Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Репродуктивный потенциал клонов плантации сосны сибирской (Pinus sibirica Du Tour) на юге Красноярского края

ВАК РФ 03.02.01, Ботаника

Автореферат диссертации по теме "Репродуктивный потенциал клонов плантации сосны сибирской (Pinus sibirica Du Tour) на юге Красноярского края"

На правах рукописи

005012598

Савельев Станислав Сергеевич

РЕПРОДУКТИВНЫМ ПОТЕНЦИАЛ КЛОНОВ ПЛАНТАЦИИ СОСНЫ СИБИРСКОЙ (PINUS SIBIRICA DU TOUR) НА ЮГЕ КРАСНОЯРСКОГО КРАЯ

03.02.01 - Ботаника

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Красноярск — 2011

005012598

Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Институте леса им. В.Н. Сукачева Сибирского отделения РАН

Научный руководитель: Официальные оппоненты:

Ведущая организация:

доктор биологических наук, профессор Третьякова Ираида Николаевна

доктор биологических наук, профессор Васильев Аркадий Николаевич

доктор сельскохозяйственных наук, профессор Буторова Ольга Федоровна

Учреждение Российской академии наук Институт мониторинга климатических и экологических систем СО РАН

Защита состоится 14 февраля 2012 г. в 14.00 часов на заседании диссертационного совета Д 003.056.01 в Институте леса им. В.Н. Сукачева СО РАН по адресу: 660036, г. Красноярск, Академгородок, 50, стр. 28.

Факс: (391) 243-36-86; E-Mail: institute forest@ksc.krasn.ru

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института леса им. В.Н. Сукачева СО РАН

Автореферат разослан «декабря 2011 г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор биологических наук, профессор

Е.Н. Муратова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. Несмотря на разноплановые исследования генеративных органов сосны сибирской (кедра сибирского, Pinus sibirica Du Tour): выявление закономерностей формирования урожаев (Некрасова, 1972; Ирошников, 1985; Воробьев, 1979; Горошкевич, 2008), изучение физиологических процессов, лежащих в основе формирования генеративных структур (Минина, Ларионова, 1979), цитоэмбриологических исследований (Третьякова, 1990), многие аспекты репродукции данного вида остаются не решенными. Между тем, репродуктивные процессы кедра сибирского имеют ряд особенностей, отличающих его от других представителей хвойных, произрастающих на территории Сибири:

• длительный генеративный цикл (2,5 года);

• незавершенность прохождения эмбриогенеза (семена требуют длительной стратификации в течение четырех-семи месяцев);

• встречаемость в популяции уникальных особей кедров-акселератов, шишки которых созревают за 2,5 месяца (вместо двух лет) и формируют семена без зародыша (Ирошников, 1974; Минина, Ларионова, 1979; Третьякова, 1990).

Изучение репродуктивного потенциала кедра сибирского является одной из основных проблем, направленных на сохранение его генофонда. Эта проблема может быть решена сочетанием классических методов селекции, таких как искусственный отбор высокоурожайных форм, контролируемое опыление, получение хозяйственно ценных гибридов с современными методами биотехнологии, позволяющими осуществить массовое размножение улучшенных сеянцев данного вида.

Цепь исследования. Определение репродуктивного потенциала клонов кедра сибирского и выявление его регенерационной способности при контролируемом опылении ex situ и в культуре in vitro.

Задачи исследования:

1. Исследовать половую репродукцию клонов прививочной плантации кедра сибирского на юге Красноярского края;

2. Провести сравнительный анализ пыльцы клонов и деревьев кедра сибирского из естественного древостоя, используемых в качестве опылителей;

3. Выявить структуру урожая, семенную продуктивность женских шишек и качество семян, полученных в результате свободного и контролируемого опыления у клонов кедра сибирского;

4. Оценить семенное потомство кедра сибирского, полученного в результате контролируемого опыления на способность к прорастанию и росту;

5. Индуцировать получение каллусных культур из зародышей семян кедра сибирского в культуре in vitro.

Защищаемые положения:

1. Полученное в результате контролируемого опыления пыльцой кедра-акселерата жизнеспособное потомство предоставляет возможность изучить

уникальное природное явление, связанное с аномальным генеративным циклом развития в системе рода Pinus.

2. Использование в качестве опылителя пыльцы дерева с однолетним циклом развития женской шишки, позволяет получить семенное потомство, которое можно успешно использовать в лесосеменной практике.

Научная новизна. Впервые проведено контролируемое опыление деревьев клонового архива кедра сибирского в Западном Саяне, в том числе пыльцой уникального дерева с однолетним циклом развития женской шишки. Выявлены комбинации родительских пар, дающие высокопродуктивное потомство. Впервые ex situ было получено селективное потомство в результате контролируемого опыления пыльцой кедра-акселерата с однолетним циклом развития женской шишки и самоопыления. Впервые получен каллус из незрелых зародышей семян «отцовских» деревьев-опылителей кедра сибирского из естественного древостоя Западного Саяна.

Теоретическое и практическое значение. Получены новые данные по влиянию пыльцы уникальных форм деревьев кедра сибирского с однолетним циклом развития женской шишки на репродуктивную способность клонов кедра сибирского. Рекомендованы варианты контролируемого опыления, которые могут быть использованы в селекционных программах. Разработаны методы биотехнологии получения каллусных культур кедра сибирского.

Апробация результатов. Основные результаты исследований представлены на следующих региональных, всероссийских и международных конференциях: школа молодых ученых "Эмбриология и биотехнология" (Санкт-Петербург, 2005); IV Российская конференция «Флора и растительность Сибири и Дальнего Востока» (Красноярск, 2006); конференция молодых ученых «Исследования компонентов лесных экосистем Сибири» (Красноярск, 2006, 2007 и 2009); IV съезд общества биотехнологов России им. Ю.А Овчинникова (Пущино, 2006); I (IX) международная конференция молодых ботаников (Санкт-Петербург, 2006); конференция «Досягнення i проблеми генетики, селекци та бютехнологп», посвященная 120-летию со дня рождения академика HAH Украины Н.И. Вавилова (Киев, 2007); международная школа молодых ученых «Эмбриология, генетика и биотехнология» (Уфа, 2007 и Саратов, 2009); II международное совещание по сохранению лесных генетических ресурсов Сибири «Генетические основы устойчивости и продуктивности древесных растений в связи с антропогенным воздействием и глобальным изменением климата» (Новосибирск, 2009); всероссийская конференция с участием иностранных ученых «Эколого-географические аспекты

лесообразовательного процесса» (Красноярск, 2009); международная научная конференция «Актуальные проблемы прикладной генетики, селекции и биотехнологии растений» (Ялта, 2009); III международное совещание «Сохранение лесных генетических ресурсов Сибири», посвященное международному году лесов (Красноярск, 2011).

Диссертационная работа выполнена при финансовой поддержке Интеграционного проекта СО РАН № 53, грантов РФФИ № 06-04-08040-офи, 07-04-96810-р_енисей_а, 08-04-00107-а, 09-04-98008-р_сибирь_а, 094)4-10023-к, 10-04-10026-к, ККФН 18G043 и проекта СФУ 1.7.09 федерального агентства по образованию.

Публикации. По результатам исследования опубликованы 22 работы, в том числе три в журналах, рекомендованных ВАК РФ.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, шести глав, заключения, выводов, списка литературы и приложения. Работа изложена на 143 страницах, содержит 27 рисунков и 33 таблицы. Библиографический список включает 179 источников литературы, 55 из которых на иностранном языке.

Личный вклад автора. Сбор экспериментального материала и его анализ проведен автором.

Благодарности. Автор выражает глубокую благодарность научному руководителю д.б.н., профессору И.Н. Третьяковой за ценные советы в работе над диссертацией. Кроме того, автор признателен директору Государственного предприятия Красноярского края «Красноярское управление лесами, Ермаковский филиал, Даурское подразделение» Ю.А. Череповскому за предоставленную возможность проведения экспериментальных работ на клоновых архивах кедра сибирского в Западно-Саянском OJ1X и зам. директора Западно-Саянского OJIX В.Ю. Череповскому за помощь в проведении работ по гибридизации.

ГЛАВА 1. ОСОБЕННОСТИ ПОЛОВОЙ РЕПРОДУКЦИИ КЕДРА СИБИРСКОГО

В главе анализируются работы отечественных и зарубежных авторов, посвященные изучению половой репродукции рода Pinus (Яковлев, 1960; Лобашев, 1967; Singh, 1972 и 1978; Тахтаджян, 1978; Минина, Ларионова, 1979; Третьякова, 1990 и др.), особенностей эмбриогенеза Pinus sibirica (Некрасова, 1972; Третьякова, 1990; Новоселова, 2004 и др.), а также кедра-акселерата с однолетним циклом развития женской шишки (Минина, Ларионова, 1979; Третьякова, 1990, 2000; Третьякова и др., 2003). Рассматриваются работы, по изучению закономерностей развития мужского гаметофита у рода Pinns (Размологов, Цингер, 1972; Сунцов, 1982; Некрасова, 1983; Минина, 1984; Третьякова, 1990 и др.) и семеношения Р. sibirica (Ракитин, 1948; Крокер, Бартон, 1955; Калинин, 1959; Прокофьев, Холодкова, 1959; Ирошников, 1972; Некрасова, 1972; Щерба и др., 1998; Кузнецова, 2002; Матвеева и др., 2007 и др.). Проанализированы работы по исследованию внутривидовой и межвидовой гибридизации кедра сибирского (Титов, 1988, 1991, 2006; Воробьев, 1989; Авров, 1989, 1993; Горошкевич, 1996, 2008; Кузнецова, 2007 и др.). Приведены данные по вопросу микроклонального размножения хвойных в культуре in vitro, в том числе

уделен о внимание проблемам соматического эмбриогенеза семейства сосновых (Durzan and Gupta, 1987; Lelu et al., 1995, 1999; Stasolla et al., 2002; von Arnold et al., 2002; Pullman, Johnson, 2002; Klimaszewska, Cyr, 2002; Park, 2002, 2003; Скрипаченко, 1982; Третьякова, 2006, 2007, 2008 и 2009 и др.).

ГЛАВА 2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объектом исследования служили клоны плюсовых деревьев кедра сибирского, произрастающие на прививочной плантации Западно-Саянского опытного лесного хозяйства (ОЛХ). Клоновая прививочная плантация располагается на территории ОЛХ Даурского лесничества вблизи поселка Ермаковское (53° 16' с.ш. и 92°23' в.д., высота над уровнем моря 300-320 м). Плантация занимает площадь 10 га. Каждый клон представлен прививками плюсовых деревьев кедра сибирского из естественного древостоя в Западном Саяне, выделенных Ю.А. Череповским с сотрудниками, и состоит из 12-15 деревьев (рамет).

В разные годы (2005 - 2009 гг.) были использованы одни и те же родительские особи. В качестве «материнских» деревьев в течение четырех лет исследования были отобраны 2 плантационных клона - 277/22 и 281/26. В 2006 году дополнительно были введены 4 клона - 280/25, 281/27, 285/31 и 320/51; в 2008 году в анализ были вовлечены 4 новых клона - 275/20, 145/4, 153/13 и 002. Опытные клоны имели возраст 15-17 лет, высоту ствола 3,0-3,3 метра и диаметр кроны 2,2-2,8 метра. В качестве «отцовских» деревьев использовали дерево-акселерат с однолетним генеративным циклом развития женской шишки (№ 106) и плюсовые деревья (№ 277, 492, 476, 357 и кш2) в возрасте 120-160 лет, высотой ствола 21,0-33,0 м, произрастающих в естественном древостое в Западном Саяне. Все деревья-опылители характеризуются обильным урожаем женских шишек, семенная продуктивность таких деревьев составляла 76,1-97,0%, масса 1000 семян варьировала от 215,6 до 338,4 г. Кроме того, производили самоопыление плантационных клонов. Сбор пыльцы и контролируемое опыление осуществляли по стандартным методикам (Райт, 1978; Титов, 2006) в период раскрытия микроспорангиев. За период исследования, с 2005 по 2009 год, на 182 раметах выполнен 1381 вариант контролируемого опыления.

По стандартным методикам (Дженсен, 1965; Паушева, 1980) определяли морфометрические параметры пыльцы, анализировали окрашенные сафранином пыльцевые зерна, проводили гистохимический тест на крахмал реактивом Люголя. Для определения жизнеспособности пыльцу проращивали на 10%-м растворе сахарозы (Паушева, 1988), двухкомпонентном растворе (10%-я сахароза + 3%-я борная кислота) (Добровольская, 2004) с добавлением гормона 2,4-Д в различной концентрации (без гормона; 0,5 мг/л и 1 мг/л 2,4-Д) и в водном растворе минеральной среды (Nygaard, 1970).

Исследование женских генеративных органов у деревьев прививочных плантационных клонов включало анализ урожая - учет заложившихся, опыленных и созревших шишек, в том числе шишек, полученных в результате контролируемого опыления. Определяли сохранность шишек, их морфологию и структуру урожая. Анализ структуры урожая и семенной продуктивности проводили по методу Д.А. Сабинина (1971), разработанному для злаковых культур и модифицированному для хвойных (Минина, Третьякова, 1983). Учитывали следующие показатели строения женских шишек: длину и ширину шишки, число семенных чешуи (общее и развитых), число семян. Показатель семенной продуктивности определяли как выраженное в процентах отношение числа семян (А) к числу семенных чешуй (В), увеличенному вдвое. Весной 2010 года часть семян шишек кедра сибирского, полученных в результате контролируемого опыления 2008 года (16 вариантов, урожай 2009 года), высажены в грунт в теплицу на стационаре ИЛ СО РАН «Погорельский бор». Осенью того же года проведен учет всхожести семян, полученное значение выражено в процентах. В июне 2011 года измерена высота (см) проростков кедра сибирского.

Для изучения регенерационной способности «отцовских» деревьев-опылителей кедра сибирского из естественного древостоя Западного Саяна, в культуре in vitro в качестве экспланта использовали незрелые зиготические зародыши (Klimaszewska, Суг, 2002). Одну часть семян прежде помещения в культуру in vitro стратифицировали при температуре 4°С в течение одного месяца, другую часть вводили без обработки. Использовали две питательные среды: 'ALV (Litvay et al., 1985) и MS (Murashige and Skoog, 1962). Концентрация регуляторов роста на стадии инициации составляла 2 мг/л 2,4-Д и 1 мг/л 6-БАП, на стадии пролиферации содержание 6-БАП уменьшалось вдвое (0,5 мг/л). На протяжении срока пролиферации через каждые две недели проводились регулярные пересадки каплусной массы на свежую питательную среду. Для сравнения интенсивности прироста каллуса проводилось измерение его веса при пересадке (Белоруссова, Третьякова, 2008).

В ходе исследования (2004 - 2009 гг.) проведен подекадный расчет среднесуточной суммарной температуры и влажности воздуха за вегетационный период (май - сентябрь).

Просмотр микроскопических образцов проводили на микроскопе JIOMO МИКМЕД-6 (Россия). Фотографии микропрепаратов осуществляли при помощи цифрового фотоаппарата Olympus FE-5020 (Япония).

Статистическая обработка данных осуществлялась с помощью пакетов программ Microsoft Excel 2003 и STATISTICA 8.0 по стандартным методикам.

ГЛАВА 3. ОСОБЕННОСТИ ПОЛОВОЙ РЕПРОДУКЦИИ КЛОНОВ НА ПРИВИВОЧНОЙ ПЛАНТАЦИИ КЕДРА СИБИРСКОГО В ЗАПАДНО-САЯНСКОМ ОЛХ

На клоновой прививочной плантации первые макростробилы появились в 2004 году на отдельных раметах 14-летних клонов № 277/22 и 281/26. В 2005 году 12% клонов формировали макростробилы. Количество формирующихся макростробилов у одного и того же клона варьировало по годам. Например, у клона 277/22, в 2005 году - 48 шт., в 2006 году - 64 шт., в 2007 - 105 шт. макростробилов (табл. 1).

Таблица 1 -Урожай макростробилов у клонов кедра сибирского

Год Клон Количество

наблюдения макростробилов, шт.

2005 277/22 48

281/26 8

2006 277/22 64

281/26 68

2007 277/22 105

281/26 29

275/20 40

280/25 35

153/13 30

2008 277/22 76

281/26 61

153/13 138

002 107

145/4 87

2009 277/22 22

276/21 8

145/4 16

В течение 2006-2009 гг. размеры шишек при свободном опылении варьировали от 35,5 мм до 55,3 мм по длине и от 30,7 мм до 45,0 мм по ширине, при этом семенная продуктивность колебалась от 1,6% до 26,1%. Интересно отметить, что у одного и того же клона в разные годы формировались неодинаковые по размерам шишки. Так у клона 277/22 в 2006 году длина шишек достигала 50,4 мм, а ширина 40,6 мм, а в 2007 году размеры уменьшились до 35,5 мм по длине и 30,7 мм по ширине (табл. 2).

Формирование микростробилов на клоновой плантации впервые было зарегистрировано в 2006 году на нескольких раметах клона 281/26. В 2007 и 2008 годах пыление клонов на плантации было массовым - пылили 70% и 60% клоповых деревьев, соответственно.

Погодные условия 2006-2008 гг. были оптимальными для формирования макро- и микростробилов на клоновых деревьях, это характеризуется умеренным балансом температуры и влажности воздуха в течение вегетационного периода.

Таким образом, клоновый архив Западно-Саянского ОЛХ, в связи с наличием большого выбора клонов и способностью их регулярно формировать макро- и микростробилы в достаточном количестве, создает благоприятные условия для проведения исследований по контролируемому опылению и селекции кедра сибирского.

Таблица 2 - Структура урожая женских шишек, полученных в результате

Год сбора Номер Длина Ширина Число Семенная

клона шишки, мм шишки, мм семян, щт. продуктивность, %

2006 277/22 50,4±6,1 40,6±3,7 20,8±7,4 17,5±2,4

7,9 6,5 32,8 34,8

281/26 48,7±5,8 35,0±4,7 10,7±6,2 7,5±1,4

14,3 9,4 24,7 28,5

277/22 35,5±3,3 30,7±6,1 12,8±1,7 10,7±1,0

20,1 27,4 27,6 27,7

280/25 50,2±7,5 35,9±4,0 32,9±5,9 23,8±5,5

23,1 24,2 17,8 22,9

2007 281/26 50,0±7,3 35,3±5,6 33,7±5,8 26,1 ±3,0

21,1 22,7 23,4 27,3

282/27 50,2±8,2 38,2±4,6 22,2±8,2 18,3±5,7

21,4 25,0 21,1 28,6

285/31 55,7±9,0 40,2±3,9 52,9±9,4 24,8±7,1

21,5 26,9 20,7 24,6

320/51 55,3±2,4 45,0±4,0 57,0±9,3 22,8±9,6

26,5 23,8 23,1 27,2

275/20 48,7±6,4 36,9±3,7 8,5±5,7 8,5±4,7

5,1 6,5 9,9 17,4

277/22 43,8±4,8 43,0±5,5 14,8±7,4 15,4±7.7

5,6 2,1 24,3 18,5

145/4 39,1±1,3 37,6±1,5 9Л±2,2 11,4±3,0

2,7 1,9 22,0 16,1

2009 153/13 44,1±5,5 39,2±3,4 16,6±6,6 17,2±6,0

3,6 2,4 11,3 7,6

280/25 42,3±1,1 38,7±4,4 2,0±1,0 1,6±1,3

2,5 4,9 53,0 56,4

281/26 54,5±4,0 40,5±1,3 14,0±9,5 14,8±9,9

3,7 6,2 19,8 23,7

002 39,0±9,2 34,0±7,2 12,0±9,2 10,2±7,7

5,1 3,7 12,7 17,5

ГЛАВА 4. КАЧЕСТВО ПЫЛЬЦЫ ДЕРЕВЬЕВ-ОПЫЛИТЕЛЕЙ КЕДРА

СИБИРСКОГО

Пыление клоновых деревьев наблюдалось 6-9 июня 2005, 9-12 июня 2006, 6-8 июня 2007, 9-10 июня 2008 и 11-12 июня 2009 гг. при суммарных эффективных температурах 316-335 град/дней.

Образовавшиеся впервые в 2006 году на клоновой плантации микростробилы у клона 281/26 формировали пыльцу, не отличающуюся по размерам от пыльцы деревьев из естественного древостоя (табл. 3).

Таблица 3 - Морфометрические показатели пыльцы клонов и деревьев из естественного древостоя (над чертой - max - min, под чертой - среднее), мкм

Год Вариант Тело пыльцевого Воздушные мешки

исследования зерна

длина ширина длина ширина

2006 Естественный 44,8-51,3 42,6-55,5 35,3-43,8 18,7-32,7

древостой 48,6 49,5 40,1 23,8

Клоновая 48,9±2,1 48,7±2,3 44,4±2,43 26,0±1,8

плантация/

клон 281/26

2007 Естественный 50,1 -59,0 35,2-55,5 29,9-43,5 17,1-26,9

древостой 55,1 44,4 37,0 22,1

Клоновая 33,4-43,7 15,8-36,4 31,0-43,0 19,8-26,7

плантация 36,4 25,8 35,3 22,5

2008 Естественный 51,8-58,8 35,3-54,3 28,9-44,6 15,2-28,0

древостой 55,0 43,8 37,0 22,0

Клоновая 34,7-44,8 14,7-39,2 31,4-44,1 19,9-27,7

плантация 36,2 28,1 32,9 22,0

2009 Естественный 45,1 -67,5 33,3 -45,8 46,7-68,5 33,3-46,1

древостой 56,3 39,3 59,5 41,7

Клоновая 44,0±0,7 29,7±0,6 57,8±0,6 34,0±0,7

плантация/

клон 284/29

Однако в 2007 и 2008 гг. пыльца клоновых деревьев оказалась меньше по размерам тела пыльцевого зерна, в сравнении с пыльцой деревьев из естественного древостоя (№ 492, 476, 277, кш2 и 106). Пыльца деревьев, использованная в контролируемом опылении, из естественного древостоя в 2007 и 2008 году между собой мало различалась по морфометрическим параметрам (табл. 3).

Гистохимический тест на содержание крахмала в пыльцевых зернах деревьев из естественного древостоя и клонов показал, что наполненность

крахмалом пыльцевого зерна варьировала от 60 до 85%, что свидетельствовало о высокой жизнеспособности пыльцевых зерен.

Таблица 4 - Прорастание пыльцы и длина пыльцевых трубок (над чертой -max - min, под чертой - среднее)

Год исследования Насаждение Процент проросшей пыльцы, % Длина пыльцевых трубок, мкм

2006 Естественный древостой 75,4-96,8 83,6 105,1 - 164,9 135,9

Клоновая плантация/ клон 281/26 56,9±1,3 153,6±8,4

2007 Естественный древостой 70,3-95,1 77,7 115,1- 158,8 138,4

Клоновая плантация 3,0-90,0 37,2 14,8-154,7 67,9

2008 Естественный древостой 71.8-81,0 78,0 115,1 - 153,7 128,4

Клоновая плантация 2.8 - 80.9 28,5 22,1 - 120,4 50,2

2009 Естественный древостой 39,0-60,0 49,0 48,4-57.1 53,8

Клоновая плантация/ клон 284/29 11,0±2,5 60,4±6,9

Процент прорастания пыльцы деревьев из естественного древостоя оказался высоким в 2006-2008 гг., однако в 2009 году, произошло снижение этого показателя до 49%. Длина пыльцевых трубок также варьировала по годам. В 2006-2008 гг. длина пыльцевых трубок оказалась высокой и составляла от 128 до 138 мкм, но в 2009 году она снизилась до 53,8 мкм. Показатели прорастания и длины пыльцевых трубок у клонов в 2006 году были близки к аналогичным показателям деревьев из естественного древостоя. Однако в последующие годы только половина пыльцы клонов прорастала, при этом средние показатели прорастания были низкими, а формирующиеся пыльцевые трубки были короткими (табл. 4).

Таким образом, для проведения гибридизационных работ на молодой клоновой прививочной плантации целесообразно использовать пыльцу плюсовых деревьев из естественного древостоя.

ГЛАВА 5. РЕПРОДУКТИВНЫЙ ПОТЕНЦИАЛ ГИБРИДНОГО ПОТОМСТВА КЕДРА СИБИРСКОГО, ПОЛУЧЕННОГО В РЕЗУЛЬТАТЕ КОНТРОЛИРУЕМОГО ОПЫЛЕНИЯ НА КЛОНОВОЙ ПРИВИВОЧНОЙ ПЛАНТАЦИИ

За период исследования было проведено два одинаковых варианта контролируемого опыления: 277/22 х 277 (вариант самоопыления) и 277/22 х 106 (вариант с пыльцой дерева-акселерата). В варианте опыления 277/22 х 106 самые крупные шишки формировались в 2006 году (длина составляла 68,4±9,4 мм, ширина 45,8±4,5 мм); в этом же варианте опыления в 2009 году размеры шишек были значительно меньше, длина их достигала только 49,8±9,3 мм, а ширина 47,1±5,8 мм. В варианте самоопыления 277/22 х 277 наиболее крупные шишки также формировались в 2006 году, длина таких шишек была 79,3±7,6 мм и ширина 52,3±4,8 мм; в 2009 году размеры шишек также оказались снижены (длина 54,7±6,4 мм и ширина 49,0±9,3 мм). Семенная продуктивность женских шишек в варианте 277/22 х 106 варьировала в течение трех лет от 35,9% (2006 год) до 50,5% (2007 год) и снизилась до 27,0% в 2009 году. В варианте самоопыления 277/22 х 277 семенная продуктивность шишек также была нестабильной, она достигала 30,9% в 2006 году, 46,1% в 2007 году и в 2009 году снизилась до 14,3% (рис. 1). Наиболее крупные шишки формировались в 2006 году в варианте опыления 277/22 х 492, длина их составляла 81,0 мм, ширина 46,5 мм, при этом семенная продуктивность достигала 42,7% (рис. 1). Доля полнозернистых семян в урожае двухлетних шишек 2006 года у всех вариантов контролируемого опыления составляла 100%.

В 2006 году контролируемое опыление было проведено на 6 «материнских» клонах, в качестве опылителей использовали пыльцу 5 деревьев. Длина образовавшихся шишек варьировала у разных клонов от 30 мм до 80 мм (в среднем 71,1 мм); ширина от 35 мм до 56 мм (в среднем 43,9 мм). Семенная продуктивность колебалась от 18,3% до 71,5%, в среднем 52,5% (рис. 1). В варианте самоопыления, проведенного на двух клонах (277/22 и 281/26), формировались крупные шишки: длина шишек составляла 64,0 мм и 69,2 мм; ширина 45,4 мм и 43,5 мм, соответственно. Семенная продуктивность в вариантах самоопыления составила 46,1% и 52,0%, соответственно (рис. 1). У клонов, опыленных пыльцой дерева-акселерата № 106, размеры шишек варьировали от 47,3 мм до 71,2 мм, ширина от 32,0 мм до 52,1 мм. Семенная продуктивность таких шишек оказалась высокой и варьировала от 47,8% до 58,6% (рис. 1). Доля полнозернистых семян в урожае двухлетних шишек 2007 года у всех вариантов контролируемого опыления составляла 90%.

В 2008 году на клоповой плантации было проведено контролируемое опыление на 7 «материнских» клонах, в качестве опылителей использовали 3 дерева (деревья № 106, 357 и кш2), кроме того на каждом клоне был проведен вариант самоопыления. 2009 год отличался высоким урожаем двухлетних женских шишек на клоповой плантации, при этом размеры их

12

уменьшились по сравнению с предыдущими годами. Длина шишек варьировала от 39 мм до 70 мм (среднее 50,8 мм); ширина от 32 мм до 54 мм (среднее 43,1 мм). Семенная продуктивность гибридных шишек (рис. 1) варьировала от 4,9% до 31,2% и в среднем составила только 16,3%. Доля полнозернистых семян в урожае двухлетних шишек 2009 года составляла 95%.

2 ш О

60 50 40 30 20 10 О

■

277/22x106 277/22x277 277/22x492 281/26 x492 Варинт опыления

2007

277/22 277/22 280/25 281/26 281/26 282/27 282/27 282/27 285/31 320/51 х 277 х 106 х 106 х 106 х х492 хкш2 х476 х106 х106 281/26 Вариант опыления

2009

л

Вариант опы л енгия

Рисунок 1 - Семенная продуктивность женских шишек урожая 2006, 2007 и 2009 гг., полученных в результате контролируемого опыления клонов в 2005, 2006 и 2008 гг.

Внутри клона наблюдалась значительная вариабельность в зависимости от использованной пыльцы дерева-опылителя (рис. 1). У клонов, обработанных пыльцой аномального кедра (№ 106) и пыльцой плюсовых деревьев (№ 277, 357 и кш2), размеры шишек и способность их формировать семена оказались увеличенной, по сравнению с вариантом свободного опыления (табл. 2).

В варианте самоопыления четырех клонов (277/22, 275/20, 153/13 и 145/4) размеры шишек и их семенная продуктивность не отличались от других вариантов контролируемого опыления. Семенная продуктивность шишек в варианте самоопыления составляла 14,3% для клона 277/22, 13,4% для клона 275/20, 14,2% для клона 153/13 и 20,8% для клона 145/4.

Заслуживает внимания вариант контролируемого опыления клонов пыльцой дерева с однолетним циклом развития женской шишки (№ 106). При опылении пыльцой данного дерева размеры женских шишек не отличались от других вариантов контролируемого опыления и варьировали по длине от 42 до 71 мм, по ширине от 32 до 52 мм. Семенная продуктивность шишек, в основном, не отличалась, а в ряде случаев превышала результаты других вариантов контролируемого опыления и достигала 37% (у клона 280/25).

Следует отметить, что в основном между размерами женских шишек у клонов кедра сибирского и способностью их продуцировать семена корреляции не наблюдалось (г=0,28).

Рисунок 2 — Масса 1000 семян гибридных шишек урожая 2009 года

Масса 1000 семян у клонов (рис. 2), опыленных пыльцой плюсовых деревьев, варьировала от 194,7 г (вариант опыления - 275/20 х кш2) до 422,8 г (вариант самоопыления - 275/20). При опылении пыльцой дерева № 106 масса 1000 семян составляла высокую величину, и варьировала от 201,6 г до 326,6 г у разных клонов, подвергнутых контролируемому опылению. При самоопылении клона 280/25 масса 1000 семян достигала также большой

величины - 278,6 г. В других вариантах самоопыления (клон 145/4), масса оказалась значительно ниже-210,1 г. При низкой семенной продуктивности женских шишек (клон 275/20, вариант самоопыления) масса 1 ООО семян составляла большую величину. В варианте опыления 280/25 х 106 при высокой семенной продуктивности формировались крупные семена. Следует отметить, что при опылении пыльцой дерева № 106 семенная продуктивность и качество продуцируемых семян во многих вариантах контролируемого опыления оказалась выше по сравнению с другими вариантами (рис. 2).

Вариант опыления

Рисунок 3 - Высота сеянцев кедра сибирского (см), 2011 год

В результате высадки гибридных семян кедра сибирского в теплицу показано, что грунтовая всхожесть в разных вариантах контролируемого опыления колебалась от 20 до 100%. Наиболее высокие показатели всхожести семян и сохранности сеянцев отмечены в вариантах контролируемого опыления у клонов 277/22, 280/25 и 145/4 при опылении их пыльцой кедра-акселерата (№ 106) с однолетним генеративным циклом развития и в варианте самоопыления, при этом всхожесть сеянцев достигала 100%. Интенсивность роста сеянцев клонов кедра сибирского значительно варьировала. Наиболее слабый рост сеянцев отмечен у потомства клона 275/20 (высота сеянцев составляла 3,8-4,6 см), а наиболее интенсивный рост сеянцев - у клона 277/22 (высота сеянцев составляла 6,0-6,8 см). Выявилось, что потомство сеянцев, полученное в результате контролируемого опыления клонов пыльцой дерева-акселерата, не отличалось по интенсивности роста от других опытных вариантов (клон 277/22 - 6,1 см) или составило меньшую величину (клона 280/25, 153/13 и 145/4 - 4,2-4,7 см). Заслуживает внимания тот факт, что самоопыление клонов положительно сказалось на росте сеянцев. Высота сеянцев у клонов 277/22, 280/25 и 145/4 превышала высоту других опытных вариантов на 60-70% (рис. 3).

Таким образом, в результате контролируемого опыления были получены шишки с удовлетворительными показателями семенной продуктивности. Семена таких шишек оказались крупными, полнозернистыми и продуцировали сеянцы с высокими показателями роста.

ГЛАВА 6. РЕГЕНЕРАЦИЯ КЕДРА СИБИРСКОГО В КУЛЬТУРЕ

IN VITRO

Для выявления регенерационной способности кедра сибирского, проводилось введение в культуру in vitro зародышей семян «отцовских» деревьев-опылителей из естественного древостоя Западного Саяна. В результате было показано, что инициация каллусной массы активно происходила из незрелых зиготических зародышей на средах MS и 'ЛLV с явным преимуществом на среде 'ЛЬV (рис. 4). Полученный каллус в течение 7 мес. поддерживался на данных средах без потери пролиферационной активности. Наибольший прирост каллусной массы на стадии инициации был отмечен у дерева № 476, где вес каллуса составлял 467 мг. В конце стадии инициации при пересадке на среду 'ЛЬУ с уменьшенным вдвое содержанием фитогормонов процесс пролиферации шел также быстрым темпом.

О инициация * пролиферация

Вариантэкспланта

Рисунок 4 - Динамика роста каллуса кедра сибирского на среде 'ЛЬV на стадиях инициации (5 недель) и пролиферации (7 недель)

Выявлено, что выдержанные в течение месяца семена кедра сибирского при температуре 4°С показали активный рост каллусной культуры, который происходил на средах М8 и 'ЛЬУ. Во время инициации вес каллусной массы у эксплантов без обработки холодом составил 300 мг, а у подвергнутых холодовой обработке - 333 мг. Во время пролиферации у первых эксплантов вес увеличился до 410 мг, а прошедших стратификацию - до 730 мг. Вероятно, обработка эксплантов пониженными температурами стимулирует рост каллусной культуры.

Таким образом, обнаруживается значительное влияние генотипа донорского дерева кедра сибирского на рост каллуса. Отмечено, что семена

кедра сибирского перед введением зародышей в культуру in vitro требуют обязательной стратификации, что увеличивает рост каллусной массы.

ВЫВОДЫ

1. Генеративные органы клонов на прививочной плантации кедра сибирского Западно-Саянского OJ1X закладываются с 14-летнего возраста.

2. Пыльца кедра-акселерата с однолетним циклом развития женской шишки и плюсовых деревьев из естественного древостоя, используемая в контролируемом опылении, характеризуется высокой жизнеспособностью (70-85%). Пыльца, продуцируемая клоновыми деревьями кедра сибирского в 15-17-летнем возрасте, оказалась низкого качества.

3. Пыльца, используемая в контролируемом опылении, в том числе и дерева с однолетним циклом развития женской шишки, не оказала влияния на морфогенез и семенную продуктивность женских шишек.

4. При большом урожае макростробилов в одних и тех же вариантах контролируемого опыления формировались мелкие шишки с низкой семенной продуктивностью (2009 год), тогда как при низком урожае макростробилов, формировались крупные шишки с высокой семенной продуктивностью (2006-2007 гг.).

5. Контролируемое опыления клонов пыльцой дерева с однолетним циклом развития женской шишки и плюсовых деревьев оказало положительное влияние на семенную продуктивность сформировавшихся двухлетних шишек, по сравнению с вариантами свободного опыления. Выявлены комбинации родительских пар, дающие высокопродуктивное потомство: 277/22 х 106, 277/22 х 357, 277/22 х 492, самоопыление 277/22, 280/25 х 106, самоопыление 280/25, 153/13 х 106, 145/4 х 106 и самоопыление 145/4.

6. Получено интенсивно растущее потомство от контролируемого опыления пыльцой кедра-акселерата, которое является ценным материалом для изучения уникального природного явления, связанного с аномальным генеративным циклом развития в системе рода Pinus.

7. Зиготические зародыши кедра сибирского из естественного древостоя in vitro способны формировать каплусную культуру. Активное образование каллуса происходило на среде '/2LV при предварительной обработке эксплантов низкими положительными температурами.

РАБОТЫ, ОПУБЛИКОВАННЫЕ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:

Статьи в журналах, рекомендованных ВАК:

1. Третьякова И.Н. Перспективы применения методов биотехнологии для размножения генетически ценных форм лесных древесных видов хвойных/ И.Н. Третьякова, A.C. Белоруссова, Н.Е. Носкова, С.С. Савельев. Н.В. Лукина, A.B. Барсукова, М.В. Ижболдина, Ю.А. Череповский // Хвойные бореальные зоны,- XXIV, № 2-3, 2007. - С.309-317.

2. Савельев С.С. Качество пыльцы кедра сибирского (Pinns sibirica (Pinaceae) на клоновой прививочной плантации в Западно-Саянском опытном лесном хозяйстве / С.С. Савельев, И.Н. Третьякова, Е.В. Ворошилова, Ю.А. Череповский // Хвойные бореальные зоны.- XXV, № 3-4, 2008. - С.295-299.

3. Савельев С.С. Особенности половой репродукции клоновой прививочной плантации кедра сибирского в Западно-Саянском OJIX / С.С. Савельев, И.Н. Третьякова // Вестник КрасГАУ,- № 8, 2011. - С. 109-111.

Публикации в других научных изданиях:

4. Новоселова Н.В. Особенности эмбрионального развития сосны кедровой сибирской с однолетним циклом развития женских шишек in vivo и в культуре in vitro / H.B. Новоселова, С.С. Савельев // Материалы Школы молодых ученых "Эмбриология и биотехнология", СПб, 2005. - С. 48.

5. Третьякова И.Н. Особенности формирования эмбриональных клеток и соматических зародышей лиственницы сибирской и сосны сибирской в культуре in vitro / И.Н. Третьякова, A.C. Белоруссова, С.С. Савельев, Н.В. Новоселова, A.B. Лукина // Материалы Четвертой Российской конференции «Флора и растительность Сибири и Дальнего Востока», Т. 2, Красноярск, 2006. - С.259-263.

6. Третьякова И.Н. Биотехнология получения эмбрионально-суспензорной массы и соматических зародышей лиственницы сибирской (Larix sibirica) и сосны сибирской (Pinns sibirica) в культуре in vitro / И.Н. Третьякова, A.C. Белоруссова, С.С. Савельев, A.B. Лукина, М.В. Ижболдина // Вестник биотехнологии и физико-химической биологии им. Ю.А. Овчинникова, Т. 2, № 4, 2006. - С. 58-59.

7. Савельев С.С. Инициация соматического эмбриогенеза у Pinns sibirica / С.С. Савельев // Материалы конференции молодых ученых «Исследования компонентов лесных экосистем», выпуск 7, ИЛ СО РАН, 2006 - С.72-74.

8. Савельев С.С. Особенности формирования соматических зародышей гибридных семян сосны кедровой сибирской в культуре in vitro / С.С. Савельев. A.B. Лукина, И.Н. Третьякова // Материалы Четвертого съезда общества биотехнологов России им. Ю.А Овчинникова, Пущино 6-7 декабря, 2006. - С. 222-223.

9. Третьякова И.Н. Биотехнология получения эмбрионально-суспензорной массы и соматических зародышей лиственницы сибирской и сосны сибирской в культуре in vitro/И.Н. Третьякова, A.C. Белоруссова, С.С. Савельев, A.B. Лукина, М.В. Ижболдина // Материалы Четвертого съезда общества биотехнологов России им. Ю.А Овчинникова, Пущино 6-7 декабря, 2006,-С. 264-266.

10. Савельев С.С. Получение соматических зародышей Piñus sibirica в культуре in vitro / С.С. Савельев, A.B. Лукина, И.Н. Третьякова //

Материалы I (IX) Международной Конференция молодых ботаников, СПб, 2006.-С. 194.

11. Третьякова И.Н. Цитоэмбриологическое исследование эмбрионально-суспензорной массы и соматических зародышей у сибирских видов хвойных в культуре in vitro / И.Н. Третьякова, A.C. Белоруссова, С.С. Савельев, A.B. Лукина // Сборник научно-популярных статей «Современные микроскопические исследования в биологии и медицине», М.: Лабора, 2006. -С. 31-33.

12. Третьякова И.Н. Соматический эмбриогенез у сибирских видов хвойных в культуре in vitro/ И.Н. Третьякова, A.C. Белоруссова, Н.Е. Носкова, С.С. Савельев, A.B. Лукина // Материалы конференции «Досягнення i проблеми генетики, селекцп та бютехнологп», посвященная 120-летию со дня рождения академика HAH Украины Н.И. Вавилова, Киев, Логос, 2007. - С. 580-584.

13. Третьякова И.Н. Биотехнология микроклонального размножения сибирских видов хвойных в культуре in vitro / И.Н. Третьякова, A.C. Белоруссова, A.B. Лукина, С.С. Савельев // Материалы докладов международной конференции «Современная физиология растений: от молекул до экосистем», Сыктывкар-Т. 3, 2007. - С. 212-214.

14. Савельев С.С. Репродуктивный потенциал сосны сибирской на клоновой плантации и в естественном древостое in vivo и в культуре in vitro / С.С. Савельев. A.B. Лукина, М.В. Ижболдина // Материалы конференции молодых ученых «Исследования компонентов лесных экосистем», выпуск 8, ИЛ СО РАН, 2007. - С.73-75.

15. Савельев С.С. Индукция эмбриогенного каллуса у гибридов сосны сибирской / Савельев С.С. // Материалы II Международной Школы молодых ученых «Эмбриология, генетика и биотехнология», 3-7 декабря, Уфа, 2007.-С.76-77.

16. Третьякова И.Н. Регуляция морфогенеза клеток при образовании соматических зародышей у сибирских видов хвойных / И.Н. Третьякова, A.C. Иваницкая, Н.Е. Носкова, С.С. Савельев. A.B. Барсукова, М.В. Ижболдина // Сборник научных трудов III Международной научной конференции «Теоретические и прикладные аспекты биохимии и биотехнологии растений», 14-16 мая 2008, Минск, 2008. - С. 328-332.

17. Савельев С.С. Характеристика пыльцы кедра сибирского (Pinus sibirica (Pinaceae) на клоновой прививочной плантации в Западно-Саянском опытном лесном хозяйстве / С.С. Савельев. Е.В. Ворошилова И Материалы III Международной школы молодых ученых «Эмбриология, генетика и биотехнология», 29 июня- 3 июля, Саратов, 2009. - С.88-91.

18. Третьякова И.Н. Перспективы плантационного лесовыращивания ■ хвойных при помощи современных методов селекции и биотехнологии (соматического эмбриогенеза)/ И.Н. Третьякова, A.C. Иваницкая, A.B. Барсукова, С.С. Савельев, A.C. Сиренко // Материалы Всероссийской конференции с участием иностранных ученых «Эколого-географические

аспекты лесообразовательного процесса», 23-25 сентября, Красноярск, 2009. - С.219-222.

19. Савельев С.С. Характеристика пыльцы кедра сибирского (Pinus sibirica (Pinaceae) на клоновой прививочной плантации в Западно-Саянском опытном лесном хозяйстве / С.С. Савельев, Е.В. Ворошилова // Материалы конференции молодых ученых «Исследования компонентов лесных экосистем Сибири», выпуск 10, ИЛ СО РАН, 2009. - С.49-52.

20. Третьякова И.Н. Сочетание классической селекции и применения современных методов биотехнологии для сохранения генофонда хвойных видов Сибири / И.Н. Третьякова, A.B. Барсукова, С.С. Савельев, A.C. Сиренко // Актуальные проблемы прикладной генетики, селекции и биотехнологии растений, сборник научных трудов, Т. 131, Ялта, 2009. - С.5-9.

21. Третьякова И.Н. Сочетание классической селекции и применения современных методов биотехнологии для сохранения генофонда хвойных видов Сибири / И.Н. Третьякова, A.B. Барсукова, С.С. Савельев // Материалы международной научной конференции, посвященной 200- летию Ч. Дарвина и 200- летию Никитского ботанического сада, «Актуальные проблемы прикладной генетики, селекции и биотехнологии растений», 3-6 ноября, Ялта, 2009.-С. 165.

22. Третьякова И.Н. Половая репродукция кедра сибирского при контролируемом опылении и его регенерационный потенциал в культуре in vitro / И.Н. Третьякова, С.С. Савельев, A.B. Лукина, Ю.А. Череповский // Материалы третьего международного совещания, посвященного международному году лесов, «Сохранение лесных генетических ресурсов Сибири», 23-29 августа, Красноярск, 2011. - С.138-139.

УОП ИЛ СО РАН Заказ № 57, тираж 100 экз.

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Савельев, Станислав Сергеевич, Красноярск

61 12-3/514

Учреждение Российской академии наук Отделение биологических наук РАН Институт леса им. В.Н. Сукачева Сибирского отделения РАН

На правах рукописи

Савельев Станислав Сергеевич

РЕПРОДУКТИВНЫЙ ПОТЕНЦИАЛ КЛОНОВ ПЛАНТАЦИИ СОСНЫ СИБИРСКОЙ (PINUS SIBIRICA DU TOUR) НА ЮГЕ

КРАСНОЯРСКОГО КРАЯ

03.02.01 - Ботаника

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор Третьякова И.Н.

Красноярск -2011

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ..........................................................................................................4

ГЛАВА 1. ОСОБЕННОСТИ ПОЛОВОЙ РЕПРОДУКЦИИ КЕДРА СИБИРСКОГО.............................................................................................................8

1.1 Дендрологическая характеристика кедра сибирского...................................8

1.2 Половая репродукция растений рода Ртш..................................................10

1.3 Развитие женского гаметофита, оплодотворение и эмбриогенез у кедра сибирского..............................................................................................................12

1.4 Развитие мужского гаметофита у кедра сибирского...................................15

1.5 Особенности семеношения кедра сибирского..............................................19

1.6 Особенности половой репродукции кедра с однолетним циклом развития женской шишки......................................................................................................23

1.7 Контролируемое опыление у хвойных..........................................................25

1.8 Микроклональное размножение хвойных....................................................30

ГЛАВА 2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ...............................38

2.1. Характеристика района исследования..........................................................38

2.2 Характеристика «отцовских» деревьев из естественного древостоя и клоновых деревьев кедра сибирского..................................................................39

2.3 Методика контролируемого опыления кедра сибирского..........................44

2.4 Определение сохранности шишек и особенностей их морфогенеза..........47

2.5 Расчет структуры урожая и семенной продуктивности кедра сибирского 48

2.6 Анализ качества пыльцы.................................................................................49

2.7 Микроклональное размножение кедра сибирского.....................................52

ГЛАВА 3. ОСОБЕННОСТИ ПОЛОВОЙ РЕПРОДУКЦИИ КЛОНОВ НА

ПРИВИВОЧНОЙ ПЛАНТАЦИИ КЕДРА СИБИРСКОГО В ЗАПАДНО-

САЯНСКОМ ОЛХ....................................................................................................55

ГЛАВА 4. КАЧЕСТВО ПЫЛЬЦЫ ДЕРЕВЬЕВ-ОПЫЛИТЕЛЕЙ КЕДРА СИБИРСКОГО...........................................................................................................64

ГЛАВА 5. РЕПРОДУКТИВНЫЙ ПОТЕНЦИАЛ ГИБРИДНОГО ПОТОМСТВА КЕДРА СИБИРСКОГО, ПОЛУЧЕННОГО В РЕЗУЛЬТАТЕ КОНТРОЛИРУЕМОГО ОПЫЛЕНИЯ НА КЛОНОВОЙ ПРИВИВОЧНОЙ

ПЛАНТАЦИИ............................................................................................................86

5.1 Эксперименты по контролируемому опылению 2005 года........................86

5.2 Эксперименты по контролируемому опылению 2006 года........................90

5.3 Эксперименты по контролируемому опылению 2007 года........................97

5.4 Эксперименты по контролируемому опылению 2008 года......................100

5.5 Сравнение структуры урожая и семенной продуктивности шишек двух

вариантов контролируемого опыления за период исследования...................111

5.6 Выращивание гибридных семян ex situ.......................................................115

ГЛАВА 6. РЕГЕНЕРАЦИЯ КЕДРА СИБИРСКОГО В КУЛЬТУРЕ IN

VITRO........................................................................................................................117

ЗАКЛЮЧЕНИЕ................................................................................................119

ВЫВОДЫ.........................................................................................................120

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ...............................................................................122

ПРИЛОЖЕНИЕ 1............................................................................................142

ПРИЛОЖЕНИЕ 2............................................................................................143

ВВЕДЕНИЕ

Несмотря на разноплановые исследования генеративных органов сосны сибирской (кедра сибирского, Pinus sibirica Du Tour) — выявление закономерностей формирования урожаев (Некрасова, 1972; Ирошников, 1985; Воробьев, 1979; Горошкевич, 2008), изучение физиологических процессов, лежащих в основе формирования генеративных структур (Минина, Ларионова, 1979), цитоэмбриологических исследований, (Третьякова, 1990), многие аспекты репродукции данного вида остаются не решенными. Между тем, репродуктивные процессы кедра сибирского имеют ряд особенностей, отличающих его от других представителей хвойных, произрастающих на территории Сибири:

• длительный генеративный цикл (2,5 года);

• незавершенность прохождения эмбриогенеза (семена требуют длительной стратификации в течение четырех-семи месяцев);

• встречаемость в популяции уникальных особей кедров-акселератов, шишки которых созревают за 2,5 месяца (вместо двух лет) и формируют семена без зародыша (Ирошников, 1974; Минина, Ларионова, 1979; Третьякова, 1990).

Изучение репродуктивного потенциала кедра сибирского является одной из основных проблем, направленных на сохранение его генофонда. Эта проблема может быть решена сочетанием классических методов селекции, таких как искусственный отбор высокоурожайных форм, контролируемое опыление, получение хозяйственно ценных гибридов с современными методами биотехнологии, позволяющими осуществить массовое размножение улучшенных сеянцев данного вида.

ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ

Определение репродуктивного потенциала клонов кедра сибирского и выявление его регенерационной способности при контролируемом опылении ех situ и в культуре in vitro.

ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ

1. Исследовать половую репродукцию клонов прививочной плантации кедра сибирского на юге Красноярского края;

2. Провести сравнительный анализ пыльцы клонов и деревьев кедра сибирского из естественного древостоя, используемых в качестве опылителей;

3. Выявить структуру урожая, семенную продуктивность женских шишек и качество семян, полученных в результате свободного и контролируемого опыления у клонов кедра сибирского;

4. Оценить семенное потомство кедра сибирского, полученного в результате контролируемого опыления на способность к прорастанию и росту;

5. Индуцировать получение каллусных культур из зародышей семян кедра сибирского в культуре in vitro.

Защищаемые положения

1. Полученное в результате контролируемого опыления пыльцой кедра-акселерата жизнеспособное потомство предоставляет возможность изучить уникальное природное явление, связанное с аномальным генеративным циклом развития в системе рода Pinus.

2. Использование в качестве опылителя пыльцы дерева с однолетним циклом развития женской шишки, позволяет получить семенное потомство, которое можно успешно использовать в лесосеменной практике.

Научная новизна

Впервые проведено контролируемое опыление деревьев клонового архива кедра сибирского в Западном Саяне, в том числе пыльцой уникального дерева с однолетним циклом развития женской шишки. Выявлены комбинации родительских пар, дающие высокопродуктивное потомство. Впервые ex situ было получено селективное потомство в результате контролируемого опыления пыльцой кедра-акселерата с однолетним циклом развития женской шишки и самоопыления. Впервые получен каллус из незрелых зародышей семян «отцовских» деревьев-опылителей кедра сибирского из естественного древостоя Западного Саяна.

Теоретическое и практическое значение

Получены новые данные по влиянию пыльцы уникальных форм деревьев кедра сибирского с однолетним циклом развития женской шишки на репродуктивную способность клонов кедра сибирского. Рекомендованы варианты контролируемого опыления, которые могут быть использованы в селекционных программах. Разработаны методы биотехнологии получения каллусных культур кедра сибирского.

Апробация результатов

Основные результаты исследований представлены на следующих региональных, всероссийских и международных конференциях: школа молодых ученых "Эмбриология и биотехнология" (Санкт-Петербург, 2005); IV Российская конференция «Флора и растительность Сибири и Дальнего Востока» (Красноярск, 2006); конференция молодых ученых «Исследования компонентов лесных экосистем Сибири» (Красноярск, 2006, 2007 и 2009); IV съезд общества биотехнологов России им. Ю.А Овчинникова (Пущино, 2006); I (IX) международная конференция молодых ботаников (Санкт-Петербург, 2006); конференция «Досягнення i проблеми генетики, селекци та бютехнологп», посвященная 120-летию со дня рождения академика HAH Украины Н.И. Вавилова (Киев, 2007); международная школа молодых ученых «Эмбриология, генетика и биотехнология» (Уфа, 2007 и Саратов, 2009); II международное совещание по сохранению лесных генетических ресурсов Сибири «Генетические основы устойчивости и продуктивности древесных растений в связи с антропогенным воздействием и глобальным изменением климата» (Новосибирск, 2009); всероссийская конференция с участием иностранных ученых «Эколого-географические аспекты лесообразовательного процесса» (Красноярск, 2009); международная научная конференция «Актуальные проблемы прикладной генетики, селекции и биотехнологии растений» (Ялта, 2009); III международное совещание «Сохранение лесных генетических ресурсов Сибири», посвященное международному году лесов (Красноярск, 2011).

Диссертационная работа выполнена при финансовой поддержке Интеграционного проекта СО РАН № 53, грантов РФФИ № 06-04—08040-офи, 07-04-96810-р_енисей_а, 08-04-00107-а, 09-04-98008-р_сибирь_а, 09-04-10023-к, 10-04-10026-к, ККФН 18С043 и проекта СФУ 1.7.09 федерального агентства по образованию.

Публикации

По результатам исследования опубликованы 22 работы, в том числе три в журналах, рекомендованных ВАК РФ.

Объем и структура работы

Диссертация состоит из введения, шести глав, заключения, выводов, списка литературы и приложения. Работа изложена на 143 страницах, содержит 27 рисунков и 33 таблицы. Библиографический список включает 179 источников литературы, 55 из которых на иностранном языке.

Благодарности

Автор выражает глубокую благодарность научному руководителю д.б.н., профессору И.Н. Третьяковой за ценные советы в работе над диссертацией. Кроме того, автор признателен директору Государственного предприятия Красноярского края «Красноярское управление лесами, Ермаковский филиал, Даурское подразделение» Ю.А. Череповскому за предоставленную возможность проведения экспериментальных работ на клоновых архивах кедра сибирского в Западно-Саянском ОЛХ и зам. директора Западно-Саянского ОЛХ В.Ю. Череповскому за помощь в проведении работ по гибридизации.

ГЛАВА 1. ОСОБЕННОСТИ ПОЛОВОЙ РЕПРОДУКЦИИ КЕДРА СИБИРСКОГО

1.1 Дендрологическая характеристика кедра сибирского

Таксономическое положение кедра сибирского: царство - Eukaryota, подцарство - Plantae, отряд - Pinophyta, класс - Pinopsida, порядок - Pinales, семейство — Pinaceae, род - Pinus, вид — Pinus sibirica Du Tour (Price et al., 1998).

Кедр сибирский, сосна сибирская {Pinus sibirica Du Tour) - вечнозелёное дерево, достигающее 35-44 метров в высоту и 1,8 метра в диаметре ствола. Максимальная продолжительность жизни 800-850 лет.

Этот вид отличается густой, часто многовершинной кроной с толстыми сучьями. Ствол буро-серый, у старых деревьев образует трещиноватую чешуйчатую кору. Ветвление мутовчатое. Побеги последнего года коричневые, покрыты длинными рыжими волосками. Хвоя тёмно-зелёная с сизым налётом, длиной 6-14 сантиметров, мягкая, в разрезе трёхгранная, слегка зазубренная, растёт пучками, по пять хвоинок в пучке. Дерево относится к теневыносливым видам (Красноборов, 1976).

Корневая система состоит из короткого стержневого корня, от которого отходят боковые корни. Боковые корни оканчиваются мелкими корневыми волосками, на концах которых развивается микориза. На хорошо дренированных, особенно лёгких по механическому составу почвах при коротком стержневом корне (до 40-50 сантиметров) у кедра развиваются мощные якорные корни, проникающие на глубину до 2-3 метров. Якорные корни вместе с прикорневыми лапами обеспечивают устойчивость мощного ствола и кроны. Древесина кедра мягкая, с приятным запахом, высоко ценится, применяется, в частности, для производства карандашей (Воробьев, 1983; Поликарпов и др., 1986).

Вегетационный период у кедра очень короткий (40-45 дней). По этой причине его можно отнести к медленнорастущим видам.

Кедр сибирский - однодомное, раздельнополое растение. Растение анемофильное. Мужские шишки (микростробилы) собраны у основания побега (прироста текущего года), женские шишки (макростробилы) образуются на концах ростовых побегов, когда последние заканчивают свой рост, возле верхушечной почки. Микростробилы на своей оси несут микроспорофиллы, более крупные у основания, чем у вершины. На оси женских шишечек размещены кроющие чешуи. В их пазухах находятся семенные чешуи с двумя семяпочками. Семенные чешуи у основания шишек также более крупные, чем у вершины (Некрасова, 1972; Горошкевич, 1996 б, 2008).

Зрелые женские шишки кедра сибирского крупные, вытянутые, яйцевидной формы, сначала фиолетовые, а затем коричневые, по диаметру они достигают 5-8 см, по длине до 13 см. Шишки вызревают в течение 14-15 месяцев. Каждая шишка содержит от 30 до 150 семян. Семена крупные, без крыльев. Плодоносить кедр начинает в среднем в возрасте 60 лет, иногда и позже. С одного дерева можно получить до 12 кг чистого ореха. Кедровые орехи - ценный пищевой продукт, могут употребляться в пищу как в сыром виде, так и после термообработки. По количеству фосфатидного фосфора кедровые орехи превосходят все другие виды орехов и семена масличных культур и равноценны сое - наиболее богатому источнику лецитина среди растительного сырья (Николаева и др., 1999; Feirer, 1995; Ireland, 1999).

Кедр сибирский распространён в Западной Сибири от 48 до 66° с.ш., в Восточной Сибири и на Урале. На запад от Урала распространяется лишь до Тиманского кряжа. В Центральном Алтае верхняя граница распространения кедра сибирского лежит на высоте 1900-2000 м над уровнем моря, а в южных районах она поднимается до высоты 2400 метров. Кедр сибирский растет также и на территории Монголии и Северного Китая. Также встречается и в горах Сихотэ-Алинь (наряду с корейским кедром) (Critchfield, 1966; Авров, 2000, 2001).

1.2 Половая репродукция растений рода Ртт

Женская шишка кедра сибирского, как и других видов рода Ртт, рассматривается как образование, происходящее эволюционно от спороносного колоска разноспоровых архегониальных растений. Их ископаемые предки -Psilophytales, перешедшие от водного к наземному образу жизни, уже имели спорангии на концах вертикально направленных веток, отходящих от горизонтального корневища. К происшедшим от них папоротникообразным {Р1епс1ор$1(1а) относятся папоротники, голосемянные и покрытосемянные (Р1еп(1орку1а - Сутпозрегтае и Ащюярегтае), характеризующиеся тем, что основным поколением у них является спорофит (Тахтаджян, 1978).

Из древесных растений семейства сосновых только род Ртш, представителем которого является кедр сибирский (сосна сибирская), имеет женские шишки с двухлетним циклом внепочечного развития. Шишки первого года жизни характеризуются интенсивно идущим формированием семяпочек, в них происходит макроспорогенез и развивается свободноядерная женская клетка. Начало образования женского гаметофита и активация жизнедеятельности всего мегастробила определяется опылением (Минина, Ларионова, 1979; Третьякова, 1990).

Более полный способ оценки половой репродукции кедра сибирского предложен С.Н. Горошкевичем и В.Н. Воробьевым (1989), где используется среднеквадратичное отклонение для ранжирования мужских и женских побегов, а для выделения половых типов - корреляционная решетка. В соответствии с этим, все деревья разделены на условно мужской, условной женский и обоеполый половые типы. Как считают авторы, такой способ оценки половой изменчивости позволит изучить возрастную, экологическую и географическую изменчивость половой структуры популяции не только кедра сибирского, но и других древесных пород, а также связать половой статус деревьев с различными морфологическими признаками.

Как известно, смена поколений (гаметофитного и спорофитного цикла)

ч «-» и тт и

является характерной чертой цикла развития растении. У высших растении предельно редуцированный в процессе эволюции гаплоидный гаметофит представлен весьма незначительным размером и трофическими особенностями, связанными с телом хорошо развитого, расчлененного на отдельные органы диплоидного спорофита. Массивность тела спорофита обеспечивает его приспособительные способности большого биологического значения. Они заключаются в увеличении возможности достигнуть большого числа различных генетических рекомбинаций, необходимых для изменчивости и независимости размножения от половых процессов.

Кроме того, диплоидная фаза допускает гетерозиготность и сохранение в потенциальном виде генетических вариаций, которые могут проявиться в каких-то новых условиях. Из двух поколений спорофит является более совершенным в морфологическом, анатомическом и биохимическом отношениях, поэтому в нем заложены наиболее значительные потенциальные силы генома (Минина, Третьякова, 1983).

Хеслоп-Харрисон высказал предположение о том, что переход диплофаза-гапл