Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Влияние уровня плоидности на морфометрические показатели вегетативной и генеративной сфер томата

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Влияние уровня плоидности на морфометрические показатели вегетативной и генеративной сфер томата"

На правах рукописи

КУЧКОВСКАЯ Екатерина Валентиновна

ВЛИЯНИЕ УРОВНЯ ПЛОИДНОСТИ НА МОРФОМЕТРИЧЕСКИЕ ПОКАЗАТЕЛИ ВЕГЕТАТИВНОЙ И ГЕНЕРАТИВНОЙ СФЕР ТОМАТА

Специальность 03.00.15 — генетика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2003

Работа выполнена на кафедре генетики Московской сельскохозяйственной академии им К А Тимирязева и в лаборатории «Новые технологии размножения растений» Главного ботанического сада им НВ Цицина РАН

Научный руководитель - доктор биологических наук, профессор, академик РАСХН А.А. Жученко.

Официальные оппоненты, доктор сельскохозяйственных наук СМ. Игнатова, кандидат биологических наук Е.И. Хорьков

Ведущее учреждение' Всероссийский научно-исследовательский институт селекции и семеноводства овощных культур

Защита состоится 2004 г в ч на заседа-

нии диссертационного совета Д 220.043 10 при Московской сельскохозяйственной академии им К. А. Тимирязева по адресу 127550, Москва, ул Тимирязевская, 49

Ученый совет МСХА.

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной научной библиотеке Московской сельскохозяйственной академии имени К А Тимирязева.

Автореферат разослан «¿¿У» ?2003 г

Ученый секретарь диссертационного совета

Г И Карлов

-У, ¿Ц5б>2 19

1432.

ОБЩАЯ ХАРАСПГЕРИСГгаКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Гетероплоидия имеет большое значение в природе и селекции культурных растений. Полиплоидные формы многих растений отличаются увеличением размеров вегетативных органов, повышением устойчивости к заболеваниям, большим содержанием витаминов, Сахаров, биологически ценных и других веществ, поэтому они представляют интерес как исходный материал для дальнейшей селекции (Гареев, 1973; Жученко, 1973; Лаптев, 1984).

Явление гаплоидии относится к геномным мутациям и представляет собой уменьшение числа хромосом в два раза по отношению к уровню плоидносги исходной формы. Поскольку у гаплоидов, полученных из диплоидных форм, все гены находятся в одной дозе, в фенотипе проявляются и рецессивные аллели. Это дает возможность селекционеру оценить и отобрать искомые рекомбинантные генотипы и сравнительно быстро, путем колхицинирования, перевести их в гомозиготное диплоидное состояние (Хохлов и др., 1976; Ницше, Венцель, 1980; Соколов, Шумный, 1989).

Цель и задачи. Целью данной работы было детальное морфо-мегрическое и цигогенетическое изучение тетраплоидных и гаплоидных растений томата Исходя из этого, были поставлены следующие задачи исследования:

■ Изучить влияние уровня плоидносги на количественные и качественные признаки гаплоидных и тетраплоидных растений томата

■ Провести анализ гибридов Fj и F2, полученных путем скрещивания гаплоидов с мутантными линиями.

■ Изучить мейоз у гаплоидных и тетраплоидных форм томата.

* Подобрать доступные методы получения гаплоидных растений томата и провести сравнительную оценку их эффективности.

■ Найти оптимальные условия культивирования пыльников in vitro с целью получения гаплоидных растений томата.

■ Разработать методику получения тетраплоидов культурного L. escu-lentum МИ и диких видов томата методом колхицинирования.

■ Разработать методику получения триплоидных растений томата in vitro из недоразвитых семян от скрещивания диплоидов и тетраплоидов томата.

■ Подобрать наиболее удобные индикаторы уровня плоидносги геномных мутантов томата.

Научная новизна результатов исследований. Впервые проведено детальное исследование морфометрических признаков вегетативной и генеративной сфер гаплоидов и тетраплоидов томата по таким показате-

Mt НАЦИОНАЛfef. s* БИБЛИОТЕКА

/ iCfl(Hf6j(jt

_

лям как' число хлоропластов в замыкающих клетках устьиц (у тетрапло-идных форм) и пыльцевая продуктивность одного пыльника Проведены скрещивания гаплоидов с многомаркерными линиями диплоидного томата с целью создания анеуплоидных форм томата и оценки рекомбина-ционных процессов в мейозе у гаплоидов по результатам анализа Т^ и Р2. Показана возможность использования гаплоидов томата в качестве компонента гибридизации с целью увеличения доступной отбору генотипи-ческой изменчивости. Изучено воздействие разных биологически активных веществ, внесенных в среду культивирования, показана возможность использования гиббереллина в качестве индуктора регенерации каллусов в культуре пыльников томата. Для идентификации гаплоидов и тетраплоидов томата на ранних этапах онтогенеза нами предложено применение показателя «число хлоропласте в в замыкающих клетках устьиц», который четко отражает уровень плоидности.

Практическая значимость. Предложено применение косвенных методов идентификации (отбор по морфологическим признакам, устьич-ный и пыльцевой анализ) тетраплоидных и гаплоидных форм томата на ранних этапах онтогенеза, что позволяет значительно сократить объемы исследовательской работы. Даны методические рекомендации по получению гаплоидных растений в культуре пыльников томата. Выделены генотипы томата (сорта Микадо, Рома, Марглоб) с высокой способность к андрогенезу ш уйго, которые предлагается использовать для получения гаплоидных растений в культуре пыльников

Апробация. Результаты работы были представлены на конференциях молодых ученых и специалистов МСХА им К А Тимирязева в 1999-2001 годах; на шестой международной конференции «Регуляторы роста и развитая растений в биотехнологии» 26-28 июня 2001 года; на научной генетической конференции, посвященной 100-летию со дня рождения А Р Жебрака и 70-летию образования кафедры генетики в МСХА им К А Тимирязева, 26-27 февраля 2002 года По результатам исследований опубликовано 7 научных работ.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из 3 глав, выводов и рекомендаций, списка литературы, включающего 233 наименования, в т ч 110 иностранных авторов и приложения Экспериментальная часть включает 3 раздела Работа изложена на 154 страницах, содержит 42 таблицы, 12 рисунков.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Экспериментальные исследования проводились в 1996-2002 гг. на кафедре генетики МСХА в теплице селекционно-генетической станции им. П.И. Лисицина, а также в лаборатории «Новые технологии размно-

жения растений» Главного ботанического сада РАН имени Н.В. Цицина.

Материалом исследований влияния уровня плоидности на морфо-метрические, цитологические признаки и мейоз являлись следующие формы: сорт Микадо (п, 2п), мутантная линия Мо 940 (2п) (а, с, d, I, г, у) и La 0793 (4п) {а, с, 4 1, г, у) культурного томата L. esculentum Mill, и дикий вид L. pimpinellifolium Mill. (2п) и La 2335 (4п). Гаплоидная форма сорта Микадо была получена профессором B.C. Тырновым (г. Саратов), методом гаплопродюсера Тетраплоидные формы томата были присланы из Центра генетических ресурсов томата (США). В экспериментах по получению тетраплоидных и гаплоидных форм томата были использованы сорта, мутантные линии, устойчивые формы культурного томата и дикие виды томата.

При изучении влияния уровня плоидности на морфометриче-ские и цитологические признаки проводили измерение растений и их органов, определение числа хлоропласгов в замыкающих клетках устьиц (ЗКУ), размеров ЗКУ, фертильности, диаметра пыльцевых зерен, количества пыльцы на 1 пыльник.

Мейоз изучали при микросоорогенезе, использовались методики Грати В.Г. и Грати М И. (1980) с окраской ацето кармином и распластывания клеток в гипотоническом растворе с окраской по Гимза

Для получения гаплоидных растений томата использовали следующие методы; 1) опыление кастрированных цветков культурного томата пыльцой, облученной гамма-лучами (Со60, дозы 5, 6, 7 кР), пыльцой диких видов (L. hirsutum Humb. et Bonpl., L. peruvianum Mill.), баклажана и паслена, 2) отбор среди близнецовых растений, 3) культура пыльников.

Культура пыльников Пыльники высаживали на стадии одноядерной пыльцы. Перед высадкой на питательные среды бутоны выдерживали 1 - 15 суток при температуре +4°С. Пыльники культивировали при освещении 2-3 клк, фотопериоде 16 ч и 120-25°С. Для каллусогенеза использовали среда- 1) среда Мурасиге и Скуга (МС) (Murashige, Skoog, 1962) с 2% сахарозой с добавками 6-(у, 7-dirnethyl-alIyl-ammo)purme (2-ИП) 1 мг/л, индолил-уксусной кислоты (ИУК) 2 иг/л, 2) МС с 2% сахарозой с добавками ИУК 0,5 мг/л, зеатина 0,25 мг/л. (Zagorska et al., 1998), 3) МС с 2% сахарозой с добавками кинетина 2 мг/л, нафтил-уксусной кислоты (НУК) 1 мг/л. Среда для регенерации: МС с 2% сахарозой с добавками зеатина 2 мг/л, ИУК 0,2 мг/л, гиббереллина 0,2 мг/л.

Триплоиды томата получали методом скрещивания дипловдов и тетраплоидов, с последующей высадкой полученных недоразвитых семей на питательные среды.

Получение тетраплоидов томата проводилось методом колхици-нирования семян по методике М.Е. Гареева (1973) и обработкой колхи-

цином точек роста растений по методике Т.И. Соболевой (1967).

Значимость различий по плоидности проверена дисперсионным анализом (с помощью пакета статистических программ AGROS). Для ситуаций значимых различий подсчитаны доверительные интервалы на 95% уровне значимости, представленные в таблицах 1, 2, 3,4, 5, 6.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 1. Морфометрическая оценка образцов геномных мутантов 1.1. Характеристика гаплоидного образца сорта Микадо

По фенотипу гаплоидные растения не отличались от исходного сорта Микадо В различных вегетативных поколениях сохранялись рецессивная мутация "с" (картофельный лист), сложная кисть, фасцииро-ванные цветки, плоды, частично сросшиеся доли листа Эти признаки стабильно проявлялись и в осенних, и в весенне-летних условиях вегетации, следовательно, для их реализации достаточно одной дозы генов, содержащейся в гаплоидном наборе хромосом.

Однако параметры количественных признаков, таких как высота растений, общее количество листьев, их размеры, линейные размеры компонентов цветка (чашелистиков, лепестков, тычинок, пестика) у гаплоидов меньше, чем у диплоидов Поскольку количественные признаки определяются аддитивным действием множественных генов, уменьшение их размеров вполне объяснимо гемизиготным состоянием гаплоидных растений по этим генам.

На большом экспериментальном материале были получены данные по устьичному аппарату гаплоидов число хлопропласгов в ЗКУ было в 2 раза меньше, чем в подобных структурах диплоидов, существенно различались и размеры ЗКУ (табл. 1).

Таблица 1

Анализ устьичного аппарата гаплоидов и диплоидов сорта Микадо

Год Плоид- Размеры замыкающих Число хлоропластов в за-

изуче- ность клеток устьиц, мкм мыкающих клетках устьиц,

ния длина ширина шт. п/2п

1996 п 20,3±0,7 14,6±0,5 6,8±0,5 0,6

2п 25,8±0,6 17,1±0,5 10,8±0,8

1997 п 19,5*0,6 13,8±0,4 7,0±0,4 0,6

2п 26,0±0,6 17,3±0,5 11,1±0,7

Метод подсчета числа хлоропластов прост и позволяет получить достаточно точные данные. Этим методом можно проверять плоидность на ранних этапах онтогенеза, что дает основание рекомендовать его как косвенный метод диагностики гаплоидов.

Для характеристики пыльцы гаплоидов томата сорта Микадо

определяли диаметр пыльцевых зерен, фертильность и количество пыльцевых зерен в одном пыльнике (табл. 2). Важно отметить, что у гаплоидов преобладают стерильные зерна меньшего диаметра и поэтому средний диаметр пыльцевых зерен у них значительно меньше, чем у ди-плоидов. Показатель фертильности у гаплоидов значительно ниже, чем у диплоидов. Гаплоиды уступают диплоидам и по такому показателю, как количество пыльцевых зерен в одном пыльнике

Таблица 2

Характеристика пыльцы гаплоидов и диплоидов томата сорта Микадо

Го- Плоид- Диаметр пыль- и/ Фертиль- п/ Кол-во пыльцы на п/

ды ность цы, мкм 2п ность, % 2п 1 пыльник, шт. 2п

1996 п 17,0±1,4 7,4±3,2 24186

2п 24,1±1,6 0,7 75,2±6,4 од 27770 0,9

1997 п 15,2±1,1 8,0±4,9 20100

2п 23Д±1,5 0,7 91,7±4,4 0,1 26167 0,8

Значительное количество плодов (до 80% и более) у гаплоидов партенокарпические. Количество семян у гаплоидов в плоде от 1 до 7 шт., у диплоидов этот показатель может достигать 250 шт. Средняя масса плодов у гаплоидов около 30 г, у диплоидов около 200 г.

Цитологический анализ гаплоидов прямым методом (подсчет хромосом) проведенный нами на корешках, полученных с пасынков разных ярусов, показал высокую стабильность гаплоидных растений (не выявлено ни одного спонтанного диплоида) и полностью согласуется с результатами анализа устьиц.

1.2. Анализ гибридов, полученных путем скрещивания гаплоидного сорта Микадо с мутантными линиями

Известно, что мужские гаметы фертильны только при нормальном наборе хромосом Для выяснения числа хромосом, при котором женские гаметы фертильны, были проведены скрещивания гаплоидов с 9 многомаркерными линиями диплоидного томата с целью создания анеу-плоидных форм. Мутации маркерных линий рецессивные, локализованы в разных хромосомах. Предполагали, что женские гаметы гаплоида могут иметь меньше, чем п-хромосом, тогда соответствующие гены отца в Р[ должны проявляться как гемизиготные

Было опылено 500 цветков гаплоидов, получено 137 семян. Из 137 семян всхожими оказалось 90, дали плоды 69. Среди погибших, возможно, были анеуплоидные растения, так как последние обладают более низкой жизнеспособностью Подсчитаны хромосомы в корешках у 30 растений (2п=24)

Растения гибридов р! по высоте превосходили мутантные линии

и материнскую гаплоидную форму (эффект гетерозиса). У всех растений наблюдается картофельный лист (ген с есть и у матери и у отца»)

В одной комбинации - гаплоид х Мо 634, было получено одно растение с желтыми плодами (у гаплоида плоды красные, мутантная линия Мо 634, содержит ген г - желтая окраска плода). К сожалению, число хромосом у него определить не удалось. По-видимому, здесь скорее всего анеуплоид моносомик по 3-й хромосоме, так как ген г находится в 3-й хромосоме, не исключена и сегментальная деления, возможны и другие объяснения этого феномена.

Анализ расщепления гибридов F2 был проведен по генам, проявляющимся на стадии проростков. По всем парам маркерных признаков, гены которых локализованы в разных хромосомах, наблюдается свободное комбинирование. Влияние гаплоидии на рекомбиногенез на хромосомном уровне не обнаружено Квазисцепления не наблюдалось

1.3. Характеристика тетраплоидных форм томата La 0793 (Мо 940) и La 2335 (/- pimpinelüfoUum Mill.)

По фенотипу тетраплоидные растения мутантной линии La 0793 (Мо 940) не отличались от диплоидных растений. Наблюдается проявление всех рецессивных аллелей: а - отсутствие антоциана (11- хромосома), d - карликовость (2), / - преждевременное пожелтение листьев (8), с -картофельный лист (6), г - желтый цвет мякоти плода (3), у - бесцветный эпидермис плода (1) Вместе с тем наблюдалась более сильная экспрессия гена ¿/-карликовости (более гофрированные и искривленные листья), что, вероятно, связано с проявлением его двойной дозы. Проявление гена / наблюдалось на более поздних этапах развития растений, это можно объяснить удлинением фаз вегетации тетраплоидных растений.

Внешний вид тетраплоидных растений томата дикого вида L pimpinellifolium Mill. (La 2335) отличается от аналогичных диплоидных форм, листья шире, толще и более темного зеленого цвета, наблюдается удлинение междоузлий.

Фаза цветения у тетраллоидов наступала примерно на 10 - 12 дней позже Цветков на тетраплоидных растениях формировалось меньше и они были более крупных размеров.

Тетраплоиды и диплоиды различались по длине и ширине усть-ичных клеток и особенно по числу хлоропластов в них (табл. 3). Цитологический анализ усгьичного аппарата, показывает высокую генетическую стабильность соматических клеток вегетирующих тетраплоидных растений. Показатель «число хлоропластов в замыкающих клетках устьиц» четко отражает уровень плоидности, так что этот показатель может быть использован также и для идентификации тетраплоидов томата.

Таблица 3

Вариант, год 9 g Размеры замыкающих клеток Число

исследования i 5 й x устьиц, мкм хлоропласгов

длина 4п/2п ширина 4п/2п шт. 4п/2п

Мо 940 2a 26,4±1,4 1,46 19,2±1,2 1,47 15,9±1,4 1,60

2000 4n 38,5±2,2 28,3±2,5 25,5±2,0

Мо 940 2n 27,3±1,5 1,38 18,5±1,8 1,57 15,5±2,2 1,57

2001 4n 37,6±2,0 29,1+2,3 24,4±2,5

L. pimpinellifohum 2n 24,4±2,1 1,51 21,1±1,5 1,38 16,6±1,9 1,60

Mill. 2000 4n 36,8±2,3 29,1 ±2,2 26,6±2,1

L. pimpinellifolium 2n 23,9±1,8 1,52 22,1+1,6 1,38 16,2±1,5 1,60

Mill. 2001 4n 36,3+2,5 30,5±2,0 25,5±2,2

Пыльцевые зерна тетраплоидов более крупные (табл. 4). У тет-раплоидов наблюдается снижение процента фертильности. По пыльцевой продуктивности одного пыльника наблюдается четкая тенденция увеличения количества пыльцы от диплоида к теграплоиду и от культурного вида к дикому виду томата.

Таблица 4

Вариант, год исследования Плоид-ность Диаметр пыльцы, мкм 4п / 2п Фертиль- ность, % 4п / 2п Кол-во пыльцы на 1 пыльник, шт.

Мо 940 2п 18,6±1,8 1,31 94,7+1,7 0,68 26522

2000 4п 24,4+2,1 64,6+2,8 27411

Мо 940 2п 19,2+1,4 1,33 95,6+2,4 0,65 25973

2001 4п 25,8+1,5 63,5+3,9 27759

L. pimpinellifolium 2п 18,2+1,9 1,36 95,8+1,2 0,69 27938

MUI. 2000 4п 24,8+1,7 66,0+3,1 30788

L. pimpinellifohum 2п 19,1+1,6 1,29 96,4+1,9 0,70 28547

Mill 2001 4п 25,5+2,0 67,8+3,3 29454

По данным таблиц 3, 4 видно, что число хлоропласгов в ЗКУ размеры ЗКУ, пыльцевых зерен у тетраплоидов томата увеличиваются по сравнению с диплоидами в 1,3-1,6 раза.

Нами были определены некоторые биохимические показатели Содержание хлорофилла (табл 5) у тетраплоидов выше, чем, вероятно, и объясняется более темный цвет листьев у этих растений.

Таблица 5.

Содержание хлорофилла в листьях тетраплоидов и диплоидов томата

Вариант Плоидность Содержание хлорофилла, % от сырой массы

Мо 940 2п 0,42±0,03

4п 0,55±0,02

L. pimpinellifolium Mill. 2п 0,45±0,03

4п 0,57±0,03

Содержание сухих веществ в вегетативных органах (листья и стебель) дикого вида L. pmpinellifolium Mill, выше у диплоидных форм. Возможно, происходит укрупнение вегетативных органов тетраплоид-ных растений за счет большей обводненности клеток.

Тетраплоиды отличались низкой завязываемостью плодов. Тет-раплоидный дикий вид L. pimpittellifolium Mill. (La 2335 (4п)) имел от 1 до 4 плодов в кисти, тогда как диплоид - от 2 до 8 плодов.

Плоды дикого вида L. pmpinellifolium Mill, мелкие, у тетрапло-дов более крупные (табл 6). У мутантной линии Мо 940 наоборот более крупные плоды у диплоидов. Количество семян с плода выше у диплоидных растений. Семена у дикого вида мельче, чем у культурного, а у диплоидов меньше чем у тетраплоидов.

Таблица 6

Признак Годы L. pimpinellifolium Mill. L. esculentwn Mill. (Мо 940)

2n 4п 2п 4п

Масса плода, г 2000 1,31 ±0,05 1,95±0,10 40,4±4,3 21,4±4,8

2001 1,34±0,07 2,11±0,09 38,2±3,8 23,4±3,6

Число семян с плода, шт. 2000 31,6±3,3 19,8±4,2 41,4±5,1 25,2±3,1

2001 32,2±2,8 17,6±3,1 39,5±4,4 26,4±2,3

Масса тысячи семян, г 2000 2,34±0,05 2,54±0,06 2,63±0,08 3,14±0,11

2001 2,37±0,06 2,56±0,04 2,65±0,09 3,11±0,13

2. Изучение мейоза у геномных мутантов томата 2.1. Мейоз у гаплоидной формы сорта Микадо

Томат - самоопылитель, поэтому у диплоидной формы гены, обеспечивающие нормальный ход мейоза, так же как и другие, находятся в гомозиготном состоянии По-видимому, это и обеспечило гаплоидам внешне нормальный ход мейоза со всеми, характерными для двудольных фазами первое деление заканчивается кариокинезом, клеточная перего-

родка возникает в конце П деления при образовании тетрады микроспор тетраэдрического типа. Однако качественная сторона этого процесса характеризуется различными нарушениями

В метафазе I из-за отсутствия партнеров в большинстве клеток образуются только униваленты, их насчитывается 12 (рис 1-1) Однако, в очень небольшом количестве (доли процента) встречаются метафазы с разным числом бивалентов (от 2 до 6) (рис 1-2) Биваленты в основном открытые, где хромосомы соединены конец в конец (end to end) или реже бок о бок (side to side), иногда встречаются и триваленты, что является, по-видимому, результатом индискриминантного синапсиса

5 6 ^ в

Рис 1 Мейоз гаплоидных форм томата сорта Микадо '1-М1 (12 унива-лентов), 2 - М1 (4 бивалента + 2 унивалента), 3 - совмещение М1 и А1; 4 - диада, триада и тетрада микроспор, 5 - деление на хроматиды в первом делении мейоза, 6 - диада микроспор, 7 - мост в И; 8 - АН

' Спаривание негомологичных хромосом отмечено у гаплоидов

других растений- пшеница монококкум (Хохлов и др., 1970), мей-мутанты ржи (Богданов, 1996)

Поскольку хромосомы, образующие ассоциации у гаплоидов, негомологичные, при их контакте возможны реципрокные транслокации, нереципрокные перемещения (транспозиции), что может привести к генетической рекомбинации на хромосомном уровне Кроме того, в процессе разрыва - воссоединения хроматид возможны аберрации типа де-леций, инверсий, дупликаций, а также изменения на генном уровне. Эти процессы в мейозе протекают на хроматидном уровне, что может привести к потере хроматидами их идентичности

На следующем этапе мейоза в анафазе I (А1) распадаются бива-

9

ленты, дихроматидные хромосомы расходятся к полюсам

Расхождение хромосом в А1 неравномерное и включает все возможные варианты от 12 :0, до 6 : 6 (чаще всего встречается соотношение 7 : 5) (рис. 2).

Рисунок 2. Расхождение хромосом в А1 у гаплоидов томата (12 хр.)

Иногда наблюдается совмещение М1 и А1 (рис 1 - 3). Наряду, с расхождением целых хромосом, встречаются случаи разделения отдельных хромосом на хроматиды еще до А1, иногда это деление происходило вблизи полюса, так что обе хроматиды, по-видимому, попадали в одно ядро. Возможно, это приводит к трехполюсному делению, что подтверждается наличием триад (рис. 1-4) Триады могут возникнуть и в том случае, если во втором делении на хроматиды делится только одно ядро. Также наблюдается разделение всех хромосом на хроматиды (рис 1-5), то есть выпадение редукционного деления Таких микроспоро цитов довольно много, до 25%. Все хромосомы таких микроспороцигов делятся уже в первом делении на хроматиды, т. е. митопгически. Образуются диады микроспор (у 2п томатов их нет) (рис. 1-6) с нормальным числом хромосом - 12, что эволюционно вполне оправдано, т к. позволяет гаплоидам решить проблему бесплодия Впоследствии из них формируются большей частью фертильные пыльцевые зерна. Клетки диады не всегда одинаковы по числу хромосом Мы наблюдали в одной из клеток 13 хроматид, в другой 11.

Но чаще всего анафаза I представляет собой вереницу движущихся к разным полюсам целых и делящихся на хроматиды хромосом, наблюдаются также мосты, хроматидные и хромосомные, по-видимому, транслокационные (рис 1 -7) Некоторые микроспороциты до конца мей-оза не вступают в деление, по-видимому, из них формируются монады с реституционными ядрами.

Второе деление (эквационное) протекает также аномально, поэтому оно не приводит к образованию тетрады микроспор с одинаковым числом хромосом, так как исходные ядра телофазьт I не были одинаковыми в силу неравномерного распределения хромосом в анафазе I И даже в тех клетках, где 12 хромосом разошлись поровну (6-6), из-за не-гомологичности хромосом тетрады должны содержать разные наборы

10

хромосом в микроспороцитах (рис 1-8). Такие микроспоры нежизнеспособны, так как не содержат полного набора генов.

Часто второе деление проходит только в одном ядре, в результате образуется не тетрада, а триада. Как правило, клетки триад не одинаковые по размерам и в целом меньше, чем у тетрад, а тем более диад. В тетрадах микроспоры тоже не всегда одинаковые по размерам, что вполне объяснимо неравномерным расхождением хромосом в AI и негомоло-гичностью хромосом.

Цитокинез в микроспороцитах диплоидного томата происходит в конце П деления. У гаплоидов наблюдается нехарактерное для двудольных образование клеточной перегородки при интеркинезе

В результате у гаплоидов при мейозе могут индуцироваться следующие типы генотипической изменчивости: реципрокная транслокация, транспозиция, анеуплоидия, хромосомные аберрации, внутри-хромосомные рекомбинации (сестринские хроматидные обмены), генные мутации, что может бьггь выявлено при помощи обычных скрещиваний.

Аномалии мейоза у гаплоидов, как и следовало ожидать, приводят к низкой фертильности пыльцы В наших опытах она была в среднем 8% (табл. 2). Но этот показатель значительно выше, чем теоретически ожидаемое число нередуцированных гамет (5x10"'). По-видимому, его фактический уровень определяется формированием большого количества диад и отдельных монад, обеспечивающих завязывание небольшого числа семян и у гаплоидов.

2.2. Мейоз у тетраплоидных форм томата La 0793 (Mo 940), La 2335 (L pimpinellifolium Mill)

В период цветения у большинства тетраплоидных растений му-тантной линии Мо 940 (La 0793) и дикого вида томата L. pimpinellifolium Mill. (La 2335) происходит опадение цветков и завязей. Ввиду чего количество плодов на тетраплоидных растениях меньше, чем на диплоидных Низкая плодовитость объясняется низкой фертильностью пыльцы тетраплоидных растений 64,6% (Мо 940), 66,0% (L pimpinellifolium Mill); соответственно у диплоидов 94,7% и 95,8% На степень фертильности тетраплоидов влияет характер мейоза, а именно поведение хромосом в профазе и анафазе первого и второго деления мейоза.

На стадии диакинеза профазы I у тетраплоидных растений томата хромосомы обычно ассоциированы в биваленты и квадриваленты, которые встречаются в каждой клетке в разных количествах, встречаются также триваленты и униваленты (рис 3 - 1,2) Общее количество квад-ривалентов на клетку составляет 1-5 Они могут иметь форму замкнуто-

го кольца или цепеобразную форму

1 2 3

Рис 3 Мейоз тетраллоидной формы L. pimpinellifolium Mill.. 1,2-диакинез (наличие бивалентов, тривалентов, квадривалентов и унива-лентов); 3 - AI (наличие отстающих хромосом)

Согласно цитологическим данным (табл. 7), в диакинезе мейоза у тетраплоидного томата/,, pimpinellifolium Mill, хромосомы конъюгируют с образованием в среднем 14,7% квадривалентов и 72,2% бивалентов, кроме того, наблюдается 6,8% унивалентов и 6,3% тривалентов

Таблица 7

Результаты анализа мейоза тетраплоидных форм томата

Вариант Стадии мейоза

диакинез анафаза I

s § 0 V 1 О Ч О X if Плоидность Униваленты, % L....... . . _ Биваленты, % Триваленты, % Квадривалеты, % Норма, % | Отставания хромосом, % Образование i мостов, %

Мо 940 200 2п 0 100 0 0 100 0 0

4п 6,2 80,0 5,7 8,1 63,5 32,0 4,5

L. pimpinelli- 200 2п 0 100 0 0 100 0 0

folium Mill. 4п 6,8 72,2 6,3 14,7 74,5 22,0 3,5

В большинстве клеток метафазы I хромосомы располагались нормально в пределах веретена деления Хромосомы же, оказавшиеся вне веретена деления, в дальнейшем могут образовать микронуклеусы, что

приводит к нарушению числа хромосом в тетрадах и образованию стерильной пыльцы Обнаруженные нами мультиваленты и униваленты также могут служить причиной появления гамет с несбалансированным числом хромосом, так как их независимое расхождение может привести к неравному числу хромосом у полюсов.

В анафазе I можно было наблюдать отставание 1-2 хромосом (рис. 3 - 3), образование мостов, неравномерное распределение хромосом по полюсам (в результате чего образуются микроспоры с анеуплоидным числом хромосом), а также хромосомы, которые опережают общую массу хромосом Отклонения от нормального числа хромосом возникают за счет неправильного первого деления, что выявляется в метафазе П.

В метафазе II мейоза хромосомы выстраиваются в метафазную пластинку, в обеих частях микроспороцита, как правило, одновременно, редко может наблюдаться асинхронность деления в пределах одной материнской клетки пыльцы: в одной половине клетки хромосомы находятся на стадии метафазы II, а во второй анафазы П или телофазы II В анафазе П мейоза сестринские хроматиды расходятся к полюсам. На этой стадии могут наблюдаться такие нарушения как отставание хромосом и возникновение мостов. На заключительном этапе мейоза образуются тетрады микроспор.

3. Разработка методов получения гаплоидных, триплоидных и тет-раплоидных форм томата 3.1. Получение гаплоидных форм томата

В результате опылений кастрированных цветков культурного томата пыльцой диких видов (L. hirsutum Humb. et Bonpl, L. peruvianum Mill), баклажана и паслена образовывались либо бессемянные плоды, либо плоды с недоразвитыми семенами, которые в дальнейшем не про-ростали. При опылении облученной пыльцой завязалось 2 плода при дозах 5 и 6 кР, содержащие 14 семян, из них 11 оказались недоразвитыми и не всхожими, 3 нормальных семени дали диплоидные проростки. Недоразвитые семена высаживали на питательные среды, где развития семян также не наблюдалось.

Нами были предприняты попытки выделтъ гаплоидые проростки среди близнецов Из 12110 проростков растений томата сорта Микадо было выделено нами 24 пары близнецов, которые оказались диплоидами Культура пыльников томата

Существует мнение, что формирование структур: каллуса и эм-бриоидов, происходит при аномальном развитии микроспоры (Батыгина, 1987), что в свою очередь можно вызвать различными типами предобработок В нашем опыте использовалась обработка бутонов пониженными

положительными температурами. Считается, что холодовая предобработка уменьшает гибель микроспор, замедляет их нормальное развитие, вызывает изменение оси деления в микроспоре, что приводит в дальнейшем к формированию репродуктивного каллуса (Шамина, 1981).

Процент каплусогенеза в зависимости от продолжительности обработки пониженными положительными температурами представлен в таблице 8.

Таблица 8.

Влияние обработки пониженными положительными температурами _(+4°С) на каллусогенез в культуре пыльников томата_

Продолжительность обработки Число высаженных пыльников, шт. Число полученных каллусов, шт. Уо каллусогенеза

2000 2001 2000 2001 2000 2001

Контроль 169 2618 22 258 13,0 9,85

1 день 877 1184 67 46 7,6 3,8

2 дня - 583 - 35 - 6,0

3 дня 185 1311 19 62 10,2 4,7

5 дней - 430 - 17 3,9

6 дней - 76 - 5 - 675

7 дней 147 54 27 5 18,36 9,3

8 дней - 63 - 6 - 9,5

9 дней - 53 - - - 0

15 дней - 17 - - - 0

Высокий процент каплусогенеза наблюдался при обработке продолжительностью в 7-8 дней 18,36% (2000 г.) и 9,3-9,5% (2001), а также у контроля (пыльники не подвергали обработке пониженными положительными температурами) 13% (2000) и 9,85% (2001). Повышение длительности обработки увеличивает гибель пыльников, этим и обусловлено небольшое число высаженных пыльников, после длительных стрессов В дальнейшем регенерация была получена только на каллусах, образовавшихся на пыльниках, которые подвергались обработке пониженными положительными температурами, т е. обработка стимулирует образование морфогенных каллусов

В зависимости от генотипа частота появления каллусов варьировала. На каллусах диких видов томата и на единичных каллусах других вариантов наблюдался при длительном культивировании ризогенез

Питательная среда играла важную роль в индукции андрогенеза (табл 9) Наиболее эффективной оказалась среда МС с добавлением 2 мг/л кинетина и 1 мг/л НУК

Таблица 9.

Влияние питательной среды на каллусогенез в культуре пыльников то__мата (2001г.),_

Среда Заложено пыльников, пгг Образование каллусов

шт %

1* 2938 114 3,88

2 1400 75 5,36

3 3310 235 7,10

•1) МС с 2% сахарозой с добавлением 2-ИП 1 мг/л, ИУК 2 мг/л; 2) МС с 2% сахарозой, ИУК 0,5 мг/л, зеатин 0,25 мг/л; 3) МС с 2% сахарозой, киветян 2 мг/л, НУК 1 мг/л.

Из всех вариантов регенерационных сред наиболее подходящей оказалась среда МС с 2% сахарозой с добавлением зеатина (2 мг/л), ИУК (0,2 мг/л) и гиббереллина (0,2 мг/л), только на этой среде были получены растения-регенераты. Частота регенерации варьировала в зависимости от генотипа (табл. 10). Высокий процент регенерации от числа полученных каллусов наблюдался на сортах Рома, Микадо, Марглоб.

Таблица 10

Вариант Число получен- Число полученных % регенерации

ных каллусов, растений- от получен-

шт. регенерантов, шт. ных каллусов

2000 2001 2000 2001 2000 2001

Микадо 26 24 1 7 3,8 29,2

Марглоб 12 24 2 3 25,0 12,5

Рома - 27 - 9 - 33,3

Мо 500 - 12 - 5 - 4,2

Л-349 - 26 - 1 - 3,8

Марглоб х Мо 628 - 32 - 1 - зд

Марглоб х Мо 500 - 19 - 4 - 2Д

Растения-регенераты были размножены в культуре и высажены в почву. Взрослые растения по фенотипу не отличались от исходных диплоидных форм. У растений была определена плоидность методом подсчета числа хлоро пластов в ЗКУ. В качестве контроля были взяты диплоидные растения соответствующих генотипов. По данным этого анализа все полученные растения имеют диплоидный набор хромосом. Проведенный в дальнейшем подсчет числа хромосом подтвердил их диплоидный уровень Возможно, образовавшиеся гаплоидные растения-регенеранты, из-за низкой жизнеспособности, обусловленной одной дозой генов по сравнению с диплоидами, спонтанно возникающими в результате полиплоидизации, или развивающимися из диплоидных клеток, окружающих микроспору, были утеряны в процессе культивирования.

3.2. Получение триплоидиых форм томата

В течение двух лет (2000 - 2001 гг) нами проводилась гибридизация диплоидных и тетраплоидных родительских форм мутантной линии Мо 940 (4n - La 0793) и дикого вида L. pimpinellifolium Mill (4n - La 2335) Плоды были получены только в комбинации, где в качестве материнской формы был тетраплоид Очевидно, это связано с низкой фер-тильностью пыльцы у тетраплоидных растений 64,6 % (Мо 940), 66,0% (L. pimpinellifolium Mill ); у диплоидов 94,7% и 95,8% соответственно, а ^

также с непроростаемостью диплоидных пыльцевых зёрен отцовского родителя в тканях пестика, которые также диплоидные Процент завязавшихся плодов в комбинации 4n х 2п невысокий (в пределах 15%).

Из полученных плодов извлекали недоразвитые семена и выса- *

живали на питательные среды. Выделенные из плодов семена имели размер около 2 мм. Через неделю после посадки наблюдалось увеличение и потемнение триплоидных семян На среде, содержащей синтетические регуляторы роста и кокосовое молоко через 29 - 46 дней некоторые (наиболее крупные) семяпочки увеличивались в размерах в 2-3 раза, приобретали светло-зеленый оттенок, на внешних покровах отмечалось образование быстро деградирующего водянистого каллуса; дальнейшего развития не происходило Повышенная активность отдельных семян, очевидно, связана с нахождением их в более поздней, по сравнению с остальными, стадией эмбриогенеза.

Цитологический анализ показал некоторую неоднородность степени развития семяпочек - в варианте с мутантной линией Мо 940 большинство из них находилось в стадии ранней или поздней глобулы и лишь единичные экземпляры достигали стадии раннего сердечка. У дикого вида это соотношение было иным, приблизительно 3:1. Наблюдаемая вариация развития в пределах плода вызвана, очевидно, индивидуальными особенностями оплодотворения и развития каждой семяпочки. Замедленный эмбриогенез у Мо 940 вызван, очевидно, общей тенденцией снижения активности всех физиологических процессов в связи с наличием большого количества мутаций у растений данного генотипа.

Чтобы выяснить, чем вызвано ингибирование развития триплоидных семян, необходимо рассмотреть процесс формирования нормальных диплоидных семян питательные вещества передаются через эндотелий в эндосперм, затем в зародыш. В случае с триплоидными зародышами, на первом этапе формирования семени нарушается связь эндотелия с эндоспермом, который имеет несбалансированный геномный набор, в результате чего лишен возможности нормально функционировать. Преимущество развития получает эндотелий Аномально разрастаясь, он накапливает в себе все питательные вещества, не пропуская их по це-

почке далее. Эндосперм постепенно дегенерирует, что, в свою очередь, приводит к гибели функционально связанного с ним зародыша.

3.3. Получение тетраплоидных растений томата методом колхицииирования

В работе были использованы два способа колхицииирования: обработка воздушно-сухих семян (концентрация колхицина 1,6%, экспозиция 24 часа) и обработка точек роста в фазе 3-5 настоящих листьев (концентрации колхицина- 0,4% (6 дней); 0,5% (5 дней); 0,6% (4 дня)).

После обработки колхицином воздушно-сухих семян, наблюдалось снижение всхожести колхицинированных семян По комплексу морфологических признаков (медленный рост, увеличение ширины семядольных листьев, утолщение подсемядольного колена, появление деформированных листьев) были отобраны Со-расгения для дальнейшей работы Они были подвергнуты устьичному и пыльцевому анализам, в результате были отобраны Co-растения, которые характеризовались увеличением размеров замыкающих клеток устьиц, повышением числа хло-ропласгов в них, укрупнением пыльцевых зерен, пониженной фертиль-ностью по сравнению с соответствующим контролем.

Необходимо отметить, что цветение контроля наблюдалось в среднем на 10 - 14 дней раньше, чем Co-томатов. Большинство выделенных Со-расгений отличалось пониженной завязываемостыо плодов

Семена с отобранных Со-расгений по косвенным методам диагностики, были высеяны для анализа С гпоколения, которые также были подвергнуты анализу при помощи косвенных методов диагностики. На заключительном этапе был проведен подсчет числа хромосом и было выделено несколько тетраплоидных растений дикого вида L. cheesmanii Mill и культурного томата на устойчивой форме Л 349

После обработки точек роста томата колхицином мы наблюдали следующие морфологические изменения: из точек роста появлялись побеги с бугристыми, раздвоенными, кожистыми, темно-зелеными листьями; рост побегов был замедлен. Растения также были подвергнуты отбору на начальном этапе по морфологическим признакам, затем устьичному и пыльцевому анализам. На заключительном этапе проводился подсчет числа хромосом у отобранных растений В результате было отобрано одно тетраплоидное растение устойчивой формы Л 349 (концентрация колхицина 0,4%), что составило примерно 1% выхода тетраплоидных растений от числа всех обработанных растений данного генотипа

выводы

1.Установлены достоверные различия между гаплоидами и дип-лоидами томата сорта Микадо по большинству количественных признаков вегетативной и генеративной сфер растений В то же время имеется и большое фенотипическое сходство гаплоида и диплоида по качественным признакам Следовательно для реализации качественных признаков, по видимому, достаточно одинарного набора хромосом.

2 По числу хлоропластов в замыкающих клетках устьиц, размерам ЗКУ, количеству и диаметру пыльцевых зерен и др. количественным признакам гаплоиды значительно уступают диплоидам. Степень уменьшения варьирует в зависимости от признака (в среднем на 30%).

3. Тетраплоидные формы дикого вида L. pimpimlhfolium Mill. (La 2335) и культурного вида на мутантной линии Мо 940 (La 0793) отличаются от аналогичных диплоидных форм увеличением размеров листьев, цветков, удлинением вегетационного периода, увеличением числа хло-ропластов в замыкающих клетках устьиц, размеров ЗКУ, диаметра пыльцы, содержания хлорофилла в листьях и уменьшением фертильно-сти пыльцы.

4. Анализ мейоза у гаплоидов томата выявил значительные аномалии этого процесса, которые явились причиной высокой стерильности пыльцы и ее разнокачественности Обнаруженные особенности мейоза у гаплоидов (синапсис негомологов, отсутствие у ряда микроспороцитов редукционного деления, неравномерное распределение хромосом и хро-матид и др) позволяют объяснить наличие фертильной пыльцы, завязывание семян при самоопылении, и высказать предположение о возможности использования гаплоидов в качестве индуктора доступной отбору генотипической изменчивости.

5.Мейоз тетраплоидов характеризуется также различными нарушениями. Наличие 4-х гомологов вызывает образование разных ассоциаций (бивалентов, квадривалентов, тривалентов и унивалентов). Их разделение в I и расхождение хроматид во П делении приводит к образованию анеуплоидных гамет и снижению фертильности пыльцы, что в конечном итоге приводит к снижению завязываемости плодов и общей продуктивности тетраплоидных растений томата по сравнению с диплоидными.

6. По лучение гаплоидных растений томата путем опыления кастрированных цветков диплоидов облученной пыльцой, пыльцой диких видов томата, баклажана и паслена, а также с помощью отбора среди близнецовых растений оказалось неэффективным

7.Выделены генотипы томата с высокой способностью к андроге-незу in vitro, это сорта Микадо, Марглоб, Рома Предварительная обра-

ботка бутонов пониженными положительными температурами стимулирует образование морфогенных каллусов в культуре пыльников томата.

8.При скрещивании диплоидов и тетраплоидов томата завязывае-мость плодов (в пределах 15%) наблюдается только, если в качестве материнской линии используется тетраплоид Но и в этом случае образуются нежизнеспособные семена. Причиной абортивности семян являются нарушения в развитии эндосперма, который имеет несбалансированный геномный набор. Культура зародышей неэффективна из-за остановки в развитии триплоидных эмбрионов на ранних стадиях эмбриогенеза (глобулы и раннего сердечка).

9 Перевод на тетраплоидный уровень растений томата сопровождается появлением ряда отличительных морфологических признаков, таких как появление гофрированных и скрученных листьев, утолщение и искривление главного стебля и пасынков, укрупнение цветков, снижение количества плодов на растении и цитологических признаков: увеличение числа хлоропластов в замыкающих клетках устьиц, снижение фертиль-ности пыльцы и увеличение ее средних размеров

РЕКОМЕНДАЦИИ

1 Показатель «число хлоропластов в замыкающих клетках устьиц» четко отражает уровень плоидности, и может быть использован для идентификации тетраплоидов и гаплоидов томата на ранних этапах онтогенеза.

2.Применение косвенных методов отбора (отбор по морфологическим признакам, устьичный и пыльцевой анализы) на ранних этапах выявления растений томата с измененным уровнем плоидности позволяет значительно сократить объемы исследовательской работы

3.Для получения андрогенных гаплоидов томата in vitro рекомендуется подвергать пыльники (в бутонах) предварительной обработке пониженными положительными температурами (+4°С) в течение 7-8 суток; применять на стадии индукции - среду МС с добавлением кине-тина (1 мг/л) и НУК (2 мг/л); на стадии регенерации растений - МС с добавлением зеатина (2 мг/л), ИУК (0,2 мг/л) и гиббереллина (0,2 мг/л)

4.Выделенные нами генотипы томата с высокой способностью к андрогенезу in vitro (сорта Микадо, Марглоб, Рома) предлагается использовать в селекционном процессе для получения гаплоидных растений в культуре пыльников.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Кучковская Е.В., Шелаболина ЕЮ., Бадаева А.Э., Лукина Л.В. Цитологическое изучение гаплоидных растений / Сборник студенческих научных работ, М/ Издательство МСХА, 1999 - Вып. 4- С 3-6.

2 Иванова СВ., Кучковская ЕВ. Биологические особенности гаплоидных растений томата, //Известия ТСХА, 1999. - Вып 3 - С 58-71.

3 Иванова СВ, Долгодворова ЛИ, Карлов ГИ, Кучковская ЕВ. Морфометрическая и цитогенетичеекая характеристика гаплоидов томата, // Генетика, 2000. - Т 36, №1 - С. 52-61.

4 Кучковская Е В. Характеристика вегетативной и генеративной сфер гаплоидных, тетраплоидных и диплоидных растений томата. // Селекция и семеноводство овощных культур в XXI веке / Международная научно-практическая конференция, М, 2000 - Т. 1 - С.301-303

5 Иванова С В., Кучковская Е В. Сравнительное изучение вегетативной и генеративной сфер гаплоидных, тетраплоидных и диплоидных растений томата / В сб. Доклады ТСХА, М, 2000- Вып 272 - С 3-8.

6. Кучковская Е.В., Молканова О.И. Получение гаплоидных растений томата в культуре пыльников / В сб Тезисы докладов // Регуляторы роста и развития растений в биотехнологии (26-28 июня 2001 года) Шестая международная конференция, М • Издательство МСХА, 2001. - С. 172-173.

7 Кучковская Е.В., Молканова О И., Бакеева О.В Проблема получения гаплоидных растений у томата в культуре пыльников / Материалы научной генетической конференции (26-27 февраля 2002 года), М.: Издательство МСХА, 2002. - С. 198-200.

1

л

\

Усл. печ. л. 1,16_Зак. 538_Тир. 100 экз.

AHO «Издательство МСХА» 127550, Москва, ул. Тимирязевская, 44

РНБ Русский фонд

2006-4 7432

22 ЯНВ ni

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Кучковская, Екатерина Валентиновна

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1 Характеристика гаплоидных, диплоидных, триплоидных и тет-раплоидных форм растений.

1.1.1 Классификация и терминология.

1.1.2 Влияние уровня плоидности на качественные и количественные показатели вегетативной и генеративной сфер растений.

1.1.3 Методы диагностики уровня плоидности.

1.2 Мейоз у геномных мутантов растений.

1.2.1 Мейоз у гаплоидных растений.

1.2.2 Мейоз у полиплоидных растений.

1.2.3 Мейоз у триплоидных растений.

1.3 Методы получения геномных мутантов.

1.3.1 Получение гаплоидных растений.

Культура пыльников.

1.3.2 Получение триплоидных растений.

Культура зародышей.

1.3.3 Получение тетраплоидных растений.

Метод колхицинирования.

ГЛАВА II. ЗАДАЧИ, УСЛОВИЯ, МАТЕРИАЛ И МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЙ.

2.1 Цель и задачи исследования.

2.2 Условия проведения исследований.

2.3 Материал исследования.

2.4 Методика проведения лабораторных и вегетационных опытов.

ГЛАВА III. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

3.1 Морфометрическая оценка образцов геномных мутантов томата

3.1.1 Характеристика гаплоидных форм томата сорта Микадо.

3.1.1.1 Анализ гибридов, полученных путем скрещивания гаплоидов сорта Микадо с диплоидными мутантными линиями.

3.1.2 Характеристика тетраплоидных форм томата La 0793 (Mo 940), La 2335 (L. pimpinellifolium Mill.).

3.2 Изучение мейоза у геномных мутантов томата.

3.2.1 Мейоз у гаплоидной формы сорта Микадо.

3.2.2 Мейоз у тетраплоидных форм томата La 0793 (Mo 940), La 2335 (L. pimpinellifolium Mill.).

3.3. Разработка методов получения гаплоидных, триплоидных и тетраплоидных форм томата.

3.3.1 Получение гаплоидных форм томата.

3.3.1.1. Получение гаплоидных растений методом экспериментального воздействия на цветок.

3.3.1.2. Отбор близнецовых растений томата.

3.3.1.3. Культура пыльников томата.

3.3.2 Получение триплоидных форм томата.

3.3.3 Получение тетраплоидных форм томата методом колхицини-рования.

3.3.3.1. Обработка колхицином воздушно-сухих семян томата.

3.3.3.2. Обработка колхицином точек роста растений томата—

ВЫВОДЫ.

РЕКОМЕНДАЦИИ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Влияние уровня плоидности на морфометрические показатели вегетативной и генеративной сфер томата"

Полиплоидия является одним из факторов формообразования в природе и селекции культурных растений. Большой размах изменчивости, свойственный полиплоидам, дает богатый материал для естественного и искусственного отбора. Полиплоидные формы многих растений отличаются увеличением размера вегетативных органов, усилением устойчивости к заболеваниям, повышением содержания витаминов, Сахаров и других веществ. Полиплоиды используют для преодоления межвидовой и межродовой несовместимости. Восстанавливается плодовитость у отдаленных гибридов при переводе их на полиплоидный уровень (Гареев, 1973, Жученко, 1973, 1988; Лаптев, 1984).

Полиплоидия сыграла большую роль в эволюции растительных организмов и их распространении. Очень часто полиплоидные виды населяют территории, которые мало пригодны для жизни исходных диплоидных форм (территория арктического пояса, высокогорья, песчаные и заболоченные или засоленные земли). Ряд авторов подчеркивают важную роль полиплоидии в приспособлении растений к неблагоприятным условиям среды (Жуковский, 1971; Соколовская, 1982)

В области полиплоидии томата работали Соколова (1941), Соболева (1967), Лебедева (1962), Гареев (1973) и др. Полиплоиды томата являются ценными, в качестве материала для ряда теоретических исследований, связанных с возможностью закрепления гетерозиса, с выяснением вопроса видообразования, межвидовых скрещиваний и др.

Частным случаем автополиплоидии является триплоидия. У ряда сельскохозяйственных растений практически ценные признаки достигают высшего развития на триплоидном уровне (Бреславец, 1967; Лаптев, 1984).

Явление гаплоидии относится к геномным мутациям и представляет собой уменьшение числа хромосом в два раза по отношению к уровню плоидности исходной формы. На основе гаплоидов, путем удвоения числа их хромосом, можно быстро получать полностью гомозиготные линии. С помощью гаплоидии решают также многие задачи теоретического плана: генетический анализ, замещение и добавление хромосом, получение аллоплазмати-ческих гибридов и т.д. Гаплоидия может быть источником генетической изменчивости, что подтверждают анеуплоиды и транслокации, полученные на основе гаплоидов (Тырнов, 1970; Хохлов и др., 1970).

Реализации потенциальных возможностей гаплоидии препятствует отсутствие общей методологии использования данного явления, а также простых и надежных способов массового получения и идентификации гаплоидных растений.

В области гаплоидии томата работали Lindstrom (1929), Newcomer (1941), Кириллова, Богданова (1978) и др. Гаплоидные растения томата позволяют быстро оценить их генный состав, в том числе выявить многочисленные мутации, получить изогенный материал для селекционных и генетических исследований.

Томат является благоприятным объектом для проведения различных генетических исследований ввиду хорошей изученности генома (Жученко, 1973; Жученко и др. 1989). В настоящее время имеются довольно подробные генетические карты всех двенадцати хромосом томата.

Целью данной работы являлось всестороннее изучение влияния уровня плоидности на количественные и качественные признаки, мейоз растений томата, поиск простых и эффективных методов получения гаплоидных, три-плоидных и тетраплоидных форм томата.

Автор выражает глубокую благодарность проф. B.C. Тырнову за исходный материал - гаплоиды сорта Микадо.

Работа выполнена при финансовой поддержке ФЦНТПП «Биоразнообразие».

Заключение Диссертация по теме "Генетика", Кучковская, Екатерина Валентиновна

ВЫВОДЫ

1. Установлены достоверные различия между гаплоидами и дип-лоидами томата сорта Микадо по большинству количественных признаков вегетативной и генеративной сфер растений. В то же время имеется и большое фенотипическое сходство гаплоида и диплоида по качественным признакам. Следовательно для реализации качественных признаков, по видимому, достаточно одинарного набора хромосом.

2. По числу хлоропластов в замыкающих клетках устьиц, размерам ЗКУ, количеству и диаметру пыльцевых зерен и др. количественным признакам гаплоиды значительно уступают диплоидам. Степень уменьшения варьирует в зависимости от признака (в среднем на 30%).

3. Тетраплоидные формы дикого вида L. pimpinellifolium Mill. (La 2335) и культурного вида на мутантной линии Мо 940 (La 0793) отличаются от аналогичных диплоидных форм увеличением размеров листьев, цветков, удлинением вегетационного периода, увеличением числа хлоропластов в замыкающих клетках устьиц, размеров ЗКУ, диаметра пыльцы, содержания хлорофилла в листьях и уменьшением фертильности пыльцы.

4. Анализ мейоза у гаплоидов томата выявил значительные аномалии этого процесса, которые явились причиной высокой стерильности пыльцы и ее разнокачественности. Обнаруженные особенности мейоза у гаплоидов (синапсис негомологов, отсутствие у ряда микроспороцитов редукционного деления, неравномерное распределение хромосом и хроматид и др.) позволяют объяснить наличие фертильной пыльцы, завязывание семян при самоопылении, и высказать предположение о возможности использования гаплоидов в качестве индуктора доступной отбору генотипической изменчивости.

5. Мейоз тетраплоидов характеризуется также различными нарушениями. Наличие 4-х гомологов вызывает образование разных ассоциаций бивалентов, квадривалентов, тривалентов и унивалентов). Их разделение в I и расхождение хроматид во II делении приводит к образованию анеуплоид-ных гамет и снижению фертильности пыльцы, что в конечном итоге приводит к снижению завязываемости плодов и общей продуктивности тетрапло-идных растений томата по сравнению с диплоидными.

6. Получение гаплоидных растений томата путем опыления кастрированных цветков диплоидов облученной пыльцой, пыльцой диких видов томата, баклажана и паслена, а также с помощью отбора среди близнецовых растений оказалось неэффективным.

7. Выделены генотипы томата с высокой способностью к андроге-незу in vitro, это сорта Микадо, Марглоб, Рома. Предварительная обработка бутонов пониженными положительными температурами стимулирует образование морфогенных каллусов в культуре пыльников томата.

8. При скрещивании диплоидов и тетраплоидов томата завязывае-мость плодов (в пределах 15%) наблюдается только, если в качестве материнской линии используется тетраплоид. Но и в этом случае образуются нежизнеспособные семена. Причиной абортивности семян являются нарушения в развитии эндосперма, который имеет несбалансированный геномный набор. Культура зародышей неэффективна из-за остановки в развитии триплоидных эмбрионов на ранних стадиях эмбриогенеза (глобулы и раннего сердечка).

9. Перевод на тетраплоидный уровень растений томата сопровождается появлением ряда отличительных морфологических признаков, таких как появление гофрированных и скрученных листьев, утолщение и искривление главного стебля и пасынков, укрупнение цветков, снижение количества плодов на растении и цитологических признаков: увеличение числа хлоропластов в замыкающих клетках устьиц, снижение фертильности пыльцы и увеличение ее средних размеров.

РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Показатель «число хлоропластов в замыкающих клетках устьиц» четко отражает уровень плоидности, и может быть использован для идентификации тетраплоидов и гаплоидов томата на ранних этапах онтогенеза.

2. Применение косвенных методов отбора (отбор по морфологическим признакам, устьичный и пыльцевой анализы) на ранних этапах выявления растений томата с измененным уровнем плоидности позволяет значительно сократить объемы исследовательской работы.

3. Для получения андрогенных гаплоидов томата in vitro рекомендуется подвергать пыльники (в бутонах) предварительной обработке пониженными положительными температурами (+4°С) в течение 7-8 суток; применять на стадии индукции - среду МС с добавлением кинетина (1 мг/л) и НУК (2 мг/л); на стадии регенерации растений — МС с добавлением зеатина (2 мг/л), ИУК (0,2 мг/л) и гиббереллина (0,2 мг/л).

4. Выделенные нами генотипы томата с высокой способностью к андрогенезу in vitro (сорта Микадо, Марглоб, Рома) предлагается использовать в селекционном процессе для получения гаплоидных растений в культуре пыльников.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Кучковская, Екатерина Валентиновна, Москва

1. Авдеев Ю.И., Кучеров В.Е. Тетраплоидные формы томатов. // Науч. Тр. ВНИИ орашаемого овощеводства и бахчеводства, 1975, вып. 3-4. — С. 161165.

2. Афанасьева А.С. Аутотетраплоиды проса, полученные действием колхицина. В сб. Полиплоидия у растений. М., 1962. - С. 154-163.

3. Бакулин В.Т. Особенности цветения и плодоношения тетраплоидных форм тополя //Пробл. репродуктив. биологии растений, Пермь, 1996. — С. 49-50.

4. Батыгина Т.Б. Хлебное зерно. JI.: Наука, 1987. — 103с.

5. Батыгина Т.Б., Васильева В.Е. Прикладные аспекты эмбриологии. Автономность зародыша и эмбриокультура цветковых растений // Ботанический журнал, 1987, Том 72, № 2. -С.155-161.

6. Бельская Г.В., Голомако В.В. Отработка методов культивирования пыльников томата // Пробл. селекции овощных культур, Минск, 1997. — С.7.

7. Берндт Б. Физиолого генетические особенности андрогенеза в культуре пыльников дикого картофеля. Автореферат на соиск. уч. степени канд. биол. наук, М., 1985. - 22с.

8. Билис Ю., Пиворюнас Ю. Использование метода полиплоидии в селекции раннеспелого клевера лугового // Селекция многолетних трав. Сб. научных статей, Вильнюс. 1988, №58. - С. 12-17.

9. Бобков С.В., Сидоренко B.C., Гуринович С.О. Генотипическая гетерогенность регенерантов культуры пыльников проса (Panicum miliaceum L.) // Селекция и семеноводство с.-х. культур в России в рыноч. условиях, М., 2001. С.286-291.

10. Брежнев Д.Д. Томаты. JI.: Колос, 1964. -313с.

11. Бреславец Л.П. Значение полиплоидии в селекции растений (обзор отечественной и иностранной литературы).- М.: ВИНТИСХ, 1967. 119с.

12. Буйдин В.В. Индуцирование полиплоидии некоторыми производными аценафтена. Цитология и генетика, 1975, т. 9, № 4. - С.315-318.

13. Бурдасов В.М. Элементы физиологии эмбриогенеза и культура незрелых зародышей яблони: Автореф. дис. канд. биол. наук. Иркутск, 1972—22с.

14. Бурмакина Н.В. Исследование мейоза у гаплоидов озимой пшеницы // Генетика 1994. - Т.ЗО (прил.). - С.20-21.

15. Бутенко Р.Г. Биология клеток высших растений in vitro и биотехнологии на их основе. М.: ФБК-ПРЕСС, 1999. 160с.

16. Буторина А.К. Особенности мейоза у триплоидной формы дуба черешча-того // Цитология и генетика, 1988. Т. 22, № 6. - С. 17-20.

17. Внучкова В.А. Разработка метода получения растений-регенерантов томата в условиях культуры ткани // Физиология растений, 1977, том 24, вып. 5.-С. 1094-1100.

18. Воробьева Г.А, Суриков И.М., Гавриленко Т.А., Павлюк А.В. межродовая гибридизация томата Lycopersicon esculentum Mill, с Solanum lycopersi-coides Dun. // Сб. науч. тр. по прикл. ботанике, генетике и селекции / ВИР, 1992,т. 148.-С. 45-52.

19. Воробьева Г.А., Приходько Н.И. Использование культуры зародышей in vitro для получения межвидовых гибридов томатов // Труды по прикладной ботанике, генетике и селекции, 1980, том 67, вып. 3. С. 64-74.

20. Габедава Л.Ш. Цитология грузинских тетраплоидных пшениц и их гибридов. Автореф. дисс. на соиск. учен, степени канд. биол. наук. Тбилиси.- 1976.-32с.

21. Гареев М.Е. Экспериментальная гапло- и полиплоидия томатов. Дисс. канд. биол. наук. 1973. 190с.

22. Голованова И.В., Прибытков А.Ю. Индукция гаплоидов тритикале в культуре пыльников // АПК Сибири, Монголии и Республики Казахстан в XXI веке, Новосибирск, 2001. С. 126-127.

23. Голубева Е.А., Носульчак В.А. Связь фертильности пыльцы с особенностями мейоза у винограда (кишмиш белый крупноягодный) // Науч.-техн. бюл. ВИР. 1992, вып. 218. - С.39-41.

24. Горбунова В.Ю., Круглова Н.Н., Бытыгина Т.Б. Андрогенез и культуре изолированных пыльников злаков: цитолого-эмбриологические аспекты // Успехи соврем, биологии, 1993, т.113, вып. 1. — С. 19-35.

25. Грати В.Г., Грати М.И. Анализ пахитенных хромосом у трех видов томатов // Цитология, 1980, Т.27, №8. С. 933-939.

26. Грати М.И. Влияние индуцированных геномных и хромосомных мутаций на характер проявления маркерных и хозяйственно-ценных признаков у томата Автореф. дисс. канд. биол. наук, М., 1981. - 26с.

27. Дабкявичене Г., Билис Ю., Применение методов эмбриокультуры и полиплоидии в селекции клевера лугового // Zemes ukiomoksla. 1999, №1. -С.32-36.

28. Данилова Т.В. Оптимизация методики получения гаплоидов мягкой пшеницы (Triticum aestivum L.) в культуре пыльников in vitro и возможности их использования в селекции // Автореферат дисс. канд. биол. наук, Москва, Изд-во МСХА, 2000. 16с.

29. Данилова Т.В., Скорняков Н.Н. Свойства линий дигаплоидов яровой пшеницы (Triticum aestivum L.) полученных в культуре пыльников in vitro // Сельскохозяйственная биотехнология, под ред. акад. РАСХН Шевелухи B.C.-М.: Воскресенье, 2001, том II.-С. 151-162.

30. Дворядкина А.Г. Гаплоидия у клещевины как метод создания гомозиготных форм в целях селекции: Автореф. дис. канд. биол. наук. Краснодар: Кубан. СХИ, 1972.-25 с.

31. Долгих С.Т. Экспериментальный мутагенез в селекции томата (обзор) // С.-х. биол. 1974. - 8, № 4. - С. 483-490.

32. Дубинин Н.П., Панин В.А. Новые методы селекции растений. М.: Колос. 1967.-360с.

33. Дьячук Т.И., Тучин С.В., Столярова С.В., Сафронова Н.Ф. Спорофитное развитие микроспор — роль холодового воздействия // Материалы научной генетической конференции 26-27 февраля 2002 года. М.: Изд-во МСХА, 2002.-С. 103-105.

34. Еникеев Х.К., Высоцкий В.А., Плотникова Г.А. Развитие зародышей вишни и черешни в культуре in vitro, изолированных на ранних фазах эмбриогенеза. // Сельскохозяйственная биология, 1984, №11. — С. 46-48.

35. Жданов Н.В. Получение мутаций путем воздействия химическими мутагенами на черенки гаплоидной и диплоидной форм томатов. Автореф. дисс. канд. биол. наук., Л., 1974. 24с.

36. Жуков О.С., Олейникова О.Я. Влияние регуляторов роста на процессы андрогенеза in vitro у вишни // В сб. Регуляторы роста и развития растений в биотехнологии (26-28 июня 2001 года). М.: Изд-во МСХ А, 2001. — С.156-157.

37. Жуков О.С., Олейникова О.Я., Савельев Н.И. Методические рекомендации по получению растений регенерантов плодовых пород в культуре пыльников. Изд-во ВНИИ генетики и селекции плодовых растений им. И.В. Мичурина, Мичуринск, 1994. - 36с.

38. Жуковский П.М. Эволюционные аспекты полиплоидии растений. // Природа, 1971, № 6.-С.29-33.

39. Жученко А.А. Генетика томатов. Кишинев: Штиинца, 1973. - 662с.

40. Жученко А.А. Адаптивный потенциал культурных растений // Кишинев: Штиинца, 1988.-767с.

41. Жученко А.А., Грати В.Г., Андрющенко В.К., Грати М.И. Индуцирование хромосомных перестроек и локализация генов, контролирующих некоторые хозяйственно-ценные признаки в геноме томата // Изв. АН Молдавской ССР, серия биол. и хим. наук, 1989, №4. С.24-30.

42. Иванова С.В., Долгодворова Л.И., Кирцова М.В. Цитогенетическая характеристика мей-мутантов томата // Изв. ТСХА, 1996, № 3. — С.54-63.

43. Кильчевский А.В., Никонович Т.В. Изучение генетики регенерации у томата Lycopersicon esculentum L. // Изв. АН Беларуси. Сер. биол. науки. — 1995, №2. С.39-43.

44. Кириллова Г.А., Богданова Е.Н. Сравнительное изучение длительно существующей гаплоидной формы томата и гомозиготной диплоидной, полученной от нее // Генетика, 1978, т. 14, №6. С. 1030-1037.

45. Кириллова Г.А. Получение диплоидных гомозигот у томатов путем использования соматических гаплоидных мутантов // Вестник Леиингр. унта, 1965, № 3, Серия биология, вып. 1. — С.97-104.

46. Ключарева М.В. Переходы хроматина и ДНК в материнских клетках пыльцы и полиплоидия у томатов. // Журнал общей биологии, 1978, т. XXXIX, № 2. С.276-288.

47. Колесников А.И. Колхицин и получение новых форм сельскохозяйственных растений. Л.: Колос, 1972. - 128с.

48. Корябин Н.А. Некоторые цитологические особенности тетраплоидов ячменя // Известия ТСХА. 1986, вып. 6. - С.55-59.

49. Косова А.И., Кику В.И. Цитоэмбриология томата, Кишинев: Штиинца, 1986.-230с.

50. Кравченко А.Ю. Создание и изучение полиплоидов и отдаленных гибридов гороха посевного и кормовых бобов. Автореф. дисс. канд. с.-х. наук, Новосиб. гос. аграр. ун-т, Новосибирск, 1996. 17с.

51. Круглова Н.Н. Морфогенез в культуре пыльников пшеницы: эмбриологический подход. Уфа: Гилем, 2001.- 175с.

52. Лаптев Ю.П. Гетероплоидия в селекции растений. М.: Колос, 1984. — 248с.

53. Лебедева Н.А. Экспериментальная полиплоидия у томата // Ботанический журнал, 1962, т. 47, № 9. С. 1375-1377.

54. Лобанова Л.П. Выявление партеногенеза у томата методом генетического маркирования // II съезд Вавил. о-ва генетиков и селекционеров: Тез. докл., СПб, 2000, т. 1. С. 153-154.

55. Малыченко В.В., Фомина И.К. Полиплоидия в гибридном потомстве яблони II Науч. техн. бюл. ВИР, 1992 (1993), Вып. 227. - С.37-40.

56. Матвеева Т.С. Полиплоидные декоративные растения: однодольные. — Л.: Наука, Ленингр. отд-ние, 1980. 299с.

57. Машкина О.С. Расширение генетического разнообразия тополя методом культуры пыльников // II съезд Вавил. о-ва генетиков и селекционеров: Тез. докл., СПб., 2000, т. 1. С. 156-157.

58. Методические рекомендации по получению гаплоидных растений мягкой пшеницы в культуре пыльников // Сост. Т.И. Дьячук, П.А. Дьячук. М., 1989.-36с.

59. Нгуен Тхи Дао Особенности дедиференциации и эмбриогенеза в культуре изолированных пыльников томата. М. 1977, Автореф. дисс. канд. биол. наук. — 22с.

60. Нгуен Тхи Дао, Шамина З.Б. Культура изолированных пыльников томатов//Физиология растений, 1978, т. 25, в 1. С. 155-160.

61. Ницше В., Венцелъ Г. Гаплоиды в селекции растений. М.: Колос, 1980. —' 218с.

62. Павлюк С.П. Анатомо-морфологические особенности гаплоидных растений Nicotiana tabacum L., полученных в культуре тканей // Пробл. дендрологии, садоводства и цветоводства, Ялта, 1995. С.71.

63. Петухов С.Н. К вопросу об уровне плоидности потомства картофеля в интерплоидных скрещиваниях 4х-2х. Актуал. пробл. картофелеводства. М., 1993.-С.9-12.

64. Пивоваров В.Ф., Мамедов М.И., Бочарникова Н.И. Пасленовые культуры в Нечерноземной зоне России // Москва, 1998. — 294с.

65. Подцубная-Арнольди В.А. Общая эмбриология покрытосеменных растений. М.: Наука, 1964. -482с.

66. Понтович В.Э. Ранний эмбриогенез покрытосемянных и его гормональная регуляция // В кн.: Рост растений: первичные механизмы. М.: Наука,1978. — С.205-234.

67. Понтович В.Э. Тканевые и гормональные взаимодействия при раннем эмбриогенезе in vitro // Тканевые и клеточные культуры в селекции растений.-М., 1979. С.104-115.

68. Приходько Н.И., Воробьева Г.А. Получение амфидигаплоидов и амфип-лоидов L. esculentum Mill. X L. peruvianum Mill, в культуре in vitro. — В кн.: Тез. докл. Ill конф. по культуре клеток растений. Абовян, 1979. — С.183-184.

69. Прохоров И.П., Крючков А.В., Комиссаров В.А. Селекция и семеноводство овощных культур. М.: Колос, 1997. - 480с.

70. Раджабли Е.П., Рудь В.Д. Получение и использование полиплоидных форм растений. Новосибирск: Наука, Сиб. отд-ние, 1972. - 132с.

71. Рассветаева Э.Г. Использование кинетина при получении полиплоидов у косточковых // Науч. техн. бюл. ВИР, 1992, вып. 222. - С. 19-20.

72. Рудь В.Д. Особенности мейоза и плодовитость тетраплоидной редьки масличной // Селекция и семеноводство. Киев. 1989, вып. 67. - С.53-56.

73. Савченко Л.Ф., Экспериментальная полиплоидия в селекции шалфея мускатного // Первый междунар. сим поз. «Новые и нетрадиц. растения и перспективы их практ. использов.»: Тез. докл., Пущино, 1995. С.472.

74. Санкин Л.С. Новый способ получения мейотических полиплоидов смородины и крыжовника // Сиб. вестн. с.-х. науки, 1997, №1-2. С.78-81.

75. Санкина А.С., Санкин Л.С., Поровость пыльцы у диплоидных и тетрап-лоидных сортов и форм черной смородины // Науч. основы садоводства Сибири, Новосибирск, 1996. — С.51-54.

76. Святченко Е.А. Получение in vitro гибридов L. esculentum Mill, с L. peruvianum Mill, в условиях Молдавии. // Экологическая генетика растений и животных. Тез. докл. Всесоюз. конф., Кишинев, 1981.— С.215-216.

77. Седышева Г.А, Седов Е.Н. Полиплоидия и селекция яблони // Всерос.

78. НИИ селекции плодовых культур. Орел, 1994. 272с.

79. Седышева Г.А., Джигадло Е.Н., Князева Е.А. Особенности мейоза у триплоидных форм вишни // Селекция и сорторазведение садовых культур. — Орел, 1996.-С. 137-145.

80. Слива Н.Ю. Разработка лабораторных технологий получения андроген-ных растений белокочанной капусты с использованием культуры пыльников: Автореф. дис. канд. биол. наук. -М., 1992. — 27с.

81. Смирнова В.В. Изучение возможности использования метода культуры клеток в селекции томата. Автореф. дис. канд. биол. наук, Киев, 1987. — 19с.

82. Соболева Т.И. Влияние полиплоидии на некоторые признаки обыкновенного томата и его скрещиваемость с дикими видами. Дисс. канд. биол. наук. 1967-210с.

83. Соколов В.А., Шумный В.К. Результаты и перспективы использования гаплоидов в генетике и селекции растений // Вавиловское наследие в современной биологии. М.: Наука, 1989. — С.247-269.

84. Соколова A.M. Тетраплоидия томатов // Вестник е.- х. науки. Овощеводство и картофель, 1941, № 2. С.39-47.

85. Соколовская А.П. Полиплоидия среди цветковых растений разных ландшафтов СССР. Д.: Изд-во Ленингр. ун-та, 1982. - 126с.

86. Соловьева Л.В., Бабина Р.Д., Алексеев В.П. Экспресс-метод определения уровня плоидности у груши // Селекция и разведение садовых культур, Орел. 1997.-С. 100-103.

87. Спицин И.П. Культура зародышей вишни, черешни и вишне-черешневых гибридов на искусственной среде // Биологический сборник. Тамбов. — 1972. - С.76-79.

88. Стрельникова С.Р. Оценка частоты хиазм у диких видов, мутантных форм и гибридов Fj томата. Автореф. дис. канд. биол. наук. Москва. — 2001.-20с.

89. Тимофеева JI. Генетический контроль конъюгации хромосом у полиплоидов// Изв. АН Эстонии. Биология, 1992, Т. 41, № 4. С. 169-182.

90. Ткачев А.Т. Цитогенетический контроль процесса мейоза и результаты отбора по комплексу признаков, влияющих на плодовитость аутотетрап-лоидной гречихи // Генет. механизмы селекции и эволюции. М., Наука, 1986. — С.34-49.

91. Ткачев А.Т. Плодовитость и конъюгация хромосом у автотетраплоидной гречихи // Морфология и генетика процессов роста и развития. — М., 1989. С.39-41.

92. Тороп А.А., Кутовой А.А. Качество зерна и зеленой массы форм озимой ржи в зависимости от плоидности // С.-х. биология, Сер. Биология растений, 1997, №1. С.43-49.

93. Тороп А.А., Морозов А.А. Генетические особенности тетраплоидных популяций озимой ржи, НИИСХ Центр. — Черноз. полосы им. В.В. Докучаева. Каменная степь. 1992. — 13с.

94. Трунин J1.J1. Цитомиксис в мейозе у индуцированных автотетраплои-дов крыжовника // Сб. науч. тр. / ВНИИ садоводства им. Мичурина. — 1985, вып. 45. С.26-28.

95. Турков В.Д., Гужов Ю.Л., Шелепина Г.А., Кишмария Я. III., Кометиа-ни Д.Г. Хромосомные исследования растений в проблемах селекции, клеточной инженерии и генетическом мониторинге. М., Издательство УДН, 1988.

96. Тырнов B.C. Генетическое исследование гаплоидии у кукурузы: Авто-реф. дис. . канд. биол. наук. Саратовский ун-т, 1970. — 28с.

97. Тырнов B.C. Гаплоидия у растений: Научное и прикладное значение. — М.: Наука, 1998.-53с.

98. Уралец Л.И. Культура in vitro зародыша томата // Физиология и биохимия культ, растений, 1984, т. 16, №5. С.495-499.

99. Хан Н. Получение анеуплоидных и гетероплоидных растений в культуре пыльников // Современные достижения молекулярной биологии хромосом и клеток. Алма-Ата. 1989. - С.71-81.

100. Хохлов С.С., Гришина Е.В., Зайцева М.И., Тырнов B.C., Малышева-Шишкинская Н.А. Гаплоидия у покрытосемянных растений. Саратов: Из-во Саратовского университета, 1970, ч.1. 140с.

101. Хохлов С.С., Тырнов B.C., Гришина Е.В. Гаплоидия и селекция. М.: Наука, 1976.-221с.

102. Цветова М.И., Ишин А.Г. Эффективность различных способов колхицинирования растений (на примере злаков) // С.х. биология. Сер. Биология растений. 1999, №5. - С. 110-121.

103. Чайлахян М.Х., Бутенко Р.Г., Кулаева и др. Терминология роста и развития высших растений. М.: Наука, 1982. С.53-63.

104. Чистякова В.Н. Гаплоиды неполных пшенично-пырейных амфидип-лоидов, мягкой пшеницы и ячменя: получение и использование. Автореф. дисс. д-ра. биол. наук, Нимчиновка 1, Московская область, 2000. -58с.

105. Шамина З.Б. Андрогенез и получение гаплоидов в культуре пыльников и микроспор // Культура клеток растений. М., 1981. - С. 124-136.

106. Шевцов И.А. Генетические основы повышения плодовитости и продуктивности аутотетраплоидных растений. Автореф. дисс. д-ра биол. наук.-Л. 1977.-40с.

107. Шевцов И.А. Генетические принципы улучшения аутополиплоидных растений, Киев, 1976. 215с.

108. Шелаботин Г.П. Метод предварительной идентификации индуцированных полиплоидов смородины // Бюл. науч. информ. Всерос. НИИ генетики и селекции плодовых растений, 1998, вып. 53. — С.23-26.

109. Шелаботин Г.П. Цитогенетическое изучение индуцированных полиплоидов черной смородины // Генетика и исследования важнейших хоз. признаков плодовых растений, Мичуринск, 1994. С.34-38.

110. Щербак B.C., Хаджинов М.И. Получение тетраплоидных форм кукурузы. Генетика. 1969. Т 5. №3. - С.5-12.

111. Эльконин J1.A., Гудова Т.Н. Диплоидизация в культуре гаплоидных тканей сорго: роль экспланта и гормонального состава среды // Биол. основы селекции, Саратов, 1991. С.9-17.

112. Юдакова О.И. Получение полиплоидных форм томатов при опылении облученной пыльцой // Тез. междунар. науч. конф. «Развитие науч. наследия акад. Н.И. Вавилова», Саратов, 1997, ч. 1. С. 83-85.

113. Юдакова О.И. Эмбрио-генетические и селекционные последствия опыления облученной пыльцой у томатов. Дисс.канд. биол. наук. -1994.-163с.

114. Юрцев В.Н., Пухальский В.А. Методическое руководство к практическим занятиям по цитологической и эмбриологической микротехнике. М., 1968.- 113с.

115. Ярмолюк Г.И. Особенности мейоза у разных форм сахарной свеклы // Цитогенет. и цитоэмбриол. исслед. в селекции сахарной свеклы, Киев. — 1988. — С.48-59.

116. Ячевская Г.Л., Иванова С.В., Наумов А.А. Особенности мейоза при отдаленной гибридизации // Учебное пособие, М.: изд-во МСХА, 1990. -80с.

117. Яшин Т.А. Получение и особенности идентификации автотетраплоидов культурного томата Lucopersicon esculentum Mill. // Матер. Всерос. научно-практич. конф. молодых ученых. Санкт-Петербург, 2001. -С.100-101

118. Baarlen P. Van, Dijk P.J. van, Hoekstra R.F., Jong J.H. de, Meiotic recombination in sexual diploid and apomictic triploid dandelions (Taraxacum officinale L.) // Genome, 2000. Vol. 43, N 5. - P.827-835.

119. Badea E.M., Lupusansehi J., Verzea M., Raicu P. Studiul unor factori implicate in variatia numarului de cromozomi ai plantelor cu origine polinica. Cers. Genet veget. anim., Bucuresti. 1994. - Vol. 3. - P.71-78.

120. Bartoszewski G., Malepszy S., Niemirowicz-Szczytt K. Shoot regeneration from a cotyledon fragment culture in selected forms of the tomato (Lycopersi-con esculentum Mill.) // Genet. Pol. 37A. 1996. - P. 101-104.

121. Bose S., Maiti S.N. Mutation induction in tomato (Lycopersicon esculentum Mill.) by combined treatments with X-rays, colchicine and diethyl sulphate. — Indian J. exper. Biol., 1972.-Vol. 10, N 4.-P.324-325.

122. Bozzini A., Casoria P., De Luca P. Discovery of an Italian fertile tetraploid line of garlic // Econ. Bot., 1991. Vol. 45, N 3. - P.436-438.

123. Bullock W.P., Baenziger P.S., Schaeffer G.W., Bottino P.J. Anther culture of wheat (Triticum aestivum L.) Fj's and their Resiprocal crosses // Theor. Appl. Genet. 1982. 62. - P. 155-159.

124. Calderini O., Mariani A. Identification of meiotic mutants producing 2n pollen in the Medicago sativa complex // J. Genet. Breedg, 1994. Vol.48, N 3.-P.317-320.

125. Campion В., Perri E., Azzimonti M.T., Vicini E., Schiavi M. Spontaneous and induced chromosome doubling in gynogenic lines of onion (Allium сера L.) // Plant Breedg, 1995. Vol. 114, N 3. - P.243-246.

126. Carle R. Bestimmung des Ploidiegrades von Kamillensorten dutch und mit-tels Durchfluss-Cytophotometrie // Vortr. fur Pflanzenzuchtung, Bonn, 1993, H. 26. S.42-48.

127. Chalyk S.T., Ostrovsky V.V. Comparison of haploid and diploid maize (Zea mays L.) plants with identical genotypes // J. Genet. Breedg, 1993. -Vol.47, N 1.-P.77-80.

128. Chase S.S. Monoploids and monoploids derivates of maize (Zea maes L.) // The Bot. Rev. - 1969. - Vol. 35., N 2. - P. 161-167.

129. Chatterjee R, Senkens G. Meiotic chromosome in teractions in inbled auto-tetraploid rye (Secale cereale) И Genome, 1993. Vol.36, N1.-P. 131-138.

130. Chenghe Z., Shuling Z., Shuxing S., Mei W., Yanhua W. Observation on obtaining the triploid by 4x x 2x and its cytoembryologyin false pakchoi // Acta hortic. sinica, 2001. Vol. 28, N 4. - P.317-322.

131. Choundhury B. Embryo culture technique. III. Growth of hybrid embryos {Lycopersicon esculenlum x L. peruvianum) in culture medium.—Indian J. Hort., 1955, 12.-P.155—156.

132. Chu C.C. The N6 medium and its applicatious to anther culture of cereal regenerated plants // Proc. Symp. Plant Tissue Cult., science Press, Pehing. — 1978. -P.45-60.

133. Conicella C., Errico A. Embryology of ovule abortion in reciprocal crosses between diploids and tetraploids in Pisum sativum and P. fulveem II J. Genet Breedg, 1993. Vol. 47, N 2. - P. 157-162.

134. Cooper D.C., Brink R.A. Seed collapse following matings between diploid and tetraploid races of Lycopersicon pimpinellifolium II Reprint from Genetics.- 1945. Vol. 30. - P.376-401.

135. Davies P. A., Morton S. A comparison of barley isolated microspore and anther culture and the influence of cell culture density // Plant Cell Rep., 1998. — Vol.17, N3. -P.206-210.

136. Debergh P., Nitsch C. Premiers resultats sur la culture in vitro de grains de pollen isoles chez la tomate // C. R. Acad. Sc., Ser. D. 1973, t. 276, N 8.1. P. 1281-1284.

137. Deimling S., Geiger H.H. Anther culture in rye: Methodical improvements and genetic analysis // Vortr. fur Pflanzenzuchtung, Bonn, 1996, H. 35. — S.225-235.

138. Dowley L.J, Routley D.G., Peirce L.C. Effect ofploidy level on stomate number and cell length in tomato. Irish J. Agr. Res. - Vol. 14, № 2, 1975. — P.220-221.

139. Ecohard R., Ramanna M.S. and De Nettancourt D. Detection and cytologi-cal analysis of tomato haploids // Genetica, 1969, Deel 40, Afl 2. P. 181 -190.

140. Ercek J. Mitoticka polyploidizace brambor Solanum chacoense dlou-hodobym ovlivnenim semen kolchicinem // Rostl. Vyroba, 1991, R. 37, c. 2. — S. 175-186.

141. Faris N.M., Rakoczy-Trojanowska M., Malepszy S., Niemirowicz-Szczytt K. Induction and regeneration of cucumber (Cucumis sativus L.) doubled haploids//J. Appl. Genet., 1996. Vol. 37A.-P.181-186.

142. Frandsen N.O. Die Plastidenzahl als Markmal bei der Kartoffel // Theoret. Appl. Genetics, 1968. Vol. 38. - P. 153-167.

143. Gamiette F., Bakry F., Ano G. Ploidy determination of some yam Species (Dioscorea spp.) by flow cytometry and conventional chromosomes counting // Genet. Resources Crop Evolut. 1999. - Vol.46, N1. - P.l9-27.

144. Gresshoff P.M., Doy C.H. Development and differentiation of haploid Lycopersicon esculentum (tomato) // Planta. 1972. - Vol. 107, N2. - P. 161 -170.

145. Hajos-Novak M., Nagy A.H., Dallmann G., Vida G., Balint A. Review of investigations on tetraploid corn (Zea mays L.) at the Department of geneticsand plant breeding from the late 1960's // Bull. Univ. Agr. Sc., Godollo, 1995., 1993 (1994). — P.17-26.

146. Henry Y., Boyser de J. Float culture of wheat anthers // Theor. Appl. Genet, 1981.-Vol. 60.-P.70-79.

147. Hisajima S. Multiple choot formation from almond embryos. Biol, planta-rum, 1982, 24, N 3. — P.235-238.

148. Hofer H. In vitro androgenesis in apple: Induction regeneration and ploidy level. Progress in Temperate Fruit Breeding // Kluwer Acad. Publ., 1994. — P.399-402.

149. Ни H., Hsi T.Y., Zhuang J.J., Ouyang T.W., Zeng J.Z., Jia X., Jing J.K., Zhou S.M. Genetic inrestigation on pollen derived plantsin wheat (Triticum aestivum) // Acta Genet. Sin. - 1979, 6. - P.322-330.

150. Ни H., Huang B. Application of pollen-derived plants to crop improvament //In: Int. Research Cytol., 1987.-107, Academic Press. -P.293-3 13.

151. Huang Qun-Ce, Sun Jing-San Autotriploid plants obtained from heteroploid rice crosses // Acta bot. sinica, 1999. Vol. 41, N 7. - P.741-746.

152. Ishikawa K., Michiba K., Yoshida H., Nunomura O. Establishment of tetraploid plants of Capsicum annum L. by colchicine treatment with the analysis of flow cytometry // Capsicum Eggplant Newsletter. Turin, 1997, N16. — P.44-47.

153. Ivanicka G., Pretova A. Embryo culture and micropropagation of cherries in vitro. Sci. hort. (Neth.), 1980, 12, N 1. - P.77-82.

154. Jaramillo J., Summers W.L. Tomato anther callus production: solidifying agent and concentration influence induction of callus // J. Amer. Soc. Hort. Sci.- 1990. Vol. 115 (6). - P. 1047-1050.

155. Jensen C.J. Cell and tissue culture in plant breeding and research — Acta agr. Scand, 1983, Suppl. N 23. P. 17-39.

156. Kagan-Zur V., Mizrahi Y. A tomato triploid hybrid whose double genome parent is the male // J. Amer. Soc. Hort. Sci. 1991. - Vol.116, N2. - P.342-345.

157. Karska K. Froba wyselekcjonowana genotypow kupkowki pospolitij (.Dac-tylis glomerata L.) i zycicytrwalej (Lolium perenne L.) о wysokishzdol-nosciach androgenetycznuch // Biul. Inst. Hodowli Aklimat. Rose., 1998, N 208. S.175-183.

158. Kasha K.J. Segun-Swartz Haploidy in crop improvement // in: Cytogenetics of Crop Plants (Ed. M.S. Swaminathan, P.K. Gupta, U. Sinha), New Delhi, 1983. -P.19-68.

159. Kasha K.J., Simion E., Yao Q.A., Oro R. Isolated microspore culture of barley has arrived // Barleg Genet. Newsletter. Milwaukee (Wise.), 1997. — Vol.27.-P.13-15.

160. Katajama V. Kariological comparisons of haploid plants from octoploid Aegiloristicum and diploid wheat // Jap. J. Bot.-1935. Vol.7, N3/4. - P.349-380.

161. Kaul M.L.H., Murthy T.G.K. Mutant genes affecting higher plant meiosis // Theor. Appl. Genet. 1985. - Vol.70. - P.449-466.

162. Khawaja H.I.T., Sybenga J., Ellis J.R. Chromosome pairing and chiasma formation in autopolyploids of different Lathyrus species II Genome, 1997. -Vol.40, N6. P.937-944.

163. Koornneef M., van Diepen J.A.M., Hanhart C.J. et al. Hromosomal instability in cell and tissure cultures of tomato haploids and diploids // Euphytica. — 1989. Vol. 43, №1/2. - P.179-186.

164. Kotova A., Tomov P., Van Bockstaele E., Carlier L. Dry matter content andproductivity of diploid and tetraploid varieties and populations of perennial ryegrass (Lolium pererme L.). // Растен. науки, 1998. Г. 35, N 9. - С.699-701.

165. Kruleva M., Dimitrov В., Kraptshev В. Haploidy in maize (Zea mays L.) // Genet. Breedg, 1996/1997. Vol. 28, N V*. - P.53-63.

166. Kubalakova M., Dolezel J., Lebeda A. Ploidy in stability of embryogenic cucumber (Cucumis sativus L.) callus culture // Biol. Plantarum, 1996, t.38, N3. -P.475-480.

167. Linde-Laursen I. Chromosome doubling of wheat rye hybrids // В сб. Тритикале. Изучение и селекция. JL, 1975. — С.133-173.

168. Lindstrom E.W. A haploid mutant in the tomato // J. Hort. Sci., 1929. — Vol.29, -p.220-225.

169. Lindstrom E.W., Koos K. Cytogenetic investigation of a haploid tomato and its diploid and tetraploid progeny // Amers J. Botany, 1931, N18. P.398-410.

170. Liu Zhizeng, Song Tongming, Teng Wentao, Xue Guobin, Liu Lijuan. Study on the method of corn parthenogenetic inducing line development // J. China Agr. Univ., 2000. - Vol.5, N 3. - P.51-57.

171. Ma Y., Kato K. and Masuda M. Efficient callus induction and shoot regeneration by anther culture in male sterile mutants of tomato (Lycopersicon escu-lentum Mill. cv. First) // J. Japan. Soc. Hort. Sci. 1999. - Vol. 68, N 4. -P.768-773.

172. Maass H.J. Studies on triploid viviparous onions their origin // Genet, resources Crop Evolut., 1997. Vol.44, N2. - P.95-99.

173. Magallanes M.G.R., Pinto C.A.B.F.P., Davide L.C. Determinacao cito-morfologica do nivel de ploidia de clones de batata (Solarium tuberosum L.) obtidos por cruzamentos inter especificol // Cient Agrotecnol. 1996. — Vol.20, N4. - P.480-484.

174. Malepszy S., Mackiewicz H.O., Sarreb D.A., Narkiewicz M. Triploids incucumber. 3. New possibilities in breeding? // J. Appl. Genet., 1996. — Vol.37A. — P.195-198.

175. Mallikarjuna N., Moss J.P. Production of hybrids between Cajanus platy-carpus and Cajanus cajan // Euphytica, 1995. Vol.83, N1. - P.43-46.

176. Marchetti S., Giordano A., Pappalardo C., Olivieri A.M. Nuclear and cytoplasmic control of anther culture response in barley (Hordeum vulgare L.) // J. Genet. Breedg, 1995. Vol.49, N1. - p. 15-20.

177. Metwally E.I., Moustafa S.A., El-Sawy B.I., Haroun S.A., Shalaby T.A. Production of haploid plants from in vitro culture of unpollinated ovules of Cu-curbita реро II Plant Cell Tissue Organ Cult., 1998. Vol.52, N3.-P. 117-121.

178. Moieni A., Sarrafi A. Genetic analysis for haploid — regeneration responses of hexaploid-wheat anther cultures // Plant Breedg, 1995. Vol.114, N3. — P.247-249.

179. Monnier M. Croissanse et developpement des embryons globulaires de Capsella bursa-pastoris cultives in vitro dans un milieu a base d'une nonvelle solution minerale I I Soc. Bot. Fr., Memoires, 1973. P. 179-194.

180. Murashige Т., Skoog F. A revised medium for raped growth and bioassays with tobacco tissue cultures // Physiol, plant., 1962. Vol.15, N3. - P.473-497.

181. Muzik T.J. Studies on the development of embryo and seed of Hevea bra-siliensis in culture // L loydia, 1956. Vol.19, N1-4. - P.86-91.

182. Neal C.A., Topoleski L.D. Effects of the basal medium on growth of immature tomato embryos in vitro // J. Amer. Soc. Hort. Sci. 1983. - Vol.108 (3). -P.434-438.

183. Newcomer E.H. A colchicine induced homozygous tomato obtained through doubling clonal haploids // Proc. Amer. Soc. Hort. Sci., 1941. — Vol.100, N38.-P.610-612.

184. Notsuka K., Tsuru Т., Shiraishi M. Induced polyploid grapes via in vitro chromosome doubling // J. Jpan. Soc. Hortic. Sc., 2000. Vol.69, N5. - P.543

185. Nugent P.E. Monoecious flowering, tetraploid, virescent melon c879 — J2-4x // Hort Science, 1994. - Vol. 29, N 1. - P.47-48.

186. Okamoto G., Hirano K., Tanaka-maru N., Omori N. Obteining triploid muscat grapes by vitro culture of ovules and embryos after crossing between diploid and tetraploid cultivars // Scient. Rep. Fac. Agr. Okayama Univ., Oka-yama, 1993, N 82. P.25-29.

187. Okamoto M., Sears B. Chromosomes involved in in translocation from obtained of common weats // Canad J/ Genet, and Cytol. 1962. Vol. 4, №1. — P.24-30.

188. Ouyang J.W., Ни H., Chuang C.C., Tsend C.C. Induction of pollen plants from anther of Tritucum aestivum cultured in vitro // Sci Sin. — 1973. N1. 16. — P.79-95.

189. Pan C.L., Kao K.H. The induction of wheat pollen embryo and the influense of some factory on its frequency of induction // Proc. Symp. Plant Tissue Cult / Science. Press., Peking, 1978. P. 133-142.

190. Pasakinskiene J. In vitro metodes daugiameciu svidriu poliploidams gauti // Zemdirbyste Akademija, 2000, t.70. S.227-234.

191. Potyondi L. Cukorrepa poliploidizacio kolchicin hatasu herbicidek alkalmazasaval. // Acta agron avariensis, Mosonmagyarovar, 1999. — Vol.41, N1. -P.45-50.

192. Qin X., Rotino G.L. Chloroplast number in guard cells as ploidy indicator of in vitro grown androgenic pepper plantlets // Plant Cell Tissue Organ Cult., 1995.-Vol.41, N2.-P.145-149.

193. Raina S.K., Irfan S.T. High-frequency embryogenesis and plantled regeneration from isolated microspores of indica rice // Plant Cell Rep., 1998. — Vol.17,N12.-P.957-962.

194. Rongbai L., Pandey M.P., Pandey S.K., Dwivedi D.K. Agro-morphologicalcharacterization of ovary culture-derived plants of rice (Oryza sativa L.) // Euphytica, 1999. Vol.106, N3. - P. 197-203.

195. Saji K.V., Sujatha M. Embryogenesis and plant regeneration in anther culture of sunflower (Heliantus annuus L.) // Euphytica, 1998. — Vol. 103, N1. — P. 1-7.

196. Santos J.L., Jimenez M.M., Diez M. Meiosis in haploid rye: extensive synapsis and low chiasma frequency // Heredity, 1994. — Vol.3, pt 6. P.580-588.

197. Schaeffer Y.W., Baenziger P.S., Worley J. Haploid plant development from anthers and in vitro embryo culture of wheat // Crop Sci. 1979. 19. N 5. — P.697-702.

198. Schmid J., Keller E.R. Effect of a gametocide on the induction of haploids in Triticum aestivum // Plant Breed. Proc. Jut Symp. Berlin sept. 1985, 3-13. -P.347-349.

199. Sharp W.R., Dougall D.K. and Paddock E.F. Haploid plantlets and callus from immature pollen grains of Nicotiana and Ly copers icon II Bull. Torrey Bot. Club, 1971. Vol. 98, N 4. - P.219-222.

200. Sharp W.R., Raskin R.S., Sommer H.E. The use of nurse culture in the development of haploid clones in tomato // Planta, 1972. Vol. 104, N 4. — P.357-361.

201. Shatskaya O.A., Zabirova E.R., Schcherbak V.S., Chumak M.V. Mass induction of maternal haploids in corn // Maize Genet. Coop. Newsletter, Columbia (Mo.), 1994, N 68. P.51.

202. Singh R.K., Raghuvanshi S.S., Prakash D. Genetic improvement in advanced generations of colchitetraploid lentil (Lens culinaris Medikus) // J. Genet. Breedg, 1992. Vol. 46, N 2. - P. 151-154.

203. Somaroo B.N., Grant W.F. Meiotic chromosome behaviour in tetraploid hybrids between synthetic Lotus amphidiploids and L. corniculatus II Canad. j. Genet. Cytol. 1972. - 14. - P.57-64.

204. Stack S.M., Roelofs D. Localized chiasmata and meiotic nodules in the tetraploid onion Allium porrum II Genome, 1996. — Vol.39, N 4. — P.770-783.

205. Subova D., Michalidesova J., Lengyel G. Urcenie ploidie podl'a poctu-chloroplastov uzatvaracich bunkach prieduchov rastlin zemiakakultivovanych in vitro. Pol'nohospodarstvo. 1997, R. 43, C.8. - S.604-613.

206. Sulistyaningsih E., Tashiro Y., Shigyo M., Isshiki S. Morphological and cy-tological characteristics of haploid shallot (Allium сера L.) // Bull. Fac. Agr. Saga Univ., Saga, 1997, N 82. P.7-15.

207. Svirshchevskaya A., Dolezel J. Karyological characterization of sugar beet gynogenetic lines cultured in vitro // J. Appl. Genet., 2001. — Vol. 42, N 1. — P. 21-32.

208. Syrous M. Etude de l'heredite quantitative de quelques caracteren aux niveaux di et tetraploides chez la tomate {Lycopersicon esculentum Mill.) // These/ Paris, 1976. - 170p.

209. Tawakley M., Sudhavani A.K., Reddy G.M. Chromosomal instabihity in callus cultures of wild and cultivated genotypes of Cicer // Indian. J. exper. biol. 1992. - Vol. 30, N 7. - P.628-631.

210. Thomas B. R., Pratt D. Efficient hybridization between Lycopersicon esculentum and L. peruvianum via embryo callus // Theor. and Appl. Genet., 1981, 59, N4, P.215-219.

211. Thomas H.W., Thomas B.J. Meiosis in triploid Lolium. 1. Synaptonemal complex formation and chromosome configurations at metaphase I in ane-uploid autotriploid L. multiflorum II Genome, 1994. Vol.37, N2. - P. 181-189.

212. Thomas S., Chen Q., Howes N. Chromosome doubling of haploids of common wheat with cafleine // Genome. 1997. - Vol.40, N 4. - P.552-558.

213. Tuna M., Vogel K.P., Arumuganathan K., Gill K.S. DNA content and ploidy determination of bromegrass germplast accessions by flow cytometry // Crop. Sc., 2001.-Vol. 41, N 5. P. 1629-1634.

214. Vainola A. Polyploidization and early screening of Rhododendron hybrids. II Euphytica, 2000. Vol. 112, N 3. - P.239-244.

215. Vilkova Z., Stoeva-Popova P. and Atanassov A. Dihaploid production as result of interspecific hybridization in genus Lycopersicon II TGC Report. — 2000, 50.-P.46-47.

216. Wang C.C., Chu C.C., Sun C.S., Wu S.H., Yin K.C., Hsu C. The andro-genesis in wheat (Triticum aestivum) anthers cultured in vitro // Sci. sin. -1973.- 16.-P.218-222.

217. Wisniewska H. Meiosis and fertility in spontaneoces tetraploids of Festuca pratensis (Huds.) // J. Appl. Genet., 1995. Vol. 36, N 3. - P.205-213.

218. Wisniewska H. Morphological characterization of spontaneous polyploids in Festuca pratensis II Huds. Genet, pol., 1994. Vol.35, N4. - P.255-269.

219. Yamashita H., Shigehara I., Haniuda T. Production of triploid grapes by in ovulo embryo culture // Vitis, 1998, Bd. 37, H. 3. P. 113-117.

220. Yan L.Y., Zhang X.Z., Liu G.I. Occurrence of unreduced gametes and ploidy restoration in haploid Capsicum annum L. // J. hortic. Sc. Biotechnol., 2000. Vol.75, N 2. - P.195-197.

221. Zagorska N.A., Shtereva A., Dimitrov B.D., Kruleva M.M. Induced andro-genesis in tomato (Lycopersicon esculentum Mill.) 1 Influence of genotype on androgenetic ability // Plant Cell Reports 1998, 17. - P.968-973.

222. Zamir D., Jones R.A., Kedar N. Anther culture of male tomato (Lycopersicon esculentum Mill) mutants // Plant. Sci. Lett., 1980. P.353-361.

223. Zeng J., Ouyang J. The early androgenesis in vitro wheat anther under ordinary and low temperature // Acta Genet. Sin. — 1980. — Vol.7. P. 165-173.

224. Zhong D., Michaux-Ferriere N., Coumans M. Assay fordoubled haploid sunflower (Heliantus annus) plant production by androgenesis: fact or artifact? Part 1. In vitro anther culture // Plant Cell Tissue Organ Cult. 1995. - Vol.41, N2. -P.91-97.