисортовом уровнях; показана наследуемость признака. Установлена возможность проведения двух видов отбора - опосредованного (по линии материнского спорофита) и прямого (по линии мужского гаметофита); их использование позволило увеличить выход андроклинных растений с 0,5% до 2,8% и 6,4$ соответственно .

7. Специфика андроклинии, как системы размножения, определяется различиями в условиях и формах отбора мужских половых клеток in vitro , отличающихся от таковых in vivo ; это приводит к различным генетическим последствиям и усиливает способность клеток к эмбриоидогенезу.

8. Разработана технология получения гаплоидов, на основе которой созданы линии, не отличающиеся от исходных форд по спектру глиадинов, но превосходящие их по урожайности на 1-9 ц/га.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

На начальном этапе исследования по мере накопления фактического материала, отражающего специфику андроклинии у пшеницы, были решены узловые методические вопросы организации андроклинного цикла на основе принципа постоянства селективного фона. Разработана система технологических операций, позволившая значительно ограничить диапазон "неконтролируемой" изменчивости частоты андроклинии, что, в частности, достигается путем отбора колосьев по морфологическому признаку, синхронизацией пыльцы на нужной стадии низкой температурой, формированием элементарных выборок пыльников по сходным начальным параметрам и стандартизацией всех этапов андроклинного цикла.

На основании цитоэмбриологического и морфологического изучения последовательных этапов развития от пыльцевого зерна и до растения выявлены спектры изменчивости признаков, дискретность и неоднородность развития, а также определены существенные и стабильные по проявлению фенотипические признаки-маркеры альтернативных путей развития и их различных стадий. Наряду с этим, благодаря анализу эмпирических и теоретических распределений пыльников по числу качественных, дискретных признаков был решен вопрос о применимости различных критериев оценки частоты андроклишш и установлено, что средняя величина распределения Пуассона адекватно отражает частоту андроклинии и может быть использована в качестве критерия ее оценки.

Все это повысило разрешающие возможности метода и создало предпосылки для проведения дальнейших исследований, в том числе и генетических.

Собственный фактический материал, накопленный в результате изучения андроклинии у пшеницы и других культур [56,59,63,66], а также анализ литературных данных (см.разделы 1.4 и 1.6) дают основание для конкретизации и дальнейшего развития представления об андроклинии, как особой экспериментальной системе размножения растений in vitro.

Специфику рассматриваемой системы размножения целесообразно проанализировать, следуя логике и последовательности развития, то есть в соответствии с основными этапами андроклинного цикла. При этом наиболее отчетливо проявляются значение и взаимосвязь ведущих процессов и явлений, выявляются уровни их генетического контроля, возможные формы, виды отбора и его генетические последствия (табл.1).

Наряду с чисто феноменологической преемственностью развития (микроспорогенез in vivo - развитие по пути В in vitro )проявляется сложный характер обусловленности андроклинии событиями, осуществляющимися в материнском спорофите и его генеративной сфере задолго до изоляции и культивирования пыльников. Установлено, что пространственно-временная асинхронность микроспорогенеза в колосе in vivo отражается на направленности.и интенсивности процессов в пыльниках in vitro (гаметогенез, различные альтернативные пути развития, дегенерация пыльцы). Показано также, что качественное состояние популяции пыльцы в самом начале культивирования непосредственно влияет на последующее развитие и конечный выход гаплоидов. Условия выращивания растений-доноров, различным образом складыващиеся в тот или иной год проведения экспериментов, и специально поставленные опыты (влагообеспечение растений, предобработка колосьев температурой) также подтверждают наличие тесной связи процессов in vivo и in vitro . Следовательно, условия развития in vivo в определенной мере предетерминируют развитие in vitro , причем воздействия на растения-доноры ведут к изменению процессов морфогенеза in vitro и сказываются на

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Суханов, Вячеслав Михайлович, Саратов

1. Баев A.A. Плазмидные вектора: общие принципы их конструирования. -В кн.: Молекулярные основы генетических процессов. М., Наука, 1981, с.197-201

2. Батыгина Т.Б. Эмбриология пшеницы. Л.", Колос, 1974, 206 с.

3. Батыгина Т.Б. Пыльник как модель изучения морфогенети-ческих потенций и путей морфогенеза. В кн;: Развитие мужской генеративной сферы растений (морфо-физиологические аспекты). Симферополь, 1983, с.9-10.

4. Бутенко Р.Г.* Дифференцировка и морфогенез в культуре тканей, клеток и протопластов. В кн.: Биологин развития растений; М;; Наука, 1975, с.48-65

5. Вавилов Н.И. Генетика на службе социалистического земледелия. В кн.: Н.И.Вавилов. Избранные сочинения. М., Колос, 1966, с.32-56

6. Бахтин Ю.Б. Генетическая теория клеточных популяций. Л., Наука, 1980, 168 с.

7. Винецкий Ю.П. Клонирование генетической информации в е. coli . В кн.: Молекулярные механизмы генетических процессов; Структура и функции хромосом, генетическая инженерия. М., Наука, 1979, с.89-126

8. ВнучковаВ.А. Получение гаплоидов из пыльников тритикале, и их цитологическая характеристика. Доклады ВАСХНИЛ, 1979, № 10, с.8-10

9. Внучкова В.А. Получение фертильного потомства от гаплоидных растений тритикале, выращенных из пыльников in vitro ;

10. Дыбан А.П. Гены и эпигеномные механизмы в начальном эмбриогенезе млекопитающих; В кн.: Четвертый Съезд Всесоюзного общества генетиков и селекционеров им .Н.И.Вавилова. Тезисы симпози-альннх докладов. М., Наука, 1982, с.17

11. Жукова Г.Я. Особенности пластидного аппарата зародыша у хлороэмбриофитов и лейкоэмбриофитов. В кш;.: Актуальные вопросы эмбриологии покрытосемянных. Л., Наука, 1979, с.104-119

12. Загорска Н., Палакарчева М. Използуване метода на антер-ните и тъканните култури за съкращаване на селекционния процес при тютюна. Растениевъдни науки, 1976, т.13, № 10, с.24-33

13. Загорска Н., Палакарчева М., Шабанов Д., Попристев В. Хомозиготни линии тютюн, лолучени при индуцирован андрогенез. -Генет. и селекция, (НРБ), 1978, т.П, №2-3, с.177-186

14. Зосимович В.П., Левенко Б.А., Кунах В.А., Лавриненко Л.Ю. Культура ПЫЛЬНИКОВ Nicotiana tabacum in vitro • -Генетика, 1974, т.10, }Ь 6, с.30-36

15. Изман Г.В. Ускорение селекционного процесса табака анд-рогаплоидным методом. Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биол. наук, Краснодар, 1975

16. Имшенецкий A.A. Селекция микроорганизмов и научно-технический прогресс. В кн.: Успехи современной генетики. Вып.5, М., Наука, 1974, с.60-73

17. Камшилов М.М. Фенотип и генотип в эволюции. В кн.: Проблемы эволюции, т.II. Новосибирск, Наука, 1972, с.28-44

18. Кардеченко Г.Д. Успехи генетики в области формообразования. В кн.: Достижения и перспективы в области прикладной бот., генет.,и селекции. Л., 1929, с.71-86

19. Кириллова Г.А. Получение независимых соматических мутаций у гаплоидного томата и перевод их в диплоидное состояние. -Генетика, 1965, 3, с.65-69

20. Кириллова Г.А. Явление галлон дни у покрытосеменных растений. Генетика, 1966, .£ 2, с.137-147

21. Кожин A.B., Кравцов П.В. Получение андроклинных гаплоидных растений в условиях стерильной культуры. Рукопись деп. в ВИНИТИ, № 1989-76 деп., Мичуринск, 1975, 43 с.

22. Козлов Г.С., Прокофьева И.Г., Суханов В.М. Морфогенети-чеекие эффекты постоянного магнитного поля в культуре ткани пшеницы и табака. В кн.: Использование биофизических методов в ге-нетико-селекционном эксперименте. Кишинев, Штиинца, 1977, с.82

23. Козлова М.Э., Суханов В.М. Селекция каллуса гаплоидного табака на солеустойчивость. В кн.: Культура клеток растений. Тезисы докладов Ш Всесоюзной конференции. Абовян, 1979, с.176

24. Лаптев Ю.П. Гетероплоидия в селекции растений. М., Колос, 1984, 248 с.

25. Левенко Б.А. Применение культуры изолированных клеток, тканей и органов растений в генетике и селекции. В кн.: Общаягенетика, т.5, М., Наука, 1978, с. 159-206

26. Лукьянюк С.Ф., Сулима Ю.Г. Игнатова С.А. Получение гаплоидных растений тритикале при культивировании пыльников. Доклады ВАСХНИЛ, 1979, }Ь I, с.7-10

27. Мирзоян Э.Н. Развитие учения о рекапитуляции. М., Наука,1974

28. Мюллер А^Д. Подходы к генетике высших растений с использованием культуры клеток и мутантов с недостаточностью нитратре-дуктазы. В кн.: Вопросы общей генетики. М., Наука, 1981, с.172-179

29. Навашин М.С. Новая возможность в селекции (об использовании гаплоидов). Бот. журн., 1934, т.19, №4, с.640-641I

30. Нгуен Тхи Дао, ШаМина З.Б. Культура изолированных пыльников томатов. Физиол. растений, 1978, т.25, № I, с.155-160

31. Нейфах A.Aw Время экспрессии генов в раннем развитии. -В кн.: Вопросы общей генетики. М., Наука, 1981, с.363-369

32. Нестеров А.Р., Суханов В.М., Тырнов B.C. Культура тканей кукурузы и ее диких сородичей. В кн;: Культура клеток растений. Тезисы докладов Ш Всесоюзной конференции. Абовян, 1979, с.178-179

33. Нестеров А.Ю., Суханов В.М., Тырнов B.C. Изучение кукурузы и ее сородичей в культуре in vitro . Доклады ВАСХНИЛ, 1980, & 6, с.12-13

34. Нестеров А.Ю., Суханов В.М., Тырнов B.C. Регенерация растений из каллусных тканей Coix sp . Физиология растений,1981, т.28, № I, с.212-51542i Ницше В., Венцель Г. Гаплоиды в селекции растении, М., Колос, 1980, 126 с.

35. Плохинский H.A. Математические методы в биологии.' Учебно-методическое пособие. М., Изд-во МГУ, 1978, 265 с.

36. Поволочко П.А. Экспериментальное получение гаплоидных растений В роде Nicotiana . Тр. по прикл. бот., серия 7, 1937, с.175-190

37. Подщубная-Арнольди В.А. Цито эмбриология покрытосеменных растений. Основы и перспективы. М., Наука, 1976, 508 с.

38. Приходько Н.И. Получение гаплоидных растений из пыльцевых зерен МЯГКОЙ пшеницы (iriticum aestivum L. )• Тр.по прикл. ботан., генет. и селекции ВНИИ растениевод., 1980, т.67, № 3, с.75-79

39. Прокофьева И.Г., Суханов В.М. Влияние постоянного магнитного поля на каллусообразование и органогенез гаплоидов табака в культуре тканей. В кн.: Химия и биология народному хозяйствуй Саратов, Изд-во СГУ, 1979, с.84

40. Размологов В.П., Пухальский В.А. Культура пыльцевых зерен Triticum aestivum in vitro . Доклады АН СССР, 1979, т.244, Jß 4, с.1278-1280

41. Резникова С.А. Пыльник как интегрированная система.

42. В кн.: Развитие мужской генеративной сферы растений (морфо-физи-ологические аспекты). Симферополь, 1983, с.69-70.

43. Рокитский П.Ф. Биологическая статистика. Минск. Вышэйш.школа, 1967, 328 с.

44. Салтыкова H.H., Суханов В.М.К методам селекции озимой твердой пшеницы. В кн.: Генетика, селекция и семеноводство. Саратов, Изд-во Саратовского СХИ, 1980, с.7-13

45. Сулима Ю.Г., Лукьянюк С.Ф., Игнатова С.А. Получение гаплоидов тритикале методом культуры пальников in vitro .- В кн.т Апомиксис у раст. и животн. (Тр. Биол. ин-та СО АН СССР, $ 35). Новосибирск, Наука, 1978, с.206-210

46. Суханов В.М., Клочков В-Л., Хохлов С.С. Получение андро-КЛИННЫХ гаплоидов Capsicum annuum L. И Nicotiana taba -cum L. Доклады АН СССР, 1973, т.2П, Ш 3, с.705-706

47. Суханов В.М., Клочков В.П., Тырнов B.C., Хохлов С.С. Эффективный метод получения гаплоидов из пыльцы и проблема создания мутантных гомозиготных линий. В кн.: Половой процесс и эмбриогенез растений. М., 1973, с.225-226

48. Суханов В.М. Использование культуры гаплоидных тканей и клеток в генетико-селекционных исследованиях. В кн.: Вопросы ботаники и генетики, вып.1, Изд-во С1У, 1975, с.39-40

49. Суханов В.М., Тырнов B.C. Получение гаплоидов in vitro из гаметических клеток. В кн.: Гаплоидия и селекция; М.,1. Наука, 1976, с.99-110

50. Суханов В.М., Тырнов B.C. Культивирование гаплоидных тканей и клеток. В кн.: Гаплоидия и селекция. М., Наука, 1976, с.110-120

51. Суханов В.М., Тырнов B.C. Получение гаплоидных мутантов табака из пыльцы. В кн.: Теоретические и практические аспекты использования ионизирующих излучений в сельском хозяйстве. Кишинев, 1976, с.209

52. Суханов В.М., Клочков В.П., Папазян Н.Д. Получение каллуса и гаплоидов в культуре пыльников. В кн.: Тезисы докладов Ш Съезда ВОГиС. Л., Наука, 1977, с.450

53. Суханов В.М., Тырнов B.C., Клочков В.П., Папазян Н.Д. Использование культуры тканей для получения гаплоидов и перевода их на диплоидный уровень. В кн.: Успехи полиплоидии. Киев*1977, с.196-203

54. Суханов В.М., Клочков В.П., Хохлов С .С., Тырнов B.C. Использование культуры пыльников для получения гаплоидов. В кн.: Культура клеток растений. Киев, Наукова думка, 1978, с.312-314

55. Суханов В.М., Нестеров А.Ю., Тырнов B.C. Эмбриоидогенез в пыльниках пшеницы. В кн.: Культура клеток растений. Тезисы докладов Ш Всесоюзной конференции. Абовян, 1979, с.161-162

56. Суханов В.М., Проскурин К.П. Получение мутантов из пыльцы табака. I. Изменчивость растений на ранних стадиях развития.-В кн.: Химия и биология народному хозяйству. Саратов, Изд-во С ГУ, 1979, с.81-82

57. Суханов В.М. Отбор гаплоидных рекомбинантов в культуре пыльников. В кн.: Адаптация и рекомбиногенез у культурных растений. Тезисы республиканской конференции. Кишинев, Изд-во АН Молд. ССР, 1982, с.93

58. Суханов В.М., Нестеров А.Ю., Зайкина Т.Ф.", Салтыкова Н.Н., Тырнов В.С-; К использованию андроклинных растений в селекции пшеницы; Доклады ВАСХНШ1, 1982, Ш II, с.7-8

59. Суханов В.М., Станко С.А., Тародей И.В*. и др. К использованию культуры пыльников табака для получения фотоиндуцирован-ных мутантов. В кн.: Чувствительность организмов к мутагенным факторам и возникновение мутаций. Вильнюс, 1982, с.31

60. Суханов В.М., Тырнов B.C., Станко С.А., Юновидов Г.А., Башарова Т.В., Тародей И.В. Способ получения растений из пыльцы. Авторское свидетельство № 1028288, 1983

61. Суханов В.М;, Тырнов B.C., Салтыкова Н.Н.Способ получения растений пшеницы из пыльцы в культуре пыльников. Авторское свидетельство № 1036306, 1983

62. Суханов В.М., Папазян Н.Д. Условия получения каллуса и регенератов в культуре зрелых зародышей пшеницы. В кн.: Апо-миксис и цитоэмбриология растений, вып. 5. Саратов, Изд-во СГУ, 1983, с.124-130

63. Суханов В.М. Получение растений из пыльцы. В кн.: Развитие мужской генеративной сферы растений (морфо-физиологические аспекты). Тезисы докладов. Симферополь, 1983, с.85

64. Суханов В.М., Тырнов B.C. Генотипическая обусловленность и модификацийнная изменчивость частоты андроклинии у пшеницы. В кн.: Тезисы докладов 1У Всесоюзной конференции по культуре клеток растений и биотехнологии. Кишинев, Штиинца, 1983, с.158

65. Сэджер Р. Цитоплазматические гены и органеллы. М., Мир, 1975, 423 с.

66. Терновский М.Ф., Изман Г.В., Сарычев Ю.Ф, Индуцированные in vitro андрогаплоиды и реституционные диплоиды как исходный материал для анализа и отбора признаков в синтетической селекции* Генетика, т.II, № IX, 1975, с.8-14

67. Терновский М.Ф., Изман Г.В. Экспериментальная гаплоидия табака в культуре пыльников. В кн.: Сборник научн.-исслед. работ ВНИИ табака и махорки. 1977, lb 166, с.73-77

68. Тырнов B.C. Генетическое исследование гаплоидии у кукурузы ( Zea mays L. ). Автореферат канд. диссертации, Саратов,1970, с.1-28

69. Тырнов B.C., Суханов В.М. Влияние лучей Рентгена на гаплоиды кукурузы. В кн.: Апомиксис и цитоэмбриология растений. Вып. 2. Саратов, Изд-во СГУ, 1971, с.71-76

70. Тырнов B.C., Суханов В.М. Особенности гаплоидов кукурузы, полученных из зерновок, облученных рентгеновскими лучами. -В кн.: Действие ионизирующих излучений и полей сверхвысоких частот на биологические объекты. Саратов, Изд-во CU, 1971, с.15-18.

71. Тырнов B.C., Хохлов С.С. Андрогенез у покрытосеменныхрастении. Генетика, 1974, т.Ю, №9, с.154-167

72. Тырнов B.C., Суханов В.М., Хохлов С.С. .Мутационная селекция и гаплоидия. В кн.: Гаплоидия и селекция. М., Наука, 1976, с.171-179

73. Тырнов B.C., Еналеева Н.Х. К проблеме культивирования зародышевых мешков покрытосеменных растений. В кн.: Культура клеток растений. Киев, Наукова думка, 1978, с.318-321

74. Урбах В.Ю. Биометрические методы." Mv, Наука, 1964, 415 с.

75. Хадаинов М.И., Паншин Б.И. Селекция перекрестно-опыляющихся растений. В кн.: Теоретические основы селекции растений, t.I. 1935, с.569-596

76. Харченко П.Н., Кучеренко Л.А. Получение растений риса из пыльников. Доклады ВАСХНИЛ, 1977, & 4, с.15-16

77. Хохлов С .С. ,Лойипй0йдия и аломиксис у покрытосеменных растений. В кщ: Полиплоидия и селекция. М., Наука, 1965, с.62-69

78. Хохлов С.С. Апомиксис: классификация и распространение у покрытосеменных. В кн.: Успехи современной генетики. Вып.' I. М., Наука, 1967, с.45-105

79. Хохлов С.С., Гришина Е.В., Зайцева М.И. и др." Галлоидия у покрытосеменных растений, часть I, Саратов, Изд-во СГУ, 1970, 137 с.

80. Хохлов С.С., Зайцева М.И. Высота гаплоидных растений, полученных от перекрестно- и самоопыленных диЛлоидов кукурузы. -В кн.: Апомиксис и селекция. М., Наука, 1970, с.251-253

81. Хохлов С .С;, Гришина Е.В., Тырнов B.C. и др. Гаплоидия у покрытосеменных растений. Часть П. Саратов. Изд-во СГУ, 1974, 180 с.105.' Хохлов С.С., Тырнов B.C., Гришина Е.В. и др. Гаплоидия и селекция. М., Наука, 1976, 221 с.

82. Шамина З.Б. Генетическая изменчивость растительных клеток in vitro . В кн;: Культура клеток растений. Труды П Всесоюзной конференции. Киев, Наукова Думка, 1978, с.80-93

83. Шамина 3. Б. Андрогенез и получение гаплоидов в культуре пыльников и микроспор. В кн.: Культура клеток растений. М., Наука, 1981, с.124-136

84. Шапиро В.И. Генетика соматических клеток животных сегодня. В кн.: Четвертый съезд Всесоюзного общества генетикови селекционеров им. Н.И.Вавилова. Тезисы симпозиальных докладов. М., Наука, 1982, с.17

85. Шевченко C.B. К вопросу о получении гаплоидных растеu

86. НИИ В культуре пульНИКОВ Nicotiana tabacum L.(Solanaceae) Бот.журн., 1977, т.62, }Ь 8, с.1176-1179

87. Шумный В.К., Першина Л.А. К итогам отдаленной гибридизации некоторых злаковых с использованием разных видов ячменя.

88. С-х биол., 1980, т.15, tè 2, с.290-296

89. Шумный В.К., Першина Л.А., Белова Л.И. Получение яч-менно-ржаных и ячменно-лшеничных гибридов на основе культурных сортов ячменя. Цитология и генетика, 1982, т.16, № 3, с.46-50

90. Юркова Г.Н., Левенко Б.А., Новожилов О.В. Культура ткани И клеток пшеницы Triticum aestivura В КН".: Культура клеток растении. Тезисы докладов. Абовян, 1979, с.122-123

91. Юркова Г.Н., Левенко Б*А. Изолированная культура пыльников злаков. В кн.: Экспериментальная генетика растений. Киев, Наукова думка, 1982, с.46-65

92. Acharya В.С,, Ramji M.V. Experimental androgenesis in plants. A review. Proc. Indian Acad. Sci., 1977, V.B86, N 6, p. 337-360.

93. Alexander D.E. Spontaneous reciprocal translocation during megasporogenesis of maize, haploids. Nature, 1964, v. 201, N 4920, p. 727-738.

94. Anand V.V., Arekal C.D., Swamy B.G.L. Chimeral ambryoids of pollen origin in tobacco. Curr. Sci.(India), 1980, v. 49,1. N 15, p. 603-604.

95. Anand V.V., Arekal G.D., Swamy B.G.L. Androgeni-c chimeral plantlets in Tobacco. Curr. Sci.,(India), 1980, v. 49, H 19,p. 750.

96. Anand V.V., Arekal G.D., Swamy B.G.L. Poliar histology of androgenetic haploid "vegetative" and "generative" tobacco. Curr. Sci(India), 1981, v. 50, N 7, p. 327-328.

97. Anand V.V., Arekal G.D., Swamy B.G.L. Variation among flowers of androgenetic tobacco haploids. Cirr. Sci.(India), 1981, v. 50, itf 8, p. 372-373.

98. AsseHnB.M. Obtention d'haploides in vitro a partir d'ovaires non fécondes de Riz. Ozyza sativa L. C.r.Acad.sci.,1980,1. D.290, N 6, p. 489-492.

99. Bajaj Y.P.S., Ram A.K., Labana K.S., Singh H. Regeneration of geneticallivariable plants frcra the anther-derived callus of Arachis hypogaea and Arachis villosa. Plant Sci. Lett.,1981,v. 23, N 1, p. 35-39.

100. Barclay I.R. High frequencies of haploid production in wheat (Triticum aestivum) by chromosome elimination. Nature (Lond.), 1975, v. 256, p. 410-411.

101. Bartkowiak E. Nome kierunku w hodowli tkanek i komorek roslinnych in vitro. Post.biol.komorki, 1976, v. 3, N. 3, p. 161-233.

102. Bennett M.D., Hughes V/.G. Additional mitosis in wheat pollen induced by entherel. Nature. 1972, v. 240, N 5383, p. 566-568.

103. Bergmann L. Planting of plant cells. Plant Tissue Cult and its Biotechnol. Appl. Proc. 1st Int. Gong.Med.PlantRes., Sect.B, Munich, 1976, Berl. e.a., 1977, p. 213-225»

104. Bernard S. Etude de quelqyes fateurs contribuant à la réussite de l'androgenése par culture d'anthères in vitro chez le triticale hexaploide. Ann. amélior. plant. 1977, v. 27, N 6, p. 639-656.

105. Bernard S. In vitro androgenesis in hexaploid triticale: determination of physical conditions increasing embryoid and green plant production. 2. Pflanzenzucht., 1980, v. 85, N 4, p. 308-321.

106. Bhojwani S.S., Dunwell J.M., Sunderland IT. Nucleic acid and protein contents of embry ogenic tobacco pollen. J. Exp. Bot.,1973, v. 24, N 82, p. 863-871.

107. Blakeslee A. Be.ijng Parnaham M.E., Berger A.D.

108. A haploid mutant in Datura stramonium. Science, 1922,v. 55 P« 646-647.

109. Blaydes D.P., Interaction of kinetin and various in the growth of soybean tissues. Physiol. Plant., 1966, v. 19, p. 748-753.

110. Bouharmont J. Cytology of microspores and calli after anther culture in Hordeum vulgare. Caryologia, 1977, v. 30, IT 3, p. 351-368.

111. Bourgin J.P., Witsch J.P., Obtention de Nicotiana haploides a partir d'étamines cultuvies in vitro. Ann. Physiol. Veg. 1967 (1968), v. 9, N 4, p. 377-382.

112. Bretteil R.I.S., Thomas В., Wernicke V/. Production of haploid maize plants by anther culture. Maydica, 1981, v. 26, II 2, p. 101-111.

113. Bullock W.P., Baenziger P.S., Schaeffer g.w. Bottino P.J. Anther culture of wheat (Triticum aestivum L.) P^ ' s and their reciprocal crosses. Theor. and Appl. Genet., 1982, v. 62, II 2,p. 155-159.

114. Butterfass Th., Kohlenbach H.V/. Monosomies of diploid xîicotiana sylvestris produced at will by androgenesis. Naturwisf senschaften, 1979, v. 66, N 3, p. 162.

115. Buyser J., Picard E. Observation de divisions supplémentaires dans les grains de pollen de plantes homozygotes de blé tendre (Triticum aestivum), obtenues par androgenèse in vitro.- C.H.Acad.sci., 1875, 281, II 16, p. 1153-1156.

116. Buyser J., Henry V. Androgenese sur des blés tendres en cours de sélection 1.L'obtention des plantes in vitro. Z. Pflanzenzucht, 1979, v. 83, N 1, p. 49-56.

117. Buyser J., Henry V. Induction of haploid and diploid plants though in vitro anther culture of haploid wheat (:и.= 3x= = 21). The or. and Appl. Genet., 1980, v, 57, II 2, p. 57-58.

118. Buyser J. Henry V. Laur R., Lonnet P. Utilization de1'androgenese in vitro dans des programmes de selection du ble tendre (Triticum aestivum L.). Z. Pflanzenzucht., 1981, v. 87, N 4, p. 270-299.

119. Buyser J., Henry Y., Amssa M. In vitro anther culture of wheat (Triticum aestivum)L.): chromosome variations. Induced Variability Plant Breeding Int.Symp. Sect.Mutat. and Polyploid Eur. Assoc. Res.Plant Breed EVCARPIA, Wageninger, 1982, p. 121-122.

120. Chandy L.P., Narayanaswamy S. Diploid and haploid androgene tic plantlets from haploid Datura in vitro. Indian J. Exp. Biol., 1971, v. 9, H 4, p. 472-475.

121. Chang Z., Hong Y.Y. Induction of haploid of rice plant-lents by ovary culture. Plant Sci. Lett., 1981 v. 20, H 3,p. 231-237.

122. Charzynska M., Pannenko I. Inhibition of cytokinesis in the microspores of Tradescantia bracteata Small, by caffeine Acta. Soc. Bot. pol., 1976(1977), v. 45, N 4, p. 469-476.

123. Chen C., Chen C. Changes in chromosome number in microspore callus of rice during successive subcultures. Can. J. Genet, and Cytol., 1980, v. 22, N 4, p. 607-614.

124. Chen C., Chen C., Lin M. Genetic analysis of anther-derived plants of rice. J. Hered., 1982, w»73, N 1, p. 49-52.

125. Clapham D. In vitro development of callus from the pollen of lolium and Hordeum. Z. Pflanzenzüchtg., 1971, v. 65, N 4, p. 285-292.

126. Clapham D. Haploid Hordeum plants from anthers in vitro. Z. Pflanzenzüchtg., 1973, v. 69, U 2, p. 142-155.

127. Clapham E.H. Haploid induction in cereals. Appl. and Pundam. Aspects Plant Cell, Tissue and Organ Cult., Berl., e.a.,1977, p. 279-298.

128. Collins G.B. Production and utilisation of anther-derived haploids in crop plants. Crop Sei., 1977, v. 17, N 4» p. 583-586.

129. Dale P. Pollen dimorphism and anther culture in barley. Planta, 1975, v. 127, N 3, p. 213-220.

130. De anon J.R. Treatment ofsv/eet corn silks with maleio hydrazide and colchicine as a means of increasing the frequency of monoploids. Philipp. Agr., 1957, v. 41 » P* 364-377.

131. De Paepe R., Witsch. C., Godard LI., Pernes I. Potential from haploid and possibe use in agriculture. Plant Tissue Cult, and its Bio-Thechnol.Appl. Proc. 1st Int. Cong.Med. Plant Res., Sect.? Munich, 1976, Berl. e.a. 1977, p. 341-352.

132. De Paepe R., Prat D., Huguet T. Heritable nuclear DNA changes in doubled haploid plants obtained by pollen culture of Nicotiana sylvestris. Plant. Sei.,Lett., 1982-1983, v. 28,1. N 1, p. 11-28.

133. Devreux M., Laneri U., DeMartinis P. Reflexions sur nos cultures d'antheres de plantes cultivies G.bot. ital., 1975, v. 109, N 6, p. 335-349.

134. Dollmantel H.-I., Reinert J. Auxin levels, antiauxin(s) and androgenic plantlet formation in isolated pollen cultures of llicotiana tabacum. Protoplasma, 1980, v. 103, N 2, p. 155-162.

135. Dore C. Production de plantes homozygotes mâles et femelles a partird'antheres asperge, cultivées in vitro (Asparagus officinalis). C.R. Acad. Sei.Paris., 1974, D 278, p. 2135-2138.

136. Dore C. Doublement du stock chromosomique d'haploides d'asperge (Asparagus officinalis L.) par culture in vitro des méristemes en presence de colchicine. Ann. Amelior.Plantes, 1976, v. 26, N 4, p. 647-653.

137. Dore G. Techniques de production des haploides et cas de l'asperge. Selec. Franc., 1978, K 26, p. 19-23.

138. Dumas de Vaulx H., Chambonnet D., Pochard S. Culture in vitro d'anthères de piment (Capsicum annuum L.) amelioration des taux d'obtention de plantes chez différents ginotypes par des traiements a+35° C. Agronomie, 1981, v. 1, IT 10, p.859-864.

139. Dunwell L.M., Sunderland IT. Pollen ultrastructure in anther cultures of Nicotiana tabacum. I.Early stages of culture.- J. Exp. Bot., 1974, v. 25, IT 85, p. 352-361.

140. Dunwell J.M., Sunderland IT. Pollen uj-trastructure in anther cultures of ITicotiana tabacum. III.The first sporophy-tic division. J. Exp.Bot., 1975, v. 26, IT 91, p. 240-247.

141. Dunwell J.M., Sunderland IT. Pollen ultrastructure in anther cultures of Datura innoxia. I.Division of the presumptive vegetative cell. J. Gell Sei., 1976, v. 22, IT 3, p.469-480.

142. Dunwell L.M., Sunderland IT. Pollen ultrastructure in anther cultures of Datura innoxia II. The generativecell wall.- J. cell Sei., 1976, v. 22, IT 3, p. 481-491.

143. Dunwell J.M., Sunderland IT. Pollen ultrastructure in anther cultures of Datura innoxia III.Incomplete microspore division. J. Cell Sei., 1976, v. 22, IT 3, p. 493-501.

144. Durr A., Fleck J. Production of haploid plants of ITicotiana langsdorf. Plant Sei. Lett., 1980, v. 18, IT 1, p. 75-79.

145. Engvild KiC., Linde-Laursen I., Lurgquist A. Anther culture of Dature innoxia: flower Budstage and embryoid level of ploidy. Hereditas, 1972, v. 72, p. 331-332.

146. Engvild K.C. Plantlet ploidy and flower-budsize in tobacco anther cultures. Hereditas, 1974, v. 76, IT 2, p. 320-322.

147. Garnborg O.L., Eveleigh D. Culture methods and detection of glucanases in suspension cultures of wheat and barley. Can. J. Biochem., 1968, v. 46, p. 417-421.

148. Gaul H., Foroughi-V/ehr B., Mix G., Y/ilson H.M. Plants produced by barley anther culture:Further observations. Acta biol. jugosl•, 1976, v. 8, N2, p. 111-118.

149. Gerstel D.U., Mishanec W. On the inheritance of apomi-xis in Parthenium argentatum. Bot. Gas., 1950, v. 112, p. 96-106.

150. Gorenflot 11., Raicu P., Pelletier G., Patrascu M. Contribution a 1'etude caryologique d'haploides artificiels du llicotiana tabacum L. G.li. Acad, sci., 1975, D 281, IT 15, p. 1097-1100.

151. Guha S., Maheshwari S.C. In vitro production of embryos from anthers of Datura. Nature, 1964, v. 204, N 4957, p. 497.

152. Guha S., Maheshwari S.C. Development of embryoids from pollem grains of Datura in vitro. Phytomorphology, 1967, v 17, N 1-4, p. 454-561.

153. Gupta P.P. Genesis of microspore-derived triploid Petunias. Theor. and Appl. Genet., 1982, v. 61, N 4, p. 327-331.

154. Han Hu, Qiguan Shao. Advances in plant cell and tissue culture in China. Adv.Agron.vol.34,New York e.a.,1981, p. 1-13

155. Hayes I.D. Arable crops."Rept. Webstr. PlantBreed. Stat.,1975" Plas Gogerddan near Aberystwyth, 1976, p. 35-45*

156. Henry Y., Buyser J. De. Float culture of wheat authers. Theor.and Appl. Genet., 1981, v. 60, IT 2, p. 77-79.

157. Heszky L., Pauk J. Induction of haploid rice plants of different origin in anther culture. Riso, 1975, v. 24, IT 3, p. 197-204.

158. Heszky L., Mesch J. Anther culture investigations in cereal gene bank collection. Z. Pflanzenzucht., 1976, v. 77 N 3, P. 187-197.

159. Horner M., Mott R.L. The frequency of embryogenic pollen grains is not increased by in vitro anther culture in ITicot iana tabacum L. Planta, 1979, v. 147, IT 2, p.156-158.

160. Horner IvI., Pratt M.L. Amino acids analysis of in vivo and androgenic anthers of Nicotiana tabacum. Protoplasma,1979, v. 98, IT 3, p. 279-282.

161. Hu Han, Hao Shui. Development of minimicrospores in pollen-derived haploids of OXi-ticum aestivum L. "Int.Cell Biol., 1980-1981, 2nd Int.Congr.,Berlin(West.), 1980".Berlin e.a., 1981, p. 880-8^.

162. Immamura J., Harada H. Effects of abscisic acid and water stress on the embryo and plantlet formation in anther culture of Nicotiana tabacum cv. Samsun. Z. Pflanzenphysiol.,1980, v.100, IT 4, p. 285-289.

163. Iyer r.d., Raina S.k. The early ontogeny of embryoids and callus from pollen and subsequent organogenesis in anther cultures of Datura raetel and Rise. Planta (Berl.), 1972, v. 104, N 2, p. U6-156.

164. Jensen C.J. Monoploid production by chromosome elimination. Appl. and Fundam. Aspects plant Cell, Tissue and Organ Cult. Berl.e.a., 1977, p. 299-340.

165. Kimber G., Riley r. Haploid Angiosperms. Bot. Rev., 1963, v. 29, IT 4, p. 408-531.

166. Kohlenback H.W., Wernicke W. Investigations on the inhibitory effect of agar and the finction of active carbon in anther culture. Z. Pflanzenphysiol., 1978, v. 86, W 5» p. 463-472.

167. Kopecky P. Haploid Populus alba L. kiserleti elöalli-tasa. Erde sr. katatasok, 1960, v. 56, it 3, p. 151-158.

168. Lakshmi S.G., Dore S.R., Chacko E.K., Bhat R.IT. Studies on anther culture I.Induction of androgenic plants and callus in Petunia hybrida Vilm. Curr. Sei.(India), 1976, v. 45, IT 20, p. 714-715.

169. Lindstrom E.Y/., Koos K. Cytogenetic investigation of a haploid tomato and its diploid and teraploid progeny. Amer. J. Bot.,1931, v. 18, p. 398-410.

170. Lupotto E., Russo S. Recenti sriluppi nella técnica delle colture di antere "in vitro" per il miglioramento genetico del riso. Riso, 1980, v. 29, N 3, p. 173-180.

171. MagoonM.L., Khanna K.R. Haploids. Caryologia, 1963, v. 16, N 1, p. 191-235.

172. Maheshwari S.C., Rashid A., Tyagi A.K. Physiology of pollen haploid formation the current status. - Plant Cell Cultures: Results and Eespectives, 1980, p. 393-398.

173. Maheshwari S.C., Rashid A., Tyagi A.K. Haploids from pollen grains retrospect and prospect. - Amer. J. Bot., 1982, v. 69, IT 5, P. 865-879.

174. Melchers G. Haploide Blutenpflanzen als Material der Mutationzuchtung. Zuchter, 1960, 3d.30, H 4, S. 129-134.

175. Melchers G., Labib G. Die Bedeutung haploider höherer Pflanzen für Pflanzenphysiology und Pflanzenzüchtnng. Ber. Dtsch. Bot. Ges., 1970, H. 3-4, S. 129-150.

176. Miller C.O. Kinetin and kinetin like compounds in: Moderne Methoden der Pflanzenanalyse. Springer Verlag Berlin, Heidelberg, New York, 1963, Bd. 1, S. 194-202.

177. Mix G., Wilson H.M., Foroughi-Wehr B. The cytological status of plants of Hordeum vulgare L. regenerated from microspore callus. z. Pflanzenzucht., 1978, v. 80, 1Г 2, p. 89-99.

178. Müller A.J. Haploide Blütenpflanzen aus in vitro kultiviertem Pollen. Biologische Rundschau, 1974, Bd. 12, H. 2, S.117.128.

179. Murashige Т., Skoog P. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultires. Physiol. Plant., 1962, v. 14, p. 473-497.

180. ITarayanaswamy S., Chandy L.P. In vitro induction of haploid, diploid and triploid angrogenic embryoids and plantlets in Datura metel L. Ann. Bot. (Gr.Brit.), 1971, v. 35, N 141, p. 535-542.

181. Niizeki H., Oono K. Induction of haploid rice plant from anther culture. Proc. Japan. Acad., 1968, v. 44, N 6, p. 554-557.

182. ITitsch G. La culture de pollen isole sur milieu synthétique. C.R. Acad.Sc. Paris., D 278, 1974, IT 8, p. 1031-1034.

183. Ogura H., Tsunewaki K. Antlier culture of the cytoplasm substitution lines of Triticum aestivum cv. Chinese Spring. -Wheat Inform. Serv., 1974, n li 39, p. 13-14.

184. Ogura H. Considerations on the involvement of genetical differences with callus formation in wheat. Wheat. Inform. Serv. 1977, N 44, p. 5-7.

185. Pelletier G., Ferault M. Relations entre l'androgenèse et l'embryogenèse somatique in vitro chez les generez Iiicotiana et Petunia. C.r. Acad. sei., 1976, D 283, N 15, p.1633-1635

186. Picard E., Buyser J. Obtention de plantules haploides de Triticum aestivum L. à partir de culture d'antheres in vitro. C.R. Acad. S. Paris., 1973, D277, N 15, p. 1463-1466.

187. Picard E., Buyser J. Nouveaux risultats concernant la culture d'antheres in vitro de blé tendre (Triticum aestivum L.) Effects d'un choe thermique et de la position de l'anthere dans l'épi. C.r.Acad. sei., 1975, D281, fr 2-3, p. 127-130.

188. Picard E., Buyser J. Nouveaux résultats concernant la culture d'antheres de Triticum aestivum L. Conditions de régénération des plantes haploides et production de lignées entièrement homozygotes. C.r.Acad.sei.,1975, D 281, N 14, p. 989-992.

189. Haghavan V. Role of the generative cell in androgene-sis in henbare. Science, 1976, v. 191, ÏÏ 4225,p.388-389.

190. Raicu P., Badea E. Direct and inderect androgenesis in Petunia hybrida. Rev. roum. biol. Ser. biol. vég., 1979, v. 24, N 2, p. 171-174.

191. Rashid A., Reinert J. High-frequency embryogenesis in ab initio pollen cultures of ÎTicotiana tabacura. Naturwissenschaften, 1981, v. 68, N 7, p. 378-379.

192. Rashid A., Reinert J. Differentiation of embryogenic pollen in cold-treat buds of Micotiana tabacum var. Badischer Burley and nutritional reguirements of the isolated pollen to form embryos. Protoplasma^ 1981, v. 106, N 1-2, p.137-144.

193. Reinert J., Bajaj Y.P.S. Anther culture: haploid production and its significance. Appl. and Fundam. Aspects Plant Cell, Tissue and Organ Cult. "Berl. e.a., 1977, p. 251-267.

194. Riley R. The diploidization of polyploid wheat. Heredity, 1960, v. 15, p. 407-429.

195. Rives M., Picard E. A case of genetic assimilation through androgenesis or parthenogenesis of haploid producing systems (an hypothesis). Ann. amélior plant, 1977, b 27, N 4, p. 489-491.

196. San Iioem. L.H. Haploides d'Hordeum vulgare Là par culture in vitro d'ovaires non fécondes. Ann. Amél, plantes, 1976, v. 26, IT 4, p. 751-754.

197. Sangwan-Horreel B.S. Cytоchemical and ultrastructural peculiarities of embryogenic pollen grains and young androgenic embryos in Datura innoxia. Can. J. Bot., 1978, v. 56, N 7,p. 805-817.

198. Sangwan-Norreel B.S. Evolution in vitro du contenu du Datura innoxia. Can. J. Bot., 1981, v. 59, IT 4, p. 508-517.

199. Sangwan R.S. Amino acid metabolism in cultured anthers of Datura metel. Biochem. and Physiol. Pflanz., 1978, v. 173, IT 4, p. 355-364.

200. Sears B.R. Cytogenetic studies with polyploid of wheat I.Chromosomal aberrations in the progeny of a haploid Triticum vulgare. Genetics, 1939, v. 24, p. 509-523.

201. Sharp W,R., Raskin R.S., Sommer H.S. The use of nurse culture in the development of haploid clones in tomato. Planta(Bex 1972, v. 104, TSS 4, p. 357-361.

202. Shimada Т., Makino T. In vitro culture of wheat III. Anther culture of the a genome aneuploids in common wheat. -Theoretical and Apploid Genetics, 1975, v. 46, N 8, p. 407-410.

203. Shimada T. Haploid plants regenerated from the pollen callus of wheat (Triticum aestivum)- Jap. J. Genet., 1981, v. 56, IT 6, p. 581-588.

204. Shui H., Meng-ywan H., Zung-you X., Ming-quan Z., Han H., Zi-ying X., Jun-wen 0. Formation of "mini-microspore" in anther-derived haploids of Triticum aestivum and its possibleuses. Plant Cell Cult: Results and Perspectives, 1980, p. 389-392.

205. Sitbon M. Production of haploid Gerbera jamesonii plants by in vitro culture of untertilized ovules. Agronomie, 1981v. 1, N 9, p. 807-812.

206. Sopory S.K., Ilaheshwari S.C. Development of pollen embryoids in anther cultures of Datura innoxia. I. General obseva-tions and effects of physical factors. J. Exp. Bot., 1976, v. 27, H 96, p. 49-67.

207. Sun C., V/ang C., Chu G. Cytological studies on the androgenesis if Triticale. Acta bot. sinica, 1975, Apr., 145-154. Transi. Acta Bot. Sinica, 1973, v. 15, N 2, p. 163-173.

208. Sun C., Wang C., Chu G. Gell division and differentiation of pollen grains in Triticale anthers cultured in vitro. -Scientia Sinica, 1974, v. 17, N1, p. 47-54.

209. Sun C., V/ang C., Ghu C., The ultrastructure of plastids in the albino pollen-plants of rise. Scientia sinica, 1974, v. 17, N 6, p. 793-802.

210. Sunderland N., Wicks P.M. Bmbryoid formation in pollen grains of Nicotiana tabacum. J. Exp. Bot., 1971, v. 22, IT 70, p. 213-226.

211. Sunderland N. Anther culture: a progress report. -Science progress. Oxf., 1971, v. 59, If 236, p. 527-549.

212. Sunderland N., Collins G.B., Dunwell J.M. The role of nuclear fision in pollen emb^yogonesis of Datura innoxia Mill. Plant a, 1974, v. 117, IT 3, p. 227-241.

213. Sunderland IT., Dunwell J.M. Pathways in pollen embryogenesis. "Tissue Cult, and Plant Sci., 1974. Proc. 3rd Int. Congr Plant Tissue and Cell Cult., Leicester, 1974".London - New York, 1974, p. 141-167.

214. Sunderland N., Roberts M. New approach to pollen culture. Nature, 1977, v. 270, N 5634, p. 236-238.

215. Sunderland N. Strategies in the improvement of yields in anther culture. Proc. Symp. Plant Tissue Culture, Peking, 1978, p. 65-86.

216. Tan B.H., Halloran G.M. Some cytological aspects of diploid wheat anther culture. Wheat Inform. Serv., 1980, N 51, p. 15-18.

217. Tyrnow V.S., Enaleeva N. Kh., Sukhanov ^.M. Cytoembryo-logical reasons of haploidy in angiosperms. Fertilization an ambryogenesis in ovulated plants. Abstracts. High Tatra / Racko-va dolina /. Czechoslovakia June 14-17, 1982, p. 74.

218. Uchimiya M., Kameya T., Takahashi IT. In vitro cultureof unfertilized ovules in Solanum melogena and ovaries Zea mays. -Jap. J. Brad. ,19171, v. 21, IT 5, p. 247-250.

219. Vagera J., Novak F.J., Vyskot B. Anther cultures of Ni-cotiana tabacum L. mutants. Tfteor. and Appl. Genet., 1976, v. 47, N 3, P. 109-114.

220. Vasil I.K., ITitsch С. Experimental production of pollen haploids and their Uses. Z. Pflanzenphysiol., 1975, v. 76, IT 3, p. 191-212.

221. Wang G.C., Sun G.S., Chu C.C. Effects of culture, factors in vitro om the production of albino pollen-derived plant-lets of rice. Acta Bot. Sinica, 1977, v. 19, p. 190-199.

222. Wang P., Chen Y. Effects of growth conditions of anther -donor plants on the production of pollen plants in wheat anther culture. Acta genet, sinica, 1980, v. 7, H 1, p. 64-71.

223. Weatherhead M.A., Henshaw G.G. The induction of emb-ryoids in free pollen culture of potatoes. Pflanzenphysiol., 1979, v. 94, IT 5, p. 441-447.

224. Wenzel G., Hoffmann F., Potrykus I., Thomas E. The separation of viable rye microspores from mixed populations and thei development in culture. Llolec. Gen. Genet., 1975, v. 138, N4, p. 293-297.

225. Wenzel G., Hoffmann F., Thomas E. Heterozygous micro-spore-derived plants in rye. Theor. and Appl. Genet., 1976, v. 48, IT 4, p. 205-208.

226. Wenzel G., Hoffmann F., ïhomas E. Anther culture as a breeding tool in rape. I. Ploid level and phenotype of androge-netic plants. Z. Pflanzenzucht, 1977, v. 78, IT 2, p.149-155.

227. Wernicke W., Kohlembach H.Y/. Antherenkulturen bei

228. Seopolia. Z.Pflanzenphysiol., 1975, 3d. 77, H.1, S. 89-93.

229. Wernicke W., Kohlenbach II.XL Investigation on liquid culture medium as a means of anther culture in Nicotiana.

230. Z. Pflanzenphysiol., 1976, v. 79, N 3, p. 189-198.

231. Wu B., Cheng IC. Cytological and embryological studies on haploid plant production from cultured unpollinated ovaries of Nicotiana tabacum L. Acta bot. sinica, 1982, v. 24, N 2, p. 125-129.

232. Zhu Z., Y/u II. In vitro production of haploid plant-lets from the unpollinated ovaries of Triticum aestivum and Nicotiana tabacum. Acta Genetica sinica, 1979, v. 6, U 2, p. 181-183.1. E I4»;rj1. ПУТИ РАЗВИТИЯ ПЫЛЬЦЫ-,'А • t ■ .

233. ЦИТО^КРИОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА КУЛЬТИВИРУЕМЫХ ПЫЛЬНЖОВ

234. Особенности развития пыльцы в пыльниках разных цветков колоска