Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Влияние экзогенной ДНК на некоторые признаки хлопчатника

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Влияние экзогенной ДНК на некоторые признаки хлопчатника"

[к и -

апш1уя наук испубщи, ге.бзщтан научно-производственное объединение "биолог"

институт экспериментальной биологии растений

Па правах рукописи

МАМАРУЗИЕВ АБДУКАХН АБДУМАБЛАН угли

УДК 575.22:633.511:577.122-.576.

ВЛИЯНИЕ ЭКЗОГЕННОЙ ДНК НА НЕКОТОРЫЕ ПРИЗНАКИ ХЛОПЧАТНИКА

(03.00.15 - Генетика)

..Авторефер ат диссертации на сскскание учёной степени кандидата биологических 'наук

Ташкент - 1992

Работа выполнена в Институте экспериментальной биологии растений НПО "Биилог" АН РУз.

Научный руководитель:

Чл.-корр. АН РУз, заслулектай деятель наука РУз. доктор биологических наук, профессор КБРАПИОВ А.П.

Официальные оппоненты:

Чл.-корр.АН Республики Белорусь КАРТЗЛЬ H.A. Кандидат биологических наук ¿БГХ'ОВС'НАЯ А.Я.

Ведущее учреждение:

Институт селекции и семеноводства им. Г.С.ЗгЧцева АСХН РУз.

Зэцитг состоится " февраля 1992 г. я час. на заседании регионального специализированного совета Д.015.1901. по присуждению ученой степени доктора биологических наук в Институте экспериментальной биологии растений НПО "Биолог" АН Pec- i публики Узбекистан,.по адресу: .

70С143, Ташкент, ул. О.Ходжаеза, 2С, Институт экспериментальной биологии растений НПО "Биолог" АН РУз.

С диссертацией moss о ознакомиться в библиотеке, института. •

Автореферат разослан " января 1992 г.

Учёный секретарь специализированного

Совета, доктор биологических наук

К.3.Павловская

г

,, • . r.s.M 3

v-.тлол ОБ Ulli Я ХЧРАКИКСЖНА РАЕОТЬ!

;иссертжций

Актуальность темь:. Гзаогика и селекция хлопчатника долхсны быть направлены ка зьшедеяяе и внедрение р проягвэдетао «гяоро-спелых, высокоурожайных: а устопчилух к болезням сортов с хо-P02ZK качееззом волокна. При стом весьма вагпо,•чтооы селекция сочеталась с сокращением сроко: вызеде:~мп сортов, что зависит от примеш;ем<:х методов и эффективного использования исходного к оллекци они о г о материала.

Разработка методов создания нозьк сортов хлопчат;1 лге с улучшенными технологически;.?:! качествами волокна связана с большими трудностями. Для таведекия новых доноров болезнеустойчивости я доуг/х полезных признаков необходимо ыироко использовать не только природное разнообраг з мировых коллекцпл хлопчатника (Абдуллаев A.A., 1276), но и.индуцированный мутагенез и рекомбиногенез (Эгамбердкев А.,1984), а такге современные методы биотехнологии и генной инаенерки. Целесообразно не только пользоваться существующим генофондом, ко и экспериментально создазать выеок'оплодозитые и болезнеустойчивые .генотипы, которые в дальнейшем могли бы пополнить существующие коллекции. Исследования в области генетическ.оИ трансформации растений привели к создания значительного ароен»ла методов, достаточно эффективных для ряда видов.

Хлопчатник ~вляется одним из основных объектоз генетических и цитологических исследований,и было бы крайне векио иметь методы получения трансформированных растении хлопчатника с заданными свойствами. Однако получеь..е п „.ебных растений осложняется тем, что хлопчатник трудно поддается регенерации из культуры клетки in vitro. В настоящее время получены трансген-кие фермы хлопчатника на основе использования 'ii-плазмид аг-робактз;.::?. введением их в протопласты с последующе;: регенерацией целостного растения (Piroozabady Е., 1989: сожрапу "Аргоса tun" cirn-j. ■,::опеэпЬо,,) ?raipy R.T., 1989: Пирузян B.C. и др.,1990).sКроме этого имеются работы китайских ученых (Zhou л.у., I9E6), которые для переноса чуаеродной ДНК.использовали метод,мпкренньекцяи в бутоны хлопчатника после их оплодотворения. 3 результате этого ими выявлены всевозисгпые измен лия

з чорфологпи р маний, что представляет немалый актерес.. В сгчзч с этим существует необходимость изучения влияния чу-ьерсдлэго материала введпнкого 2 генеративные органы растений, ко морх^лсгию, фпзкологпю и каолядогание гзиепекньк п. знаков.

''ель з?дзчп гсзлздозеькя. Целью насгсячей psíoa-ы язяля-лось изучение глияк«!!' okcci-ohkjíí ДНК на кокогорые цодаологь- • ческпе у. биохимические по.^зчаки ^лолчатш-ла. Б соответствии с 3?i:»i 51Ш1 поставлен-; о.'.еду^ие задачи:

1. Выявить оптимальные условии переноса чужеродного генетического материала иу?ец уихроикгекдак.

2. ЭсуцсстЕктз трансуормадлх, уеко2&'.2ангно& плазмпды pCaVI torneo анализ её г.кспргссии.

3. тЛзучить ъллянпе эу.зотенлой ДНК на экспрессию зсдорастзо-?:::¿ac белков расгекзй-гуснсjo риансгов.

4. Изучить влияни-. экзогенной ДНК на формирование цитозм-б он алогических структур генеративные органов хлопчатника.

5. Пол учение новых фор:: хлопчатника введением тотальной ДНК-донора G.íhurberü X. в генеративные органы хлопчатника сорта TaiKüHT-I G.hirsutun L.

Ь'оапзнз i: практическая значимость результатов исследований.

При определении оптимальных условий переноса чужеродной -ДНК нами был разработан способ защиты ДНК от эндогенных нук-леаз инкапсулированием в липосомы. йксперпмонтально нацени оптимальные концентрации ДНК п соотношение ДКК-липосомы. Методом блот-гибоидизации по Саузерну, а текае использованием " метода маркерных белков, показана интеграция .маркерных генов (неомлг'нфосфотоансфбразы II) в геном растений-трансформантов в первом поколении. Впервые получены новые формы-хлопчатника, обладающие хсзяйствекно-ценкнми признаками, такими как скороспелость, зысскоуро>::айнэс?ь, устойчивость к сельхозвредите-ляц и болезням,.ранняя листопадноеть. Решением апробацнонкой комиссии Ученого совета института линия Л-5 рекомендована на конкурсное "...¡питание. Использованный нами метод микроикъекции инкапсулированной экзогенной ДНК даёт возможность перекоса генов в геном растений-трансформантов, который mosct применяться в селекционной практике.

Апообтция работы. Результаты работы докладывались к обсуждались но 7 съезде 30TV.C (MocKsa,I?87), на каучно-прокззодст-зеикоГ: конференции "Прпмекскьз достпкзннЛ биотехнологии в народном хозяйстве" (Уфа,1937), ка ill Всесоюзном симпозиуме ""о-лскулярнке механизмы генетических процессов" (Москва, 1900),на I Республиканской конференции молоды:; ученых "Теоретические и прикладное аспекты генетики и селекции квотных, рзстзни." и микроорганизмов" (Таж&нт,1990) и ка 7 конференции биохимиков республик Средне л Азии и Казахстана (Таэкент, 199').

Публикации. Основные материалы и положения диссертации изложены з 7 работах.

Структура и йбъЦ'л заботь:. Диссертация включает следующие разделы: введение, обзор литература:, материал а методы исследования, результаты, обсуждение, заю. чение, выводы и рекомендации, список использованной литературы. Работа изложена ка страницах машинописного текста: она включает 5 таблицы,С1 рисунок. Список литературы насчитывает 150 источника, з тс:: числе 100 на иностранных языках.

МАТЗРйАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Работа проводилась на культуре хлопчатника. Использовались самоопыленные гомозиготные по основным морфологическим и биохимическим маркерным признакам сорта хлопчатника ЮЗ-Ф, Таи-кент-I, Краснсистная акала G.hirsutun, С—6037 G.barbadcr.so и дикий вид G.thurberii из коллекции ИНЭЬР РУз. Растения выращивались по общепринято!! методике з условиях поля в Зонально!' лаборатории и вегетационном уч-стк института.

Пыльцу, собранную из специально выделенных растений, проращивали по методу, предложенному Roger С.Huren и др. (1979) з среде, содержащей 1,6 ч мМ Н3В03; 1,27 м\! Са(И03)2 • 4Н20; 0,31 ¡¿I ::£S04; 0,2 ¡£.1 КН2Р04; 0,3 мМ Маннит CgHI406; 0,0015 иг - ИУХ и Кинетин, при температуре т37°С, 12-14 часов. Выделение ДНК из пыльцы после проращивания осуществляли по методу, сочетающему отдельные этапы общепринятых методов Сиволап Ю.М. (1933): Манкаткс и др.(1984) с некоторыми модификациями, применительно к нашим условиям.

Мпч-чогя'г-екд.я г'гзогенно'! ДНК ъ гонетатдвгке органа хлоп-ча.ш-.ка. 3 опь. .ах применяя!! ыетод цихсолнгекциГ. экзогенной ЛНП в ггиерггивчгз органч хлопчатки:^ в ¿азы по рад- к после-¡¿ейозного состояния бутонов ис ходу цзетокодки (в плаценту сем.-лзчк:;). де::ъ / 1:2 лорой день цззге.чля Д:а' здод.;ась (2 :'кд буферного рсстаоьа, содержащего .1.0 :.:кг/:.:кл ДНК) в р:-:льде пестика, "спсльзовалп икхроппшц; скрж "еа^" ЛазЪгаНа. Б^'Х'сш: до- к после кка-екция изолировали бу::а^лг.!н црслягора-Расделтецкс ДНК для блст-глбочдаспцяа ?естркц-:ру2ц'гл1 эн-донуклеазами, электрофорез 2 агпрозно:.' г зле, печеное ДНК ¿;з о?арозл:гс гзлеИ на яеЗяонозие ¿цльяр», аак-гранеагдал», блот-гибридизациа по Саузерну, радиоавтографа прободай по общеприняты.: цегодалак Мак^аих и др.(1934). Д'Ч инкапсулировали в .•:ппосс:.ш нетодсм. ргзработакн;:и в институте биохимии АН РУз "ссозы:: 3-й. (авторское сяхдагеиьсгво & 1166333 ст 1/2-1985).

Элгктэо.Тооез :;одо1 -ствоьгмых белков проводил;: по методу ОС (1974), ДДО-Еа злектрофорез трудно- и легко-растиоримых белков по катоду у/еъег ОзЬэт (1969) с некоторыми Г!03::-;лКаЦ2&«!.

!'". ?оз;.;б рп ол о гг. чес ки е не с л е д ов акия. Для микроскопических исследований материал фиксировали в :::идкосгк Кларка: 1 часть ледяной уксусно:-! кислоты + 3 -части этилового спирта. '.]:-> с об-, ранног.о материала готовили давленные препараты, которые окрашивали 2,3 ацетокармино^:. Для хранения препаратов была использована смесь Розина. Препараты изучались под роекопон МЕИ-3, микрофотографии выполнены при помоци '.'СЛ-15. Фиксированный материал (для изучения влияния экзогенной ДНК на про-., цесс оп ¡дотверения, развития зародьгла и эндосперма) был обработан по общепринятой цитсзус-'риологической методике З.П.Пау-ыева (1974). "з парафинированного материала были изготовлены микротемные препараты, толциной 13-16 укм. Окрашивали реактивом Пиффа и подкраиивали геыотоксиликоы Зрлиха.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Поиск оптимальных условий и сроков фазы развития генеративных органов хлопчатника для трансформации.

Трансформация рекомбинантной пдззмиды »ДаУ^охпео в генеративные органы хлопчатника и анализ ее экспрессии. Используя метод микроиньекцип, осуществлено зклпчеппе рекомбикантной плазмиды рСаУ1*о:сг.ео, содержащей кодирующую последоватоль-ность активной части инсектотоксина и канамицинфосфотрансфера-зы в геном реципиэнгного хлэпчаыика сорта 108-0. Растения-реципиенты культивировали в вегетационных сосудах. Контрольные и опытные 7-дневные проростки перенесли в раствор, содержащий различные концентрации канаыицина. Дальнейшее наблюдение за ростом растений проводили до 20 дней. Контрольные растения, . перенесенные в раствор, содержащий кь.,амнцлн в концентрации от 50 до 100 цкг/мл полностью погибали в течение 3-8 дней. Среди

Рис.1. Блот-гибридизационный анализ ДНК хлопчатника кананицннус-: ТОЙЧИЗЫХ И контрольных раСТОНИЙ. ■ . ;•,] 2,4,5 - контроль N л! 1,6 - обработаны ресгрикгазой Hind III .К Pat I . 3 - с 'раб-тана рестриктазой-Kpn I.

1 2 3 4 5 6

опытных растений-трансформантов. проявляющих устойчивость к кг :ампцкну, пр; звсли первоначальный отбор для дальнеЛщих исследовании. Показана зависимость относительного прироста трансформированных и, контрольных проростков от концентрации ка-нампцнна. Канамкцин в концентрации 50 м к г/мл угнетает, а при ЮГ! м:-:г/ыл останавливает рост проростков.

Нами было доказано наличие копий рекомбинактньэс нлазмид, интегрированных з хромосомы хлопчатника методом блот-гибри-дпзации по Сзуззрну, используя в качестве гнбридизационного зонда плазмиды pCaVlvoxneo. Геномная ДНК. в^одонкап из молодых листьев опьгтшдс растениЛ после рзстри^ирсвання ферментами Hind III, Kpn I и Pst I фракционировали в. 30 агарозном геле, затем переносили на неЛлонозые мембран . Результаты блот-гнбрндпэацци представлены на рис.1. ДНК, обработанные рестрик-тазоЛ Hind hi к ?st I (рис.1, I,С дор.), дают по одному гпб-ридизацненному сигнал- з зоне высокомолекулярных р^стриктоз. 1'огда как ДКК, обработанная рестснктазон Крл I, дает два гибрид;; с аци энных сигнала в зоне низкомоленулярных рестриктов.

Влияние зкзогеннол ДНК на экспресс:;» зодорастзоснмж белков семян хлопчатника. Введение ДНК в бутоны хлопчатника осуществляли но зылеописанноЛ методике. Электрофоретпческому анализу водорастворимых белкоз подвергались отдельные семена камдоп опытно:': и контрольной коробочки. При постановке опытов по вве-г декиа экзогенной ДНК учитывали наличие биохимических маркерных признаков у растени?., использованных з качестве донорсз и реципиентов (наличие антоциановои окраски, наличие белковых мар-' кероз). Изучены электрофоретические спектры отдельных семян растений хлопчатника Краснолистной акалы, в бутоны которых были введены ДНК хлопчатника 7-5037 ü-barcadciice.Спектры электрофореграмм белков опытных семян ке отличались от спектров контрольных семян. При этом вероятно ке происходило трансформации рецилиентного генома.

При анализе электрофореграмм семян от растений сорта C-S037, полученных п"зле инъекция ДНК Краснолистной акали, было обна-руяено, что электрофоретические спектры белкоз отдельных семян некоторых коробочек изменяются. Эти семена по наличию маркерных белков Н-0,13 в В-0,18 делились на две группы (рис.2).

ь

ЗиСЮ

]Ш[.'

Рис.2. Схема электрофорети-чзского набора б: :коз семян различных йору хлопчатника.

2.С-6057 (контроль), 3 .С-6037 (реципиент) 4.С--037 (реципиент)

I 2 3 4

Одна группа содержала белок В-0,18 и по электрофоретичес-кому спектру отличалась от семян контр-чьных коробочек.(рис.2, дор.З), другая группа содержала одновременно белки Н-0,13 и В-0,18 (рис.2, юрЛ), а спектр электрофореграмм напоминал спектр белков-семян менвидовых гибридов. Поскольку.семена хлопчатника С-6037 .не .содержат белковый маркер Н-0,13, то его появление в опытных семенах свидетельствует об экспрессии'чу-херодной ДНК, полученной от КраснолистноЗ акалы, в состав генома С-6037.. ' ■ •

Такка было изучено влияние экзогенной ДНК на трудно- и логкорастворимые фракции белков семян хлопчатника.

Из рис.3 видно, что в спектре труднорастворимых белков опытных растений (б) количественное содержание отдельных компонентов изменяется. В электрофореграмне растворимых белков такзе наблюдается некоторое изменение опытных семян растений (д) по сравнению с донором и реципиентом. Например, концентрация компонентов с мол.массой около 47-53 кД, увеличивается, а

... V--'.» -г <, >

V ..}'

—. <.'* к л

о и X I

Рис.3.ДДС Иа-ПААГ электрофоре- . г раммы. а, б, ъ-труднораствг -»имые, г,д,е-легкораствориыые фракции белков семян хлопчатника,

а,г-сорт Таскент1-реципиент,

б,д-трансформированная форма Л-5, В,е- О.-ШигЪегЗ -донор

а 5 в гдв

низкомэлскулярг.ые компоненты заметно уыеньпактся или исчезают. Такле наблюдаются минорные изменения в 30 спектрах опытных растений.

Таким образом, результаты ДДС 1!а-ПААГ электрофореза семян подтверждают тот факт, что при микроикъекции ч\керодной ДНК в ЭС спектре запасных белков реципиента происходят определенные' изменения.

Влияние экзогенной ДНК на формирование цитозмбриологических структур .анеративньрс органов хлопчатника. Для решения вопроса о том, какое действие оказызает экзогенная ДНК на прохождение мойоза на развитие иуяских и зексккх генеративных структур и поиска оптимальных условий для трансформации, а такзе на темпы эмбриональных процессов,вазко знать их состояние в момент введения ДНК. В счязи с тем, что влияние экзогенной ДНК на генеративные структуры хлопчатника изучается впервые с использованием эибриологических методов, наш! была,предложена схема проведения

экспериментов:

Схема опытов по изучению влияния экзогенной ДНК на эмбриональные процессы генеративных органов хлопчатника

Таблица I

~ Способ ,-С"остоянле-гёнаратйзно!Г , "Сроки-фйкЗацяи

введения ¡сферы в момент введения ДНК; после введения

По ходу цвето- 1,До начальной стадии мейоза 1,2,3 сутки нозки 2.Конец мейоза(фаза тетрад) 1,2,3 сутки

3 рыльце пестика 3.3а день до цветения 1,2,3 сутки

4.Через сутки после цветения 3,6,10 с:;тки

Согласно этой с^еке, экзогенную ДНК предусматривалось бво- ■ дить в бутоны или завязи в момент прохождения наиболее чувствительных и ответственных этапов эмбриональных процессов.

Изучали влияние экзогенной ДНК на мейоз при микроспороге-незе и, естественно, на развитие пыльцы. Длл этой цели были поставлены 2 варианта опытов согласно схеме. Анализ собранного материала показал, что в опытных бутонах фазы мейозэ проходили более интенсивно, чем в контрольных. Как показали исследовании через сутки после введения ДНК в пыльниках уяз завершился мей-оз и образовалась молодая одноядерная пыльца. Она мелкая, цитоплазма мелковакуолизированная, оболочка тонкая и шипы еле ви. чы. Ядро с ядрызком хорсто просматриваются. В контрольных' вариантах к этому времени начиналось образование тетрад, что говорит о конечной стадии мейоза.. ]удя по характеру аномальных пыльцевых зёрен, в мейозе I и П мозно предположить неравномерное расхождение хромосом в мета- и анафазе. Наиболее часто встречавшимися аномалиями были очень мелкие пылинки .(микропылинки),, которые иногда имели либо нормально развитую экзину с винами,либо слабовырагенчую экзину с тонкими нитевидными иипака. Нередко отмечались гигантские пылинки вытянутой или согнутой формы, которые нетипичны для хлопчатника.

Введение экзогенной ДНК в бутоны в фазу тетрад показало, что дальнейшее развитие пыльцы проходило таклга с нарушениями. 3 результате этого наряду с нордальной пыльцой часто формируются недоразвитые, которые представлены половинкой (рнс.4,а),

вогнутой вовнутрь (рис.4,в),ассиметричной (ркс.4,б,д), ганте-левидной формой со слаборазвитой экзиной с шипами либо отсутствующими (рис.4,г), либо расположенными на э'кзине неравномерно.

Ка над взгляд, нетипичными явля:отся достаточно часто встречавшиеся пыльцевые зёрьа, у которых экзина менее развита и на которой совершенно отсутствовали иипы (рис.5). Иногда они имели размеры, близкие к нормальным, и в них хорошо просматривались проростковые поры. Кроме ^писанных аномалий отмечено некоторое разнообразие фора, размеров пыльцевых зерен. Изучено качество пыльцы в начале-, -в период массового и -конце цветения с^тов хлопчатника 108-0 и Таикент-1.

Ана;. .з пыльцы двух сортов хлопчатника 108-Ф и Таыкент-1 • ■ • Таблица 2.

"¡Период ! _ _ Качество пыльцы в % _ __

Т контроль ; опыт

! !"фёр!^ "¡""Сте- ~!~Ано- Т Фер-~ Т итв-~ Г 1чо-___X _ _ .__1тильной!¿ильной!малвно^тильнойХрильнойХмальнп^

Сорт

начало. . 93,4 6,6 - 91,2 5,9 2,9

108-0 массовое 96,9 2.9-, 0,2 93,4 3,2 ' 3,4

конец 96,9 ■ 3,1 - 93,1 3,8 3,1

начало 89,7 10 - 88,5 9,2 . 2,'3

Т-1 массовое 97,4 ' 2,6 ' - 93,2 2,8 4,0

конец 97,3 2,6 0,1 96,1 2,2 1.7

Выполненность пыльцы у обоих сортов достаточно высокая в течение всего периода цветения. В опытных бутонах в связи со всевозможными аномалиями в развитии пыльцы выполненность её снижается приблизительно па 2-4^.

Процесс оплодотворения, развития зародыша и эндосперма после микроинъекции экзогенной ДНК. Для изучения влияния экзогенной ДНК на процесс оплодотворения, а также развития зароды-за и эндосперма были поставлены два варианта опыта (см.схема опыта:3 и 4). Исследования показали, что в контрольной вариан-.те через сутки после опылекая спершш клетки воили в одну из

Рис.4. Аномалии б развитии пыльцы"при взедонии ДНК г бутоны к концу меЛоза (фаза тетрады).

■ ,

ту'

К., <Г-

. к* >

-с . ь. 1 '

И-?'

«

'.--Г.:.:'»- ^"Ч--*."*?/

,ЧУ , - " - Г-.г • • - , V

■V4.'-

¡Л 41-

- . -'.-'У

-у.*)

Рис.5. Аномальные пылкнкк-без шипов (ДНК введена в конце иейоза).

синегрид и через двое суток в полости зародышевого меска наблюдались ядра эндосперма и сбразозазпапея зигота. В опытном варианте процесс оплодотворения несколько запаздывал, т.к. в центральной клетке на вторые сутки после опыления отмечалось лпыь небольшое количество ядер эндосперма, а зигота образовалась только на 3 день. На наа взгляд, неболыяае количество ядер эндосперма сэидетел-отяует о замедленном ыигогнчоском -членик трлллондмог'о ядра, а такло о значительной по времени задержке слияния спермил с ядчом яЯцеклогк:.. Однако по згоку вариант:/ опыта установлено, что на 4-5 сутки после опыления развитие .зар'-дыма и эндосперма у контрольного и опытного вз-риантов находится на одинаковом уровне развития, что говорит об ускорен:;:! ¿тих г~юцессоз под действием ДНК з более поздний • сроки.

Введение экзогенной ДНК через сутки после цветении не оказывало влияния на рззвитке зародыла к эндосперма.

Установлено, что з опытных вариантах эмбриональные процессы проходят синхронно, тогда как в контрольных - асинхронно. Ядра эндосперма,з опытных вариантах располагающиеся з ха-лаззльнсл части зародышевого мелка, увеличены в размера:':, что очевидно способствовало быстрому росту и развитию зиготы и зародыша на более поздних сроках развития. -

Введение тотальной ДНК (о.-^-.игЪег-И Т-. в генеративные органы репипианта соота Тапкект-! Ю.Чтобы полу-

чить новые формы хлопчатника, исследовали самсопыленные гомозиготные по основным морфологическим признакам и имеющие свойства биохимических маркеров линии -сорта Тапкеит-1

ь., а такле устоЗчизый к болезням зид хлопчатника й.-^ь-аг-Ь. 3 опытах применяли метод мпхроин-екшш экзогенной ДНК в генеративные органы хлопчатника как описано .ьыле.После инвенции бутоны изолировали. Следующее поколение опытных растений получали из отдельно выращенных коробочек. 3 результате вьеденпя тотальной ДНК из пыльцы О.гЬигЪегИ в бутоны хлопчатника сорта Таикент-1 на следующий год у девяти растений из 1200 опытных семян по сравнению с контрольными отмечены различия по морфологическим признакам. 3 отличие

Цитоэмбриологическая часть работы проводилась совместно с к.б.к.Эрккеновой ЗЛ. (Институт ботаники АН РУз).

от реципиента, который имел раскидистую форму куста,' полученные нами формы растения имели компактный куст высотой 120-1'Ю см. Первая плодовая ветвь закладывается па четвертом к пятом узле. Стебель зеленый, к осени с красноватым оттенком. Листья темно-зеленые, слабо опушенные, трех-пят« лопастные. Цветок небольшой, со светло-желтыми лепестками, три 14-15-ти-зубчатых прицветника. На плодовой ветви две-три коробочки, расположенные на расстоянии 2-5 см от главного стебля. Ыасса коробочек меиъые, »ем реципиента. Семена опушенные. В процессе изучения было этмече1 1 несколько ускоренные темпы при бутонизации и цветении.

Рис.6. Сезонная динамика цветения сорта Таи-кент-I и линии Л-5.

--- Ташкент-Т

изучение динамики цветения линии Л-5 показывало, что оно начин"зтся доволь о активна и через 9-IQ дней от e-jo на-, чала достигает высоких темпов (рис.6). График показывает, что такой высокий темп цветет . сохраняется 25-26 дней, з течение которого и раскрывается большее количество цзетков и формируется основной урожай. Выявлено, что на мутантных линиях урожайность значительно больше, чей у .реципиента (табл.3) сорта Ташкент-I. Среди этих форм были выделены линии'Л-2, Л-5 и Л-5, ■которые обладают рядом хозяйственно-ценных признаков, таких

Хознйствешю-ценннэ и технологические показатели ли.4ий хлопчатника, полученных иетодом генетической трансформации

Таблица 3

Сорта ! Вегех. {Бес 1ой{Урозай {Выход [ ¡¡1тапел{ Цзгрчч.Мро- (РазртЦЛлсхо- {Пораааеи. и линии! период

дни

г

.1-1'...

46,5

65,2

64,3.

71,5.

I

1-д 1 км 1 на 1.1Х ! 1 в 2

4,4 23,3 41,0 84,2

4,4 24,6 61,7 20,5

4,4 26,0 66,7 12,5

4,5 25,4 ¿15,0 5,0

Т-1

Л-2 Л-5 Л-6 ■

152 125 125 123

6,1

5,5

5.4

5.5

34,5 35,5 36,1 35,5

32,1 35,5 34,0 33,4

5300 5600 5300 5550

как интенсивный рост и развитие, скороспелость, внеокоуро-

зсайность, устойчивость .ч болезням и вредителям к могут рассматриваться как перспективный селекционный материал.

ВЬШСДЫ

1. Впервые разработан метод инкапсулирования ДНК (и плазмпд) для введения в генеративные органы хлопчатника,

2. Установлены оптимальные концентрации чужеродной ¡ПК,не . влиявшие на естественный п.оцесс опыления-оплодотворения.

3. Методом молекулярной и илот-гибридизации по Оаузерчу, а такзе с .использованием метода маркерных белков показана интеграция чужеродной ДНК (рекомбикаптной плазмиды, оодер-вацей ген устойчивости " канамицину) в геном реципиента. Электрофорезом в ДДС Иа-ПААГ показаны нексторые изменения в спектрах легко- и труднораствориыыу белков опытных растений. "етодоа белковых маркеров была выявлена экспрессия

. чужеродной ДНК начиная с растений первого поколения.

5. Цитоэмбриолох'ическке исследования показали, что экзогенная ДНК, введенная и бутоны перед начало« мейоза при микросп. -рогенезе, заметно ускоряла темп митотического проце.са и развития пыльцы. Г -д .влиянием экзогенной ДНК возникают аномалии: неравномерное расхождение хромосом, появление микропшинок, гигантски пылинок вытянутой или согнутой' формы, отсутствие шипов, ч?о снижает фертильнесть пыльцы

. на 2-4Г».'

6. Введение экзогенной ДНК в бутоны за I день до раскрытия цветка несколько задераивало процесс оплодотворения. Экзогенная ДНК, введенная.на 11-й день после цветения, не злияла на процесс эмбрио-и экдсспермогекеза.

7. На основе использования.метода генетической трансформации впорзые получены новые формы хлопчатника, обладание такими хозяйственно-ценными признаками, как высокоурожаеность,

• скороспелость, устойчивость к болезням и вредителям, ранняя листопадносгь.

РЕКОМЕНДАЦИЯ

"I. Для получения новых форм .растений, в том числе хлопчатни-

ка, рекомендуем использовать мьл'од микроинъекции чукерод-нсй инкапсулированной ДНК для введения в генеративные органы растений.

2. Полученные линии хлопчатника характеризуются рядом хозяй-. стзенно-цекн:£с признаков - зысокоплодовитссть, скороспелость, устойчивость к болезням и jродителя::, ранняя листо-падность - и рекомендуем использовать их в селекционной практике в качестве доноров этих признаков.

Список публикаций по теме диссертации

1. Получение новых форм хлопчатника методом моле^улярно-ге-негической трансформации экзсх-елнсй ДНК/ А.П.Пбрагкмоз, К.Абдураимоза, Ь.В.Балптова// Тезисы докладоз У-сгез^а

. ВЭГиС. !.!., 1987.

2. Влияние экзогенной ДНК на экспрессию водорастворимых бел-коз семян хлопчатника/ А.П.Иерагимов, П.~лусханоз и др.// Тезисы докладоз науч.-прсиз.конференции "Применение достижений биотехнологии в народном хозяйстве". Уфа.-1937. С.

. 'íO-41.

3. Введение рекомбинантных плазмид, обладающих резистентностью к :ганамиц;;ну,в генеративна органы хлопчатника/ Т.Юсупоэ, А.С.Кмамходнаева, А.П.Пбрагимоз// Тезисы докладоз УП Всесоюзного симпозиума "Молекулярные механизмы генетических процессов". !.i.- 1990. G.161.

4. Изучение генетической активное v экзогенной ДНК ка хлоп-■чатннке/ А.С.Имзмходяаеза// Тезисы докладов I Республиканской конференции молодых ученых "Теоретические и прикладные аспекты генетики и селекции кизогных, растений и микроорганизмов". Т.- 1990. С.57-58.

5. Нетрадиционные методы генетика и селекции/ А.П.Ибрагимоз, А.С.!'мамхсдЕаева// Хлопок, M.- 1991. I. С.58-59.

6. Генетическая трансформация хлопчатника с использованием процесса опыления-оплодотворения// Тезисы докладов У-кок-феранции биохимиков республик Средней Азии и Казахстана. Г.- 1991. С.201.

7. Влияние экзогенио.1 ДНК на формирование цитоэмбриологичес-ких структур генеративных органов хлопчатника/ А.П.Ибрагимов, З.М.Эрккеноза, К.Галиаова// Tau ке.

. Подписано в печать t£o/.gz. Заксд Л? . 1крал /00 экз.

Оспецат-rtO на ротапринте в ИК с ВЦ НПО "Кибернетика" АН Уз? 700125, г.Ташкент- 25, ул.Ф.Ходжаева,34