Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Генетические основы микрогаметофитного отбора кукурузы

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Генетические основы микрогаметофитного отбора кукурузы"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ НАУК

ВСЕРОССИЙСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ РАСТЕНИЕВОДСТВА имени Н. И. ВАВИЛОВА

На правах рукописи

ЛЯХ

Виктор Алексеевич Кандидат биологических наук

УДК 575:033.15

ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ МИ К РО ГАМ ЕТО Ф И Т Н О ГО ОТБОРА КУКУРУЗЫ

Специальность: 03.00.15 — Генетика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

САНКТ-ПЕТЕРБУРГ

1992 ,

\

Работа выполнена в Институте генетики Академии наук Молдовы в 1985—1992 гг.

Официальные оппоненты: доктор | биологических наук, профессор Н. Ф. Батыгин; доктор сельскохозяйственных наук, профессор 3. В. Абрамова; доктор сельскохозяйственных наук, профессор В. Н. Лысиков.

Ведущая организация: Институт генетики и цитологии Академии наук Беларуси.

Защита диссертации состоится 199 ¿¿-г.

в /О часов на заседании Специализированного совета Д.020.18.01 при Всероссийском научно-исследовательском институте растениеводства им. Н. И. Вавилова по адресу: 190000, Санкт-Петербург, Центр, ул. Герцена, 44.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Всероссийского научно-исследовательского института растениеводства им. Н. И. Вавилова.

Автореферат разослан 1992 г.

Ученый секретарь Специализированного совета,

доктор биологических наук ' * "~ончаРова

1Д

. .. Общая характеристика работы

Актуальность теш

В настоящее время интенсификация процесса селекции высокоурожайных сортов и гибридов во многом сдерживается из-за отсутствия простых и, вместе с тем, надежных методов оценки и отбора ценных генотипов (в том числе устойчивых к температурным стрессам) на различных этапах селекционного процесса, включая самые ранние. В решении данного вопроса немаловажная роль отводится отбору на микрогаметофитном уровне. • Принципиальная возможность проведения такого отбора основывается на предположении об экспрессии части генов генома спорофита в гаплоидной.фазе развития растения (ми1саЬу, 1979), а такие две характерные особенности мужского гаметофита как микроскопические размеры и гаплоидный генотип позволяют надеяться на успешное использование микрогаметофитного отбора в различных селекционных программах, поскольку при его применении селекционный процесс может быть в значительной степени интенсифицирован (Ми1саЬу, 1984; 0«ау1апо, Ми1са11у, 1989).

Наиболее изученным в плане успешного осуществления отбора ценных генотипов на гаплоидном уровне является томат, что, по-видимому, связано со способностью его мужского гаметофита выдерживать-различные манипуляции (гат1г et а1., 1982; БасЛег et а1., 1983; Жученко и др., 1986; Кравченко, Лях и др., 1988; Балашова и др., 1992). На кукурузе исследования подобного рода единичны и не носят систематизированного характера, что, скорее всего,объясняется недостаточной разработкой теоретических и экспериментальных основ микрогаметофитного отбора у данной культуры. Появившиеся лишь в последние годы публикации указывают на возвозможность проведения эффективного гаметофитного

отбора на гербицидоустойчивость (Sari Gorla et al., 1989) и устойчивость к пониженной температуре (Barnabas, Kovacs.1989). При этом в последнем случае селекцию проводили только на стадии зрелого пыльцевого зерна. Данные же об отборе генотипов устойчивых к повышенной температуре на микрогаметофитном уровне, также как и отбор на холодоустойчивость на иных, кроме зрелой .пыльцы, стадиях мужского гаметофита, в литературе вообще отсутствуют.

Несмотря на хорошо известную способность пыльцы кукурузы переноситься воздушным потоком на значительное расстояние, совершенно не изучены свойства пыльцы, различающейся по летательной способности, а также связь между данным признаком мужского гаметофита и различными признаками спорофита.

Практически не разработан и вопрос о возможности осуществления успешного микрогаметофитного отбора на инбредных линиях кукурузы.

Вышесказанное предполагает проведений интенсивных' исследований в области микрогаметофитного отбора на кукурузе, являющейся важным объектом сельского хозяйства во многих странах. При этом особую актуальность, на наш пзгляд, приобретает вопрос отбора температуроустойчивых генотипов, поскольку как по7 ниженные, так и-повышенные(температуры, действующие в различные периоды онтогенеза, являются наиболее лимитирующими для кукурузы.

Экспрессия генов в гаплоидном поколении является не только основой для разработки методов отбора ценных генотипов на микрогаметофитном уровне; но и методов оценки качества спорофита по их мужскому гаметофиту. Кроме того, оценка устойчи-

вости на уровне пыльцы представляет и самостоятельный интерес, так как данное свойство микрогаметофита является весьма вагагам признаком в селекции кукурузы.

Цель и задачи исследования

Целью настоящей работы являлось изучение генетической активности генома микрогаметофита как на стадиях его развития, так и функционирования, связи в проявлении гаметофитных и спо-рофитных признаков и на основе этого разработка методов оценки и отбора- на микрогаметофитном уровне ценных в хозяйственном отношении генотипов.

Исходя из цели определены следующие задачи:

1. Изучить реакцию мужского гаметофита на действие температурного фактора у различных генотипов кукурузы. Выявить связь между стрессоустойчивостыо микрогаметофита и спорофита.

2. Установить особенности изменения моногибридного расщепления и оценок частоты рекомбинации в Р2 в зависимости от температурной обработки микрогаметофитов в Р1. Определить хромосомы, гены которых детерминируют чувствительность к высокой и пониженной температуре у мужского гаметофита на стадиях созревания пыльцы, зрелого пыльцевого зерна, прорастания пыльцы и роста пыльцевой трубки.

3. Исследовать влияние отбора температуроустойчивых мик-рогаметофитов в гетерогенной популяции пыльцы на качество образующегося спорофитного поколения.

4. Изучить возможность использования методов оценки и отбора пыльцы по теплоустойчивости в селекции кукурузы.

5., Выявить свойства пыльцы, различающейся по летательной

3

способности. Определить влияние отбора в Р1 пыльцы по ее способности переноситься в горизонтальном воздушном потоке на структуру и качество расщепляющихся популяций Р2.

6. Исследовать связь между жизнеспособностью пыльцы и морфоцитохимическими параметрами ядер вегетативной и генеративной клеток.

7, Изучить возможность дифференциации инбредных линий на экотипы-подлинии за счет отбора на микрогаметофитном уровне.

На защиту и обсуждение выносятся следующие положения;

- о дифференциальной реакции мужского гаметофита на действие температурного фактора и положительной связи между стрессоустойчивостыо микрогаметофита и спорофита; •

- об экспрессии в мужском гаметофите генов, детерминирующих его чувствительность к повышенной и пониженной температурам, и их локализации по хромосомам;

- об отборе температуроустойчивых генотипов в результате воздействия на мужской гаметофит и использовании методов оцен- . ки и отбора на гаплоидном уровне в создании новых линий кукурузы; • ■ .

- об отборе жизнеспособной пыльцы кукурузы за счет сепарирования в горизонтальном воздушном потоке и использовании фракционированной по летательной способности пыльцы в Р1 для изменения структуры расщепляющихся популяций Р2; •

- о связи между жизнеспособностью пыльцы и некоторыми морфологическими параметрами ядра вегетативной клетки;

- о возможности дифференциации по скороспелости инбредных линий на подлинии за счет проведения микрогаметофитного отбора.

Епарзые в науке раскрыты основы отбора ценных, прелде всего то1.ч1оратуроуса'опч1Ш!:х, генотипов в нуяском ггмето^нтнсм поколении кукурузы. В той тесле показано, что на уровне кузсюго гг_>.?ето'ф::та гмоется значительная геиетачзская гетерогенность по признакам устойчивости к погашенной и погашенной температурам, при зтсм хотя бы часть генов, детераюирукзях ' чувствительность гстэтс^ита к температурному стрессу, эксярессируется з спорофите. .

Экспериментально определены параметра тешературного воздействия, в наилучшей степени дифференцирующие различные генотипы кукурузы по устойчивости ¡к пгкрог&четофптов к повшенной (стадия зрелого пальцевого зерна) н пониженной (стадия прорастания пыльцы и роста пыльцевой трубки) тешературам.' Обнаружена высокая положительная связь мз:2ду устойчивостью гскэто-фита и спорофита к тошературному фактору.

Выявлена значительная генетическая-активность гаплоидного генома кукурузы. Впервые установлено, что в условиях температурного стресса микрогачетофит на каадой стадии характеризуется своим набором экспрессирующихся генов, причем некоторые из иих проявляются кат« на этапах развития, так и функционирования. Обнаружено, что гены, детерминирующие чувствительность микрогаметофита к температуре, локализованы: на стадии созревания пылыда - во 2-й, ' 3-й, 4-й и 10-й, зрелого пыльцевого зерна - 1-й, 3-й, 4-й и 10-й, прорастания пыльцы и роста пыльцевой трубки - 1-й, 4-й, 7-й и 8-й хромосомах.

Определена связь- Между стрессоустойчивостью мужского га-метофита и различны™ признаками спорофита. Выявлена значи-

тельная эффективность отбора в гетерогенной популяции мшсрога-кетофитов на засухо- и холодоустойчивость в результате температурного воздействия на мужской гаметофит. Показано, что отбор гамет на устойчивость к повышенной температуре благоприятствует реализации в процессе опыления-оплодотворения гапло-'идише генотипов, несущих гены, детерминирующие мощный фенотип, а такз.:;е ген .(гены) восстановители фертилыюсти пыльцы стерильной цитоплазмы молдавского типа.

Продемонстрировано использование методов пыльцевой оценки и отбора на.теплоустойчивость в создании новых линий и высокоурожайных гибридов кукурузы. При этом данные методические подходы могут быть использованы на различных этапах селекционного процесса, включая саше ранние. ■ .

Впервые исследованы свойства пыльцы, различающейся по летательной способности, и установлено, что отбор по данному признаку может существенно изменять струк/уг>У расщвплящейоя поруляции.

Выявлена высокая отрицательная ст..*,.. ¡¿'.л ¿ясшоспособ- . ностью пыльцы и некоторыми морфологически?Пй^-хатри;.:. ¡ща вегетативной клетки пыльцевого зерна. ^ ■

Показана принципиальная возможность отбора ценшх гл.ог:;-пов в мужском гаметофитном поколении икбре&шх линий кукуруиа..

Теоретическое и практическое значении

Результаты, полученные в диссертационной работе, развивают представление о роли микрогаметофитного отбора в эволюции покрытосеменных растений', и позволяют рассматривать его в качестве -одного из важнейших механизмов, регулирующих генетическую изменчивость в природных и искусственных популяциях.

6

В силу ТОГО, ЧТО МИКрОГ"М'?ТСфПТ и спорофит одного и того :;-:о генотипа, как правило, характеризуются однотипной реакцией па действие температурного ректора, о качестве последнего полно судить по гаметофнту. Разработанные метода оценки ;::аро- и холодоустойчивости генотипов кукурузы на основе анализа плль-цы, закрепленше двумя авторскими свидетельствами, могут использоваться на различных этапах селекционного процесса, .включая самые ранние.

Основываясь на связи ¡лзмду признаками гаметофита и спорофита, для увеличения з популяциях частоты скороспелых, ::юро-, засухо- и холодоустойчивых генотипов, а так:::е генотипов с более мощным габитусом растения, мс:::зт использоваться отбор в муксксм гачетофитном поколении гибридов .

Методические приеш, основанные на оценке и отборе пыльцы на устойчивость к повышенной 'температуре, могут найти успешное применение в создании новых засухо- и жаростойких линий кукурузы, а два полученных нами гибрида, в состав которых вошли аналоги линий, созданных методами пыльцевого отбора, рекомендуются для производства. ■

Учитывая, что в селекционно-генетических исследованиях к качеству.- пыльцы кукурузы нередко предъявляют са»/ые высокие требования,'для'отбора жизнеспособных пыльцевых зерен из популяции микрогаметофитов предлагается использовать сепарирование пыльцы в горизонтальном воздушном потоке с последующим выделением фракции ближней к источнику воздушного потока.

В процессе экспериментальных исследований по микрогамето-фитному отбору была выявлена значительная- элиминация на различных температурных фонах • некоторых генотипов пыльцы на стадиях созревания и зрелого пыльцевого зерна. Эти ре, 7

зультаты дол'лш приниматься во внимание при использовании в различных селекционных программах широко распространенных. методов хранения пыльцы, основаниях на вддержившшн в лабораторных условиях как метелок, так и зрелых пыльцевых зерен, выделенных из растения, поскольку в данном случае часть ценных генотипов монет быть потеряна еще до опылзнил.

Апробация

Результаты исследований докладывались и обсуждались на Всесоюзной конференции по экологической генетике растений и мивотншс (Кишинев, 1987), 3-м Международном симпозиума до клеткам спермиев у высших растений (Венгрия, Нартонвапар, 1989), Всесоюзной конференции по частной генотипе растений (Киев, 1989), Всесоюзном совещании по методам отбора по комплексам признаков в селекции растений (Симферополь, 1989), Всесоюзной конференции по онтогенетике хз.чс рготс-инй (Кили-нев, 1989), Международном симпозиуме по у.-лр';а;:г.рйи и семзкиоп репродукции (Ленинград. 1990), иевдупар-.-лр« схинссиуке' ко пыльце и яйцеклеткам покрытосеменных рас?--т:й (Цтал!«, Кого, 1991), Всесоюзной конференции по аколоточ&сксП гснетакэ раер-ний, животных и человека (Кишинев, 1991), VI съезде ЧОРнС (Кишинев, 1992)..

Структура и объаи гегосераации

Диссертация изложена на 261 страшщг ; :!:■.>«:::спого тскагь и состоит из введения, обзора ятзратурц, м^-риа^ ¡-1 методов, .пяти экспериментальных глав, выводов и списка использованной литературы. В работе приведены 38 таблиц и 23 рисунка. Список литературы включает 330 наименований, в том числе 235 иностранных авторов.

Глава I. Микрогаыетофитный отбор у покрытосеменных расте-

1 с,

ний. Обзор литературы.

Еще в ранних работах по генетике отмечалось, что несмотря на сильную редуцированность гаплоидного поколения у покрытосеменных,- возможность для мужского гаметофитного отбора полностью не устраняется (Brink, 1925; Mangelsdorf, Jones, 1926). На различных объектах отбор на стадиях развития и функционирования мужского гаметофита наблюдали Соггепз (1924), Sprague (1933), Barnes, Cleveland. (1963), Мирюта (1967), Алпатьев, Юрьева (1970) и ~р. Вместе с тем, лишь недавно на основании предположения о выраженности части спорофитного генома в гаплоидной фазе была высказана мысль о том, что отбор микрогаме-тофитов, устойчивых к какому-либо экстремальному фактору среды, может обеспечить появление спорофитов со сходной устойчивостью (Mulcahy, 1979; Tanksley et al., 1981). Это предположе-. ние вскоре было -подтверждено экспериментальными исследованиями, выполненными, в основном, на томате- (Тараканов и др.,1978; Zamir et al., 1982; Sacher et al., 1983; Лях, 1985; Кравченко, Лях и др., 1988), а впоследствии и на ряде других культур, таких как хлопчатник (Rodriguez-Garay, Barrow, 1988), капуста (Hodgkin, 1988). Использование изоферментов в качестве генетических маркеров позволило оценить степень гапло-диплоидной экспрессии генов. Процент генов,- -экспрессирующихся в пыльце и вегетативных тканях, равнялся у томата - 60 (Tanksley et al., 1981), у традесканции - более 60 (Willing, Мавсагеп1газ, 1984), у кукурузы - 72 (Sari Gorla et al., 1985), у тополя - от 74 до 80 (Rajora, Zsuifa, 198б).

Большая часть сведений, указывающих на возможность прове, • 9

дения эффективного отбора на гаметном уровне у кукурузы, касается оценки основных компонентов гаметофитной конкурентной способности в оптимальных температурных условиях и скоррелиро-ванных реакций относительно спорофитных признаков (Ottaviano et al., 1982, 1985; Sari Gorla et al., 1987). Данные же о воз-■можности отбора устойчивых к абиотическим факторам среды генотипов .на гаплоидном уровне ограничены лишь информацией об эффективности селекции на гербицидоустойчивость (Sari Gorla et al., 1989) и частично на устойчивость к пониженной температуре ■ (Barnabas, Kovacs, 1988).

Глава II. Материал и иетода исследования.

Материалом исследования служили различные перспективные линии, различающиеся по устойчивости на спорофитной стадии развития, а также гибриды, полученные от скрещивания контрастных по устойчивости к какому-либо стрессу генотипов. Для проведения маркерного анализа в исследования были вовлечены гибрида , полученные' от скрещивания ряда линий с многомаркер- . ной формой' - тестером Мангельсдорфа, который маркирован 10-тыо генами , локализованными в различных хромосомах. В наших экспериментах использовали лишь . семь из них, легко идентифицирующихся на ранних стадиях, развития растения: Ът2 (1-я хромосома), lgl (2),- al (3), sul (4), gil (7), jl (8), gl (10).

Большая часть материала была получена из коллекции генофонда кукурузы Института генетики АН РМ, а часть линий была любезно предоставлена ст;н.с. лаборатории гетерозиса УкрНШГиС (f*. Харьков), к.б.н. Г,А. Ильяшенко. ■

В полевых экспериментах растения выращивали по общеприня-

10

той методике. В лабораторных - в условиях теплицы в грунте, либо в сосудах емкостью 10,0 л.

Воздействие на мужской гаметофит повышенной и пониженной температурами осуществляли как на стадии его развития (стадия созревания пыльцы), так и функционирования (стадии зрелого пыльцевого зерна, прорастания пыльцы и роста пыльцевой трубки). Помимо температурной обработки пыльцу помещали в горизонтальный воздушный поток с целью ее дифференциации по летательной способности. Конкретные условия обработай мужского гамето-фита описаны в соответствующих экспериментальных главах.

Для воздействия на мужской гаметофит использовали различный инструментарий: как традиционный - камеры искусственного климата, так и специально созданный для целей пыльцевой селекции в Институте генетики.

Об экспрессии генов, детерминирующих чувствительность мужского гаметофита к используемому фактору отбора, судили по изменению структуры расщепляющихся популяций в результате обработки гетерогенных популяций гаплоидных генотипов в Р1. При этом учитывали процентное соотношение некоторых классов фенотипов, оценку частоты рекомбинации между несцепленными маркерными генами и моногибридные соотношения по семи маркерным ло-кусам, локализованным в различных хромосомах генома.

; Образующееся спорофитное поколение контрольных и опытных вариантов оценивали татке по устойчивости к повышенной и пониженной температурам и некоторым другим хозяйственно-ценным признакам.

Различные манипуляции с пыльцой, включая ее оценку на устойчивость к повышенной температуре и отбор толерантных к данному температурному стрессу гаплоидных генотипов, были

И

использованы при создании на основе линии 092 генотипов, значительно превосходящих исходный образец по теплоустойчивости пыльцы и пыльцевой продуктивности и не уступающих ему по комбинационной способности. Создание новых линий проводилось на базе комбинации скрещивания, предложенной руководителем сектора селекции кукурузы ИГ АН РМ, к.б.н. Чалык С.Т.

В основу дифференциации инбредной линии МК01 на экотипы-подлинии были положены различия в конкурентоспособности мужского гаметофита. О этой целью были проведены опыления в разные сроки появления рылец из обвертки початка.

Для изучения морфологических и цитохимических характеристик ядер вегетативной и генеративной клеток пыльцы использовали анализатор микрообъектов "Морфоквант".

Статистическую обработку экспериментальных данных' проводили на мини-ЭВМ СМ-4, а та.же на персональных компьютерах типа "IBM рон по программам,, разработанным в'Институте генетики АН'РМ. .

Глава III. Реакция мужского гаиетофита и спорофита куку. руаы на действие температурного фактора. . '

В данной и последующих главах использованы следующие сокращения терминов: ПЗ - пыльцевое зерно, ИТ - пыльцевая трубка..

Первоначально нами изучалась реакция зрелой пыльцы на действие повышенной температуры. Акцентирование внимания именно на зрелой пыльце обусловлено тем, что мужской гаметофит на данной стадии развития в наилучшей степени может быть подвержен манипулированию, а методы и подходы, основанные на манипулировании зрелой пыльцой, легче всего могут быть вовлечены в селекционный процесс.

; Таблица 1.

Реакция мужского гаметофита на действие повышенной температуры

Температура . и экспозиция прогревания Генотип

толерантный чувствительный

прорастание ПЗ, % степень снижения,% прорастание 113, % степень снижения,%

Контроль 45,9±2,2 -. 40,2±2,1 -

26°с, 10 мин 2В°С, 20 мщ 26°0, 30 мин 45,6±2,2 25,3±1,8* 18,2*1,7* 0,7 44,9 ' 60,3 29,7+1,9* 7,9±1,2* 0* 26,1 80,3 100

35°С, 5 мин 35°С, 10 мин 35°0, 20 мин 45,3+2,1 13,4±1,5* 1,0±0,5* 1,3 70,8 97,8 11,1±1,3* 0* 0* 72,4 100 . 100

Примеч..» - отличия от контроля значимы при Р < 0,001.

В результате исследования более 20-ти инбредных линий между ними выявлены существенные различия в реакции зрелой пыльцы на действие повышенной температуры. Как видно из таблицы 1, •после кратковременной температурной обработки (26°с, 10 мин; 35°С,_ 3-5 мин) у толерантного образца степень снижения процента прорастания пыльцы небольшая, тогда как при тех же обработках этот показатель у чувствительного к температуре генотипа

> аЗ

существенно вшпе. Еще более четкие различия между генотипами видны'при более длительной обработке пыльцы (26°С, 20-30 мин; 35°С, 10-20 мин). Сходная реакция мужского гаметофита на действие пониженной температуры обнаружена при анализе длины ПТ. Жизнеспособность свежей и прогретой пыльцы у контрастных генотипов хорошо коррелирует с ее оплодотворяющей способностью.

Сравнение теплоустойчивости пыльцы с жаростойкостью линий на стадии 20-дневных сеянцев позволяет говорить об определенной закономерности: линии с более устойчивой к высокой температуре пыльцой характеризуются также белее устойчивым к данному фактору среда спорофитом. Коэффициент корреляции между тем-пературоустойчивостыо мужского гаметофита и спорофита оказался довольно высоким. В том случае, когда для сравнения использовали показатели теплоустойчивости пыльцы после 10-минутного прогревания, г в различные годы составлял от 0,60 до 0,78.

, Мужской гаметофит различных генотипов кукурузы в период прорастания пыльцы и роста ПТ неоднозначно реагирует и на действие пониженной температуры.

Как видно из таблицы 2, где в качестве примера приведены 4 инбредные линии, в стрессовых условиях у линий Хлг79 и Хлг286 прорастают лишь единичные ПЗ, тогда как у Хлг162 и Хлг407 процент проросшей пыльцы достаточно, высокий. Степень снижения прорастания пыльцы в опытном варианте по сравнению с контролем у первых двух генотипов была выше 90%, тогда как у последних она не превышала 60%. Пониженная температура дифференцированно влияет'и на рост ПТ. Тая, обработка в значительно меньшей степени изменяет среднюю длину ПТ линии Хлг407 по сравнению с Хдг286. В опытном варианте у линии Хлг407 по

14

Таблица 2.

Реакция мужского гаметофита на действие пониженной температуры

Генотип Температура Степень снижения, 0/ л

26±1°С 12+1°С

прорастание пыльцы, % '

Хлг79 Хлг162 ' Хлг286 ХЛГ407 44.2il.70 27,1+1,13 55,6+1,27 55,5+1,19 4,3+0,60 11,2+0,80 . 2,3+0,39 24,0+1,06 92,4 58.7 95,9 56.8

длина шльц. трубки, отн. ед.

Хлг286 Хлг407 17,8±0,70 13,4+0,67 2,8±0,10 4,9+0,27 84,2 63,4

сравнению с Хлг286 значительно более широкий и спектр изменчивости по длине ПТ, тогда как при оптимальной температуре проращивания пыльцы спектры сравниваемых генотипов между собой практически-не различаются, что свидетельствует о более высокой холодоустойчивости мужского гаметофита линии Хлг407.

Коэффициент корреляции между' холодоустойчивостью гаметофита (стадия' прорастания пыльцы и роста пыльцевой трубки) и .спорофита (стадия сеянца) оказался даже более высоким, чем при сравнении устойчивости 'К повышенной температуре линий на гаплоидном и диплоидном уровнях.. При этом данный показатель был значительно выше в том случае, когда о холодоустойчивости

15

мужского гаметофита судили по способности пыльцы прорастать (г варьировал от 0,79 до 0,90), чем формировать в стрессовых условиях длинную пыльцевую трубку (г = 0,65-0,75).

Полученные результаты позволяют сделать вывод о том, что чувствительность мужского гаметофита к повышенной и пониженной температурам различна и зависит от генотипа. При этом линии с устойчивым .гаметофитом по сравнению с неустойчивым характеризуются как более высоким процентом прорастания пыльцы, так и способностью формировать достаточно длинную пыльцевую трубку в стрессовых условиях.

Учитывая положительную связь между устойчивостью гаметофита и спорофита к температуре, нами предложены способы оценки жаро- и холодоустойчивости генотипов кукурузы, основанные на анализе пыльцы (Лях и др.,.1990; 1991).

Можно предположить, что однотипная реакция гаметофита и спорофита на действие используемых температур обусловлена экспрессией одних и тех же генов, детермшшрущих жаро- или холодоустойчивость, в обеих фазах жизненного цикла. Если ато предположение справедливо, то отбор в мужском гаметофитном поколении гибридов , полученных от скрещивания контрастных.по температуроустойчивости генотипов, должен быть эффективным в изменении качества образующегося•спорофитного поколения.

Глава IV. Влияние•различных температурных обработок пыльцы гибридов на структуру расщепляющихся популяций.

Нарушение менделевских расщеплений в результате каких-либо воздействий на гетерогенную популяцию микрогаметсфитов является одним из убедительных доказательств генетической активности гамет. .Следует отметить, что нарушение расщепления по

16

какому-либо маркерному гену в результате воздействия на гете-

I,

рогенную популяцию пыльцы еще не является доказательством того, что именно данный ген экспрессируется в-мужском гаметофи-те. Оно может быть обусловлено и его сцеплением с каким-либо другим геном,, детерминирующим чувствительность гаметофита к используемому фактору отбора. Вместе с тем, выводы о локализации этого гена (генов) в определенной хромосоме генома могут быть сделаны.

В результате анализа расщепляющихся популяций Р2, полученных от-опыления прогретыми ПЗ, установлено, что такая обработка существенно влияет на моногибридные расщепления по некоторым маркерным локусам. На гибриде нму х ММ изменения отмечены для локусов Вт2, А1 и Би1, а на Х118 х мМ - для маркерного гена При этом различия между опытом и контролем имеются лишь в том случае, когда температурный фон обработки пыльцы является достаточно жестким. Никаких отличий от контроля не выявлено в результате обработки мужского гаметофита, обеспечивающей снижение его жизнеспособности менее, чем на 60Ж. Очевидно , данные условия средового воздействия на пыльцу еще не были дифференцирующими. Исходя из данных маркерного анализа, в целом между вариантами различия в моногенных соотношениях выявлены для четырех маркерных генов. Дифференциальная передача аллелей обнаружена для локусов Вт2, А1, Би1 и 01.

Помимо обработки пыльцы повышенными температурами, на зрелые ПЗ воздействовали также пониженной температурой. Для •этого их выдерживали при 3-5°С в течение 1-10-ти суток.

Как и ожидалось, выдерживание пыльцы обоих гибридов при пониженной температуре в течение 1-х - 3-х суток практически не сказывается на структуре расщепляющихся популяций. Однако,

17

при более длительном хранении ПЗ наблюдаются изменения моногенных соотношений на гибриде Р1 Х118 х мМ - по двум (Вш2 и А1) локусам, а на нЫу404 х мМ - по трем маркерным генам: а1, вч1 и Выдерживание пыльцы в течение 5-ти суток при пониженной температуре менее эффективно, чем недельная обработка ПЗ. Очевидно, 7 суток хранения пыльцы являются наилучшим фоном для избирательного действия на микрогаметофиты.

С целью изучения экспрессии генов, детерминирующих чувствительность мужского гаметофита кукурузы_ к температурному фактору на стадии незрелых ПЗ температурному воздействию подвергали метелки, в начале цветения перенесенные в лабораторные условия. Использовали два температурных режима: Ю-15°о и 18-26°0.

Обе температурные обработки ПЗ в оказывают .существенное влияние на частоту моно^ибридных соотношений к Р2> При температуре 18-26°с уже через-двое суток хранения наблюдаются различия в расщеплении по трем локусам - 1^1, Би1 и 01. На температурном фоне 10-15°с значительные изменения в расщеплении (по маркерным генам а1, ви1 и ¿1) отмечены при более длительном сроке хранения (96 часов и более), хотя уже через двое суток по одному из указанных генов ' (а1) имеются .отличия от контроля. •

Микрогаметофит в-период прорастания пыльцы и роста ПТ подвергали температурному воздействию используя два диапазона пониженных температур: 16-18°0 и Ю-13°о. В комбинации скрещивания нму404 х мМ в опытном варианте по сравнению с контролем обнаружены различия по одному из семи изученных ло-кусов уже при обработке микрогаметофитов температурой 16-18°о. При более низкой температуре отличия 'Наблюдаются уже по двум

18 .'

генам - sul и ji. На другом генетическом фоне - Х118 х мМ - в

с.

варианте обработки микрогаметофнтов температурой 16-18°с моно-геннне соотношения существенно отличаются от контроля по маркерному локусу Gil, тогда как при более сильном действии фактора различия сэбнаружены по четырем из семи изученных генов. В целом на обоих гибридах низкотемпературная обработка микрогаметофнтов в период прорастания пыльцы и роста ГГГ изменяет моногенные соотношения по маркерным генам bm2,sul, gil и д'1, локализованным в 1-й, 4-й, 7-й и 8-й хромосомах, соответственно.

Анализ частоты рекомбинации между несцепленными маркерными генами и процентного соотношения некоторых фенотипических классов подтверждает эффективность термообработок в ?1 микрогаметофнтов как на стадиях развития, так и функционирования, в изменении структуры расщепляющихся популяций f2. Так, например, в результате прогревания гетерогенной популяции зрелых ПЗ гибрида f Х118 х мМ для 4-х пар маркерных локусов были обнаружены отличия в частоте рекомбинантных генотипов в ту или иную сторону от значений контрольного варианта (Табл.3). Характерно, что при термообработке пыльцы, обеспечивающей снижение ее жизнеспособности менее чем на 60%, различия между вариантами отсутствуют. Учитывая, что сравниваемые варианты различаются только температурным воздействием на зрелую пыльцу, изменение оценок частоты рекомбинации может быть объяснено лишь различной селективной ценностью гаплоидных генотипов (пыльцевых зерен) на фоне повышенной температуры. Значительные отличия в частоте рекомбинантных генотипов между контрольными и опытными популяциями выявлены и при температурной обработке в Р1 микрогаметофитов, находящихся на стадии созревания и з период прорастания пыльцы и роста ПТ.

19

Таблица 3.

Оценка частоты рекомбинации в контрольных и опытных популяциях Р2 комбинации скрещивания ХИ8 х мы, %

Пары маркеров . Контроль (свежая пыльца) Опыт (прогретая пыльца)

Снижение жизнеспособности пыльцы

менее 60Ж . более 6056

ви1 - 181 61,612,18 50,512,00 50,314,23

ви1 - в11 48,8+2,25 49,712,15 55,014,00

ви1 - а1 .50,712,21 Б0,ЗИ,99 50,914,20

ви1 - Ьш2 49,112,25 51,511,97 52,614,12

ви1 - Л 37,712,51 40,512,12 32,015,00

ви1 7 в! 45,1±2,34 47,8x2,34 51,114,19

1«1 - ей 46,712,30 49,8И,97 • 50,414,22

1е1 - а1 49,1±2,25 51,812,14 57,513,87*

■1е1 - Ьт2 54,012,12 48,312,17 41,7*4,61*

1е1 - л 49,612,24 60,912.21 51,514,17 '

181 - «1 48,812,25 51,0И,98 47,614,35

ей - а1 48,612,26 50,312,09 61,514,17

811 - Ьш2 48,212,27 46,412,18 50,414,22 "

«11 - Л 48,112,27 45,7*1,98 33,614,94**

«11 - 61 47,912,27 48,512,07 47,414,36

а1 - Ьт2 53,012,15 50,212,02 49,614,26

а1 - 31 44,012,37 .50,712,11 56,513,92**

а1 - «1 49,912,23 50,912,18 45,114,47

Ьго2 - Л 48,712,26 48,612,13 41,414,63

Ьш2 - в1 44,812,35 47,312,15 41,414,39

Л - 81 54,612,11 53,812,13 54,614,02

Примеч. *,** - отличия от контроля значимы при Р < 0,05 и 0,01, соответственно.

Результаты анализа оценок частоты рекомбинации между несцепленными маркерными генами, процентного соотношения некоторых фенотипических классов, таете как и моногенных соотношений в контрольных (пыльца без обработки) и опытных (различные варианты температурной обработки пыльцы) популяциях Р2 позволяют говорить об избирательном действии используемых температур на определенные классы генотипов гамет в гаплоидном поколении гибридов р.,. Очевидно, что значительный селективный эффект температурных воздействий на микрогаметофит обусловлен экспрессией в нем, на различных его стадиях, хотя бы части генов генома кукурузы.

. Сравнивая данные по изменению моногибридных соотношений в популяциях ]?2 различных комбинаций скрещивания в результате температурных обработок микрогаметофита на этапе созревания пыльцы, зрелого Шив период прорастания пыльцы и роста ПТ, молено сделать вывод о том, что направленность этих изменений на каждой из стадий Практически не зависит от того, какая (повышенная, или пониженная температура) используется для обработки (Табл. 4). Таге, действие повышенной и пониженной температур на созревающие ПЗ гибридов приводит к нарушению расщепления в практически по одним и том же•маркерным генам. В обоих случаях ими являются гены 3-й и 4-й хромосом. При термообработке зрелой пыльцы различия в соотношении доминантных и рецессивных форм по сравнению с контролем наблюдаются по генам 1-й, 3-й, 4-й и 10-й хромосом,независимо от используемого температурного ■ режима. В то же время, хорошо прослеживается .специфичность реакции на температурное Ёоздействие у мужского гаметофита на каждой из исследуемых стадий.- Вышесказанное позволяет говорить

Таблица 4.

Маркерные гещ, по которым обнаружено нарушение моногибридных соотношений в Р2 в результате воздействия температуры на различные стадии мужского гаметофита гибридов Р1 кукурузы

. Стадия мужского гаметофита Температура

пониженная повышенная

Созревание пыльцы а1 (3-я хромое.) еи1 (4-я) «1 (Ю-я) а! (3-я) ви1 (4-я)' 611- (2-я).

Зрелое пыльцевое зерно Ьт2 (1-Я). а1 (3-я) ви1 (4-Я) в1 <Ю-Я) Ьш2 (1-я) ' а1 (3-я) ви1 (4-Я) «1 (Ю-я) '

Прорастание пыльцы и рост пыльцевой-I трубки Ьш2 (1-я) ви1 (4-я). 1Л" (7-я) - 'Л (8-я)

о том, что мужской гаметофит на каждой стадии характеризуется своим набором экспрессирунцихся генов, при етом некоторые из цйх проявляются как на этапах развития, так и функционирования микрогаметофита.

Гйава V. Отбор устойчивых к температурным стрессам генотипов на гаплоидном уровне.

Эффективность микрогаметофитной селекции, главным образом, обеспечивается за счет наличия генетической гетерогенности пыльцы и экспрессии хотя бы части генов генома спорофита в гаплоидном поколении. Полученные нами в этом плане экспери-, ментальные данные, позволили предположить, что микрогаметофит-ный отбор на устойчивость к повышенной и пониженной•температурам может' быть успешным на кукурузе.

В исследовании влияния отбора теплоустойчивой пыльцы в Р1 на качество спорофитного поколения для прогревания зрелых ПЗ использовали такую экспозицию, которая обеспечивала снижение процента прорастания ПЗ по сравнению с контролем не. менее, чем на 80£.

Установлено, что обработка зрелой пыльцы гибридов Р1 в несколько раз увеличивает процент семян, проросших на растворе с осмотиком. Эта закономерность прослеживается при анализе 'числа зерен, образовавших как зародышевые корешки, так и проростки в условиях осмотического стресса (Рис.1). Полученные результаты позволяют говорить оо эффективности отбора на засухоустойчивость в гетерогенной популяции зрелых ПЗ.

' Для воздействия пониженной температурой на гетерогенную популяцию микрогаметофитов в период прорастания пыльцы и роста ПТ In vivo применяли температурный режим 10-13°с, который в ■ наилучшей степени дифференцирует генотипы кукурузы по холодоустойчивости их микрогаметофитов In vitro. >•

Табл.5 показывает, что- при низкотемпературной обработке микрогаметофитов гибридов Р.,-как в беккроссном потомстве, так

23

Рис.1. Влияние прогревания пыльцы в на засухоустойчивость расщепляющейся популяции К - контроль, О-опыт; а)-процент семян, сформировавших корешки, б)-роотки| * - отличия значимы при Р < 0,001;

н н и о

в ю о и о о и ш н п в И си

а

и 0) м а м и

100

И

2 И

ч :

§ 70 60 50

А Б

100- А А

4 ж ■ ' * * V* V ' 90- А

А* 80-

70- А

60-

50-

»А . *

" * ***** А * ** А .

Фертильные растения, выделенные из раощепляющейоя популяции

Рио.2. Теплоустойчивость мукокого гаметофита растений, полученных в результате опыления чувствительными (А) и толерантными (В), к повышенной температуре пыльцевыми зернами.

и в популяциях на фоне пониженной температуры семена формируют значительно более длинные зародышевые корешки и ростки, чем в контроле. Различия между опытными и контрольными вариантами обнаружены и при анализе частоты распределения растений в потомствах Р2 и ВС1 по длине зародышевого корешка и ростка.

Таблица 5.

Влияние низкотемпературной обработки микрогаметофитов в Р1 на холодоустойчивость спорофитного поколения

Анализируемый признак Контроль (22-28°С) Опыт (10-13°С)

X ■ X

Длина корешка, мм Длина ростка, мм Р2 Хлг286 х ХЛГ162

22,710,66 5,8±0,27 24,910,77* 6,5±0,26*

Длина корейка, мм Длина ростка, мм В01 Хлг286 х (ХЛГ286 х ХЛГ162)

29,810,95 11,010,48 47,413,53 52,814,12 29,5Ю,59 13,810,31*475,913,02** 59,713,91

Процент всходов Высота сеянца, мм

Примеч. *,** - различия достоверны при р < 0,05 и 0,001 соответственно.

В данном случае низкотемпературная обработка микрогаметофитов приводит к увеличению числа зерен с максимальными значениями изученных признаков. Оценка части семенного материала о помощью другого метода (Югенхеймер, 1979) на более поздней стадии - стадии сеянцев - также свидетельствует об успешном микрогаме тофитнсм отборе на холодоустойчивость. На это указывают как существенное возрастание в опытном варианте процента появившихся при пониженной температуре всходов, так и тенденция к увеличению высоты сеянцев.

Методические приедоя, основанные на оценке теплоустойчи-' вости мужского гаметофита и селекции устойчивых генотипов на гаплоидной стадии развития растения, использовались для создания аналогов линии 092. Данный генотип характеризуется высокой специфической комбинационной способностью при скрещивании с линией МК01, однако имеет низкую жаро- и засухоустойчивость, а также невысокую пыльцевую продуктивность. Последний признак представляет особую важность для линий, использующихся в качестве отцовских компонентов гибридов.-

Для создания аналогов, отличающихся от исходной линии более высокими теплоустойчивостью пыльцы, пыльцевой продуктив-. ностью ' и не уступающих ей по комбинационной способности в скрещивания были вовлечены ряд .линий - источников sapo- и засухоустойчивости, превосходящих исходный образец по данному признаку. В итоге, перед ■ началом проведения исследований исходная комбинация скрещивания имела следующий вид - [N384 М х 092] х [ 092 х (Rf7 х МК159) ]. Кроме того, данная схема позволяет контролировать получение линий, несущих гены, вос-

становители фертильности пыльцы для растений с молдавским типом стерильности.

Помимо селекции на уровне мужского гаметофита, пыльцу растений многократно, на различных этапах селекционного процесса, подвергали оценке на устойчивость к повышенной температуре 'и на основе этого проводили выбраковку недостаточно толе. рантных генотипов.

Первый отбор на микрогаметофитном уровне был проведен в 1987 г. в тепличных условиях в зимне-весенний период на растениях, полученных от опыления линии 092 пыльцой гибрида Р1 В.17 х МК159. Семена контрольных и опытных вариантов, полученных от опыления Р1 N384 м х 092 пыльцой растений 092 х (аг7 х МК159), высевали летом того же года в поле. В каждом из вариантов выделяли растения с полностью фертильной метелкой и оценивали их •по устойчивости пыльцы, пыльцевой продуктивности и длине вегетационного периода. Из более, чем 3000 растений были отобраны 60 с полностью фертильной метелкой, из которых 8 характеризовались наиболее высокой устойчивостью пыльцы к температуре (снижение жизнеспособности пыльты после прогревания не превышало 80 %).

Характерно, что устойчивые на уровне пыльцы генотипы получены только в том случае, когда в предыдущем поколении для опыления используют теплоустойчивую.пыльцу. Ни одного растения с уотойчиеым к повышенной температуре мужским гаметофитом не • было обнаружено при опылении чувствительными к температурному стрессу ПЗ, что позволяет говорить о наследуемости признака 'теплоустойчивости пыльцы (Рис.2).

Для оце'нки действия отбора пыльцы в гибридной комбинации 092 х (Ш7 х МК159) на качество следующего спорофитного покс-

'■< 27

ления в расщепляющейся популяции [N384 М х 092] х [ 092 х (М7 х МК159) ] анализировали различные признаки спорофита. Установлено, что термообработка пыльцы приводит к увеличению средних значений числа листьев и высоты растения. В отдельных случаях эффективно даже, прогревание пыльцы в течение Б мин (Табл.6).

• Таблица 6.

Влияние отбора в гетерогенной популяции пыльцы по теплоустойчивости на качество спорофита в следующем поколении

Номер 1 1 Число Высота

попу- Вариант ' листьев, растения,

ляции шт. см.

1 Контроль 6,7+0,09 34,310,72 ■

(свежая пыльца)

Опыт (прогревание 6,910,06 38,0Ю,46*.

пыльцы э теч.10 мин) •

2 Контроль 6,810,11 35,2Ю,84

1 (свежая пыльца)

Опыт (прогревание 7,410(08* 40,110,76*

пыльцы в теч.5 мин)

Опыт (прогревание. 7,ЗЮ.06* ' 35,310,62

пыльцы в теч.10 мин)

Примеч. * - отличия от контроля значимы при Р < 0,01.

Рис. 3. Влияние микрогаметофитного отбора на распределение .' растений по числу листьев (а) и высоте (б) в следующем спорофитном поколении. А - популяция л 1, В - популяция Л 2. ---контроль (свежая пыльца); —прогревание пыльцы в течение 5 мин;' ——»- в теч. 10 мин.

Между вариантами также обнаружены существенные различия в спектрах изменчивости по этим двум признакам. В результате проведения отбора на уровне пыльны в .популяциях значительно возрастает доля растений с максимальными значениями признаков (Рис.3). Учитывая, что высота растения и число листьев являются составляющими более общего свойства, такого как мощность растения, можно говорить об увеличении в опытных популяциях доли генотипов с мощным габитусом. Очевидно, высокотемпературное воздействие на пыльцу обеспечивает.селекцию генотипов, детерминирующих более мощный фенотип. •

Анализировали и другие признаки спорофита на более поздних стадиях развития растения. .Между сравниваемыми вариантами не наблюдается значимых различий в поражаемости растений пузырчатой головней. Вместе с тем, при селекции на микрогамето-фитном уровне в популяциях существенно возрастает число растений с фертилыюй метелкой. По-видимому, прогревание зрелых ПЗ благоприятствует отбору гаплоидных генотипов, несущих гены восстановления фертильности.

В результате последующей трехлетней оценки потомств (семей) отобранных генотипов по толерантности мужского гаметофита к повышенной температуре, полной фертильности метелки и высокой пыльцевой продуктивности, а также другим агрономически-ценным признакам получено более 20 новых линий.

Одним из условий создания новых генотипов на базе линии 092 являлось сохранение высокой специфической комбинационной способности исходного генотипа. Поэтому, начиная с самых ранних этапов получения линий, селектируемые генотипы постоянно оценивали на комбинационную способность. Для этого одновременно с проведением самоопылений их скрещивали с материнской фор-

30

мой предполагаемого гибрида - №Ю1. Данные трехлетней оценки гибридов по урожайности в конкурсном испытании в Институте генетики позволяют говорить о высокой комбинационной способности отобранных генотипов. В большинстве случаев она не только не уступает, а значительно превосходит таковую у линии 092 (Табл.7).

Таблица 7.

Урожайность гибридов, полученных с участием аналогов

линии 092, ц/га

Гибрид 1S88 1989 1991

f.! 291MB (стандарт) 74,1 84,1 94,9

М 377мв (стандарт) 76,4 69,6 91,6

'2983 - 83,3 116,4*

2997 84,3*** - 114,9*

3028 87,3*** ' - 116,2*

3031-1 92,6** 84,2 116,3*

3031-2 - ■ 87,4 130,3*

3043-1 89,3** 81,7 '129,2*

3043-2 - 78,2 120,3*.'

'' 3044 75,0 .82,6 108,7**

304? 76,7 88,5 114,1*

3048 88,5*** - . 117,5*

3049 . 83,6*** - 118,5*

Примеч. #,*«>** - отличия значимы при Р < 0,001, 0,01 и С,05 соответственно.

Высокая комбинационная способность двух лучших аналогов линии 092 подтверждается ■ и данными испытания в НПО . "Гибрид" при НИИ кукурузы и сорго (г. Кишинев) в 1990 году, где гибриды с участием этих линий заняли одни из первых мест по урожайности. • '

По результатам исследований выделены две линии - 3031 и 3043, в наибольшей степени превосходящие исходный образец по устойчивости пыльцы к высокой температуре, пыльцевой продуктивности и не' уступающих ему по комбинационной способности. Таким образом, методы, основанные на манипулировании пыльцой,

нашли удачное применение в селекции новых линий кукурузы.

| ■

Глава VI. Летательная способность пыльцы и возможности пыльцевой селекции по данному признаку.

Известно, что пыльца кукурузы способна переноситься, ветром на значительные расстояния. Вместе с тем' данные о каких-либо различиях между пыльцой контрастной по летательной способности, также как и информация о возможности изменения .структуры популяции в результате опыления такой пыльцой, в литературе полностью отсутствуют.

Анализ фракций, полученных в результате сепарирования пыльцы," и контрольных популяций 113, оцененных до начала манипуляций с' пыльцойпоказывает, что между ними имеются существенные различия в жизнеспособности пыльцы (Табл.8). При этом значительная дифференциация фракций по данному показателю имеет место как после разделения в воздушном потоке смеси ПЗ ■нескольких генотипов, так и пыльцы гибридов . Наибольшим числом гтанеспоссбных ПЗ характеризуется вторая фракция, а наименьшей - четвертая - дальняя от источника воздушного потока.

32

Сходные различия обнаружены также по величине ПЗ, длине ПТ и проценту лопнувших после посева на питательную среду ПЗ. Учитывая связь между жизнеспособностью пыльцы и ее летательной способностью, нами предложен способ отбора жизнеспособной пыльцы кукурузы из популяции пыльцевых зерен.

Процент прорастания, пыльцы, различающейся по

способности

Таблица 8. летательной

Источник пыльцы Контроль Фракции

1-я 2-я 3-я 4-я

Смесь пыльцы генотипов из 43,4 37,8 71,7* 50,3** 0,2*

. Р1 Х118 >< мМ 20,5 " 18,8 38,5* 27,4** 0,8*

Примеч. *,** - различия между фракциями и контролем существенны при р < 0,01 и 0,05, соответственно.

С целью изучения влияния отбора в ПЗ.с различной летательной способностью на структуру популяций в следующем споро--фитном поколении для самоопыления либо беккросспровэния в качестве наиболее контрастных применяли вторую и третью фракции пыльцы, поскольку ПЗ 4-й фракции характеризовались очень низкой жизнеспособностью. Использование в опылении фракционированной пыльцы существенно влияет на структуру расщепляющейся

33

¡=1 Хлг182 х Хлг286

2 3 4 5

Рис. 4. Изменение морфологических " параметров ядра вегетативной клетки в зависимости от жизнеспособности пыльцы у различных генотипов: 1 - контроль (свежая пыльца), 2 - выдерживание при 26°С в-течение 15 мин, 3-30 мин, 4-45 мин, 5-60 мин.

популяции. На это указывают результаты наших экспериментов по изменении моногибридшх соотношений для ряда маркерных генов, а также холодоустойчивости и длины вегетационного периода популяций при опылении контрастной по летательной способности пыльцой. Полученные данные свидетельствуют о наличии связи между способностью пыльцы перекоситься воздушным потоком и определенными свойствами спорофита.

Еде при изучении фракций пыльцы, контрастных по летательной способности, сило обнаружено, что существует определенная связь между жизнеспособностью пыльцы и морфоцитохимическими признаками ядер ИЗ. Используя специальную методику, когда варианты пыльцы отличаются лишь по жизнеспособности, установлено, что пыльца в зависимости от уровня ее жизнеспособности характеризуется определенной величиной некоторых из изученных .морфологических параметров ядер. При этом существенные различия 'обнаруживаются лишь на уровне ядра вегетативной клетки. Никаких различий между ПЗ контрастными по жизнеспособности не 'установлено при изучении ядер генеративной клетки. Информативные показателями являлись периметр и площадь ядра (Рис.4). Коэффициенты корреляции ме;.чду жизнеспособностью пыльцы и этими двумя исследуемыми параметрами ядра вегетативной'клетки били очень высотами. В первом случае г варьировал от -0,79 до -0,84, а во втором - от -0,.94 до -0,95. Данная коррелятивная зависимость слу;.:ит основой для разработки метода оценки жизнеспособности пыльны кукурузы с использованием Морфсквыгга.

Глггаэ VII. Зкотипическая селекция на раннеспелость.

Известно, что сортовой и линейный материал может характеризоваться значительной генетической гетерогенностью по тем о 35

или иным признакам, что позволяет рассматривать его в качестве популяция, представляющих собой смесь различных генотипов (Хо-тылева, Кильчевский, 1984; Серый, Головин, 1985 и др.). Ожидается, что не только по признакам спорофита, но и по многим признакам гаМетофита сорта и линии также, характеризуются значительной генетической гетерогенностью. Тем более, что, как правило, свойства гаметофита выпадают из поля зрения селекционера и селекция по этим признакам не ведется вообще.

Нами изучено влияние гаметофитного отбора различной степени интенсивности по конкурентоспособности пыльцы на качество спорофитного поколения одной из инбредных линий кукурузы -• МК01. ОтселектированНая много лет тому назад, ' она в качестве материнского компонента входит в состав многих районированных гибридов. . Однако одним из отрицательных свойств данной линии является более длинный вегетационный период по сравнению с большинством генотипов, используемых в качестве отцовского компонента скрещивания. В силу этого, основным, интересующим нас признаком спорофита, на который предполагалось повлиять с .помощью манипулирования пыльцой, была скороспелость. Регулирование интенсивности гаметофитной конкуренции осуществлялось за счет опыления рылец различной длины, используя для этого разные сроки появления нитей из обвертки початка.

Популяции растений, полученные в результате одного цикла опыления в разные сроки появления рылец существенно различаются по частоте ранозацветающих растений. Через- пять дней после появления первых цветущих растений, процент растений с цветущими как мужским, так и женским соцветиями значительно выше в варианте опыления рылец на 1-2-й день их выхода.' Характеристика сравниваемых популяций после двукратного цикла

36

опылений в разные сроки цветения початка представлена в таблице 9. Видно, что частота растений как с цветущим в ранние сроки мужским,так и женским соцветиями, значимо выше в варианте с ранним опылением рылец по сравнению с более поздним. При этом в варианте 1 выделяются семьи с частотой ранозацветающих растений в 2 - 3 раза выше, чем в лучшей из семей варианта 2.

Таблица 9.

Влияние опыления в разные сроки выхода рылец на скороспелость растений в следующем поколении

Процент растений с цветущим соцветием

Вариант мужским женским

1-я 2-я 1-я 2-я

оценка оценка оценка оценка

Раннее 22,613,66** 49,3*4,61 9,212,37* 50,6±4,68

опыление (1)

Нормальное 8,812,66 39,314,81 3,8И,23 38,414,62

опыление (2)

Позднее 15,2±3,49 37,814,81 6,412,03 40,914,88

опыление (3)

Примеч. *,»* - различия между вариантами 1 и 2 достоверны при Р < 0,05 и 0,01 соответственно.

При использовании обычного опыления (на 3-5-й день появления рылец) в течение двух последующих лет семьи, выделившиеся по скороспелости, сохраняют свое преимущество. В результате проведенного микрогаметофитного отбора различной степени интенсивности на базе исходной инбредной линии МК01 выделен ряд экотипов-подлиннй, существенно различающихся по скороспелости. .

Очевидно, что успешный микрогаметофитный- отбор в нашем эксперименте мог быть осуществлен лишь при наличии значительной генетической гетерогенности .по конкурентоспособности мужского гаметофита, а также устойчивой связи между, данным-

I

признаком пыльцы и скороспелостью.

ВЫВОДЫ

1. Обнаружены генотипические различия в реакции мужского гаметофита кукурузы на стадии зрелого пыльцевого зерна и в период прорастания пыльцы и роста пыльцевой трубки на действие повышенной и пониженной температур, соответственно. Показано, что устойчивая к температуре пыльца, по сравнению с неустойчивой, характеризуется как более высоким процентом прорастания, так и лучшей способностью развивать нормальную пыльцевую трубку в стрессовых условиях. Определены температурные' режимы обработки пыльцы и экспозиция (выдерживание при 35°о в течение 10-20 мин и 26°с, 30 мин и проращивание при 12°о, 6 час), обеспечивающие дифференциацию генотипов по температуроустойчи-вости их микрсгаметофитов.

2. Выявлена высокая положительная связь между устойчивостью -гаметофита и спорофита кукурузы к повышенной (г варь-

38

ирует от 0,60 до 0,78) и пониженной (г = 0,79-0,90) температурам.

3. Установлено избирательное действие повышенной и пониженной температур на определенные классы генотипов гамет в гаплоидном поколении гибридов г1, полученных от скрещивания контрастных по температуроустойчивости линий. Об этом свидетельствуют существенные различия между опытными (различные варианты температурной обработки пыльцы в Р,) и контрольными (пыльца не подвергалась температурному воздействию) популяциями Р2 по: а) процентному соотношению некоторых фенотипических классов, б) оценке частоты рекомбинации между несцепленными маркерными генами, в) моногенным соотношениям по некоторым из семи изученных маркеров. Неодинаковая селективная ценность различных гаплоидных генотипов в стрессовых температурных условиях указывает на экспрессию в пыльце генов, детерминирующих ' чувствительность микрогаметофита к температурному фактору.

4. Впервые выявлены хромосомы, гены которых, хотя бы частично, детерминируют чувствительность к температуре мужского. гаметофита кукурузы на стадиях созревания пыльцы, зрелого пыльцевого зерна, прорастания пыльцы и роста пыльцевой трубки. В результате температурной обработки мужского гаметофитного поколения гибридов р1 дифференциальная передача аллелей обнаружена для локусов:

а) на стадии созревания пыльцы - (хромосома 2), А1 (3),-Зи1 (4) при действии повышенной и А1 (3), Би1 (4) и 01 (10) при Действии пониженной температуры;

б) на стадии зрелого пыльцевого зерна - Вт2 (1), А1 (3), Бц1 (4) и 01 '(10) как при действии повышенной, так и понинен-

. 39

ной температур;

в) на стадии прорастания пыльцы и роста пыльцевой трубки - Вт2 (1), Би1 (4), 011 (7) и Л (8) на низкотемпературном фоне.

Предполагается, что-.эти гены либо сами детерминируют чувствительность микрогаметофита к температуре, либо сцеплены в соответствующих хромосомах с генами, детерминирующими данное свойство гаплоидного генотипа. ■ •

б. В условиях температурного стресса на каждой из изученных стадий (созревания пыльцы, зрелого пыльцевого зерна, прорастания пыльцы и роста пыльцевой трубки) мужского гаметофита экспрессируется свой определенный набор генов, детерминирующих чувствительность пыльцы к температуре. При этом количество и состав генов, проявляющихся на гаплоидном уровне, в значительно меньшей степени зависят от вида температурного воздействия (повышенная или пониженная температура), чем от стадии микрогаметофита. Часть генов, имеющих сбою выраженность в мужском гаметофитном поколении, по-Бидимому, может проявляться как на этапах развития, так и функционирования микрогаметофита.

6, Отбор в зрелых пыльцевых зерен, устойчивых к повышенной температуре, и минрогаметофитов в период прорастания пыльцы и роста пыльцевой трубки, устойчивых к пониженной температуре,- приводит к значительному увеличению засухо- и холодоустойчивости спорофитного поколения, соответственно. Высокая эффективность селекции засухо- и холодоустойчивых генотипов на микрогаметофитном уровне указывает на экспрессию,в мужском га. метофите кукурузы значительной части генов генома спорофита, хонтролгаупцих данные признаки.

7. Прогревание зрелых пыльцевых зерен в гетерогенной популяции шпфогаметофитов благоприятствует реализации в процессе опыления-оплодотворения гаплоидных генотипов, несущих гены восстановители фертильности пыльцы стерильной цитоплазм :/.олдаЕского типа, что, очевидно, свидетельствует о его сцеплении с геном или генами, детерминирующими чувствительность пчльцы тс повышенной температуре. Данная температурная обработка пыльцы такго существенно увеличивает в образующемся потомстве выход растений с мощным фенотипом.

8. В результате использования разработанных нами методов оценки и отбора пыльцы на устойчивость к повышенной температуре на основе линии 092 созданы 20 инбредных линии, отличающихся от исходного генотипа более высокими теплоустойчивостью пыльцы и пыльцевой продуктивностью и не уступающих ему по комбинационной способности. С участием аналогов линии 092 получены знсокоуро:ааЯ!|«е гибриды, характеризующиеся высоким потенциалом ¡5 о'хнокыиш засухо- и жаростойкости.

ы-^арпроБаппе гетерогенной популяции пыльцы в горизонтально;! ьиздпшсн потоке суа;;)с?5внио дифференцирует пыльцевые зерна по ,ппне- и сплодотиирявде« способности, длине пыльцевой трубки, и¿ьиимм палецвиою зерна, а 1-с.а-е по раду кор^оцито-хамичеи-их. параметров ядра вегетативной ллегки. Влкяш-о к источнику создудоого потопа иыяьцзвьл зерна (2-я Ф^аг-.щ!;») по с 1 дальними (3-;; л ¿р^сц,..!) со::;.-

ЬиУй ОДаЧеШМИ ИЗучйННЫХ ПрИЗи&лСВ.

10. Использование в опылении рзддошх но ^ег-ь'х-^йьнои способности фракций пыльцы а значительно!! степени влияет на качество образующегося спорофитлого поколения. При этом опыление в г^ пыльцой с низкой летательной способностью (2-я Фрак-о 41

ция) по сравнению с высокой (3-я фракция) приводит к увеличению в Р2 частоты скороспелых и холодоустойчивых генотипов.

11. Впервые обнаружена связь между -жизнеспособностью пыльцы и двумя морфологическими параметрами ядра вегетативной метки пыльцевого зерна.Снижение процента прорастания пыльцы сопровождается существенным увеличением периметра и площади ядер (г варьирует от -0,73 до -0,95).

12. Показана принципиальная возможность осуществления эффективного отбора на микрогаметофитном .уровне у инбредтшх линий кукурузы. Об этом свидетельствует получение на основе инб-редной линии МК01 экотипов-подлиний с более высокой, чем-исходная форма, скороспелостью в результате проведения двукратной интенсивной селекции микрогеметофитов по конкурентоспособности.

РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Обнаруженная положительная связь между устойчивостью гаметофита и спорофита к температурному фактору (повышенная й пониженная температуры) позволяет, в определенной мере, о качестве спорофита судить по гаметофиту (пыльце). Предлагаемые методические подходы предусматривают возможность проведения оценки генотипов по жаро- (Лях и'др., 1990) и холодоустойчивости (Лях и др., 1991) практически на всех звеньях селекционного процесса, начиная с самых ранних его этапов. Кроме того, оценка устойчивости на уровне пыльцы представляет' самостоятельный интерес, так как в большой степени, характеризует устойчивость репродуктивной системы растения, что является весьма важным признаком в селекции кукурузы. . ' •

42

2. Для изменения качества спорофитного поколения, на основе выявленных связей между различными признаками гаметофи-та и спорофита, монет использоваться отбор в гетерогенных популяциях микрогаметофитов. При этом с помощью селекции гамет в популяциях удается существенно увеличивать частоту скороспелых, холодо- и засухоустойчивых растений, а также растений с мощным фенотипом. Использование данных методических приемов позволит обеспечить значительное ускорение селекционного процесса.

3. Методы сценки и отбора пыльцы на устойчивость к повышенной температуре могут успешно использоваться при создании высокоурожайных гетерсзисных гибридов, сохраняющих высокий урожай в засушливых условиях. Два полученных наг™ гибрида, .в состав которых вошли аналоги, линии 092, созданные методами пыльцевой селекции, по результатам трехлетнего конкурсного пспитавия в Институте генетики и НПО "Гибрид" могут быть рекомендованы для впрыгивания в производстве.

4. У-.-итакг;;; (;плзь иизду жизнеспособностью и летательной епос^т-ч/, ьп !и»!,ы"г, предложи способ отбора жизнеспособных пыльце-;.::.: и:< копу.г-п'ил 1::!.-рога.»етсфитов, который основан

рг.г''',г.'м гг::.-'^ гок-зс;;■;.■.зоздуянсм потоке и рпде-.■РНГ.Й гсорс,*. >КЦ'.Ш, бЛИЧЯий К ИСТО'.ШЖУ возщгпяого потока. ГТг. о л Г1Г т г."; ? й способ позволяет проводить отбор тшеспособкой гп;л-нк хукурузи практически на ст лсЗеа селекционной лаоора-тсп:и, поскольку ;гдя этих Ци.-.оЯ ¡«'пользуется 9С7,едсступиое 'оборудование.

5. В исследованиях по гаметофитному отбору было установлено, что при выдерживании метелок на различных температурных фонах наблюдается значительная элшинация некоторых генотипов

' о 43

пыльцы в процессе ее созревания. На нал; взгляд, эти результаты должны приниматься во внимание при использовании в различных селекционных программах широко применяемого метода хранения пыльцы, основанного на выдерживании метелок в лабораторных ■условиях, поскольку в результате длительного хранения пыльцы в метелках часть ценных генотипов монет бить потеряна еще до опыления. Аналогично вышесказанному,- с большой осторожностью также следует подходить к использованию в опылении пыльцевых зерен, выделенных из растения в зрелом .состоянии и хранившихся в лаборатории условиях при низких положительных температурах.

По материалам диссертации опубликована следующие paöowis

1. Кученко A.A., Кравченко А.Н., Суружиу А.И., Лях З.А. Газетный отбор на устойчивость к температурному фактору у то;.;а-тов. // Генет. основы селекции с.-х. культур в Молдавии. Кишинев, 1986. С.4-14.

2. Лях В.А., Сорока А.И., Дрючина E.H. Оценка жаростойкости пыльцы некоторых линий кукурузы. // Матер. Всес. конф."Экологическая генетика растений и животных." Кишинев, 1987.

• С.210-211.

3. Лях В.А. Гаметная селекция растений на устойчивость к температурному фактору. //Тез. докл. V съезда ВОГИС. М., 1987. '

4. Лях В.А., Кравченко А.Н., Сорока А.И., Дрючина E.H. Возможности гаметного отбора на устойчивость к температурному фактору у кукурузы. // Матер. Всес. конф. "Экологическая генетика растений и животных." Кишинев, 1987. С.209-210.

5. Lyakh V.A., Kravchenko A.N., Soroka A.I. Possibilities oi garste selection tor heat tolerance in maize. // Abstracts

44

of papers presented, at the XIV-th EUCAEPIA maize and sorghum section congress. Nitra,Czechoslovakia. 1987. P,45.

6. Лях В.А., Кравченко A.H., Сорока А.И., Дрючина E.H. Влияние гликозидов на жизнеспособность пыльцы кукурузы. // Изв. АН РМ. Серия Оиол. и хим. наук, 1987. Ji 4. С.24-27.

7. Лях В.А., Сорока А.И. Действие некоторых стероидных соединений на жизнеспособность пыльцы кукурузы. // В кн.: Фи-зич., хим. и матем. методы в современной биологии. Кишинев, 1987. С.29.

8. Лях В.А., Кравченко. А.Н., Сорока А.И. Влияние высокой температуры на жизнеспособность пыльцы кукурузы. // Изв. АН РМ. Серия биол. и хим. наук, 1988. N 2. С.15-20.

9. Кравченко А.Н., Лях В.А. и др. Метода гаметной и зиготной селекции томатов. Кишинев, "Штиинца", 1988. 152 С.

10.Lyakh V.A., Kravchenko A.N., Soroka A.I. Heat tolerance of maize (Zea mays L.) pollen. // Abs. 10—th Int. Symp. on Sexual Reproduction in Higher Plants. Italy, 1988. P.76.

'11.Лях В.A., Сорока А.И. Использование проращивания пыльцы для. оценки генотипов на устойчивость к высокой температуре у кукурузы.// Тез. докл. Всес. конф. "Частная генетика растений." Киев, 1989. Т.1. С.143-144.

12.Лях В.А., Сорока А.И. Использование гаметофитной селекции :для увеличения выхода скороспелых форм у кукурузы. // Тез. докл. Всес. конф. "Методы отбора по комплексам признаков в селекции растений." Симферополь, 1989. С.61-62.

13:Лях В.А., Сорока А.И., Кравченко А.Н. Аэродинамические свойства пыльцы различных генотипов кукурузы. // Матер. Матер. Всес. конф. "Онтогенетика высших растений." Кишинев, -, 1989. С.186. . .

45

14.Лях В.А. Холодоустойчивость мужского гаметофита кукурузы. // Матер. Всес. конф. "Онтогенетика высших растений." Кишинев, 1989. С.185..

15.Лях В.А., Сорока А.И. Возможности отбора жизнеспособной пыльцы кукурузы. // Тез. докл. научн. конф. "Изучение, охрана и рац. использ. прир. ресурсов." Уфа, 1989. С.90.

16.Сорока А.И., Лях В.А. Изменение'структуры популяции F£ при воздействии температуры на пыльцу гибридов кукурузы. // Тез. докл. IV Всес. конф. молодых ученых. Минск, 1990. С.24.

17.Кравченко А.Н., Лях В.А., Тодераш Л.Г.', Салтанович Т.И., Ласкал М.К., Духовный А.И. Методы гаметной селекции растений (Методические рекомендации). Кишинев, "Штиинца", 1990. 48 С. ■

18.Lyakh V.A., Soroka A.I., Kravcheriko A.N. Gameto]?hyte and sporophyte response to low temperature in different • maize genotypes. // Froc. 3-rd Int. Symp. on Characterization of Male Transmission Units in Higher Plants. Hungary, 1990. P.51-59.

' 19.Лях В.А., Сорока А.И. Холодоустойчивость мужских гаметофи-тов различных генотипов кукурузы. // Известия АН РМ. Серия биол. и хим. наук, 1990. Ji 2. С.27-32.

20.Лях В.А., • Кравченко А.Н., .Сорока А.И., Дрючина Е.Н. Способ определения жаростойкости генотипов кукурузы. // Авторское свид-во, # 1584838 от 15 апреля 1990г. Бюл. № 30. 15.08.90.

21.1yakh V.A., Soroka A.I. Air-dynamic properties of pollen and possibilities of pollen selection on the given trait in rr.aisci. // Abstract? of the XI Int. Symp.Bnbriology and Seed reproduction. Leningrad, 199G. P.94.

46

22.Лях В.А. Пыльцевая селекция на устойчивость к повышенной температуре у кукурузы. // Матер. Всес. конф."Экологическая генетика растений, животных, человека." Кишинев, 1991. С.376.

23.Лях В.А., Былич Е.Н. Жизнеспособность пыльцы и морфоцитохи-мические характеристики ядер пыльцевых зерен кукурузы. // Матер. Всес. конф. "Экологическая генетика растений, животных, человека." Кишинев, 1991. С.377.

24.1yakh V.A. Pollen viability and morphological and cytochemical characters of pollen grain nuclei.// Abstracts of Int. Symp. on Biocliera. genet, of plants. Sofia, Bulgaria. 1991. P.55.

25.Лях В.А., Кравченко A.II., Сорока А.И. Возможности гаметной селекции на устойчивость к температурному фактору у кукурузы. // Селекция растений: Новые генетические подходы и решения. Кишинев, "Штиинца", 1991. С.228-236.

26.Lyal;h V.A, Kravchenko A.N., SorokaA.I., Drjuchina E.N. Effects of high temperatures on mature pollen grains in wild and cultivated maize accessions. // Buphytica, 1991. V.55. P.203-207.

27.Лях В.А. Гаметофитный отбор как метод селекции растений. // Современные методы и подходы в селекции растений. Кишинев, "Штиинца", 1991. С.14-21.

28.Лях 3.А.,. Сорока А.И., Кравченко А.Н. Влияние отбора в Р., пыльцы с различными аэродинамическими свойствами на спектр

,'генотипической изменчивости расщепляющихся популяций. // Матер, пленума МОГиС. Кишинев, 1991. С.157-161.

29.Лях В.А.,- Кравченко А.Н., Сорока A.M. Способ оценки исход-ч ного материала кукурузы на холодоустойчивость. // Авторское

, 47

свид-во * 1692377 от 22 ивля 1991 г. Бюл. Ji 43 от 23.11.91.

30.Lyakh Y.A., Soroka A.I., Kravchenko A.N. Male gametophyte selection for cold tolerance In maize. // Abs. Int. Symp. on Angiosperm Pollen and Ovules. Basic and Appl. Aspects. Italy, 1991. P.36. ■.

31.Лях В.А.,' Сорока А.И., Былич E.H. Использование методов пыльцевого отбора в селекции кукурузы на температуро-устойчивость. // Матер. Респ. научн.-произв. конф. Горки, i992. С.48-49. .

32.Lyakh V.A. Competence of the pollen of wild species and the cultivar of tomatojto affect fertilization at low temperature. // Sex. Plant'Reprod., 1992. Y.5. Ji 2. P.128-130.

ЗЗ.Чалык С.Г., Лях В.А., Перчуляк Л.П. Новые подхода в селекции кукурузы. Кишинев, "Штиинца", 1992. 148 С.

34.Lyakh V.A., Soroka A.I. Air-dynamic properties of pollen and possibilities of pollen selection on the given trait in maize. // Proc. Int. Symp. on Bnbriology and Seed Reproduction. Leningrad, 1992. P.332-333.

.Зб.Лях B.A., Былич E.H. Изучение морфо-цитохимических свойств ядер пыльцы различающейся по зшзнеспособности у кукурузы.// Тез. докл. VI съезда МОГиС. Кишинев, 1992. С.124-126.

36.Лях В.А. Селективное действие различных температур на пыльцу кукурузы при ее хранении в метелках. // Тез. докл. VI съезда ВОГиС. Минск, 1992.

37.Lyakh V.A., Soroka A.I. Influence of pollen storage in tas3el on the quality of pollen grains and • structure of resulting populations. // Maydica, 19Э2. Y.37.