Цитокинин-связывающие белки хлоропластов листьев ячменя

Люкевич, Татьяна Владимировна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Цитокинин-связывающие белки хлоропластов листьев ячменя
ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Цитокинин-связывающие белки хлоропластов листьев ячменя"

На правах рукописи

Люкевич

Татьяна Владимировна

Цитокинин-связывающие белки хлоропластов листьев ячменя

03 00 12- Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

МОСКВА-2005

Работа выполнена в Лаборатории экспрессии генома растений Института физиологии растений им. К.А.Тимирязева РАН, г. Москва

НАУЧНЫЕ РУКОВОДИТЕЛИ: доктор биологических наук кандидат биологических наук

Кузнецов Виктор Васильевич Каравайко Наталья Николаевна

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ: доктор биологических наук

Клячко Нелла Леопольдовна

доктор биологических наук

Юрина Надежда Петровна

ВЕДУЩЕЕ УЧРЕЖДЕНИЕ:

Московский Государственный Университет им М.В. Ломоносова, Кафедра физиологии растений

Защита состоится «12 » апреля 2005 г. в 11 часов на заседании Диссертационного совета К 002.210.01 при Институте физиологии растений им. К.А.Тимирязева РАН по адресу:

127276, г. Москва, ул. Ботаническая, 35. Факс (095) 977 -80-18 E-mail: ifr@ippras.ru

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института физиологии растений им. К.А.Тимирязева РАН

Автореферат разослан

марта 2005 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета, кандидат биологических наук

Общая характеристика работы.

Актуальность проблемы В настоящее время установлено, что действие гормонов на клетки-мишени осуществляется через специфические клеточные рецепторы. Изучение механизма действия гормонов заключается в исследовании их рецепторов и процессов, приводящих к проявлению специфического гормонального эффекта.

Для цитокининов открыты мембранные рецепторы (Inoue et al., 2001; Ueguchi et. al., 2001), воспринимающие внешний по отношению к клетке цитокинин. Эти рецепторы участвуют в активации ядерных генов первичного ответа (ARR типа А) цитокинином (Sakakibara et. al., 1998; D'Agastino et. al., 2000). Кроме того, обнаружены ядерные цитокинин-связывающие белки, способные в присутствии цитокинина активировать транскрипцию in vitro в гомологичных транскрипционных системах, содержащих выделенные ядра или препараты хроматина (Каравайко с соавт., 1995, Kulaeva et. al., 1995, 2000). Эти белки являются кандидатами на роль внутриклеточных рецепторов цитокинина, подобно ядерным рецепторам стероидных гормонов животных (Hall et. al., 2001).

Однако, несмотря на значительный прогресс в изучении механизма действия цитокинина, практически ничего не известно о поступлении цитокининового сигнала в хлоропласты и о белках, которые участвуют в рецепции и передаче этого сигнала. Между тем известно, что хлоропласты являются одной из основных мишеней действия цитокининов в клетке листа (Хохлова с соавт., 1978, Kusnetsov et. al., 1994, Kulaeva et. al., 2002). Показано также, что хлоропласт содержит большой набор цитокининов (Benkova et. al., 1999). Несколько лет назад в нашей лаборатории был выделен из хлоропластов листьев ячменя цитокинин-связывающий белок (хлЗСБ), который, совместно с зеатином, регулировал тотальную хлоропластную транскрипцию в системе in vitro. До настоящего времени это единственный белок, который может претендовать на роль предполагаемого рецептора цитокинина в пластидах. Требуется дальнейшее изучение этого белка.

Это определило цель и задачи нашей работы.

Цель и задачи исследования Целью работы являлось изучение функциональных и некоторых структурных особенностей хлЗСБ в листьях ячменя разного возраста.

Для ее достижения были поставлены следующие задачи: 1

1) Исследовать чувствительность к цитокинину в онтогенезе первого листа растений ячменя, сравнив разные сорта для выбора оптимального для работы объекта.

2) Изучить присутствие хлЗСБ в первом листе ячменя в ходе его развития.

3) Проанализировать в условиях нативного электрофореза изменения хлЗСБ в листьях разного возраста, различающихся по чувствительности к цитокинину.

4) Сравнить функциональные свойства хлЗСБ из листьев ячменя разного возраста, а также из других видов растений.

5) Изучить активность ЗСБ в хлоропластных лизатах, полученных из первого листа ячменя разного возраста.

Научная новизна и практическая значимость работы

Исследованы свойства хлЗСБ в листьях ячменя разного возраста, отличающихся чувствительностью к цитокинину. С помощью антиидиотипических антител показано присутствие хлЗСБ как в молодых 3-дневных, так и в стареющих 14-дневных листьях ячменя. Обнаружено, что в условиях нативного электрофореза хлЗСБ представлен полипептидами 67 ±2, 69±2и128±2 кД. Полоса 69 ± 2 кД обнаруживается приемущественно в 10 дневных растениях. Показаны различия в функциональной активности хлЗСБ из растений ячменя разного возраста. Так, ЗСБ, активирующий транскрипцию в условиях in vitro без добавления цитокинина, преобладает в хлоропластах молодых и старых листьев, а белок, регулирующий транскрипцию гормон-зависимым способом, преобладает в хлоропластах листьев 10 дневных проростков. Детальное изучение механизма гормональной регуляции биогенеза хлоропластов позволит в будущем разработать технологии повышения продуктивности важнейших сельскохозяйственных растений.

Апробация диссертационного материала Диссертационный материал опубликован в российских и зарубежных научных журналах. Полученные результаты обсуждены на международной конференции «Физиология растений - наука III тысячелетия», Москва, 1999, а также на 5-м съезде Общества физиологов растений России в Пензе - 2004 г.

Публикации Материал диссертации опубликован в 3 печатных работах и двух тезисах международных конференций.

Объем и структура работы

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания методов, изложения и обсуждения результатов, заключения, выводов и списка цитированной литературы, который включает 165 работ, в том числе 139 иностранных. Работа изложена на страницах машинописного текста, содержит 15 рисунков и 3

таблицы.

Содержание работы

Объект и методы исследований

Объект исследований Для выделения цитокинин-связывающего белка из хлоропластов были выбраны листья первого яруса ячменя (Hordeum vulgäre) сорта Луч, находящиеся на разных стадиях развития. Растения выращивали в факторостатных условиях: длина светового дня 16 ч., освещенность- 50 Вт/м2, температура 22-23°С. В работе были также использованы листья первого яруса 23 дневных проростков люпина (Lupinus luteus) сорта Дружный, листья второго яруса 14 дневных проростков риса (Oryza sativa) сорта Лиман и изолированные семядоли люпина.

Биотест по задержке цитокинином разрушения хлорофилла а в первом листе ячменя Листья, срезанные с растений разного возраста, инкубировали на растворе БАП (10"5 М) или воде в течение 5 дней при температуре 23°С. После инкубации из отрезков листьев экстрагировали хлорофилл и определяли его содержание спектрофотометрически (Lichtenhaler et. al., 1983).

Получение антиидиотипических антител к зеатину Выделение АТа-и с помощью хроматографии на ATZ сефарозе проводили из антисыворотки против АТЖ, а также из антисыворотки к зеатинрибозиду после иммунизации кролика в течение 6 мес.( Каравайко с соавт., 1995). Иммунизацию кроликов проводили по схеме, как описано ранее (Кудоярова с соавт., 1990).

Выделение хлоропластов из листьев ячменя и экстракция из них белков Для выделения хлоропластов срезанные листья гомогенизировали в течение 10-15 с в гомогенизаторе марки «Komet» в буфере А, содержащем 0.33 М сорбит, 0.05 М трицин pH 8.0, 2 мМ ЭДТА, 5 мМ ß-меркаптоэтанол (60 мл буфера на 15 г листьев). Гомогенат после фильтрования центрифугировали при 4000 g 10 мин. Хлоропласта отделяли от ядер с помощью ступенчатого градиента Перкола 40-70%. Лизис

хлоропласте® и экстракцию хлоропластных белков проводили гипотоническим шоком. Лизат хлоропластов центрифугироали при 16000 g 20 мин для отделения мембранных компонентов. Супернатант использовали для выделения хлЗСБ.

Хроматографическая очистка зеатин-связывающего белка

Использован разрботанный ранее многостадийный метод выделения ЗСБ (Каравайко с соавт., 1995). Гель-фильтрация на сефадексе Г-50, как первый этап очистки, была применена для отделения белков от низкомолекулярных соединений. Полученную белковую фракцию далее очищали с помощью гидрофобной хроматографии на фенил-сефарозе CL-4B («Pharmacia», Швеция). Элюцию белков, связавшихся с фенил-сефарозой, проводили последовательно 20 мМ Трис-HCI, pH 7.5, содержащим 200 мМ NaCI, затем 20 мМ Трис-HCI pH 7.5,10 мМ Трис-HCI pH 7.5 и водой. Присутствие ЗСБ в элюатах определяли по их реакции с антиидиотипическими антителами в условиях твердофазного ИФА. Поледняя стадия очистки - аффинная хроматография белков проводилась на зеатинрибозид сефарозе (ZR-сефарозе).

ZR-сефароза была синтезирована путем иммобилизации зеатинрибозида на АН-сефарозе 4В (« Pharmacia», Швеция) периодатным методом, как описано у Moore (1979).

Для очистки белка на уравновешенную буфером ZR-сефарозу наносили ЗСБ-содержащую фракцию, полученную после хроматографии на фенил-сефарозе. Связавшиеся с матриксом белки элюировали 1 М NaCI в 50 мМ Трис-HCI буфере, pH 8.8, а затем 0.2 М NaOH. Элюированные белки диализовали и использовали для дальнейшего анализа.

Твердофазный иммуноферментный анализ был использован для идентификации зеатин-связывающего белка, для определения специфичности исходной антисыворотки против зеатинрибозида и моноспецифических антител к зеатину, а также для выявления АТа.и в антисыворотке против зеатинрибозида после длительной иммунизации кролика (Каравайко с соавт., 1990).

Участие ЗСБ в цитокинин-зависимой регуляции транскрипции было исследовано по методу, описанному ранее (Селиванкина с соавт., 2001). Методы выделения хроматина и ядер из листьев ячменя, определения активности РНК-полимераз I и П, определения содержания ДНК приведены в статье (Селиванкина с соавт., 2001).

Электрофорез белков в денатурирующих условиях проводили в системе Laemmly (1970) в 10% ПААГ.

Электрофорез белков в неденатурирующих условиях проводили по методу Laemmly (1970), исключая из состава буферов ДЦС-Na и уменьшая концентрацию 2-меркаптоэтанола до 4 мМ. В работе использовали 10% гели и гели с линейным градиентом концентрации акриламида 15-30%. Для определения молекулярной массы полипептидов использовали набор маркерных белков, включавший тиреоглобулин-669 кД, ферритин - 440 кД, каталазу - 232 кД, лактатдегидрогеназу - 140 кД, бычий сывороточный альбумин - 67 кД.

Электроперенос и иммуноблотинг белков. Белки после электрофореза переносили с незафиксированного геля на нитроцеллюлозную мембрану Hybond-C («Amersham», Англия) полусухим способом в течение 1.5 ч. на приборе Мультифор-2 («LKB», Швеция). ЗСБ идентифицировали на мембране с помощью АТа.и, как описано в работе Каравайко с соавт. (1995).

Элюцию белков из геля и их ренатурацию осуществляли по методу, описанному ранее (Hager and Burgess, 1980).

Результаты экспериментов и их обсуждение

Изучение чувствительности к цитокинину листьев первого яруса ячменя, отделенных от растений разного возраста Известно, что чувствительность ткани к гормону определяется в значительной степени содержанием в ней соответствующих рецепторов (Розен, 1994). Содержание и свойства рецептора в ткани находятся под воздействием различных факторов. Так как целью работы было изучение свойств хлЗСБ из первого листа ячменя при его развитии то, прежде чем выделять хлЗСБ, мы считали целесообразным изучить реакцию на цитокинин in vivo у растений ячменя разного возраста, используя биотест, основанный на задержке цитокинином пожелтения листьев ячменя (Кулаева, 1973).

В предварительных опытах была изучена чувствительность к экзогенному цитокинину 4 сортов ячменя (Дина, Дуэт, Андрей, Луч), полученных проф. H.A. Родиной (г. Киров) для районировния в Северо-воточной зоне Европейкой части России. Результаты показали, что наибольшей чувствительностью к цитокинину отличался сорт Луч, который и был использован для всех последующих

экспериментов. Изучение динамики роста первого листа ячменя показало, что в отличие от сорта Винер, первый лист которого рос в течение 6-7 дней (Ки1аеуа й а1, 1996), рост первого листа сорта Луч продолжался всего в течение первых 4 дней (рис. 1). Столь разная динамика роста могла отразиться на чувствительности первого листа молодых растений к экзогенному цитокинину. Содержание хлорофилла а в первом листе сорта Луч достигало максимума в шести-дневных растениях и оставалось без изменения в течение длительного времени.

1 3 5 7 9 11 13

Возраст растений, дни

Рис. 1. Динамика роста первого (1) и второго (2) листьев ячменя сорта Луч.

Для изучения возрастных изменений чувствительности к цитокинину листья первого яруса отрезали от растений ячменя разного возраста, инкубировали на растворе БАЛ (10-5 М) или воде в течение 5 дней, после чего определяли в них содержание хлорофилла. Интенсивность разрушения хлорофилла при инкубации листьев на воде увеличивалась с возрастом растений, от которых был отделен лист. Инкубация на цитокинине приводила к увеличению содержания хлорофилла, причем максимальное влияние на накопление хлорофилла наблюдалось у листьев, отделенных от 8 дневных растений при их инкубации в течение 5-и дней на растворе БАП (рис. 2). По мере старения растений эффект БАП на срезанные листья ослабевал. Интересно отметить, что при инкубации на воде листьев, отделенных от 3 дневных растений, практически не наблюдалось уменьшение хлорофилла и эффект цитокинина, вероятно, объясняется влиянием на новообразование пигмента, тогда как эффект БАП на содержание хлорофилла в листьях ячменя, отделенных от 8-и 14-и дневных растений связан преимущественно с подавлением распада хлорофилла. Таким образом, результаты показали, что листья ячменя, отделенные от растений всех исследованных возрастов, были чувствительны к цитокинину, но степень чувствительности зависела от возраста растений, от которых был отделен лист.

Рис 2. Влияние 6-БАП (10 М) на содержание хлорофилла а при инкубации первого листа ячменя на гормоне в течение 8 дней. На оси абсцисс показан возраст растений, от которых был отделен 1-й лист, на оси ординат содержание хлорофилла а при инкубации листьев на растворе БАП в процентах от его содержания в контрольных листьях, инкубированных на воде.

Изменение чувствительности листьев ячменя разного возраста к цитокинину может происходить в результате изменения различных факторов: содержания гормона, количества или свойств ЗСБ или других белков участвующих в ответе на цитокинин. Так, изменение свойств рецепторов при старении показано для рецепторов гормонов животных (Samochocki et. al., 1994, Igwe et. al., 1995). Обнаружение различных структурных и функциональных состояний рецептора важно для понимания механизма действия гормона.

Экстракция зеатин-связывающего белка из хлоропластов

ЗСБ выделяли из первого листа 3-, 10- и 14-дневных проростков ячменя, поскольку листья растений ячменя этих возрастов отличались чувствительностью к цитокинину. Как указано в методическом разделе, выделение белка проводили из хлоропластов, полученных с помощью ступенчатого градиента Перкола. Хлоропластный лизат центрифугировали в течение 20 мин при 16000 g с последующим анализом белков супернатанта и осадка электрофорезом в ПААГ и дальнейшей очисткой (рис. 3). Как показывают результаты Вестерн-анализа с АТа.и, ЗСБ находился в растворимой фракции белков хлоропластов (рис.4).

Очистка хлоропластного зеатин-связывающего белка Для исследования функциональных свойств ЗСБ необходимо было получить очищенный препарат из листьев ячменя разного возраста. ХлЗСБ выделяли с помощью многоступенчатого метода очистки (рис. 3) и исследовали в системе транскрипции in vitro. Данный метод очистки был успешно применен ранее для выделения цитозольных и ядерных цитокинин-связывающих белков (Каравайко с соавт., 1995, Селиванкина с соавт., 1997).

Рис 3 Схема выделения и анализа хлоропластного ЗСБ.

Рис 4 А Экжтрофорсч белковых фракций хлоропластов листьев ячменя Гель окрашен Кумасси Я-250 (1)-Белки-маркеры (2)-Суммарный белок хлоропластов (3)-Супернатанг лизированных хлоропластов после центрифугирования 20 мин при 16000$ (4)-Белки мембранной фракции, полученной после центрифугирования лизированных

хлоропластов 20 мин при 16000 g Б Детектирование хлЗСБ методом

иммуноблотинга с антиидиотипическими антителами против зеатина Для их визуализации применяли коньюгат антивидовых А Б антител с пероксидазой хрена (1)-Белки-маркеры

(2)-Суммарный белок хлоропластов (З)-Супернатант, полученный после центрифугирования лизированных хлоропластов в течение 20 мин 16000 g (4)-Мембранная фракция, полученная в тех же условиях центрифугирования

После гель-фильтрации на Г-50 для дальнейшей очистки ЗСБ использовали гидрофобную хроматографию на фенил-сефарозе. Тестированием белков в элюатах с помощью АТа.и в условиях твердофазного ИФА было обнаружено, что цитокинин-связывающая активность полностью задерживается на фенил-сефарозной колонке и элюируется с нее водой. На каждом этапе очистки фракции белков анализировали в денатурирующих условиях ДДС-ПААГ-электрофореза. В результате хроматографии на сефадексе Г-50 и фенил-сефарозе, достигается очистка хлЗСБ примерно в 10 раз. АТа.и в белковой фракции после Г-50 хроматографии взаимодействуют с единственным полипептидом с молекулярной массой около 65 ± 2 кД (рис.4Б). После хроматографии на фенил сефарозе зеатин-связывающая фракция, содержала несколько полипептидов, взаимодействующих с АТа и (65 ± 2, 59 ± 2 и 30 ± 2 кД). Возможно, полипептиды меньшего размера образуются в результате частичной деградации полипептида 65 ± 2 кД.

Для дальнейшей очистки хлЗСБ использовали аффинную хроматографию на зеатин-рибозид сефарозе (Каравайко с соавт., 1995). Белковую фракцию, полученную при элюции с фенил-сефарозы водой наносили на аффинную колонку и промывали как указано в методическом разделе. Тестирование белковых фракций методом твердофазного ИФА показало присутствие зеатинсвязывающей активности во фракции, элюируемой 0.2 М №ОЫ. Анализ этой фракции, перенесенной на нитроцеллюлозную мембрану после ДДС-ПААГ электрофореза в денатурирующих условиях обнаружил, что АТа.и взаимодействуют с полипептидом, обладающим

молекулярной массой около 65 ± 2 кД (Рис 5). Рис 5. Электрофорез в денатурирующих условиях хлоропластных белков после аффинной хроматографии на /И-сефарозе 1 Белки окрашенные Кумасси, 2. Маркерные белки 3. Детектирование хлЗСБ методом иммуноблотинга с

антиидиотипическими антителами против зеатина Для их визуализации применяли коньюгат антивидовых антител с пероксидазой хрена

Аффинная и гидрофобная хроматография позволяют очистить хлЗСБ, примерно, в 10000 раз. Это означает, что выделенный нами хлЗСБ составляет около 0.01% от

суммарного растворимого белка хлоропластов. Такое содержание характерно для рецепторных белков. Выход белка, возможно, занижен из-за потерь при его очистке и экстракции. Вероятнее всего, полипептид, полученный, этим методом и полипептид, взаимодействующий с антителами в неочищенном экстракте (рис.4Б), являются одним и тем же белком. Для подтверждения этого предположения необходимы дополнительные исследования.

Функциональные свойства выделенного хлЗСБ

Полученную с аффинной колонки зеатин-связывающую фракцию использовали для изучения функциональных свойств белка. Функциональная активность ЗСБ исследовалась в системе синтеза РНК in vitro в лизате хлоропластов из листьев ячменя. В присутствии хлЗСБ транс-зеатин значительно активировал тотальную транскрипцию в лизированных хлоропластах. Как видно из рис. б, максимальная активация транскрипции наблюдалась при концентрации транс-зеатин 10-'М, в то время как цис-зеатин в широком диапазоне концентраций ( 10-9 М-105 М) в присутствии хлЗСБ не влиял на транскрипционную активность. Эти данные указывают на специфичность регуляции транскрипции комплексом хлЗСБ и транс-изоформы зеатина.

Рис.6. Влияние цис~ и транс- зеатина совместно с хлЗСБ на синтез РНК в лизате хлоропластов из листьев 10-дневных проростков ячменя. 1- транс- зеатин, 2- цис- зеатин. Контрольный уровень включения метки в РНК в отсутствие гормона и белка составлял 11.2 тыс. имп/мин на 20 мкг. ДНК.

Несмотря на значительные различия в механизмах регуляции транскрипции ядерных и хлоропластных генов, нельзя было исключить возможность участия хлЗСБ в гормональной регуляции транскрипции ядерных генов. Ранее было показано, что хлЗСБ не влияет на активность РНК-полимеразы I, а ЗСБ цитозоля не влияет на синтез РНК в лизате хлоропластов (Селиванкина с соавт., 1997). В условиях, оптимизированных для РНК-полимеразы-П, хлЗСБ также практически не активировал

транскрипцию. Эти данные показывают, что хлЗСБ является специфическим регулятором транскрипции хлоропластного генома.

Так как были обнаружены различия в чувствительности листьев ячменя разного возраста к цитокинину, важно было узнать, отличаются ли при этом функциональные свойства хлЗСБ. Для этого белок выделяли из листьев ячменя разного возраста и проверяли его транскрипционную активность в системе транскрипции in vitro в лизате хлоропластов из листьев ячменя. Добавление одного гормона (без хлЗСБ) в лизат хлоропластов, независимо от возраста листьев, из которых он был получен, не приводило к активации транскрипции. Полученные результаты показали, что в хлоропластном лизате из листьев 3-дневных растений хлЗСБ без гормона, независимо от возраста листьев, из которых они были выделены (3, 10 и 14 дней), не оказывали влияния на транскрипцию. Добавление гормона в хлоропластный лизат из листьев 3-дневных растений приводило к активации транскрипции только при использовании хлЗСБ из 14-дневных растений. Транскрипционная активность хлоропластов в листьях молодых 3-дневных растений более чем в два раза превышает активность транскрипции в хлоропластах из листьев 10-дневных растений, и почти в 40 раз - из листьев 14-дневных растений. Скорее всего, в листьях 3-дневных растений регуляция не происходит из-за высокого содержания эндогенного ЗСБ.

В лизате хлоропластов из листьев 14-дневных проростков хлЗСБ из листьев растений всех трех возрастов обладали транскрипционной активностью в отсутствии гормона. ХлЗСБ активировали транскрипцию без гормона, а добавление гормона ингибировало их действие. Это могло быть связано с изменением свойств хлЗСБ при его добавлении в хлоропластный лизат из 14-дневных растений, либо с изменением в этом возрасте белков, взаимодействующих с хлЗСБ.

В хлоропластном лизате из 10-дневных растений оказалось, что белки из растений разного возраста отличались по характеру действия и по-разному реагировали на добавление цитокинина (рис. 7). Так, белок из листьев 10-дневных растений не активен без добавления гормона, тогда как белки из 3- и 14-дневных проростков могли активировать транскрипцию независимо от присутствия экзогенного гормона. Добавление гормона в реакционную среду не влияло на активность хлЗСБ из листьев 3-дневных растений и подавляло действие хлЗСБ из листьев 14-дневных растений.

Таким образом, обнаружено два функционально различных состояния хлЗСБ. В одном из состояний ЗСБ активирует транскрипцию без добавления экзогенного гормона (хлЗСБ из 14-и дневных проростков), а в другом состоянии для активации транскрипции необходим и белок и гормон (хлЗСБ из 10-и дневных проростков).

Рис.7. Влияние зеатина и хлЗСБ на синтез РНК in vitro в системе, содержащей хлоропластный лизат из 10-дневных проростков ячменя. 1. Синтез РНК без добавления -транс-зеатина и хлоропластных ЗСБ. 2, 3,4 синтез РНК в присутствии хл ЗСБ из листьев - 3-, 10- и 14- дневных проростков ячменя в отсутствии и присутствии зеатина.

Из литературы известно, что причиной изменения свойств белка могут быть различные поспрансляционные модификации (Kouzarides, 2000) или белки коактиваторы и корепрессоры (Shin et. al., 2001; Salchiert et. al., 1998). В пользу ковалентной модификации свидетельствует тот факт, что при хроматографическом выделении белка его свойства сохраняются.

Различия активности зеатин-связывающего белка, определяемые возрастом листьев из которых был приготовлен хлоропластный лизат, использованный в качестве системы транскрипции, могут быть обусловлены рядом причин. Листья разного возраста могут отличаться соотношением активности хлоропластных РНК-полимераз (Link etal., 1996; Hess etal., 1999), которые могут по-разному регулироваться хлЗСБ. Например, в хлоропластах шпината был идентифицирован транскрипционный фактор CDF2 (Bligny et al, 2000), который активировал транскрипцию РНК-полимеразы фагового типа (NEP) и подавлял РНК-полимеразу бактериального типа (PEP). Показано также, что свойства полимеразы могут меняться при развитии пластид. В этиопластах преобладает А-форма PEP, а в хлоропластах - В-форма (Tiller, Link, 1993). Разные формы полимераз отличаются по взаимодействию с ДНК и по транскрипционной активности (Tiller, Link, 1993). Хлоропласта на разных

стадиях развития могут отличаться набором a-факторов, что также может приводить к изменению регуляции транскрипции с помощью хлЗСБ (Allison, 2000).

Свойства хлЗСБ в условиях нативного электрофореза

В белковом экстракте, полученном после центрифугирования хлоропластного лизата, анализировали наличие ЗСБ с помощью АТа.и. На рис. 4 представлены результаты электрофореза в денатурирующих условиях белков супернатанта и осадка, полученных после центрифугирования лизированных хлоропластов. Приведенные данные показывают, что хлЗСБ представлен в этих условиях одним полипептидом с молекулярной массой 65 ± 2 кД и локализуется преимуществено в супернатанте при условиях экстракции, описанных выше.

Так как денатурирующий ПААГ позволяет разделить белки только на основании различий в молекулярной массе (Остерман, 1981), в этих условиях невозможно выявить различия в конформации или в заряде, которые могут быть результатом посттрансляционных модификаций. В условиях нативного электрофореза подвижность белка является функцией не только его молекулярной, массы, но и формы белковой молекулы и её заряда. Таким образом, этот метод позволяет обнаружить наличие различных конформации белка, а также получить представление об его четвертичной структуре (Дарбре, 1989).

Анализ неочищенного грубого экстракта белков хлоропластов в условиях неденатурирующего электрофореза в 10% ПААГ выявил два полипептида с кажущейся молекулярной массой 67±2и128±2кД (рис. 8). Повторное разделение полипептида 128 кД в денатурирующих условиях выявило полипептид 65 ± 2 кД, который взаимодействовал с АТа.и, и несколько минорных полипептидов с меньшей молекулярной массой (рис. 9). Полученные результаты позволяют предполагать существование хлЗСБ в мономерном и димерном состоянии. Возможно, хлЗСБ образует комплекс in vivo, однако этот комплекс может состоять не только из ЗСБ, но и из других белков. Образование комплекса может быть необходимо для выполнения белком определенной функции. Известно, что в виде димеров связываются с ДНК многие транскрипционные факторы (Glass , 1996; Leid et. al., 1992). Показано также, что один и тот же белок может, в зависимости от степени димеризации, изменять свою активность на противоположную (Sauer and Jackie, 1991). Существуют

рецепторы, которые в виде мономера, гомодимера и гетеродимера связываются с различными участками ДНК (Aranda and Pascual, 2001)

Рис 8

Рис 9

Рис 8 Электрофорез в неденатурирующих у словиях белкового экстракта хлоропластов из 10 и дневных листьев 1-метчики, 2 белки окрашенные хлорамином Т, З-Детектирование хлЗСБ методом иммуноблотинга с антиидиотипическими антитетами против зеатина Для их визуализации применяли коньюгат антивидовых антитет с пероксидазой хрена

Рис 9 Электрофорез в денатурирующих условиях в 10% ПААГ полипептидов 67 ± 2 и 128 ± 2 кД, экстрагированных из нативного геля (1) маркерные белки, (2) полипептиды 67 и (3) 128 кД, экстрагированные из нативного геля Белки окрашенны Кумасси

Комплекс 128+2 кД был неустойчив к действию высокой концентрации ß-меркаптоэтанола При концентрации ß-меркаптоэтанола 700 мМ димерная форма ЗСБ точностью исчезала (рис 10) Это говорит об участии дисульфидных связей в стабилизации четвертичной или третичной структуры белка

Рис 10 Электрофорез в неденатурирующих условиях в 10% ПААГ хлоропластных белков из 10-и дневных проростков А-Гель окрашенный Кумасси, Б- Детектирование хлЗСБ методом иммуноблотинга с антиидиотипическими антителами против зеатина Для их визуализации применяли коньюгат антивидовых антител с пероксидазой хрена 1-700 мМ ß-МЭ в образце, 2- 5 мМ ß МЭ в образце, 3 маркеры

При анализе белковых фракций из листьев растений ячменя разного возраста были обнаружены различия в интенсивности взаимодействия белков хлоропластов с АТ,,(рис. 11).

Рис. 11. Вестерн блот хлоропластных белков из листьев разного возраста разделенных в 10% ПААГ в неденатурирующих условиях, с использованием АТа-и. 1-маркерные белки, 2- белок из 3-дневных растений, 3 - белок из 10-и дневных растений, 4. - белок из 14-и дневных растений.

На электрофорез наносили одинаковое количество суммарного белка хлоропластов. Взаимодействие с полосой 128±2 кД обнаруживалось только в хлоропластном лизате из 3-х и 10-и дневных проростков. Взаимодействие с полосой 67 ± 2 кД наблюдалось в хлоропластном лизате из проростков всех трех возрастов, но в 14-и дневных оно было существенно слабее. Полученные данные говорят о том, что хлЗСБ присутствует в растениях всех трех возрастов, но его количество уменьшается при старении листа. Возможно также, что происходит изменение сродства хлЗСБ к зеатину, что отражается на его взаимодействии с АТа.и.

Интересно отметить, что при нанесении одинакового количества суммарного белка, полученного из безхлорофильной нижней части листа (влагалище), интенсивность связывания АТа.и с полосой 67 ± 2 кД была значительно слабее, чем с аналогичной полосой тотального белка, полученного из хлоропластов листовой пластины 10-дневных растений. А взаимодействие антител с полосой 128±2 кД отсутствует (рис. 12). Снижение значения взаимодействия с антителами может происходить либо в результате снижения количества данного белка, либо в результате изменения его структуры. Во влагалище листа находятся самые молодые, делящиеся клетки, еще не достигшие своего максимального размера, происходит интенсивное деление хлоропластов и синтез хлоропластной ДНК (Baumgartner, 1989). Эта область листа имеет наиболее низкую транскрипционную активность пластид (Baumgartner, 1989).

Таким образом, в клетках с развивающимися пластидами и в стареющих (14 дневных) клетках, со слабой интенсивностью транскрипции, наблюдается либо пониженное содержание хлЗСБ, либо изменение его взаимодействия с антителами.

Рис 12. Электрофорез в неденатурирующих условиях в 10% геле. 1-Маркерные белки, 2-Белки из листовой части и 3-влагалшца листа 10-и дневных проростков ячменя, 1-Маркерные белки. А - Белки окрашенные Кумасси, Б -Детектирование , хлЗСБ методом

иммуноблотинга с антиидиотипическими антителами против зеатина. Для их визуализации применяли коньюгат антивидовых антител с пероксидазой хрена.

При анализе белкового препарата хлоропластов в градиенте ПААГ 15-30% в нативных условиях был обнаружен дополнительный полипептид 69 ± 2 кД, который взаимодействовал с АТа.и (рис. 13). Полипептиды вырезали из геля и экстрагировали, как указано в методическом разделе, и анализировали на планшете иммунологически (рис. 14), так как при такой высокой концентрации ПААГ не удалось перенести их на мембрану обычным способом. Таким образом, удалось разделить два полипептида в области 67 кД: 67 ± 2 и 69 ± 2 кД, которые взаимодействовали с АТ а.и. (табл. № 1).

При сравнении интенсивности взаимодействия с антителами полос 67 ± 2 и 69 ± 2 кД из листьев разного возраста обнаруживаются следующие различия. Взаимодействие с АГа.И полосы 67 ± 2 кД примерно одинаково в листьях 3 и 10 дневных растений, и снижается в листьях 14-и дневных растений. Взаимодействие с АГ^-и полосы 69 ± 2 кД максимально в листьях 10-и дневных растений и в несколько раз меньше у листьев из 3 и 10 дневных растений. Гак как не известно количество хлЗСБ в полосе, то изменение значения взаимодействия с антителами может свидетельствовать либо об изменении количества белка, либо об изменении сайта связывания зеатина, что приводит к изменению связывания белка с антителами.

кД

69ч 67-

кД

> 440 '232 '140

.67

Рис 13 Электрофорез хлоропластных белков в нативных условиях в градиенте 15-30% ПААГ. 1-Бечковый экстракт хлоропластов, окрашенный Кумасси 2-Белки маркеры (На геле указаны полипептиды, взаимодействующие с АТ,, -69 + 2 и -67 ± 2 кД)

Рис 14. Схема анализа полипептидов 67 и 69 кД.

Таблица 1.Взаимодействие АТ„.„ в системе твердофазного ИФА с полипептидами 67 и 69 кД после экстракции из геля и ренатурашш Представлен хромофорный ответ при 492 нм.

Кажущаяся молекулярная масса белковых полос в геле Возраст растений ячменя, дни АТ а-и хромофорный ответ при 492 нм

67±2кД 3 0.бб8±48

10 0.870152

14 0.450±30

69 ± 2 кД 3 0.144±21

10 0.750+43

14 0.10б±17

Анализ полипептидов 67±2и69±2кДв ПААГ в денатурирующих условиях показал, что оба полипептида обладают одинаковой молекулярной массой 65 ± 2 кД (рис 15)

Рис 15 Электрофорез в

денатурирующих условиях

полипептидов 67 и 69 кД, экстрагированных из нативного геля

А- Гель, окрашенный Кумасси,

Б- Детектирование хлЗСБ методом иммуноблотинга с

антиидиотипическими антителами против зеатина Для их визуализации применяли коньюгат антивидовых антител с пероксидазой хрена 1 маркеры, 2 и 3-полипептиды 69 ± 2 и 67 ± 2 кД соответственно

Последние результаты позволяют предполагать, что эти полипептиды могут отличаться зарядом или конформацией молекулы, что и приводит к изменению подвижности белка в нативном геле Нельзя исключить, что полипептид 69 ± 2 кД является продуктом другого гена Однако экстрагированный из геля и ренатурированный полипептид 69 ± 2 кД был способен регулировать транскрипцию in vitro в лизате хлоропластов Его функциональная активность зависела от присутствия транс-зеатина в среде Не исключено, что белковый препарат приготовленный таким способом мог содержать другие, не связывающие зеатин белки, которые способны участвовать в регуляции транскрипции Для установления природы модификации, приводящей к появлению второй полосы в области 67 кД, необходимы дополнительные исследования

Изменение конформации может происходить при связывании гормона При связывании лиганда ядерные рецепторы животных существенно изменяют свою конформацию, что приводит к изменению их сродства к ДНК и к другим белкам (Hermanson et al, 2002)

Заряд и конформация ЗСБ могут измениться в результате посттрансляционной модификации. Многие транскрипционные факторы животных, в том числе рецепторы, могут подвергаться таким посттрансляционным модификациям, как фосфорилирование (Nakae et. al., 2000, Hammer et.al., 1999), ацетилирование (Kouzarides, 2000), метилирование (Hermanson et.al., 2002). В результате таких модификаций у транскрипционного фактора может измениться сродство к ДНК или к другим белкам коактиваторам и корепрессорам (Kouzarides, 2000), а также афинность к лиганду (Shao and Lazar, 1999). В результате таких модификаций изменяется активность транскрипционного фактора. Обнаружено влияние фосфорилирования на связывание с ДНК некоторых хлоропластных белков (Kim et.al., 1999).

Сравнение данных таблицы 1 и транскрипционной активности белков из растений разного возраста (рис. 7), указывает на корреляцию между конформационными особенностями и функциональной активностью белка. Так, максимальное содержание (интенсивность связывания с антителами) полипептида 69 ± 2 кД обнаруживается в 10- дневном возрасте. Возможно, эти конформационные особенности 10-и дневного белка обуславливают его характерные свойства (неспособность действовать без гормона и активироваться в его присутствии).

Таким образом мы показали, что реакция хлЗСБ на цитокинин может изменяться. Дальнейшие исследования в этом направлении помогут понять механизм изменения свойств белка и функциональное значение этих изменений. Идентификация генов, регулируемых белком в листе разного возраста, поможет понять биологический смысл изменений свойств хлЗСБ с возрастом.

Исследование видовой специфичности цитокинин-связывающего белка

Для характеристики хлЗСБ, как предполагаемого гормон-зависимого трансфактора представляет значительный интерес изучение его видовой специфичности. С этой целью активность хлЗСБ из ячменя была проанализирована в хлоропластных лизатах из листьев риса и люпина. Оказалось, что хлЗСБ из листьев ячменя способен активировать транскрипцию во всех изученных системах, однако в листьях люпина белок активировал транскрипцию только при совместном добавлении с зеатином, а в листьях риса и семядолях люпина хлЗСБ был способен активировать транскрипцию в отсутствии гормона. Таким образом, гормоннезависимая активность белка, вероятно, обуславливается возрастными особенностями растения. Гормоннезависимое действие

белка из ячменя в листьях риса и семядолях люпина напоминает действие ЗСБ в хлоропластах листьев 14-и дневных растений ячменя.

Полученные данные говорят о том, что в рисе и люпине присутствуют мишени для хлЗСБ из ячменя. Однако на основании этих данных нельзя утверждать, что аналогичный белок присутствует в этих растениях. Из хлоропластов риса был выделен ЗСБ, который был способен активировать транскрипцию в хлоропластных лизатах, как риса, так и ячменя. Цитокинин подавлял его действие в хлоропластах ячменя и не влиял на активность в хлоропластах риса. Полученные результаты говорят об отсутствии видовой специфичности в действии хлЗСБ из ячменя.

Отсутствие видовой специфичности показано также для цитозольного ЗСБ из ячменя, который активировал совместно с зеатином, синтез РНК в системе транскрипции in vitro, содержащей изолированный хроматин из арабидопсиса и ряда других видов растений (Селиванкина с соавт., 2001; Бровко с соавт.,1996).

Заключение

Как было сказано во введении, целью нашей работы было изучение свойств хлоропластного ЗСБ в листьях ячменя разного возраста, отличающихся чувствительностью к цитокинину.

Способность хлЗСБ из листьев 10-и дневных растений ячменя активировать транскрипцию была показана ранее (Селиванкина и др., 1997). Так как изначально белок выделяли только из первых листьев 10-дневного проростка ячменя, было не известно, присутствует ли он в листьях более молодых и старых растений.

Проделанная работа показывает, что зеатин-связывающий белок, обнаруженный ранее в хлоропластах листьев ячменя (Селиванкина и др., 1997), присутствует в хлоропластах листьев ячменя всех изученных возрастов, но изменяет свои свойства в процессе развития листа.

цитокинина. Так, белок из 10-и дневных растений не активен без добавления гормона, тогда как белки из 3 и 14-и дневных проростков могли активировать транскрипцию. Добавление гормона в реакционную среду не влияло на активность хлЗСБ из 3-дневных растений и подавляло действие белка из хлоропластов 14-и дневных растений.

Изменение функциональной активности белка может быть вызвано различными посттрансляционными модификациями. Так как в результате такой модификации изменяется либо заряд, либо конформация белковой молекулы, то она может изменить подвижность белка в условиях нативного электрофореза. После электрофореза белков в 10% неденатурирующем ПААГ антителами идентифицировали два белка с молекулярной массой 67 ± 2 и 128 ± 2 кД. Взаимодействие с антителами данных полипептидов уменьшалось при старении первого листа ячменя. Возможно, это в какой-то степени обуславливает различную чувствительность листа к гормону.

Обнаружение двух полипептидов, связывающихся с АТа.и в нативных условиях, ставило вопрос об их природе. При анализе полипептидов 128±2и67±2кДв условиях денатурирующего 10% ПААГ электрофореза был обнаружен единственный полипептид с молекулярной массой 65 ± 2 кД. Таким образом, полипептид с кажущейся молекулярной массой 128 кД, возможно, является димером состоящим из двух полипептидов 65 кД.

Исследование хлоропластных белков в нативных условиях в градиенте ПААГ 1530 % позволило выявить дополнительный зеатин-связывающий полипептид' с кажущейся молекулярной массой 69 ± 2 кД. Анализ белков 67± 2 и 69 ± 2 кД в ПААГ в денатурирующих условиях показал, что оба полипептида обладают одинаковой молекулярной массой 65 ± 2 кД. Полученные данные позволяют предположить, что эти два полипептида отличаются зарядом или конформацией молекулы, что и приводит к изменению подвижности белка в геле. Для установления природы модификации, приводящей к появлению второй полосы, необходимы дополнительные исследования. Возможно также, что эти полипептиды являются продуктами разных генов. Полипептид 69 ± 2 кД преимущественно обнаруживается в листьях 10-и дневных растений. Полученные результаты говорят о существовании системы модификации ЗСБ, которая, вероятно, влияет на его активность.

Чтобы изучить видоспецифичность хлЗСБ, его активность проверяли в хлоропластах из растений риса и люпина. Было показано, что белок из ячменя может активировать транскрипцию в этих видах. Из хлоропластов риса был выделен ЗСБ, который активировал транскрипцию в хлоропластах ячменя. Эти данные свидетельствуют об отсутствии строгой видовой специфичности хлЗСБ в листьях высших растений.

Выводы.

1. Показано, что хлЗСБ присутствует как в листьях молодых 3- дневных растений, так и в старых 14-дневных листьях ячменя первого яруса. Содержание хлЗСБ уменьшается с возрастом растений.

2. В нативных условиях при электрофорезе в 10% ПААГ хлЗСБ представлен двумя белками с молекулярными массами 67 ± 2 и 128 ± 2 кД. Белок 128 ± 2 кД, возможно, является димером белка 67±2 кД, так как в денатурирующих условиях он представлен единственным полипептидом 65 ±2 кД.

3. В градиентном геле 15-30% в нативных условиях в области мономерного хлЗСБ обнаруживаются два полипептида с молекулярными массами 67 ± 2 и 69 ± 2 кД. В условиях 8Э8-ПААГ оба полипептида обладают одинаковой молекулярной массой 65 ± 2 кД. Максимальное содержание полипептида 69 ± 2 кД обнаруживается только в хлоропластах 10-дневных растений.

4. Обнаружены различия функциональной активности хлЗСБ из растений разного возраста. Так, активный без гормона ЗСБ преобладает в хлоропласта молодых и старых листьев, а неактивный без гормона - в листе 10-и дневных проростков.

5. Показано, что хлЗСБ из листьев ячменя способен активировать транскрипцию в хлоропластах растений люпина. А из хлоропластов растений риса по методике выделения ЗСБ из ячменя был выделен ЗСБ, обладающий транскрипционной активностью. Полученные данные говорят об отсутствии видовой специфичности в отношении данного белка.

Список работ, опубликованных автором по теме диссертации

1. Люкевич Т. В., Кузнецов В.В. Изучение старения отделенных и находящихся на растении листьев ячменя. Тезисы международной конференции «Физиология растений- наука III тысячелетия». Москва 1999, с.772-773.

2.Селиванкина С.Ю., Каравайко Н. Н., Лкжевич Т.В., Сапожкова A.A., Черепнева Г.Н., Кузнецов В.В., Кулаева О.Н. Зеатин-связывающий белок хлоропластов, учавствующий в регуляции транскрипции. Тезисы международной конференции «Физиология растений- наука III тысячелетия». Москва 1999, с.778.

3.Kulaeva O.N., Karavaiko N.N., Selivankina S.Yu., Kusnetsov V.V., Zemlyachenko Va.V., Cherepneva G.N., Maslova G.G., Lukevich T.V., Smith A.R. and Hall M.A. Nuclear and chloroplast cytokinin-binding proteins from barley leaves participating in transcription regulation. Plant Growth Regulation. 2000, V.32, c.329-335.

4.Люкевич Т.В., Каравайко H.H., Кулаева О.Н., Кузнецов В.В., Селиванкина СЮ. Поиск белков, участвующих в цитокинин-зависимой регуляции транскрипции хлоропластного генома. Вестник Башкирского университета. 2000, № 2 (1), с.144-147.

5.Лкжевич Т.В., Кузнецов В.В., Каравайко Н.Н„ Кулаева О.Н., Селиванкина СЮ. Изучение функциональных свойств хлоропластного зеатин-связывающего белка, участвующего в гормон-зависимой регуляции транскрипции хлоропластного генома. Физиология растений. 2002, т.49(1), с. 105-112.

Объем 1,5 п, л.

Зак. 125

Тир. 100 экз.

Издательство МСХА 127550, Москва, ул. Тимирязевская, 44

51S

2 2 m 2005 t

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Люкевич, Татьяна Владимировна

ВВЕДЕНИЕ

ЦЕЛЬ РАБОТЫ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1 Молекулярные механизмы действия гормонов.

1.2 Физиологические эффекты цитокинина.

1.3 Элементы трансдукции цитокининового сигнала.

1.3.1 Цитокинин-связывающие белки.

1.3.2 Участие двухкомпонентной системы в восприятии и передаче цитокининового сигнала.

1.3.3 Другие возможные пути трансдукции цитокининового сигнала.

1.4 Действие цитокинина на транскрипцию хлоропластных генов.

1.5 Транскрипционная система хлоропластов.

1.5.1 Роль сигма-подобных факторов в дифференциальной экспрессии хлоропластных генов.

1.5.2 ДНК-связывающие белки хлоропластов.

1.5.3 Неспецифические ДНК-связывающие белки хлоропластов.

ГЛАВА 2. ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

2.1 Объект исследований.

2.2 Синтез коньюгата цитокинина с белком.

2.3 Получение иммунной сыворотки против зеатинрибозида.

2.4 Выделение моноспецифических антител к зеатину.

2.5 Синтез иммуноаффинного сорбента (АТ2-сефарозы) для выделения АТа.и.

2.'6 Получение антиидиотипических антител к зеатину.

2.6.1 Иммунизация кроликов моноспецифическими антителами к зеатину.

2.6.2 Выделение АТа.и с помощью хроматографии на А Т2 сефарозе.

2.7Выделение хлоропластов из листьев ячменя и экстракция из них белков.

2.8 Хроматографическая очистка зеатин-связывающего белка.

2.8.1 Гель-фильтрация на сефадексе Г-50.

2.8.2 Гидрофобная хроматография на фенил-сефарозе.

2.8.3 Аффинная хроматография.

2.9 Твердофазный иммуноферментный анализ.

2.9.1. Идентификация зеатин-связывающего белка.

2.9.2 Определение специфичности антисыворотки против зеатин-рибозида и очищенных антител к зеатину.

2.9.3 Выявление присутствия АТа.и в антисыворотке против Щ зеатинрибозида.

2.10 Участие ЗСБ в цитокинин-зависимой регуляции транскрипции.

2.11. Электрофорез белков в денатурирующих условиях.

2.12. Электрофорез белков в неденатурирующих условиях.

2.13. Электроперенос и иммуноблотинг белков.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ЭКСПЕРИМЕНТОВ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1 Изучение чувствительности к цитокинину листьев первого яруса ячменя отделенных от растений разного возраста.

3.2 Выделение хлЗСБ из первого листа растений ячменя разного возраста.

3.2.1 Экстракция зеатин-связывающего белка из хлоропластов.

3.2.2 Очистка хлоропластного зеатин-связывающего белка.

3.3 Функциональные свойства выделенного хлЗСБ.

3.3.1 Сравнение транскрипционной активности хлЗСБ, выделенных из 3-, 10- и 14-дневных растений ячменя.

3.4 Изучение хлЗСБ в условиях нативного электрофореза.

3.4.1 Сравнение хлЗСБ из листьев ячменя 3-, 10-и 14-дневных растений в условиях нативного электрофореза.

3.5 Исследование видовой специфичности цитокинин-связывающего белка.

3.5.1 Исследование транскрипционной активности хлЗСБ из листьев ячменя в хлоропластном лизате из листьев риса и люпин.

3.5.2 Выделение ЗСБ из хлоропластов риса.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Цитокинин-связывающие белки хлоропластов листьев ячменя"

В настоящее время установлено, что действие гормонов на клетки-мишени осуществляется через специфические клеточные рецепторы. Изучение механизма действия гормонов заключается в исследовании их рецепторов и процессов, приводящих к проявлению специфического гормонального эффекта (Розен, 1994).

Для цитокининов открыты мембранные рецепторы (Inoue et. al., 2001; Ueguchi et. al., 2001), воспринимающие внешний по отношению к клетке цитокинин. Эти рецепторы участвуют в активации ядерных генов первичного ответа (ARR типа А) цитокинином (Sakakibara et. al., 1998; D'Agastino et. al., 2000). Кроме того, обнаружены ядерные цитокинин-связывающие белки, способные в присутствии цитокинина активировать транскрипцию in vitro в гомологичных транскрипционных системах, содержащих выделенные ядра или препараты хроматина (Каравайко с соавт., 1995, Kulaeva et. al., 1995, 2000), Эти белки являются кандидатами на роль внутриклеточных рецепторов цитокинина, подобно ядерным рецепторам стероидных гормонов животных (Hall et. al., 2001).

Обнаружение как мембранного, так и ядерного рецепторов цитокинина говорит о сложности системы восприятия цитокининового сигнала и приводит к вопросу о разделении функций между этими рецепторами. Так как мембранный рецептор цитокинина в основном локализован в корне, возможно, что в надземной части рецепция цитокинина происходит с помощью других белков (Inoue et. al., 2001). Возможно также, что мембранный и растворимый рецепторы необходимы одновременно в клетке, как это показано на животных (Hall, 2001; Watson and Gametchu, 2003).

Множественность рецепторов обнаружена для стероидных гормонов животных. Восприятие стероидных гормонов у животных осуществляется не только ядерными, но также и мембранными рецепторами (Hall, 2001, Watson and Gametchu, 2003). Мембранные рецепторы индуцируют быстрые ответы на стероиды (синтез вторичных месенджеров и активация сигнальных каскадов), ядерные рецепторы -более медленные (синтез макромолекул). В настоящее время остается не решенным вопрос о роли различных рецепторов в ответе клетки на стероидные гормоны. В некоторых случаях показано взаимодействие между мембранными и ядерными рецепторами. Для растений пока такие данные отсутствуют.

Несмотря на значительный прогресс в изучении механизма действия цитокинина, практически ничего не известно о поступлении цитокининового сигнала в хлоропласты и о белках, которые участвуют в рецепции и передаче этого сигнала. Между тем известно, что хлоропласты являются одной из основных мишеней действия цитокининов в клетке листа (Хохлова с соавт., 1978, Kusnetsov et. al., 1994, Kulaeva et. al., 2002). Показано также, что хлоропласт содержит большой набор цитокининов (Benkova et. al., 1999). Несколько лет назад в нашей лаборатории был выделен из хлоропластов листьев ячменя цитокинин-связывающий белок (хлЗСБ), который, совместно с зеатином, регулировал тотальную хлоропластную транскрипцию в системе in vitro. До настоящего времени это единственный белок, который может претендовать на роль предполагаемого рецептора цитокинина в пластидах.

Известно, что уровень и состояние рецепторов в клетке изменяются под воздействием различных внешних и внутренних факторов (Розен, 1994). Так как хлЗСБ ранее выделялся только из проростков 10-дневных растений, не известно присутствует ли он в хлоропластах более молодых и старых листьев ячменя. Известно, что содержание цитокинина в первом листе ячменя достигает максимума в 3-дневных проростках и далее резко падает (Kulaeva, 1996). Возникает вопрос, что происходит при этом с зеатин-связывающим белком.

В связи с этим целью работы являлось изучение функциональных и некоторых структурных особенностей хлЗСБ в листьях ячменя разного возраста.

Для ее достижения были поставлены следующие задачи:

2) Изучить присутствие хлЗСБ в первом листе ячменя в ходе его развития.

5) Изучить активность ЗСБ в хлоропластных лизатах, полученных из первого листа ячменя разного возраста.

Заключение Диссертация по теме "Физиология и биохимия растений", Люкевич, Татьяна Владимировна

Выводы

1. Показано, что хлЗСБ присутствует как в листьях молодых 3-дневных растений, так и в старых 14-дневных листьях ячменя первого яруса. Содержание хлЗСБ уменьшается с возрастом растений.

2. В нативных условиях при электрофорезе в 10% ПААГ хлЗСБ представлен двумя белками с молекулярными массами 67 ± 2 и 128 ± 2 кД. Белок 128 ± 2 кД, возможно, является димером белка 67+2 кД, так как в денатурирующих условиях он представлен единственным полипептидом 65 ±2 кД.

3. В градиентном геле 15-30% в нативных условиях в области мономерного хлЗСБ обнаруживаются два полипептида с молекулярными массами 67 ± 2 и 69 ± 2 кД. В условиях БОБ-НАЛГ оба полипептида обладают одинаковой молекулярной массой 65 ± 2 кД. Максимальное содержание полипептида 69 ± 2 кД обнаруживается в хлоропластах 10-дневных растений.

4. Обнаружены различия функциональной активности хлЗСБ из растений разного возраста. Активный без гормона ЗСБ преобладает в хлоропласт^молодых и старых листьев, а неактивный без гормона — в листе 10-дневных проростков.

Заключение

Способность хлЗСБ из листьев 10-дневных растений ячменя активировать транскрипцию была показана ранее (Селиванкина и др., 1997). Так как изначально белок выделяли только из первых листьев 10-дневн^го проростов ячменя, было не известно, присутствует ли он в листьях более молодых и старых растений.

Для изучения функциональных свойств хлЗСБ использовали белок, полученный с помощью многоступенчатой системы очистки, включающей аффинную хроматографию на зеатин-рибозид сефарозе. Белок выделяли из первого листа 3-, 10- и 14-дневных проростков ячменя. Было показано, что при использовании хлоропластного лизата из листьев 10-дневных растений, хлЗСБ из растений разного возраста отличаются по характеру действия и по-разному реагируют на добавление цитокинина. Так, белок из 10-дневных растений не активен без добавления гормона, тогда как белки из 3- и 14-дневных проростков могли активировать транскрипцию. Добавление гормона в реакционную среду не влияло на активность хлЗСБ из 3-дневных растений и подавляло действие белка из хлоропластов 14-дневных растений.

Обнаружение двух полипептидов, связывающихся с АТаи в нативных условиях, ставило вопрос об их природе. При анализе белков 128 ± 2 и 67 ± 2 кД в условиях денатурирующего 10% ПААГ электрофореза был обнаружен единственный полипептид с молекулярной массой 65 ± 2 кД. Таким образом, полипептид с кажущейся молекулярной массой 128 кД, возможно, является димером состоящим из двух полипептидов 65 кД.

Исследование хлоропластных белков в нативных условиях в градиенте ПААГ 15-30 % позволило выявить дополнительный зеатин-связывающий полипептид с кажущейся молекулярной массой 69 ± 2 кД. Анализ белков 67± 2 и 69 ± 2 кД в ПААГ в денатурирующих условиях показал, что оба полипептида обладают одинаковой молекулярной массой 65 ± 2 кД. Полученные данные позволяют предположить, что эти два полипептида отличаются зарядом или конформацией молекулы, что и приводит к изменению подвижности белка в геле. Для установления природы модификации, приводящей к появлению второй полосы, необходимы дополнительные исследования. Возможно также, что эти полипептиды являются продуктами разных генов. Полипептид 69 ± 2 кД преимущественно обнаруживается в листьях 10-дневных растений. Полученные результаты говорят о существовании системы модификации ЗСБ, которая, вероятно, влияет на его активность.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Люкевич, Татьяна Владимировна, Москва

1. D'Agostino IB, Deruere J, Kieber JJ. (2000) Characterization of the response of the Arabidopsis response regulator gene family to cytokinin.

2. Plant Physiol, 124(4), 1706-17.

3. Allison L.A. (2000) The role of sigma factors in plastid transcription. Biochimie, 82, 537-548.

4. Aranda A. and Pascual A. (2001) Nuclear hormone receptors and gene expression. Physiol. Rev., 81, 1269-1303.

5. Baba K., Nakano Т., Yamagishi K. and Yoshida S. (2001) Involvement of a nuclear-encoded basic helix-loop-helix protein in transcription of the light-responsive promoter of psbD. Plant Physiol., 125, 595-603.

6. Baeza L.(1991) Characterization of a protein binding sequence in the promoter region of the 16S rRNA gene of the spinach chloroplast genome. Nucleic Acids Res. V.19(13):3577-81.

7. Baginsky S., Tiller K. and Link G. (1997) Transcription factor Phosphorylation by a protein kinase associated with chloroplast RNA polimerase from mustard (Sinapis alba). Plant Molicular biology, V.34, 181-189.

8. Baumgartner B.J. (1989) Plastid transcription activity and DNA copy namber increase early in barley chloroplast development. Plant Physiol. 89, 1011 -1018.

9. Baumgartner B.J., Rapp J.C. and Mullet J.E. (1993) Plastid genes encoding the transcription/translation apparatus are differentially transcribed early in barly (Hordeum vulgare) chloroplast development. Plant Physiol., 101, 781 -791.

10. Benkova E, Witters E, Van Dongen W, Kolar J, Motyka V, Brzobohaty B, Van Onckelen HA, Machackova I. (1999) Cytokinins in tobacco and wheat chloroplasts. Occurrence and changes due to light/dark treatment. Plant Physiol. V. 121(l):245-52.

11. Bleecker A.B.,Kende H., (2000) Ethylene: a gaseous signal molecule in plant. Annu.Rev. Cell Dev. Biol. V.16, 1-18.

12. Bligny M, Courtois F, Thaminy S, Chang CC, Lagrange T, Baruah-Wolff J, Stern D, Lerbs-Mache S. (2000) Regulation of plastid rDNA transcription by interaction of CDF2 with two different RNA polymerases. EMBOJ., 19(8), 1851-60.

13. Brandstatter I. And Kieber J.(1998) Two genes with similarity to bacterial response regulators are rapidly and specifically induced by cytokinin in Arabidopsis. The plant cell. V.10, 1009-1020.

14. Brault M, Caiveau O, Pedron J, Maldiney R, Sotta B, Miginiac E. (1999) Detection of membrane-bound cytokinin-binding proteins in Arabidopsis thaliana cells. Eur J Biochem. V. 260(2), 5129.

15. Brinegar A.C., Fox J.E. (1985) Resolution of subunit composition of a cytokinin-binding protein from wheat embryos. Biol. Plantarum. V.27, 100-104.

16. Brownell J.E., Zhou J., Ranalli T., Kobayashi R., Edmondson D.G., Roth S.Y. and Allis C.D. (1996) Tetrahymenahistone acetyltransferase A: a homolog to yeast Gcn5p linking histone acetylation to gene activation. Cell, 84, 843-851.

17. Calvo J.M., Matthews R.G. (1994) The leucine-responsive regulatory protein, a global regulator of metabolism in Escherichia coli. Microbiol. Rev., 32, 466-490.

18. Cato A.T., Nestl A., Mink S., 2002, Rapid actions of steroid receptors in cellular signaling pathways. Sci STKE, V.138, 9.

19. Chen C., Melitz D., Petschow B., Eckert R.L. (1980) Isolation of cytokinin-binding protein from plant tissues by affinity chromatiography. Eur. J. Biochem. V.108, 379-387.

20. Cheng M.C., Wu S.P., Chen L.F.O., Chen S.C.G. (1997) Identification and Purification of a spinach chloroplast DNA-binding protein that interact specificaly with the plastid psaA-psaB-rpsl4 promotor region. Planta V.203, 373-380.

21. Christopher D.A., Kim M. and Mullet J.E. (1992) A novel light-regulated promoter is conserved in cereal and dicot chloroplast. Plant Cell, 4, 785-798.

22. CoIIand F., Barth M., Hengge-Arons R. and Kolb A. (2000) 5 factor selectivity of Escherichia coli RNA polymerase: role for CRP, IHF and Lrp transcription factor. EMBOJ., 19, 3028-3037.

23. D'Agostino I.,Deruere J. And Kieber J. (2000) Characterization of the response of the Arabidopsis response regulator gene family to cytokinin. Plant Physiology, V. 124, 1706-1717.

24. Darimont B.D., Wagner R.L., Apriletti J.W., Stallcup M.R., Kushner P.J., Baxter J.D., Fletterick R.J., Yamamoto K.R. (1998) Structure and specificity of nuclear receptor-coactivator interactions. Genes Dev., 12(21), 3343-56.

25. Doebley J, Lukens L. (1998) Transcriptional regulators and the evolution of plant form. Plant Cell., 10(7), 1075-82.

26. Engvall E. (1980) Enzyme immunoassay ELISA and EMIT. Methods Enzymol. ,70(A), 419-39.

27. Erion J.L., Fox J.E. (1981) Purification and properties of a protein which binds cytokinin-active 6-substituted purines. Plant Physiol. V.67, 156-162.

28. Estelle M. Cytokinin action: two receptors better than one? 1998, Current Biology, V.8, 539-541.

29. Forman BM, Evans RM. (1995) Nuclear hormone receptors activate direct, inverted, and everted repeats. Ann N YAcad Sci., 761, 29-37.

30. Fox J.E., Erion J.L. (1977) Cytokinin binding proteins in higher plants. In: Plant Growth Regulation (Pilet P.E., ed.)- Berlin: Springer-Verlag, pp. 139-146.

31. Glass C.K. (1994) Differential recognition of target genes by nuclear receptor monomers, dimers, and heteridimers. Endocr. Rev., 15,391-407.

32. Glass C.K. (1996) Same new twists in the regulation of gene expression by thyroid hormone and retinoic acid receptors. J.Endocrinology, V.150, 349-357.

33. Glass S. K. and Rosenfeld M.G. (2000) The coregulator exchange in transcriptional functions of nuclear receptors. Genes Dev., 14, 121-141.

34. Gu W, Roeder RG.(1997) Activation of p53 sequence-specific DNA binding by acetylation of the p53 C-terminal domain. Cell, 90(4):595-606.

35. Gu W., Malik S., Ito M., Yuan C.X., Fondell J.D., Zang X., Martinez E., Oin J. and Roeder R.G. (1999) A novel human SRB/MED-containing cofactor complex, SMCC, involvd in transcription regulation. Mol. Cell, 3, 97-108.

36. Haberer G, Kieber JJ Cytokinins. New insights into a classic phytohormone. (2002) Plant Physiol., 128(2), 354-62.

37. Hammer GD, Krylova I, Zhang Y, Darimont BD, Simpson K, Weigel NL, Ingraham H.A. (1999) Phosphorylation of the nuclear receptor SF-1 modulates cofactor recruitment: integration of hormone signaling in reproduction and stress. Mol Cell., 3(4), 521-6.

38. Hare P. And Staden J. (1997) The molecular basis of cytokinin action. Plant Growth Regulation. V. 23, 41-78.

39. Hermanson O., Glass C.K. and Rosenfeld M.G.Nuclear receptor coregulators: multiple modes of modification. (2002) Trends in endocrinologyand metabolism, V. 13, 55-60.

40. Hess W.R. and Borner T. (1999) Organellar RNA polimerases of higher plants. International review of cytology. V. 190, 1-59.

41. Hua J. And Meyerowitz E.M. (1998) Ethylene responses are negativelyregulated by a receptor gene family in Arabidopsis Thaliana. Cell. V. 94, 261-271.

42. Jayabaskaran C. (1988) Isolation of a cytokinin-binding protein from Cucumis sativus cotyledons. Proc. Indian Acad. Sci. (Plant Sci), 98(4), 269-276.

43. Jayabaskaran C. (1990) Isolation and characterization of a cytokinin-binding protein from cucumber cotyledons. Plant Growth Regulation, 9, 9-17.

44. Jervis L. and Pierpoint W.S. (1989) Purification technologies for plant ptroteins. J.Biotechnology, 14, 161-198.

45. Jishage M and Ishihama A. (1998) A stationary phase protein in Escherichia coli with binding activity to the major 5 subunit of RNA polymerase. Biochemistry, 95, 4953-4958.

46. Kakimoto T. (1996) CKI1, a histidin kinase homolog implicated in cytokinin signal transduction. Science, 274, 982-985.

47. Kakimoto T. (2003) Perception and signal transduction of cytokinins., Annu Rev Plant Biol., 54, 605-27.

48. Katzenellenbogen B.S. (2000) Mechanisms of action and cross-tolk between estrogen receptor and progesteron receptor pathways. J.Soc. Gynecol. Investig, 7, 33-7.

49. Kim J.W., Park J.K., Kim B.H., Lee J.S. and Sim W.S. (2002) Molecular analysis of the accumulation of the transcripts of the large subunit gene of ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase by light. Mol. Cells, 14, 281-287.

50. Kim M, Mullet JE. (1995) Identification of a sequence-specific DNA binding factor required for transcription of the barley chloroplast blue light-responsive psbD-psbC promoter. Plant Cell, 7(9), 1445-57.

51. Kim M., Christopher D.A.,Mullet J.E. (1999) ADF-Dependent phosphorylation regulates association of a DNA-binding complex with the barley chloroplast psbD blue-light-responsive promoter. Plant Physiol., 119(2), 663-70.

52. Kim Y.,S. Kim D., H., Jung J. (1998) Isolation of a novel auxin receptor from soluble fraction of rise ( Oryza sativa L.) shoots. FEBS Lett., 438, 241-244.

53. Kobayashi K., Fukuda M., Igarashi D., Sunaoshi M. (2000) Cytokinin-binding proteins from Tobacco callus Share Homologywith Osmotin-like protein and an endochitinase. Plant. Cell Physiol., 41, 148-157.

54. Kobayashi K., Zbell B., ReinertJ. (1981) A high affinity binding site for cytokinin to a particulate fraction in carrot suspension cells. Protoplasma, 106, 145-155.

55. Kouzarides T. (2000) Acetylation: a regulatory modification to rival phosphorylation? EMBO J. , 19(6),1176-9.

56. Kulaeva O.N., Karavaiko N.N., Selivankina S.Yu., Moshkov I.E., Novikova G.V., Zemlyachenko Y.V., Shipilova S.V., Orudgev E.M.(1996) Cytokinin Signaling Systems. Plant Growth Regul. 18, 29-37.

57. Kulaeva ON, Prokoptseva OS. (2004) Recent advances in the study of mechanisms of action of phytohormones. Biochemistry, 69(3), 233-47.

58. Kulaeva O.N., Karavaiko N.N., Selivankina S.Yu., Zemlyachenko Ya.V., Shipilova S.V. (1995) Receptor of transe-zeatin involved in transcription activation by cytokinin. FEBS Lett., 366, 26-28.

59. Kulaeva ON, Zagranichnaya TK, Brovko FA, Karavaiko NN, Selivankina SY, Zemlyachenko YV, Hall M, Lipkin VM, Boziev KM. A new family of cytokinin receptors from Cereales. (1998) FEBSLett., 423(2), 239-42.

60. Kumar A., Grimes B., Fujita N., Makino K., Malloch R.A., Hayward R.S. and Ishihama A. (1994) Role of the sigma70 subunitof E. coli RNA polimerase in transcription activation. J. Mol. Biol., 235, 405-413.

61. Kusnetsov V, Bolle C, Lübberstedt T, Sopory S, Herrmann RG, Oelmuller R. (1996) Evidence that the plastid signal and light operate via the same cis-acting elements in the promoters of nuclear genes for plastid proteins. Mol Gen Genet., 252(6), 631-9.

62. Malik S, Baek HJ, Wu W, Roeder RG. (2005) Structural and Functional Characterization of PC2 and RNA Polymerase II-Associated Subpopulations of Metazoan Mediator. Mol Cell Biol., 25(6),2117-29.

63. Maliga P. (1998) Two plastid RNA polimerases of higher plants: an evolving story. Trends in plant science, 3(1), 4-6.

64. Mitsui S., Sugiura M. (1993a) Purification and properties of cytokinin-binding proteins from tobacco leaves. Plant Cell Physiol., 34(4), 543-547.

65. Mitsui S., Sugiura M. (1993b) A cDNA encoding the 57 kDa subunit of a cytokinin-binding protein complex from tobacco: the subunit has high homology to S-adenosyl-L-homocysteine hydrolase. Plant Cell Physiol. 34(7), 1089-1096.

66. MokDW, MokMC. (2001) Cp^NINMETABOLISM ' AND ACTION. Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol., 52, 89-118.

67. Momotani E., Tsuji H. (1992) Isolation and characterization of cytokinin-binding protein from the water soluble fraction of tobacco leaves. Plant Cell Physiol., 33(4), 407-412.

68. Moore F.H. (1979) A cytokinin binding proteins from wheat germ. PlantPhysioIogy., 64, 594-599.

69. Morikawa K., Shiina T., Murakami S., Toyoshima Y. (2002) Novel nuclear-encoded proteins interacting with a plastid sigma factor, Sigl, in Arabidopsis thaliana. FEBSLett., 514, 300-4.

70. Moshkov IE, Mur LA, Novikova GV, Smith AR, Hall MA. (2003) Ethylene regulates monomeric GTP-binding protein gene expression and activity in Arabidopsis. Plant Physiol., 131(4), 170517.

71. Moshkov IE, Novikova GV, Mur LA, Smith AR, Hall MA.2003) Ethylene rapidly up-regulates the activities of both monomeric GTP-binding proteins and protein kinase(s) in epicotyls of pea. Plant Physiol 131(4), 1718-26.

72. Mustilli AC, Bowler C. (1997) Tuning in to the signals controlling photoregulated gene expression in plants. EMBOJ., 16(19), 5801-6.

73. Nagata R., Kawachchi E., Hashimoto Y., Shudo K. (1993) Cytokinin-specific binding protein in ethyolated mung bean seedlings. Biochem. Biophys. Res. Comm., 191(2), 543-549.

74. Nakae J, Barr V, Accili D. (2000) Differential regulation of gene expression by insulin and IGF-1 receptors correlates with phosphorylation of a single amino acid residue in the forkhead transcription factor FKHR. EMBOJ., 19(5), 989-96.

75. Nakano T., Murakami S., Shoji T.,Yoshida S.,YamadaY., Sato F. (1997) A novel protein with DNA binding activity from tobacco chloroplast nucleoids. The Plant Cell, 9, 1673-1682.

76. Nogue F., Mornet R. And Laloue M. (1995) Specific photoaffinity of a thylakoid membrane protein with a n azido-cytokinin agonist. Plant Growth. Regul., 18, 51-58.

77. Ouelhazi, L., S. Hamdi, J.C. Chenieux, M. Rideau. (1994) Cytokinin and auxin-induced regulation of protein synthesis and poly(A)+ RNA accumulation in Catharanthus roseus cell cultures. J. Plant Physiol. 144, 167-174.

78. Pego JV, Kortstee AJ, Huijser C, Smeekens SC. (2000) Photosynthesis, sugars and the regulation of gene expression. J Exp Bot., 407, 16.

79. Pfannschmidt T, Nilsson A, Tullberg A, Link G, Allen JF.1999) Direct transcriptional control of the chloroplast genes psbAand psaAB adjusts photosynthesis to light energy distribution in plants. IUBMB Life, 48(3), 271-6.

80. Pfannschmidt T., Ogrzewalla K., Baginsky S., Sickmann A., Meyer H.E., Link G. (2000) The multisubunit chloroplast RNA polimerase A from mustard (Sinapis alba L.) Eur. J. Biochem., 267, 253-261.

81. Polya G.M., Davis A.W. (1978) Properties of high-affinity cytokinin-binding protein from wheat germ. Planta, 139, 139-147.

82. Puigserver P., Wu Z., Park C.W., Graves R., Wright M. and Spiegelman B.M. (1998) A cold inducibl coactivator of nuclear receptors linked to adaptiv thermogenesis. Cell, 92, 829-839.

83. Rashotte A., Carson S., To J., Kieber J. (2003) Expression profiling of cytokinin action in Arabidopsis. Plant Physiology, 132, 1998-2011.

84. Romanov G.A., Getman I.A., Schmulling T. (2000) Investigatin of early cytokinin effects in a rapid Amaranthus seedling test. Plant Growth Regulation, 32, 337-344.

85. Romanov G.A., Taran V.Ya., Chvojka L., Kulaeva O.N. (1988) Receptor-like cytokinin-binding protein(s) from barley leaves. J.Plant. Groth.Regul., 7(4), 1-17.

86. Salchert K, Bhalerao R, Koncz-Kalman Z, Koncz C. (1998) Control of cell elongation and stress responses by steroid hormones and carbon catabolic repression in plants. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 353(1374), 1517-20.

87. Salchert K, Bhalerao R, Koncz-Kalman Z, Koncz C. (1998) Control of cell elongation and stress responses by steroid hormones and carbon catabolic repression in plants. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci., 353(1374), 1517-20.

88. Samochocki M, Strosznajder J.(1994) Age-related changes of GABA-activated chloride channel properties in brain cortex synaptic plasma membrane: evidence for phospholipase involvement. J. Neurochem, 63(4), 1522-8.

89. Sato N.,Misumi O., Shinada Y., Sasaki M., and Yoine M. (1997) Dynamics of localization and protein composition of plastid nucleoids in light-grown pea seedlings. Protoplasma, 200, 163-173.

90. Sauer F, Jackie H. (1991) Concentration-dependent transcriptional activation or repression by Kruppel from a single binding site. Nature, 353(6344), 563-6.

91. Schmulling T., Schafer S., Romanov G. (1997) Cytokinin as regulators of gene expression. Physiologia Plantarum, 100, 505-519.

92. Schmulling T. CREam of cytokinin signalling: receptor identified. Trends Plant Sci., 6(7), 281-4.

93. Shao D, Lazar MA. (1999) Modulating nuclear receptor function: may the phos be with you. J Clin Invest., 103(12), 1617-8.

94. Sheen J. (2002) Phosphoreay and transcription control in cytokinin signal transduction. Science, 296, 1650-1652.

95. Shiine T., Allison L. and Maliga P. (1998) rbcL Transcript levels in tobacco plastids are independent of light: reduced darktranscription rate is compensated by increased mRNA stability. Plant Cell, 10, 1713-1722.

96. Shin M., Kang S., Hyun S., Fujita N., Ishihama A., ValentinHansen P. and Choy H.E. (2001) Repression of deoP2 in Escherichia coli by CytR: conversion of a transcription activator into a repressor. EMBOJ20, 5392-5399.

97. Shine T., Allison L. and Maliga P. (1998) rbcL Transcript levels in tobacco plastids are independent of light: reduced dark transcription rate is compensated by increased mRNA stability. Plant Cell, 10, 1713-1722.

98. Smale S. (2001) Core promoters: active contributors to combinatorial gene regulation., Genes and Development, 15, 25032508.

99. Smale S.T. (2001) Core promoters: active contributors to combinatorial gene regulation. Genes Dev., 15(19), 2503-8.

100. Stock A., Robinson V., Goudreau P. (2000) Two-component signal transduction. Annu Rev Biochem., 69, 183-215.

101. Strosznajder J, Samochocki M, Duran M. (1994) Aging diminishes serotonin-stimulated arachidonic acid uptake and cholinergic receptor-activated arachidonic acid release in rat brain cortex membrane. JNeurochem., 62(3), 1048-54.

102. Suzuki T, Miwa K, Ishikawa K, Yamada H, Aiba H, Mizuno T. (2001) The Arabidopsis sensor His-kinase, AHk4, can respond to cytokinins. Plant Cell Physiol., 42(2), 107-13.

103. Sweere U., Eichenberg K., Lohrman J., Mira-Rodado V., Baurlel., Kudla J., Nagy F., Schafer E.,Harter K. (2001) Interaction of response regulator ARR4 with phytochrome B in modulating red light signaling. Sciense, 294, 1108-1 111.

104. Takegami E.T., Yoshida K. (1975) Isolation and purification of cytokinin binding protein from tobacco leaves by affynity column chromatiography. Biochem. Biophys. Res. Com., 67(2), 782-789.

105. Tan S.,TroxIer R.F. (1999) Characterization of two chloroplast RNA polimerase sigma factors from Zea mays: Photoregulation and differential expression. PNAS USA, 96, 5316-5321.

106. Tiller K. and Link G. (1993) Phosphorylation and dephosphorylation affect functional characteristics of chloroplast and etioplast transcription systems from mustard (Sinapis alba L.) The EMBOJ., 12, 1745-1753.

107. To K.Y., Cheng M.C., Suen D.F., Mon D.P., Chen L.F., Chen S.C. (1996) Characterization of the light-responsive promoter of rice chloroplast psbD-C operon and the sequence-specific DNA binding factor.P/an/ Cell Physiology, 37, 660-6.

108. Trifa Y, Lerbs-Mache S. (2000) Extra-ribosomal function(s) of the plastid ribosomal protein L4 in the expression of ribosomal components in spinach. Mol Gen Genet. 263(4), 642-7.

109. Trifa Y, Privat I, Gagnon J, Baeza L, Lerbs-Mache S. (1998) The nuclear RPL4 gene encodes a chloroplast protein that co-purifies with the T7-like transcription complex as well as plastid ribosomes. J Biol Chem., 273(7), 3980-5.

110. Tsunoyama Y., Morikawa K., Shiina T., Toyoshima Y. (2002) Blue light specific and differential expression of a plastid sigma factor, Sig 5 in Arabidopsis thaliana., 516, 225-8.

111. Umesono K., Murakami K.K., Thompson C.C. and Evans R.M. (1991) Direct repeats as selective response elements for the thyroid hormon,retinoic acid, and vitamin D3 receptors. Cell, 65, 1255-1266.

112. Urao T., Miyata S., Yamaguchi-Shinozaki K., Shinozaki K.2000) Possible His-to-Asp phosphorelay signaling in an Arabidopsis two-component system. FEBSLett., 478, 227-232.

113. Urao T., Yakubov B., Satoh R., Yamaguchi-Shinozaki K., Seki M., Hirayama T.,Shinozaki K. (1999) A transmembrane hybrid-type histidine kinase in Arabidopsis functions as an osmosensor. Plant Cell. 11, 1743-1754.

114. Vicente M., Chater K.,Lorenzo V. (1999) Bacterial transcription factors involved in global regulation. Molecular Microbiology, 33, 8.

115. Waltzer L, Bienz M. (1998) Drosophila CBP represses the transcription factor TCF to antagonize Wingless signalling. Nature., 395(6701), 521-5.

116. Watson C.S., Gametchu B. (2003) Proteins of multiple classes may participate in nongenomic steroid action. Experimental biology and medicine, 228, 1272-1281.

117. Weber H, Polen T, Heuveling J, Wendisch VF, Hengge R. (2005) Genome-wide analysis of the general stress response network in Escherichia coli: sigmaS-dependent genes, promoters, and sigma factor selectivity. JBacteriol., 187(5), 1591-603.

118. Werner., Motyka V., StrandM., SchmullingT. (2001) Regulation of plant growth by cytokinin. PNAS, 98, 10487-10492.

119. Williams R.M., Rhodius V.A., Bell A.I., Kolb A. and Busby S.J.W. (1996) Orientation of functional activating region in the Escherichia coli CRP protein during transcription activation at classll promoters. Nucleic Acids Res., 24, 1112-1118.

120. Woo EJ, Marshall J, Bauly J, Chen JG, Venis M, Napier RM, Pickersgill RW. (2002) Crystal structure of auxin-binding protein 1 in complex with auxin. EMBO J. , 21(12), 2877-85.

121. Yen S. and Chang C. (1996) Cloning and haracterization of a specificcoactivator, ARA 70, for the androgen receptor in human prostatit cells. Proc. Natl Acad. Sci. USA, 93, 5517-5521.

122. Yoshida K., Tagami E.T. (1977) Isolation of cytokinin binding protein from tobacco leaves by bioaffinity chromatiography and its partial characterization. J. Biochem., 1, 791-799.

123. Yurina N.P., Belkina G.G., Karapetyan N.V., Odintsova

124. M.S. (1995) Nucleoids of pea chloroplasts: microscopic and chemical characterization. Occurrence of histone-like proteins. Biochem. Mol. Biol. Internat.y 36, 145-154.

125. Zhang D.,P.,Wu Z.,Y., Li X.,Y., Zhao Z.,X., (2002) Purification and identification of 42-kilodalton abscisic acid-specific-binding protein from epidermis of broad bean leaves. Plant. Physiol, 128, 714-725.

126. Zhi J., Mathew E. and Freundlich M. (1998) In vitro and in vivo characterization of three major dadAX promoters in Escherichia coli that are regulated by cyclic AMP-CRP and Lrp. MolGen. Genet., 32,442-447.

127. Zhi J., Mathew E. and Freundlich M. (1999) Lrp binds to two regions in the dadAX promoter region of Escherichia coli to repress and activate transcription directly. Mol Microbiol., 32, 29.

128. Зубо Я.О., Селиванкина С.Ю., Ямбуренко М.Б., Зубкова Н.К., Кулаева О.Н., Кузнецов В.В. (2005) Цитокинины активируют транскрипцию хлоропластных генов. Докл. Акад. Наук, 400(3), 396-399.

129. Гладун A.A., Калинин Ф.Л., Сарнацкая В.В. (1986) Выделение и исследование функций цитокинин-связывающих белков из культуры ткани табака. Физиология и биохимия культурных растений, 18(4), 333-337.

130. Земляченко Я.В. (1996) Диссертация на соискание ученойстепени кандидата биологических наук.

131. Каравайко H.H., Земляченко Я.В ., Земляченко Я.В., Кулаева О.Н. (1995) Выделение из цитозоля листьев ячменя зеатин-связывающего белка, учавствующего в активации транс-зеатином синтеза РНК in vitro. Физиология растений., 42, 547554.

132. Каравайко H.H., Мошков И.Е., Селиванкина С.Ю., Новикова Г.В., Кулаева О.Н. (1990) Выделение при помощи антиидиотипических антител белка со свойствами рецептора цитокининов.Докл. АН СССР.,310,165-161.

133. Кулаева О.Н. (1979) Цитокинины. В кн.: Регуляторы роста растениий., Под ред. Муромцева Г.С, М.: Колос, с.990-1008.

134. Кулаева О.Н. (1982) Гормональная регуляция физиологических процессов у растений на уровне синтеза РНК и белка. 41 Тимирязевское чтение. М., Наука, с.83.

135. Кулаева О.Н. (1973) Цитокинины, их структура и функция. М: Наука, с. 264.

136. Кулаева О.Н., Кузнецов В.В. (2002) Новейшие достижения и перспективы в области изучения цитокининов. Физиология растений, 49(4), 626-640.

137. Курсанов А.Л., Кулаева О.Н., Свешникова И.Н., Попова Э.А., Болякина Ю.П., Клячко Н.Л., Воробьева И.П.(1964) Восстановление клеточных структур и обмена веществ в желтых листьях под действием 6-бензиламинопурина. Физиол.раст. т.11, с.838.

138. Микулович Т.П., Хохлова В.А., Кулаева О.Н., Свешникова И.Н. (1971) Влияние 6-бензиламинопурина на изолированные семядоли тыквы. Физиол^Раст. Т. 18, с.98.

139. Никифоров В.Г. Структурно-функциональные исследования РНК-полимеразы (1962-2001). (2002) Молекулярная биология, 36(2), 197-207.

140. Розен В.Б. (1994) Основы эндокринологии. Издательство Московского университета.

141. Розен В.Б., Смирнов А.Н. Рецепторы и стероидные гормоны.М., 1981.

142. Романко Е.Г., Селиванкина С.Ю., Мошков И.Е., Новикова Г.В. (1986) Действие выделенных из хлоропластов цитокининсвязывающих белков на транскрипцию. Физиология растений. Т.ЗЗ, Вып.6, с. 1078-1083.

143. Романко Е.Г., Селиванкина С.Ю., Овчаров А.К. (1982) Участие цитокинин-связывающих белков из листьев ячменя в активации цитокинином синтеза РНК в изолированных ядрах и хлоропластах. Физиология растений. Т.29, №3, с. 524-531.

144. Романко Е.Г., Селиванкина С.Ю., Овчаров А.К., Кулаева О.Н. Активация цитокинин-рецепторным комплексом из листьев ячменя синтеза РНК in vitro. (1980)Докл. А.Н. СССР, Т.255, № 4, с. 1009-1011.

145. Романов Г.А., Таран В.Я., Хвойка JL, Кулаева О.Н. (1986) Специфическое связывание зеатина белковой фракцией листьев ячменя и очистка цитокинин-связывающих белков. Физиология растений. Т.ЗЗ, с. 93-102.

146. Селиванкина С.Ю., Каравайко H.H., Земляченко Я.В., Маслова Г.Г., Кулаева О.Н. (2001) Регуляция транскрипции рецептором цитокинина в системах in vitro. Физиология растений, 48(3), 434-440.

147. Селиванкина С.Ю., Каравайко H.H., Черепнева Г.Н., Прищепова А.Е., Кузнецов В.В., Кулаева О.Н. (1997) Биологически активный зеатин-связывающий белок из хлоропластов листьев ячменя. Докл. Акад.наук. Т.356, с.830-832.

148. Селиванкина С.Ю., Романко Е.Г., Овчаров А.К., Харчеико В.И. (1982) Участие цитокинин-связывающих белков из листьев ячменя в активации цитокинином связанной с хроматином РНК-полимеразы. Физиология растений. Т.29., в.2, с.274-281.

149. Смирнов А.Н. Ядерные рецепторы мелатонина. 2001, Биохимия, том 66, стр.28-36.

150. Степанов В.М. (1996) Молекулярная биология. М.: Высш.шк.

151. Хохлова В.А., Свешникова И.Н., Кулаева О.Н.(1971)

152. Влияние фитогормонов на формирование структуры хлоропластов в изолированных семядолях тыквы. Цитология. Т. 13, с. 1074.

Информация о работе

Люкевич, Татьяна Владимировна
кандидата биологических наук
Москва, 2005
ВАК 03.00.12

Диссертация

Цитокинин-связывающие белки хлоропластов листьев ячменя - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы