Роль каротиноидов в антиоксидантной защите грибной клетки

Соколов, Александр Вячеславович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Роль каротиноидов в антиоксидантной защите грибной клетки
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Роль каротиноидов в антиоксидантной защите грибной клетки"

На правах рукописи

СОКОЛОВ Александр Вячеславович

РОЛЬ КАРОТИНОИДОВ В АНТИОКСИДАНТНОЙ ЗАЩИТЕ ГРИБНОЙ КЛЕТКИ.

03.00.04-биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 2004

Работа выполнена в отделе Биохимии и биотехнологии низкомолекулярных природных соединений Института биохимии им. А.Н. Баха РАН.

Научный руководитель:

кандидат биологических наук Н.Н. Гесслер

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Е.П. Феофилова кандидат биологических наук А.И. Деев

Ведущая организация:

Институт Биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН

(Пущино).

Защита диссертации состоится «_» июня_2004г. в «_» часов на

заседании диссертационного совета К 002.247.01 по присуждению ученой степени кандидата наук в Институте биохимии им. А.Н. Баха РАН по адресу: 119071, Москва, Ленинский проспект, 33, корп.2.

С диссертацией можно ознакомиться в Библиотеке биологической литературы по адресу: 119071, Москва, Ленинский проспект.ЗЗ, корп.1.

Автореферат разослан «_»_2004г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

А.Ф. Орловский

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. У нефотосинтезирующих организмов каротиноиды выполняют роль фотопротекторов и антиоксидантов. Кроме того, в биологических системах каротиноиды также выступают предшественниками сигнальных молекул, таких как витамин А у животных, абсцизовая кислота у растений и триспоровые кислоты у мукоровых грибов. Широкое применение каротиноидов в медицине и сельском хозяйстве, использование в качестве красителей и стабилизаторов пищевых продуктов и косметических средств делает актуальным исследованием функций этих соединений в живой клетке.

Способность синтезировать каротиноиды обнаружена у многих представителей царства грибов. Показано, что каротиногенез может стимулироваться условиями выращивания или химическими соединениями, повышающими уровень активных форм кислорода (АФК) в клетке, что указывает на важную роль каротиноидов в защите клетки от окислительного стресса и тесную связь их синтеза с процессами дифференцировки. Исследование функций каротиноидов в грибной клетке и их участие в системе антиоксидантной защиты является важным моментом в регуляции жизнедеятельности грибов.

Работа в основном выполнена на культуре гриба Blakeslea tnspora (промышленном продуценте каротина), а также на каротиноидсинтези-рующем грибе Neurospora crassa и модельном объекте - бактерии E.coli со встроенной плазмидой, несущей гены синтеза каротина.

Цели и задачи работы. Настоящая работа направлена на изучение функциональной активности каротиноидов и их роли в системе антиоксидантной защиты (АОЗ) грибной клетки при окислительном стрессе, а также на выявление причины феномена «сверхсинтеза» каротина у B.trispora. В связи с этим в работе были поставлены следующие задачи:

1. Характеристика системы АОЗ у B.trispora - активность антиоксидантных ферментов супероксиддисмутазы (СОД) и каталазы, содержание ß-каротина у разных штаммов.

2. Сравнительный анализ реакции компонентов системы АОЗ на окислительный стресс у представителей разных классов грибов B.trispora и N.crassa.

3. Изучение участия Р-каротина в защите клетки от окислительного стресса на примере E.coli со встроенной плазмидой, несущей гены синтеза каротина.

4. Изучение начальных этапов синтеза триспоровых кислот (ТСК) из ß-каротина у B.trispora. Связь синтеза.__претпественников ТСК с

окислительным стрессом.

РОС, НАЦИОНАЛЬНАЯ БИБЛИОТЕКА

Научная новизна. При сравнении реакции компонентов системы АОЗ на окислительный стресс у представителей разных классов грибов B.trispora и N.crassa впервые было показано отсутствие C^Zn-СОД у B.trispora. У B.trispo-ra каротиноиды выступали в роли основного активируемого компонента системы АОЗ, в отличие от N.crassa, у которой синтез каротиноидов происходил только в ответ на действие света. Впервые показано, что наличие ß-каротина в клетке рекомбинантной бактерии E.coli предупреждало активацию СОД под действием редокс-медиаторов, что подтверждает участие каротиноидов в системе АОЗ in vivo. Впервые обнаружено, что под действием белковых препаратов, выделенных из мицелия гриба B.trispora, происходило окисление ß-каротина по 4 углеродному атому ß-иононового кольца с образованием изокриптоксантина. Выявлено, что образующийся в результате окислительной деградации ß-каротина ß-апо-13-каротинон является более предпочтительным субстратом для гидроксилирования иононового кольца, чем каротин. Полученные данные позволяют предположить наличие двух путей синтеза ТСК в зависимости от стадии развития гриба. Апробация работы. Основные материалы диссертации были представлены на 5-ой Путинской конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2001г.), Международной конференции «Signaling systems of plant cell» (Москва, 2001г.), Международном симпозиуме «Биология клетки в культуре» (Санкт-Петербург, 2001г.), 3-ем съезде фотобиологов России (Воронеж, 2001г.), Международном симпозиуме «Plant under environmental stress» (Москва, 2001г.), 1-ом съезде микологов России (Москва, 2002г.), Международной конференции «Neurospora 2002» (Asilomar, California, USA, 2002г.), 6-ой международной конференции «Биоантиоксидант» (Москва, 2002г.), Международной конференции «Микология и альгология 2004» (Москва, 2004г.), 16-ой зимней молодежной научной школе «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (Москва, 2004г.). Публикации. По материалам диссертации опубликовано 4 печатные работы. Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа изложена на ... страницах, включает в себя 16 рисунков, 8 таблиц и 1 схему. Список цитируемой литературы включает ... наименований.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Объектами исследования были штаммы мукорового гриба B.trispora 1521 (+), 4707 (-), предоставленные Е.С. Морозовой (ГНИЙ генетики и селекции промышленных

микроорганизмов, Москва), и штаммы 811(-) и 666(+) из Всероссийской коллекции микроорганизмов Института биохимии и физиологии микроорганизмов РАН, Москва. В работе использовали штамм аскомицета N.crassa дикого типа (RL3-8A) [FGSC № 2218], любезно предоставленный Fungal Genetics Stock Center (FGSC, University of Kansas, Kansas City, USA). В качестве модельных объектов были использованы штаммы E.coli (ТОР-10) и E.coli (ТОР-10 + рАС-ВЕТА) со встроенной плазмидой, несущей гены синтеза ß-каротина. Данные штаммы были любезно предоставлены Фрэнсисом Каннингамом мл. (Department of Plant Biology, University of Maryland, USA).

Выделение и частичную очистку белков, проявляющих СОД активность, осуществляли после разрушения мицелия замораживанием в жидком азоте с последующей обработкой гомогената ультразвуком (прибор УЗДТ-2Н). Белки, полученные из бесклеточного экстракта высаливанием при 80-ти %

насыщении, последовательно фракционировали на колонках с QAE-сефадексом А-50 и ДЕАЕ-целюлозой.

Активность СОД определяли по ингибированию окисления кверцетина (Костюк с соавт., 1990). Расчет активности проводили графически с применением регрессионного анализа (пробит - анализ) (Eldred et al., 1981).

Определение активности каталазы в экстрактах проводили перманганатным методом (Белозерский, 1951).

Электрофорез СОД в ПААГ проводили на пластинках по методу Дэвиса с модификацией, заключающейся в том, что рибофлавин входил в состав как концентрирующего, так и разделяющего геля. Окрашивание геля после электрофореза проводили в водном растворе тетразолиевого нитросинего (Beauchamp et al., 1971). Белковый препарат из мицелия B.trispora, выращенного на жидкой среде (2,5 сут), получали из бесклеточного экстракта путем осаждения белков сульфатом аммония при 80-ти % насыщении.

Идентификацию апокаротиналей, образующихся из ß-каротина, и определение соотношения их максимумов поглощения проводили после их преобразования в трифторуксусные производные (Dugan R. et. al, 1964).

Окислительную деградацию ß-кяротипа в условиях генерации супероксидиого анион-радикала проводили в присутствии ксантина и ксантиноксидазы. Получение 4-кето-13-апо-!3-клротинона. С-апо-13-каротинон в гексане наносили на колонку с элгоцию проводили серным эфиром. Полученные соединения

очищали на окиси алюминия методом тонкослойной хроматографии (ТСХ) (гептан:ацетон, 1:1), и анализировали спектрофотометрически.

Синтез нзокриптоксантина Изокриптоксантин синтезировали из ß-каротина с эфератом трифторида бора (L. Zeichmeister et al. 1956), с последующей очисткой на окиси алюминия методом ТСХ.

Синтез 4-метокси-Р-каротина Метилирование проводили в смеси хлороформ -метанол с добавлением хлористого водорода в хлороформе, с последующей очисткой продукта методом ТСХ.

Выделение триспоровых кислот проводили по методу Bu'Lock J.D. (1971) путем экстракции из культуральной жидкости хлороформом с последующей очисткой.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Глава 1. СРАВНЕНИЕ РЕАКЦИИ НА ОКИСЛИТЕЛЬНЫЙ СТРЕСС ОТДЕЛЬНЫХ КОМПОНЕНТОВ СИСТЕМЫ АНТИОКСИДАНТНОЙ ЗАЩИТЫ У Б.ТЫЗРСЖЛ и N.СКЛИЗА.

1.1. Характеристика системы антиоксидаитиой защиты у B.trispora. Проведено сравнительное исследование основных компонентов системы АОЗ (СОД, каталазы, уровня каротиноидов и ТСК) в процессе развития В.^рога. Наиболее активное накопление ТСК и р-каротина в мицелии В.^рога были выявлены при переходе (+/-) культуры к стационарной фазе роста к началу 2-х сут (рис.1). Следует отметить, что повышение каталазной и СОД активности на фоне некоторого снижения уровня каротина и увеличения количества ТСК отмечалось на стадии массового образования прогаметангиев в совместном (+/-) мицелии (рис. 1).

Бремя (ч) Вр»мя(ч)

Рис.1. Активность СОД, каталазы, уровень Р-каротина и содержание ТСК в совместной 666/811 (+/-) культуре ВЛтрога при выращивании в жидкой среде на качалке.

Эти же параметры исследовали на стационарной фазе роста у разных штаммов В.^рога при выращивании на жидкой среде как раздельных (+) и (-) культур, а так и в виде совместной (+/-) культуры. На рис. 2 показано, что в

совместно выращиваемой культуре на стационарной фазе роста наблюдалось увеличение уровня р-каротина и ТСК у всех исследованных пар В trispora.

Рис. 2. Сравнение компонентов системы АОЗ на стационарной стадии роста у разных штаммов В trispora, выращенных на жидкой среде.

В табл. 1 приведены данные относительно реакции В.^рога на добавление в колбы с совместно выращиваемым (+/-) мицелием на стационарной фазе роста ингибитора СОД диэтилдитиокарбамата натрия, ингибитора дыхания азида натрия или редокс-медиатора менадиона. Как видно из представленных данных, ингибиторы дыхания и СОД вызывали увеличение уровня Р-каротина при снижении СОД активности, что, по-видимому, связанно с его участием в дезактивации АФК, образующихся в процессе метаболизма.

Таблица 1

Действие ингибиторов дыхания и СОД, а также и редокс-медиатора на культуру В.^рога при культивировании на жидкой среде

Вариант опыта СОД ед./г сырого мицелия Р-Каротнп мкг/г сырого мицелия

Контроль 12,0х103+0,4 136,0+10,3

Азид натрия (2,5мМ) 0,7x10^0,2 178,6+14,7

Циэтнлднтиокарбамат N3 (1тМ) 1,4х103+0,2 266,1+10,5

Менадион (0,1 тМ) 1,1.\103+0,1 85,8+4,2

Менадпок (0,5тМ) Гибель клеток

Известно, что редокс-медиаторы увеличивают образования супероксидных радикалов в клетке и, как следствие, вызывают возрастание активности СОД. Наблюдающееся снижение СОД активности в ответ на введение менадиона у B.trispora свидетельствует, по-видимому, о том, что дисмутазная активность у

гриба Б.^-шрога обусловлена не действием супероксиддисмутаз, а присутствием других антиоксидантов. Следует отметить, что у микроорганизмов, дефицитных по СОД, наблюдается повышенная чувствительность к действию редокс-медиаторов.

Данные, отражающие изменение состояния компонентов АОЗ у В. М8рога (активность СОД, каталазы и уровень Р-каротина) под действием света при выращивании на агаризованной среде, представлены в табл. 2. Результаты табл. 2 указывают на более высокую стабильность ферментов АОЗ у отдельно растущего (+) мицелия БЛтрога по сравнению с совместно выращиваемым мицелием, хотя и в этом случае свет вызывал частичное ингибирование каталазы. Одновременно у (+/-) культуры под действием света уровень каротина увеличивался более чем в 3 раза (табл. 2).

Таблица 2

Влияние света на активности СОД, каталазы и накопление каротина у (+) и

(+/-) культур Б.^рога при выращивании на агаризованной среде*

Вариант опыта активность СОД, ед./мг белка активность каталазы (мкмоль/мг белка) Р-Каротнн мкг/мг белка

Темнота(+/-) 2,4+0,2 110+15 2,9+0,3

Свет (+/-) 1,7+0,3 0 9,7+0,7

Темнота (+) 3,0+0,2 231+17 Следы

Свет (+) 4,0+0,3 128+19 Следы

• Освещение проводилось с помощью люминесцентной лампы (15 вт/м ) в течение 3 часов.

Полученные данные указывают на то, что совместная (+/-) культура БЛп-¡рога в стационарной фазе роста предпочтительно использует Р-каротин как средство защиты от действия света при снижении активности ферментов АОЗ.

На основании полученных данных можно предположить, что у гриба БЛтрога при совместном выращивании (+) и (-) мицелиев на фоне развивающегося окислительного стресса под действием света и ингибиторов СОД каротин функционировал как наиболее активный компонент в системе АОЗ клетки, тогда как активности СОД и каталазы снижались. Повышенная чувствительность БЛтрога к действию менадиона, по-видимому, указывает на низкую активность СОД у этой культуры. Таким образом, из рассматриваемых компонентов АОЗ у БЛтрога, вероятно, преобладает неэнзиматический способ защиты от окислительного стресса.

1.2. Изменение активности СОД, каталазы и уровня каротиноидов у N.cгassa при окислительном стрессе. При изучении реакции компонентов АОЗ на свет, а также соединения, увеличивающие уровень АФК, у

представителя другого класса грибов - К.егааа, было выявлено, что при выращивании на поверхности агаризованной среды в темноте конститутивный уровень каротиноидов у данного гриба очень низкий (табл. 3). При освещении уровень каротиноидов возрастал на два порядка. В ответ на действие света отмечалось увеличение активности СОД более чем в 2 раза, а также каталазы в 1,5 раза. Таким образом, все три исследованных компонента системы АОЗ у N.crassa активировались под действием света.

Таблица 3

Влияние света на активность СОД, каталазы и накопление каротиноидов у N.crassa при выращивании на агаризованной среде*

Вариант сод Катал аза Каротннонды

опыта ед./мг белка мкмоль/мг белка мкг/мг белка

Темнота 520+31 54,9+5,2 0,005+0,0001

Свет 1160+48 84,3+7,8 0,79+0,006

* Освещение проводилось с помощью люминесцентной лампы (15 вт/м ) в течении 3 часов.

При действии на культуру N.crassa, выращенную на агаризованной среде в темноте, редокс-медиатора менадиона в концентрации 1мМ наблюдалось увеличение активности СОД в мицелии в 1,5 раза. В то же время количество каротиноидов оставалось без изменения. По-видимому, культура способна справляться с вызываемым окислительным стрессом путём активации СОД.

Таким образом, различия в изменении активности ферментов АОЗ у (+/-) B.trispora и N.crassa в ответ на действие света или других факторов, увеличивающих уровень АФК, свидетельствуют о неспособности В.^рот справляться с окислительным стрессом повышением СОД активности, и основным антиоксидантом у этой культуры выступает р-каротин.

Глава 2. УЧАСТИЕ Р-КАРОТИНА В АОЗ КЛЕТКИ ПРИ ОКИСЛИТЕЛЬНОМ СТРЕССЕ.

В данном разделе нами проводилось исследование влияния окислительного стресса на активность СОД при наличии и отсутствии р-каротина в клетке. Работа проводилась на модельном объекте - штамме ЕхоН, способном синтезировать каротин благодаря присутствию в клетке бактерии плазмиды рАС-ВЕТА, несущей гены синтеза р-каротина и устойчивости к хлорамфениколу. Наличие в среде антибиотика позволяло получать клетки с постоянным уровнем Р-каротина (0.1 мг/г сухого веса).

Окислительный стресс создавали введением в среду выращивания микроорганизмов редокс-медиаторов, таких как менадион или паракват (метилвиоло-

ген). Добавление менадиона в концентрации от 0,1 до 1 мМ в логарифмической фазе развития Е coli (штамм ТОР-10, не содержащий ß-каротина) вызывало к 20 часам роста культуры дозозависимое снижение скорости накопления биомассы и повышение активности СОД (рис.3). Наличие ß-каротина в клетках штамма Е coli (TOP-10 + рАС-ВЕТА) в значительной мере предотвращало увеличение активности СОД вплоть до концентрации менадиона 1,0 мМ, но не снимало торможения роста (рис.3). Паракват в концентрации 0,1-0,2 мМ оказывал аналогичное действие на культуры Ecoli, т.е. увеличение активности СОД в большей степени наблюдалось у штамма, не синтезирующего ß-каротин, тогда как торможение роста проявлялось у обоих штаммов.

......... * « «• » т р ш Г О Д , II1 il/>f |>ш

-1 ,0 -0.» -0 .« -0,4

0 ,0 0 ,"2 0 ,'4 0 ,'й 0 ,'t 1 ,0

С , а М

Рис.3 Действие редокс-медиатора менадиона на рост культуры и активность СОД у Еcoli ТОР-10 и Еcoli [ТОР-10 + рАС-ВЕТА] при выращивании в жидкой среде. 1 -биомасса ТОР-10; 2 - биомасса [ТОР-10 + рАС-ВЕТА], 3 - активность СОД у ТОР-10 (ед акт./мг белка); 4 - активность СОД у [ТОР-10 + рАС-ВЕТА] (ед акт./мг белка)

g 400

О 300 О

g 200 о

m 100

1 2 3

Рис. 4 Изменение активности СОД у БеоН через 2.5 часа после введения редокс-медиаторов. 1- контроль; 2- менаднон (0,5 мМ), 3- паракват (0,1 мМ) а) штамм ТОР-10; б) штамм [ТОР-10 + рАС-ВЕТА]

1 2 3

Изменение активности СОД у E.coli на стадии логарифмического роста исследовали при концентрации менадиона 0,5 мМ и параквата 0,1 мМ. У штамма E.coU, не содержащего |3-каротина, уже через 30-40 мин после введения редокс-медиаторов происходило изменение активности СОД, а через 2,5 часа активность СОД повышалась в 3-3,5 раза (рис.4), что хорошо согласуется с результатами других авторов. При наличии в клетках E.coli 3-каротина активность СОД увеличивалась лишь в 1,2-1,5 раза (рис.4).

Таким образом, наличие в клетках E.coli плазмиды, несущей гены синтеза (3-каротина, не снимало действия редокс-медиаторов на рост культуры, но оказывало влияние на уровень СОД.

Суммируя полученные данные, можно сказать, что присутствие в клетке рекомбинантной KcoU Р-каротина в значительной мере снижало активацию СОД под действием редокс-медиаторов, что свидетельствует об активном участии каротина в защите клетки от окислительного стресса.

Глава 3. ИЗУЧЕНИЕ СУПЕРОКСИДДИСМУТАЗНОЙ АКТИВНОСТИ У В. TRISPORA н N.CRASSA.

Нами проведено сравнение супероксиддисмутазной активности в препаратах, выделенных из N.crassa и B.trispora, в ответ на действие ингибитора СОД (KCN) и хелатора металлов (фенантролин).

Таблица 4

Действие ингибиторов СОД на препараты, проявляющие СОД активность, из

N.crassa и B.trispora. (выращивание в колбах на качалке)

СОД активность Ингибирование СОД активности (%)

(единицы активности о-Фенаитролин

Культура /мг белка за 20 минут) (2мМ) 10"®М

¡У.сгана 1.5x10^0.18 100% 95%

ВЛгЬрога (+) 0.125х10"'+0.02 100% 0

Влпзрога (-) 0.23x10^0.03 100% 0

В. ¡трога (+/-) 0.14x10^+0.015 100% 0

Показано, что СОД активность выделенного и частично очищенного препарата из N.crassa полностью ингибировалась в присутствии 2 мМ KCN (табл. 4). Это совпадает с литературными данными, что у N.crassa основная супероксиддисмутазная активнось принадлежит ферменту ^^п-СОД. Была также отмечена высокая чувствительность СОД, выделенной из Ncrassa, к 1,10-фенантролину (табл. 4).

СОД активность в белковых препаратах из (+), (-) и совместного (+/-) миц-елиев B.trispora была значительно ниже, чем в препаратах из N.crassa (табл. 4).

Ферментативная активность у данной культуры полностью инактивировалась в присутствии 2 мМ KCN, что характерно для Си,2п-С0Д Однако добавление хелатора металлов 1,10-фенантролина вплоть до конечной концентрации 10 М к белковому препарату, выделенному из мицелия В tnspora, не вызывало ингибирования СОД активности, что указывает на отсутствие металлов в белках, проявлявших активность СОД Ингибирование СОД активности у В tnspora KCN не позволяет отнести данные ферменты к Мп-СОД.

Различная реакция ферментов, проявляющих СОД активность у В trispora и N crassa на стресс в условиях in vivo, а также данные ингибиторного анализа, заставили нас усомнится в наличии цитозольной Си,2п-СОД у В trispora Для проверки этого предположения было проведено электрофоретическое исследование изозимного состава СОД из мицелиев В trispora и N crassa (рис 5)

а б

Рис 5 Изучение изозимного состава СОД из В ^рот (а) и N crassa (б) 1- В ^рога (+) (15 мг белка); 2- В Щрога (-) (12 мг белка), 3- В Щрога (+/-) (24 мг белка), 4-Ncrassa, мицелий выращенный в темноте (10 мкг белка), 5- СОД из эритроцитов быка (0,05 мкг белка), 6- мнтохондрнальная фракция из N crassa ( 7 мкг белка), 7-N crassa, мицелий после освещения (12 мкг белка)

* Препарат любезно предоставлен Исаковой Е П, за что автор выражает ей благодарность)

Результаты электрофореза белковых препаратов из В Шрот, проявляющих СОД активность, приведены на рис 5а Белки из (+) культуры В tnspora (трек

1) представлены на электрофореграмме одной зоной белки из (-)

культуры (трек 2) представлены тремя зонами а из

совместно выращенного (+/-) мицелия В Ш8рога (трек 3) - четырьмя зонами (Ят=0.96; 11п,=0.68; 1^=0.52; Ят=0.26).

При электрофоретическом разделении белкового препарата из Nсга88а (рис. 5б), выращенного в темноте (трек 4), СОД активность представлена двумя зонами, соответствующими Си,2п-С0Д (зона 1^=0.37) и Мп^ОБ (зона Ж.т=0.2б), что было подтверждено сравнением этих зон по относительной подвижности с Си,2п-СОД из эритроцитов быка (трек 5) и с препаратом, выделенным из митохондрий N.crassa (трек 6). В экстракте мицелия Nегахха, подвергавшегося световому воздействию, при электрофоретическом разделении (трек 7) обнаружено появление дополнительной зоны что может быть

связанно с появлением при стрессе низкомолекулярных пептидов, проявляющих СОД активность. Следует отметить, что у В рога не обнаружена зона, соответствующая по электрофоретической подвижности Си,2п-СОД.

Рис.6 Обработка изозимов СОД из Врога, N.crassa, Saccharomyces cerevisiae и коммерческих препаратов ферментов (а) до обработки и (б) после

обработки. I, 7- В Ш8рога (+/-) (25 мг белка); 2, 8- N^ахха, мицелий выращенный в темноте (10 мкг белка); 3, 9- СОД из эритроцитов быка (0,05 мкг белка); 4, 10- лактат-дегидрогеназа из сердца быка (65 мкг белка), 5, 11- дрожжевая алкогольдегидрогеназа (70 мкг белка); 6, 12- препарат из Saccharomyces cerevisiae (0,5 мг белка);

Препараты из N.crassa и B.trispora после разделения были подвергнуты обработке Н2О2 (рис. 6), при этом, как видно на электрофореграмме, исчезали зоны ^^n-СОД из N.crassa и эритроцитов быка. После обработки Н2О2 препаратов из B.trispora интенсивность окраски зон на электрофореграмме не менялась, что вместе с данными ингибиторного анализа и различием в подвижности подтверждает факт отсутствия у данной культуры C^Zn-СОД.

Необходимо подчеркнуть, что высокая константа устойчивости комплексов Ni и Fe с 1,10-фенантролином, а также отсутствие снижения активности СОД в препаратах из B.trispora под действием перекиси водорода позволяет исключить Ni-СОД и Fe-СОД из числа возможных супероксиддисмутаз у B.trispora. В то же время на электрофореграммах белковых препаратов из (-) и (+/-) B.trispora присутствовала зона Rm=0.26. Относительная подвижность данной зоны соответствует подвижности Mn-СОД из N.crassa.

Метод выявления СОД активности в полиакриламидном геле с использованием тетразолиевого нитросинего, предложенный Beauchamp С. и Fridovich I., уже более 30 лет активно используется для выявления и идентификации различных типов супероксиддисмутаз. Однако, в наших опытах было обнаружено, что СОД-подобную активность при выявлении данным методом способны проявлять и некоторые дегидрогеназы. Как видно из рисунка 6а, ферменты лактатдегидрогеназа из сердца быка (Sigma, USA) и алкоголь-дегидрогеназа из дрожжей ("Reanal", Венгрия) аналогично СОД препятствовали восстановлению тетразолиевого нитросинего до бисформазана в условиях образования супероксидных радикалов, что проявлялось на геле в виде неокрашенной зоны. Как видно на рисунке 6, в препаратах лактатдегидро-геназы и алкогольдегидрогеназы нет зон, совпадающих по относительной подвижности с C^Zn-СОД или Mn-СОД. Известно (Красновский А.А., 1999), что все белки способны активировать дисмутацию супероксид-аниона, однако активность C^Zn-СОД значительно выше. Супероксиддисмутазная активность исследуемых нами дегидрогеназ проявляется на электрофореграмме при нанесении большего количества белка по сравнению с препаратом C^Zn-СОД из эритроцитов быка (Sigma) (рис. 6).

Важно отметить, что при обработке гелей с испытуемыми дегидрогеназами перекисью водорода СОД-подобная активность, проявляемая данными ферментами, не исчезала (рис. 6б). Этот факт объясняется тем, что использовавшиеся нами дегидрогеназы, в отличие от СОД, не содержат в активном центре металл с переменной валентностью, который при взаимодействии с перекисью

водорода окисляется и, по-видимому, не способен более принимать участие в катализе.

Таким образом, зоны, получаемые при окрашивании геля с препаратами из B.trispora тетразолиевым нитросиним, могут являться не супероксиддисмутаза-ми, а не содержащими металлов дегидрогеназами.

Известно, что на стационарной фазе роста у B.trispora происходит активный синтез каротина и ТСК. Согласно литературным данным, мицелии (+) и (-) B.trispora отличаются друг от друга только набором ферментов синтеза ТСК, при этом только (-) штамм способен окислять 4-й атом Р-иононового кольца до кето группы. Различия в результате электрофоретического разделения препаратов из (+), (-) и совместного (+/-) мицелиев B.trispora может указывать на присутствие у (-) и совместного (+/-) мицелиев дегидрогеназы, осуществляющей данную реакцию. В работах СИетртвЫ с соавторами (1996) показано, что 4-дегидрометилтриспоратдегидрогеназа из Mucor mucedo обладает молекулярной массой 33 кДа. Нами было проведено препаративное выделение белков из зоны Кт=0.52, проявляющих СОД-подобную активность, с последующим электрофоретическим разделением полученного экстракта в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата №. Результаты электрофореза показали наличие белков с молекулярной массой в интервале 29 - 45 кДа, среди которых, по-видимому, присутствует 4-дегидрометил-триспоратдегидрогеназа.

Полученные нами данные показали, что у B.trispora, по-видимому, отсутствуют такие металлосодержащие СОД, как Си,2п; Бе или N1, так как СОД-подобная активность сохранялась при концентрации фенантролина 10-5 М и в присутствии Предполагается, что СОД активность в препаратах

B.trispora обусловлена присутствием в них ферментов дегидрогеназного типа, в том числе, возможно, 4-дегидрометилтриспоратдегидрогеназы, участвующей в синтезе ТСК.

Глава 4. НАЧАЛЬНЫЕ ЭТАПЫ СИНТЕЗА ТРИСПОРОВЫХ КИСЛОТ.

Исследование биотрансформации каротина проводили в присутствии ферментного препарата из (+/-) мицелия B.trispora. Хроматографическое разделение продуктов метаболического превращения каротина показало появление в инкубационной смеси соединений с Яг 0,5 и 0,3, не обнаруживаемых в контрольных пробах (ферментный препарат без каротина и эмульсия каротина в буферном растворе). Инкубация каротина с препаратами из отдельно растущих (+) и (-) культур приводила к образованию сходных по хроматографическим свойствам продуктов, но в меньших количествах. При

использовании в качестве субстрата ретиналя синтеза каких-либо продуктов его биотрансформации в этих условиях обнаружено не было.

4.1. Обнаружение изокриптоксантнна. Среди продуктов биотрансформации Р-каротина было обнаружено соединение с Яг 0,3 со спектром в видимой области, характерным для каротиноидов. Количество образующегося соединения составляло 0,02-0,04 мкг/мг белка за 4 часа.

ми

Рис.7. Идентификация изокриптоксантина. а - выявление аллильной группировки: спектр поглощения соединения с Rf 0,3 до (1) и после обработки НС1 в хлороформе (2), б - масс-спектр метокси- производного соединения с Rf 0,3.

Полученное соединение в реакции с НС1 в хлороформе давало базохромное смещение максимумов поглощения на 20 нм (рис.7), что указывало на присутствие аллильной группировки в структуре этого соединения и позволяло идентифицировать его как 4-окси- Р-каротин (изокриптоксантин). Масс-спектр метокси-производного полученного соединения также указывал на присутствие гидроксильной группы. Сравнение продукта биотрансформации Р-каротина с синтезированным нами изокриптоксантином по спектральным, хроматографическим и химическим свойствам подтвердило их идентичность.

Таким образом, обнаружение изокриптоксантина среди продуктов биотрансформации каротина позволяет высказать предположение о том, что синтез ТСК может начинаться с гидроксилирования Р-каротина.

4.2. Идентификация апокаротиналей. Исследование спектра зоны с Rf 0,5 выявило образование группы соединений, причем их максимумы поглощения в видимой области не разделялись. Под действием NaBH4 спектр поглощения этих соединений смещался в коротковолновую область, указывая на наличие альдегидной или кето групп в их структуре. Это позволило предположить образование апокаротиналей и апокаротинонов при биотрансформации каротина. Относительные величины оптической плотности в максимумах

поглощения ТФУ-производных отдельных апокаротиналей, синтезирующихся из Р-каротина, представлены в таблице 5.

Рис. 8. Схема, иллюстрирующая образование апокаротиналей (а), спектр поглощения их ТФУ производных (б): 1 - В-апо- 13-каротинон; 2 - ретиналь; 3 - В-апо-14'-каротиналь; 4 - В-апо-12'-каротиналь;5 - В-апо-10'-каротиналь.

Состав апокаротиналей, полученных при инкубации Р-каротина в присутствии системы ксантин - ксантиноксидаза, сходен с таковым при инкубации под действием препарата из В. ^рога. Низкое содержание ретиналя среди продуктов окислительного расщепления каротина говорит о значительно большей вероятности расщепления полиеновой цепи не по центральной, а по соседним с ней двойным связям как при инкубации с ферментным препаратом из В.М8рога, так и при деградации Р-каротина под действием АФК, создаваемых системой ксантин - ксантиноксидаза.

Таблица 5

Соотношение максимумов поглощения ТФУ производных апокаротиналей, образовавшихся из Р-каротина

Условия опыта Относительная велнчена оптической плотности поглощения ТФУ производного апокаротиналя относительно р-апо-13-каротиноня

Р-апо-13 ^»«кс 543 р-апо-15 Хнма 618 р-апо-14* )->|>кс 676 р-апо-12' ^макс 741 Р-апо-10' ^макс 806

Инкубация Р-каротнна с ферментным препаратом из ВлгЬрога (п=14) 1,0 0,18+0,04 1,10+0,06 1,10+0,16 0,60+0,11

Инкубация Р-каротнна в условиях генерации супероксид-анион радикала* (п=3) 1,0 0,27+0,05 1,1+0,10 0,4+0,14 0,43+0,10

*Супероксидные анион-радикалы создавали в присутствии системы ксантин : ксантиноксидаза.

4.3. Биотранформация Р-апо-13-каротинона. Как видно из рис. 8, среди продуктов биотрансформации p-каротина присутствует Р-апо- 13-каротинон. Ранее в опытах с культурой B.trispora было показано, что метка из Р-апо-13-каротинона и его производных может переходить в ТСК. Учитывая это, мы исследовали превращение р-апо-13-каротинона и его 4-гидрокси- производного под действием ферментных препаратов, выделенных из мицелия B.trispora в стационарной фазе роста (табл. 6).

Было обнаружено, что препараты из (-) B.trispora катализировали превращение Р-апо-13-каротинона в более полярное соединение с Rf 0,35, обнаруживаемое в ультрафиолете как темная зона. Образовавшееся соединение в этаноле давало поглощение с максимумом в области 328 нм и при обработке спектр смещался в УФ-область с максимумами поглощения 267 (плечо), 280 и 289 нм (рис. 9а). Характер изменения спектра соединения с Rf 0,35 при обработке NaBHí сходен с изменением спектра 4-кето- Р-апо-13-каротинона (рис. 10в). Полученные данные позволяют предположить, что образовавшееся соединение с Rf 0,35 по своей структуре соответствует 4-кето- производному гипотетического предшественника ТСК.

Таблица б

Превращение Р-апо-13-каротинона и 4-гидрокси-р-апо- 13-каротинона под действием ферментных препаратов из разных штаммов Blakeslea trispora

Штамм Субстрат (1 мг) Продукты, мкг/мг белка за 4 ч

Rf 0,35 Rr 0,25

811(-)(п=2) р-апо-13 -каротннон 1,45 Не обнаружены

4707 (-) (п=2) Р-апо-13 -каротннон 0,75 Не обнаружены

666 (+) (п=2) Р-апо-13 -каротннон не обнаружены 2,29

1521 (+) (п=2) р-апо-13 -каротннон не обнаружены 0,89

811 (-) (п=2) 4-гидрокси р-апо-13 — каротннон 0,57* 0,50

666/811 (+/-) (п=2) Р-апо-13 -каротннон 0,97 Не обнаружены

*-Соответствует 4-кето~Р-апо-13-каротинону по хроматографическим и спектральным свойствам;

Препараты из (+) культуры В ^рога катализировали трансформацию р-апо-13-каротинона в соединение с Rf 0,25 и максимумом поглощения 328 нм (табл. 6, рис 106). Меньшая подвижность продукта, получаемого с препаратами (+) культуры, указывает на более высокую полярность этого соединения по сравнению с продуктом (-) культуры. Обработка КаБЫ4 соединения с Rf 0,25 приводила к образованию соединения, сходного с получаемым при обработке

соединения с 0,35 (рис. 9а,б; 10б,в). На основании приведенных результатов можно предположить, что образующиеся из (З-апо-13-каротинона под действием ферментных препаратов (+) и (-) B.trispora соединения отличаются друг от друга только степенью окисленности 4 углеродного атома -гидрокси группа в продукте (+) мицелия и кето группа в продукте (-) мицелия.

X, им

Рис. 9. Спектры поглощения продуктов биотрансформации Р-апо-13-каротинона при инкубации с ферментным препаратом из B.trispora до (1) и после (2) обработки КаВН^ а - соединение с 0,35; б - соединение с Яг 0,25.

1 о

Я, нм

Рис. 10. Спектры поглощения (3-апо-13-каротинона и его производных до (1) и после (2) обработки КаВН*. а - р-апо-13-каротинон; б - 4-гидрокси- р-апо-13-каротинон; в -4-кето-Р-апо- 13-каротинон.

При инкубации препарата из (-) культуры с 4-гидрокси- р-апо-13-каротиноном в качестве субстрата наблюдалось образование соединения с 0,25 и спектральными свойствами, аналогичными продукту из (+) культуры. Кроме того, при хроматографическом разделении было обнаружено соединение, по спектральным характеристикам и подвижности совпадающее с 4-кето- р-апо-13-каротиноном (табл.6). Эти результаты хорошо согласуются с литературными данными о наличии только у (-) штаммов ферментов, способных превращать 4-гидрокси- в 4-кето- группу.

Препараты из совместной (+/-) культуры B.trispora вызывали превращение Р-апо-13-каротинона в соединение с 0,35 (табл. 6), как и препараты из (-)-культуры.

Исследование биотрансформации р-каротина и Р-апо-13-каротинона под действием препарата из совместной (+/-) культуры B.trispora показало, что за 4 часа инкубации с каротином в качестве субстрата в смеси образовывались изокриптоксантин (0,03+/-0,01 мкг/мг белка) и Р-апо-13-каротинон (0,25+/-0,05 мкг/мг белка), а Р-апо-13-каротинон, внесенный в инкубационную смесь, превращался в 4-кето соединение (1 мкг/мг белка). Приведенные данные свидетельствуют, что в присутствии ферментного препарата биотрансформация Р-апо-13-каротинона происходит активнее, чем синтез изокриптоксантина из Р-каротина.

4.4. Схема начальных этапов синтеза ТСК. На основании полученных результатов мы предположили, что синтез предшественников триспоровых кислот может осуществляться двумя путями (рис.11). Первый путь связан с ферментативным гидроксилированием Р-каротина по 4 углеродному атому Р-иононового кольца с последующим несимметричным расщеплением полиеновой цепи. Второй путь обусловлен образованием Р-апо-13-каротинона при окислительном расщеплении каротина в процессе его взаимодействия с АФК при окислительном стрессе. Как видно из приведенных данных, в присутствии ферментных препаратов из B.trispora окисление Р-апо-13-каротинона протекает значительно активнее, чем гидроксилирование каротина.

Предлагаемая нами схема (рис.11) показывает, что выбор пути синтеза ТСК в культуре может определяться интенсивностью деградации каротина. Вероятно в отсутствии окислителей будет преобладать образование ТСК через изокриптоксантин, а при нарастании окислительного стресса и усилении окислительной деградации р-каротина - через Р-апо-13-каротинон. Следует отметить, что в условиях деградации каротина ретиналя образовывалось меньше, чем других апокаротиналей (рис.8). Учитывая, что у B.trispora синтез Р-каротина и ТСК тесно связан с процессами дифференцировки и сопряжен с увеличением уровня АФК, можно ожидать, что в этот период основная масса ТСК образуется из Р-апо-13-каротинона.

трЬспоровые кислоты Рис. 11. Гипотетическая схема начальных этапов синтеза ТСК.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Исследование биологической роли ß-каротина у B.trispora показало тесную взаимосвязь выполняемых им функций: предшественника сигнальных молекул (ТСК) и антиоксиданта. Проведенная нами работа по определению роли ß-каротина в системе АОЗ B.trispora позволила установить, что ß-каротин является основным активируемым при стрессе компонентом АОЗ. Активное участие каротиноидов в детоксикации АФК in vivo в условиях окислительного стресса подтверждено экспериментами на модельном объекте - Е coli, несущем плазмиду со встроенными генами синтеза ß-каротина.

Реакция антиоксидантных ферментов на стресс у B.trispora существенно отличалась от их реакции у другого каротиноидсинтезирующего гриба -N.crassa, что позволило предположить конститутивное снижение активности СОД у В. trispora.

Полученные нами результаты электрофоретического разделения белковых препаратов из мицелия B.trispora и их сравнение с супероксиддисмутазами из N.crassa показали наличие Mn-СОД и отсутствие ^^n-СОД у B.trispora. Полученные результаты хорошо коррелируют с данными других авторов об отсутствии ^^n-СОД у дрожжей - сверхпродуцентов каротиноидов Phaffia rhodozyma и Rhodotorula mucilaginosa.

Показано, что основная СОД-подобная активность у B.trispora, по-видимому, представлена несколькими не содержащими металлов ферментами дегидрогеназного типа, возможно, принимающими участие в синтезе ТСК. Это предположение подтверждается отсутствием зон и

проявляющих СОД-подобную активность, в препаратах из (+) мицелия B.trispora, не способного превращать 4-окси группу в 4-кето.

Установлено, что синтезируемый культурой ß-каротин может окисляться по 4-ому атому углерода иононового кольца с образованием изокриптоксантина, который, как мы предполагаем, является одним из возможных предшественников ТСК. С другой стороны, при взаимодействии с АФК каротин может подвергаться окислительной деградации с образованием ряда продуктов, среди которых присутствует р-апо-13-каротинон. Как было нами показано, этот метаболит каротина также может гидроксилироваться, причем реакция идет активнее, чем гидроксилирование каротина с образованием изокриптоксантина. Полученные данные позволяют предположить наличие двух путей синтеза ТСК в зависимости от состояния культуры - в процессе роста малые количества ТСК могут образовываться через изокриптоксантин, а при окислительной деградации каротина, сопряженной с развитием стресса,

основное количество ТСК будет образовываться через р-апо-13-каротинон. Синтезируемые культурой на стадии дифференцировки ТСК выступают индукторами «сверхсинтеза» Р-каротина, усиливая тем самым АОЗ клетки.

Таким образом, на примере B.trispora хорошо прослеживается взаимосвязь функций Р-каротина как предшественника сигнальных молекул - синтез ТСК, так и роль Р-каротина как антиоксиданта. Потребность культуры в сверхсинтезе Р-каротина и его значительная роль в АОЗ клетки у B.trispora обусловлены, по-видимому, отсутствием Си,2п-СОД.

ВЫВОДЫ.

1. Проведено сравнительное исследование элементов системы АОЗ (СОД, каталаза, p-каротин) и содержания триспоровых кислот - метаболитов Р-каротина у (+), (-) и совместного (+/-) мицелиев B.trispora на стационарной фазе роста, а также на разных стадиях развития (+/-) мицелия. Наиболее активно р-каротин и триспоровые кислоты накапливались у (+/-) мицелия при переходе к стационарной фазе роста на фоне снижения активности СОД и каталазы.

2. Исследование реакции системы АОЗ в ответ на действие света у грибов показало, что у B.trispora наблюдалось снижение активности ферментов АОЗ на фоне роста уровня каротина, тогда как у N.crassa свет активировал СОД, каталазу и синтез каротиноидов.

3. Показано, что присутствие Р-каротина в рекомбинантных клетках E.coli предотвращало активацию СОД в ответ на действие стрессорных агентов. Полученные данные подтверждают активное участие каротиноидов в детоксикации АФК в условиях окислительного стресса in vivo.

4. Электрофоретическое разделение выделенных и частично очищенных белков из B.trispora показало наличие Mn-СОД и отсутствие Си,2п-СОД.

5. Показано, что под действием белковых препаратов, выделенных из мицелия мукорового гриба B.trispora, Р-каротин окислялся по 4 углеродному атому р-иононового кольца с образованием изокриптоксантина - возможного предшественнника ТСК. Однако Р-апо-13-каротинон, образующийся в результате спонтанной окислительной деградации каротина при окислительном стрессе, сопровождающем стационарную фазу роста, являлся более предпочтительным субстратом для гидроксилирования Р-иононового кольца и формирования предшественников ТСК, чём р-каротин.

6. Полученные данные позволяют предположить наличие двух путей синтеза ТСК в зависимости от стадии развития B.trispora, а также показывают тесную взаимосвязь антиоксидантной функции Р-каротина с активацией синтеза ТСК в ходедифференцировки.

- А.В. Соколов, Н.Н. Гесслер, В.Я. Быховский, Т.А. Белозерская. Особенности антиоксидантной защиты у мукорового гриба Blakeslea trispora. Сборник трудов "Новые и нетрадиционные растения и перспективы их использования". Москва. Издательство Российского университета дружбы народов. 2001г. Т.1, стр.441-443.

- A.V. Sokolov, N.N. Gessler, V.Ya. Bykchovsky. Pathways of trisporic acids biosynthesis in Blakeslea trispora. Сборник тезисов международной конференции "Sygnalling systems ofplant cell". Москва. 2001г. 5-7 июня. стр. 109.

- А.В. Соколов, Н.Н. Гесслер, В.Я. Быховский, Т.А. Белозерская. Активация систем антистрессовой защиты у грибов под действием света. Сборник тезисов 3-его съезда фотобиологов России. Воронеж. 2001г. 28 июня-4 июля. стр. 201.

- Н.Н. Гесслер, А.В. Соколов, ВЛ. Быховский, Т.А. Белозерская. Активность супераксиддисмутазы и каталазы у каротиноидсинтезирующих грибов Blakeslea trispora и Neurospora crassa при окислительном стрессе. // Прикл. биохим. микробиол., 2002, Т.38, №3, стр.237-242.

- Н.Н. Гесслер, А.В. Соколов, ТА Белозерская. Начальные этапы синтеза триспоровых кислот у Blakeslea trispora. // Прикл. биохим. микробиол., 2002, Т.38, №6, стр. 625-633.

- А.В. Соколов, Н.Н. Гесслер, Т.А Белозерская. Функциональная активность каротиноидов у бактерий и грибов при окислительном стрессе. Сборник докладов 6-й международной конференции "Биоантиоксидант" . Москва. 16-19 апреля 2002 г. стр. 540-541.

- А.В. Соколов, Н.Н. Гесслер, ТА. Белозерская. Активность отдельных компонентов системы антиоксидантной защиты у грибов при окислительном стрессе. Сборник докладов 1-го съезда микологов России. Москва. 11-13 апреля. 2002 г. стр. 155.

- Н.Н. Гесслер, А.В. Соколов, Т.А. Белозерская. Участие р-каротина в антиоксидантной защите бактериальной клетки. // Прикл. биохим. микробиол., 2003, Т.39, №4, стр. 435-437.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ

Типография ИМАШ РАН, г Москва, М Харитоньевский пер , 4

Лиц ПД № 00492 от 12 04 2000

Зак № //)]■, от 5.0$ 20 04 тир {00 экз

^ 80 0 3

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Соколов, Александр Вячеславович

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Глава 1. ХАРАКТЕРИСТИКИ ОСНОВНЫХ КОМПОНЕНТОВ СИСТЕМЫ АНТИОКСИДАНТНОЙ ЗАЩИТЫ ГРИБНОЙ КЛЕТКИ.

1.1. АФК и их источники у грибов.

1.2. Окислительный стресс, рост и дифференцировка у грибов.

1.3. Характеристика основных компонентов системы антиоксидантной защиты грибной клетки.

1.3.1. Супероксиддисмутазы.

1.3.2. Каталазы.

1.3.3. Пероксидазы.

Глава 2. КАРОТИНОИДЫ.

2.1. Свойства каротиноидов и факторы, влияющие на их синтез у грибов.

2.2. Локализация каротиноидов у грибов.

2.3. Синтез каротиноидов у грибов.

2.4. Регуляция биосинтеза каротиноидов.

2.5. Связь синтеза вторичных метаболитов с процессами дифференцировки у грибов.

2.6. Каротиноиды - предшественники триспоровых кислот.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Роль каротиноидов в антиоксидантной защите грибной клетки"

Биологическая активность каротиноидов объясняется их способностью взаимодействовать с активными формами кислорода (АФК) или возникающими в процессе свободнорадикальных реакций соединениями (57), а также физиологической значимостью метаболитов, образующихся в процессе их биотрансформации (154).

Каротиноиды признаны наиболее эффективными природными фотопротекторами, причем эту функцию они выполняют как в клетках фотосинтетиков, где непосредственно участвуют в процессе фоторецепции, так и у многих нефотосинтезирующих организмов, образование каротиноидов у которых нередко сопряжено с действием света. Синтез каротиноидов может также стимулироваться условиями выращивания или химическими соединениями, повышающими уровень АФК в клетке (1, 32, 146), что указывает на их важную роль в защите клетки от окислительного стресса.

Процесс взаимодействия каротиноидов с АФК или свободными радикалами происходит с образованием разнообразных окисленных продуктов (57), многие из которых также весьма реакционноспособны и токсичны (57, 73). Способность каротиноидов проявлять антиоксидантные свойства in vivo во многом зависит от их строения и концентрации, характера повреждающего агента, парциального давления кислорода, а конечный результат определяется также токсичностью образующихся продуктов,, скоростью их удаления из клетки и взаимодействием с другими антиоксидантами (73, 205). В определенных условиях (повышенное содержание кислорода в тканях, высокая токсичность конечных продуктов, образующихся в ходе реакции каротиноидов с некоторыми соединениями) каротиноиды могут оказывать прооксидантное действие, что было выявлено при профилактическом применении каротиноидов на курильщиках и рабочих асбестовых предприятий (73). Эти данные поставили под сомнение эффективность каротиноидов как антиоксидантов в условиях окислительного стресса (73,205).

Помимо антиоксидантной функции каротиноиды в клетке выполняют также и другую функцию - выступают предшественниками сигнальных молекул, таких как витамин А у животных, абсцизовая кислота у растений и триспоровые кислоты у мукоровых грибов. Метаболиты каротиноидов принимают участие в регуляции процессов дифференцировки, адаптации к условиям внешней среды, размножения и светорецепции (156).

Антиоксидантные функции каротиноидов в клетке могут быть тесно связаны с действием их метаболитов. Так, ретиноевая кислота, образующаяся у животных из Р-каротина, задерживала апоптоз клеток путем поддержания уровня основных ферментов системы антиоксидантной защиты клетки - Cu/Zn и Мп супероксиддисмутаз (СОД) (37).

Окислительный стресс, вызываемый увеличением уровня АФК в клетке, приводит к преждевременной ее гибели и сопровождает развитие многих патологических процессов. В этих случаях особое значение приобретает система антиоксидантной защиты, действие которой направлено на « предупреждение развития реакций свободнорадикального окисления.

Несмотря на широкое применение каротиноидов в медицинской практике, пищевой и косметической промышленности, имеющиеся данные об их антиоксидантной активности основываются главным образом на экспериментах, проводившихся in vitro. Каротиноиды являются важным компонентом системы антиоксидантной защиты у многих микроорганизмов, в том числе и у многих грибов.

Грибы привлекают внимание специалистов самых различных областей, например, биотехнологов как продуценты различных соединений, медиков и специалистов различных областей народного хозяйства как возбудители заболеваний животных и растений. Грибы активно участвуют в усвоении

• • неорганических соединений, в том числе ? и радиоактивных, и включение последних в состав органических молекул не может не вызывать беспокойство экологов. Исследование функций каротиноидов в грибной клетке и их участие в системе антиоксидантной защиты является важным моментом в регуляции жизнедеятельности грибов.

Работа в основном выполнена на культуре гриба Blakeslea trispora (промышленном продуценте ß-каротина), а также на каротиноидсинтези-рующем грибе Neurospora crassa и модельном объекте - бактерии E.coli со встроенной плазмидой, несущей гены синтеза ß-каротина.

Настоящая работа была направлена на изучение функциональной активности каротиноидов и их роли в системе антиоксидантной защиты (АОЗ) клетки при окислительном стрессе, а также на выявление причины феномена «сверхсинтеза» ß-каротина у B.trispora. При изучении системы АОЗ клетки нас интересовали компоненты, действие которых направлено на устранение первично возникающих АФК: СОД (дисмутация супероксидного анион-радикала), каталаза (разложение перекиси водорода) и каротиноиды (гашение синглетной формы кислорода, реакция со свободными радикалами). В связи с этим в работе были поставлены следующие задачи:

3. Изучение участия ß-каротина в защите клетки от окислительного стресса на примере E.coli со встроенной плазмидой, несущей гены синтеза ß-каротина. Изучение начальных этапов синтеза триспоровых кислот (ТСК) из ßкаротина у B.trispora. Связь синтеза предшественников ТСК с окислительным стрессом.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ Глава 1. ХАРАКТЕРИСТИКА ОСНОВНЫХ КОМПОНЕНТОВ СИСТЕМЫ АНТИОКСИДАНТНОЙ ЗАЩИТЫ ГРИБНОЙ КЛЕТКИ.

1.1. АФК и их источники в клетке.

В основе жизнедеятельности аэробных организмов, включая грибы, лежит получение энергии за счет процессов дыхания. В то время как кислород участвует в процессах жизнедеятельности клетки, он также способен наносить и вред. Приблизительно 5 % кислорода используемого митохондриями в процессе дыхания полностью не восстанавливаются до воды, образуя при этом супероксидный анион-радикал, гидроперекись и гидроксильный радикал (56). Не все образующиеся внутри клетки активные формы кислорода являются радикалами. Термин АФК употребляется в отношении всех внутриклеточных метаболитов кислорода, более реакционноспособных, чем молекула кислорода в триплетном состоянии

ЗО2). Наиболее часто к АФК относят такие соединения, как кислород в его возбужденном синглетном состоянии (IO2), продукты одноэлектронного восстановления кислорода - супероксидный анион-радикал (0"2), пероксидный радикал (НО2О» пероксидный ион (НО2"), перекись водорода

Н2О2) и гидроксильный радикал (-ОН). К АФК относят также соединения кислорода с хлором - гипохлориты (183) и азотом - пероксинитриты (62).

Установлено, что данные активные формы кислорода (АФК) способны наносить существенные повреждения молекулам ДНК, белкам и клеточным мембранам (56, 75, 96, 105). Более того, с токсичностью кислорода связан ряд заболеваний человека, так же как и процесс старения и многостадийный процесс канцерогенеза (96, 103,68,108,83).

Образование супероксидного анион-радикала у микроорганизмов может проходить под действием некоторых ферментов (ЫАБРН-оксидаза, ксантиноксидаза и др.), а также при автоокислении таких соединений как убихинолы, катехолы, флавины и др. (133). Супероксидный анион-радикал, образующийся при одноэлектронном восстановлении молекулярного кислорода, не является сильным окислителем. Время жизни супероксидого анион-радикала -10"6 сек, при этом он не способен проникать через мембраны и не может окислять липиды. Часто для исследования действия супероксидного анион-радикала вводят вещества, повышающие его уровень в клетке - редокс-медиаторы. Основное повреждающее действие супероксидного анион-радикала обусловлено его способностью окислять ионы металлов с переменной валентностью, например, ионы железа и меди. Реакция супероксидного анион-радикала с железом, входящим в состав 4Ре-4Б кластеров ряда дегидрогеназ, приводит к инактивации этих ферментов, содержащих данные кластеры в активном центре. Высвобождение в ходе этой ч I

• реакции свободного железа (Бе ) усиливает повреждающее действие супероксидного анион-радикала за счет образования других АФК, главным образом, гидроперекиси. Образование гидроперекиси может происходить также спонтанно или ферментативно при дисмутации супероксидного анион-радикала (119).

Н2О2, образующаяся при дисмутация супероксидного анион-радикала, является сильным окислителем. Молекула Н2О2 способна, легко проникать через мембраны, поэтому она свободно диффундирует в клетку и из нее.

Гидроперекиси способны реагировать с рядом биомолекул, таких как гистидин, аланин, глицин, аспарагиновая кислота или с основаниями ДНК (174). Образующиеся органические перекиси выполняют роль переносчиков Н2Ог, чем способствуют её проникновению через мембраны. Этим значительно увеличивается время жизни Н2О2 и усиливается её повреждающее действие. Н2Ог способна реагировать с металлами переменной валентности, например Fe2+, с образованием крайне реакционноспособного гидроксильного радикала (реакция Fenton и реакция Haber-Weiss) (95) (реакции 1,2).

Fe3+ + Ог--►Fe2+ + 02 (1)

Fe2+ + H202 + H1" —* Fe3+ + H20 + HO (2)

Гидроксильный радикал, образующийся при реакции Н202 с металлами переменной валентности, является крайне реакционноспособным.

Время жизни гидроксильного радикала крайне мало (менее 1 нсек.), при этом скорость его действия очень велика (109-101° JI моль"1 сек."1). Гидроксильный радикал способен реагировать практически со всеми биомолекулами. Многие продукты его действия являются биомаркерами окислительного стресса, например, при взаимодействии с основаниями ДНК образуется тимингликоль (116), и 8-гидрокси-2'-дезокси гуанозин (114), а при взаимодействии с фенилаланином образуется о-тирозин. Следует отметить, что в клетке нет ферментных систем для детоксикации гидроксильных • радикалов, поэтому важное значение приобретает предупреждение его образования.

Не менее важным путем активации молекулярного кислорода является внутриклеточное образование синглетного кислорода, происходящие в результате передачи энергии кванта света, а также, возможно, тепла на молекулу кислорода (21,10). Синглетная форма кислорода реагирует быстро и выборочно с биомолекулами (жирные кислоты или гуаниновые основания в ДНК), образуя пероксиды и гидропероксиды. Синглет эффективно улавливается водой и супероксидным анион-радикалом, а также витамином С и супероксиддисмутазой, витамином Е (на границе полярных и неполярных фаз), ß-каротином (в липидной фазе) (178). Следует отметить, что синглетная форма кислорода и супероксидный анион-радикал способны к взаимопревращению (119).

Возникающие в процессе активации молекулярного кислорода АФК ('Ог, 02\ Н202, ОН) взаимодействуют с биологическими молекулами, вызывая их окисление по свободнорадикальному механизму (38, 183). Показано, что АФК способны играть роль вторичных мессенжеров в клетках бактерий, животных и растений, т.е. опосредовать действие внешних факторов на экспрессию генов (85, 176). Как медиаторы экспрессии генов АФК модулируют активность факторов транскрипции. У бактерий две разные группы генов стимулируются под действием Н2О2 и 0"2 (157, 163). В патогенезе растений Н2О2 также является сигнальной молекулой (157). На стационарной фазе развития у большинства микроорганизмов уровень Н2О2 в клетке достаточно низок (1-100 нМ), что обеспечивается действием антиоксидантных ферментов - каталазы и глютатион пероксидазы (178). В то же время есть данные, что у грибов при субстратном голодании, изменении значения рН и освещении уровень Н2С>2 может повышаться до 50 мкМ (90).

Способность АФК окислять белки, липиды, ДНК и другие органические соединения требует присутствия в клетке системы антиоксидантной защиты клетки (АОЗ) от действия этих соединений. В любой клетке система АОЗ включает в себя ферменты и низкомолекулярные соединения, способные реагировать с АФК или возникающими под их действием новыми соединениями свободнорадикальной природы. Важную роль в непосредственной детоксикации АФК играют такие ферменты как супероксиддисмутазы (СОД) и каталазы, а также целый ряд низкомолекулярных соединений - каротиноиды, альфа-токоферол, эритроаскорбат, глутатион и др. (178).

Устойчивость тех или иных организмов к факторам окружающей среды, повышающим внутриклеточный уровень АФК, а также продолжительность жизни клетки напрямую связаны с активностью систем ее антиоксидантной защиты (2).

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Соколов, Александр Вячеславович

выводы.

1. Проведено сравнительное исследование элементов системы АОЗ (СОД, каталаза, Р-каротин) и содержания триспоровых кислот — метаболитов р-каротина у (+), (-) и совместного (+/-) мицелиев B.trispora на стационарной фазе роста, а также на разных стадиях развития (+/-) мицелия. Наиболее активно Р-каротин и триспоровые кислоты накапливались у (+/-) мицелия при переходе к стационарной фазе роста на фоне снижения активности СОД и каталазы.

2. Исследование реакции системы АОЗ в ответ на действие света у грибов показало, что у B.trispora наблюдалось снижение активности ферментов АОЗ на фоне роста уровня p-каротина, тогда как у N.crassa свет активировал СОД, каталазу и синтез каротиноидов.

4. Электрофоретическое разделение выделенных и частично очищенных белков из B.trispora показало наличие Mn-СОД и отсутствие Си,2п-С0Д.

5. Показано, что под действием белковых препаратов, выделенных из мицелия мукорового гриба B.trispora, Р-каротин окислялся по 4 углеродному атому р-иононового кольца с образованием изокриптоксантина- возможного предшественнника ТСК. Однако Р-апо-13-каротинон, образующийся в результате спонтанной окислительной деградации Р-каротина при окислительном стрессе, сопровождающем стационарную фазу роста, являлся более предпочтительным субстратом для гидроксилирования Р-иононового кольца и формирования предшественников ТСК, чем р-каротин.

6. Полученные данные позволяют предположить наличие двух путей синтеза ТСК в зависимости от стадии развития B.trispora, а также показывают тесную взаимосвязь антиоксидантной функции p-каротина с активацией синтеза ТСК в ходе дифференцировки.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Исследование действия Р-каротина у ВЛшрога показало тесную взаимосвязь выполняемых им функций: предшественника сигнальных молекул (ТСК) и антиоксиданта. Синтезируемый культурой р-каротин окисляется по 4-ому атому углерода р-иононового кольца с образованием изокриптоксантина, который, как мы предполагаем, является одним из возможных предшественников ТСК. С другой стороны при взаимодействии с АФК р-каротин может подвергаться окислительной деградации с образованием ряда продуктов, среди которых присутствует р-апо-13-каротинон. Как было нами показано, данный метаболит Р-каротина также может гидроксилироваться, причем данная реакция идет активнее, чем гидроксилирование р-каротина с образованием изокриптоксантина. Полученные данные позволяют предположить наличие двух путей синтеза ТСК в зависимости от состояния культуры - в процессе роста малые количества ТСК могут образовываться через изокриптоксантин (подобно синтезу абсцизовой кислоты у растений), а при окислительной деградации р-каротина, сопряженной с развитием стресса, основное количество ТСК будет образовываться через р-апо-13-каротинон.Синтезируемые культурой на стадии дифференцировки ТСК выступают индукторами «сверхсинтеза» Р-каротина, усиливая тем самым АОЗ клетки.

Особенностью ВЛшрога является способность синтезировать р-каротин не только в условиях освещения, но и в темноте. При исследовании системы АОЗ у ВЛшрога на разных стадиях развития (+/-) мицелия, а также у отдельно растущих (+) и (-) мицелиев на стационарной фазе роста, было показано, что наибольшая скорость накопления р-каротина наблюдалась у (+/-) мицелия при переходе к стационарной фазе роста на фоне низкой активности СОД и каталазы. Рост активности СОД и каталазы отмечены в конце стационарной фазы роста на фоне образования структур, характерных для совместного мицелия, что, вероятно, связано с прохождением культурой этапов дифференцировки.

Проведенная нами работа по определению роли Р-каротина в системе АОЗ B.trispora показала, что p-каротин является основным активируемым при стрессе компонентом АОЗ на фоне инактивации СОД и каталазы у данной культуры. Процессы дифференцировки сопровождают развитие окислительного стресса. В этих условиях у B.trispora наблюдалась деструкция ферментов детоксикации АФК и увеличение уровня р-каротина. Это указывает на то, что Р-каротин является основным протектором клетки B.trispora от губительного действия АФК. Исследование реакции системы АОЗ на стресс у другого каротиноидсинтезирующего гриба - N.crassa -показало, что при действии стрессорных агентов в темноте наблюдалась адекватная активация СОД, а каротиноиды выступали главным образом как фотопротекторы.

Исследовали роль p-каротина в системе АОЗ клетки при окислительном стрессе на модельном объекте - Е coli, несущем плазмиду со встроенными генами синтеза Р-каротина. Показано, что присутствие Р-каротина предотвращало активацию СОД в ответ на действие стрессорных агентов в отличие от контроля, где активность СОД увеличивалась в 3-3,5 раза. Полученные данные свидетельствуют об активном участии каротиноидов в детоксикации АФК in vivo в условиях окислительного стресса.

Сравнение выделенных и частично очищенных СОД из B.trispora и N.crassa показало, что СОД активность у N.crassa представлена Си,2п-СОД и Мп-СОД, причем большая часть активности приходится на Си,7п-СОД. Данный факт подтвержден действием ингибитора СОД (KCN) и хелатора металлов (фенантролина). Полученные нами данные указывают, что у B.trispora отсутствует металлосодержащая СОД, так как СОД-подобная активность сохранялась при концентрации фенантролина 10"5 Ми действии перекиси водорода.

Полученные нами результаты электрофоретического разделения белковых препаратов из мицелия ВЛшрога показали, что основная СОД активность у данной культуры представлена ферментами дегидрогеназного типа, не содержащими металл в активном центре, а также отмечено наличие Мп-СОД у данной культуры. Последующее препаративное выделение и электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата № белков из зоны с Кт= 0,52 позволило выдвинуть гипотезу о присутствии 4-дигидрометилтриспоратдегидрогеназы в данной зоне.

Результаты проведенной нами работы хорошо коррелируют с данными, полученными другими авторами об отсутствии Си,2п-С0Д у сверхпродуцентов каротиноидов, таких как РЬаГйа гЬос^ута и Шюс1о1:оги1а тисПа§то8а () [39-41].

Таким образом, на примере ВЛшрога хорошо прослеживается взаимосвязь функций (3-каротина как предшественника сигнальных молекул (синтез ТСК) и антиоксиданта. Потребность культуры в сверхсинтезе (3-каротина и его значительная роль в АОЗ клетки у ВЛшрога обусловлены отсутствием у нее Си^п-СОД.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Соколов, Александр Вячеславович, Москва

1. Аверьянов A.A., Гужова Н.В., Мочалов В.В. Влияние света на биохимические свойства мицелия Fusarium oxisporum Schlecht // Микология и фитопатология. 1981. Т. 15. С. 361-365.

2. Анисимов В.Н. Современное представление о природе старения. // Успехи соврем, биологии. 2000. Т.120. №2. С. 146-164.

3. Белозерская Т.А. Межклеточное взаимодействия в дифференцировке мицелиалльных грибов. // Биол. мембраны. 1997. Т. 14. С. 671-677.

4. Белозерская Т.А. Роль Н*- АТФазы грибной клетки в процессах трансдукции и дифференцировки. Дисс. докт. биол. наук. М. Институт биохимии им. А.Н. Баха РАН. 1995.136 с.

5. Белозерская Т.А., Ершов Ю.В., Петрова Н.Э., Дмитровский A.A., Крицкий М.С. Активация биосинтеза каротиноидов при генетическом повреждении транспортного механизма плазмотической мембраны грибной клетки. // Докл. РАН. 1998. Т. 359. С. 548-550.

6. Белозерская Т.А., Соколовский В.Ю., Крицкий М.С. Мембранный электрогенез и проблемы клеточной дифференцировки у мицелиальных грибов. // Микробиология. 1995. Т. 64. С. 293-300.

7. Белозерская, Т.А., Крицкий. М.С., Левина, H.H., Потапова, Т.В., Чайлахян, Л.Х. Связь фотоиндуцированной гиперполяризации плазмотической мембраны Neurospora crassa с метаболическими процессами клетки //Биологические мембраны, 1988.Т. 5. С.1081-1089.

8. Белозерский А. Н., / Практическое руководство по биохимии растений. 1951. М.: Советская наука. С. 281.

9. Брусков В .И., Масалимов Ж.К., Черников A.B. Образование активных форм кислорода в воде под действием тепла // Доклады РАН 2002. Т. 384. N6. С. 821-824.

10. Гесслер H.H., Гомбоева С.Б., Шумаев К.Б., Быховский В.Я., Ланкин В.З. Свободнорадикальное окисление липидов подавляет ферментативную конверсию ß-каротина в витамин А // Бюл.эксп.биол. мед. 2001. Т. 131. №5. С. 532-535.

11. Гесслер H.H., Соколов A.B., Белозерская Т.А. Участие ß-каротина в антиоксидантной защите грибной клетки. //Прикладная биохим. и микробиол. 2003. Т 39. № 4. с.427-429.

12. Гомбоева С.Б. Биотрансформация ß-каротина и влияние антиоксидантов на этот процесс, дисс. канд. биол. наук М Институт биохимии им. А.Н. Баха РАН. 1998.117 с.

13. Гомбоева С.Г., Гесслер H.H., Шумаев К.Б., Хомич Т.И., Мойсеенок А.Г., Быховский В.Я. // Некоторые природные и синтетические антиоксиданты как стабилизаторы превращения ß-каротина в витамин А. Биохим. 1998. Т. 63. С. 224-229.

14. Гужова Н.В., Варик О.Я., Рубин Л.В., Фрайкин Г.Я. Влияние активных форм кислорода на синтез каротиноидовFusarium oxysporum f. Sp. Vasinfectium.//Микология и фитопатология. 1977. Т. 11. С. 467-470.

15. Колот Ф.Б., Вакулова Л.А., Веселов ИЛ., Самохвалов Г.И. Биосинтез каротиноидов грибами. //Успехи совр. биол. 1971. Т. 71. № 1. С. 1842.

16. Косов H.A., Чернышева Е.К., Людникова Т.А., Ерьгин Г.Д., Крицкий М.С. Кислородостат для исследования биосинтетической продуктивности микроорганизмов. //Прикл. биох. и микробиол. 1989. Т. 25. С. 565-570.

17. Костюк В. А., Потапович А. И., Ковалёва Ж. В. Определение активности супероксиддисмутазы // Вопросы медицинской химии. 1990. Т. 36. № 2. С. 88-91.

18. Кох А. Измерение роста. / Методы общей бактериологии. Под редакцией Герхарда Ф. МИР. Москва. 1983. Т. 1. С. 442-511.

19. Красновский A.A. мл. Фосфоресцентный анализ синглетного молекулярного кислорода в фотобиохимических системах. // Биол. мембраны. 1998. Т. 15. С. 530-548.

20. Красновский A.A., мл. // Итоги науки и техники. Современные проблемы лазерной физики. Т. 3. Фотодинамическое воздействие лазерного излучения. М. ВИНИТИ. 1990. С. 63-134.

21. Крицкий М.С. Фоторегуляция механизма и онтогенеза у гетеротрофных микроорганизмов. //Успехимикробиологии. 1982.Т. 17С.41-62.

22. Крицкий М.С., Афанасьева Т.П., Белозерская Т.А., Соболева И.С:, Соколовский В.Ю., Филипович С.Ю., Чернышева Е.К. Исследование функциональных свойств фоторецепторной системы грибной клетки. // ЖОБ. 1984. Т. 35. С. 552-565.

23. Крицкий М.С., Чернышева Е.К. Об участии никотинамидных коферментов в фотоиндукции синтеза каротиноидных пигментов в клетках мицелия Neurospora crassa. // Докл. АНСССР. 1980. Т. 65. С. 473476.

24. Пасешниченко В.А. Новый альтернативный путь биосинтеза изопреноидов у эубактерий и растений // Биохимия. 1998. Т. 63. № 2. С. 171-183.

25. Скулачев В.П. // Соросовский образовательный журнал. 1996. № 3. С. 4-7.

26. Соколова Н.А., Мицнер Б.И., Закс В.И. Синтез 4-кето и 4-оксипроизводных all-E и 132-ретиналя и их взаимодействие с бактериоопсином. // Биоорг. химия. 1979. Т. 5. № 7. С. 1053-1058.

27. Соколовский В.Ю., Белозерская Т.А. // Действие стрессоров на дифференциальную экспрессию генов в ходе развитияКеигоБрога crassa. // 2000. Успехи биол. химии. Т. 40. С. 85-152.

28. Терешина В.М., КиселёваА.И., Феофилова Е.П., Кашпорова Е.В. // Микробиология. 1993. Т. 62. Вып. 1. С. 56.

29. Феофилова Е.П, Бехтерева М.Н. Влияние витамина А на биосинтез^-каротина грибом Blakeslea trispora // Микробиология. 1976. Т. 45. №3. С. 557-559.

30. Феофилова Е.П. // Пигменты микроорганизмов. М. Наука. 1974.

31. Феофилова Е.П., Терешина В.М., Ивакин А.Ф., Киселева А.И. Действие зеленого света на образование каротина и триспоровых кислот у мукорового гриба Blakeslea trispora. // Прикл. биох. микроб. 1994. Т. 30. Стр. 415-419.

32. Феофилова Е.П., Таптыкова С.Д. Влияние триспоровых кислот на дыхание (-) штамма Blakeslea trispora. // Микробиология. 1971. Т. 40. С. 495.

33. Aguirre J., Hansberg W. Two divergent catalase genes are differentially regulated during Aspergillus nidulans development and oxidative stress // J. Bacterid. 1986. Vol. 166. P. 1040-1045.

34. Aguirre J., Rodrigues R., Hansberg W. Posttranscriptional Control Mediates Cell Type-Specific Localization of Catalase A during Aspergillus nidulans Development //J. Bacteriol. 1989. Vol. 171. P. 6243-6250.

35. Ahlemeyer B, Bauerbach E, Plath M, Steuber M, Heers C, Tegtmeier F, Krieglstein J. Retinoic acid reduces apoptosis and oxidative stress bypreservation of SOD protein level //Free Rad. Biol. Med. 2001. V.30, N.10. p. 10671077.

36. Ames B.N., Shigenaga N.K., Hagen T.M. // Oxidants, antioxidants and degenerative disease of aging. Prot. Nat. Acad. Sci. USA. 1993. V. 90. P. 79157922.

37. Armstrong G.A. Eubacteria show their true colors: Genetics of carotinoid pigment biosynthesis from microbes to plants. // J.Bacteriol. 1994. V.176. № 16. P.4795-4802.

38. Arpaia G., Carattoli A., Macino G. Light and development regulate the expression of albino-3 gene in neurospora crassa. // Dev. Biol. 1995. Vol. 170. P. 626-635.

39. Attwood M.M. The production of P-carotene in |Mortierella ramanniana var. Ramanniana M29. // Antonie van Leeuwenhoek. J. Microbiol, and serol. 1971. V. 37. 369. p.

40. Austin D.J., Bu'Lock J.D., Drake D. The biosynthesis of trisporic acids from P-carotene via retinal and trisporol. // Experientia. 1970. V. 26. №5. P. 348-34).

41. Austin D.J., Bu'Lock J.D., Winstanley D.J. Trisporic acid biosynthesis and carotenogenesis in Blakeslea trispora. // Biochem. J. 1969. V. 113. №1. P. 34p.

42. Bannister J.V., Bannister W.H., // Methods Enzymology. 1984. V.105. P.88-93.

43. Bar E., Rise M., Vishkautsan M., Arad S. // J. Plant Physiol. 1995. Vol. 146. P. 527-534.

44. Barkley K.B., Gregory E.M. / Tetrameric manganese superoxide dismutases from anaerobic Actinomyces. Arch. Biocherh. Biophys. 1990. V. 280. P. 192200.

45. Barron G.L. / Genera of hyphomycetes from soil. Williams and Wilkins. Baltimore. 1968. p. 145.

46. Bennett J. W. In: Secondary metabolism and differentiation in fungi. Ed. Bennett J.W., Ciegler A.1983. Marcel Dekker inc. New York. P. 1-32.

47. Bergman K., Burke P.V., Cerda-Olmedo E., David C.M., Delbruck M., Foster K.W., Goodel E.W., Heisenberg M., Meissner G., Zalokar M., Dennison D.S., Shropshire W. Phycomyces. // Bacteriol. Rev. 1969. V. 33.99. p.

48. Bernlohr R.W., Novelli G.D. Uptake of bacitracin by sporangia and its incorporation in to the spores of bacillus licheniformes. // Arch. Biochem. Biophys. 1960. V. 87. p. 232.

49. Betina V. // Differentiation and secondary metabolism in some prokaryotes and fungi. Folia Microbiologica. 1995. V. 40. P. 51-67.

50. Beyer W., Imlay J., Fridovich I. / Superoxide dismutases. Prog Nucl. Acids

51. Res. Mol. Biol. 1991. V. 40. P. 221-253.

52. Bilinski T. Krawiec Z. Liczmanski A. Litwinska J // Is hydroxyl radical generated by the Fenton reaction in vivo. Biochem Biophys Res Commun. 1985. V. 130. P. 533-539

53. Bostek C. C. Oxygen toxicity: an introduction. (1989) J. Am. Assoc. Nur. Anes. 57,213-237

54. Britton G. Structure and properties of carotenoids in relation to function. // Faseb J. 1995. Vol. 9. P. 1551-1558.

55. Bu'Lock J.D., Winstanley D.J. Trisporic acid production by Blakeslea trispora and its promotion by barbiturate. J. Gen. Microbiol. 1971. V.69. P.391-394.• 59. Bu'Lock J.D., Jones B.E., Taylor D., Winskill N., Quarrie S.A. Sexuality in

56. Mucorales. The effect of plus-minus ration hormone production by mated cultures. //J.Gen.Microbiol. 1974. V. 80. №5. P. 301-306.

57. Bu'Lock J.D. New benzofurans from stereum subpileatum, their biosynthesis, and related processes of aromatic aminoacid metabolism in a basidiomycete. // Add. Appl. Microbiol. 1961. V. 3.293. p.

58. Bu'Lock J.D., Powell A.J. Oxygen requirements for secondary metabolism in Trichoderma viride, and the effect of barbiturate. // Experientia. 1965. V. 21. 55. p.

59. Caglioti L., Cainelli G., Camerino B., Mondelli R., Prieto A., Quilico A., Salvatori T., Selva A. Structure of trisporic-C acid. // Tetrahedron, Suppl. 1967. V.7. p. 175-187.

60. Calvo A.M., Wilson R.A., Bok J.W., Keller N.P. // Relationship between secondary metabolism and fungal development. Microbiol. And Molec. Boil. Rev. 2002. V. 66. P. 447-459.

61. Candeias L.P., Stratford M.R.L., Wardman P. / Formation of hydroxyl radicals in reaction hypochlorous acid with ferrocyanide, in model iron(II) complex. Free Radicals Res. 1994. V. 20. P. 241-249.

62. Carlioz A. Touati D // Isolation of superoxide dismutase mutants in Escherichia coli: is superoxide dismutase necessary for aerobic life. EMBO. 1986. V. 5. P. 623-630

63. Cederberg E., Neujahr H.Y. Distribution of (3-carotene in subcellular fraction of Blakeslea trispora. // Experimentia. 1970. V. 26. 366. p.

64. Cerda-Olmedo E. Phycomyces. / Eds. E. Cerda-Olmedo, E.D. Lipson. Cold Spring Harbour Lab. 1987. P. 199-222.

65. Cerutti, R., Larsson, R., Krupitza, G., Crawford, D., and P. Amstad. Pathophysiologycal mechanismsa of active oxygen. / Mutation Research/Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis, Sep 1989

66. Chary P. Dillon D. Schroeder AL. Natvig DO // Superoxide dismutase (sotl-1)null mutants of Neurospora crassa. oxidative stress sensitivity, spontaneousi mutation rate and responses to muluacns. Genetics. 1994. V. 137. P. 723-730

67. Chary P., Natvig D.O. // Evidence for three differentially regulated catalase genes in Neurospora crassa: effects of oxidalive stress, heat shock, and development. J Bacteriol. 1989. V. 171. P. 2646-2652

68. Chu F.S., Lilly V.G. // Micologia. 1960. V. 52. 80. p.

69. Crabtree D.V., Adler A.J. Is |3-carotene an antioxidant. // Medical Hypotheses. 1997. V.48. № 2. P.183-187.

70. Czempinski K., Kraft V., Wostemeyer J., Burmester A. // 4-Dihydromethyltrisporate dehydrogenase from Mucor mucedo, an enzyme of the sexual hormone pathway: purification, And cloning of the corresponding gene. Microbiol .1996. V. 142. P. 2647-2654.

71. Davies, K. Protein damage and degradation by oxygen radicals. (1987) J. Biol.1. Chem. 262, 9895-9901

72. DeFabo E. C., Harding R. W., Shropshire W. Action spectrum between 260 and 800 nanometers for the photoinduction of carotenoid biosynthesis in Neurospora crassa. // Plant Physiol. 1976. V.57. P. 440-445.

73. Degli-Innocenti F., Pohl U., Russo V.E.A. Isolation of new white collar mutants of Neurospora crassa and studies of their behavior in the blue light-induced formation a carotenoids. // Phorochem. Photobiol. 1983. Vol. 37. P. 49-51.

74. Droillard M.J., Paulin A. / Isozymes of superoxide dismutase .in mitochondria and peroxisomes isolated from petals of carnation (Diiinilnix airyopliyllus)during senescence. Plant Physiol. 1990. V. 94. P. 1187-1192.

75. Dugan R., Frigerio N., Siebert J. Calorimetric determination of vitamin A and its derivatives with triflouroacetic acid. // Anal. Chem. 1964. V. 36. №1. P. 114-117.

76. Ebbole D.J. Light and Developmental Regulation of the Gene con-10 of Neurospora crassa II J. Genet. 1996. Vol. 75. P. 361-374.

77. Eldred G. E., Hoffert J. R. A test for endogenous interference in superoxide dismutase assays. //Anal. Biochem. 1981.V.110.№ l.P.137-143.

78. Ende van den H., Werkmann A.H.C.A., Reyngoud D.J., Hendriks T. Hormonal interactions in Mucor mucedo and Blakeslea trispora. // J. Bacteriol. 1970. V. 101. p. 423.

79. Evans, H., Roaenfeld, W., Jhaveri, R., Concepcion, L., and Zabaleta, I. (1989) J. Free. Rod. Biol. Med. 2, 369-372

80. Farr S.B., Kogoma T. // Oxidalive stress responses in Escherichiircoli and Salmonella tvpliinntriiiin. Microbiol Rev. 1991. V. 55. P. 561-585

81. Finkel T. Oxygen radicals and signaling. // Curr. Opin. Cell Biol. 1998. Vol. 10. P. 248-253.

82. Fita I. Rossman M.G. // The active center of catalase. J Mof Biol. 1985. V. 185. P. 21-37

83. Foot C.S., Denny R.W. Chemistry os singlet oxygen. YII. Quenching by 3 carotene. // J. Amer. Chem. Soc. 1968. V. 90. p. 6233-6234.

84. Galiazzo F., Schiesser A., Rotilio G. // Glutathione peroxidase in yeast. Biochem. Res. Comm. 1987. V. 147. P. 1200-1205.

85. Georgiou C.D. // Colorimetric method for determining hydrogen peroxide production in liquid media by filamentous fungi. Mycologia. 2000. V. 92. P. 835-840.

86. Goodwin T.W. Snudies in carotenogenesis. 22. The structure of echinenone. // Biochem. J. 1956. V. 63. p. 481.

87. Gort A.S., Imlay J.A. Balance between endogenous superoxide stress and antioxidant defense. // J. Bacteriol. 1998. V. 180. p. 1402-1410.

88. Gralla EB. Kosman DJ // Molecular genetics of superoxide dismutases in yeasts and related fiinai. Adv Genet. 1992. V. 30. P. 251-319

89. Gudas L.J. Retinoids and Vertebrate development // J. Biol. Chem. 1994. V. 269. p. 15399-15402.

90. Haber F. Weiss J // The catalytic decomposition of hydrogen peroxide by iron salts. Proc R Soc London. 1934. V. 147. P.332-351

91. Halliwell, B., and Gutteridge, J. Oxygen toxicity, oxygen radicals, transitions metals and disease. (1984) Biochem. J. 219,1 -21

92. Handelman G.J., van Kuijk F.J., Chatterjee A., Krinsky N.I. Characterization of products formed during the autoxidation of p-carotene. // Free Radie. Biol. Med. 1991. V. 10. p. 427-437.

93. Hansberg W., Aguirre J. Hyperoxidation states cause microbial cell différenciation by cell insulation from dioxygen. // J. Theor. Biol. 1990. Vol. 142. P. 201-221.

94. Hansberg W., de Groot H., Sies H. Reactive oxygen species associated with cell différenciation of Neurospora crassa. // Free Rad. Biol. Med. 1993. Vol. 14. P. 287-293.

95. Harding R.W., Huang P.C., Mitchell H.K. Photochemical studies of the carotenoid biosynthesis pathway in Neurospora crassa. // Arch. Biochem. Biophys. 1969. Vol. 129. P. 696-707.

96. Harding R.W., Shropshire W., Jr. Calcium inhibition of a heat-stable cyclic nucleotide phosphodiesturase from |Neurospora crassa. // Ann. Rev. Plant Physiol. 1980. Vol. 31. P. 217-238.

97. Harding R.W., Turner R.V. Calcium inhibition of a heat-stable cyclic nucleotide phosphodiesterase from Neurospora crassa. // Plant Physiol. 1981. Vol. 68. P. 745-749.

98. Herman, D. Synthesis, crystal and molecular structure of 3,4-di-t-butilthiophen. (1981) Proc. Natl. Acad. Sci. LI. S. A. 78, 7124-7128

99. Imlay J. A., Fridovich I. Suppression of oxidative envelope damage by pseudoreversion of a superoxide dismutase-deficient mutant of E.coli. // Arch. Biochem. Biophys. 1992. V. 296. p. 337-346.

100. Imlay JA. Linn S // DNA damage and oxygen radical r toxicity. Science. 1988. V. 240. P. 1302-1309

101. Inoue Y., Kobayashi S., Kimura A. // Cloning and phenotypic characterization > of a gene resistance against oxidative stress in Saccharomyces cerevisiae. J.

102. Ferment. Eng. 1993. V. 75. P. 327-331.

103. Jacob G.S., Orme- Johnson W.H. // Catalase of Neurospora crassa. 1. Induction, purification, and physical properties. J Am Chem. Soc. 1979. V. 18. P. 29672975

104. Jamieson D.J. // oxidative stress response of the yeast Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 1998. V. 14. P. 1511-1527.

105. Jamieson, D. Oxygen toxicity and reactive oxygen metabolites in mammals. (1989) J. Free Rod. Biol. Med. 7, 87-108

106. Jeum K.J., Lee-Kim Y.C., Yoon S., Lee, K.Y., Park I.S., Lee K.S., Kim B.S., Tang G., Russel R.M., Krinsky N.I. Novel synthesis of pyridazino4,5• 6.l,4]oxazin-3,8-diones // Arch. Biochem. Biophys. 1995. V. 321. № 1. P.167.174.

107. Jil-Hwan An. // Photosensitization of the yeast Phaffia rhodozyma at a low temperature for screening carotenoid hyperproducting mutants. Appl. Biochem. Biotechnol. 1997. V. 66. P. 263-268.

108. Johnson E.A., Schroeder W.A. Microbial carotenoids. in Adv. Biochem. Eng. Biotechnol. 1996. Vol. 53. P. 120-179.

109. Jones J.P. Oxidative stress/ Ed. H. Sies. N. Y.-London: Acad. Press. 1985. P. 151-195.

110. Kaneko T., Tahara S., Matsuo M. // Non-linear accumulation of 8-hydroxy2-deoxyguanosine, a marker oxidized DNA damage during aging. Mutat. Res. 1996. V.316. P. 277-285

111. Kanematsu S., Asada K. / Characteristic amino acid sequences of chloroplast and cytosol isozymes of CuZn-superoxide dismutase in spinach, rice and horsetail. Plant Cell Physiol. 1990. V. 31. P. 99-112.

112. Karam L.R., Bergtold D.S., Simic M.G. // Biomarkers of radical damage in vivo. Free Radicals Res. Commun. 1991. V. 12-13. P. 11-16

113. Kobayashi S., Miyabe S., Izawa S., Inoue Y., Kimura A. // Correlation of the OSR1 ZCR1 gene product and the intracellular glutathione levels in Saccharomyces cerevisiae. Biotechnol. Appl. Biochem. 1996. V. 23. P. 3-6.

114. Kono Y. Fridovich I. // Isolation and characterization of the pseudocatalase of Lactobacillus plantamm. J Biol. Chem. 1983. V. 358. P. 6015-6019

115. Krinsky N.I. Carotinoid protective against photooxidation. // Pure & Appl. Chem. 1979. Vol. 51. P. 649-660.

116. Krinsky N.I. Free radicals, oxidative stress, and antioxidants / Ed. T. Ozben. N. Y.: Plenum Press. 1998. P. 323-332.

117. Krinsky N.I. The antioxidant and biological properties of the carotenoids. // Ann. Of the New York Acad. Of Sciences. 1998. V. 854. p. 443-447.

118. Kritsky M.S., Belozerskaya T.A., Sokolovsky V.Yu. //Sov. Sci. Rev. D. Physico-Chem. Biol. 1994. Vol. 12. P.99-134.

119. Kritsky M.S., Sokolovsky V.Yu., Belozerskaya T.A., Chernyshova E.K. Developmental regulation of NAD+ kinase in Neurospora crassa. // Arch. Microbiol. 1982. Vol. 133. P. 206-208.

120. Kroll J.S., Langford P.R., Loynds B.M. Cooper-Zinc superoxide dismutase of Haemophilus influenzae and H.parainfluenzae. J. Bacteriol. 1991. V. 173. P. 7449-7457.

121. Kuo CF. Vlashino T. Fridovich I // a,|3-dihydroxyiso-valerale dehydratase: a superoxide-sensitive enzyme. J Biol Chem. 1987. V. 362. P. 4724-4727

122. Lauter F.-R., Russo V.E.A., Yanofsky C. Developmental and light regulation of eas, the structural gene for the rodlet protein for Neurospora. // Genes Dev. 1992. Vol 6. P. 2373-2381.

123. Lauter F.-R., Yamashiro C.T., Yanofsky C. Light stimulation of conidiation in Neurospora crassa: studies with the wild-type strain and mutants wc-1, wc-2 and acon-2 II J. Photochem. Photobiol. B: Biol. 1997. Vol. 37. P. 203-211.

124. Levina N.N., Belozerskaya T.A., Kritsky M.S., Potapova T.V. // Exp. Mycol.1988. Vol. 12. P. 77-79.

125. Li C., Sachs M.S., Schmidhauser T.J. Developmental and photoregulation of three Neurospora crassa carotenogenic genes during conidiation induced by desiccation. //Fungal Genet. Biol. 1997. Vol. 21. P. 101-108.

126. Li C., Schmidhauser T.J. Developmental and photoregulation of al-1 and al-2 structural genes for two enzymes essential for carotenoid biosynthesis. // Dev. Biol. 1995. Vol. 169. P. 90-95.

127. Liu S. // Generating, partitioning, targeting and functioning of superoxide in mitochondria. Biosci. Rep. 1997. V. 17. P. 259-272

128. Liu X.F. Elashvili I. Gralla E.B. Valentine J.S. Lapmskas P. Culotta V.C. // Yeast lacking superoxide dismutase. Isolation of genetic suppressors. J. Biol Chem. 1992. V. 267. P. 18298-18302

129. Loewen P.C., Switala J. // Purification and characterization of catalase HPII from Escherichia coli K12. Biochem.Cell Biol. 1986. V. 64. P. 638-646

130. Loewen P.C., Switala J. // Purification and characterization-of catalase-1 from Bacillus suhtilis. Biochem. Cell Biol. 1987. V. 65. P. 939-947

131. McCord JM. Fridovich I. / Superoxide dismutase an enzymic function for erythrocuprein (hemocuprein). J Biol Chem. 1969. V. 244. P. 6044-6055.

132. McCord JM. Keele BB. Fridovich 1./ An enzyme-based theory of obligate anaerobiosis: the physiological func'tion of superoxide dismutase. Proc Natl Acad Sci USA. 1971. V. 68. P. 1024-1027.

133. Meissner G., Delbruck M. Carotenes and retinal in Phycomices mutants. // Plant Physiol. 1968. V. 43. N. 8. P. 1279-1283.

134. Michan Sh., Lleidas F., Baldwin J.D., Natvig D.O., Hansberg W. // Regulation and oxidation of two large monofunctional catalases. Free radic. Biol. Med. 2002. V. 33. P. 521-532.

135. Mitzka-Schnabel U., Rau W. The subcellular distribution of carotenoids in Neurospora crassa. //Phytochemistry. 1980. Vol. 19. P. 1409-1413.

136. Mitzka-Schnabel U., Rau W. Subcellular site of carotenoid biosynthesis in Neurospora crassa. // Phytochemistry. 1981. Vol. 20. P. 63-69.

137. Moody C.S., Hassan H.M. // Mutagenicity of oxygen free radicals. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1982. V. 79. P. 2855-2859.

138. Moore M.M., Breedveld M.W., Autor A.P. // The role of carotenoids in preventing oxidative damage in pigmented yeast Rhodotorula mucilaginosa. 1989. V. 270. P. 419-431.

139. Moye-Royley W.Scott Regulation of transcriptional response to oxidative stress in fungi: similarities and differences. Eukaryotic cell, 2003 ,V.2, No.3, P. 381389.

140. Muller B.T., Russo V.E.A. // Nitrogen starvation or glucose limitation induces conidiation in constantly shaken liquid cultures. Fungal Genet. Newsl. 1989. Vol. 36. P. 58-60.

141. Munkres K.D. / Selection and analysis of superoxide dismutase mutants of .Neurospora. Free Radical Bio. Med. 1992. V. 13. P. 305-318.1. Mutat. Res. 214,81-88

142. Natvig D. O., Sylvester K., Dvorachek W.H., Baldwin J.L. // Superoxide dismutases and catalases. The Mycota III. 1996. Springer-Verlag. Berlin. Heidelberg. P. 196.

143. Nelson R.E., Selitrennikoff C.P., Siegel R.W. Results and problems of cell differentiation / Eds. Reiner J., Holzer H. Berlin: Springer-Verlag. 1975. P. 291-300.

144. Nieuwenhuis M., van den Ende H. Sex specificity of hormon synthesis in Mucor mucedo. // Arch. Microbiol. 1975. V. 102. № 2. P. 167169.

145. Ninet L., Renaut J., Tissier R. Isolation of new antibiotic with antitumor activity rubidomycin. // Biotechnology a. Bioengineering. 1969. V. 11. p. 1195.

146. Ninnemann H. Photostimulation of canidiation in mutants of Neurospora crassa. // J. Photochem. Photobiol. B: Biol. 1991. Vol. 9. P. 189-199.

147. Olson J. A. Molecular actions of carotenoids. // Ann. Of the New York Acad. Of Sciences. 1993. V. 691. p. 156-166.

148. Olson J. A. The convert of radioactive p-carotene into vitamine A by the rat intestine in vivo // J. Biol. Chem. 1961. V. 236. p. 349-356.

149. Olson J. A., Krinsky N.I. Introduction: the colorful, fascinating world of the carotenoids: important physiologic modulators. // Faseb J. 1995. Vol. 9. P. 1547-1550.

150. Pahl H.L., Bawerle P.A. Oxygen and the control of gene expression. // BioEssay. 1994. Vol. 16. P. 497-502.

151. Parvin S.G., Sivakumar B. Nutritional status affects intestinal carotene cleavage activity and carotene conversion to vitamine A in rats. // J. Nutr. 2000. V. 130. p. 573-577.

152. Perkins D.D., Glassey M., Bloom B.A. position of linkage group V markers in chromosome 2 of Neurospora crassa. // Can. J. Genet. Cytol. 1962. Vol. 4. P. 187-205.

153. Qin X., Zeevaart J.A.D. The 9-cis-epoxycarotenoid cleavage reaction is the key regulatory step of abscisic acid biosynthesis in water-stressed bean. // Proc. Natl. Acad. Sci. 1999. V. 96. p. 15354-15361.

154. Rau W. Photoregulation of carotenoid biosynthesis / Eds. J.W. Porter, S.L. Spurgeon. John Willey & Son. 1983. P. 123-157.

155. Ricci M., Krappmann D., Russo V.E.A. Vibrational density of states of the hydrogen sites in hydrogen-bonded molecular solids. // Fungal Genet. Newsl. 1991. Vol. 38. P. 87-88.

156. Rosner J.L., Storz G. Regulation of bacterial responses to oxidative stress. // Curr. Top. Cell. Regul. 1997. Vol. 35. P. 163-177.

157. Royer J.C., Yamashiro L.R. Meiotic behavior and linkage relationship in the secondarily homothallic fungus Agaricus bisporus. // Fungal Genet. Newsl. 1992. Vol. 39. P. 76- 79.

158. Ruddat M., Garber E.D. In: Secondary metabolism and differentiation in fungi. Ed. Bennett J.W., Ciegler A. 1983. Marcel Dekker inc. New York. P. 95-152.

159. Ruiz-Hidalgo M.J., Benito E.P., Sandmann G., Eslava A.P. The phytoene dehydrogenase gene of Phycomices: regulation of the expression by the blue light and vitamin A. // Mol.Gen.Genet. 1997. V.253. N. 6. P. 734-744.

160. Russo V.E.A., Pandit N.N. Development: the molecular genetic approach / Eds. V.E.A. Russo, W.E. Timberlake. Berlin: Springer-Verlag. 1992. P. 88102.

161. Ryter S.W., Tyrrell R.M. Singled molecular oxygen: a possible affector of eucariotic gene expression. // Free Rad. Biol. Med. 1998. Vol. 24. P. 15201534.

162. Sambrook J., Fritsch E. F., Maniatis T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. / N.Y.: Cold Spring Harbor, Laboratory Press, 1989. V. 3. Appendix A.l.

163. Sandman G., Kuhn S., Boger P. Evaluation of structurally different carotenoids in E.coli trasformants as protectants against UV-B radiation. // Applied and Enviromental microbiol. 1998. V. 64. p. 1972-1974.

164. Sargent M.L., Kaltenborn S.H. Use of liquid nitrogen and high ionic strength for the isolation of functional polyribosomes from Neurospora crassa. // Plant Physiol. 1972. Vol. 50. P. 171-175.

165. Schmit J.C., Brody S. Biochemical genetics of Neurospora crassa conidial germination. // Bacterid. Rev. 1976. Vol. 40. P. 1-41.

166. Schroeder W.A., Johnson E.A. // Antioxidant role carotenoids in Phaffiarhodozyma. J. General Microbiol. 1993. V. 139. P. 907-912.

167. Schubert J., Wilmer J.W. // Does hydrogen peroxide exist "free" in biological systems? Free Radicals Biol. Med. 1991. V. 11. P. 545-555

168. Schwartz S.H., Tan B.C., Gage D.A., Zeevaart J.A.D., McCarty D.R. Specific oxidative cleavage of carotenoids by VP 14 of maize. // Science. 1997. V. 276. p. 1872-1874.

169. Sen C.K., Packer L. Antioxidant and redox regulation of gene transcription. // Faseb J. 1996. Vol. 10. P. 709-720.

170. Shatzman A.R., Kosman D.J. / Biosynthesis and cellular distribution of the two superoxide dismutases of Dactyliiim dendroides. J Baclcriol. 1979. V. 137. P. 313-320.

171. Sigler K., Chaloupka J., Brozmanova J., Stadler N., Hofer M. / Oxidative stress in microorganisms. Folia Microbiol. 1999. V. 44. P. 587-624.

172. Sistrom W.R, Griffiths M., Stanier R.Y. On the physical state of the introcellulary accumulated substrates of p-galactoside-permease in E.coli. // J. Cell. Comp. Physiol. 1958. V. 48. p. 473-515.

173. Smirnova Y., Muzyka N., Ylukhovchenko M., Oktyabrsky O. Effects of menadione and hydrogen peroxide on glutathione status in growing E.coli. // Free Rad. Biol. Med. 2000. V. 28. P. 1009-1016.

174. Smith M.W., Doolittle R.F. / A comparison of evolutionary rates of the two major kinds of superoxide dismutase. J Mol. Evol. 1992. V. 34. P. 175-184.

175. Springer M.L. Genetic control of fungal differentiation: the three sporulation pathways of Neurospora crassa. // BioEssays. 1993. Vol. 15. P. 365-374.

176. Stadtman E.R. // Protein oxidation and aging. Science. 1992. V. 257. P. 12201224

177. Stahl V., Sies H. / Antioxidants defense: vitamins E and C and carotenoids. Diabetes. 1997. V. 46. S14-S17.

178. Stahl W., Ale-Agha N., Polidori M.C. Non-antioxidant properties of carotenoids. // Biol. Chemistry. 2002. V. 383. p. 553-558.

179. Subczynski W.K., Markowska E., Sielewiesiuk J. Effect of polar carotenoids of the oxygen diffusion-concentration products. // Biochim. Biophys. Acta. 1991. Vol. 1068. P. 68-72.

180. Sumiki U., Miyao K. Gibberellin A7. A new fungal gibberellin. // Bull. Agric.

181. Chem. Soc. 1959. Japan. V. 24. p. 23.

182. Sun Z., Gantt E., Cunningham F.X. Jr. Cloning and functional analysis of the p-carotene hydroxilase of the Arabidopsis thaliana. // J. Biol. Chem. 1996. V.271. № 40. P.24349-24352.

183. Sutter R.P., Grandin A.B., Dye B. D., Moore W.R. (-) Mating type-specific mutant of Phycomices defective in sex pheromone biosynthesis. // Fungal Genetics and Biology. 1996. V. 20. № 5. P. 268-279.

184. Tan B.C., Schwartz S.H., Zeevaart J.A.D., McCarty D.R. Genetic control of abscisic acid biosynthesis in maize. // Proc. Natl. Acad. Sci. 1997. V. 94. p. 12235-12240.

185. Thirkell D. Growth and pigmentation of Micrococcus radiodurans. // J. gen. Microbiol. 1969. V. 55.337. p.

186. Thomas S.A., Sargent M.L., Tuveson R.W. // Photochem. Photobiol. Inactivation of normal and mutant Neurospora crassa conidia by visible light and near-UV. 1981. Vol. 33. P. 349-354.

187. Toledo I., Aguirre J., Hansberg W. Aerial growth in Neurospora crassa: characterization of an experimental model system. // Exp. Mycol. 1986. Vol. 10. P. 114-125.

188. Toledo I., Noronha-Dutra A., Hansberg W. Loss of NAD(P)-reducting power and glutathione disulphide excretion at the start of induction of aerial growth in Neurospora crassa. // J. Bacteriol. 1991. Vol. 173. P. 3243-3249.

189. Toledo I., Randel P., Hansberg W. Redox imbalance at the start of each morfogenetic step of Neurospora crassa canidiation. // Arch. Biochem. Biophys. 1995. Vol. 319. P. 519-524.

190. Tuttobello L., Foppen F.H., Carilli A. Carotenoids in some ultraviolet mutants of Epicoccum nigrum link. //Appl. Microbiol. 1969. V. 17. 847. p.

191. Van den Ende H., Stegwee D. Trisporic acid synthesis in mated cultures of the fungus Blakeslea trispora. // Bot. Rev. 1971. V. 37. №1. P. 22-36.

192. Vliet T. van, Schaik F. van, Berg H. van den, Schreurs W.H. Effect of vitamine A and p-carotene intake on dioxigenase activity in ratintestine. // Ann. N.Y. Acad. Sci. 1993. V. 691. p. 220-222.

193. Vogel, H.J. Distribution of lysine pathways among fungi: evolutionary implication. // Amer. Nature. 1964.V. 98, P. 435-446.

194. Weinberg E.D. iron requirement for Pseudomonas cultures. // Adv. Microbiol. Physiol. 1970. V. 4.1. p.

195. Williams R.P., Hearn W. Enzimic formation of prodigiosin analog by a cellfree preparation from Serratia marcescens. // Antibiotics. 1967. V.2. 410. p.

196. Wolff S.P., Gamer A., Dean RT. Fragmentation of the proteins by free radicals and its effect on their susceptibility to enzimic hydrolyses. // Trends in Biochem. Sci. 1986. Vol. 11. P. 27-31.

197. Young A.E., Lowe E.M. Antioxidant and prooxidant properties of carotenoids. //Arch.Biochem. Biophys. 2001. V.38. № 1. P.2027.

198. Zechmeister L., Petracek F.J. The hydrolytic cleavage products of boron trifluoride complexes of P-carotene, some dehydrogenated carotenes and anhydrovitamin A. // J. Am. Chem. Soc. 1956. V. 78. p. 3178.

199. Zeevaart J.A.D., Creelman R.A. 7,-hydroxi (-)-R-abscisic acid. // Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 1988. V. 39. P. 439.

Информация о работе

Соколов, Александр Вячеславович
кандидата биологических наук
Москва, 2004
ВАК 03.00.04

Диссертация

Роль каротиноидов в антиоксидантной защите грибной клетки - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы