Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

ВЛИЯНИЕ УРОВНЯ ПЛОИДНОСТИ НА МОРФОМЕТРИЧЕСКИЕ ПОКАЗАТЕЛИ ВЕГЕТАТИВНОЙ И ГЕНЕРАТИВНОЙ СФЕР ТОМАТА

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "ВЛИЯНИЕ УРОВНЯ ПЛОИДНОСТИ НА МОРФОМЕТРИЧЕСКИЕ ПОКАЗАТЕЛИ ВЕГЕТАТИВНОЙ И ГЕНЕРАТИВНОЙ СФЕР ТОМАТА"

А-32АМ (

/І На правах рукописи

ФГ

КУЧКОВСКАЯ Екатерина Валентиновна

ВЛИЯНИЕ УРОВНЯ ПЛОИДНОСТИ НА МОРФОМЕТРИЧЕСКИЕ ПОКАЗАТЕЛИ ВЕГЕТАТИВНОЙ И ГЕНЕРАТИВНОЙ СФЕР ТОМАТА

Специальность 03.00.15 — генетика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2003

Работа выполнена на кафедре генетики Московской сельскохозяйственной академии им К А. Тимирязева и в лаборатории «Новые технологии размножения растений» Главного ботанического сада им НВ Цицина РАН

Научный руководитель - доктор биологических наук, профессор, академик РАСХН А.А. Жученко

Официальные оппоненты доктор сельскохозяйственных наук С.И. Игнатова, кандидат биологических наук Е.И. Хорьков

Ведущее учреждение Всероссийский научно-исследовательский институт селекции и семеноводства овощных культур

Защита состоится 2004 г в /^У^ч на заседа-

нии диссертационного совета Д 220 043 10 при Московской сельскохозяйственной академии им К А Тимирязева по адресу 127550, Москва, ул Тимирязевская, 49

Ученый совет МСХА

С дис а; знакомиться в Центральной научной биб-

лии- ' 1ЬСкохозяйственной академии имени

К

\

>рат

т

Г И Картов

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Гетероплоидия имеет большое значение в природе и селекции культурных растений. Полиплоидные формы многих растений отличаются увеличением размеров вегетативных органов, повышением устойчивости к заболеваниям, большим содержанием витаминов, Сахаров, биологически ценных и других веществ, поэтому они представляют интерес как исходный материал для дальнейшей селекции (Гареев, 1973; Жученко, 1973; Лаптев, 1984).

Явление гаплоидии относится к геномным мутациям и представляет собой уменьшение числа хромосом в два раза по отношению к уровню плоидности исходной формы. Поскольку у гаплоидов, полученных из диплоидных форм, все гены находятся в одной дозе, в фенотипе проявляются и рецессивные аллели. Это дает возможность селекционеру оценить и отобрать искомые рекомбинантные генотипы и сравнительно быстро, путем колхицинирования, перевести их в гомозиготное диплоидное состояние (Хохлов и др., 1976; Ницше, Венцель, 1980; Соколов, Шумный, 1989).

Цель и задачи. Целью данной работы было детальное морфо-метрическое и цитогенетическое изучение тетр алло идных и гаплоидных растений томата. Исходя из этого, были поставлены следующие задачи исследования:

■ Изучить влияние уровня плоидности на количественные и качественные признаки гаплоидных и тетраплоидных растений томата.

■ Провести анализ гибридов Ft и F2, полученных путем скрещивания гаплоидов с мутантными линиями.

■ Изучить мейоз у гаплоидных и тетраплоидных форм томата.

• Подобрать доступные методы получения гаплоидных растений томата и провести сравнительную оценку их эффективности.

■ Найти оптимальные условия культивирования пыльников in vitro с целью получения гаплоидных растений томата.

■ Разработать методику получения тетраплоидов культурного L. escu-lentum Mill и диких видов томата методом колхицинирования.

■ Разработать методику получения триплоидных растений томата in vitro из недоразвитых семян от скрещивания диплоидов и тетраплоидов томата.

■ Подобрать наиболее удобные индикаторы уровня плоидности геномных мутантов томата.

Научная новизна результатов исследований. Впервые проведено детальное исследование морфометрических признаков вегетативной и генеративной сфер гаплоидов и тетраплоидов томата по таким показате-

ЦНБ МЬХА

фонд научной ^итер^и

лям как число хлоропластов в замыкающих клетках устьиц (у тетрапло-идных форм) и пыльцевая продуктивность одного пыльника Проведены скрещивания гаплоидов с многомаркерными линиями диплоидного томата с целью создания анеуплоидных форм томата и опенки рекомбина-ционных процессов в мейозе у гаплоидов по результатам анализа Fi и F; Показана возможность использования гаплоидов томата в качестве компонента гибридизации с целью увеличения доступной отбору генотипи-ческой изменчивости Изучено воздействие разных биологически активных веществ, внесенных в среду культивирования, показана возможность использования гиббереллина в качестве индуктора регенерации каллусов в культуре пыльников томата Для идентификации гаплоидов и тетраплоидов томата на ранних этапах онтогенеза нами предложено применение показателя «число члоропластов в замыкающих клетках устьиц», который четко отражает уровень плоидности

Практическая значимость. Предложено применение косвенных методов идентификации (отбор по морфологическим признакам, устьич-ный и пыльцевой анализ) тетраплоидных и гаплоидных форм томата на ранних этапах онтогенеза, что позволяет значительно сократить объемы исследовательской работы. Даны методические рекомендации по получению гаплоидных растений в культуре пыльников томата Выделены генотипы томата (сорта Микадо, Рома, Марглоб) с высокой способность к андрогенезу in vitro, которые предлагается использовать для получения гаплоидных растений в культуре пыльников

Апробация. Результаты работы были представлены на конференциях молодых ученых и специалистов МСХА им К А Тимирязева в 1999-2001 годах, на шестой международной конференции «Регуляторы роста и развития растений в биотехнологии» 26-28 июня 2001 года, на научной генетической конференции, посвященной 100-летию со дня рождения АР Жебрака и 70-летию образования кафедры генетики в МСХА им К А Тимирязева, 26-27 февраля 2002 года По результатам исследований опубликовано 7 научных работ

Структура и объем работы. Диссертация состоит из 3 глав, выводов и рекомендаций, списка литературы, включающего 233 наименования, в тч 110 иностранных авторов и приложения Экспериментальная часть включает 3 раздела Работа изложена на 154 страницах, содержит 42 таблицы, 12 рисунков

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Экспериментальные исследования проводились в 1996-2002 гт на кафедре генетики МСХА в теплице селекционно-генетической станции им П И Лисицина, а также в лаборатории «Новые технологии размно-

жения растений» Главного ботанического сада РАН имени Н.В. Цицина.

Материалом исследований влияния уровня плоидности на морфо-меггрические, цитологические признаки и мейоз являлись следующие формы: сорт Микадо (п, 2п), мутантная линия Мо 940 (2п) (а, с, d, I, г, у) и La 0793 (4п) (а, с, d, /, г, у) культурного томата L. esculentum Mill, и дикий вид L. pimpinelli/olium Mill. (2п) и La 2335 (4п). Гаплоидная форма сорта Микадо была получена профессором B.C. Тырновым (г. Саратов), методом гаплопродюсера. Тетраплоидные формы томата были присланы из Центра генетических ресурсов томата (США). В экспериментах по получению тетраплоидных и гаплоидных форм томата были использованы сорта, мутантные линии, устойчивые формы культурного томата и дикие виды томата.

При изучении влияния уровня плоидности на морфометриче-ские и цитологические признаки проводили измерение растений и их органов; определение числа хлоропластов в замыкающих клетках устьиц (ЗКУ), размеров ЗКУ, фертильности, диаметра пыльцевых зерен, количества пыльцы на 1 пыльник.

Мейоз изучали при микроспоро генезе, использовались методики Грати В.Г. и Грати М.И. (1980) с окраской ацетокармином и распластывания клеток в гипотоническом растворе с окраской по Гимза.

Для получения гаплоидных растений томата использовали следующие методы: 1) опыление кастрированных цветков культурного томата пыльцой, облученной гамма-лучами (Со60, дозы 5, б, 7 кР), пыльцой диких видов (JL hirsutum Humb. et Bonpl., L. peruvianum Mill.), баклажана и паслена, 2) отбор среди близнецовых растений, 3) культура пыльников.

Культура пыльников. Пыльники высаживали на стадии одноядерной пыльцы. Перед высадкой на питательные среды бутоны выдерживали 1 - 15 суток при температуре +4°С. Пыльники культивировали при освещении 2-3 клк, фотопериоде 16 ч и 120-25°С. Для каллусогенеза использовали среды: 1) среда Мурасиге и С куга (МС) (Murashige, Skoog, 1962) с 2% сахарозой с добавками 6-(у, Y-dimethyl-allyl-amino)purine (2-ИП) 1 мг/л, индолил-уксусной кислоты (ИУК) 2 мг/л, 2) МС с 2% сахарозой с добавками ИУК 0,5 мг/л, зеатина 0,25 мг/л. (Zagorska et al., 199S), 3) МС с 2% сахарозой с добавками кинетина 2 мг/л, нафтил-уксусной кислоты (НУК) 1 мг/л. Среда для регенерации: МС с 2% сахарозой с добавками зеатина 2 мг/л, ИУК 0,2 мг/л, гиббереллина 0,2 мг/л.

Триплоиды томата получали методом скрещивания диплоидов и тетраплоидов, с последующей высадкой полученных недоразвитых семей на питательные среды.

Получение тетраплоидов томата проводилось методом колхици-нирования семян по методике М.Е. Гареева (1973) и обработкой колхи-

цином точек роста растений по методике Т И Соболевой (1967)

Значимость различий по плоидности проверена дисперсионным анализом (с помошью пакета статистических программ AGROS) Для ситуаций значимых различий подсчитаны доверительные интервалы на 95% уровне значимости, представленные в таблицах I, 2,3, 4, 5, 6

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 1. Морфометрическая оценка образцов геномных мутантов 1.1. Характеристика гаплоидного образца сорта Микадо

По фенотипу гаплоидные растения не отличались от исходного сорта Микадо В различных вегетативных поколениях сохранялись рецессивная мутация "с" (картофельный лист), сложная кисть, фасцииро-ванные цветки, плоды, частично сросшиеся доли листа Эти признаки стабильно проявлялись и в осенних, и в весенне-летних условиях вегетации, следовательно, для их реализации достаточно одной дозы генов, содержащейся в гаплоидном наборе хромосом

Однако параметры количественных признаков, таких как высота растений, общее количество листьев, их размеры, линейные размеры компонентов цветка (чашелистиков, лепестков, тычинок, пестика) у гаплоидов меньше, чем у диплоидов Поскольку количественные признаки определяются аддитивным действием множественных генов, уменьшение их размеров вполне объяснимо гемизиготным состоянием гаплоидных растений по этим генам

На большом экспериментальном материале были получены данные по устьичному аппарату гаплоидов число хлопропластов в ЗКУ было в 2 раза меньше, чем в подобных структурах диплоидов, существенно различались и размеры ЗКУ (табл 1)

Таблица 1

Анализ устьичного аппарата гаплоидов и диплоидов сорта Микадо

Год Плоид- Размеры замыкающих Число хлоропластов в за-

изуче- ность клеток устьиц, мкм мыкающих клетках устьиц.

ния длина ширина шт п/2п

1996 п 20,3±0,7 14,6*0,5 6,8±0,5 0,6

2п 25,8±0,6 17,1±0,5 10,8±0,8

1QQ7 п 19,5±0,6 13,8±0,4 7,0*0,4 0,6

2п 26,0±0,6 17,3±0,5 П.ЬО.7

Метод подсчета числа хлоропластов прост и позволяет получить достаточно точные данные Этим методом можно проверять плоидность на ранних этапах онтогенеза, что дает основание рекомендовать его как косвенный метод диагностики гаплоидов

Для характеристики пыльцы гаплоидов томата сорта Микадо

определяли диаметр пыльцевых зерен, фертильность и количество пыльцевых зерен в одном пыльнике (табл. 2). Важно отметтъ, что у гаплоидов преобладают стерильные зерна меньшего диаметра и поэтому средний диаметр пыльцевых зерен у них значительно меньше, чем у ди-плоидов. Показатель фертильносги у гаплоидов значительно ниже, чем у диплоидов. Гаплоиды уступают диплоидам и по такому показателю, как количество пыльцевых зерен в одном пыльнике.

Таблица 2

Характеристика пыльцы гаплоидов и диплоидов томата сорта Микадо

Годы Плоид-ность Циаметр пыльцы, мкм п/ 2п Фертильность, % п/ 2п Кол-во пыльцы на 1 пыльник, шт. п/ 2п

1996 п 17,0±1,4 0,7 7,4±3,2 0,1 24186 0,9

2п 24,1±1,6 75,2±6,4 27770

1997 п 15,2±1,1 0.7 8,0±4,9 0,1 20100 0,8

2п 23,1±1,5 91,7±4,4 26167

Значительное количество плодов (до 80% и более) у гаплоидов партенокарпические. Количество семян у гаплоидов в плоде от 1 до 7 шт., у диплоидов этот показатель может достигать 250 шт. Средняя масса плодов у гаплоидов около 30 г., у диплоидов около 200 г.

Цитологический анализ гаплоидов прямым методом (подсчет хромосом) проведенный нами на корешках, полученных с пасынков разных ярусов, показал высокую стабильность гаплоидных растений (не выявлено ни одного спонтанного диплоида) и полностью согласуется с результатами анализа устьиц.

1.2. Анализ гибридов, полученных путем скрещивания гаплоидного сорта Микадо с мутантиыми линиями

Известно, что мужские гаметы фертильны только при нормальном наборе хромосом. Для выяснения числа хромосом, при котором женские гаметы фертильны, были проведены скрещивания гаплоидов с 9 многомаркерными линиями диплоидного томата с целью создания анеу-плоидных форм. Мутации маркерных линий рецессивные, локализованы в разных хромосомах. Предполагали, что женские гаметы гаплоида могут иметь меньше, чем п-хромосом, тогда соответствующие гены отца в должны проявляться как гемизиготные.

Было опылено 500 цветков гаплоидов, получено 137 семян. Из 137 семян всхожими оказалось 90, дали плоды 69. Среди погибших, возможно, были анеуплоидные растения, так как последние обладают более низкой жизнеспособностью. Подсчитаны хромосомы в корешках у 30 растений (2п=24).

Растения гибридов Р] по высоте превосходили мутантные линии

и материнскую гаплоидную форму (эффект гетерозиса) У всех растений наблюдается картофельный лист (ген с есть и у матери и у ото»)

В одной комбинации - гаплоид ч Мо 634, было получено одно растение с желтыми плодами (у гаплоида плоды красные, мутантная линия Мо 634, содержит ген г - желтая окраска плода) К сожалению, число хромосом у него определить не удалось По-видимому, здесь скорее всего анеуплоид моносомик по 3-й хромосоме, так как ген г находится в 3-й хромосоме, не исключена и сегментальная деления, возможны и другие объяснения этого феномена

Анализ расщепления гибридов F2 был проведен по генам, проявляющимся на стадии проростков По всем парам маркерных признаков, гены которых локализованы в разных хромосомах, наблюдается свободное комбинирование Влияние гаплоидии на рекомбиногенез на хромосомном уровне не обнаружено Квазисцепления не наблюдалось

1.3. Характеристика тетраплоидных форм томата La 0793 (Мо 940) и La 2335 (X. pimp'mcUifolium Mill.)

По фенотипу теграплоидные растения мутантной линии La 0793 (Мо 940) не отличались от диплоидных растений Наблюдается проявление всех рецессивных аллелей а - отсутствие антоииана (U- хромосома), d - карликовость (2), / - преждевременное пожелтение листьев (8), с -картофельный лист (6), г - желтый цвет мякоти плода (3), _v - бесцветный эпидермис плода (1) Вместе с тем наблюдалась более сильная экспрессия гена (/-карликовости (более гофрированные и искривленные листья), что, вероятно, связано с проявлением его двойной дозы Проявление гена / наблюдалось на более поздних этапах развития растений, это можно объяснить удлинением фаз вегетации тетраплоидных растений

Внешний вид тетраплоидных растений томата дикого вида L pimpmelhfohum Mill (La 2335) отличается от аналогичных диплоидных форм листья шире, толще и более темного зеленого цвета, наблюдается удлинение междоузлий

Фаза цветения у тетраплоидов наступала примерно на 10 - 12 дней позже Цветков на тетраплоидных растениях формировалось меньше и они были более крупных размеров

Тетраплоиды и диплоиды различались по длине и ширине усть-ичных клеток и особенно по числу члоропластов в них (табл 3) Цитологический анализ уегьичного аппарата, показывает высокую генетическую стабильность соматических клеток вегетирующих тетраплоидных растений Показатель «число хлоропластов в замыкающих клетках устьиц» четко отражает уровень плоидносги, так что этот показатель может быть использован также и для идентификации тетраплоидов томата

Таблица З

Анализ устьичного

Вариант, год исследования Плоид-ность Размеры замыкающих клеток устьиц, мкм Число хлоропласгов

длина 4п/2п ширина 4п/2п шт.' 4п/2а

Мо 940 2000 2п 26,4±1,4 1,46 19,2±1,2 1,47 15,9±1,4 1,60

4п 38,5±2,2 28,3±2,5 25,5±2,0

Мо 940 2001 2п 27,3±1,5 1,38 18,5±1,8 1,57 15,5i2,2 1,57

4п 37,6±2,0 29,1 ±2,3 24,4±2,5

L. pimpimllifolium Mill. 2000 2п 24,4±2,1 1,51 21,1+1,5 1,38 16,6±1,9 1,60

4п 36,8±2,3 29,1+2,2 2б,6±2,1

L. pimpimllifolium Mill. 2001 2п 23,9±1,8 1,52 22,1±1,б 1,38 16,2±1,5 1,60

4п 36,3 ±2,5 30,5±2,0 25,5±2,2

Пыльцевые зерна тетраплоидов более крупные (табл. 4). У тет-раплоидов наблюдается снижение процента фертильности. По пыльцевой продуктивности одного пыльника наблюдается четкая тенденция увеличения количества пыльцы от диплоида к тетраплоиду и от культурного вида к дикому виду томата.

Таблица 4

Характеристика пыльцы тетраплоидов и диплоидов томата

Вариант, год исследования Плоид-ность Диаметр пыльцы, мкм 4п і 2п Фертиль- носгь, % 4п / 2п Кол-во пыльцы на 1 пыльник, шт.

Мо 940 2000 2n 18,6±1,8 1,31 94,7±1,7 0,68 26522

4n 24,4±2,1 64,6±2,8 27411

Мо 940 2001 2n 19,2±1,4 1,33 95,6±2,4 0,65 25973

4n 25,8±1,5 63,5±3,9 27759

L. pimpinellifolium Mill. 2000 2n 18,2±1,9 1,36 95,8±1,2 0,69 27938

4n 24,8±1,7 66,0±3,1 30788

L. pimpinellifolmm Mill. 2001 2n 19,1±1,6 1,29 96,4±1,9 0,70 28547

4n 25,5±2,0 67,8±3,3 29454

По данным таблиц 3, 4 видно, что число хлоропласгов в ЗКУ размеры ЗКУ, пыльцевых зерен у тетраплоидов томата увеличиваются по сравнению с диплоидами в 1,3-1,6 раза.

Нами были определены некоторые биохимические показатели. Содержание хлорофилла (табл. 5) у тетраплоидов выше, чем, вероятно, и объясняется более темный цвет листьев у этих растений.

Таблица 5

Содержание хлорофилла в листьях тетраплоидов и диплоидов томата

Вариант Плоидность Содержание хлорофилла, % от сырой массы

Мо 940 2п 0,42±0,03

4п 0 55±0,02

L pimpinelhfohum Mill 2п 0,45±0,03

4п 0,S7±0,03

Содержание сухих веществ в вегетативных органах (листья и стебель) дикого вида L. pimpinelhfohum Mill выше у диплоидных форм Возможно, происходит укрупнение вегетативных органов тетраплоид-ных растений за счет большей обводненности клеток

Тетраплоиды отличались низкой завязываемостью плодов Тет-раплоидный дикий віщ L. pimpmellifohum Mill (La 2335 (4n)) имел от 1 до 4 плодов в кисти, тогда как диплоид - от 2 до 8 плодов

Плоды дикого вида L pimpinelhfohum Mill мелкие, у тетрашш-дов более крупные (табл 6) У мутантной линии Мо 940 наоборот более крупные плоды у диплоидов Количество семян с плода выше у диплоидных растений Семена у дикого вида мельче, чем у культурного, а у диплоидов меньше чем у тетраплоидов

Таблица ъ

Признак Годы L. pimpinelhfohum Mill L. esculentum Mill (Mo 940)

2n 4n 2n 4n

Масса плода, г 2000 1,31 ±0.05 1,95*0,10 40 4±4.3 21,4±4,8

2001 1,34*0,07 2,1 I ±0,09 38,2±3,8 23,4=t3,&

Число семян с плода, шт 2000 31,6=t3 3 19,8±4,2 41,4±5,1 25,2±3,1

2001 32,2*2.8 17.6±3.1 39,5*4,4 26,4±2 3

Масса тысячи семян, г 2000 2,34±0,05 2,54±0,06 2,63±0,08 3,14±0,11

2001 2,37±0,06 2,56±0,04 2,65*0,09 3,11±0,13

2. Изучение мейоза у геномных мутантов томата 2.1. Мейоз у гаплоидной формы сорта Микадо Томат - самоопылитель, поэтому у диплоидной формы гены, обеспечивающие нормальный ход мейоза, так же как и другие, находятся в гомозиготном состоянии По-видимому, это и обеспечило гаплоидам внешне нормальный ход мейоза со всеми, характерными для двудольных фазами первое деление заканчивается кариокинезом, клеточная перего-

родкз возникает в конце П деления при образовании тетрады микроспор тетраэдрнческого типа. Однако качественная сторона этого процесса характеризуется различными нарушениями.

В метафазе I шз-за отсутствия партнеров в большинстве клеток образуются только унтааленты, та насчитывается 12 (рвс.1-1). Однако, в очень небольшом количестве (доли процента) встречаются метафазы с разным числом бивалентов (от 2 до 6) (рис. 1-2). Биваленты в основном открытые, где хромосомы соединены конец в конец (end to end) иди реже бок о бок (side to side), иногда встречаются и тривалиггы, что является,

Рис. 1. Мейоз гаплоидных форм томата сорта Микадо: 1 - Ml (12 унива-лентов); 2-Ml (4 бивалента + 2 унивалента); 3 - совмещение Ml и AI; 4 - диада, триада и тетрада микроспор; 5 - деление на хроматиды в первом делении мейоза; б - диада микроспор; 7 - мост в Т1; 8 - All.

Спаривание негомологачных хромосом отмечено у гаплоидов других растений: пшеница монококкум (Хохлов и др., 1970), мей-мутанты ржи (Богданов, 1996).

Поскольку хромосомы, образующие ассоциации у гаплоидов, негомологичиые, при их контакте возможны решшрокные трансяока-ции, нерецкпрокиые перемещения (тфшшсвиыда), что может привести к генетической рекомбинации на хромосомном уровне. Кроме того, в процессе разрыва - воссоединения хроматид возможны аберрации типа де-леций, инверсий, дупликаций, а также изменения на генном уровне. Эти процессы в мейозе протекают на хроматидном уровне, что может привести к потере хроматинами «к идентичности.

На следующем этапе мейоза в анафазе I (AI) распадаются бива-

9

ленты, дихроматидные хромосомы расходятся к полюсам.

Расхождение хромосом в А1 неравномерное и включает все возможные варианты от 12 0, до 6 6 (чаще всего встречается соотношение 7 5) (рис 2)

Рисунок 2 Расхождение хромосом в АІ у гаплоидов томата (12 хр)

Иногда наблюдается совмещение МІ и АІ (рис 1-3) Наряду, с расхождением целых хромосом, встречаются случаи разделения отдельных хромосом на хроматиды еще до А Г, иногда это деление происходило вблизи полюса, так что обе хроматиды, по-видимому, попадали в одно ядро Возможно, это приводит к трехполюсному делению, что подтверждается наличием триад (рис 1-4) Триады могут возникнуть и в том случае, если во втором делении на хроматиды делится только одно ядро Также наблюдается разделение всех хромосом на хроматиды (рис 1-5), то есть выпадение редукционного деления Таких микроспороцитов довольно много, до 25% Все хромосомы таких микроспороцитов делятся уже в первом делении на хроматиды, т е митотически Образуются диады микроспор (у 2п томатов их нет) (рис !-Ъ) с нормальным числом хромосом - 12, что эволюционно вполне оправдано, т к позволяет гаплоидам решить проблему бесплодия Впоследствии из них формируются большей частью фертильные пыльцевые зерна Клетки диады не всегда одинаковы по числу хромосом Мы наблюдали в одной из клеток 13 хроматид, в другой 11

Но чаще всего анафаза Г представляет собой вереницу движущихся к разным полюсам целых и делящихся на хроматиды хромосом, наблюдаются также мосты, хроматидные и хромосомные, по-видимому, транслокационные (рис 1-7) Некоторые микроспороциты до конца мей-оза не вступают в деление, по-видимому, из них формируются монады с реституционными ядрами

Второе деление (эквационное) протекает также аномально, поэтому оно не приводит к образованию тетрады микроспор с одинаковым числом хромосом, так как исходные ядра телофазы I не были одинаковыми в силу неравномерного распределения хромосом в знафазе I И даже в тех клетках, где 12 хромосом разошлись поровну (6-6), из-за не-гомологачности хромосом тетрады должны содержать разные наборы

10

хромосом в микрослороцитах (рис 1-8) Такие микроспоры нежизнеспособны, так как не содержат полного набора генов

Часто второе деление проходит только в одном ядре, в результате образуется не тетрада, а триада. Как правило, клетки триад не одинаковые по размерам и в целом меньше, чем у тетрад, а тем более диад В тетрадах микроспоры тоже не всегда одинаковые по размерам, что вполне объяснимо неравномерным расхождением хромосом в AI и негомоло-гичносгью хромосом

Цитокинез в микроспорошггах диплоидного томата происходит в конце Д деления У гаплоидов наблюдается нехарактерное для двудольных образование клеточной neperopoi™ni при интеркинезе

В результате у гаплоидов при мейозе могут индуцироваться следующие типы генотипической изменчивости реципрокная транслокация, транспозиция, анеуплоидпя, хромосомные аберрации, внутри-хромосомные рекомбинации (сестринские хроматидные обмены), генные мутации, что может быть выявлено при помощи обычных скрещиваний

Аномалии мейоза у гаплоидов, как и следовало ожидать, приводят к низкой фертильности пыльцы В наших опытах она была в среднем 8% (табл 2) Но этот показатель значительно выше, чем теоретически ожидаемое число нередуцированных гамет (5x105) По-видимому, его фактический уровень определяется формированием большого количества диад и отдельных монад, обеспечивающих завязывание небольшого числа семян и у гаплоидов

2.2. Мейоз у тетраплоидных форм томата La 0793 (Mo 940), La 2335 (L. pimpinellifalium Mill.)

В период цветения у большинства тетраплоидных растений му-тантной линии Мо 940 (La 0793) и дикого вида томата L. pimpinellrfolium Mill (La 2335) происходит опадение цветков и завязей. Ввиду чего количество плодов на тетраплоидных растениях меньше, чем на диплоидных Низкая плодовитость объясняется низкой фертильностью пыльцы тетраплоидных растений 64,6% (Мо 940), 66,0% (L. ptmpinelhfohum Mill), соответственно у диллоидов 94,7% и 95,8% На степень фертильности тетраплоидов влияет характер мейоза, а именно поведение хромосом в профазе и анафазе первого и второго деления мейоза

На стадии диакинеза профазы Г у тетраплоидных растений томата хромосомы обычно ассоциированы в биваленты и квадривапенты, которые встречаются в каждой клетке в разных количествах, встречаются также триваленты и униваленты (рис 3 - 1, 2) Общее количество квад-ривалентов на клетку составляет 1-5 Они могут иметь форму замкнуто-

го кольца или цепеобразную форму.

Рис. 3. Мейоз тетраплоидной формыL, pimpinellifolium Mill.: 1,2-диакинез (наличие бивалентов, тривалентов, квадривалентов и унива-лентов); 3 - AI (наличие отстающих хромосом)

Согласно цитологическим данным (табл. 7), в диакинезе мейоза у тетраплоидного томата L. pimpinellifolium Mill, хромосомы конъюгируют с образованием в среднем 14,7% квадривалентов и 72,2% бивалентов, кроме того, наблюдается 6,8% унивалентов и 6,3% тривалентов.

Таблица 7

Результаты анализа мейоза тетраплоидных форм томата.

Вариант Стадии мейоза

диакинез анафаза I

Й

2

§ к X И в- S о « о К V Плоидность Унивапешы, % Биваленты, % і Триваленты, % Квадриваленты, % Норма, % Отставания хромосом,' Образование мостов, %

Мо 940 200 2п 0 100 0 0 100 0 0

4п 6,2 80,0 5,7 63,5 32,0 4,5

L. pimpinelli- 200 2п 0 100 0 0 100 0 0

folium Mill. 4п 6,8 72,2 6,3 14,7 74,5 22,0 3,5

В большинстве клеток мегафазы I хромосомы располагались нормально в пределах веретена деления. Хромосомы же, оказавшиеся вне веретена деления, в дальнейшем могут образовать микронуклеусы, что

приводит к нарушению числа хромосом в тетрадах и образованию стерильной пыльцы Обнаруженные нами мультиваленты и униваленты также могут служить причиной появления гамет с несбалансированным числом хромосом, так как их независимое расхождение может привести к неравному числу хромосом у полюсов

В анафазе I можно было наблюдать отставание 1-2 хромосом (рис 3-3), образование мостов, неравномерное распределение хромосом по полюсам (в результате чего образуются микроспоры с анеуплоидным числом хромосом), а также хромосомы, которые опережают общую массу хромосом Отклонения от нормального числа хромосом возникают за счет неправильного первого деления, что выявляется в метафазе П

В метафазе II мейоза хромосомы выстраиваются в мегафазную пластинку, в обеих частях микроспорошгга, как правило, одновременно, редко может наблюдаться асинхронность деления в пределах одной материнской клетки пыльцы в одной половине клетки хромосомы находятся на стадии метафазы II, а во второй анафазы П или телофазы II В анафазе II мейоза сестринские хроматиды расходятся к полюсам На этой стадии могут наблюдаться такие нарушения как отставание хромосом и возникновение мостов На заключительном этапе мейоза образуются тетрады микроспор

3. Разработка методов получения гаплоидных, трнплоидных и тет-раплоидных форм томата 3.1. Получение гаплоидных форм томата

В результате опылений кастрированных цветков культурного томата пыльцой диких видов (L hirvutum Humb et Bonpl, I.. ретимстит Mill ), баклажана и паслена образовывались либо бессемянные плоды, либо плоды с недоразвитыми семенами, которые в дальнейшем не проростали При опылении облученной пыльцой завязалось 2 плода при дозах 5 и 6 кР, содержащие 14 семян, из них 11 оказались недоразвитыми и не всхожими, 3 нормальных семени дали диплоидные проростки Недоразвитые семена высаживали на питательные среды, где развития семян также не наблюдалось

Нами были предприняты попытки выделить гаплоидые проростки среди близнецов Из 12110 проростков растений томата сорта Микадо было выделено нами 24 пары близнецов, которые оказались диплоидами Культура пыльников томата Существует мнение, что формирование структур каллуса и эм-бриоидов, происходит при аномальном развитии микроспоры (Батыгина, 1987), что в свою очередь можно вызвать различными типами предобработок В нашем опыте использовалась обработка бутонов пониженными

положительными температурами. Считается, что холодовая предобработка уменьшает гибель микроспор, замедляет их нормальное развитие, вызывает изменение оси деления в микроспоре, что приводит в дальнейшем к формированию репродуктивного каллуса (Шамина, 1981).

Процент каллусогенеза в зависимости от продолжительности обработки пониженными положительными температурами представлен в таблице 8.

Таблица 8.

Влияние обработки пониженными положительными температурами _(+4° С) на каллусогенез в культуре пыльников томата._

Продолжи- Число высаженных Число полученных Уо каллусогенеза

тельность пыльников, шт. каллусов, шт.

обработки 2000 2001 2000 2001 2000 2001

Контроль 169 2618 22 258 13,0 9,85

1 день 877 1184 67 46 7,6 3,8

2 дня - 583 - 35 - 6,0

3 дня 185 1311 19 62 10,2 4,7

5 дней - 430 - 17 - 3,9

6 дней - 76 - * 5 - 6,5

7 дней 147 54 27 5 18,36 9,3

8 дней - 63 - 6 - 9,5

9 дней - 53 - - - 0

15 дней - 17 - - - 0

Высокий процент каллусогенеза наблюдался при обработке продолжительностью в 7-8 дней 18,36% (2000 г.) и 9,3-9,5% (2001), а также у контроля (пыльники не подвергали обработке пониженными положительными температурами) 13% (2000) и 9,85% (2001). Повышение длительности обработки увеличивает гибель пыльников, этим и обусловлено небольшое число высаженных пыльников, после длительных стрессов. В дальнейшем регенерация была получена только на каллусах, образовавшихся на пыльниках, которые подвергались обработке пониженными положительными температурами, т.е. обработка стимулирует образование морфогенных каллусов.

В зависимости от генотипа частота появления каллусов варьировала. На каллусах диких видов томата и на единичных каллусах других вариантов наблюдался при длительном культивировании ризогенез.

Питательная среда играла важную роль в индукции андрогенеза (табл. 9). Наиболее эффективной оказалась среда МС с добавлением 2 мг/л кинетина и 1 мг/л НУК.

Таблица 9

Влияние питательной среды на каллусогенез в культуре пыльников то__мата (2001г)_

Среда Заложено пыльников, пгг Образование каллусов

шт %

1* 2938 114 3,88

*> 1400 75 5,36

3 1 3310 235 7,10

*1) МС с 2% сахарозой с добавлением 2 ИП I мг/л, ИУК 2 мг/л, 2) МС с 2% сахарозой, ИУК 0 5 мгУі зеатин О 25 мг/л, 3) МС с 2% сахарозой, килетин 2 мг/т, НУК 1 мг/л

Из всех вариантов регенерационных сред наиболее подходящей оказалась среда МС с 2% сахарозой с добавлением зеатина (2 мг/л), ИУК (0,2 мг/л) и гиббереллина (0,2 мг/л), только на этой среде были получены растения-регенеранты Частота регенерации варьировала в зависимости от генотипа (табл 10) Высокий процент регенерации от числа полученных каллусов наблюдался на сортах Рома, Микадо, Марглоб

Таблица 10

Регенерация из каллусов в культуре пыльников томата_

Вариант Число получен- Число полученных % регенерации

ных каллусов, растении- от получен-

шт регенерантов, шт ных каллусов

2000 2001 2000 2001 2000 2001

Микадо 26 24 1 7 38 29 2

Марглоб 12 24 2 3 25.0 12,5

Рома - 27 - 9 - 33,3

Мо 500 } - 12 - 5 - 4,2

Л-349 1 - 26 - 1 - 3,8

Марглоб х Мо 628! 32 - 1 - 3,1

Марглоб ч Мо 5001 19 - 4 - 2,1

Растения-регенеранты были размножены в культуре и высажены в почву Взрослые растения по фенотипу не отличались от исходных диплоидных форм У растений была определена плоидность методом подсчета числа хлоропластов в ЗКУ В качестве контроля были взяты диплоидные растения соответствующих генотипов По данным этого анализа все полученные растения имеют диплоидный набор хромосом Проведенный в дальнейшем подсчет числа хромосом подтвердил их диплоидный уровень Возможно, образовавшиеся гаплоидные растения-регенеранты, из-за низкой жизнеспособности, обусловленной одной дозой генов по сравнению с диплоидами, спонтанно возникающими в результате полиплоидизации, или развивающимися из диплоидных клеток, окружающих микроспору, были утеряны в процессе культивирования

3.2. Получение триплоидных форм томата

В течение двух лет (2000 - 2001 гг) нами проводилась гибридизация диплоидных и тетраплоидных родительских форм мутантной линии Мо 940 (4n - La 0793) и дикого вида L. pimpinellifotiwn Mill. (4n - La 2335). Плоды были получены только в комбинации, где в качестве материнской формы был тетраплоид. Очевидно, это связано с низкой фер-тильностью пыльцы у тетраплоидных растений 64,6 % (Мо 940), 66,0% (L. pimpinellifotium Mill.); у диплоидов 94,7% и 95,8% соответственно, а также с непроростаемостью диплоидных пыльцевых зёрен отцовского родителя в тканях пестика, которые также диплоидные. Процент завязавшихся плодов в комбинации 4n х 2п невысокий (в пределах 15%).

Из полученных плодов извлекали недоразвитые семена и высаживали на питательные среды. Выделенные из плодов семена имели размер около 2 мм. Через неделю после посадки наблюдалось увеличение и потемнение триплоидных семян. На среде, содержащей синтетические регуляторы роста и кокосовое молоко через 29 - 46 дней некоторые (наиболее крупные) семяпочки увеличивались в размерах в 2-3 раза, приобретали светло-зеленый оттенок, на внешних покровах отмечалось образование быстро деградирующего водянистого каллуса; дальнейшего развития не происходило. Повышенная активность отдельных семян, очевидно, связана с нахождением их в более поздней, по сравнению с остальными, стадией эмбриогенеза.

Цитологический анализ показал некоторую неоднородность степени развития семяпочек - в варианте с мутантной линией Мо 940 большинство из них находилось в стадии ранней или поздней глобулы и лишь единичные экземпляры достигали стадии раннего сердечка. У дикого вида это соотношение было иным, приблизительно 3:1. Наблюдаемая вариация развития в пределах плода вызвана, очевидно, индивидуальными особенностями оплодотворения и развития каждой семяпочки. Замедленный эмбриогенез у Мо 940 вызван, очевидно, общей тенденцией снижения активности всех физиологических процессов в связи с наличием большого количества мутаций у растений данного генотипа.

Чтобы выяснить, чем вызвано ингибирование развития триплоидных семян, необходимо рассмотреть процесс формирования нормальных диплоидных семян: питательные вещества передаются через эндотелий в эндосперм, затем в зародыш. В случае с триплоидными зародышами, на первом этапе формирования семени нарушается связь эндотелия с эндоспермом, который имеет несбалансированный геномный набор, в результате чего лишен возможности нормально функционировать. Преимущество развития получает эндотелий. Аномально разрастаясь, он накапливает в себе все питательные вещества, не пропуская их по це-

почке далее Эндосперм постепенно дегенерирует, что, в свою очередь, приводит к гибели функционально связанного с ним зародыша

3.3. Получение тетраплоидных растений томата методом колхнцинирования

В работе были использованы два способа колхнцинирования обработка воздушно-сухих семян (концентрация колхицина 1,6%, экспозиция 24 часа) и обработка точек роста в фазе 3-5 настоящих листьев (концентрации колхицина 0,4% (6 дней), 0,5% (5 дней), 0,6% (4 дня))

После обработки колхицином воздушно-сухих семян, наблюдалось снижение всхожести колхииинированных семян По комплексу морфологических признаков (медленный рост, увеличение ширины семядольных листьев, утолщение подсемядольного колена, появление деформированных листьев) были отобраны Co-растения для дальнейшей работы Они были подвергнуты устьичному и пыльцевому анализам, в результате были отобраны Co-растения, которые характеризовались увеличением размеров замыкающих клеток устьиц, повышением числа хло-ропластов в них, укрупнением пыльцевых зерен, пониженной фертилъ-ностью по сравнению с соответствующим контролем

Необходимо отметить, что цветение контроля наблюдалось в среднем на 10 - 14 дней раньше, чем Co-томатов Большинство выделенных Co-растений отличалось пониженной завязываемосгью плодов

Семена с отобранных Co-растений по косвенным методам диагностики, были высеяны для анализа Ci-поколения, которые также были подвергнуты анализу при помощи косвенных методов диагностики На заключительном этапе был проведен подсчет числа хромосом и было выделено несколько тетраплоидных растений дикого вида L cheesmanu Mill и культурного томата на устойчивой форме JI349

После обработки точек роста томата колхицином мы наблюдали следующие морфологические изменения из точек роста появлялись побеги с бугристыми, раздвоенными, кожистыми, темно-зелеными листьями, рост побегов был замедлен Растения также были подвергнуты отбору на начальном этапе по морфологическим признакам, затем устьичному и пыльцевому анализам На заключительном этапе проводился подсчет числа хромосом у отобранных растений В результате было отобрано одно тетраплоидное растение устойчивой формы Л 349 (концентрация колхицина 0,4%), что составило примерно 1% выхода тетраплоидных растений от числа всех обработанных растений данного генотипа

выводы

1.Установлены достоверные различия между гаплоидами и дип-лоидами томата сорта Микадо по большинству количественных признаков вегетативной и генеративной сфер растений. В то же время имеется и большое фенотипическое сходство гаплоида и диплоида по качественным признакам. Следовательно для реализации качественных признаков, по видимому, достаточно одинарного набора хромосом^

2.По числу хлоропластов в замыкающих клетках устьиц, размерам ЗКУ, количеству и диаметру пыльцевых зерен и др. количественным признакам гаплоиды значительно уступают диплоидам. Степень уменьшения варьирует в зависимости от признака (в среднем на 30%).

3.Тетраплоидные формы дикого вида L pimpinellifolium Mill. (La 2335) и культурного вида на мутантной линии Мо 940 (La 0793) отличаются от аналогичных диплоидных форм увеличением размеров листьев, цветков, удлинением вегетационного периода, увеличением числа хлоропластов в замыкающих клетках устьиц, размеров ЗКУ, диаметра пыльцы, содержания хлорофилла в листьях и уменьшением фертильно-сти пыльцы.

4. Анализ мейоза у гаплоидов томата выявил значительные аномалии этого процесса, которые явились причиной высокой стерильности пыльцы и ее разнокачественности. Обнаруженные особенности мейоза у гаплоидов (синапсис негомологов, отсутствие у ряда микроспороцигов редукционного деления, неравномерное распределение хромосом и хро-матид и др.) позволяют объяснить наличие фертильной пыльцы, завязывание семян при самоопылении, и высказать предположение о возможности использования гаплоидов в качестве индуктора доступной отбору генотипической изменчивости.

5.Мейоз тетраплоидов характеризуется также различными нарушениями. Наличие 4-х гомологов вызывает образование разных ассоциаций (бивалентов, квадривалентов, тривалентов и унивалентов). Их разделение в I и расхождение хроматид во П делении приводит к образованию анеуплоидных гамет и снижению фертильности пыльцы, что в конечном итоге приводит к снижению завязываемости плодов и общей продуктивности тетраплоидных растений томата по сравнению с диплоидными.

бЛолучение гаплоидных растений томата путем опыления кастрированных цветков диплоидов облученной пыльцой, пыльцой диких видов томата, баклажана и паслена, а также с помощью отбора среди близнецовых растений оказалось неэффективным.

7.Выделены генотипы томата с высокой способностью к андрогенезу in vitro, это сорта Микадо, Марглоб, Рома. Предварительная обра-

ботка бутонов пониженными положительными температурами стимулирует образование морфогенных каллусов в культуре пыльников томата

8 При скрещивании диплоидов и тетраплоидов томата завязывае-мость плодов (в пределах 15%) наблюдается только, если в качестве материнской линии используется теггр агата ид Но и в этом случае образуются нежизнеспособные семена Причиной абортивности семян являются нарушения в развитии эндосперма, который имеет несбалансированный геномный набор Культура зародышей неэффективна из-за остановки в развитии триплоидных эмбрионов на ранних стадиях эмбриогенеза (глобулы и раннего сердечка)

9 Перевод на тетраплоидный уровень растений томата сопровождается появлением ряда отличительных морфологических признаков, таких как появление гофрированных и скрученных листьев, утолщение и искривление главного стебля и пасынков, укрупнение цветков, снижение количества плодов на растении и цитологических признаков увеличение числа хлоропластов в замыкающих клетках устьиц, снижение фертиль-ности пыльцы и увеличение ее средних размеров

РЕКОМЕНДАЦИИ

1 Показатель «число хлоропластов в замыкающих клетках устьиц» четко отражает уровень плотности, и может быть использован для идентификации тетраплоидов и гаплоидов томата на ранних этапах онтогенеза

2 Применение косвенных методов отбора (отбор по морфологическим признакам, устьичный и пыльцевой анализы) на ранних этапах выявления растений томата с измененным уровнем плоидности позволяет значительно сократить объемы исследовательской работы

3 Для получения андрогенных гаплоидов томата in vitro рекомендуется подвергать пыльники (в бутонах) предварительной обработке пониженными положительными температурами (+4°С) в течение 7-8 суток, применять на стадии индукции - среду МС с добавлением кине-тина (I мг/л) и ПУК (2 мг/л), на стадии регенерации растений - МС с добавлением зеатина (2 мг/л), ИУК (0,2 мг/л) и гиббереллина (0,2 мг/л)

4 Выделенные нами генотипы томата с высокой способностью к андрогенезу m vitro (сорта Микадо, Марглоб, Рома) предлагается использовать в селекционном процессе для получения гаплоидных растений в культуре пыльников

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Кучковская Е.В., Шелаболина Е.Ю., Бадаева А.Э., Лукина Л.В. Цитологическое изучение гаплоидных растений / Сборник студенческих научных работ, М.: Издательство МСХА, 1999.- Вып. 4,- С.3-6.

2. Иванова C.B., Кучковская Е.В. Биологические особенности гаплоидных растений томата, // Известия ТСХА, 1999. - Вып. 3. - С.58-71.

3. Иванова C.B., Долгодворова Л.И., Карлов Г.И., Кучковская Е.В. Морфометрическая и цитогенетическая характеристика гаплоидов томата, // Генетика, 2000. - Т.Зб, №1. - С. 52-61.

4. Кучковская Е.В. Характеристика вегетативной и генеративной сфер гаплоидных, тетраплоидных и диплоидных растений томата. // Селекция и семеноводство овощных культур в XXI веке / Международная научно-практическая конференция, М., 2000,- Т. 1,- С.301-303.

5. Иванова" C.B., Кучковская Е.В. Сравнительное изучение вегетативной и генеративной сфер гаплоидных, тетраплоидных и диплоидных растений томата / В сб. Доклады ТСХА, М., 2000,- Вып. 272.- С.3-8.

6. Кучковская Е.В., Молканова О.И. Получение гаплоидных растений томата в культуре пыльников / В сб. Тезисы докладов II Регуляторы роста и развития растений в биотехнологии (26-28 июня 2001 года). Шестая международная конференция, М.: Издательство МСХА, 2001.-С. 172-173.

7. Кучковская Е.В., Молканова О.И., Бакеева О.В. Проблема получения гаплоидных растений у томата в культуре пыльников / Материалы научной генетической конференции (26-27 февраля 2002 года), М.: Издательство МСХА, 2002. - С. 198-200.

Уел иеч л 1,16

Зак S38

Гир 100 эю

ДНО «Издательство МСХА» 127550, Москва, ут Тимирязевская, 44