Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование функций каротиноидов у животных

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Исследование функций каротиноидов у животных"

ЮСКОВСКШ ГОСУДАРСТВЕННЫМ УНИВЕРСИТЕТ имэш М.В.ЛОМОНОСОВА

БИОЛОГИЧЕСКИМ ФАКУЛЬТЕТ

Иа г 1ввх рукописи • УДК 677.336: 577.116

ВЕРШИНИН Александр Олегович

«

ПССЛЕДОШШЕ СУШЩИ! КАРОТИПОПДОВ У ЖИВОТНЫХ

(03.00.02 - биофгаика'

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидвта биологических наук

Москва 1992

Работа шпорена на кафедре биофизики Биологического факультета Московского Государственного Университета им. М.В.Ломоносова.

Научный руководитель: доктор физ.-ыат. наук, профессор В.З.Пащенко

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук А.Я.Потапенко кандидат биологических наук И.Н.Стадничук

Ведущая организация: Инс лтут биоорганической химии АН СССР

Защита состоится 1992 года в часов

на заседании Специализированного Совета К 053.05.§8 при Московском Государственном Университете ем. М.В.Ломоно'сова по адресу: Москва, Ленинские Горы, Биологический факультет, аудитория

С диссертацией можно ознакомить^ в библиотеко Биологического факультета МГУ.

. Автореферат разослан Ученый секретарь Совета,

\ г'

дс. хор биологических наук

\

1992 года.

Б.А.Гуляев

' АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ. Яркая окраска губок, -житий, 1'кораллов, раков, моллюсков, иглокожих, асцидай, рыб, амфибий, рептилий и птиц в большинстве случаев обусловлена каротинои-дамь К сегодняшнему дню описаны сотни представителей это^о класса-пигментов, присущих огромному количеству видов яшотшх, исследованы пути их-метаболизма, в том числе их роль как предшественников витамина А. Однако, сейчас yse не вызывает сомге-пия то, что, помимо провитамшшой или пигментирующей роли, каротиноида в организмах животных из большинства. систематических групп (преимущественно беспозвоночных и низши позвоночных) имеют и другие, до сих пор неизвестные функции.

. Р"д гипотез прэдпола1 ает участие каротиноидов в осущест-вленин ваянейших физиологических а биохимических процессов. Tait, различными авторам предполагается, что они входят в состав электронно-транспортной цепи, действующей в условиях анок-сии у моллюсков; играют- роль депо кислорода в животных' клетках; участвуют в процессах накопл зия'кальция; наконец. Они изучаются в связи с'Явлением экстрарэтинной фоторецепции у моллюсков.-.Столь широкий спектр предполагаемых функций свидетельствует о сложности и .одновременно о недостаточной из>-юнности 'вопроса.' Отдельным направлением в пауке является исследование функции каротиноидов в. оогенезе и эмбриогенезе - их присутствие в репродуктивных орган'ах (обычло у самок) является характерным для многих видов ишотних, вютная человека.

очевидно, сведения об участии каротиноидов в фундаментальных процессах, протекакшдх в швотном организме, заслуживают пристального внимания, à.сама проблема - тщательного исследования: Кроме того, дополнительную актуальность вопросу о функциях каротиноидов у кивотных'придают факты, свидетельствующие о лечебной ценности этих пигментов, в первую очерг ъ об их противоопухолевой активности. ■

ЦЕЛЫ}- данной работы явилось изучение вопроса о невитаминных функциях каротиноидов у животных. Ь свете этого были' поставлены следуивда нинкратше УАДА4И:

1. Выделить и химически идентифицировать каротиноида из тканей различных видов моллюсков и асцидий

2. Изучить распределение каротиноидов между органами и субклеточными фракциями.

3. Исследовать каротиноида in situ с помощью абсорбционной спектроскопии и спектроскопии РКР.

- 4. Изучить зависимость всех вышеуказанных характеристик от ©гаиологаческого состояния животных и експеримента. па

-г-

условий температуры, наличия кислорода и др.

5. Исследоват* в модельных системах взаимодействие каротиноидов из ханей животных с различными формами кальция.

6.' Исследовать каротиноиды в ходе эмбрионального развития морского ежа спектроскопическими методами.

7. Исследовать электрохромные свойства каротипоидов в нерве, развита метод регистрации изменений трансмембранного потенциала и поверхностного заряда мембрЕШ нерва о помощью спектроскопии резонансного комбинационного рассеяния карОд ..шидгч.

ЛДУЧНАЯ НОВИЗНА РАБОТЫ. Идентифицированы каротиноиды у 9 видов моллюсков и 2 видов асцидий; они представлены исключительно ксантофиллами, которые находятся в all-írana конформации и не связаны с белками. Установлено, что основной пул каротинои-' дов в клетках моллюсков локализован в различных клеточных мембранах. Получены данные, свидетельствующие о том, что функция каротиноидов в соматических тканях изученных животных не связа-; на с их химическими превращениями. Выдвинуто и обосновано пред-■ ставлв! е об участии каротиноидов в поддержании гомеостаза вязкости клеточных мембран кивотных. Предложена методика получения препарата поверхностной .лембраны клеток жаберного эпителия морских моллюсков с помощью у 'дуцируемого ЭДТА экзоцитоза. Разра 1 ботаны основы метода регистрации изменений трансмембранного потенциала и поверхностного заряда мембран нервных клеток с помощью спектроскопии РКР каротиноидов. Показано наличие сильногр локального электрического поля, действующего на молекулы пигмента в мембране аксона. В ходе эмбриогенеза морского ежа обнаружено лишение содержания all-traaa формы каротиноида (эхинено-на) в эмбрионе, что может указывать на антиоксидайтную роль этого пигмента процессах развития. ¡

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЦЕННОСТЬ РАБОТЫ. Результаты исследования внутриклеточной лсализации, состояния ln situ и возможных функций карогпюидов у изученных модельных объектов важны для понимания механизмов противоопухолевой активности !и других терапевтичес-♦ ких эффектов этих пигментов. Предложенная методика получения везикул поверхностной мембраны клеток жаберного эпителия проста : и эффективна, она может быть применена в исследованиях процессов трансмембранного ионного транспорта и осморегуляции. Метод ре-лстраци.. изменений напряженности внутримембранного элоктри-■ некого поля в мембранах нервны* клеток с помощью спектроскопии РКР каротиноидов ценен тем, что с его помощью можно напрямую заре, утрировать изменения поверхностного 8аряда мембраны.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ. Основные результаты-работы докладывались

aa семинарах кафедры биофизики Биологического фэкулм :а МГУ и заседаниях секции биофизика.МОИП. По теме диссертации опубликовало 4 работы, одна находится в печати.

OEffií И СТРУКТУРА РАБОТЫ. Диссертация состоит из введения, трзх Тлав, заключения, выводов и списка литературы (138 ссылок)- Работа содержит 124 страница машинописного текста, включая G таблиц, 10 рисунков и 4 микрофотографии.

Первая глава представляет собой обзор ллторатуры, посвя-цепниЯ фяоичосиЕМ и химическим свойствам каротшорпов и различным представлениям о роли эют пнгмэнтов у жявотнъх.

ИШНШМ II Í.GT0CI

1 . С3~ciciu исследования. х. Пресноводные моллюски: Unto ptcto-гтсп. Unto tunl&is, Ano$onta сygnea, Dre i aserta polytnarpha (Biva-Ivia), Vlviparus canteatus, Mpullarla gtgas (Gsgtropoua). Морские подписки (EC0 - представителя Bivalvla): Uytllua gallopro-vtnctalta, L'cdtolaa modíolm, Crenanytilu9 grjyanua и Htzuho-' poeten yessoensls. 2. Асцвдин ЯаЮс; ithta aurantlm и Styela clava. '3.. Зкбрпонн морского ока Strongylocentrvtus Intermsdlua. 4. Сэдалгсзшй нерв травяной лягушки Item temporaria.

2 Зхстргетпя, разделение п дденпфвггцЕЯ керотшювдов. ¿йгменты рездоляля с помощью тонкослойной хроматографии на пластинах си-явкагвль/крахкал или силикагель G в системе петролейный эфир (Т кип. <40°-60°С)/ ацетон в ссотьоаечкн от 7:3 до 9:1 (о/о). Для идентификации каротиноидов и других лкпидов использовали хр_ча-тогрефш ео свидетелями, реакции на функциональные группы, оп-рэдэлошга коэффициентов распределения пигментов в системе 95% мзтанол/гексен, абсорбционную и ИК-спектроскопию, в отдельных случаях - масс-спектрометрию. '.■'"■..3 Субглетсшса фракционирование: Полученный стандартными методами суммарный мембранный препарат' гомогенат кабер моллюсков центрифугировали 12ч в линейном градиенте сахарозы (0.G - 1.9 М) при IOOOOOxg в бакет-роторе.

4. Спектроскопия коибкппцкошюго рассеяния. Для возбуждения КР' использовались линии аргонового лазера 457.9; 472.7; 476.Б; 403.0; 495,5; 514,5 нм, а также гелий-кадаиевы!» лазер (441.6 нм). Мощность луча составляла приблизительно 20 мВт, диаметр пятна света на образце - около 50 (im. Выделение лгаши КР и сканирование спектра осуществлялось с помощи монохроматора ДФС-24. Регистрирующее устройство - фотоэлектронный укноштвль ФЭУ-79, работающий в режиме счета фотонов. Спектры накпгшгеали п анализаторе НТА-1024. КР-спектры нерва снимал;! в специальной ккв?те с раствором Ркнгера. '

-45 Кикроскопия и ыикроспектроматрая. Локализацию отложений кальция осуществл ти по методу Косса. Абсорбционные микроспектрн в облает 380-800 нм снимали и обрабатывали на ыикроспектральном анализаторе Opton. Диаметр зонда - от I до 10 цга. Для электронной микроскопии образцы фиксировали 2.51 глутаровым альдегидом на фосфатном буфер» с сответствущей конкретному объекту осно-лярностью (обеспеченной сахарозой) и постфиксировали 1% ОаО^. Препараты заливали в Ероп-812, окрашивали уранилацетатом и докрашивали цитратом свинца.

6 Определение кальцин. Содержание кальция в пробах тканей определяли после озоления атомно-абсорбци^ншш методом.

РЕЗУЛЬТАТЫ

I Содержание и распределение каротнновдоь в организмах

моллюсков и вецидий. Полученные данные свидетельствуют о том, что каротиноиды у изученных видов содержатся в самых различию оргайах, и четкой закономерности в их распределении внутри организма не обнаруживается; ето указывает на некую общую рол] каротш: ладов в клетках животных, не связанную со специфшо! конкретных тканей и органов. Следует отметить полное отсутстви< какой бы то ни было корреляции между распределением в организм*

моллюсков кальция и каро ноидов, что противоречит предстввле~чям Шетруняка, 19791 (табл I).

имещимс

Таблица I. Содержание каротиноидов и кальция в некоторых органах двух видов моллюсков (ошибка не более 10%).

i каротиноиды, мг/IOOr кальций, мкг/'г ,

Modtolu" жабры ÍT.0 82

modlolus край мантии j*.6 102

гепатопанкреас Р 158

Ct -nomytllua grayanua жабры край мантии центр мантии гепатопанкреас 1:3б i, 3 11.9 95 . 121 72 112

Исследование содержания каротиноидов^ в организме Иге1ааел роХутагрЬа в зависимости от сезона года показало, что у отлм лонк .л. зимой моллюсков содержание пигмента крайне низкое I ьсех рргаяах (0.1-0.3 мг/100г). При помещении животных в аквг

ряум о температурой 17°0 с момента начала обильного 'зрмлания хлореллой происходило бист1Je (в течение нескольких дней) накопление каротиноидов в тканях до уровня, характерного для дрейс-сен, отловленных летом (27,6 мг/100г).

После недельного голодания содержание каротиноидов в организме моллюсков и асцидий оставалось неизменным. Не наблюдалось также изменения содержания каротиноидов в изолированных пэрекн-вавдих препаратах жабер 11осИо1иа тсхИоХив и V. ро~1утогр/ш в течение 40 ч. Эти факты указывают на то, что функция каротиноидов у данных тавотных не связана сих необратимым разрушением.

2 Ддеппфпшция каротиноидов у различных видов животных

'И-ентификация каротиклшов показала, что в соматических органах и тканях всех исследованных видов присутствуют только ксантофиллы,.от 3 до 10 у разных видов. Всего у 9 видов моллюсков п 2 видов асцидий была обнаружено и идентифицировано 17 каротиноидов, Совокупности пигментов были идентичными для всех' исследованных органов у каждого вида Исключением являются пищеварительные органы, в которых обнаруживаются каротины, имеющие, очевидно, непосредственно пищевое происхождение. Нам на удалось обнаружить в тканях изученных видов животных никаких соединений карогалоидной природы о укороченной (менее 9 сопряжениих связей) поливновой цепью, детектируемых по спектрам поглощения. Было обнаружено, что, несмотря на такое разнообразие каротиноидов, экстракты суммарных липидов у всех изученных видов содержат одно и то и УФ-поглощапдее (главный максимум в гексане 269 нм) вещество, считающееся в рамках теории о кисло-родзапасащей функции каротиноидов [Карнаухов, 1988) формой ка-ротиноида, связавшей кислород по одной из двойных связей. Оно располагалось на хроматограммах вплотную следом за холестерином. По данным масс-спектрометрии молекулярная масса этого соединения составляет 384 а.е.м. Кроме того, было установлено, что оно образует нерастворимый в этаноле комплекс с дигитонином (реакция на холестерин и родственные соединения). Перечисленные' результата позволяют нам идентифицировать указанное вещество как 7-дегидрохолестерин.

Итак, для каждого из изученных видов югеотиых характерно присутствие в тканях набора из нескольких ксантофиллов. Очевидно, чтб любая теория о роли каротиноидов у животных должна объяснять'* необходимость наличия ьолярных группировок па концах молекул каротиноидов для их функционирования. 3 Научение взаимодействия каротиноидов из тканей татотшх с солями калыяя. В связи с гипотезой об участии каротине!, ли в

-б- ~

процессах накопления кальция, которая базируется на утвэрздензш

0 способности г тих пигментов селективно сорбироваться на солях кальц. : [Петруняка, 197Э), представлялось необходимым вкспери-. ментально проверить указанное утверждение. Было обваругэио, что в чистых органических растворителях (хлороформ, ацетон, ыэта-, нол, этанол) каротшоида на связываются в течение" сколь угодно долгого и 1иода времени ш с аморфными карбонатом или фосфатом, кальция (как с образованиями непосредственно в растворе, так а с добавленными в него в готовом виде), ни с гедроконапэ-чтом. или известняковым порошком, приготовленным из раковин- ыоллхс-; ков. Было установлено, что стопроцентнойсорбции, мокло добиться лиаь в достаточно полярной среде (такой, как 60 % этанол). Однако, проведенные эксперименты показали, что в еткх условиях не меньшей способностью к сорбции на солях кальция обладают и все остальные липиды тканей моллюсков. Очевидно, наблюдаемую неспе-цифиЗескую сорбцию стимулирует повышение полярности среда; ли-, пида связываются на поверхности, когда пребывание в растворе станов. ;ся энергетически менее выгодным.

Препараты мантий Dretaaena polymorpha и Crenanytilua gray-апиз были исследованы ьЬ методу Косса для выяснения локализации отложений нерастворимых олей кальция. Отложений связанно! кальция в пигментных гранулах не было обнаружено. Окраска была связана с диффузно распределенными частицами, морфологически неопределенными на световом уровне. ¡ , ;

На основе этих результатов, а также учитывая отсутствие какоч бы то ни было корреляции мозду распределением каротшю-адоь и кальция в организме моллюсков (табл. I), следует вывод о' том, что гипотеза об участии каротиноидов в процессах связывания и накопления кальция не подтверждается.

1 Исследование состояния каротиноидов в тканях впвотшх штсдои спектроскоп! FKP. Спектры РКР каротиноидов в тканях моллюсков, чсцидиЯ и эмбрионов морского ежаполученные In ai tu при температуре жидкого азота изображены на рис. I. В случае Uodlo-

* lua modiolus были исследованы различные органы и ткани - кабры,' мантия, г латопанкреас - спектры оказались идентичными.

В первую очередь, следует отметить, что во всех случаях спектры срответствуют all-írcrta нонформации молекул каротинои-; дой, так как полоса в районе 1220 см-*, которая в случае )!/з-конформации примерно равна по интенсивности полосе 1160 см-1 (Lutz et al., 19781, выражена слабо.

Зо вторых, сравнение спектров каротиноидов in sttu со спектрами каротиноидов в составе экстрактов тканей в органических

растворителях (этанол, гексан, хлороформ) показывает ..шнималь-нао отлзгогя ¡гэгду этгаи спектраш (при таком сравнении спектры регистрировались при 20°С). Отличия во всех случаях заключались в разшзцэ з 2-6 см"-1 в пологэнии полос, соответствующих валент-шг-i колебаниям С=С и С-С связей. Является очевидным, что такие различия определяются известной корреляцией мэгду положением максимума спектра поглощения я гологапяем этих полос (в первую очередь, С=С колебаний) [Кэрл, IS353. Этот факт указывает на то, что со всех изучению: случаях каротиноида. ir видимому, не связана с бвлквот, таг: как избэстео, что связь с оелком отрекается структуре спектров И£Р tBrltton et al., 1932; Goodwin, 1984, "erlln, 1987; Berlin et al.. 1987; Clark et al., 19901.

а 1ÍM

not l^y V-

1013 jj

Ряс. I. Спзктри FKP каротиноидсв в тканях гзсотгспс. а - Еабра CretEcena polymorJvi, Ъ - {.ашэчшй местах StyeZa clava. Хех=488нм Шйрз - пологзнпе максимумов полос (см-1).

Особоэ пплданио обращалось на область скелетных колебаний -1000-900 см""1, в связи с данными (НауаяМ et al.', 1969) о том, что полсгеткз а относительная интенсивность слабых полос из этого региона чувствитольш к доформциям скелета каротиноида на белке, по спектры в этой области были абсолютно шшнти»"ч 1п el tu и в растворе.

5. Влияние внешних факторов на состоите каропшсшдов в организме моллюсков. Результаты экспериментов по влияны> аноксии не содер. ..ние каротиноидов в тканях моллюсков представлены £ табл.2. Видно, что если следовать гипотезе о кислородзапасапце! функции каротиноидов, данные изменения содержания кароткновдоЕ не могли бы обеспечить ткани моллюска необходимым количество;, кислороде поскольку.измеренная нами интенсивность дыхания щи 20°С у ип1о составляет 0,24 мг 02/ч, у 0ге1ззепа 0,31 мг/ч ш грамм сырого веса. Если принять, что при аноксии об ,лй уровэш метьоолизма снижается на порядок, а I моль каротиноидов может связать несколько молей кислорода, то даже в этом случае расхождение между необходимым и действительным изменением содерзанш пигмента достигает тысячи раз.

Таблица 2.

Динамика содержания каротиноидов в тканях при аноксии.

аноксия, Ч. М] саротиноиды, "■Ж (на сырой вес)

о ипЮ 2 р1аогт, 4 нога ' 8 30 1,25 1.0 1.2 1.6 1,55

жа( ¡ге1ззепа 0 7 роТутогрЬа 30 8 ¡ры печень [Б 6,8 ]з 5,9

Все величины в таблице являются!средними из трех повторностей. Разброс значений не превышал 1% от среднего.

О действительном смысле наблюдаемых изменений содержани пигментоь в тканях трудно судить, так как при аноксии проис ходит перестройка всего метаболизма, и неясно,- в какой из про ипссов вовлечены при этом каротицоиды. Противонаправленные из менения содержания пигментов в печени и жабрах дают, возможност предположить, что в основе наблюдаемых изменений лежит перерас пре^ление каротиноидов меаду органами, ражныы результатом яв ляеиия то, что изменения соотношения между различными каротине идами при аноксии не наблюдалось.

Для изучения зависимости содержания каротиноидо! з тканях от температуры моллюски, •адаптированные к температуре 20сС, помещались' в воду о другой температурой па 2 ч- Результат представлен пз рис.2. Как видно из графика, чем ниже температура инкубации моллюсков, тем ниже содержание каротиноидов. Нарушение этой зависимости происходит лишь при 2°С; очевидно, это связано с розгам охлаждением моллюсков, которое не давало гозмогности организму адаптироваться. Был

рис.2. Зависимость содержания каротиноидов в ноге Unto ptoto-пга от температур!. /

проведён отдельный эксперимент с целью прояснить механизм наб-лвдаемнх изменений содержания/пигментов в тканях. Для етого определяли содержание каротиноидов параллельно в ноге [into и,в печени, при температурах 20 и 8°С. Било установлено, что за 2/ч пребывания при 8°0 содержание каротиноидов в ноге падает от 1,3 до 0,8 мг/ЮОг (среднее отклонение -0,08 мг/100г в трех грушах по 7 моллюсков), а в печени повышается от -',0 до 7,6 мг/100г, (±0,32 мг/100г). Хотя изменения концентрации в печени статистически недостоверны, показательно уже то, что они не имеют той же направленности, что и в ноге. Таким образом, и в этом случае, видимо, имеет место транспорт пигментов между печенью н другими оргенами. В экспериментах с температурой также не наблюдалось ни изменений молярного соотношения между различными каротиноидвмя, ни их изомеризации.

Логично предположить, что перераспределение каротиноидов между органами, наблюдаемое при изм -нении экмтеримонталыг • условий, связано о функцией, выполняем Я этими пигментами. Отсюда

следует вывод: функционирование каротиноидов в тканях изученных вэдов животны- ,нэ связано с ех взаимопревращениями, ток как на наблад этся изменения молярного соотношения меяду различными каротиноидами при изменении сварного содержания в конктютных органах. Если учесть ещэ, что у моллюсков и асцвдай не обнаружено соединений - "ронзводннх коротиноидов, следует вывод, что функции каротиноидов у атих животных не связаны с их химрескн-ки превращениями. .

6. Исследование внутриклеточной локалкгощи ксротЕаолДоа.

оолышшство объектов исследования было просмотрено под световым микроскопом в виде давленных препаратов. К их числу относятся жабры и мантия всех'изучавшихся й работе видов двустворчатых моллюсков, нервные ганглии АпобоМа су&геа, мышечный мешок и глотка двух видов асцидий. Во всех случаях каротиноид-ная пигментация визуально обнаруживалась только е гранулярных отруктурах диаметром от 0.5 до 15 мкм. .

Микроспектральному исследованию были подвергнуты пигментные гр )улы в клетках мантии 1)ге1ааепа и глотки На1осуШМа. Полученные спектры характеризуются шир9кими максимумами, одви-нутыми на 10-15 нм в ^мнноволоновую область по сравнению со спектрами соответствующих гзротиноидов в этаноле. Важной черте, этих спектров является то, что в них не! наблюдается присутствия полосы Соре, характерной для гемопротеинов. Это существенно, так как локализацию каротиноидов в рамках представлений об ар. биоэнергетической роли связывали с "цитосомами", которые участвуют в энергетическом обмене и в которых поэтому должны присутствовать цитохромы [Zs.-Hagy, 1979, Карнаухов, 13333.

Дифференциальное центрифугирование,гомогенатов Тканей еыя-вило, что в жабрах Оге1ззепп и Иой1о1иа\ ноге ип1о, а такко кишечных мешках и внутренних органах обоих изучавшихся видов асцидий каротине, тд локализованы в ррганаллах клеток и отсутствуют - цитозоле. ( |

С помоа^ю фракционирования/в непрерывном градиенте сахарозы были изучены жабры дгеЬааепа'и иоЛ1о1из\ Были выделены следующие фракцп. I. Флотирующая к поверхности фракция низкой плотности. 2. Наиболее обильная фракция в диапазоне концентраций сахарозы 1.1-1.25 М. 3. Фракция из области с концентрацией 1.7 М. 4. Следующая непосредственно за предыдущей фракция с немного 'ольшей плотностью. Спек'гры поглощения фракций I и 2 соответствуют каротиноидам, с размытым максимумом ^ области 460 нм, полоса Ооре отсутствует. Фракция 3 - желтовато-серого цвета.;.В спектре поглощения теж-коричневоЯ фрзхаиц 4 к;деля?тся полоса

¡opa в районе 410 им.

Фракция I, очевидно, представляет собой запасные лкпида слеток, ©ракцня 2 бала подвергнута э^октроппо-гггафоскопнчос-сому исследовании. Еэ составляв? момбраянно вэзикулы различного размера. Субклзточигэ структур« из фракции 3 остались неиденти-¡^щироввзпшгл, Но шзшзает сокяопиЯ то, что ко фракция 4 лока-тазоваш. всэ ишшзвдряа ¡схо'ю;: набор, так как гол* ко в пей якктроксошчоскл обнаругспзаотся гокопротегаш (полоса Сорэ). Зпределалпэ распределения каротаноидов кввду суйслэточцнкя Фра-¡сцзя!Л показало, что основная гдасса зтлх пигазнтов локализована в везикулярной фракции (табл. 3.)

Таблица 3 Распределение каротиноздов в субклеточных фракциях . зхабер двух еидов моллюсков {%) .

фракции 1 Uodlolua 2 1 dretsuena г 3

флотирующая 12 7 82 24 32

везикулярная 69 71 12 62 57

фракция 3 4 6 . 3 r\ О 4

митохондриальиая 15 16 3 tí 7

клеточных мембран в процессе гомогеш» •щии. В первую очередь .что поверхностная мембрана и эндоплазматический рэтцхулум. Та-. кие органеллы, к а:; митохондрии, лизосомз и другиэ, ойяадаизн» замкнутым объемом п, в большинстве случаев, пеболъпг^ размерами, при обычных условиях выделяются как целостности стру/.ту-ры. Поэтому указанные органоллу не дают еначительного вклада в везикулярную фракцию, что подтверадается отсутствием в ней га-нопротеинов. Следовательно, пршзэдешше результаты говорят о том, что каропшоида в клетках аебэр локализованы преимущественно в мембранах - поверхностной н евдоплазматического ретику-лума. В. первую очередь в поверхностной, так как в клетках наборного эпителия она имеет очень большую площадь ио-зз ресничек на апикальной поверхности;, поэтому в данных клетках су?,марная поверхность ялазмалвмкы значительно больше чем у ретикулума.

Ёцэ одно указание на внутркклаточную локг тзацию каротино идов было получено другим методом. Было обнаружено, что при инкубации габер ИосЧоХиэ псхНоХиэ или НугиЬореМёп уеээоепз1а в морской воде, к которой добаляла ЭДТА до концентрации 12 Ш, происходит ослабление каротиковддоЯ пигментации жабер, сспрог.о-

здавдеес* переходом окраски в среду. Электронно-микроскопическое .исследование показало, что в основе этого явления лежит эк-зоцитозноо высвобождение везикул из поверхностных мембран клеток жаберного эпителия. Каро'тиновды обнаруживаются в среде инкубации в ссУ'ВБв экзоцито?ных везикул. Поскольку содержащие каротиноида везикулы ведут свое происховдение из поверхностных мембран, можно заключить, что основная. часть каротиноидов в клетках жабер моллюсков сосредоточена в поверхностной мембране.

Можно предположить, что в основе индуцированного экзоцито-за лежит разборка примембранного цитоскелета, вызванная нехваткой ионов кальция, которые хелатируются ЭДГА. При этом поверхностная мембрана должна приобретать большую свободу механически флуктуация, вплоть до спонтанного очишуровывания везикул. Это предположение подкрепляется тем фактом, что на г имках об-реботрняик ЭДГА првпярятов не ббнвружяввтсй скелетных структур 1 ресничек, которые хорошо видны на снимках, соответствующих контролю. обнаруженное явление может стать основой для разработки метода получения чистого препарата апикаль ой поверхностной ме-: мбраны клеток жаберного эпителия морских моллюсков.Эта мембра-' на, безусловно, представляет интерес как объект изучения проце-, ссов ионного транспорта.

Итак, двумя независимыми методами установлено, что в жабрах моллгског, каротиноида локализованы преимущественно в мемб-; ранних образованиях, причем в первую.очередь в поверхности мембранах ¡слеток. Таким образом, выяснилось, что нэ существуем ; неоднократно постулировавшейся приуроченности каротиаоидов 1 ■ специальным органеллам. Действительно, как отмечалось выше, по; . световым мтфоскопом каротююида в клетках наших объектов обнаруживаются только в гранулярных структурах. Это объяснимо, поскольку кароганоидную пигмонтацзв мембран невозможно определит; рчзуально в силу того, что их просто нельзя увидеть на светова уровне. Представляется,'что именно это обстоятельство ^служил причиной того, что каротиноида у животных (обычно моллюсков) в . протяжении долгого времени изучались в связи .с гранулярным структурами ("цитосомами", "лиаохОвдриями" и- т.п.).

Какова >•• роль кароткноадовв мембранах животньйс клеток Учитывая хорошо известные антиоксидантные свойства каротияо идов, мо 1зю предположить, что их роль заключается в защите мем брагашх липидов от окисления за счет тушения свободных радака лов. Однако, известно, что при взаимодействии с. радикалами кв ротиноидо разрушаются, тогда как мы .выяфмли, что. Их функция и смзона с химическими превращениями. С другой-сторош. исхоЛ

из,предположения об антиоксидантиой ролл трудно объяснить установленную нами необходимость налитая полярных групп на концах молекул каротиноидов. Таким образом, - антиоксидантная функция представляется маловероятной.

Мы обнаружили, что все каротшюиды у наших объектов являются ксантофиллами, причем они на связаны с белкагли, то есть находятся в мембранах в свободном виде. Из ряда работ известно, что all-trans ксантоф5ШШ, в отличие от каротинов, ьстраиваются в липидныо мембраны ориентированно, по нормали к поверхности мембраны (рис.3), при этом полиеновая цепь пронизывает гидрофобную зону бислоя, а полярные группы на концах молекулы ксантофилла взаимодействуют с заряженными группами липидов или водой. Встраиваясь в мембрану таким образом, ксантофиллы влияют на свойства липидного бислоя подобно холестерину, они упорядочивают бислой и повышают его вязкость. Конкретный физический меха-; низм этого явления неясен, но известно, что при этом не меняет-

рис.З. Два возможных варианта встраивания молекул ксантофиллов в липидный бислой: а - взаимодействие полярной группировки с одной из заряженных-поверхностей'мембраны (4-кето-а-каротин). Ъ - молекула ксантофилла ■(митилоксантин) проникает через всю толщу мембраны и фиксируется на обоих ее сторонах за счет взаимодействия кето- и оксогрупп с полярными головками.липидов.

ся температура фазового перехода, а снижается его энтальпия и уменьшается размер кооперативной единицы. При некоторых концентрациях ксантофиллов в мембрайе фазовый переход исчезает вооб-

що. Тек, на модельных мембранах показано, что одна молекула лс-■ той. предотврадвэт фазошй пзрзход плтвдэслга молекул дипаль-штоклфосфаву^иаол^та, хохосторин s.o пришрно вдвое) Менее эффективен. Ряд исследования, провэдшшх на бакяерзах tRofcmer et al., 1ЭТ9) и мшюштзмах [RoUca, 1580,1, показывает, что функция ксштфишов в ыэмбрша srax оргазизмоз ашитаэтся именно б регуляции вязкости дивдвого Слслоя.. Посколыгу указашаге свойства коаотофдаов пролвляатся во всех . вауташх остеотвон-шх и цскусствв1гних лшшдаих иегйЗршш, йот осаовепий полагать, ч-J они нэ проявляются в мэмбрапах хлэток ювотпах. Если Предположить, что коротиноида у наших обвдктов кгps»T роль рагу ля-торов вяакосзи комбраи, то еснзруизгшое увзлачэюэ содержания 1 'вротшоцдов, прспсаодазао прп пававзхт í лшервдры, шжао лн-терпратировать иск p:iys рэаэдзз ортгдаага, '»фодотвра-

AHufCüfjeO уTClty^CCTIÍ Ли!—'CI'IP—'O 220^10 bdíííCHHTh

и обноружзшюо jiavsi значительное снаквнае садорйайпя раротаноя-дов в тканях KO№KüiOB -SIL. Й. ' 7 *;лрз;апаздоа в ®2з£5раоаая морского ota i¡ даащшы

' рзззгггл, В Сздкглягх а n.wtfJpuoBia всех стеля." до раазогс илотоуса бал обазрлаа сдан коротлновд - вишэнон. Енлс

установлено, Ч1й в працеосо развития происходит состепэшгас • jkmüems» сто содо^ианая в рагяои» на один вибрион. Графтаесга

< этот прочь на 4. Ясследовшшэ каротсшовдов V

< о пи с лошака ПО5 показало, что карокшозд

рас,*. iU'jir-vsma coíepxaima эхиненопэ в эмбрионах Strongylo-cerctrotua trAeraedliía в ходе развитая.

заходятся в all-trana коиформацлл на всзх стадиях развития.

Как видно из приведенных результатов, исследование кароти- ! ; зондов в эмбрионах f,юрского eza внявля,т картину, отличную от гой, которую мы наблюдаем в эмбриогенезе ракообразных и моллюс- ' ■ юв. У представителей двух последних групп организмов не пропс- ■ (содат уменьшения содзрзания яаротлновдов в эмбрионе в ходе развития, все каротипопда связаны о белком в водорастворимых каро- : гинопротеавовнх комплексах; кроме того, известно, что у раков • ; ¡саротшоиды находятся в составе каротянопротоина ц ct/a-конфзр-зациа. В связи с этш, прэдставлэния о функция каротиноидов в эмбриогенезе, развитые на основе перэчислэншх данных, в случае «орскоГо ена не находят подтверждения. . '

Учитывая наблюдаемое уменьшение содержания квротшоидов в-соде развития, можно предположить, что каротиновды в ЕМбри нах , выполняют функции защиты клеток от повреждения активными форма- ' ' ии кислорода. Как известно [Krinsky, 1989], при взаимодействии с оксирадикаламз каротиноиды необрат-"Мо окисляются. Это явление , !,!0кзт лежать в основе уменьшения содержания каротшоидов в эмбрионе в ходе развития.

3. Исследование электрохроишх свойств каротшоидов в мембранах содалщного нерва лягушки с поиощьо спектроскопии РКР.

Спектр РКР нерва изображен на рис.5а. Профили возбуждения полос РКР каротиновдов 1521 и 1156 см-1, полученные по данным измерений на 10 нервах, представлены на рис.БЬ. 0*ш характеризуются максимумом при длине волны возоуздения 488 ш и резким спадом в области от 488 до 514 нм. Логично предположить, что при небольшом элэктрохромном сдвиге профилей следует ожида-более значительных изменений интенсивности полос KP при длинах волн возбуждения 496,5 и 514,5 нм.

Для изучения электрохромного ответа на изменение трансмембранной разности потенциалов нервные .волокна деполяризовались на 40% при повышении концентрации ионов К+ в омывающем растворе до 50 Ш. Эффект исследовался при различных длинах волн возбуждения. "Изменение интенсивности полосы 1521 см-1 в ходе дьполя-ризации мембран показано па рис.6а. Кинетические кривые исправлены с учетом фотодеструкции карогалоидов. Задержка в ответе определяется скоростью диффузии ионов К4" к мембранам. Установлено, -что при возбуждении спектров KP лазерными линиями 441.6. 457.9, 472.7, и 476.5 нм не наблюдается измэи.иий интесивност« полосы, тогда как при возбуждении линиями 488, 496.5 и 514.5 нм ' интенсивность возрастала на 20, 15 и 4% соответственно. Аналогичные результаты были получены для полосы 1156 см-1. Эти резу-

115в

1521 Л _1 /XV, от

100

я 8

50

Д и О

о и и ч о к

о

и

«

. E¡

480

510 Лсх,нм

рис.Б.'а - спектр РКР керотиноидов в нерве лягушки, лвх=488 нм Ъ - профили возбуждения полос РКР каротиноидов в перве.

льтаты можно объяснить Длинноволновым смещением профиля возбу» ; диния примерно на 0.6 нм. Точно определить Ее.чичину сдвига не ! возможно: из-за ограниченного,числа лазерных линий полученнь . экспериментально профиль возбуждения строили по малому чису точрк, поэтому тангенсы углов наклона этого профиля не равг ; производным р льного профиля в соответствующих точках.

Известно, что при повышении напряженности элоктрическо! ; шля, направленного вдоль оси молекулы каротиноида, происхода 1 сдеиг спектра поглощения (или профиля возбуждения РКР)в красна оольсть. На же наблюдаем красный сдвиг профиля возбуждения п] умин1.ионии величины олвктричесхого поля, обусловленного иошпо

1 Д41Л

1 437.0

1 ЛУ9Л

О5

о as

(Ч

я

чгз

а

05

И о

со

=5

СКГ1гЧ»'тМ 30 SO 75 loo 1го ISO ITS

..-I

рис. 6. a - кинэтика изменения интенсивности полосы 1521 см" 'после повышения концентрации ионов К+ ьри различных длинах волн ' возбуждения; стрелка - момент добавления KCl. Ъ, с - зависимости изменения интенсивности полосы 1521 см-1 оч величины изм>. нения трансмембранной разности потенциалов (100% - потенциал покоя); цифры сверху - концентрации KCl, соответствующие точкам на кривых; Ь - \ех=488 нм, с - A.eJ=496,5 нм.

градиентами на мембранах нервных волокон. Как из теории IKakl-tani et al., 19821, так и из экспериментов tMatsura, Niahlmora, 1977; Bowyer, Crofts, 1980) известно, что такое явление имеет место, если на каротиноиды в мембране действует сильное локальное электрическое поле, направленное противоположно полю, задаваемому ионными градиентами. Возможно, в нашем случае,, это поле задается поверхностными зарядами мембран. '

Кривые зависимости изменения интенсивное.^ полос от вэль • чины деполяризации клеточных-мембран нерва при длинах волн воз-бувдения 488.0 и 496.5 нм приведены на рис. 6. Видно, что кали-

i бровг -чые кривые, соответствующие лазерное линии 488 вм, имь.г максимум, присутствие которого, вероятно, связано.с тем, что максимум реального профиля возбуждения леапт вблизи 488 нм и • при длинноволновом сдвиге профиля переходит через эту .длину i волны. .Подтверждением этого коеэт слугшть тот факт, что епало-: гичше крише для Ае_=496,5 нм максимума нэ имеют. ' , Известно, что ионы лантана вытесняют 'ионы кальция ир мост I связывания на мембранах CDiecke, Stout, 19811. Исследование j bjt-чшш ионов лантана на спектры РКР каротиноидов в нерве пока зало, что при концантрашш ЬаС13 4 кМ в смыванием'раствора про; исходит снижение иионсивностк полос РКР на 15-202 (возбузденке i 488 кы) - эффектt противоположений наблэдсрчому при дэполярпза-■ ,шш мембран. Отсюда следует, при добавлении в' раствор лантана . ^возрастает напряженность виутртаиОрзииогб электричеш.-го поля. I Еалс ^¡д'яснонс, что это сОуслсн. знно повышением плотности поло-i ^мтелышх зарядов ка вкэигчх поверхностях мембран при обиенэ |сорбироЕ пик ионов кальция на кош лантана. Этот вывод подтверждается значительным погашением порога элзктрлчэского воз-:бувдония нерва пр:; добавл чве 1аС13.

! j ' еыеоди ■ •

: i I. В соматических тканях моллюсков к аеццдай обнаруживаются ! . тольх' С4п-1!саь'тофл1ллн, находящиеся в all-trans конформа-ции. Всети в тканях 2 видов колдюсков и 2 видов асцидиЯ обнаружено и идентифицировано 17 ксантофтлллоз. Онп на связаны с солками к локализовав в клеточных мембранах. ] II. Выявлена четкая ■ ¡завшшеть. содержания кароташокдов в \ тканях моллюсков от температуры: о повышением"температуры i содержание пигмента возрастает. В осново наблюдаемых в j акспорикзнтах изменений содеркадая квротшкщдов в тканях лежит транспорт пигментов аз гепатопанкреаса, содар:;гдого основной запас каротинзадов, в другие органы. . ,111. Установлено, что фушция каротиноидов в соматических ; тквнях животных не связано с iix химическими превращениями. ! 1 С учетом зависимости содержания каротиноидов в тканях от температуры и данных о влиянии каротиноидов на свойства литцашх .слоев, наиболее вероятной функцией каротиноидов ( является участие в поддержании гомеостаза вязкости клеточных момбран животных.

IV. Hj -льтоты экспериментальных исследований не подтверждают гипотезы о кислородзапзсотаеЯ роли каротиноидов, об учас-

т -----.

г:«! каротиноидов в электронно-транспортных процессах.

свяг -иных с синтезом ATФ при анаэробиозе и об участи каротиноидов в процессах связывания и накопления кальция.

V. В ходе эмбриогенеза морского ена Strongylocentrotuk Inter medtus обнаружено сшшйше содержания all-irons форм ; каротиноида (эхйненона) в расчете на эмбрион, что моке j указывать на шгиоксидантпую'роль этого пигмента. < VI. Разработаны основы метода получения чистого препарат поверхностной мембраны клеток жаберного эпителия йорски ' моллюсков.с помощью индуцируемого ЭДГА экзоцитоза. VI:. На основе 'электрохромных свойств каротиноидов в нор! ; лягушки разработаны основы метода регистрации измэпеиг трансмембранного потенциала . п . поверхностного зарщ мембран нервных клоток с помощью спеь .роскопш РКР. Напрс i вленность электрохрошюго сдвига профиля возбувдрчия поле ! РКР свидетельствует о том, что на.молекулы пигмента в Met j бранах нерва действует сильное, локальное элэктрическс ■ j полз, направленное пр тивополошо полю, задаваемому трая<

1 m8j, равными ионнши градиентами. ' ' ' ' По-тема диссертации опубликованы следующие работы: j |1. Вершинин а.о., 4ypiai ...а., Пащенко В.В. Регистрация hsmbhi t !ний трансмембрашюго потенциала и поверхностного, заряда клато1 I j шх мембран нерва с помощью спектроскопии резонансного комбин ! ¡циошгаго p. jce~4iw каротиноидов.//Биологический мембраны. 193 | |Т. 7, И 6, С. 634-639.

j i2. вершншш А.О.,. Паценко В.З. Каротиноида и 7-дегидрохол i : старин в тконях моллюсков в порыв и в условиях анокгащ.//Д i ¡.СССР; 1991. Т. 318, & 6, С. 1476-1479.

! 'г. Вершинин А.0., Пащенко В.З. К вопросу о роли каротиноидоя ; !процессах связывания и накопления кальция в клетках .животных. | iДоклада МОИП. Ы: Наука, 1992.

; 4. Вершинин А.О., Пащенко В.З.'йсследование состояния In elti ,Лч .ализации каротиноидов" в клетках животных. //Доклады Ml. ; Наука, 1992. . ' . . „ "

I 'б. Paachenko V.Z., Vershlnift А.О., Churln A.A. Electrochron ' behaviour of carotenold molecules In nerve membranes, a reaoi : ,nce . anan atudv,//j. Photochem. Fliotobiol. 1992. in press.