Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Использование пыльцы для генетической трансформации хлопчатника

ВАК РФ 03.00.26, Молекулярная генетика

Автореферат диссертации по теме "Использование пыльцы для генетической трансформации хлопчатника"

АКАДЕМИЯ НАУК РЕСПУБЛИКИ УЗБЕКИСТАН ИНСТИТУТ ГЕНЕТИКИ И ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ БИОЛОГИИ - РАСТЕНИЙ АН РУз

РГ6 од

/ 6 ИЮЛ 1998 На пРавах рукописи

УДК: 633.51:581.331:579.254.2

ИМАМХОДЖАЕВА Азадахан Сабировна

ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ПЫЛЬЦЫ ДЛЯ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ТРАНСФОРМАЦИИ ХЛОПЧАТНИКА

(03.00.26— молекулярная генетика)

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Ташкент — 1998 г.

Работа выполнена в лаборатории молекулярной генетики хлопчатника Института Экспериментальной Биологии растений НПО «Биолог» АН РУз.

Научный руководитель:

Заслуженный деятель пауки, чл.-корр. АН РУз, д.б.н.,

профессор ИБРАГИМОВ А. П,

Официальные оппоненты:

Доктор биологических наук МУХАМЕДОВ Р. С.

Кандидат биологических наук КАДЫРОВА Д. А.

Ведущая организация:

Институт микробиологии АН РУз.

Защита диссертации состоится « »__

1998 г. в _ часов на заседании Специализированного

совета Д 015.80.01 по присуждению ученой степени доктора биологических наук в Институте Генетики и Экспериментальной Биологии растений АН РУз (702151, Ташкентская область, Кибрайский р-н, п/о Юкори-Юз). Fax: 64-22-30.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИГиЭБР АН РУз.

Автореферат разослан «_»___ 1998 года.

Ученый секретарь Специализированного совета, доктор биологических наук

ЮНУСХАНОВ Ш. Ю.

- о -

ощля ХЛУМГГЕРИСТКГСЛ г.шяи

• Литуальненгл» работы. Успешное развитие молекулярной биологии, разработка технологий получекия рейомбгнантных молекул ДКЙ, согдание целого арсенала методов генетической ккжеяерии растений открыли широкие ногмодноси; как для прикладных, так и для фундаментальных исследований растений. .

На сегодняшний день научные.работы продсллаюгся в направлении поиска и подбора новых, более эффективных способов получения траисгешшх рьстеякй из хогяйственяо-ценных культур, в том числе и хлопчатника.

Активность использования Методов генной инженерии ограничивается небольшим количеством хорошо отработанных систем'трансформации к векторов, • несущих индивидуальные пслеавке гены. Дал большинства сельскохозяйственных культур, вкллчал хлопчатник, процессы взаимодействия между растительным геномом к иятегрпруха:г.2.п'.сн чужеродными генами еще недостаточно изучены.

Пыльца стала Привлекать юе - большее' внимание исследователей в салгя с проблемой трансформации растений. В структурно! отного-яии пыльцу мовдо рзсскзтрпвать как изолированную клеточку:«? систему. Знание структуры и функции пыдыда - есть одно из нэсСхоцимил условий эффективной работы .по создания новкх форм цуддеуржяс растений.

. Цель и задачи исследований. Целью настоящей работы Сило игу--чение молек^лярио-биологических-свойств пыльцы хлопчатника и ис- . пользование ее для гранспортировки 'чужеродной ДНК в растенпл-р-э-.ципкента. В сваей с этим были, поставлены еледуяяяэ задач;::

1) подобрать /шд»о?ю питательную среду цял проргмяшя а стабилизации пыльцы, хдопчатвииз, инкубировать ее с плзгмлдой, предназначенной для трансформации;

¡2) клонировать рекэкбинантяух» плаэмиду', испольгуецу» для эксперимента;

3) проанализировать спектр белков и нуклеиновые кислоты пыль-1;ы хлопчатника;

4) провести эксперимент по травсфсршадвг хлопчатнака и аи-. лиа интеграцию плаи.гнда.

Научизл новшиа и нрзютгавенйя аиа'ий^ос!» раСотн. В работе подобрана искусственная питательная среда, предназначенная для стабилизация и прорастет?* оизьцы хлопчатника. Впервые' наследованы фивкко-химичоскиэ характеристики нуклеиновых кислот и рассмотрен

спектр тотальных белков пыльцы тетрашюадньх видов G.hlrsutum L. и G.barbadense L. до и после трансформации. Пыльца использована в качестве переносчика экзогенной ДНК. Хлопчатник трансформировали • вперим согнанной ка базе митохондриалъной плазмиды хлопчатника pG:fe2 рекомбинантной плаэмвдой с индивидуальным генсм инсоктоток-сина и устойчивости к канамицину.

АпрсСпфга ра&оты. Результаты работы были представлены на VII Всесоюзном симпозиуме "Молекулярное механизмы генетических процессов" (Москва, 18SQ); на 1-м съезде Физиологов растений Узбекистана (-Таз:-»пг,1931)! на 2-й и 3-й конференция биохимиков Уэбекис-тана (Ташкент,1933, 139Ö); на korï^p-ihium! "Узбекиетон Республика-, скшшг Даэлат тми хаквдати конунининг 5 мил иг ига багшланган ёи олкмдаршшг Сиринчи клмий аклумани (Ташкент, 1S94); на 1 Международной кси$ередацш микробиологов (Ташкент,. 19S7).

Публжгщии. Ссновные материалы по теме диссертации ояублико-. валы в 12-тк работах. • . .

Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из следующих разделов: взадеш», обгор .мхгратуры," материалы и методы, результаты и их оСсуядеш», выводы и список литературы. Работа изложена на ЮО страницах, иллжстрироьана Ю рисунками и 4 таблицами. Список использованной литературы насчитывает 156источ-ника, э том числе 100 на иностранных языках.

МАТЕРИАЛЫ ц ШЛОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 'Эксперименты были проведены на тетраплокдных видах хлопчатника G.hlrsútun) L. (сорт 1G8-C) и G.barbadense L. (сорт С-6037).

Изучение физико-химических свойств нуклеиновых кислот пьшьцы хлопчатника проводили по методу, списанному в работе Юсупова Т. н Т.ззратова П. (1982, 1990).

Обработку ДНК рестрикцяошшми нуклеаззми, электрофорез в ага-роэном геле, актирование, печение ДШ, молекулярную гибрвднзацк» проводили по стандартным методикам (Manlatls et al., 1982).

Электрофорез тотальных белков пыльцы проводили в 10 Х-ной по-лизкриламидном геле е'додецилсулъфатси натрия (ДСН) по метода Laemmll {1973).

Пыльцу выращивали на среде, ' содержащей 15?. пияютиленгдиколь (ПЭГ) 6000,' Z0X сахарозы, 0,2 M CaCL,, Б Ш KCl, Birtí Ca(KD3\, ■ 1,5 triM RjEDj, 0,021 цитохром С, pH-5, ï.

На ршща пестиков раетений-реци.шентов наносили суспензию -

- п -

пыльца/плазмида. Для этого пильчу помещали в искусственную питательную среду для проращивания пыльцы и туда ме добавляли плазмкду-до конечной концентрации 10 мкг/мл.

рзг.1УЛ,тл"п,1 и iK овсу?яплк 1. Использование пыльцы в генетической трапсфор.чащш хлопчатника.

Пыльца является удобным оОтокхои для генетической трансформации с последующей передачей яйцеклетке трансформационного материала. В данной работе предложено рассмотреть возможность привлечения пыльцы-хлопчатника для трансформации и получения траксген-ного поколения растений используя естественный способ-спиле-ния-оплодотворения для доставки- экзогенной ДКК.

Для выполнения этого эксперимента необходимо было рзкить такие задачи, как:. 1) подобрать состав среды для" гопг/бэцгл пыяью* хлопчатника; 2) создать' условия, взкнщзаа/.е' экеогеяяу» ДНХ (плазмкду) от деградации; 3) лаоаирсь-*?» споцпальлу« плзгмиду с мэркерякми генами, которая функционировала бы в клетках здопчахнкка

. . 1.1. Подбор условий для сохранения катявиости пыльцы .

Пильцэвое верно, как известно, имеет плотные оболочки сложного строения. Проникновение экгсгелной ДНК через, них в вегетативную клетку маловероятно. Однако, при проросганнл пыльцы образуется пыльцевая трубка, стенки которой гаеат сетчат'о-фйбркллраое строение (ПоддуСная-Аряольдп, 1976),.поеволяввде экзогенной ДНХ проникать в клетку пыльцевого верна, •

Для' того, чтобы обеспечить прмвя«шьо1«;з 75HR в шльцевда аэрна, необходимо создать условия для проростзнпя' пальцы In vitro Как правило, искуссгвэнные питательные среды содержали соли К, Са, Ыг. Обязательным компонентом таких рьствороэ был Сор, доставляемый в виде борной кослсги, п сахароза. Определенное значение имеет кислотность (рН). В процессе эксперимента было определено среднее значение величины рН гоногенат'а пыльцы исследуемых видов . Она оказалась равной 5,6, При этом, существенных различий 'по данному показателю у. изученных' аа,\га видов' хлопчатника не обнаружено. В 'дальнейшее.' исследованиях для. поддержания нативности пыльцы использовались буферные раствори, J2,;?Euyie рК-5,6.

Неыаижаинсв виачение имеет установление внутреннего и внешнего осмотического равновесия медду ссдерхимым пыльцы и давлением среди, в которую попадает пыльца. При несоответствии давления из шиацегьх зорен карулу происходит Еьброс цитоплазмы.

ÍUu: создания осмотического равновесия,, как правило, используют сахарозу. Сахарога такле является необходимым компонентом среди для роста пыльцевых трубок. 15Í сахарозы в среде достаточно, при 20Х-х навоэдаля высокий вффект сроростатиа пыльцевых зерен. При атом, эффективность наблюдалась если в среду для проростанга. доб&влялк ец» к ПЭГ 6000. Об сочетания Сахаровы'и ПЗГ в

искусственных средах для роста иьшцы отмечено в работах ряда аа-торов (Zhan H.e-t.al.,lS82; Subblan С., 1993).

Таблица.1.

Компонентный состав среди для трансформации пыльцы хлопчатника

1-Г !К? i Состав среды !

1 rtrr L

ПЗГ Сахарова CaCL, KC1 Ca(N03)2 H3BO3 цитохром Сj

X X irM KiM KM irU X 1

1 1 1 5 5 70 0,5 0,5 0,5 I

! 2 1 10 10 140 г,б 2,5 1,0 .. ¡

1 з | 16 15 ECO 5,0 5,0 1,6 |

1 4 | 15 го ZOO 5,0 5,0 1,5 0,01 |

i s | i, . i 15 го гоо 5,0 5,0 1.5 0,02 | 1

£ля процесса проростания пыльцевых трубок необходимы соли Са (в состав среды включены Са(И03)2и СаС1г.) .

. Макроскопические наблюдения покагали, что пыльцевые зерна хлопчатника в среде/1-2 через некоторое время (1-10 минут) начинали менять свои структуру. Вокруг кга образовывались клеточные выступы, выбросы содерхимого и деформация пыльцевых трубок (рис. 1).-При нанесении таких суспензий на рыльца растений-реципиентов не было получено ни одного пладозлемента. в вариантах, гдэ 'пыльца вид;р;*знз в растворах .{Л 4-5 наблюдали рост пыльцевых трубок (из одной пори начинается выпп:-злаанке вегетативной клетки) (рис.2). Эти явления ш привязываем в разному содержанки ПЭГ и

Сахаровы в средах. С увеличением их концентрации наблюдал;: стабн-шгзтш состоялся пыхы%?кх ?ереп и иоследукккй рост яь!гьц5Е1« трубок. Нэа*сеш:ем на рыг.ьца посткксв этих ::.!е-сой получили 38,8 и 42,5 " гаья >ывз' ысстк агя a.hlrsu'.u-n L. и 61,5 а 63.Г-3 г - для G. barfcad«R5<? и. F-at тааззлоса з назем эксперименте, нгпЗолее устойчивым к такому iп',"У оплодотворения слагался вид Р.МгЬ.ыМп-?.» L.

- г ■ '••...'

Рио.1. Поведение пильцеЕого зорна яри попадании з ср-?ДУ для яро-раздевания пкльцц №1-3. Цитоплазма вегетативной выбрасыва-

ется в среду.

V

•¿у*• ..... .. .ал.У' ' ..

V'

, 3 -

"■'й-

Рис.2. Состояние пильцч'вого герва в среде длн прсрэщтаиип j£4-5.

- е. -

7алим образок, были подобраны условия для стабилизации ю-цеаых геосН в жилкой питательной среду и для . начального этапа проросхалгя пыльцевых трубок. Однысо, при добавлении t среду с пыльцой п.'.9Ук;:дной да была выявлена деградация последней. В свя-t-í! о схйм. олс-'Диэзло такие подобрать услойт, вря которых была бы обеспечена натквяоеть вносимой в раствор ДИК.

1.2. Исследование нуклеаэной активности шш>цы хлопчатника.

Ъаола* ьерочтло, что неудача яекоюрых ранее проведенных, отлов !¡í» введен;^ экзогенной ¿¡Я ь рашеккА связана с нэдо'оцен-кой тачого ¿!'.vK''.üpa, как нэдкчи*' иу&одьаой акгквностя пыльцы. Слздоватс-лько, у.ес^/.од-.мо педосдоь .усливая, при которых' происходило бы »«.-бирс-гаа:;- ц/кздде хлояч-шиа»..

гу^еизная активность п^лщы Сила выявлена в каедом типе среды, представленной а таблице 1.

Как известно v» лахератуяык данных, при введении в растение или в растительные ткани экзогенной ДНК, последняя испытывает на себе активное действие растигельвьх кукд^аз. Экспериментально определено, что наибольшей нуклеаэной активностью среди растительных клеток обладает пыльца (Кочнова К., 1&34).

В ншем Експерк^ьвте длл кнгпбироьанкя нуклеаз пыльцы ш использовали »шэксмолекулярный полипептвд цитохром С.' Данный белек икроко изпользувт электронной микроскопии при фотографировании ДКК. Цихохром С, образуя комплекс с нуклеиновыми кислотами, способен блокировать атаку ДКВьа и, одновременно с.этим« обеспечить свягъ между фотопл&нкой и ДНК (выполняя функцию посредника). Эти свойства - ингибирование и повышенное сродство ДНК с мембранами мы рекиля использовать для обеспечения ейлулы плагмидпой ДНК от нуклеаз пыльцы и проникновение плаэмады в пыльцевую трубку. При этом, время инкубации было не более 30 минут. Таким образом, в состав среды для прорагдевани пыльцевых верен был включен цнтох-ром С для аая'гты пдззмпдной ДНЯ от ферментов пыльцы, обладающих нукдеазной активность».

1.3. Конструкция плаэмнды, использованной для трансформации хлопчатки. са

В экспериментах.по трансформации хлолчатникз метолом прямого переноса (микротгьекцкей), выполнены* ранее в как:': лаборатории, (Измзруэкев A.A., 1992) Сила использована кйрвдная шгагмида pCaVItoxneo, любезно предсстаэлэн-дя профессором Еекякиньм (институт Сельскохозяйственной Биотехнологии FACXH). Эта плаэмида ео-дердит гибридный гея двухдоменкого белка, tí- концевая часть которого представляет собой шсгсвяую часть у-эндотоксина 3. thur.'.nííen-з1з var.kurstakl HD-1, а Оконцевая часть ферментатизко активную канамщннфосфотранс1$ерагу. Эта гибридная конструкция нзходлг-ся г.сд контролем 193 промотора ЕЭДХ. Однако, использование данного интегративного вектора ограничивалось недостаточной стабильностью ее в геноме хлопчатника, Для репс-ния этой проблем ¡¿а решили дополнить состав вышеупомянутой ллазмиды фрагментом ■растительной ¿HK, благодаря которой гибридная плаамида могла бы автономно существовать в клетках растения. Такая плззмндз была обнаружена, выделена из митохондрий хлопчатника, обозначена как pGKm2 и охарактеризована "струдниками нагей лаборатории (Юсупов Т.,1934; Артыкова P.M., 1994). Авторами был сделан выеод о,способности плазмнцы интегрироваться в хлопковые хромосом и автономно реялй-' цироваться в цитоплазме. Нами сделано предположение, что при совмещении данных двух конструкцт!, гибридная плагмида приобретет свойства автономности и интегратквности от рйНм2, при это!.! reinj •от г.лавкиды pCaVItoxneo не утратят своей функциональности. Для получения гибридной плазмида мкникольцевзя митохондризльыая рЗНтй была обработана рестдикционным ферментом, подобранным нз . основе физической карты (по данным авторов, мнтохондркальная плаамвда имеет уникальный 'сайт рестрикции Sal Gl, не затрагивавший ее функциональной активности). У полученной линейной последовательности достраивали, концы и дотировали с иктзгратинной векторной плазмидой pCaVItoxneo, рестрнцированной.по Hlnd III сайту.

Чтобы удостовериться в функциональной активности полученной конструкции была осуществлена трансформация бесплазмндного штамма ¿.coll f!B 101 плазмидой pGHir&toxneo. Отбор трансформированных ка. доний производили на селективной среде, ■ содержащей глнамицин.

'1.4. Изучение спектра белков и нуклеиновых кислот , пыльцы хлопчатника.

. Для получения более полной информации о пыльце, нами Сила

I; л-тйьлеьа Тфсллухочйзз гадачз: исследовать Оолки и нукдеиновиа IДля ь:ого Сил проведен злвк'гр&^орехкчеоккй анализ о».бе.глиа пальцы хлопчатника В МгсиШт Ь (103-0) и и (С-С05?). 'Картина распределении белков пыльцы .в :..- геле (ПЛАТ) нри денатурирующих условиях представ-

на р;^. 3.

... 1 .. 2. .........5 ч

'г. ¿О

-ША1 ЛИ »¿¿.

П г?

пп

» > 4- ! К

Ркс. у. г^зетроЗореграла-к* то гадь них ъ пыльцы хлопчатника.. 1 - кзркерные Села:; 2 - п.ГЛгзи1»ай I.. (сор? Юэ-г); ? - б.ЬагЬаЗагйЮ Ь. (С-СОЭГ); 4 - В.и-ПсДит ЗКОУ. 5 - 6;Мгзд'.ип (Краснолаотнал Акала); б - БЛЬотЬегЬ

Сопсстав^еякем сшкгроэ распределения белков к ¡дым хловчат-н;иа тетр^плокдных видов б.Мгзьшп I. (ЮЗ-Ф) и Б.ЬагЬасЗепзе Ь. (С-ЮЗ?) выявили отличил вь к*к-з?ор.'.м ¿г&чциэл. Так, например, кьдоа&пздш с мскк/лярксй иьсрок 35,5; 33,8'. 31,0 кД, разсчатаа-}га по Сел««:, п-.-гко выралрш у 0.Ь1гзиик> Ь. (10&-Ф) и

нэ проав::.н:оь в спектре распределения тотальных белков пыльцы П.ЬагЬзгЗепзг Ь (С-6057). Далее, белковые фракции с мол. массой 24,4 и 20,5 кД хотя и слабо, но иролршаенны в спектре распределение В.МгзиШ» 1.. (103-0) и не проявились у 0, ЬагЬзЛепзв Ь. (С-603?). Довольно много высоко- и среднемолекулярных белковых ^рггиеигоь характерно для обоих видов. Это белки верхней части спешра. У всех представленных на данной фотографии , видов четко кивляотся белковый блок на уровне 44 - 56 кД. Имеюздзяся над та-

- п - .

кнм блоком тонкая полоска vavmtn у (J.* arbadense L. (0-0D3?/,. она н» огделчдлсь у U.r.lraytu-* L. (10Э-Ф). Гагстатгешд иод. м t\-еа этой ^ракцпл рэгяч Eü,ö кД, Есчь в этих сл.'ктрзх no-uasínrai у %.?агх видов, iin ютнсиииее у сдш:о иа них. Ts«, na:n:n:;vp. c-is-совий Kcw:i(..:!i>:cf с !.-ол. -массой 22,0 кД наг-энсите* пр :крзе."лг;? У З.Ыгзиих-) I,. iWB-S) о срзангина с в.barbante L. (С-ГГЗ?). Наоборот ом» отметить о ф-рапмато о мол. массой 23,0 кЛ, чехиэ «•амётного у 9.tarb2«o-r.3* L. (C-S03V). В hwüjm раздело сяс-ктрн распределении Оенизих компонентов меньше и они не сталь х-;.рсио прокр&силтсь u-'-í!-: евздятальстео их «алого кодпчеста-экнсго содлр-д?-нил). однако и среди них saweiHa различил.

. Полпп^ггл'.дл с мол.массой 19,6 и 24,5 !'Д, хотя и слабо, но пг>о*рэ;г.еяые среди белков G.h'rsutura L. (1G3-0) , не'прс ¡лились у S.larfcadeRse L. (С-6037). Га.и:;.! обрагсм, раепредедиглиося а двинем геле тогадькко болкя выла да хдсячатяккз ке.тао разделить на .три груп:;;;: 1) белки, имаг снеся у 'обеих sярг:к?рко в равнее количэ'.-т} вплел oroTHcujjiHii; 2) í^aj-uüsj, }шеи:ч;гя»

у одного з.да л «•-•«•¿•а - у другого (т.е. рзг.дагжг:«-' ся только по количеотвзянеку ссд-грдаша?!, и 3) белки, сгдочезкыэ иекгоч.'ггольио у одного вида и отсутствующ» у другого (других). Длл на;; интересно было угнать, .насколько сильно один рнд ыаадт отличаться от другого по белкам, прмсутстярлда з пцяьц-вом эер-89. ЧГОбЫ ПРОЯСНИ'!!^ ДаМНЫЙ ?ОПРОС ИЗМИ peii>3IiO CUSO ?КЛОЧИТЬ ». ШШ1И балкон ккяылг такде. представителей другой геномной группа. (Д reHC.vH'iT - 7з. trilcfcu.ii, ß. thurterl) а такде ец* одного ярэдстз-витета ьзда'а.МгеиЬил I (длт ерззнигехйнего аа&лдаз). Сгвет кз данный вопрос уоро,:о виден на . Язртнна раеярз-

дехеикл. еукчзркых Csjcrofe. еилйчн представлен Д-геномной группой.-O.trllobu», вначител! не отличается ст ьи оахоапикх спектров, •как и «иекур рлсиредол^шм Оелнов пыльцы ох красволистной Малы-(в' сравнении с сортом 1G8-0). Здесь есть и общ!?, отхеченийэ • у ьсех четырех вэдоэ. гояипегткдн, »о есть и характерные только для одного вила,

Тани« с-0р?аом,!г.1 основании полученных результатов v« пркзшп к га!«вч-->я;ао с том, что ггшцевео зерно зз своем'состава г.:,:еет большое количество белков, псследугций анализ которых погаолят провести н.кетс-руи кгзелгфзгзшзд и, все* можно, вдектп^шеац.'аз среди них маркерных, харзлтзрящ только для данного вида белков, т.е.

при изучении белковых фракций пыльцы разных видов улопчатника выявлен генетический полиморфизм.

Для получения некоторых характеристик генома пыльцы бил проведан анализ количественного содержания их нуклеиновых кислот. .Из пыльць; анализируемых тетраплоидных видов были выделены ДНК и РНК и очиа-ны скоростным центрифугированием в градиенте • плотности хлсрпзюгс цезия. Данные обобщенно представлены в таблице Э. При цэнтрлфупгрованки.в градиента плотности CsCl ДНК пыльцы исследуемых видов распределялась одной полосой. На основании показателя плавучей плотности Сыло расчктано содержание ГЦ-пар. оснований.

Полученные нами данные хсрсао корродируют с данными ряда ав-' торов, проводивших аналогичные определения в вегетативных органах и субклеточных структурах различных видов хлопчатника (Ибрагимов A.D., 1536; Geever R.F.et al., 19Б9; Юсупов Т.,1994).

Таблица 3

Физико-химические характеристики нуклеиновых кислот пыльцы хлопчатника

1 ■■" ---------------■ - ■ ----------- (Характеристика нуклеи- ß.hlrsutuin L. 1 .............■ ! ß. barbacJenss L. i

новых кислот . 1 сорт 108-Ф сорт С-6037 |

1 .................. .......... | Содерланне ДНИ (мкг/мг сухого • |

(веса пыльцы) l,30i0,06 1,27*0,06 I

¡Содержанке РНК (мкг/мг сухого

|веса пыльцы) 10,1510,60 10,07*0,40 |

¡Плавучая плотность (г/сы3) •1,692 1,693 |

|Содержание Г+Ц пар оснований,

(расчитаняое на основе плаву-

чей плотности 1____________ . — . _„....... -I." 39,0 40,0 | 1 .....п., , )

2. Трансформация хлопчатника пыльцевой суспензией и анализ потомства растений-трансформантов

В данной работе предложен метод трансформации хлопчатника, который ке предусматривает применение .культквировайия ткани. Чтобы определить наилучше условия опыления с жидкими средами, мы испольэоэыщ разные объемы суспензии - от 1,0 мл до 10 мл .на 20

wt пыльцы. 60 мг пыльца используется d каядом опылении на 100 цветков-. Для выполнения эксперимента в питательную среду для про-ростания пыльцы (среда N 5), добзвляли плзэмидную ДНК до конечной концентрации 10 мкг/ккл и вместе с пыльцой инкубировали до 30 минут при 28 С, а затем наносили на рыльца пестиков растенж-реци-шмнтов. Концентрация чужеродной ДНН для разных культур подбирается индивидуально. Так, например, для трансформации ячменя аналогичным способом достаточно 0,05 мкг/мкл экзогенной ДНК (кзк геномной, так и плаамйдной ) (Ночнова Н., 1894). Тогда как для кукурузы необходимо не менее 50 мкг/м/. (Rceckel Р., 1938).

2.1. Анализ потомства растений трансформантов

За время эксперимента было обработало 1172 цветка из которых 400 цветков G.hlrsutum L. и 772 - G.barbadense L. В качестве контроля по БО цветков того и другого вида были обработаш суспензией пыльцы в растворе для лрорациванкя баз плазмиды.

В конце периода созревания было получено 106 коробочек от G.hlrsutun L. (108 ф) и 318 коробочек от G.barbadense L.(C-60S7). При этом коробочки у G.hlr-sutim были Солее выполнены (с числом семян fe пределах 15-20 штук), чем у G.barbadense (коробочки были меньпе размером с числом семян от 2 до 15 ет). Был проведен первичный тест полученных семян на среде с канамицином. В опытных вариантах из 1908 (D.hir3utum) и 2226 (G.barbadense) семян подучили 72 проростка (20 - от Q.hlrsutura и 52 - от коробочек G.barbadense) . Дальнейший анализ был проведен только на этих проростках. Данные по учету сформировавшихся семян и весу сырца опытных коробочек, семена которых ьыжили на канамацике, представлены в табл. 4.

Как видно из табличных данных, вес семян опытных коробочек, й количество семян в коробочках значительно отстает от веса семян и их количества в контрольных вариантах. Это произошло еа • .счет малого количества сформировавшихся семян. Наибольшее число семян в опытных коробочках равнялось 14,наименьшее - два семечка. Тогда как в контрольных коробочках у Q.hlr3utum L. в среднем сформировалось до 29 семян весом около 0,110 г, среднее число се.. мян в контрольных коробочках G.barbadense L. равно 25 г, и сред". ний вес одного семени - около D, 128 г. Средний вес одного семечка из опытной ¡{оробочки O.'íiírautijn L. равен 0,100 г. Семена были жизнеспособны, взошли и дали начало нормальным растениям.

Таблица 4

й(>личч:ч;"-кш;й г»и&т>р опнгннх и контрольных коробочек ■ разтений трздс^ормантсв. №7«)

г т — . } ..................т ' ' 1 ■..........-.-. 1

г ! !!ид | ■ Коя-иэ | Вес сырца Вес.семян| Средний |

! ! 1 и и | (гр) (гр) I ьес 1-го!

1 1 1 , . __________ ... __ ... 1 кг-ро'очке | семечка |

Г 1 г 11 Ы)\ £3 ! 4,90 1 3,20 | 0,110 |

[?. ¡а.Мгзш.и.'л ! го | 8.23. 2,00 | 0,100 |

14 ! 1,87 1.50 | 0,107 1

|4 Ьяг!:| " 7 1 1.85 0,75 | 0,107 |

¡5 {О.Ки-Ьлй?!,.** I В | 1,05 1,47 | 0,183 |

1*5. ',С>. сМ^Л-'д«:'!;'';» ' ! 3 I 0,53 0,40 | 0,133 |

IV |П.Ьэг1а,'"й*пг,е I 2 | 0,35 0,25- | 0,125 1

¡У К?. Ьэ:!. | 5 . I 0,4? 0,35 | 0,110 |

¡У 1ьД дН-л-к пзе 1 4 ! 0.05 0,40 ! 0,100 I

Ци|а.Ь.агм.1оазч | 3 1 0,54 0,37 | 0,123 |

IИ (И.ЬагЬайвгт 1 Б | 0,90 0,63 | 0,126 |

2 | 0,35 0,25 | 0,125 |

II ! 25 | 4,00 3,20 | | 0,129 | |

Примечание: (к) - контроль

В. опнтвых коробочках в.ЬагЬаОепвв Ь -сформировалось малое количество с?«Л!1, но при этом вес одного семени варьировал в пределах от 0,107 до 0,163 г. и эти семена тоже были жизнеспособны. 1олъко ое;.;енэ от растения В. ЬвгЬааегй» Ь под номером 9 (средний вес семян рмен 0,100 г) не рагвклиеь до • состояния нормального растеиия. Опытные семена были распределена между гель-эдвктрофо1 ревмы« анализом эаиасных бегков колучешш семян; и для высева с целъю нредал*епиа изменив наследования перенесенных гвров в пос-л?дусгаих яэкегежш. ■'

г. Яот-гн?рвдизациенный геот на трансформацию хлопчатника'

С целью одзитн&кекдак интеграции трансформированного гена был проведен дог-г>&рэди?&шюпшй анализ ДНК опытных семян. В ка-

честве эоэда Сила кспольаовала гибридная плагкида у я:!..:;,*.<■ содерлвщдя полную последовательность гена иис.гитг'к.киюп (}::••$. • Полученное результат«. интересны о точки <1|>~ыч ^(«¿п'.-ъ-шм подученных Обь-ян растении б.МгзиЫи I.. и I.. и ¡'¿.да-

чеетва гиоркдм&ьционяых сигналс'в. Вс-львде нс-личтогго ее; • )».;■( шихея и исюрешзкх коробочек нолучело от О. I ¡. 1-

Однчко, количество сеылн в корг.бочкня Силе- оч-,-,»ъ '¡ч г:..1 г«;

в эксперименте на растениях б.Мгй'иш. (.. »а,- ¡¡с.л.1 <!с ьи полненные коробо'иш.'

В результате дот-гиСрндиэашсоннлго анализа ьичлч-н;:. ч.ч> г.н! на 20-г и растений, . выры*:някх иа спыгаых седш. 3.гЛг?.-.-'.1№ и 12-ти вариантах давали полежи г.- ль иые Г1:Срид!;йс):;:;> н::^ г;: чьвы. Тогда как в случал с ОЛшгЬасЗепзд Ь. секнн И)- та к:;/:?"; '¿'¡и, выраженных на кздьмвдшсбой ерьд«) срс-ли 1ШК 4-1-х ;.•л-.«,• ко в 25-х вариантах получили гкбрвднггаг.ге и • .•'••.¡«сч.

Я.

г т-.

■О

Х-в,

Л

Рис.4(А). Ло-х гибридизация

Д!!К рас те ний- транефер:,-:а,мтой О.Мгз^ит с плаамвдой рйНгп2Рохпео. (к - контроль; о - опытные варианты)

1, Ь

Рис.4 (3). ЯЯК

растений-трэпс-ф''.р!/знг(>в г', г -(Зепзе о плдамидйй ¡^'Мг^Ьгыпео (к - контроль, о - слитные варианты)

Возможно, здесь кисло значеим» то, что в рркомбинчнтной плагчвде, исполъэовзнней нами для ?р«мсфор>ацт1 хлопчатника, нмелзсь последовательность на генома я. ш ездил I. (плашяднач да р'ЗЛчй).

2.4. Аиалиа белков семян растений-трапеформзнтов

Нам не иавесхйо »«лк«^ »убредшая Д!Ш(плаом)<дп) пра*

пикает в пильттю зерна, какова ее судьба внутри пыльцевого вер-

на, а также что происходит в тканях рыльца после этого события. Devfet (1685) считает, что ДНК поглощается верхушкой прорастающей трубки пыльцы, тогда как Heslop-Harrlson (197S) показал, что мак-' ромолекулы могут проникать через интину в течение "растекающейся фазы" при попадании пыльцы на рыльце, при набухании пыльцевого зерна. Допустив вариант попадания чужеродного генетического материала в яйцеклетку и синергиду, мы провели анализ белковых спектров контрольных и опытных семян РТ (рис.5).

■ ;, 2 3 * .......5 - Ё - —.....7 ..- •»

i .-—■ .. и. т "у ■"'»'« > [ .....

ЖлИ JtiUL£SJ

i

¿5 r.V !

JIA&Sl 6,4 KD .

...

Рис.Б. Электро-^ореграмма тотальных, белков семян (РТ0) растений трансформантов хлопчатника. 1- маркерные белки; 2- белки семян контрольного варианта З.Ьаг^эЬзе Ь; 3-7 -белки семян .опытных растений (З.ЬагЬа^еЬзо; 8- бедки семянопытных растеши В.МгзиЬш; 9- контрольный вариант С.МгзиЮТ Ь.

Визуальным анализом электрофореграммы белков семян контрольных и опытюк вариантов выявлено до 10-тн достаточно прокрашенных по-липептвдшх полос, среди которых имеются интенсивно окрашенные, средне- н слабо окрашенные фракции равномерно распределенные по всей длине дорожки. Кол:г)-:-стео прокрашенных белковых полос и в контрольных .и в опытных вариантах одинаково. Различия выявлены . только'в .интенсивности скрашиваема некоторых фракций' полипептидов, то есть в кол!!чественном соотношении этих белков.. В результате опыления хлопчатника трансформированной пыльцой в гибридных семенах в большем, количестве синтезированы полипептвды с мод. массой 48, 21 г. 13,В кД Возможно, что при попадании в плету рас-' тений и в результате генетических процессов, происхочшщцс мэдду

фрагментам! ДНК, илазмида индуцировала участки, ответственнее ьн количественное содирлангл того или иного белка.

Растения PIâ тшме имели некоторые отклонения в рькиип:« в сравнении е контроль ними растениями, выралавешес-я a tun. чю опытные семена всхолили aua*a, чем контрольные, ¡кЛмкак-\:ь стогование в. росте, более позднем цветении, а такче на cttusro количества нлодоэлементов, гавиааваншгя при самоопыления, п<>Л№>с?ыа созревала 1/3 - 1/4 часть . Так, например у растения под номером 2-на 13 эавяэавалхся лдодоэледаитов созрело всего 9 (а.шгы.-мт t.). У растения МЗ (0. barpadsbsô L. ) из 37- цлодоэлементоь раскрылось о сего Б, у расзчшил iß 4 из 48 - 10 коробочек раскрылись. У растения Я?В из 40 плодоэлекентсв созрело только 2, а у растения tfïQ - из 20 коробочек раскрылось две. Б растение if: 7 насчитан. 34 вавявавшихся плодоэлеменга, а согрело всего 5,тогда как у растения ils8 на 26 коробочек раскрылось только 3. У растений под номером 10 и 11 сформировалось по 20 и 16 плодоэлеменаоь, а р«г>рылось - 5 и 3 соответственно. 7*»ким образом, при трансформации хлопчзтника посредством пяльцы в последующих поколениях члС::»'-п-wtüsi.«вменения, зафиксированные a спектре белков пылыу яосл^ду»-щего поколений растеиш-трансформзнтов, в спектре белков секли , а такле в физиологических признаках растений, эти явления молно отнести к следствию мутационного эффекта внесенной . гибридной плагмвди. При классической гибридизации такие явления проявляются только во втором, третьем и следующих поколениях.

' Для представления ксаользуемого нзмк метода нанесения пыльцевой суспенэик у чужеродным генетическим катериалом в выгодном свете проведем сравнение его с методе» микрог.нгекции экзогенной ДНК в цветки хлопчатника, примененного в натай лаборатории (Кбрз-гш/ов A.n., 1S8Q; Камзругиев A.A., 1G33) для получения растений -трансформаитов. В этом эксперименте кслзльгоьала« плззмида pCaVItoxneo. Б данном случае тоже било доказано наличие копий ре-комбвнантяои ялагмвды, интегрированной в. хромое, ш хлопчатника методой Слот-гибридизаца'и. Однако, пру. осуществлении микроинъекции в бутоны на разнш стадиях развития получали сильно траБыиро-вшнше ткани, формирование неполноценных стерильных и деформированных яыльцевьи герен у трайсформ)."роваяя£/го цветка как догзьтат действия экзогенной ДНК. Дале при введения .чужеродной ДКК в бутоны на стадии эрелйх тетрад, происходило образование недоразвитых пймян и процесс С5додотвореи«и несколько запаздывал.. Тогда как в

- га -

методе нанесения суопанзии использует?? полноценная зрелая пыльца рартйигя-рецишт-та. Рыльиэ цветка почти не травмируются, то есть гоыому растении наносятся наименьшие травма и этим методом тоже моляо получить рш'тенил■трансформанты.

ВЫВОДЫ

1, Установлено, что штш-эльной средой длл сохранения нативного состояния пыльцы хлопчатника является среда, содержащая соли калия и кальки, борнуч кислоту, необходимые длл проростания пыльны,, а такле гюлизтиля«гликоль, еггасобствуювдш проникновению плазмиды в пыльцевую клетку. Цитэхром С был внесен в состав среды с целью предохранения илавмиды от нуклеазной активности пыльцы.

2. Длл трансформации пыльцы хлопчатника была создана гибридная нлазмида (pfflta2toxrieo) на основе автономно реплицирующейся плазми-ды pi.iHm2 и ннтегрзтивного вектора (pCaVItoxneo), содержащей индивидуальный ген инсектотоксина и устойчивости к канамицину.

3. В результате использования в эксперименте суспензии, содержащей гибридную плаэывду (pGHrii2toxheo) и пыльцы растений-реципиентов были получены "трансфорыантные" семена для тетрапловдкых видов G.hlrsu-ture 1..И Й. tar-badsпзе L.

4. Дбт-гкб?идйза1кюиным анализом были получены положительные сигналы гибридизации,свидетельствующие об интеграции гибридной плаз-миды в геном растений-трансфорыантов первого поколения.

Б. Анализ электрофореграмм белков семян трансформированных растений и контрольных вариантов выявил определенные.количественные изменения белковых фракций с молекулярной массой 48, 21 и 13,5 кД.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТШК ДИССЕРТАЦИИ РАБОТ

1. Нетрадиционные методы генет шеи и селекции.// Хлопок. 1991.N 1. С.57-58, (в соавтор, с Мзмаруэиевым А. и Ибрагимовым А.П.)

2. Исследование электрофоретического состав белков пыльцевых верен хлопчатника.// Химия природ, соед. 1995. N 3. (в соавтор, с Юнусхановым Ш.Ю. и Ибрагимовы» Д.П.)

3. Функционирование конструированной рекомбинантной плазмиды для получения растений, устойчивых-к насекомым.//Химия природ.соед.

1998. N 1. С. 104-166.(в соавт.с Намаруэиевым А. и Юсуиомм Т.) 4. Белковый анализ первого поколотит растений-трвнсформчнтоп хлопчатника Qosaypiuw barbadense.// Хи>лш прород.ео^д- 1990. М 1 С.40-42. (в соавт. с Цамзрувкевым A.A. и Юсуповым Т.Ю.) б. Введение рекомОилантнда шюрыод, обладахвдм ренютйнтностые к канамицину, в генеративные органм хлопчатника.// wi'iet'.Vll Всесо-го. сишогшум. момша. 1800. (в соавт.с {однрумюмм л, и Юауааьш т.)

6. Изучение генетической активности акаогетшй ДНК на хлопчатнике.// Матор.1-Респу0д.кояф.молод,y4t.*iii<;:. тшвк^ит. (в соаот. о Мамаруэиеььм A.A.)

7. Злектрофоретическо» выделение нуклеиновых кислот -на пыльцы хлопчатншса.// тез. докл 2-ой коифер, бко*имикоя Узбекистана. Ташкент. 1993. (в соавт с Ибрагимовым A.n.)

8. Руза чаиги он^пштрининг электрофоретик тузулитшш ургаипя.// Узбекистоя Республ. Даэлат тили xai^yjarit крнушшинг Г5 йиллигига багиш.ёт олкмл. 1-чи илмий аншуманн. Тшкент. 1994.

9. Новый метод получения растеннй-тргшсформантов хлопчатника.// Матер.науч. конф."Биолог. основы опткм. скорость и продукт, раст. Ташкент. 1996 (в соавт. с Иамаруэиевым A.A., Юсуповым Т.КЗ. и Хад-ралиевой Д.Ш.)

10. Перспективы использования пыльцы и плаэмидной ДНК митохондрий хлопчатника Для переноса чужеродных генов,// тегисы докл 3-й конф. Биохим. Узбекистана.Ташкент. 1995. (в соавт. с Мамаруэие-вым A.A., Юсуповым Т.Ю. и Оскнской ¡i.A.)

И. Физико-химическая характеристика ДНК пыльцы хлопчатника.//тезисы докл 3-й конф. Биохим. Узбекистана. Ташкент. 1996. (в соавт.с Ибрагимовым А.П. и Хадралиевой Д.Ш.)

RJiCfyWA ИАЭкУИ Руза гули чангини генетик трансформациядаида туллаиь

Маэкур илмий иода гугэнп трансформация |уш!ш учун "чанг-плаэ-

ч/

мида" суспензиясини реципиент-устлиняартшнг оналик оргапларига утказишда олинган натижалар бзен »умииган. Тамриба асосида гуза гули чангини устириш сукириги танланди. Бу сукиушк таркибига Ca ва К тузлари, И,ВО,, сахарозе, ПЭГ ва шукингдек чапгни нуклеаэа-лзр таьсиридан са!уювчи шдда сифэтида цитохром С киради..

Чанг-плаэшма cynnoiiatwnj'uu трпнсфср^агп-тс;; y-iyu G,hlr»uLurn

L. митохондриясининг рВНиг плэгмияаси асосида, тэркябияа мясекго-

токсин (1ох) ва канамищшга чвдзмли (пео) индивидуал генлари мав-*уд булгаи - рСзУКохпео (^иано^ функцияли вектор тузилди. Шу-нкигдек ишда О.Мгэиинп Ь. ва а.ЬагЬайепзе !.. турлари гул чанги-иннг яуклеии кнслоталэрн та^лил ^линди, умуммй и^иллароинг трансформзш<ягачз ва увдан койинги электрофоретик сиектри урга-нилди. Трансформация натижасида о^штарнинг спектрида уагариш-лар булганлиги куроатилди. Трансформант-усинлиги ва гибрид плаз-мида рОНпйЮхлво ДНКсини дот-гибридизация усулини (уллаа ор^ли гибрид 'плагмвданинг трансформзнт-уснмдик геноыига интеграция булганлиги элшр.зяди.

Шундай ьртиб, руэа гули чангидан экзоген ДНКни тааувчд сифа-тида куллаш мумкунлиги тадрпбада курсатилди.

The present thesis concerns data on cotton transformation by nwana of applying of pollen suspension, oontalnin? plaswid on the sti^ina of plant-recipients. On the process of the study; It- was selected, the lequtd-medla for eertnln3tion of cotton's pollen and stabilization of pollen grains and plasroid-DNA Introduced, into the wedla. The media consisted of Ca, K salts, HsBOJ( sucrose and polyethyleneglycol. Cytochrome C was used as defencer of plaaiiid from pollen's enzymes nuclease activity. For cotton's transformation to be'done it was cloned hybrid plasmid being preliminary constructed on the dasis of mitochondrial plasmid pGHm2 and integration vector, containing individual Inseototoxln's gens (tox),resistant to kananicin (neo) - pCaVltoxneo. It was analysed pollen's nuolein aoid3 of Q.hirsutum L. and Q.barbaden3e L. and the speotra of total proteins distribution before and after transformation. Trial seed being obtained in the course of the study were treated for revealing of the speotra of total protein by means of electrophoresis teohniquo. This study ha3 shown some alterations whioh could be explained by affecting of transformation and integration of exogenic DMA. Positive dot-hybridization signals of DMA plants transfonmants and labeled plasmid (pGHmStox-neo) have shown that it took place of plasmid's sequences Integra^ tlon into the eenome of, plants-transforaiant3.

A.3. Imamkhodjaeva Usо of pollen for cotton Ronetlo tranafor*at J on