Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Триспороиды и липиды в каротинообразовании мицелиального гриба Blakeslea trispora

ВАК РФ 03.02.03, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Триспороиды и липиды в каротинообразовании мицелиального гриба Blakeslea trispora"

На правах рукописи

ВЕРЕЩАГИНА Ольга Александровна

ТРИСПОРОИДЫ И ЛИПИДЫ В КАРОТИНООБРАЗОВАНИИ МИЦЕЛИАЛЬНОГО ГРИБА ВЬАКЕБЬЕА ТЫБРСЖА

Специальность 03.02.03 - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

14 МАР 2013

Москва-2013

005050707

005050707

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институт микробиологии им. С.Н. Виноградского Российской академии наук (ИНМИ РАН)

Научный руководитель: Терёшина Вера Михайловна, доктор

биологических наук

Официальные оппоненты: Складнев Дмитрий Анатольевич,

доктор биологических наук, ИНМИ РАН, главный научный сотрудник

Гесслер Наталья Николаевна, кандидат биологических наук, Институт биохимии им. А.Н.Баха РАН, старший научный сотрудник

Ведущая организация: Московский Государственный

Университет имени М.В. Ломоносова, биологический факультет

Защита состоится 18 марта 2013 г. в 1500 на заседании диссертационного совета Д002.224.01 при ИНМИ РАН по адресу: 117312, Москва, проспект 60-летия Октября, д.7, корп. 2. Тел. (499) 135-21-39, факс (499) 135-65-30.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИНМИ РАН.

Автореферат разослан « » февраля 2013 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность. Среди каротиноидов ликопин обладает наибольшей антиоксидантной активностью и регуляторными свойствами, обусловливающими его перспективность для профилактики и лечения многих хронических заболеваний и рака [Tanaka et. al., 2012], а также для применения в пищевой промышленности и косметологии [Archer et. al., 2008; Anunciato, da Rocha, 2012]. Поскольку химически синтезированный ликопин вызывает побочные эффекты [Scientific committee on food, 1999], возрастает интерес к биотехнологическим способам его получения [Pegklidou et. al., 2008; Tang et. al., 2011; Yan et. al., 2012; Papaioannou, Liakopou-Kyriakides, 2012]. Среди продуцентов гриб Blakeslea trispora наиболее перспективен в связи с высоким выходом каротиноидов.

Изучение каротиногенеза у В. trispora имеет длительную историю. Большой вклад в развитие этой тематики внесли работы М.Н. Бехтеревой, Г.И. Самохвалова, Е.П. Феофиловой, JI.A. Вакуловой и многих других. В результате были разработаны биотехнологии получения ß-каротина [Бехтерева, 1973] и ликопина [Феофилова и др., 1998; 2001], в которых используется совместная культура гетероталличных (+) и (-) штаммов гриба. Необходимость использования совместной культуры обусловлена тем, что при половом взаимодействии (+) и (-) штаммов образуются половые гормоны, триспоровые кислоты (ТСК), которые стимулируют каротиногенез [Schmidt et. al., 2005] и контролируют образование покоящихся половых клеток, зигоспор. Однако литературные данные о взаимосвязи зиготообразования, синтеза ТСК и каротиногенеза противоречивы [Бобнева, 1974; Sutter et. al., 1996; Калинина и др., 2007]. Отсутствуют данные о составе триспороидов (ТС) в глубинной культуре, в том числе в условиях стимуляции каротиногенеза, а также не разработан метод количественного анализа состава ТС.

В биотехнологии получения ликопина используется 6-метил-2-аминопиридин (МАП), который ингибирует ликопинциклазу, что приводит к накоплению ликопина в мицелии гриба, но выход его остаётся низким [Феофилова и др:, 1998]. В связи с этим, открытым остаётся вопрос поиска путей дополнительной стимуляции синтеза ликопина.

Эмпирически обнаружено, что введение в среду выращивания растительных масел в качестве дополнительного источника углерода приводит к заметной стимуляции синтеза ß-каротина [Anderson et. al., 1958; Ciegler et. al., 1959; Pazola et. al., 1968; Björk et. al., 1970]. Однако данных о влиянии масел на, синтез ликопина, растворимость которого в маслах ниже, чем у ß-каротина, в литературе не

обнаружено. Также неясен механизм их стимулирующего действия, хотя на взаимосвязь липо- и каротиногенеза указывает то, что в клетке липофильные каротиноиды локализованы в липидных глобулах [Murphy, Vance, 1999].

Совокупность вышеизложенного показывает, что исследование содержания и состава ТС в глубинных совместных культурах при различных соотношениях (+) и (-) штаммов В. trispora, в зависимости от их способности к зиготообразованию и в условиях интенсификации каротиногенеза может способствовать выявлению механизмов взаимосвязи этих процессов, а изучение влияния ТСК на липогенез и экзогенных масел на состав запасных и мембранных липидов - прояснить взаимосвязь между липо- и каротиногенезом.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы стало исследование роли триспороидов и липидов в каротиногенезе мицелиального гриба В. trispora.

Для достижения данной цели были поставлены задачи:

1. Изучить взаимосвязь каротиногенеза с образованием зигоспор и триспороидов у В. trispora',

2. Исследовать состав триспороидов в динамике развития совместных культур В. trispora, при различных соотношениях (+) и (-) штаммов гриба в инокуляте и в условиях стимуляции каротиногенеза МАП и ß-иононом;

3. Изучить влияние триспороидов на липогенез у Т (-) штамма гриба;

4. Исследовать влияние экзогенных масел на рост, образование липидов и ликопина в совместной культуре штаммов Т (+) и Т (-) В. trispora.

Научная новизна работы. Установлено, что зиготообразующие пары (+) и (-) штаммов дикого типа Blakeslea trispora синтезируют значительно больше триспороидов и каротиноидов, чем пары, неспособные к зиготообразованию. Однако прямой корреляции между интенсивностью зиготообразования и активностью каротиногенеза не обнаружено. Основными триспороидами в глубинной культуре гриба являются триспоровые кислоты В и С и их нейтральные предшественники, триспорины и триспоролы, а минорными - триспоровая кислота А и метилтриспораты.

Впервые показано, что совместное применение ß-ионона в комбинации с МАП приводит к значительной интенсификации ликопиногенеза и сопровождается ингибированием синтеза триспороидов, особенно ТСК. Впервые установлено, что ТСК оказывают стимулирующий эффект на синтез триацилглицеринов, который снимается при введении экзогенных масел. Впервые выявлено, что экзогенные масла с высоким содержанием С]8:2 и особенно С^з значительно стимулируют образование

ликопина, оказывая существенное влияние на состав жирных кислот запасных три- и диацилглицеринов, но не мембранных липидов.

Практическая значимость работы. Результаты исследования могут быть использованы для оптимизации биотехнологии получения ликопина с использованием гетероталличного гриба В. trispora. Сформулированы критерии отбора каротиногенных штаммов гриба при селекции, в качестве которых могут служить высокий уровень ТСК и (или) способность совместных культур к зиготообразованию. Предложен способ количественного анализа триспороидов, который может быть использован для селекции неспособных к зиготообразованию мутантных штаммов по уровню ТСК. Разработана схема введения двух стимуляторов, р-ионона и МАП, позволяющая в 1.5-2 раза увеличить выход ликопина. Определён критерий подбора экзогенных масел для интенсификации ликопиногенеза - высокое содержание в их составе ненасыщенных жирных кислот Ci8:2 и С^з- Получены новые данные о синтезе триспороидов, зиготообразовании и каротиногенезе пары штаммов-суперпродуцентов каротиноидов, Т (+) и Т (-).

Основные положения, выносимые на защиту:

1) Зиготообразующие пары штаммов дикого типа синтезируют значительно больше триспороидов и каротиноидов, чем пары, неспособные к зиготообразованию. Между интенсивностью зиготообразования и активностью каротиногенеза прямой корреляции не обнаружено.

2) Стимуляция биосинтеза ликопина под действием р-ионона в комбинации с ингибитором ликопинциклазы, МАП, сопровождается ингибированием синтеза триспоровых кислот.

3) Триспоровые кислоты оказывают стимулирующий эффект не только на синтез каротиноидов, но и на синтез триацилглицеринов.

4) Стимулирующее ликопиногенез действие экзогенных масел с полиненасыщенными жирными кислотами связано с повышением степени ненасыщенности жирных кислот триацилглицеринов липидных глобул клеток гриба.

Апробация. Материалы работы были представлены на V Молодежной школе-конференции с международным участием «Актуальные аспекты современной микробиологии» (Москва, Россия, 2009 г.), FEBS Workshop on Microbial Lipids from Genomics to Lipidomics (Вена, Австрия, 2010 г.) и 20th International Symposium on Plant Lipids (Севилья, Испания, 2012 г.).

Публикации. По теме диссертационной работы опубликовано 6 печатных работ, в т.ч. 3 статьи в рецензируемых журналах из списка ВАК и 3 тезисов.

Место проведения работы. Работа проводилась в ИНМИ РАН (лаборатория Экспериментальной микологии).

Объём и структура диссертации. Материалы диссертации изложены на 139 страницах машинописного текста и включают 13 рисунков и 14 таблиц. Список литературы» содержит 208 источников, в том числе 49 отечественных и 159 зарубежных.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ 1. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Объектом исследования служил гетероталличный мукоровый гриб Blakeslea trispora Thaxter (1914): (-) штаммы - ВКМ F-811, 921, 987, 826 и (+) штаммы - ВКМ F-666, 701, 812, 902, 904, 989, 1201; а также два штамма-суперпродуцента p-каротина из коллекции культур ИНМИ РАН: Т (+) и Т (-). Штамм Т (-) был получен ранее с помощью мутагенеза. Культуры гриба выращивали на скошенном картофельно-морковном агаре в течение 5-7 сут при 26-27°С, хранили при tK0MH, пересевали 1 раз в месяц.

Интенсивность зиготообразованию определяли как описано [Калинина и др.,

2007].

Глубинное культивирование проводили в два этапа. В течение 2 сут на гидролизной среде [Феофилова и др., 1995] выращивали инокулят отдельных (+) и (-) штаммов. Затем совместную культуру (+) и (-) штаммов в определённом соотношении помещали в мучную среду, добавляли масло и выращивали ещё в течение 4 сут на круговой качалке с 220 об/мин при 27-28°С. В зависимости от цели, параметры экспериментов варьировали (подробнее см. в соответствующей главе).

Динамику накопления ТС изучали в интервале 2-4 сут роста гриба. Влияние соотношения штаммов в инокуляте на образование каротиноидов и ТС изучали при соотношениях (+) и (-) штаммов 1:7, 1:1 и 7:1.

Для изучения влияния масел на каротиногенез использовали оливковое, льняное, подсолнечное, хлопковое, горчичное и касторовое масла, которые вносили в глубинную культуру в количестве 5%.

Определение количественного содержания каротиноидов проводили по методу [Терёшина и др., 1994].

Растворимость ликопина определяли по появлению кристаллов в 0.00025-0.4% растворах ликопина в маслах после 3 сут выдерживания при tK0MH-

Анализ липидов. Липиды экстрагировали по методу [Nichols, 1963], разделяли с помощью ТСХ: нейтральные липиды - в системе гексан:серный эфир:уксусная

4

кислота (85:15:1) (1975) [Кейтс, 1975], мембранные - в системе хлороформ:метанол:вода (65:25:4) в первом направлении и в системе хлороформ:ацетон:метанол:уксусная кислота:вода (50:20:10:10:5) во втором направлении [Benning et. al., 1995]. Проявляли хроматограммы 5% H2S04 в этиловом спирте. СфЛ определяли по окраске а-нафтолом и устойчивости к омылению, ФЛ — с помощью индивидуальных метчиков, по окраске нингидрином и раствором Драгендорфа [Кейтс, 1975]. Количественный анализ липидов проводили методом денситометрии с использованием компьютерной программы Dens в режиме линейной аппроксимации по калибровочным кривым на основе стандартных растворов: для СфЛ - смеси гликоцерамидов ("Larodan", Швеция), для ФЛ - фосфатидилхолина ("Sigma", США).

Жирные кислоты анализировали в виде метиловых эфиров. Интересующую фракцию липидов выскребали с хроматографической пластинки, элюировали смесью хлороформ:метанол = 1:1 в течение ночи на холоду, декантировали и упаривали. Сухой остаток растворяли в небольшом количестве растворителя и проводили метанолиз в течение 2 ч при 70°С. Состав ЖК определяли методом ГЖХ на хроматографе Кристалл 5000.1 (ЗАО «Хроматек», Россия) с капиллярной колонкой 0ptima-240-0.25 мкм 60 м 0.25 мм (Macherey-Nagel-GmbH&Co, Germany). Идентификацию проводили с использованием смеси метчиков метиловых эфиров ЖК Supelco 37 Component FAME Mix (США).

Анализ триспороидов. Экстракцию ТС проводили с помощью ТСХ проводили как описано [Schimek et.al, 2003]. ТС детектировали в УФ на денситометре Сорбфил-М и идентифицировали по спектрам поглощения в области 220-400 нм [Sutter, 1970] и данным биологической активности (см. ниже) [Ende, 1971; Sutter, 1981; Nieuwenhuis, Ende, 1975]. Количественный анализ ТС проводили методом денситометрии с помощью компьютерной программы Dens в режиме линейной аппроксимации по калибровочным кривым на основе стандартных растворов ретинола и ß-ионона ("Sigma", США).

Биологическую активность ТС определяли по индукции образования зигофоров у тест-штаммов Mucor mucedo ВКМ F-1355 (-) и 1356 (+) в диапазоне концентраций ТС 20-300 мкг [Schimek et. al., 2003; Ende, 1968].

Для изучения каротиногенной активности ТС Т (-) штамм В. trispora выращивали газоном на чашках Петри с сусловым агаром 7°Б при 27-28°С в течение 36 ч. Затем на газон помещали бумажные кружки с ТС (20-300 мкг) и инкубировали ещё в течение 1 сут. Каротиногенную реакцию отмечали по появлению оранжевой окраски мицелия вокруг кружка.

Влияние ТС на липогенез изучали радиоизотопным методом. Культуру штамма Т (-) выращивали в мучной среде. В начале идиофазы вносили ТС (50 мкг/мл), спустя 2 ч добавляли CH3[14C]OONa (16 КБк/мл) и культивировали ещё 3 ч. После экстракции и разделения липидов методом ТСХ (см. выше) радиоактивность отдельных фракций липидов измеряли на сцинтилляционном счётчике Tri-Carb 2800 TR ("Perkin Elmer", США) и выражали в имп/мин/г СБ.

Опыты проводили в трехкратной повторности, в результатах представлены данные типичного опыта, отражающие общую закономерность. Разброс результатов не превышал 10%.

2. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 2.1. Состав триспороидов и каротиноидов у пар штаммов В. trispora с различной способностью к зиготообразованию

Половое взаимодействие (+) и (-) штаммов дикого типа В. trispora исследовали в парах, образованных (-) штаммами ВКМ F-811, 921, 987, 826 и (+) штаммами ВКМ F-666, 701, 812, 902, 904, 989, 1201. Особый интерес представляло сравнительное изучение полового взаимодействия в паре штаммов-суперпродуцентов ß-каротина, Т (+) и Т (-), из коллекции ИНМИ РАН, которую нельзя рассматривать наравне с парами штаммов дикого типа, так как штамм Т (-) является мутантным.

Исследование различных комбинаций (+) и (-) штаммов В. trispora показало, что все штаммы дикого типа были способны образовывать зигоспоры, но не со всеми половыми партнёрами (табл. 1). То же было характерно и для штамма Т (+). Напротив, мутантный штамм Т (-) существенно отличался от всех (-) штаммов дикого типа неспособностью образовывать зигоспоры ни с одним из партнёров. В парах Т (-) с 701 (+) и Т (-) с Т (+) было отмечено образование единичных незрелых зигоспор, не имеющих утолщенной оболочки и центральной липидной вакуоли.

Таблица 1. Зиготообразование у различных пар штаммов В. trispora.

Ширина полосы зиготообразования, мм

Штаммы 811 (-) 921 (-) 826 (-) 987 (-) Т(-)

1201 (+) 3 1 4 -

666 (+) ед 4 1 2 -

904 (+) 2 4 2 6 -

812 (+) 3 3 - 7 -

989 (+) 5 8 2 7 -

701 (+) 6 3 ед 6 ед

902 (+) 2 2 ед 7 -

Т(+) 1 4 - 7 ед

Обозначения: „ед" - единичные незрелые зигоспоры; „-" - отсутствие зигоспор.

6

Таким образом, исследованные пары различались, во-первых, по способности к зиготообразованию и, во-вторых, по интенсивности зиготообразования. В связи с этим, представляло интерес проверить, существует ли зависимость активности каротиногенеза от способности пар к зиготообразованию и от его интенсивности.

Для этого были отобраны два штамма, 1201 (+) и Т (+), и на их основе были составлены пары со всеми (-) штаммами, образующие и не образующие зигоспор. Полученные данные позволили построить следующие ряды по каротиногенной активности для пар штаммов дикого типа (табл. 2).

Для пар с 1201 (+*): 921 (-) > 826 (-) > 987 (-) (зиготообразующие) > 811 (-) (не образует зигоспор).

Для пар с Т (+): 921 (-) >987 (-) = 811 (-) (зиготообразующие) >826 (-) (не образует зигоспор).

Таблица 2. Каротиногенез в совместной культуре гетероталличных штаммов В. рога, различающихся по способности к зиготообразованию.

Пары штаммов Ширина полосы зиготообразования, мм Р-каротин, % от СБ

Т (+) х 987 (-) 7 0,15

Т (+) х 921 (-) 4 0,25

Т(+) х 826 (-) 0,07

Т (+) х 811 (-) 1 0,16

Т(+) х Т (-) — 1,28

1201 (+)х 987 (-) 4 0,21

1201 (+) х 921 (-) 3 0,73

1201 (+) х 826 (-) 1 0,47

1201 (+) х 811 (-) - 0,02

1201 (+) х Г С-) - 0,84

Обозначения: "-" - отсутствие зигоспор.

Таким образом, для штаммов дикого типа показано, что зиготообразующие пары накапливали больше Р-каротина, чем зиготонеобразующие. Однако, между интенсивностью зиготообразования и синтезом Р-каротина прямой корреляции обнаружено не было. В отличие от пар штаммов дикого типа, пары с мутантным штаммом Т (-), не образующие зигоспор, проявляли наибольшую каротиногенную активность.

У пар штаммов, контрастных по способности к зиготообразованию и синтезу Р-каротина, был изучен состав ТС. Установлено, что независимо от способности к зиготообразованию все исследованные пары образовывали ТС близкого качественного состава (табл. 3). При этом зиготообразующие пары накапливали в 3-10

раз больше ТСК, чем зиготонеобразующие. В отличие от пар штаммов дикого типа, зиготонеобразующие пары с мутантным штаммом Т (-) накапливали сравнимое с зиготообразующими парами количество ТСК.

Таблица 3. Состав основных триспороидов в парах гетероталличных штаммов В. ¡Ньрога, различающихся по способности к зиготообразованию.

Пары штаммов Триспороиды

%отХ Т., г/л

ТНиТЛ ^290 ТСК-А ТСК-В ТСК-С £ ТСК

Т(+)хТ(-) 31.7 — 1.7 17.8 32.0 51.5 2.26

Т (+) х 826 (-) 39.5 — 3.4 - 18.0 21.5 0.71

Т(+)х 921 (-) 36.8 — 3.8 8.8 31.8 44.4 2.28

1201 (+) х т (-) 26.6 18.5 - 7.7 26.2 33.9 0.61

1201 (+) х 811 (-) — 43.3 - 3.3 23.3 26.7 0.08

1201 (+) х 921 (-) 35.7 - - 10.2 15.8 26.0 0.92

По результатам спектрофотометрического анализа, в качестве основных ТС были обнаружены ТСК А, В и С и их нейтральные предшественники, ТН и ТЛ. Для подтверждения идентификации был использован метод определения биологической активности ТС, основанный на индукции образования зигофоров у (+) и (-) тест-штаммов М. тисес1о под действием ТС. Для исследования использовали ТС, выделенные из совместных культур пар штаммов Т (+) и 921 (-), 1201 (+) и Т (-), а также производственной пары Т (+) и Т (-). Показано, что индивидуальные ТС проявляли разную активность по отношению к (+) и (-) тестовым штаммам М. тисе<1о'. ТН, ТЛ и Х29о вызывали образование зигофоров только у (+) штамма, тогда как ТСК А, В, С и м-ТСК - у обоих штаммов (табл. 4). Общей закономерностью, согласующейся с литературными данными [БсЫтек е1. а!., 2003], была значительно более сильная реакция на присутствие ТС у (-) штамма М. тисес1о. Напротив, (+) штамм, во-первых, реагировал на более высокие концентрации ТС и, во-вторых, образовывал меньше зигофоров, чем (-) штамм. Среди ТС наибольшую активность по отношению к (-) штамму М. тисейо проявляли ТСК и м-ТСК, а среди ТСК наиболее выраженным действием обладала ТСК-В. Для (+) штамма М тисес1о такой закономерности отмечено не было. Неидентифицированное соединение с максимумом поглощения при 260 нм проявляло слабую биологическую активность по отношению к обоим тестовым штаммам.

Установлено, что пара штаммов Т (+) и Т (-) образует большое количество ТС и в том числе наибольшее количество ТСК. В связи с неспособностью этой пары к зиготообразованию, возникает вопрос, являются ли синтезируемые ею ТС

8

биологически активными. Проведённое исследование показало, что ТС пары штаммов Т (+) и Т (-) по биологической активности принципиально не отличаются от ТС пары штаммов дикого типа, Т (+) и 921 (-).

Таблица 4. Биологическая активность триспороидов, выделенных из совместных культур различных пар штаммов В. 1трога.

Биологическая активность триспороидов

ТС, фракция (-) штамм М. тисес1о (+) штамм М. тисеёо

ТС, мкг Количество зигофоров ТС, мкг Количество зигофоров

ТН и ТЛ, НФ * 130-260 - 20-150 240 ++ +-н-

Х26о, КФ * 50 ++ 50-80 100-200 + -н-

м-ТСК, НФ * 80 ++++ 80-160 ++

ТСК-А, КФ * 20 ++ 20 +

50 +++ 40-80 ++

ТСК-В, КФ * 30 50 ++++ ++++ 30-50 60-100 ++ +++

ТСК-С, КФ * 20-60 +++ 25-120 150 ++ +++

Х290, НФ ** 15-150 - 90-180 +

Обозначения: количество зигофоров «+» — менее 10; «++» — 10-50; «+++» - 50-100; «1111» -более 100; «-» — не обнаружено.

* - ТС, выделенные из совместной культуры штаммов Т (+) и 921 (-);

** - ТС, выделенные из совместной культуры штаммов 1201 (+) и Т (-).

Количественный анализ состава ТС показал высокое относительное содержание нейтральных предшественников ТСК, ТН и ТЛ (около 1/3 от суммы ТС), которое не зависело от способности пар к зиготообразованию (табл. 1) и синтезу каротиноидов (табл. 2). Напротив, состав ТСК у исследованных пар различался. Общей закономерностью было значительное снижение содержания ТСК-В в парах, не образующих зигоспоры и накапливающих мало каротиноидов. Однако в культурах пар с мутантным штаммом Т (-), не образующих зигоспор, уровень ТСК-В был наибольшим.

Таким образом, изучение взаимосвязи каротиногенеза, зиготообразования и

синтеза триспороидов у пар штаммов дикого типа В. зрога показало, что пары

штаммов, способные к зиготообразованию, синтезировали больше каротиноидов и

ТС, чем пары, неспособные к зиготообразованию. Однако между интенсивностью

зиготообразования и уровнем каротиногенеза прямой корреляции не обнаружено.

Отмечено, что не образующая зигоспор пара штаммов Т (+) и Т (-), в которой штамм

9

Т (-) является мутантным, накапливала большое количество как каротиноидов, так и ТС.

2.2. Состав триспороидов в условиях стимуляции каротиногенеза у В. trispora

Хотя ТСК являются основными стимуляторами каротиногенеза, оптимальные условия (соотношение штаммов в инокуляте) для биосинтеза ТСК и каротиноидов не совпадают. Чтобы разобраться в причине этого, мы изучили интенсивность каротиногенеза и состав ТС при разных соотношениях (+) и (-) штаммов в инокуляте -1:7, 1:1 и 7:1. Показано, что при изменении соотношения штаммов изменяется как уровень каротиноидов, так и количество и состав ТС (табл. 5).

Таблица 5. Влияние соотношения штаммов в инокуляте на состав основных триспороидов совместной культуры Т (+) х Т (-) В. Iтрога.

ß- Триспороиды

(+):(-) % от £ Е,

каротин, % СБ ТН и ТЛ Х290 м-ТСК ТСК-А ТСК-В ТСК-С X ТСК г/л

7:1 0.073 13.3 - 1.3 13.6 10.6 29.8 54.0 1.92

1:1 0.135 31.1 13.0 3.4 5.6 9.1 31.5 46.2 3.28

1:7 0.244 25.3 16.2 5.6 - 3.2 26.0 29.2 2.08

Время культивирования — 4 сут.

Если максимальный уровень каротиногенеза наблюдался при соотношении (+) и (-) штаммов 1:7, то наибольшее количество ТС образовывалось при соотношении 1:1. В варианте 1:1 доля суммарной фракции ТЫ и ТЛ составляла 31.1%, а доля ТСК -46.2%, при этом преобладающей являлась ТСК-С (29.8%). В условиях преобладания (+) или (-) штамма в инокуляте общее количество ТС снижалось в 1.5 раза и менялся их качественный состав. При доминировании (-) штамма образовывалось в 1.5 раза меньше ТСК, что обусловлено отсутствием ТСК-А и резким падением содержания ТСК-В (в 3 раза). При этом уровень ТН и ТЛ снижался незначительно. Преобладание (+) штамма, напротив, сопровождалось уменьшением доли ТН и ТЛ (в 2.4 раза) и небольшим увеличением доли ТСК в результате роста относительного содержания ТСК-А (в 2.4 раза).

Изучение динамики образования ТС при оптимальном для их синтеза соотношении штаммов 1:1 выявило максимальное накопление ТС на 4 сут, причём в динамике роста увеличение их количества происходило скачкообразно (табл. 6): в 4-суточной культуре содержание ТС было в 5 раз больше, чем в 3-суточной, тогда как

ю

между 2- и 3-суточными культурами разница в содержании ТС была двукратной. Суммарная доля ТН и ТЛ в динамике развития культуры менялась слабо, а доля ТСК на 3 сут возрастала в 1.5 раза, в основном, из-за увеличения относительного содержания ТСК-С.

Таблица 6. Динамика образования основных триспороидов в совместной культуре Т (+) * Т (-) В. 1г1$рога при равном соотношении штаммов в инокуляте.

Время культивирования, сут Триспороиды г/л

% от 2

ТН и ТЛ ТСК-А ТСК-В ТСК-С £ ТСК

2 31.0 Следы 20.0 13.0 33.0 0.37

3 37.9 2.2 24.6 22.3 49.1 0.75

4 25.7 3.8 18.4 27.1 49.3 3.61

В биотехнологиях получения каротиноидов на основе В. Мврога используют различные стимуляторы: (3-ионон - для получения р-каротина [№пс1 е1.а1., 1969]; ингибитор ликопинциклазы, МАП — для получения ликопина [Феофилова и др., 1995]. Схема действия стимуляторов и ТСК на синтез каротиноидов представлена на рис. 1.

мевалонаткнназа

hmgR

iTCK

5-фосфомевалонат

оета-ионон

*

дпмешлаллшшнрофосфат

фитоинсинтаза j carRA

фитоин

фитоиндегидрогеназа j carB

тек

¡TCK ТСК

лшеопин

МАП ' дшеотшщшвза I carRA ТСК

1 бета-каропш

оксигеназа tsp3

4-дипщротрнспорин-дегидрогеназа tsp2 <C=iTCK

4-дигидрометшприспорат- tspl

депщрогеназа

ТСК

Рисунок 1. Обобщённая схема действия триспоровых кислот и стимуляторов каротиногенеза на синтез каротиноидов [Reyes et. al., 1964; Rao, Modi, 1977; Феофилова и др., 1995; Schmidt et. al.,

2005; Burmester et. al., 2007].

Хотя внесение МАП приводит к увеличению доли ликопина в составе каротиноидов (до 95% от их суммы), общее количество каротиноидов при этом значительно меньше, чем при получении Р-каротина с использованием р-ионона (рис. 1). Исходя из этого, возникло предположение, что р-ионон в комбинации с МАП может повысить уровень ликопина.

В результате исследования была разработана схема совместного введения стимуляторов, позволяющая при высокой степени ингибирования синтеза Р-каротина повысить выход ликопина в 1.5-2 раза по сравнению с вариантом использования одного МАП (рис. 2).

и

3

I а5

Н

о

¡2 О

Рисунок 2. Влияние Р-ионона и МАП на каротиногенез совместной культуры штаммов

Т (+) х Т (-) В. ¡трога.

1 - контроль; 2 - Р-ионон (48 ч); 3 - МАП (0 ч); 4 - МАП (0 ч; 48 ч), р-ионон (48 ч).

Так как стимуляторы вносят в совместную культуру (+) и (-) штаммов на фоне их полового взаимодействия, можно предположить, что их стимулирующее действие связано с усилением синтеза половых гормонов гриба, ТСК, которые действуют на все стадии каротиногенеза (рис. 1).

Изучение состава ТС в условиях стимуляции каротиногенеза показало, что при введении МАП происходит небольшое снижение количества ТС, тогда как под действием р-ионона, напротив, уровень ТС увеличивается в 4 раза по сравнению с контролем (табл. 7).

Общей закономерностью во всех вариантах стимуляции было резкое снижение синтеза ТСК и появление нового вещества с максимумом поглощения в области 250 нм (Х25о) в количестве до 45% от суммы ТС. Метаболит Х25о не проявлял ни биологической, ни каротиногенной активности. ТСК (в форме ТСК-С) накапливались только при использования Р-ионона в относительном количестве 10.3%, что в 2 раза

ниже, чем в контроле. В обоих вариантах с МАП ТСК обнаружены не были. Кроме того, относительное . содержание ТН и ТЛ в присутствии МАП также немного снижалось (с 24.2 до 19.9%), а под действием Р-ионона падало в 2 раза.

Таблица 7. Состав основных триспороидов совместной культуры Т (+) * Т (-) В. Ьг'прога в условиях стимуляции каротиногенеза МАП и Р-иононом._

Вариант Триспороиды

• . %от£ Е,г/л

ТНиТЛ ТСК-В тск-с S ТСК Х^бо X2J0

Контроль 24.2 10.3 19.5 29.8 10.2 - 1.28

Р-ионон 9.7 - 10.3 10.3 11.4 33.4 5.39

МАП 19.9 — - — 8.5 44.5 0.97

МАП + Р-ИОНОН 7.8 - - - 3.3 41.2 1.92

Время культивирования - 4 сут.

Отметим, что при соотношении (+) и (-) штаммов в инокуляте 1:7 образовывалось наибольшее количество каротиноидов, преимущественно p-каротина, а при соотношении штаммов 1:1 — вдвое меньше каротиноидов, но в 2.5 раза больше ТСК. Следовательно, для стимуляции каротиногенеза более важным является преобладание в совместной культуре каротиногенного (-) штамма, а не высокий уровень ТСК. Комбинированное использование р-ионона и МАП приводит к дополнительной стимуляции ликопиногенеза на фоне ингибирования синтеза ТСК.

2.3. Влияние триспороидов на липогенез Т (-) штамма В. trispora

Каротиноиды, будучи липофильными соединениями, в клетках грибов локализованы в липидных глобулах, основными компонентами которых являются ТАГ [Murphy, Vance, 1999]. Ранее было установлено, что ТСК стимулируют каротиногенез и синтез стеринов, действуя на ранних стадиях синтеза изопреноидов [Bu'lock, Osagie, 1973]. При стимуляции каротиногенеза потребность клетки в липидах для депонирования каротиноидов, по-видимому, возрастает. В связи с этим можно предположить, что половые гормоны, ТСК, могут влиять не только на каротиногенез, но и на синтез ацилглицеринов. В опыте использовали культуру каротиногенного Т (-) штамма В. trispora, в которую не добавляли масел, так как известно их ингибирующее действие на синтез липидов de novo [Bossie, Martin, 1989; Mantzouridou, Tsimidou, 2007].

Исследование показало, что ТСК обладали выраженным действием на синтез НЛ, стимулируя образование ДАГ, ТАГ и Ст в 1.5-2 раза, что сопровождалось усилением синтеза каротиноидов в 13 раз (табл. 8). В противовес действию на синтез НЛ, ТСК практически не влияли на синтез мембранных липидов. Нейтральные предшественники ТСК, ТН и ТЛ, влияния на биосинтез НЛ не оказывали.

Таблица 8. Включение [14С]-ацетата в нейтральные липиды в присутствии триспороидов (имп/мин/г

СБхЮ3)

Липиды Контроль ТН и ТЛ ТСК

ДАГ 63.9 61.1 129.3

Ст 348.5 371.5 507.8

СЖК 62.5 53.9 79.7

ТАГ 706.6 733.5 1277.7

Каротиноиды 60.7 50.0 791.1

2.4. Влияние экзогенных масел на рост, накопление липидов и ликопиногенез

В. /трога

Поскольку при выращивании В. &1$рога на глюкозной среде основными ЖК общих липидов гриба являются С^г, С^! и С16 0, а минорными - С]2:о, С14 0, С^ь С16 2, С18:о, и С|8з [Дедюхина, 1969], при подборе масел мы исходили из их жирнокислотного состава и использовали масла, имеющие как сходный с грибными липидами состав ЖК (подсолнечное, льняное, хлопковое и оливковое масла), так и отличный от такового (горчичное и касторовое масла) [Беззубов, 1956]. Анализ состава ЖК использованных масел показал, что основными ЖК подсолнечного и хлопкового масел являются Сц:2, оливкового — С^ь льняного - С183, горчичного — С18:1 ИС18;2, КЭСТОрОВОГО - С22:1"ОН.

Экзогенные масла служат для гриба источником углерода и стимулируют его рост. В наших экспериментах самый большой выход биомассы наблюдался при использовании горчичного и оливкового масел, а наименьший — в варианте с касторовым маслом. При этом все экзогенные масла способствовали накоплению липидов в мицелии гриба. Наибольший эффект оказывало хлопковое масло, наименьший — оливковое.

В отличие от действия на рост и накопление липидов, действие масел на синтез ликопина более специфично. Установлено, что в присутствии оливкового, касторового и горчичного масел выход ликопина (г/л среды) увеличивался в 3-5 раз,

при добавлении подсолнечного - в 14 раз и в вариантах с хлопковым и льняным маслами - в 30-38 раз. Таким образом, наибольшим стимулирующим действием на ликопиногенез гриба обладали масла с высоким содержанием С^г и С18:3 — подсолнечное, хлопковое и особенно льняное.

Изучение состава фракций НЛ гриба в присутствии экзогенных масел показало, что наибольшая стимуляция ликопиногенеза сопровождается наиболее сильным повышением в составе НЛ доли ТАГ (до 70-73%) (табл. 9).

Таблица 9. Влияние экзогенных масел на рост биомассы, накопление липидов и ликопина и фракционный состав нейтральных липидов.

Экзогенные масла СБ, г/л Липиды, % от СБ Ликопин, г/л Фракции НЛ, % от Е

ТАГ СЖК ДАГ

Контроль 9.6 9.0 0.03 57.0 12.0 31.0

Оливковое 49.5 15.8 0.09 65.7 31.4 2.9

Льняное 35.9 18.8 1.15 70.1 14.5 15.4

Подсолнечное 44.8 18.5 0.41 72.7 14.9 12.4

Хлопковое 35.2 34.0 0.91 73.2 9.7 17.1

Горчичное 55.6 31.5 0.15 47.5 38.3 14.2

Касторовое 20.3 19.8 0.16 53.9 20.1 26.0

В составе мембранных липидов в контрольных культурах В. Мзрога основными компонентами были Ст (35-58%) и фосфолипиды. Под действием экзогенных масел количество мембранных липидов возрастало (в 2-8 раз), причём наиболее сильным действием обладали стимулирующие ликопиногенез льняное, хлопковое и подсолнечное масла. При этом доля СфЛ резко снижалась, а в составе фосфолипидов увеличивалось относительное содержание ФЭ (табл. 10).

Таблица 10. Влияние экзогенных масел на состав мембранных липидов В. Iшрога.

Вариант опыта Мембранные липиды, % от суммы ЕМЛ, мг/ г СБ

ФЭ ФХ КЛ ФК СфЛ Ст

Контроль 1.79 16.88 5.82 8.34 23.27 43.91 11.82

Экзогенные масла Оливковое 13.58 18.49 2.06 1.37 6.49 58.01 22.24

Льняное 17.06 22.71 2.50 5.67 5.71 46.36 63.57

Подсолнечное 17.65 28.09 Следы Следы 4.92 49.34 65.70

Хлопковое 22.66 24.97 4.70 8.13 4.65 34.90 83.26

Горчичное 18.73 28.40 2.64 3.36 7.68 39.19 96.17

Касторовое 16.55 29.25 4.09 2.81 3.08 44.22 38.15

Для того чтобы выяснить, существует ли зависимость между составом экзогенных масел и составом нейтральных и мембранных липидов мицелия гриба, был изучен состав ЖК индивидуальных фракций нейтральных липидов - СЖК, ДАГ, ТАГ, и основных мембранных липидов - ФХ и ФЭ.

Сравнение состава ЖК отдельных фракций НЛ гриба с ЖК триацилглицеринов экзогенных масел показало, что наибольшее влияние экзогенные масла оказывают на состав жирных кислот ДАГ и ТАГ, который становится близким к составу ЖК экзогенных масел, что приводит и к сходству их СН (табл. 11). Так, в НЛ контрольного варианта основными жирными кислотами были С^г (28-30% от X), С181 (20-22%), С160 (20-22%) и С180 (8-10%). Внесение в среду оливкового масла приводило к накоплению во фракциях ТАГ, ДАГ и СЖК мицелия гриба 52-70% С^, которая является основной жирной кислотой масла. При использовании подсолнечного масла во фракциях ДАГ и ТАГ мицелия гриба наблюдалось накопление доминирующей в масле (53-60%), В варианте с льняным маслом, богатым С18з- наблюдалось накопление 43-48% этой кислоты во фракции ТАГ гриба. Использование хлопкового масла приводило к повышению содержания доминирующей в нём С18:2 во фракциях ТАГ и ДАГ мицелия гриба (48-50%). Напротив, изучение ЖК состава основных фосфолипидов гриба - ФЭ и ФХ, показало, что их жирнокислотный состав более консервативен и слабо зависит от состава ЖК экзогенных масел. Однако при использовании масел, стимулирующих ликопиногенез. в основных фосфолипидах также отмечалось небольшое увеличение степени ненасыщенности ЖК.

Показано, что все исследованные масла стимулировали рост и накопление липидов у В. Мзрога, тогда как действие масел на ликопиногенез было более специфичным: наибольшим эффектом в стимуляции синтеза ликопина обладали масла, содержащие С^г и С^з в своём составе.

Таблица 11. Влияние экзогенных липидов на состав основных жирных кислот нейтральных липидов гриба, % от суммы.

жк Контроль Экзогенные масла

Оливковое Льняное Подсолнечное Хлопковое

ДАГ СЖК ТАГ ДАГ СЖК ТАГ ДАГ СЖК ТАГ ДАГ СЖК ТАГ ДАГ СЖК ТАГ

с 16:0 18.4 18.4 22.8 16.9 7.6 11.1 11.8 13.4 7.7 9.2 12.6 7.7 16.3 19.9 18.6

С 18:0 4.6 16.9 9.4 12.7 12.2 1.6 7.7 19.8 1.3 4.7 21.6 1.4 5.1 20.3 1.8

С 18:1 25.2 26.6 24.3 52.4 69.2 65.5 35.4 48.6 22.1 25.1 34.5 27.2 28.7 20.5 25.3

С 18:2 44.9 16.0 32.3 12.1 4.7 16.8 22.1 8.4 23.2 53.2 16.5 59.7 47.6 15.2 50.2

С 18:3 3.3 - 2.6 0.5 0.6 0.8 22.1 5.7 43.9 1.5 0.6 1.9 1.5 2.4 1.7

С 20:0 0.4 4.4 0.5 - 1.1 - - 1.0 - 1.1 1.9 - - 2.7 -

С 22:1 - 2.8 - - 0.3 0.4 - - - - 3.1 - - 5.6 0.3

сн 1.29 0.76 0.98 0.79 0.82 1.06 1.46 0.85 2.01 1.42 0.92 1.55 1.28 0.67 1.32

3. ОБСУЖДЕНИЕ

Вопрос о взаимосвязи каротиногенеза с зиготообразованием и синтезом ТСК давно привлекает внимание исследователей. В результате полового взаимодействии (+) и (-) штаммов В. trispora происходит индукция синтеза половых гормонов, ТСК, стимуляция синтеза каротиноидов и образование покоящихся половых клеток, зигоспор. Очевидная взаимосвязь этих процессов позволяет предположить, что способность к зиготообразованию и синтезу ТСК могут быть критериями каротиногенной активности гриба, имеющей большое практическое значение. Однако литературные данные противоречивы. Так в работе [Бобнева, 1974] использовались моноспоровые варианты промышленной пары штаммов В. trispora, (+) 5 и (—) 4, представляющие собой спонтанные мутанты с различной интенсивностью зиготообразования. И хотя автором была установлена «корреляционная зависимость»между интенсивностью зиготообразования и каротиногенезом, взаимосвязь с синтезом ТСК обнаружить не удалось. В другом исследовании, проведённом на маленькой выборке из двух пар штаммов, показано, что зиготообразующая пара 812 (+) х 921 (-) в глубинной культуре синтезировала больше ТСК, но меньше каротиноидов, чем пара 812 (+) х 826 (-), не способная к зиготообразованию [Калинина и др., 2007]. Существующие противоречия не удается объяснить с позиций современных представлений о роли ТСК в каротиногенезе. В связи с этим задача установления взаимосвязи между зиготообразованием, каротиногенезом и синтезом ТСК была вновь поставлена в настоящей работе.

Данное исследование, проведённое на базе пар (+) и (-) штаммов дикого типа из коллекции ВКМ и на паре промышленных Т (+) и Т (-) штаммов В. trispora, не подтвердило выявленной ранее прямой корреляции между интенсивностью зиготообразования и уровнем каротиногенеза, но показало, что для активного каротиногенеза пар (+) и (-) штаммов дикого типа необходима их способность к зиготообразованию.

Все исследованные пары с активным каротинообразованием накапливали большое количество триспороидов, в том числе ТСК. Пара штаммов-суперпродуцентов (3-каротина, Т (+) и Т (-), в которой штамм Т (-) является мутантным, накапливала большое количество ТС, но не образовывала зрелых зигоспор. В поверхностной культуре этой пары штаммов были обнаружены единичные незрелые зигоспоры. Полученные данные указывают на то, что зиготообразование в культуре штаммов Т (+) и Т (-) блокируется на более позднем этапе, чем синтез ТСК, а именно на стадии формирования молодой зигоспоры.

18

Таким образом, полученные данные позволяют считать, что способность к зиготообразованию у пар штаммов дикого типа и уровень ТСК у всех пар штаммов могут быть критериями каротиногенной активности грибов и использоваться для селекции перспективных штаммов.

Ранее было установлено, что оптимальные условия для интенсивного каротиногенеза и образования ТСК различаются [Феофилова, 1974]. Так, равное соотношение (+) и (-) штаммов в инокуляте благоприятно для синтеза ТСК, тогда как для интенсивного каротиногенеза требуется преобладание (-) штамма (7:1). Проведённое исследование состава ТС, синтезируемых культурами с различными соотношениями (+) и (-) штаммов, показало, что при соотношении 1:7, оптимальном для каротиногенеза, образуется в 2.5 раза меньше ТСК, чем при равном соотношении штаммов. Таким образом, уровень ТСК, который достигается при соотношении штаммов (+) и (-) штаммов 1:7, хотя и не максимален, но достаточен для индукции каротиногенеза. Исходя из полученных данных и показанных ранее существенных различий (+) и (-) штаммов по активности каротиногенеза ((-) штамм образует в 12-15 раз больше каротиноидов, чем (+) штамм [Феофилова, 2006]), можно сделать вывод о том, что после индукции каротиногенеза ТСК его эффективность обусловливается не количеством ТСК, а преобладанием в культуре каротиногенного (-) штамма.

Другой способ интенсификации каротиногенеза основан на использовании регуляторов этого процесса. Внесение в культуру ингибитора ликопинциклазы, МАП, позволяет получить ликопин в качестве основного каротиноида (рис. 1) [Феофилова и др., 1998; 2001], но не обеспечивает такого высокого выхода продукта, который достигается в биотехнологии получения p-каротина при использовании р-ионона, действующего на ранних стадиях и стимулирующего общий биосинтез изопреноидов [Reyes et. al., 1964; Феофилова, Арбузов, 1975; Rao, Modi, 1977]. Совместное использование р-ионона и МАП позволило интенсифицировать биосинтез каротиноидов и повысить выход ликопина в 1.5-2 раза по сравнению с использованием одного МАП.

В условиях стимуляции синтеза каротиноидов был изучен состав ТС. Известно, что стимуляторы каротиногенеза действуют только на совместную культуру штаммов [Колот и др., 1971]. Поэтому можно было ожидать, что их совместное действие может быть опосредовано интенсификацией синтеза ТСК. Однако оказалось, что стимуляция синтеза каротиноидов, напротив, сопровождалась ингибированием синтеза ТСК (табл. 7). Для объяснения наблюдаемых эффектов следует обратиться, к механизмам действия стимуляторов. МАП ингибирует ликопинциклазу, что приводит к резкому снижению уровня p-каротина [Феофилова и др., 1995]. Поскольку p-каротин является

19

предшественником ТС, уменьшение его количества приводит к падению уровня ТСК. При этом небольшое количество p-каротина всё же образуется, тогда как ТСК не обнаруживаются вовсе. Это означает, что МАП ингибирует, помимо синтеза Р-каро-тина, также и синтез ТСК. В отношении р-ионона также отмечено, что он ингибирует синтез ТСК. Однако так как р-ионон вносят в совместную культуру в стационарной фазе, ТСК образуются, хотя и в меньшем количестве, чем в контроле. При комбинированном действии МАП и р-ионона наблюдается такое же подавление синтеза ТСК как и в варианте с одним МАП. На ингибирование синтеза ТСК в присутствии стимуляторов указывает также накопление в составе триспороидов большого количества неидентифицированного вещества, Х250. Этот метаболит не вызывает образования зигофоров у тест-штаммов М mucedo и не стимулирует каротиногенез у Т (-) штамма В. trispora.

Таким образом, ТСК необходимы для интенсификации каротиногенеза на стадии индукции экспрессии генов каротиногенных ферментов [Gooday, 1978; Shmidt et. al., 2005]. Использование регуляторов, действующих на уже сформированные ферменты каротиногенеза, позволяет добиться дополнительной стимуляции синтеза каротиноидов.

Ещё один эффект ТСК связан со стимуляцией синтеза ТАГ у каротиногенного Т (-) штамма В. trispora, что свидетельствует о тесной взаимосвязи липо- и каротиногенеза и указывает на новую функцию ТСК. Действие ТСК полностью снимается при внесении экзогенных масел в среду выращивания. Это закономерно, так как синтез жирных кислот de novo ингибируется при наличии их альтернативного источника - экзогенных липидов [Bjork et. al., 1970; Mantzouridou, Tsimidou. 2007]. Возникает вопрос - как введение масел влияет на липидный состав клеток грибов и ликопиногенез.

Оказалось, что наибольшее влияние экзогенные растительные масла оказывают на состав ЖК три- и диацилглицеринов, в то время как состав ЖК основных фосфолипидов меняется слабо. Обнаружено, что льняное, хлопковое и подсолнечное масла с высоким содержанием ненасыщенных С182 и особенно С^з жирных кислот существенно стимулируют ликопиногенез. Так, в присутствии льняного масла в ТАГ гриба накапливается 40-45% С18:3, а в присутствии хлопкового и подсолнечного масел - до 50-60% Ci8;2. Напротив, накопление в ТАГ гриба 50% Ci8 i (при введении оливкового масла) подобного влияния на ликопиногенез не оказывает.

Особый интерес вызывает действие льняного масла с доминирующей С^з, так как эта кислота в небольшом количестве обнаружена только у (+) штамма В. trispora, а у (-) штамма полностью отсутствует не только в мицелии, но и в спорах и даже в

20

ловиях холодового шока, который, как правило, сопровождается повышением степени ненасыщенности ЖК [Геннис. 1997].

На основании полученных данных можно предположить, что стимулирующее тикопиногенез действие масел связано с наличием в их составе полиненасыщенных >КК. Увеличение доли этих кислот в ацилглицеринах гриба повышает СН их жирных шслот, что является определяющим фактором снижения вязкости липидов глобул Los, Murata, 2004]. В результате растворимость ликопина в липидах глобулах товышается, что подтверждается прямыми опытами по определению растворимости кристаллического ликопина в маслах, показавшими его наибольшую растворимость в тьняном масле. Таким образом, ёмкость липидов глобул увеличивается, что позволяет грибу накапливать в них большие количества ликопина, снижая концентрацию конечного продукта, что и обусловливает стимуляцию ликопиногенеза.

4. ВЫВОДЫ

1) Зиготообразующие пары штаммов дикого типа Blakeslea trispora синтезируют значительно больше триспороидов и каротиноидов, чем пары, неспособные к зиготообразованию. Между интенсивностью зиготообразования и активностью каротиногенеза прямой корреляции не обнаружено.

2) В глубинной культуре (+) и (-) штаммов В. trispora, независимо от возраста и соотношения штаммов, основными триспороидами являются триспоровые кислоты В и С, триспорины и триспоролы, а минорными — триспоровая кислота А и метилтриспораты.

3) Пара штаммов-суперпродуцентов каротиноидов, Т (+) и Т (-), образует большое количество триспороидов. Мутантный штамм Т (-) отличается от штаммов дикого типа тем, что не образует зигоспор ни с одним из (+) штаммов, тогда как Т (+) от них не отличается. Зиготообразование у этой пары блокировано на стадии формирования молодой зигоспоры.

4) Впервые показано, что ß-ионон в комбинации с ингибитором ликопинциклазы, 6-метил-2-аминопиридином, значительно стимулирует ликопиногенез на фоне ингибирования синтеза триспоровых кислот.

5) Впервые установлено, что триспоровые кислоты оказывают стимулирующее действие не только на каротиногенез, но и на синтез основных запасных липидов, триацилглицеринов. Этот эффект снимается экзогенными маслами.

6) Выявлено стимулирующее ликопиногенез действие экзогенных масел с высоким содержанием линолевой и особенно линоленовой кислот, которые значительно увеличивают степень ненасыщенности триацилглицеринов липидных глобул гриба, способствуя повышению растворимости в них ликопина и, тем самым, интенсификации его биосинтеза.

СПИСОК РАБОТ

1. Верещагина О. А., Меморская А. С., Терёшина В. М. Значение экзогенных липидов в ликопиногенезе мицелиального гриба Blakeslea trispora // Материалы V Молодежной школы-конференции с международным участием «Актуальные аспекты современной микробиологии». Москва, Россия, 26-27 октября 2009 г. С. 98.

2. Верещагина O.A., Меморская A.C., Терёшина В.М. Роль экзогенных липидов в ликопиногенезе мукорового гриба Blakeslea trispora II Микробиология. 2010. Т. 79. № 5. С. 605-613.

3. Vereshchagina О. A., Memorskaya A.S., Tereshina V.M. The role of exogenous lipids in lycopene production in mycelial fungus Blakeslea trispora // Abstracts of FEBS Workshop on Microbial Lipids from Genomics to Lipidomics. Vienna, Austria, 13-15 May 2010. P. 89.

4. Верещагина O.A., Меморская A.C., Кочкина Г.А., Терёшина В.М. Триспороиды и каротиноиды у штаммов Blakeslea trispora с различной способностью к зиготообразованию // Микробиология. 2012. Т. 81. № 5. С. 561-569.

5. Верещагина O.A.. Меморская A.C., Терёшина В.М. Триспороиды в условиях стимуляции каротиногенеза у Blakeslea trispora II Микробиология. 2012. Т. 81. № 5. С. 570-577.

6. Vereshchagina O.A., Memorskaya A.S., Tereshina V.M. Trisporoids composition in Blakeslea trispora under the lycopenogenesis Stimulation II Abstracts of 20th International Symposium on Plant Lipids. Seville, Spain, 8-13 July 2012. P. 72.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

1,АГ — диацилглицерины

ЕСК - жирные кислоты

[Л - кардиолипины

СФ - кислотная фракция

1ФК - лизофосфатидные кислоты

ЛАГ — моноацилглицерины

ЛАП - 6-метил-2-аминопиридин

ЛЯ — мембранные липиды

1-ТСК - метилтриспораты

Ш - нейтральные липиды

1Ф - нейтральная фракция

1Б - сухая биомасса

ЖК - свободные жирные кислоты

ЗН - степень ненасыщенности

]т - стерины

]фЛ - сфинголипиды

ТАГ - триацилглицерины

ТЛ - триспоролы

ТН - триспорины

ТС - триспороиды

ТСК - триспоровые кислоты

УВ - углеводороды

ФИ - фосфатидилинозиты

ФК - фосфатидные кислоты

ФЛ - фосфолипиды

ФС - фосфатидилсерины

ФХ - фосфатидилхолины

ФЭ - фосфатидилэтаноламины

Х250, Х260, Х28о, Х290 - неидентифици-

рованные вещества с максимумами

поглощения Х=250; 260; 280; 290

Подписано в печать 12.02.2013 г. Формат 60x90/16. Заказ 1639. Тираж 100 экз. Печать офсетная. Бумага для множительных аппаратов. Отпечатано в ООО "ФЭД+", Москва, Ленинский пр. 42, тел. (495)774-26-96