Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Микрогаметофитный отбор на устойчивость к температурному фактору у кукурузы

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Микрогаметофитный отбор на устойчивость к температурному фактору у кукурузы"

АКАДЕМИЯ НАУК БЕЛАРУСИ Институт генетики и цитологии

На правах рукописи

СОРОКА Анатолий Иванович

МИКРОГАМЕТОФИТНЫЙ ОТБОР НА УСТОЙЧИВОСТЬ К ТЕМПЕРАТУРНОМУ ФАКТОРУ У КУКУРУЗЫ

Специальность 03.00.15 — генетика

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Минск — 1992

Работа выполнена в Институте генетики АН РМ

Научный руководитель: кандидат биологических наук А. Н. Кравченко Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, член-корреспондент АН Б Б мотав В. Е.

доктор биологических наук Гордей И. А.

Ведущая организация:

Одесский сельс.чохо-якстьсннын кпетпту! Защита состоится « {{ » оыьЬжалЖ' 199'

в /{Ц часов на заседании специализированного совета К 006.0$ но защите диссертаций на соискание ученой степени кандид биологических наук в Институте генетики и цитологии АН Бе руси по адресу: 220734, г. Минск, ул. Скорниы, 27.

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной науч! библиотеке им. Я. Коласа.

Автореферат разослан « М » , 199

Ученый секретарь специализированного совета К 006.02.01, кандидат

биологических наук Е. В. Л оба

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

'--^^.¿¿¿туальность теш. В настоящее время в качестве одного из путей более эффективной селекции устойчивых к стрессовым факторам среди генотипов рассматривается метод гаметофитного отбора. Этот подход основан на существовании связи между проявлением гвмето-фитных и спорофитных признаков, обусловленной экспрессией одних и тех же генов на обеих стадиях развития растительного организма (Mulcahy, 1979; Tanksley et al., 1981; Sari Oorla et al., 1983). В сравнении с традиционными методами селекции на уровне спорофита, гаметофитный отбор имеет ряд преимуществ. К ним следует отнести легкость манипулирования таким селекционным материалом как пыльца растений (благодаря ее малым размерам) и гаплоидный генотип, обеспечивающий более высокую эффективность отбора. Вследствие этого селекционный процесс может быть в значительной степени интенсифицирован при применении этих методов (Muloahy, 1934; Ottaviano, Mulcahy, 1989).

Уже сейчас гаметофитный отбор успешно используется для повышения качества спорофитного поколения. Спектр культур, на которых достигнуты положительные результаты постоянно расширяется, и в настоящее время включает в себя такие важные для человека виды как томат (Zamir et al., 1982; Sacher et al., 1983; Лях, 1985; Кравченко, Лях и др., 1988), хлопчатник (Rodriguez-Garay, Barrow, 1988), капуста (Hodgkin, 1988) и некоторые другие. Однако, па кукурузе исследования подобного рода практически отсутствуют. Всо это предполагает проведете интенсивных разработок в области микрогаме тофитного отбора на кукурузе, являющейся важным объектом сельского хозяйства во многих странах. Особенно актуальным является изучение возможности селекции на гаплоидном уровне темпера-туроустсйчнЕых генотипов, поскольку как пониженные, так и повышенные температуры, действующие) в различные периода онтогенеза, существенно снижают потенциальную продуктивность у данной культуры.

Цель и задачи исследований. Целью настоящей работы является изучение влияния отбора в Р1 микрогаметофнтов, устойчивых к температурному фактору на структуру и качество (устойчивость к пониженной и повышенной температурам) образующегося спорофитного поколения у кукурузы.

В соответствии с этим в диссертационной работе ставились

следующие задачи:

1. Выявить различия между генотипами кукурузы по холодоустойчивости мужского гаметофита. Изучить возможность повышения холодоустойчивости спорофита за счет отбора микрогаметофитов, устойчивых к данному температурному стрессу в период прорастания пыльцы и роста пыльцевых трубок.

2. Исследовать влияние хранения пыльцы при пониженной температуре у гибридов на качество спорофитного поколения

3. Выявить разлитая между генотипами по устойчивости зрелой пыльцы кукурузы к повышенной температуре. Изучить возможность изменения качества спорофита за счет отбора температуроустойчивой пыльцы.

4. Установить особенности изменения моногибридного расщепления, оценок частоты рекомбинации, а также процентного соотношения некоторых фенотипических классов в Р2 в зависимости от температурной обработки мужского гаметофитного поколения в .

Новизна и практическая значимость результатов исследований.

Впервые получены данные о действии температурной обработки микрогаметофитов (на различных этапах их развития и функционирования) в Р1 на структуру и качество расщепляющихся популяций Р2.

Установлено, что отбор в микрогаметофитов (в период прорастания пыльцы и роста пыльцевых 'трубок), устойчивых к пониженной температуре, повышал холодоустойчивость расщепляющихся популяций на ранних стадиях развития растения' .. Отмечено, что эффективность отбора выше при 10-13°0, чем при 16-18°С.

Обнаружены различия в реакции ядер вегетативной и генеративной клеток пыльцы на воздействие повышенной температурой у контрастных по жаростойкости линий кукурузы.

Показало, что обработка повышенной температурой микрогаметофитов как на стадии зрелой пыльцы, так и в период прорастания пыльцы и роста пыльцевых трубок в Р1 повышает засухоустойчивость образующегося спорофитного поколения.

В результате исследований по микрогаметофитному отбору на устойчивость к температурному фактору выявлена экспрессия генов на различных этапах развития и функционирования мужского гаметофита. Установлено, что 1-я, 3-я, 10-я и 1-я, 3-я, 4-я и 10-я хромосомы 'детерминируют, хотя бы частично, чувствительность зрелой •пыльцы соответственно к. повышенной и пониженной температурам; а 4-я, 7-я и 8-я хромосомы - чувствительность микрогаметофитов в

период прорастания пыльцы и роста пыльцевых труСок к пониженной температуре.

Предложенные в работе методические приемы могут найти успешное применение в селекционной практике для эффективного отбора устойчивых к температурным стрессам генотипов кукурузы.

Апробация работы. Результаты исследований докладывались и обсуждались на Всесоюзной конференции по онтогенетике р.чсших растений (Кишинев, 1989), 3-м Международном симпозиуме по клеткам спермиев у высших растений (Венгрия, Мартонвашар, 1989), Всесоюзной конференции молодых ученых по физиологии растительной.клетки (Минск, 1990), Международном симпозиуме по пыльце и. яйцеклеткам покрытосеменных растений (Италия, Комо, 1991), Всесоюзной конференции по экологической генетике растений, животных и человека (Кишинев, 1991), заседании Ученого совета ИГ АН РМ (1991).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 10 работ.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 162 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, материала и методов, трех экспериментальных глав, обсувде-ния, выводов и списка использованной литературы. В работе приведены 24 таблицы и 8 рисунков. Список литературы включает 241 наименоЕчние, в том числе 180 иностранных авторов.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

В качестве объекта исследований использовали гибриды Р1 кукурузы, полученные от скрещивания самоопыляющихся линий юто4, XL18, МК01 с многомаркерной формой - тестером Мангельсдорфа. Тестер Мангельсдорфа (мМ) маркирован 10-тью генами, локализованными в различных хромосомах, однако, в наших экспериментах учитывали лишь семь из них, легко идентифицирующихся на ранних стадиях развития растения: bm2 (1-я хромосома), lgl (2), ai (3), sul (4), gn (7), J1 (8), gi (10). В отдельных случаях использовали .такзэ гибриды Хлг 286 * Хлг 162 и Вир 27 « Mit 01. Родительские компо-кзнтн используемых гибридов различались по устойчивости к пониженной и повышенной температурам на спорофитной стадии развития. Растения выращивали в условиях теплицы в грунте, либо в сосудах емкостью 10,0 л. Сбор пыльцы с растений производился в утренние часы в солнечную погоду. В контрольных вариантах опыление проводили свекесобранной пыльцой не позднее, чем через 30 мин после сбора.

Бо всех экспериментах анализировали жизнеспособность пыльцы, которую определяли при помощи метода проращивания пыльцы на искусственной питательной среде (Cook, Waiden, 1965). Пыльцевые аерна подсчитывали в 15-20 полях зрения и измеряли длину 30-50 случайно-выбранных пыльцевых трубок в делениях окуляр-микрометра при увеличении 125.

00 устойчивости пыльцы к повышенной и пониженной температурам судили по изменении процента прорастания пыльцы и длины пыльцевых трубок в опытных вариантах ю сравнению с контролем. В контроле све&есобранную пыльцу высевали на питательную среду и проращивали при 26±1°С в течение 3-х часов. Для оценки холодоустойчивости пыльцы в опытном варианте ее высевали на питательную среду и проращивали при температуре 12±1°С в течение 6-ти часов. В опытном варианте по оценке теплоустойчивости пыльцы стекла с размещенной на них монослоем пыльцой помещали в термостат и прог-. ревали при 35 °С в течение 3, 5, 10, 15 и 20-ти минут. После проведения температурной обработки пыльцу высевали на искусственную питательную среду и проращивали при 26°С в точение 3-х часов.

Для проведения отбора в Р1 микрогаметофитов, устойчивых к пониженной температуре на этапе прорастания пыльцы и роста пыльцевых трубок in vivo, в качестве фактора отбора использовали по-нииекные тешературы 10-13°С и 16-18°С, в контроле - 22-29°С. Через 6 суток растения опытных вариантов переносили на температурный фон 22-29°С, предварительно удалив часть рылец с 1,5-2 см обвертки початка для предотвращения прорастания при оптимальной температуре ранее непроросией пыльцы.

Отбор в Р., зрелой пыльцы, устойчивой к пониженной температура осуществляли за счет ее хранения при 3-5°С и 90й-ной влажности воздуха в течение 1-7 суток. Через каждые сутки часть пыльцы использовали для ОИЫЛОНИЯ.

Для проведения отбора ь г1 пыльцы, устойчивой к повышенной температура, ее размещали монослоем на предметном стекле, после чего прогревали при 35°С в течение 5-20 мин в термостате.

Влияние различных обработок пыльцы гибридов Р1 на структуру и качество расщепляющихся популяций Р2 и во1 оценивали но следующим критерии,■i:

а) изменению моногибридных соотношений rio семи маркерным локу • сам в опытных вариантах но сравнению с контролем;

б) изменению оценок частот рекомбинаций между несценлошшми

•Í

маркерами;

в) изменению процентного соотношения некоторых классов фенотипов в опытных вариантах по сравнению с контролем;

г) изменению холодо- и засухоустойчивости на ранних стадиях развития растения.

Анализ холодоустойчивости сриоопыленных линий и расщепляющихся популяций проводили по методу Югенхоймера (1979). О холодоустойчивости судили также по способности семян формировать длинные зародышевые корешки и ростки на фоне пониженной температуры.

Оценку популяций на засухоустойчивость проводили по методу Осипова (1968), основанному на проращивании семян на растворах сахарозы с высоким осмотическим давлением.

Для изучения морфологических и цитохимических характеристик ядер вегетативной и генеративной клеток пыльцы использовгли анализатор микрообъектов "Морфоквант". Постоянные препараты готовили по методике Ермакова и др.- (1976) и Кравченко (1986).

Достоверность отклонений опытных данных от контроля оценивали по критерию Стьыдента, а отклонения частоты полученных моногибридных соотношений от контроля определяли по критерию хи-ивад-рат при уровнях значимости 0,05, 0,01 и 0,001. Оценку частоты рекомбшшции (в процентах) между несцеплешшми маркерами проводили по методу максимального правдоподобия. Процентное соотношение фенотипических классов анализировали ' лишь для всех возможных двойных рецессивов, независимо от состояния аллелей по другим маркерам. Все эксперименты проводились в трехкратной повторности. Объем высеянных семян по каждому варианту составлял не менее 400500 штук.

Статистическую обработку экспериментальных данных проводили на мини-ЭВМ СМ-4, а также на персональных компьютерах типа "1ВМ РС" по программам, разработанным в Институте генетики АН РМ Королем А.Б. и Прейгелем И.А.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ МИКРОГАМЕТОФИТНЫИ ОТБОР НА УСТОЙЧИВОСТЬ К ПОНИЖЕННОЙ ТЕМПЕРАТУРЕ

Известно, что эффективность микрогаметофитной селекции главным образом зависит от наличия генетической гетерогенности исходного материала. В силу этого, для получения используемых в исследовании по микрогаметофитному отбору гибридов Р1 должны быть

вовлечены линии достаточно контрастные по холодоустойчивости на уровне мужского гаметофита. Другой особенностью получения гибридов Р1 являлось то, что для части материала одним из обязательных компонентов скрещивания была гаркерная форма, в качестве которой использовался метчик Мангельсдорфа. Поэтому линии, используемые для получения гибридов Р1 должны, прежде всего, быть контрастными по холодоустойчивости их микрогаметофитов в отношении этой маркерной формы.

Анализ ряда линий кукурузы показал, что они существенно различались по реакции пыльцы in vitro на действие пониженной.темпе-.ратуры. Так, одни линии характеризовались довольно выооким процентом прорастания пыльцы при действии на нее пониженной температуры, тогда как другие - низкими значениями этого показателя. Сходные различия мезду генотипами по холодоустойчивости пыльцы наблюдались и при изучении длины пыльцевых трубок в условиях in vitro.

На основании вышеприведенной оценки для скрещивашш с многомаркерной формой были отобраны линии с менее уотойчивой к холоду пыльцой, чем у мМ - ш 404 и с более холодостойким мужским гамэ-тофитом - XL 18. В результате были получены гибриды P1 miv 404 *

M)J И XL 18 X мМ.

Используемые в исследовании лиши Онда также оценены по холодоустойчивости на уровне спорофита. Полученные данные позволяют говорить о положительной связи между устойчивостью гаметофита и спорофита кукурузы к действию пониженных температур, что, вероятно, обусловлено экспрессией одних и тех же генов холодостойкости в обеих фазах жизненного цикла.

Структура расщепляющихся популяций. Для оценки действия отбора в Р1 на структуру расщепляющихся популяций в Р2 использовали метод маркерного анализа. Как видно из Табл.1, действие пониженной температуры 16-18°С в период прорастания пыльцы и роста пыльцевых трубок гибрида P1 Hilv 404 х мМ не оказывает существенного влияния на частоту моногибридных соотношений по всем изученным генам. Более низкая температура (Ю-13°С) такке не влияла существенным образом на расщепление по пяти из семи изученных маркеров. Однако, по генам еш (4-я хромосома) и J1 (8-я хромосома) частота растений, обладающих доминантными аллелями данных генов, значимо превосходила таковую в контроле.

При действии пониженной температуры на гетерогенную ионуля-

цию микрогаметофитов гибрида ХЪ 18 * мМ в Р2 наблюдали изменение в расщеплении помимо локусов Би1 и л еще и по гену gl1. Характерно, что на данной гибридной комбинации оба температурных режима были эффективными.

Таблица 1

Влияние обработки микрогаметофитов в Р., пониженной температурой на моногибридпое расщепление в Р?

Соотношение генотипов

Вариант

Bm2:bm2 Lgl: lgl А1:а1 , Su1: eu1 011 :gl1 J1 :J1 Q1:g1 •

HMv 404 « мМ

Контроль 3,31 3,39 7,30 3,50 3,31 4,21 2,80

(22/29°С)

16/18°С 3,08 3,02 10,98 3,90 3,43 5,95 2,73

10/13°С 3,57 3,23 7,90 5,32* 3,06 7,60* 2,58

XL 18 « мМ

Контроль 5,80 2,83 1,06 2,59 3,63 5,40 2,83

(22/29°С)

16/18°С 6,13 3,19 1,12 4,00** 2,24** 4,99 2,96

10/13°С 6,49 2,76 1,05 3,62** 2,80* 4,17* 3,07

Примеч. *, ** - различия достоверны при Р < о,05 и 0,01 соот-

ветственно.

О значительном селективном действии пониженной температуры на микрогаметофиты гибридов Р1 свидетельствуют и данные анализа соотношения различных классов фенотипов в популяциях т^. Так, в опытном варианте (10-13°С) по 3 из 21 изученного класса наблюдались существенные отклонения от контроля.

Полученные данные свидетельствуют об экспрессии части генов генома кукурузы на гаметофитной стадии развития растения. Очевидно, гены ви1, ви и либо сами принимают участие в детерминировании холодоустойчивости на стадии прорастания .пыльцы и роста пыльцевых трубок, либо сцеплены в данных хромосомах с локусами, участвующими в определении устойчивости микрогаметофитов к пониженной температуре.

Холодоустойчивость популяций Действие пониженной темпе-

О 5 10 15 20 25

ш ей о

о &

В 5 1В 15 20 25

Длина корешка, мм

0 2 Ч В 8 10

В

В 2 Ч В В 10 12

Длина ростка, юл

Рис.

Клияние отбора в ^ Щу 404 х мМ микрогаматофитов, устойчивых к пониженной температуре, на распределение растений в р по длине корешка (а) и ростка (б):

А - растения Бц1- (неморщинистый эндосперм): Б - растения оц1аи1 (морщинистый эндосперм); -—~ контроль; —«-и---опыт.

ратуры на этапе прорастания пыльцы и роста пыльцевых трубок оказывало существенное Елияние на холодоустойчивость образующегося спорофитного поколения. На Рис. показано распределение растении по длине корешка и ростка измеренных на фоне пониженной температуры, в контрольной и опытной популяциях ?2 комбинации скрещивания нму 404 * мМ. Видно, что во всех грушах анализируемых растений (с и без гена вш) в опытном варианте по сравнению с контролем наблюдается увеличение частоты растений в классах с максимальной длиной корешка. Сходныо отличия были такяе обнаружены и по другому изучаемому признаку - длине ростка.

Характерно, что действие пониженной температуры на микрога-метофиты в некоторых случаях приводит к расширению спектров изменчивости по длине корешка и ростка. При этом, расширение спектра происходит за счет появления классов с максимальными значениями признака, отсутствующими в контроле.

Эффективность отбора оценивали также и на гибриде Р1 Хлг 286 * Хлг 162, родительские компоненты которого были контрастными по холодоустойчивости на обеих стадиях жизненного цикла. В данном случае оценку холодоустойчивости популяций проводили при помощи двух методов: холодового проращивания семян при 10°С и методу Югенхеймеча. Оба метода дали сопоставимые результаты, свидетельствующие о более высокой холодоустойчивости опытных популяций.

ОТБОР НА СТАДИИ ЗРЕЛОГО ПЫЛЬЦЕВОГО ЗЕРНА ПРИ ХРАНЕНИИ ПЫЛЬШ В УСЛОВИЯХ ПОНИЖЕННОЙ ТЕМПЕРАТУРЫ

Жизно- и оплодотворяющая способность пыльцы. В данном эксперименте использовались те же гибриды, что и в опытах по действию пониженных температур на этапе прорастания пыльцы и роста пыльцевых трубок: ХЬ 18 х мМ и НЫу 404 * мМ.

Пыльца обоих гибридов постепенно снижала своя шзнеспособность с увеличением времени хранения. Через 5 суток жизнеспособность пыльцы гибридов хь 18 * мМ и нму 404 * мМ составляла 2С,0% и 20,7%, а через 7 - 2,8$ и 10,7$ от исходной.

Хранение пыльцы негативно влияло на ее оплодотворяющую способность, на что указывало существенное -уменьшение озернешюсти початков в опытных вариантах.

Структура расщепляющихся популяций. Анализ данных Табл.2 свидетельствует о значительных изменениях в популяциях Р2 моногибридных соотношений по некоторым из исследованных генов в вари-

антах хранения пыльцы 5 и 7 суток. На гибридной комбинации 404 « мМ различия между контролем и опытными вариантами были обнаружены для трех маркерных генов - а1, ац1 и £1, а у ХЬ 18 * мЫ - для а1 и Ъга2.

Характерно, что наиболее длительное хранение пыльцы вызывало изменения моногибридных соотношений по большему числу маркерных генов. Очевидно, 7 суток хранения по сравнению с другими вариантами являлись наилучшим фоном для избирательного действия на пыльцу.

Таблица 2

Влияние хранения пыльцы гибридов Р1 при температуре +3+5°0 на моногибридные расщепления в Р2

Соотношение генотипов

Вариант -_:_

Вт2:Ьга2 1^1!А1:а1 8и1 :ви1 011 «ёИ 01 !в1

ХЬ 18 х ММ

Контроль 3,53 3,15 9,31 2,86 3,33 5,80 2,65

3 суток 4,03 2,63 5,79** 3,08 2,78 5,40 3,20

5 суток 4,92** 2,86 3,75*** 3,16 2,83 5,51 2,86

НЫу 404 х ММ

Контроль 3,89 ■ 3,23 2,82 2,45 2,91 - 3,67

2 суток 3,94 3,38 3,01 2,94 2,93 - 3,10

5 суток 3,64 3,28 2,09 4,20*** 2,71 - 3,17

7 суток . 4,03 2,90 2,09* 3,79*** 3,22 - 2,55**

Примеч. *, **, *** - отличия от контроля значимы при р < о,05, 0,01 и 0,001 соответственно.

Варианты, различающиеся длительностью хранения пыльцы (3, 5 суток), сравнивали между собой по процентному соотношению некоторых фенотипических классов. Наибольшие отклонения от контроля наблюдались в варианте хранения пыльцы в течение 5 дней. В данном случае значимые различия отмечались по трем фенотипическим классам. В варианте хранения пыльцы в течение 3-х суток отличий от контроля.практически не наблюдалось.

Полученные данные позволяют говорить о том, что длительное выдерживание пыльгу кукурузы при пониженной температуре является

селективным фоном, обусловливающим отбор одних генотипов и элиминацию других. Это, в свою очередь, указывает на генетическую активность пыльцы при ее хранении в условиях +3+6°С.

Холодоустойчивость популяций Для оценки действия попиленной температуры в период хранения пыльцы на холодоустойчивость растений в следующем поколении семена расщепляющихся популяций Р2 проращивали при 10°С и через 3-4 недели анализировали длину корешков и ростков. В данном случае в качестве сравниваемых использовали варианты, где пыльца хранилась в течение 5-ти и 7-ми дней. Установлено, что хранение пыльцы в течение 7-ми суток обеспечивало в потомстве реализацию большего числа холодостойких генотипов. На это указывали как большие значения средней длины корешка и ростка, так и увеличение спектра изменчивости указанных признаков.

Появление новых классов генотипов.в популяциях Р2 в варианте с наиболее длительным сроком хранения пыльцы, по-видимому, объясняется элиминацией менее холодостойких гаметофитов в процессе хранения. Являясь более конкурентоспособными по сравнению с холодостойкой пыльцой в нормальных условиях среды, они при оптимальной температуре препятствовали реализации последних (холодостойких гаплоидных генотипов) в процессе оплодотворения.

' ПЫЛЬЦЕВАЯ СЕЛЕКЦИЯ НА УСТОЙЧИВОСТЬ К ПОВЫШЕННОЙ ТЕМПЕРАТУРЕ

Как уже отмечалось ранее, одним из условий проведения эффективного отбора в гаплоидном поколении гибрида Р1 является наличие генетической изменчивости по селектируемому признаку мужского га-метофита. В связи с этим, ряд генотипов оценивали по устойчивости пыльцы с целью их дифференциации и получения Р1. Для оценки использовали следующие линии: 404, ХЬ 18, МК 01 и мМ.

Исследуемые генотипы существенно различались по реакции пыльцы на прогревание. У одних генотипов степень сшшзния жизнеспособности пыльцы после десятимшутного воздействия на лее повышенной температурой составляла лишь 50$ и меньше, тогда как у других. -, почти 1СШ. На основании полученных данных генотипы были разделены на устойчивые к высокой температуре (ХЬ 18, нму 404), со средней устойчивостью (мМ) и неустойчивые (МК 01). Можно предположить, что гибриды XI 1а » мМ, 404 * мМ, и (Ж 01 * мМ будут отвечать требованиям для проведения отбора на стадии зрелой пыльцы.

Линии, контрастные по устойчивости к повышенной температуре также значительно различались по реакции ядер вегетативной и генеративной клеток пыльцы на данное температурное воздействие. При прогревании пыльцы температуроустойчивой линии нМу 404 отмечено увеличение числа ядер с высоким содержанием ДНК и, наоборот, у чувствительной линии МК 01 возрастало число клеток с низким содержанием ДНК.

Структура расщепляющихся популяций. В результате анализа расщепляющихся популяций Р2 установлено, что прогревание пыльцы гибридов Р1 приводило к изменению соотношений генотипов по ряду маркерных генов. У гибрида МК 01 * тИ значимые отклонения от контроля наблюдались для генов Ьш2 и а1, расположенных соответственно в 1-й и 3-й хромосомах, а у гибрида XI 18 к тМ - для гена £1 (ю-я хромосома).

Интересно отметить, что различия мевду опытом и контролем имелись лишь в том случав, когда температурный фон обработки пыльцы был достаточно жестким (снижение жизнеспособности пыльцы составляло 60% и более). Причем эффект отбора был наибольшим в варианте, где снижение жизнеспособности пыльцы составляло 80-100% (Табл.3).

Таблица 3

Влияние прогревания пыльцы в Р1 ХЬ 18 * мМ на моногибридные расщепления в Р2

Соотношение генотипов

Вариант

Вш2:Ьт2 1^1:1^1 А1 :а1 Би1 :ви1 011^11 Л:Я 01

Контроль 4,10 . 3,05 1,22 2,80 2,90 5,54 3,18

Прогревание пыльцы: снижение жизнеспособности на

5-15% 4,66 3,27 1,09 2,68 3,10 4,60 3,13

15-355& 4,58 3,19 1,13 2,70 3,02 4,71 3,01

35-60Ж 4,4 3,35 1,16 2,70 3,04 4,56 2,99

60-80% 3,94 3,30 1,20 3,03 3,11 4,65 2,58*

80-100% . 4,22 2,73 1,11 3,20 3,06 5,39 2,48*

Примеч. * - отличия от контроля значимы при Р < 0,05.

Термообработка пыльцы исследуемых, гибридов приводила к значительному изменению оценок частоты рекомбинаций между несцеплен-шми маркерными генами. Если в контрольной популяции частота рекомбинации практически по всем парам маркеров незначительно отличалась от 50%, что, как и следовало ожидать, свидетельствует о независимом комбинировании исследуемых маркерных генов, то в результате обработки пыльцы независимое комбинирование по ряду маркеров нарушалось.

Результаты анализа моногибридных расщеплений и оценки частот рекомбинаций свидетельствует об избирательном действии повышенной температуры на определенные классы генотипов гамет в гаплоидном поколении Р.,. Значительный селективный эффект данного температурного воздействия, очевидно, обусловлен экспрессией части генов

Таблица 4

Действие отбора в Р1 температуроустойчивых микрогаметофмтов на качество популяций Рэ

Степень

С1ШЖ6Ш1Я

Вариант жизяес-пособн. пыльцы в опыте, %

Процент семян, проросших па растворе осмотика, через

8 дней 12 дней

Корешок Росток Корешок Росток

Контроль - 14,8

35°С (П/з) 49,9 18,6

32~36°С (п/т) - 33,9**

Контроль - 2,4

Зб°С (п/з) 80,2 15,0***

32-36°С (П/Т) - 5,0

Контроле - 9,0

32-36°С (п/т) - 22,7а**

0,9 24,2 4,0

0,9 34,5* 0,9

7,6** 36,8** 13,5**

0,0 7,2 0,0

1.5 29,0*** 6,8*** 1,0 18,1** 5,0**

1.6 27,5 4,7 4,0 54,0*** 14,1***

Примеч. *, **, *** - отличия от контроля значимы при р < 0,03, 0,01 и 0,001 соответственно, п/з - зрэлая пыльца, п/т - пыльцевые трубки.

генома на стадии зрелой пыльцы при ее прогревании. Предполагается, что гены Ьш2, а1 и gi, локализованные в 1-й, 3- й и 10-Й хромосомах соответственно, либо сами детерминируют, либо сцеплены с генами, детерминирующими чувствительность зрелой пыльцы к повышенной температуре.

Засухоустойчивость спорофитного поколения. Данные о влиянии отбора в Р1 пыльцы, устойчивой к повышенной температуре, на качество (засухоустойчивость) спорофитного поколения Р2 представлены в Табл.4. При этом повышенной температурой действовали как на зрелую пыльцу, так и на микрогаметофиты в период прорастания пыльцы и роста пыльцевых трубок (гибрид Вир 27 х МК 01). О засухоустойчивости популяций Р2 судили по проценту семян, проросших на растворе с осмотиком.

Как видно из таблицы, прогревание зрелой пыльцы значительно увеличивает в Р2 процент семян, проросших на растворе с осмотиком, что свидетельствует о более высокой засухоустойчивости опытных популяций по сравнению с контролем.

Эффективной оказалась также обработка повышенной температурой микрогаметофитов в период роста пыльцевых трубок in vivo. Во всех вариантах воздействия повышенной температурой на рост пыльцевых трубок процент проросших семян на растворе с осмотиком был значимо выше, чем в контрольной популяции.

ВЫВОДЫ

1. Установлены различия между генотипами по реакции микрога-метофитов в период прорастания пыльцы и роста пыльцевых трубок на действие пониженной температуры. Обнаружена положительная зависимость между устойчивостью гаметофита и спорофита к данному температурному фактору.

2. Отбор в F1 микрогаметофитов (в период прорастания пыльцы и роста пыльцевых трубок), устойчивых к пониженной температуре, изменял моногенные соотношения по трем из семи изученных генов: sui (4-я хромосома), gil (7-я хромосома) и J1 (8-я хромосома) и повышал холодоустойчивость расщепляющейся популяции на ранних стадиях развития растения. Эффективность отбора была выше при 10-13°С, чем при 16-18°С.

3. Использование в опылении пыльцы, хранившейся длительное время при пониженной температуре, приводило к изменению моногибридных соотношений по маркерным локусам bm2 (1-я хромосома), а1

(3-я хромосома), sui (4-я хромосома) и gl (ю-я хромосома), а также повышало холодоустойчивость образующегося спорофитного поколения.

4. Выявлены различия между генотипами по реакции зрелой пыльцы на прогревание при температуре Зб°С в течение 10-20 мин. Причем различия наблюдались как по проценту прорастания пыльцы, так и по длине пыльцевых трубок после посева пыльцы на искусственную питательную среду. Обнаружена положительная зависимость между устойчивостью гаметофита и спорофита к повышенной температуре.

5. Обнаружена различная реакция ядер вегетативных и генеративных клеток пыльцы на воздействие повышенной температурой у контрастных по жаростойкости линий кукурузы.

6. Прогревание зрелой пыльцы гибридов Р1 в расщепляющейся популяции ?2 изменяло оценку частоты рекомбинации между несцеп-ленными маркерными генами и моногибридные соотношения по трем из семи изученных генов: Ът2 (1-я хромосома), ai (3-я хромосома) и gl (Ю-я хромосома), аффект наблюдался лишь в том случае, когда прогревание обеспечивало снижение жизнеспособности пыльцы в опыте по сравнении с контролем не менее, чем на 60%.

7. Действие повышенной температуры на зрелую пыльцу гибридов ?1 а тага» на мшсрогаметофиты в период роста пыльцевых трубок 1п 7lvo в тканях столбика, повышало засухоустойчивость расщепляющейся популяции.

8. Исследования по микрогамвтсфггаому отбору выявили экс-■ прэссию генов в гаплоидной фазе развития растения - на стадии

зрелой пыльцы и в период прорастания пыльцы и роста пыльцевых трубок. Установлено, что 1-я, 3-я, 10-я и 1-я, 3-я, 4-я, 10-я хромосомы детерминируют, хотя бы частично, чувствительность"зрелой пыльцы к повышенной и понинэнной температурам соответственно, а 4-я, 7-я, 8-я хромосомы - чувствительность мшсрогамэтофитов в период прорастания пыльцы и роста пыльцевых трубок к пошскенной температуре.

РЕШ.ЯЕШШШ

1. Учитывая связь мээду устойчивостью гаметофита и спорофита как к высокой, тек и к пониженной температурам, о качестве спорофита в определенной маре могага судить по гаметофиту. Таким образом, оценка теплоустойчивости или холодоустойчивости микрогамото-фита мокет одновремешю являться и оценкой спорофита на

устойчивость к высокой и пониженной температурам. Предложенные методические подходы могут найти успешное применение в селекционном процессе, особенно, на ранних его этапах, когда не представляется возможным дать оценку на уровне спорофита.

2. Исследования по изучению влияния отбора в гаплоидном поколении гибридов F., на стадии зрелой пыльцы и в период прорастания пыльцы и роста пыльцевых трубок на качество спорофитного поколения расщепляющихся популяций свидетельствует о его эффективности. При этом селекция в Р1 микрогаметофитов, устойчивых к повышенной и пониженной температурам, значительно повышала устойчивость спорофитного поколения к используемым факторам отбора. Данные приемы могут использоваться на практике как один из путей ускорения селекционного процесса.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Лях В.А., Сорока А.И. Холодоустойчивость мужских гамето-фитов различных генотипов кукурузы // Известия АН МССР, серия <3и-ол. и хим. наук, 1990. - N 2.

2. Сорока А.И., Лях В.А. Изменение структуры популяции Р2 при воздействии температуры на пыльцу гибридов F1 кукурузы // Тез. докл. IY Всес. конф. мол. ученых. Минск. 1990.

3. Lyakh V., Soroka A., Kravohenko A. Gametophyte and sporophyte response to low temperature in different maize genotypes // Proo. Int. Symp. "Charaoterization of Male Transmission Unite in Higher Plante", Martonvasar, 1989, June 1216. Budapest,' 1990.

4. Lyakh V., Soroka A., Kravohenko A. Male gametophyte seleotion for oold toleranoe in maize // Abstracts ol Int. Symp.' on Angiosperm pollen and ovules. Basic and applied aspeóte. Como, Italy. 1991.

5. Сорока А.И. Микрогаметофитный отбор на устойчивость к пониженной температуре у кукурузы // Известия АН РМ, серия биол. и хим. наук, 1991. - N 4.

6. Сорока А.И. Изменчивость морфоцитохимических параметров ядер пыльцы кукурузы в условиях повышенной температуры // Современные метода и подходы в селекции растений. Кишинев, "Штишща", 1991.

7. Lyakh V., Kravohenko A., Soroka A., Dryuohina Е. Effects of high temperatures on mature pollen grains in wild and

cultivated maize aooessions // Euphytioa, 1991. - V.55.

8. Soroka A.I. Effects of high temperature on moriologioal and oytochemical characteristics of pollen nuolei in different maize lines // Abstracts of Int. Symp. on Biochem. genet, of plants. Sofia, Bulgaria. 1991.

9. Сорока А.И. Влияние микрогаметофитного отбора на холодоустойчивость популяций f2 у кукурузы // Матер. Всес. конф. "Экологическая генетика растений, животных и человека". Кишинев, 1991.

10. Сорока А.И. Изменение структуры расщепляющейся популяции в результате хранения пыльцы при пониженной температуре у кукурузы // Там же. Кишинев, 1991.