Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Покоящиеся клетки и адаптация мицелиальных грибов к температурному шоку

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Покоящиеся клетки и адаптация мицелиальных грибов к температурному шоку"



На правах рукописи

ТБРЁШИНА ВЕРА МИХАЙЛОВНА

ПОКОЯЩИЕСЯ КЛЕТКИ И АДАПТАЦИЯ МИЦЕЛИАЛЬНЫХ ГРИБОВ К ТЕМПЕРАТУРНОМУ ШОКУ

Специальность 03.00.07 - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

МОСКВА -2006 г.

Работа выполнена в Институте микробиологии им. С. Н. Виноградского РАН

Официальные оппоненты:

Ведущая организация - Институт биохимии им. А.Н. Баха РАН

Защита диссертации состоится 17 апреля 2006 г. в 1400 ч. на заседании Диссертационного совета Д.002.224.01 при Институте микробиологии им. С. Н. Виноградского РАН по адресу: 117312, Москва, пр-т 60-летия Октября, д. 7, корп. 2.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института микробиологии им. С. Н. Виноградского РАН.

Автореферат диссертации разослан « 13 » марта 2006 г.

Доктор биологических наук, профессор Доктор биологических наук, профессор Доктор биологических наук

В.К. Плакунов Н.Б.Градова Т.С. Калебина

Ученый секретарь Диссертационного совета, кандидат биологических наук »/^/и-

Л.Е. Никитин

OOoG(\

S77H

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Проблема криптобиоза - скрытой жизни или состояния «физиологического покоя» имеет общебиологическое значение в связи с широким распространением этого феномена в природе. В таком состоянии находятся споры грибов, низших растений и прокариот, почки растений, насекомые в диапаузе, животные в спячке [Ушатинская, 1990]. Актуальность этой проблемы связана с необходимостью изучения явлений скрытой жизни и длительного существования в экстремальных условиях для сохранения биоразнообразия на Земле, освоения Космоса и территорий с неблагоприятными условиями, борьбы с патогенными грибами, использования спор в биотехнологии и разработки методов их хранения.

Индукторами спорогенеза являются многие факторы (истощение питательных веществ, снижение влажности, изменение температурных условий и др.), которые вызывают торможение жизненной активности [Феофилова, 2003]. В онтогенезе грибов спору рассматривают как конечную точку цикла, т.е. как ключевую структуру, обеспечивающую сохранение жизни во времени и пространстве [Sussman, 1976; Osherov, May, 2001]. Для этого необходима устойчивость к абиотическим факторам, среди которых наиболее опасным является тепловой шок.

Верхний предел витальной зоны, который определяется тепловой коагуляцией белков, довольно узок, тогда как нижняя граница более широка в связи с тем, что холод не разрушает органических соединений. В вегетативных клетках грибов адаптация к температурным колебаниям в зоне толерантности осуществляется имеющимися регуляторными механизмами. Однако, когда воздействие отличается от оптимальной температуры на 8-12°С, что называется тепловым шоком [Lindquist, 1986], происходит индукция особой защитной системы. Такая система включает: синтез белков теплового шока, аккумуляцию трегалозы, детоксикацию активных форм кислорода, структуризацию и перераспределение воды в компартментах цитозоля, изменение состава мембран и поддержание внутриклеточного pH [Piper, 1993]. В результате организм переходит в другое дискретное стационарное состояние метаболизма, называемое стрессом [Веселова и др., 1993], характерным признаком которого является термоустойчивость.

Ранее трегалозу считали лишь одним из запасных углеводов, но по современным представлениям этому соединению присущи следующие функции: (а) резервного углевода (б) протектора мембран при разнообразных типах стресса: тепловом, окислительном, осмотическом, действии тяжелых металлов, лекарств, метаболических ингибиторов; (в) регулятора процесса гликолиза, концентрации глюкозы и АТФ в клетке; (г) транспортируемой формы углеводов в мицелии [Thevelein, 1996; Argüelles, 2000]; (д) шапероноподобного соединения, участвующего в стабилизации и фолдинге белков [Singer, Lindquist, 1998; Sampedro, Uride, 2004]; антиоксиданта [Oku et.al., 2003].

В связи с участием трегалозы в защите мембран от теплового шока возникает вопрос о роли фосфолипидов 001ГОВИЫА комдив липидного бислоя. Известно, что в зоне толерантност и jgjjnepaiypHbiM коле-

с о®

баниям осуществляется путем изменения состава мембранных липидов и (или) их жирных кислот [Sinensky, 1974; Hazel, 1995]. Происходят ли подобные изменения в составе липидов в условиях ТШ, учитывая резкое торможение жизнедеятельности, или достаточно термопротекторного действия трегалозы - оставалось неясным. Такое исследование состава углеводов цитозоля и липидов грибов в условиях теплового шока может содействовать пониманию биохимических механизмов термоустойчивости не только вегетативных, но и покоящихся клеток, так как известно, что трегалоза в значительном количестве накапливается в спорах грибов [Thevelein, 1996]. Кроме того, разнообразный состав внутриклеточных углеводов грибов, включающий и сахароспирты, позволяет предположить их участие в адаптации к температурному шоку.

Новое понимание функций углеводов определило идею данной работы -изучение различных состояний покоя спор с позиций биохимической адаптации к тепловому шоку. Кроме того, это может способствовать более глубокому пониманию природы клеток с различными типами покоя и процессов, происходящих в них при хранении и прорастании, что представляет большую ценность не только для фундаментальной науки, но и для создания биотехнологий, использующих споры грибов.

Целью настоящей работы являлось изучение состава растворимых углеводов и липидов в вегетативных клетках мицелиальных грибов в условиях температурного шока и в спорах с различными типами покоя. Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

1. Изучить состав углеводов цитозоля и липидов в условиях температурного шока в вегетативных клетках грибов, относящихся к различным отделам Fungi.

2. Провести сравнительное исследование состава углеводов цитозоля и липидов в спорах с экзогенным и эндогенным типами покоя.

3. Выявить отличия в ответе экзогенно покоящихся спор грибов на температурный шок по сравнению с вегетативными клетками.

4. Изучить изменения в составе углеводов цитозоля при хранении спор грибов с различными типами покоя.

5. Исследовать состав углеводов и липидов в процессе прорастания экзогенно покоящихся спор.

6. Использовать результаты фундаментальных исследований в разработке биотехнологий получения лекарственных средств из мицелиальных грибов.

Научная новизна работы. На примере изученных грибов впервые доказано, что защита мембран вегетативных клеток грибов от теплового шока осуществляется, в основном, с помощью мембраностабшшзирующих соединений, к которым относятся стерины и углеводы (трегалоза, сахароза и инозит), а не путем изменения фосфолипидного состава. Механизм адаптации вегетативных клеток грибов (Ascomycota, Basidiomycota) к холодовому шоку включает аккумуляцию поли<?лов. Впервые обнаружено, что жизнеспособность плодовых тел базидиальных грибов в природных условиях слабых отрицательных темпера-

тур связана не только с увеличением доли полиненасыщенных жирных кислот в фосфолипидах, но с высоким уровнем этих полиолов. Впервые установлено, что у базидиальных грибов механизм индукции плодообразования Холодовым шоком включает накопление полиолов - арабита и глицерина.

С позиций биохимической адаптации, независимо от типа покоя, в защите спор от тепловых воздействий сочетаются две стратегии защиты - от теплового шока (высокий уровень трегалозы) и от тепловых модуляций в зоне толерантности (большое количество фосфатидилхолина). Впервые установлено, что основным отличительным критерием типа покоя является степень ненасыщенности жирных кислот фосфолипидов: если она высокая, как в вегетативных клетках, то споры находятся в состоянии экзогенного покоя, если низкая - то в эндогенном покое. Новым фактом является установление биохимического ответа экзогенно покоящихся спор на температурный шок. Выявлена прямая корреляция между термостабильностью и количеством трегалозы в спорах. Впервые показано, что при хранении экзогенно покоящихся спор поддерживается определенный уровень термопротекторных углеводов цитозоля, тогда как в спорах с эндогенным покоем количество трегалозы уменьшается, что сопровождается снижением их всхожести. Установлено, что от количества трегалозы в экзогенно покоящихся клетках зависит длительность I фазы прорастания.

Практическая значимость и реализация результатов работы. Проведенные фундаментальные исследования дают теоретические предпосылки для разработки новых подходов к созданию биотехнологий получения лекарственных средств на основе мицелиальных грибов. Один из таких подходов - «воспитание» спорового посевного материала в процессе спорогенеза, позволяющее получить споры с определенным химическим составом, что влияет не только на процессы хранения и прорастания, но и на синтез биологически активных веществ, в частности каротиноидов.

Разработаны способы подготовки спорового посевного материала с новыми свойствами для биотехнологии. Предложены биохимические критерии оценки жизнеспособности спорового посевного материала на примере конидий А. niger - продуцента лимонной кислоты.

Автор был ответственным исполнителем в проектах, возглавляемых профессором Е.П. Феофиловой, по разработке лекарственных средств из мицелиальных грибов. На основе мукорового гриба В. trispora. нами созданы два лекарственных средства - Микоран (совместно с Институтом хирургии им A.B. Вишневского РАМН) и Миколикопин (совместно с РОНЦ им. H.H. Блохина РАМН). Разработан опытно-промышленный регламент, проведены токсикологические и клинические испытания, получены временные фармакопейные статьи на субстанцию и ранозаживляющий препарат Микоран. Активным началом препарата являются полиаминосахариды хитин и хитозан. Препарат Микоран разрешен к применению в медицинской практике приказом Минздрава РФ № 368 от 1996 г. и включен в Фармакопею РФ. Разработана биотехнология получения ликопина из гриба. На основе ликопина и других биологически активных соединений гриба создано адаптогенное средство Миколикопин с противораковым эффектом, установлены его радиопротекторные, антимутагенные

и иммуномодулирующие свойства, создана лекарственная форма в виде желатиновых капсул. В испытаниях на модели рака простаты у крыс показан лечебный эффект Миколикопина, что открывает перспективы его использования в профилактике и лекарственной терапии заболеваний простаты.

Предложены два новых метода исследования: экспресс-метод определения ликопина и ß-каротина в смеси и способ определения степени деацети-лирования хитина в полисахаридных комплексах грибов.

Апробация работы. Основные результаты работы были представлены доложены и обсуждены на: IV-th Int. Mycological Congress (Regensburg, Germany, 1990), XV-th Int. Symposium of yeasts (Riga. 1991), Vl-th Int. Fungal Spore Conference, (Konstanz, Germany, 1996), VI Международной конференции «Новые достижения в исследовании хитина и хитозана" (Москва, 2001), Конференции «Физиология и биохимия культивируемых грибов» (Саратов. 2002), I Всероссийском Конгрессе по медицинской микологии (Москва, 2003), VII Международной конференции «Современные перспективы в исследовании хитина и хитозана (Санкт-Петербург-Репино, 2003).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 63 научные работы, в том числе 42 экспериментальные статьи, 4 обзора, 9 тезисов конференций, 2 авторских свидетельства и 6 патентов.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов исследования в 3 главах, обсуждения и выводов, изложена на 300 страницах машинописного текста, содержит 69 рисунков и 45 таблиц. Список литературы включает 341 работу, в том числе 274 на английском языке.

Место проведения работы. Работа проводилась в лаборатории «Экспериментальной микологии» Института микробиологии РАН, возглавляемой проф., засл. де-ят. науки РФ Еленой Петровной Феофиловой.

Автор выражает глубокую признательность своему Учителю и наставнику профессору Елене Петровне Феофиловой, большую благодарность за консультации и сотрудничество профессору Лидии Васильевне Гарибовой, ст.н.с., к.х.н. Людмиле Александровне Вакуловой, ст.н.с., к.б.н. Евгении Михайловне Афанасьевой. Кроме того, на отдельных этапах работы принимали участие Грязнова М.В., Михайлова М.В., Горнова И.Б., Садовова Н.В., Марьин А.П., Волохова М.В., Дараган-Сущова М.В., Немцев Д.В., Завьялова Л.А., Кочкина Г.А., Косяков В.Н., Марышова Н.С., Хохлова Н.С., Морозова Е.В., Хомидов Х.С., Шуйская Г.Г., Головина Е.А., Широкова Е.А., Меморская A.C., Шашкина М.Я., Алексеев A.A., Гришина И.А., Буренин И.С., Полянская Н.И., и студенты-дипломники: Александрова Е.А., Кроткова Н.Б., Кашпорова Е.В., Баранова М.В., Бадаева Е.В., Ковтуненко A.B., Калинина Н.В., которым автор выражает большую благодарность. Самые теплые слова благодарности за долгую дружную совместную работу автор выражает сотруднице лаборатории Анне Сергеевне Меморской. Автор благодарит весь коллектив Института микробиологии за доброжелательное отношение и помощь в работе.

Основные защищаемые положения

1. Защита мембран грибов вегетативных клеток в условиях теплового шока осуществляется, в основном, с помощью мембраностабилизирующих со-

единений - углеводов и стеринов, а не путем изменения состава фосфоли-пидов.

2. Глубина покоя спор грибов связана с жирнокислотным составом фосфоли-пидов - насыщенные жирные кислоты преобладают в эндогенно покоящихся клетках, а ненасыщенные - в экзогенно покоящихся спорах.

3. В экзогенно покоящихся спорах поддерживается определенный уровень и соотношение основных углеводов цитозоля, тогда как в клетках с эндогенным покоем наблюдается постепенное снижение количества трегалозы.

4. Чем больше количество трегалозы в с экзогенно покоящихся спорах, тем выше их термоустойчивость и короче стадия прорастания.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Обзор литературных данных содержит 3 главы, посвященных адаптации грибов к температурному шоку, химическому составу спор, а также процессу их прорастания.

Объекты и методы исследований.

В работе использовали следующие штаммы грибов, относящиеся [Ainsworth, Bisby, 2001] к отделам Zygomycete (Cunninghamella japónica ВКМ F - 1204 (-); Blakeslea trispora: (-) штаммы: ВКМ F 811, 921, 987, 826 и (+) штаммы: ВКМ F 666, 701, 812, 902, 903, 904, 986, 989, 1201, а также 2 штамма из коллекции культур ИНМИ РАН: Т (+) и Т (-); Ascomycota (Myceliophthora thermophila, Aspergillus niger (коллекция ИНМИ PAH), Aspergillus niger Б1-1 ВКПМ F - 790 (продуцент лимонной кислоты, АО «Цитрабел», г. Белгород) и Basidiomycota (Pleurotus ostreatus, Flammulina velutipes (коллекция ИНМИ PAH), Lentinus edodes F-249 (коллекция кафедры микологии и альгологии МГУ).

Мукоровый гриб В. trispora культивировали в погруженных условиях на среде Гуд-вина [Garton et.al., 1961] и кукурузно-соевой среде [Бехтерева, 1973]. Выращивание проводили в колбах емкостью 250 мл с 30-50 мл среды и колбах емкостью 2 л с 300-500 мл среды при 26-28°С на круговой качалке со скоростью 220 об/мин. Для изучения действия температурного шока культивирование проводили в колбах емкостью 250 мл с 30 мл среды Гудвина при температуре 26-28°С в течение 66-68 часов на качалке с 150 об/мин. Далее часть колб перенесли на 6 часов в условия 18-20°С (ХШ)и 34-36°С (ТШ).

Для получения спор из спорангиолей (СП) и стилоспорангиев (СТ) В. trispora выращивали в пробирках диаметром 15-20 мм с 5-6 мл картофельно-морковной среды в течение 10 сут при 25-26 и 29-29,5°С соответственно. Споры собирали путем смыва водой, отделяли от мицелия через капроновое сито, центрифугировали при 10 000 g, один раз промывали водой. Все операции проводили при 4°С. Лиофильно высушенные споры хранили при 21°С.

Термоустойчивость СП и СТ В. trispora определяли после прогревания споровой суспензии (5x106-1x107 спор/мл дистиллированой воды) в течение 5 мин при 44-68°С, высевая на тонкий слой суслового агара и подсчитывая число проросших спор с помощью окулярой сетки.

Для получения зигоспор В. trispora одинаковые кусочки мицелия (+) и (-) штаммов помещали на противоположные стороны чашки Петри с сусловым агаром. Культивирование проводили в течение 14 суток при 26-28°С в темноте. Образовавшуюся темную полосу отделяли, растирали в ступке, выделяли зигоспоры способом отмучивания, затем лиофильно высушивали. Интенсивность зиготообразования определяли по ширине полосы зигото-образования, выращивая гриб на чашках Петри с 7°Б сусло-агаровой средой в течение 7 суток при температурах: 25, 28, 30, 32, 35°С. Для посева использовали кружочки диаметром 10 мм газонной 2-х суточной культуры (+) и (-) штаммов, которые помещали на противоположные полюса чашки со средой.

Для выращивания C.iaponica на среде Гудвина в качестве инокулята использовали споровую суспензию из расчета 2-5x106 спор/мл среды, культивирование проводили в тече-

ние 24 ч при 26-28°С, далее в течение 6 ч часть колб продолжали инкубировать при 26-28°С, а другие колбы - при 34-36°. Антиоксидант ПХГ (5-метил-2-этил-3-оксипиридин) вносили в концентрации 2x1 О^М перед теплловым шоком. Выращивание проводили в колбах емкостью 250 мл с 30-50 мл среды при 26-28°С на круговой качалке, вращающейся со скоростью 220 об/мин.

Для получения слот) С. japónica выращивали на чашках Петри с сусловым агаром в течение 12 сут при 27-28°С. Споры собирали двумя способами: путем смыва тетрадеканом и водой при 4°С.

Для получения мутантов C.iaponica. дефектных по спорообразованию, использовали специально выращенные с использованием УФ-В слабоокрашенные споры, которые облучали УФ-А, используя лампу БУФ-15 (Хти=254 нм), в чашках Петри с толщиной водного слоя - 0,5 мм, интенсивность облучения - 46,5 эрг/сек х м2.

Работу проводили с конидиями гриба A. niger ВКПМ Б1-1 F-790, которые используются в качестве посевного материала в производстве лимонной кислоты на заводе "Цит-робел", г. Белгород. Конидии выращивали на сусловом агаре и собирали вакуумным способом. После подсушивания до влажности 6-7% хранение спор проводилось при температуре 15-20°С. Погруженное культивирование проводили на среде Блюменталя-Роземана [Blumental, Roseman, 1967]. Для изучения состава конидий в процессе прорастания культивирование проводили в течение 4, 8 и 12 часов при 30-32°С на качалке с 200 об/мин. Действие температурного шока изучали, перенося культуры в стадии средней трофофазы (1 сут) и начале идиофазы (2 сут) на 6 часов в условия 40-42°С и 17-19°С. Зависимость от температуры химического состава спор и их способность к прорастанию изучали, выдерживая сухие конидии при 10,20, 37°С в течение 30 и 60 суток.

Для получения конидий A. niger (штамм ИНМИ РАН) с различным составом углеводов выращивание проводили в течение 10 суток в следующих условиях: (1) сусловый агар 7°Б, при 30-32°С, в темноте; (2) то же, но выращивание проводили при 36-37 С; (3) то же что и вариант 1, но с облучением зеленым светом (фотопериод 16 часов с момента посева) с интенсивностью 1,7 вт/см2, используя люминесцентную лампу К-35 (Хтах=525 нм) ; (4) агари-зованная среда Чапека в состав которой входят (г/л): сахароза-30, КН2РО4 -1 , MgSÜ4 - 0,5 , NaN03 - 2, КС1 - 0,5 , FcSC>4 -001, агар -1,5-2%, агар-агар - 20; выращивание проводили в темноте при 30-32°С (5) то же, что и (4), но сахароза частично (на 2/3) заменена на трегало-зу, (6) маннит или (7) глицерин); (8) то же, что и (4), но сахароза полностью замещена на 14% глицерина. Сбор конидий осуществляли с помощью додекана. Конидии хранили при комнатной температуре (18-22°С) в стеклянных пробирках с ватными пробками. Для определения жизнеспособности конидий A. niger использовали экспресс-метод в тонком слое агаризованной среды: 0,2% глюкозы, 0,2% пептона на фосфатно-цитратном буфере, рН -4,0-4,2.

Мицелий М. thermophila выращивали на среде Гудвина, используя в качестве иноку-лята споровую суспензию из расчета 2-5 х 106 спор/мл среды, в течение 24 ч при 40-42°С, далее часть колб инкубировали 6 ч при 50-52°С и 26-28°С.

Базидиомицетный гриб Р. ostreatus - культивировали на среде следующего состава (г/л): соевая мука - 7,0; MgSC>4 • ТНгО - 0,38; КН2РО4- 3,5; подсолнечное масло - 10; молочная сыворотка - 20% от объема среды. Выращивание проводили на качалке с 200-220 об/мин, в колбах на 250 мл с 50 мл среды в течение 72 ч при температуре 25-27°С. Затем часть колб переносили в условия 33-35 С и 12-14°С на 24 ч.

Выращивание L. edodes проводили на сусловом агаре в течение 7 суток при 26-27°С, затем переносили культуру в условия 8-10°С на 36 часов (ХШ).

Для определения активности трегалазы споры С. japónica разрушали двукратно на прессе Хьюза и путем дифференциального центрифугирования получали три фракции -клеточные стенки, микросомальную и растворимую. По 1 мл клеточных фракций, суспендированных в фосфатном буфере, инкубировали с 1 мл 40 мМ раствора трегалозы в течение 30 мин при 30 С. После остановки реакции нагреванием и центрифугирования надосадоч-

ную жидкость анализировали на содержание глюкозы глюкозооксидазным методом [Щер-бухин с соавт., 1970] и белка [Lowry et.al., 1951]. Специфическую активность выражали в нмолъ глюкозы/мин х мг белка.

Определение общего количества каротиноидов в спорах и мицелии грибов проводили по методике [Вйкулова с соавт., 1964]. Состав каротиноидов в смеси анализировали разработанным нами экспресс-методом [Терешина с соавт., 1994] и методом ТСХ на АЬОэ Хроматографирование проводили в системе ацетон : гексан = 1:49. Для количественного определения использовали следующие значения экстинкции: 3450 - для ликопина; 2505 - для ß-каротинаи 3100-дляу-каротина[Davies, 1965].

Анализ липидов. Экстракцию липидов проводили по методу Фолча [Folch et.al., 1951]. Разделение общих липидов на фракции фосфо-, глико- и нейтральных липидов проводили на колонке с силикагелем L (100/160 меш, Chemapol, Чехия) с использованием растворителей, различающихся по степени полярности [Кейтс, 1975]. Состав HJI и ФЛ анализировали методом восходящей тонкослойной хроматографии на стеклянных пластинках с силикагелем КСКГ. Для разделения HJT пользовались системой растворителей: гексан - серный эфир - уксусная кислота (85:15:1). Для разделения ФЛ использовали последовательно в одном направлении две системы растворителей: (1) гексан - серный эфир - уксусная кислота (85:15:1) и (2) хлороформ - метанол - уксусная кислота - вода (25:15:4:2). Хроматограммы опрыскивали 5% серной кислотой в этаноле с последующим нагреванием при 180°С до проявления пятен. Для анализа жирных кислот НЛ. ФЛ и ГЛ методом ГЖХ получали их метиловые эфиры. Метанолиз 5-10 мг липидов с 2 мл метанольного реагента (HCl: метанол = 1 : 5) проводили в тёмных пузырьках с завинчивающимися пробками с тефлоновыми прокладками при 80°С в течение 6 часов. Определение состава метиловых эфиров жирных кислот проводили на газожидкостном хроматографе Модель 3700 с пламенно-ионизационным детектором и стеклянной набивной колонкой длиной 2 м, наполненной 17% DEGS на твердом носителе Chromosorb W-AW AMGS-HP ( 80-100 меш). Хроматографирование проводили в изотермическом режиме при 170°С.

Для определения углеводною состава цитозоля мицелия и спор грибов экстракцию Сахаров проводили кипящей водой в течение 20 минут четырёхкратно. После центрифугирования в полученном экстракте удаляли белки [Somogui, 1945]. Дальнейшую очистку экстракта углеводов от заряженных соединений проводили, используя комбинированную колонку с ионообменными смолами Dowex-1 (ацетатная форма) и Dowex 50W (Н+). Количественный состав Сахаров определяли методом ГЖХ, получая из лиофильно высушенного экстракта триметилсилильные производные [Бробст, 1975] В качестве внутреннего стандарта использовали а-метил-О-маннозид. Хроматографирование проводили на газожидкостном хроматографе Модель 3700 с пламенно-ионизационным детектором, используя 2 м стеклянную колонку с 5% SE-30 на Хроматоне 70-90 меш и применяя температурную программу от 130 до 270°С со скоростью 5-6 град/мин.

Для определения количества гликогена споры 3-4-кратно разрушали методом замораживания оттаивания и растиранием в ступке с кварцевым песком, контролируя степень разрушения под световым микроскопом. Далее проводили экстракцию кипящей водой в течение 20 минут четырёхкратно. В полученном экстракте проводили ферментный гидролиз гликогена, используя амилоглюкозидазу [Brana et.al., 1982]. Для анализа образующейся глюкозы использовали глюкозооксидазный метод [Щербухин с соавт., 1970].

Статистическую обработку результатов проводили с использованием метода медианы [Ашмарин, Воробьев, 1962]. Опыты проводили в 3-6-кратной повторности.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ I. Углеводы цитозоля и липиды на вегетативной стадии развития грибов.

Грибы, относящиеся к отделам Zygomycota, Ascomycota и Basidiomycota, отличаются по составу растворимых углеводов цитозоля. Все грибы образуют глюкозу и трегалозу, но у базидиомицетных и аскомицетных грибов основными углеводами являются также сахароспирты (полиолы): глицерин, эритрит, арабит, маннит и инозит, которые только в качестве минорных компонентов встречаются у некоторых зигомицетов. Поэтому было проведено изучение состава углеводов в условиях температурного шока: (а) у представителей различных отделов грибов в фазе активного роста (трофофазе) и в период остановки ростовых процессов (идиофазе); (б) в присутствии адаптогена - антиоксиданта; (в) у термофильного гриба. Параллельно изучали, какие изменения происходят в составе липидов в условиях температурного шока.

1.1. Закономерности изменения состава углеводов мицелиальных грибов в ответ на действие теплового шока.

В динамике развития погруженной культуры С. japónica (Zygomycota)

при оптимальной температуре в середине трофофазы содержание углеводов цитозоля достигало 16,8% от сухой массы и представлены они в основном глюкозой. В идиофазе наблюдалось снижение уровня углеводов до 2,7% и появлялась трегалоза (6% от суммы углеводов). В ответ на действие ТШ в стадии трофофазы количество углеводов цитозоля изменялось несущественно, однако происходили заметные изменения их состава (табл. 1): наблюдался

Таблица 1

Изменения в углеводном составе мицелия С. japónica в стадии трофофазы под воздействием теплового шока в присутствии антиоксиданта ПХГ

Вариант опыта Сухая биомасса, г/л Углеводы % от сухой массы Углеводы, % от суммы

манноза глюкоза трегалоза

Контроль 5,0 21,0 3,3 94,2 2,4

ТШ 5,1 20,5 4,2 85,2 10,6

ТШ + ПХГ 5,5 19,7 3,2 77,2 19,6

Примечание ПХГ - 5-метил-2-этил-3-оксипиридин

рост уровня трегалозы в 4-5 раз. Если одновременно с действием ТШ ввести антиоксидант ПХГ, который способствует более быстрой адаптации к ТШ, то количество трегалозы возрастает примерно в 8 раз.

Другой мукоровый гриб В. &крога (гу§отуаЛа) на стадии идиофазы содержит небольшое количество полиолов - арабита и глицерина, однако основным углеводом является трегалоза, содержание которой под воздействием ТШ возрастает в полтора раза, тогда как холодовой шок (ХШ) вызывает небольшое увеличение количества арабита в составе углеводов (табл. 2).

Таблица 2

Состав углеводов цитозоля в мицелии (+) штамма В. (трога в стадии идиофазы под воздействием температурного шока.

Вариант опыта Углеводы, % от сухой массы Углеводы, % от суммы

глицерин арабит глюкоза грегалоза

Контроль 5,4 4,2 7,8 31,8 56,2

ХШ 6,4 4,2 9,6 30,0 56,2

Ш1 6,2 1,3 1,6 20,3 76,7

На примере мицелиального гриба А. niger (Азсошусо1а) установлено, что в середине трофофазы в мицелии, выращенном в оптимальных температурных условиях, углеводы цитозоля составляют около 9% от сухой массы и представлены, в основном, маннитом и глицерином (рис. 1).

ох

В трегалоза □ маннит

■ глюкоза

■ арабит Шэритрит В глицерин

К-1 К-2 ТШ-1 ТШ-2 ХШ-1 ХШ-2

Рис. 1. Состав углеводов цитозоля при тепловом и холодовом шоке на различных стадиях роста Л. niger.

Примечание: 1 -трофофаза, 2- идиофаза; Х- неидентифицированный углевод

Действие ТШ приводит к образованию нового углевода - трегалозы, доля которой достигает 80% от суммы углеводов на фоне снижения содержания ман-нита и исчезновения глицерина. Под влиянием ХШ происходит образование заметного количества глицерина (до 52% от суммы углеводов) и появление около 20% глюкозы. Нужно отметить, что общее количество углеводов в условиях ХШ и ТШ практически не изменяется.

В идиофазе мицелий контрольного варианта A.niger содержит примерно вдвое меньше углеводов цитозоля, чем в трофофазе, кроме того в их составе появляются трегалоза и арабит. Воздействие ТШ, как и в стадии трофофазы, приводит к росту уровня трегалозы (до 72% от суммы углеводов) на фоне снижения содержания полиолов. При ХШ наблюдается возрастание вдвое доли глицерина и появление около 20% глюкозы, тогда как уровень маннита и трегалозы снижается.

Особый интерес представляет изучение состава углеводов цитозоля в условиях температурного шока у термофильного гриба М. /АегторИНа (Азсоту-аЛа). Установлено, что у этого гриба уже в стадии трофофазы при оптимальной температуре в мицелии образуется значительное количество трегалозы (табл. 3 ). Внимание привлекает факт двукратного увеличения количества углеводов цитозоля в мицелии гриба под воздействием ТШ.

Таблица 3

Влияние температурного шока на состав углеводов цитозоля глубинного мицелия М. МегторкНа в стадии трофофазы

Вар иант Тепловой шок Холодовой шок

Углеводы, % от сухой массы Углеводы, % от сухой массы

глюкоза мании т инозит трегалоза сумма глюкоза маннит инозит трегалоза сумма

Кз 4,5 1,7 1,7 4,2 12,1 3,8 2,4 0,5 6,5 13,3

Оз 4,5 2,0 3,5 13,6 23,6 10,2 3,8 0,9 3,4 18,3

Кб 4,6 2,3 1,8 7,7 16,4 4,8 2,7 1,6 9,7 18,9

о6 6,3 - 8,2 19,6 34,1 4,0 2,6 0,2 1,5 8,3

Обозначения: Кз, Кб - контрольные варианты (3 и 6 часов после начала опыта) при 40-42°С; Оз, 06- опытные варианты ТШ - при 50-52°С, ХШ - при 26-28°С

В составе углеводов значительно увеличивается количество трегалозы и инозита. Диаметрально противоположная картина наблюдается при ХШ: к концу опыта количество углеводов вдвое снижается за счет падения уровня трегалозы, что приводит к увеличению долей маннита и глюкозы.

Особенностью углеводного состава глубинного мицелия Р. ОБП-еаШ (Ваз1с1ютусо1а) является присутствие двух дисахаридов - трегалозы и сахарозы, составляющих около 60-70% от суммы углеводов (рис. 2). Под воздействием ТШ в мицелии увеличивается количество глюкозы, трегалозы и сахарозы. Холодовой шок приводит к снижению уровня сахарозы в полтора раза, а содержание трегалозы практически не изменяется.

Костроль

Рис. 2. Состав углеводов цитозоля погруженного мицелия Р. аыКеаШх в условиях температурного шока (в % от сухой массы).

При воздействии Холодовым шоком на поверхностный мицелий 1риба Ь. edodes (Ваз1с1ютусо1а) количество углеводов возрастает с 8,6% до 11,8%. При этом наблюдались не только количественные, но и качественные изменения в составе углеводов: появлялся глицерин и более чем вдвое повышался уровень арабита на фоне снижения доли трегалозы и маннита (рис. 3).

хш

Контроль

40%

80%

100%

Вглицерин

глюкоза □ маниит В инозит Втрагапоза

Рис. 3. Состав углеводов цитозоля поверхностного мицелия L. edodes в условиях холодового шока (в % от суммы)

В итоге, проведенное исследование показало, что ответ на тепловой и хо-лодовой шок имеет принципиальные отличия. В условиях теплового шока у всех исследованных мицелиальиых грибов, независимо от фазы развития, наблюдается рост уровня трегалозы. Показано также, что и адаптогенное действие аитиоксиданта в условиях ТШ сопровождается значительным увеличением уровня трегалозы в мицелии. Кроме того, установлено, что у некоторых грибов сахароза и инозит могут участвовать в защите от теплового шока. Напротив, в условиях ХШ у мицелиальиых грибов наблюдается рост уровня полиолов и глюкозы на фоне снижения количества трегалозы.

1.2. Липидный состав вегетативных клеток грибов в условиях теплового шока.

У мукорового гриба С. japónica (Zygomycota) основные изменения под воздействием теплового шока наблюдаются в составе мембранных липидов: возрастает количество стеринов и ФЭА (табл. 4). Состав жирных кислот нейтральных и фосфолипидов под действием ТШ изменяется несущественно, тогда как в гликолипидах увеличивается доля C¡81, а в присутствии аитиоксиданта на фоне ТШ - Qs 1, С!8 2, Cis 3, что в обоих случаях приводит к росту степени ненасыщенности по сравнению с контролем.

Таблица 4

Состав липидов глубинного мицелия С. japónica под воздействием теплового шока в присутствии антиоксиданта ПХГ.

Вариант опыта Липиды, % от сухой массы Основные НЛ, % от суммы Фосфолипиды, % от суммы

ТАГ Ст см ФХ ФИ ФС ФЭА

Контроль 9,2 37,6 14,8 3,7 7,4 5,7 24,0 58,8

ТШ 8,8 50,9 22,7 2,6 4,1 4,6 20,8 67,9

ТШ+ПХГ 8,9 32,9 27,8 6,2 4,4 2,6 8,9 77,8

Липиды глубинного мицелия аскомицетного гриба А. niger (Азсотусо1а) в стадии средней трофофазы составляют около 5% от сухой биомассы. Фосфо-липиды мицелия гриба представлены, в основном, ФХ и ФЭА. На стадии трофофазы в контрольном варианте, при ТШ и ХШ доля ФХ составляет соответственно 18, 24 и 15%, тогда как в стадии идиофазы - 37,0, 28,3 и 2,2%, то есть количество ФХ не увеличивается. Нейтральные липиды мицелия в стадии трофофазы представлены преимущественно СЖК (36,7% от суммы), Ст

(25,4%) и ТАГ (19,4%), а в идиофазе - Ст (52,1%) и ТАГ (23,4%). Самые существенные изменения происходят при ТШ - в стадии трофофазы наблюдается рост доли ТАГ и стериновых соединений, тогда как в идиофазе заметно возрастает доля Ст - до 75,1% на фоне снижения доли ТАГ до 2,9%.

В стадии трофофазы под воздействием ТШ состав жирных кислот нейтральных и фосфолипидов изменяется незначительно, тогда как в гликолипи-дах наблюдается рост уровня Ci82 на фоне снижения доли 0и Ci6i- При ХШ во всех фракциях липидов повышается доля Ci83, однако в нейтральных липидах это происходит на фоне снижения доли Cjs i и Ci8 2, в гликолипидах -C]6 о, в фосфолипидах - С18 г-

Влияние ТШ в стадии идиофазы способствует снижению С 18.з и повышению Cig 1 в нейтральных липидах, росту С182 до 63% и снижению С16.о в фосфолипидах, исчезновению Сп о и повышению уровня С|4-жирных кислот в гликолипидах. При ХШ только в нейтральных липидах наблюдается эффект, свойственный всем фракциям липидов трофофазной культуры, - повышение вдвое уровня Сиз- В гликолипидах наблюдается появление Сi^-жирных кислот с двумя ненасыщенными связями, что сопровождается снижением Сп0и исчезновением Спо Появление Q4-C15 жирных кислот отмечено также в фосфолипидах на фоне снижения С16 о и Cjs 1. Степень ненасыщенности жирных кислот фосфолипидов мицелия гриба в трофофазе в оптимальных температурных условиях (контроле) составляет 1,37, при ТШ - 1,45, при ХШ - 1,29, тогда как в стадии идиофазы - 1,30, 1,52 и 1,27 соответственно.

Таким образом, вопреки обеим гипотезам адаптации к температурным изменениям в зоне толерантности [Sinensky, 1974; Hazel, 1995], на примере исследованных грибов нами установлено, что под воздействием теплового шока не наблюдается заметного снижения степени ненасыщенности мембранных липидов н увеличения доли стабилизирующего структуру мембран фосфолипнда - ФХ. Основные изменения касаются стериновых соединений -рост их уровня наблюдается, независимо от фазы развития, в условиях ТШ и, особенно, в присутствии антиоксиданта. Этот факт, а также значительное увеличение уровня некоторых углеводов в клетке при ТШ, дают основание предложить новую гипотезу защиты мембран с помощью мембраностабилизирующих соединений, к которым относятся стерины и термопротекторные углеводы - трегалоза, сахароза и инознт.

1.3. Углеводы цитозоля в процессе индукции плодообразования базидиально-го гриба L. edades Холодовым шоком.

В онтогенезе многих базидиомицетов стадия плодообразования индуцируется холодовым шоком. Основываясь на результатах действия ХШ на углеводный состав мицелия грибов и литературных данных об индукции катаболизма запасных углеводов в процессе плодообразования [Wessels, 1994], возникло предположение об участии углеводов цитозоля в механизме стимуляции плодообразования.

На примере L. edodes показано, что части плодового тела имеют примерно равное количество (11-15% от сухой массы), но различный состав углеводов. В ножке гриба углеводы представлены поровну маннитом, арабитом и трегалозой, тогда как в шляпке основным углеводом является маннит, доля которого достигает 80%. Нами установлено, что состав поверхностного мицелия гриба близок к таковому в ножке плодового тела, но под действием холодового шока в нем значительно увеличивается доля арабита и появляется новый компонент - глицерин (рис. 3). Эти данные подтверждают предположение о том, что холодозависимый синтез углеводов может быть связан с индукцией плодообразования. Для исследования этого вопроса был изучен состав углеводов на ранних стадиях развития плодового тела под воздействием холодового шока различной глубины. Нужно отметить, что оптимальная температура роста мицелия гриба - 26-28°С, после переноса мицелия в стадии идиофазы в условия холодового шока - 15-17°С наблюдается образование небольшого количества плодовых тел. Но если в качестве холодового шока используются более низкие температуры, например 8-10 или 0-2°С в течение 24-36 часов, а затем культивирование продолжают при 15-17°С, то количество плодовых тел возрастает в несколько раз.

Изучение углеводного состава цитозоля L. edodes в процессе образования плодового тела на стадиях несформировавшегося и сформировавшегося примордиев, а также на стадии молодого плодового тела показало, что существует определенная последовательность появления углеводов. Так, в варианте с глубоким холодовым шоком уже в фазе несформировавшегося примордия

количество глицерина достигает максимума - 8-9% от суммы углеводов, затем уровень этого углевода снижается до следовых количеств в молодом плодовом теле. А в контрольном варианте на стадии ^сформировавшегося примордия глицерина практически нет, но он появляется позже - на стадии сформировавшегося примордия и тоже исчезает в плодовом теле. Это согласуется с фактом снижения в условиях шока уровня трегалозы в ^сформировавшемся примор-дии по сравнению с контрольным вариантом. Эти результаты позволяют предположить холодомиметическое действие полиолов, синтезируемых грибом под влиянием ХШ, в данном случае - глицерина и арабита.

1.4. Углеводы и лип иды в адаптации к гипотермии у базидиального гриба

Р. \elutipes.

Биология этого гриба вызывает интерес в связи со способностью плодовых тел переносить слабые заморозки до -5°С. Является ли это настоящим крио-биозом или только способностью кратковременно переносить низкие температуры пока неясно, но изучение химического состава базидиом при отрицательных температурах может прояснить этот вопрос. Для этого в природных условиях были собраны плодовые тела Р. уЫииреэ при следующих колебаниях ночной и дневной температур: +(10-15) (оптимальные условия), +(3-5)°С (I вариант гипотермии) и после резких заморозков без снега в течении 2 суток при -(5-1)°С (П вариант гипотермии).

Растворимые углеводы цитозоля в шляпках Р. уеШНреэ в оптимальных температурных условиях составляют 15,3% и представлены трегалозой и двумя полиолами - арабитом и маннитом, причем преобладающим (81% от суммы углеводов) является арабит (рис. 4). Характерной чертой состава углеводов при I варианте гипотермии является появление нового полиола - глицерина, достигающего 20% от суммы углеводов и существенное снижение содержания ара-бита (более чем в 3 раза) и трегалозы (в полтора раза). Отрицательные температуры вызывают по сравнению с I вариантом гипотермии увеличение в 1,5 раза общего количества углеводов, среди которых существенно повышается содержание глицерина ( в 2,5 раза) и арабита (в 1,5 раза), причем на фоне постоянного уровня трегалозы. Полученные данные об углеводном составе сви-

детельствуют о том, что при гипотермии у Р. уе1ийрез наблюдается аккумуляция глицерина и арабита.

01 ОН Ш1П

глицерин а рябит маниит трсгшюзя

Рис. 4. Состав углеводов цитозоля шляпок базидиом К уеЫИрея в зависимости от температурных условий роста.

Примечание: Температура: 1-+(7-15), II-+(3-5); Ш--(1-5°С)_

Количество общих липидов шляпок грибов К уе!иОрез в оптимальных температурных условиях достигает 6,8% от сухой массы и снижается почти вдвое при отрицательных температурах. Полярные липиды составляют 49-55% от суммы липидов, среди которых больше фосфолипидов (26-32%), чем глико-липидов. Основным изменением в нейтральных липидах под действием гипотермии является рост доли углеводородов и ЭСт и снижения Ст. В составе фосфолипидов существенно изменяется соотношение ФХ/ФЭА: от 1,25 в оптимальных условиях до 2,5 во II варианте гипотермии.

Особенностью состава жирных кислот гриба является преобладание во фракции глико- и нейтральных липидов С16о, С^ ь С)8 2 и С)8 з- Жирные кислоты ФЛ (рис. 5) наиболее ненасыщенные (СН - 2,20), так как основными являются С182 и С|8 з, составляющие около 75% при оптимальных температурах и до 85% от суммы жирных кислот во II варианте гипотермии. Основные изменения в жирных кислотах фосфолипидов - рост уровня С18 з (до 50%) на фоне снижения количества С18 2-

eat on вш

60

50-

30

m

ClfcO С 16:1

С 18:0

C18:l

С 18:2

C18:3

Рис. 5. Состав жирных кислот фосфолипидов шляпок базидиом Г. \е1ийре$ при гипотермии (в % от суммы).

Примечание. Температура■ 1-+(7-15); II- +(3-5); Ш--(1-5°С)

Таким образом, обнаружено, что при гипотермии у F. velutipes существенные изменения происходят именно в мембранных липидах, основными компонентами которых являются ФЛ, ГЛ и Ст. Наблюдается рост доли фосфолипидов на фоне снижения уровня Ст и ГЛ. Исходя из этого, видно, что основные изменения связаны с ФЛ, в составе которых возрастает доля ФХ и повышается содержание линоленовой кислоты, что приводит к высокой СН.

Анализируя полученный экспериментальный материал на примере вегетативных клеток грибов из различных отделов Fungi, можно сделать следующие заключения. У мезофильных грибов трегалоза накапливается в небольшом количестве только в идиофазе. Однако, под влиянием теплового шока уровень этого дисахарида может возрасти 4-8% от сухой массы, независимо от фазы роста грибов. Это соответствует концентрации трегалозы в стадии трофофазы у термофильного гриба М. thermophiia, что позволяет сделать предположение о возникновении термофилии у грибов путем приобретения конститутивного синтеза трегалозы. Обнаружено, что в адаптации к тепловому шоку у некоторых грибов, наряду с трегалозой, могут участвовать инозит и сахароза.

Тот факт, что в составе фосфолипидов и их жирных кислот под воздействием теплового шока не обнаружено изменений, характерных для адаптации к температурным изменениям в зоне толерантности, показывает, что в защите мембран от теплового шока участвуют в основном, соединения (стерины и углеводы), способные встраиваться в липидный бислой, оказывая стабилизирующее действие.

Ответ мицелиальиых грибов на холодовой шок включает аккумуляцию малоатомных полиолов - арабита и глицерина. В условиях слабых отрицательных температур количество глицерина в плодовых телах F. velutipes достигает

трети от суммы углеводов, тогда как в оптимальных условиях этот полиол отсутствует. Этот факт указывает на его антифризное действие. Исследование состава углеводов в процессе образования плодовых тел, индуцируемого Холодовым шоком, позволяет предположить регуляторное действие полиолов.

II. Углеводы и липиды в покоящихся клетках мицелиальных грибов.

Основная идея настоящей работы - исследовать покоящиеся клетки с позиций адаптации к температурному шоку, который является индуктором защитной системы вегетативных клеток. Это позволит понять, как споры адаптированы одновременно к ТШ и ХШ, какую роль играют углеводы и липиды в спорах с различным типом покоя, термостабильности спор и сохранении жизнеспособности при их хранении.

2.1. Особенности химического состава эндогенно и экзогенно покоящихся спор В. Мьрога.

Этот гриб интересен тем, что в цикле его развития присутствуют споры с различными типами покоя. Так, В. Мхрога образует в процессе бесполого размножения два типа спорангиев: стилоспорангии, содержащие до трехсот спор, и спорангиоли с тремя спорами. Установлено, что состав среды и облучение спорогенной культуры светом различного спектрального состава влияет только на интенсивность спорообразования, тогда как температура является регулятором типа бесполого размножения: при 24-26°С образуются преимущественно спорангиоли, при 29-29,5°С - стилоспорангии. Установлено, что спорогенез стимулирует облучение зеленым светом поверхностной культуры в стадии идиофазы.

В результате полового взаимодействия (+) и (-) штаммов этот гриб образует зигоспоры. Нужно отметить, что на среде, оптимальной для бесполого спороношения, образуются единичные зигоспоры, а для интенсивного зигото-образования требуются богатые натуральные среды, например сусловый агар. Исследование 13 музейных штаммов выявило, что все штаммы гриба способны образовывать зигоспоры с определенным партнером, однако интенсивность этого процесса и избирательность по отношению к партнеру заметно различаются. Выявлены пары штаммов не образующие, слабо и интенсивно образующие зигоспоры. Установлено, что оптимальной температурой зиготообразова-ния является 25-26°С, что значительно отличается от температурного оптимума роста гриба (28-32°С). Ингибиторный анализ показал, что для зиготообразова-

ния необходим синтез (3-каротина. Для зрелых зигоспор характерна темная окраска оболочки, наличие крупной центральной липидной вакуоли, митохондрий с немногочисленными кристами и гранул гликогена.

Споры из спорангиолей (СП) и стилоспорангиев (СТ), образующиеся в результате бесполого спороношения, прорастают в оптимальных температурных условиях при наличии воды (тип покоя - экзогенный). Зигоспоры имеют длительный период покоя (несколько месяцев), в течение которого спора неспособна к прорастанию, так как происходит дозревание, связанное с мейозом [Cutter, 1942] (тип покоя - эндогенный).

Изучение состава растворимых углеводов цитозоля спорангио- и зигоспор В. trispora показало, что основным углеводом во всех видах покоящихся клеток является трегалоза, составляющая 70-90% от суммы углеводов (табл. 5).

Таблица 5

Состав углеводов покоящихся клеток В. trispora

Вариант Гликоген, % от сухой массы Растворимые углеводы, % от сухой массы Растворимые углеводы, % от суммы

глюкоза трегалоза инозит

СП(+) 0,3 6,1 11,3 87,3 1,4

СТ(+) 0,5 7,6 9,3 90,7 -

СП(-) 0,6 3,1 28,8 71,2 -

СТ(-) 1,3 4,6 18,2 81,8 -

Зигоспоры 0,3 3,8 23,7 76,3 -

Следует отметить, что у обоих штаммов СТ содержат больше трегалозы и гликогена, чем СП. Существенных отличий между спорангио- и зигоспорами в составе углеводов не обнаружено.

Напротив, в составе липидов (табл. 6) между клетками В. йгярога, находящимися в состоянии экзогенного (СТ и СП) и эндогенного (зигоспоры) покоя, наблюдаются заметные различия. Зигоспоры содержат в несколько раз больше липидов, чем спорангиоспоры. Для них характерно большое количество ТАГ(до 33%) и повышенное содержание СЖК в составе нейтральных липи-

дов по сравнению со спорангиоспорами. Привлекает внимание тот факт, что в СТ содержится больше стериновых соединений, чем в СП.

Таблица 6.

Состав нейтральных липидов покоящихся клеток В. Мърога.

Вариант спор Липиды, % от сухой массы Липиды, % от суммы Нейтральные липиды, % от сухой массы

НЛ: ФЛ .ГЛ МГ ДГ Ст сжк ТАГ ЭСт УВ

СП(+) 16,7 69,6:13,5:16,9 Сл 0,57 1,00 0,78 7,67 1,24 0,21

СТ(+) 19,4 69,6:16,9:13,5 0,32 1,30 1,71 0,20 8,57 0,92 0,47

СП(-) 6,1 37,0:40,9:22,1 - 0,08 0,59 0,31 0,48 0,85 -

СТ(-) 7,4 38,3:47,1:14,6 - 0,17 0,60 0,12 0,37 1,56 -

Зигоспоры 40,1 91,1:6,3:2,6 - 0,80 0,51 1,20 33,16 0,80 Сл

В фосфолипидах всех типов спор основным является ФХ, доля которого достигает 50-65% от суммы. В зигоспорах обнаружены два фосфолипида, отсутствующие в спорах, - ЛФХ и КЛ. Этим покоящимся клеткам свойственно значительно более низкое, чем в спорангиоспорах, содержание ФЭА - основного фосфолипида вегетативных клеток (рис. 6).

Сравнение жирнокислотного состава отдельных классов липидов позволило установить, что: (а) в составе жирных кислот НЛ между эндогенно и экзо-генно покоящимися клетками существенных различий не обнаружено, основными являются С160, С181 и С182; (б) для ФЛ зигоспор, по сравнению со спо-

рангиоспорами, характерно более высокое содержание С160 и С|7-0 (в 2-4) и более низкий уровень Cig2, что приводит к существенному снижению СН (до 0,5); (в) для гликолипидов зигоспор характерно большее (в 1,5-2 раза) содержание С|бо, Cigo, тогда как уровень С)7о в 2-6 раз ниже, чем в спорангиоспо-рах.

В составе липидов покоящихся клеток обнаружены каротиноиды, которые представляют интерес как внутриклеточные антиоксиданты. Изучение их состава в зигоспорах и спорангиоспорах выявило следующие закономерности: (а) во всех типах покоящихся клеток преобладающим каротиноидом является у-каротин; (б) в спорах (-) штамма отсутствует ликопин (табл. 7). Представляет интерес тот факт, что в зигоспорах содержится значительно большее количество ликопина (в 15 раз), чем в спорангиоспорах, что может быть связано с его высокой антиоксидантной активностью, необходимой для продолжительного периода покоя.

Таблица 7

Состав каротиноидов покоящихся клеток В. trispora

Споры Каротиноиды, % от сухой массы Каротиноиды, % от сухой массы

у-каротин ликопин Р-каротин

СП(+) 0,04 0,025 0,01 0,005

СТ(+) 0,05 0,031 0,01 0,01

СП(-) 0,75 0,65 - t),10

СТ(-) 0,70 0,64 - 0,06

зигоспоры 0,45 0,225 0,15 0,075

Настоящее исследование выявило также различия между спорами из стилоспорангиев и спорангиолей. В образующихся при повышенной температуре СТ обнаружено большее содержание трегалозы и стериновых соединений. Основываясь на результатах исследования ответа вегетативных клеток на тепловой шок, можно предположить, что это связано с большей термостабильностью СТ. Исследование этого вопроса важно для понимания биологического смысла двух типов спороношения у В. (трога. Сравнительное изучение тер-

моустойчивости СТ и СП (+) и (-) штаммов выявило общую закономерность -СТ обоих штаммов на 4-6°С более термоустойчивы, чем СП (рис. 7), что подтверждает термопротекторную роль трегалозы и стеринов. Эти результаты показывают также, что существует прямая корреляция между количеством трегалозы и термостабильностью, что видно как при сравнении соответствующих спор (+) и (-) штаммов, так и спор каждого штамма.

температура, град. С

Рис. 7. Термоустойчивость спорангиоспор (+) и (-) штаммов В. trispora.

Обозначения: CT (I) и СП (II) (+) штамма; CT (III) и СП (IV) (-) штамма

Таким образом, на примере покоящихся клеток В. Мврога общими признаками эндогенно и экзогенно покоящихся клеток являются высокое содержание трегалозы и преобладание фосфатндилхолина в фосфолипидах. Основные различия проявляются в лнпидном, а не в углеводном составе клеток. Отличительными чертами зигоспор являются: высокий уровень основных энергетических соединений - трнацнлглицеринов, низкая степень ненасыщенности жирных кислот фосфолипидов и наличие в них ЛФХ и КЛ, а также высокий уровень ликопина, который обладает самой высокой антиоксидантной активностью среди каротиноидов. Напротив, для спорангиоспор характерными признаками являются значительная доля ФЭА в фосфолипидах и высокая степень ненасыщенности их жирных кислот.

Насколько эти различия между экзогенно и эндогенно покоящимися клетками являются универсальными? Для выяснения этого вопроса был дополнительно изучен углеводный и липидный состав эндогенно покоящихся базидиоспор А. Ькрогш и экзогенно покоящихся конидий А. т§ег.

Углеводы цитозоля базидиоспор А. Ыярогш составляют около 12% от сухой массы и представлены маннитом и трегалозой в соотношении 3:1. Ко-

личество липидов в спорах достигает 20-24%, доля НЛ в них составляет 77%. В составе НЛ основными компонентами являются ТАГ (87% от суммы), Ст (7,0) и Эст (4,6%), в качестве минорного компонента обнаружены диацилгли-церины. В составе жирных кислот НЛ преобладает линолевая кислота (68,6%), что определяет их высокую степень ненасыщенности (1,47). Фосфо-липиды представлены ФХ (50,0), ФС (22,5), ФЭА (27,5%). Основной жирной кислотой ФЛ является пальмитиновая (34%), содержание линолевой кислоты, в отличие от НЛ, составляет около 20%, поэтому СН вдвое ниже (0,70).

Углеводы цитозоля конидий А. т£ег составляют 10-14% от сухой массы и представлены рядом сахароспиртов (глицерином, эритритом, арабитом, маннитом), глюкозой и трегалозой, составляющей 30-35% от суммы. Конидии А. !%ег содержат 5-7% липидов. Характерной особенностью покоящихся конидий является преобладание ТАГ (74% от суммы) в составе нейтральных липидов и ФХ (79% от суммы) в составе фосфолипидов. В покоящихся конидиях самыми ненасыщенными являются жирные кислоты фосфолипидов (СН -1,52), самыми насыщенными - жирные кислоты гликолипидов (0,70).

Таким образом, сравнивая эндогенно покоящиеся базидиоспоры А. 1ш-ропк и зигоспоры В. Мзрога с экзогенно покоящимися спорангиоспорами В. йгёрога и конидиями А. можно заключить, что для всех типов покоящихся клеток характерно высокое содержание трегалозы и преобладание фосфати-дилхолина в составе фосфолипидов. Отличительными чертами эндогенно покоящихся спор является высокое содержание запасных триацилглицеринов и низкая степень ненасыщенности жирных кислот фосфолипидов Экзогенно покоящимся клеткам свойственна высокая степень ненасыщенности жирных кислот фосфолипидов, сравнимая с таковой в вегетативных клетках.

2.2. Ответ экзогенно покоящихся конидий A.mger на температурный шок

Выдерживание воздушно сухих конидий А. niger при 10°С в течение 30 суток практически не изменяет их способность к прорастанию, но при 37 °С -приводит к снижению их всхожести на 14%.

Изменение температуры хранения практически не влияет на количество липидов в конидиях и соотношение в них глико-, фосфо- и нейтральных липидов. Однако заметные изменения отмечаются в составе нейтральных и фосфолипидов. Значительный интерес представляет увеличение содержания в НЛ

стеринов (вдвое) при действии ТШ (табл. 8), что отмечено и для вегетативных клеток. Еще более заметные изменения в условиях температурного шока обнаружены в составе ФЛ: при ТШ и ХШ наблюдается увеличение содержания ФХ, но в случае ТШ - на фоне снижения уровня ФЭА, а при ХШ - за счет небольшого снижения долей ЛФХ, ФЭА и КЛ.

Таблица 8

Влияние температуры на состав нейтральных липидов конидий А. тдег

Температура, Нейтральные липиды, % от суммы Фосфолипиды, % от суммы

дг СТ СЖК ТАГ ЭСТ УВ ЛФХ ФХ ФС ФЭА КЛ

20 3,7 7,7 5,1 42,6 26,5 13,6 8,0 64,5 0,6 22,8 4,0

37 8,4 14,5 5,4 49,3 Сл 22,2 12,2 84,1 Сл 3,7 Сл

10 7,6 8,2 4,5 41,8 22,0 14,1 3,9 75,0 Сл 19,7 1,4

Изучение состава углеводов конидий А. п'щег при ТШ показало, что наблюдается слабое увеличение уровня эритрита, арабита и трегалозы, сопровождающийся снижением количества маннита и глицерина. Напротив, при ХШ заметно увеличивается уровень глицерина и несколько уменьшается содержание эритрита и трегалозы (табл. 9).

Таблица 9

Влияние температуры на состав углеводов цитозоля конидий А. ш§ег.

Температ ура,°С Углеводы, % от сухой массы Углеводы, % от суммы.

Глицерин Эритрит Арабит Маннит Трегалоза

20 10,5 12,4 12,4 10,5 42,8 21,9

37 10,4 10,3 14,7 14,7 37,4 22,9

10 10,5 17,3 10,6 12,5 41,3 18,3

Итак, особенностью ответа экзогенно покоящихся клеток на действие теплового шока по сравнению с вегетативными клетками является слабое изменение уровня трегалозы, тогда как в составе липидов наблюдается увеличение уровня стеринов. В ответ на действие холодового шока увеличивается доля глицерина в составе углеводов. Состав жирных кислот фосфолипидов в условиях как теплового, так и холодового шоков изменяется незначительно. Универсальной реакцией является увеличение доли фосфатидилхолина в составе фосфолипидов.

2.3. Влияние углеводного состава цитозоля конидий А. niger на их жизнеспособность при хранении.

Что происходит с составом углеводов при хранении спор и как это связано с их жизнеспособностью? Этот вопрос представляет интерес изучить на примерах спор с различными типами покоя.

Для этого, используя различные среды и изменяя условия спорогенеза,

были получены экзогенно покоящиеся конидии А. пг$ег с различным углеводным составом. Выбор объекта обусловлен возможностью сбора конидий безводным способом, исключающим индукцию прорастания.

Исследование конидиеобразования на средах различного состава показало, что наиболее интенсивное образование конидий происходит на богатой сусло-агаровой среде по сравнению со средой Чапека с нитратным азотом. Частичная замена сахарозы в среде Чапека на трегалозу, маннит или глицерин не оказывало существенного влияния на интенсивность спорогенеза. На сусловом агаре повышение температуры культивирования на 4°С снижает количество конидий в 3 раза, а освещение поверхностной культуры зеленым светом в 4 раза увеличивает количество конидий.

Установлено, что содержание растворимых углеводов в исходных конидиях А. ш§ег зависит от состава среды выращивания. Так, оно значительно выше в конидиях, полученных на всех вариантах среды Чапека (8-17%), по сравнению с выращенными на сусловом агаре конидиями, которые содержали только 3-4% углеводов.

Изучение состава углеводов цитозоля конидий показало, что растворимые углеводы представлены, в основном, трегалозой и маннитом, а также минорными углеводами - глицерином, эритритом и арабитом, а нерастворимый полисахарид гликоген отсутствовал. Установлено, что: (1) в двух случаях -при введении трегалозы в состав среды и при выращивании в супраоптималь-ных температурных условиях количество трегалозы в конидиях значительно возрастало (в 2-3 раза); (2) осмотическое давление в среде, создаваемое 14% глицерина, приводило к появлению в составе углеводов конидий глицерина и эритрита; (3) в двух случаях - при освещении зеленым светом и на среде с 14% глицерина - в составе углеводов конидий наблюдалось равное количество тре-

галозы и маннита, тогда как во всех остальных вариантах трегалоза существенно преобладала над маннитом. В результате были получены конидии с различным составом углеводов.

При хранении всхожесть всех вариантов конидий снижалась, причем наиболее резко после 60 суток хранения. К 7-ми месяцам хранения наиболее отчетливо проявлялись различия в жизнеспособности конидий в зависимости от условий их получения. Все варианты можно разделить на 2 группы. В первую группу входят 4 варианта конидий: выращенные в оптимальных температурных условиях на среде Чапека и в присутствии 2% трегалозы, а также на сусловом агаре в оптимальных и супраоптимальных температурных условиях. Эти конидии примерно на 45-50% утрачивали всхожесть к 7 месяцам хранения. Во вторую группу входят варианты конидий, значительно утративших всхожесть ( на 75-85%): выращенные на сусловом агаре при освещении зеленым светом и в обоих вариантах вариантах среды Чапека с глицерином.

Изучение всхожести и состава углеводов при хранении конидий (при комнатной температуре и влажности) позволило выявить общую закономерность, независимую от условий спорогенеза, - наличие значительных (в 2-4 раза) колебаний уровня растворимых углеводов (рис. 8).

Можно выделить несколько особенностей в изменении состава углеводов цитозоля конидий при хранении:

• исходное соотношение трегалозы и маннита изменялось незначительно, независимо от колебания общего количества углеводов;

• к 7 месяцам хранения практически во всех вариантах конидий наблюдалось появление низкомолекулярных полиолов и глюкозы.

Показано, что между интенсивностью спорогенеза и количеством углеводов в конидиях наблюдалась обратная зависимость. Причем исходный уровень углеводов в конидиях определял характер их изменений в процессе хранения. Так, в конидиях с низким содержанием углеводов наблюдалось повышение их уровня, а при высоком исходном количестве - сначала снижение их уровня до 4-6%, а затем подъем практически до исходного количества.

Рис. 8. Содержание углеводов при хранении различных вариантов конидий А. ПЩег (условия получения конидий описаны в разделе «Обхекты и методы исследований»

Полученные нами данные позволили установить определенную зависимость всхожести конидий от нескольких исследованных факторов - интенсивности спорогенеза, начального уровня и состава углеводов цитозоля. Установленные закономерности можно сформулировать следующим образом:

• увеличение интенсивности спорогенеза отрицательно влияло на сохранение всхожести конидий при хранении;

• снижение всхожести четко коррелировало: (1) с периодом возрастания уровня углеводов в конидиях; (2) с появлением в составе углеводов конидий низкомолекулярных полиолов и глюкозы;

• сохранению всхожести способствовало преобладание трегалозы над маннитом и отсутствие малоатомных полиолов в составе углеводов исходных конидий.

2.3. Углеводный состав и жизнеспособность эндогенно покоящихся базиди-оспор А. Ьюрогш при хранении в различных температурных условиях.

В связи с противоречивыми данными о стимуляторах прорастания бази-

диоспор первоначально были исследованы факторы, способствующие выходу клеток из покоящегося состояния. Базидиоспоры А. Ыэрогт представляют со-

бой овальные клетки с одним или несколькими крупными липидными включениями, обычно расположенными в центре. Для этих покоящихся клеток характерна одна ростковая пора, поэтому стадии набухания не наблюдается.

Базидиоспоры не прорастают на голодном агаре и на средах, содержащих только 0,5% глюкозы или мальтозы, но 1-4% базидиоспор прорастает на богатых средах, например на 2 и 7°Б сусловом агаре и среде Гудвина. Особенностью процесса прорастания является большая длительность I фазы, так как появление ростковых трубок наблюдается через 6-8 суток.

По литературным данным, тепловой шок оказывает на прорастание базидиоспор А. Ыярогия отрицательное действие [Клюшникова, 1940], однако, по нашему мнению, в цитируемой работе были использованы слишком жесткие температурные обработки (50-70°С в течение 1 часа). Результаты наших исследований показали, что тепловой шок (45°С в течение 20 мин) значительно стимулировал прорастание базидиоспор (в 3-4 раза) (рис. 9).

35 40 46 50 S5

Температура, град. С

Рис.9. Влияние тепловой обработки на прорастание базидиоспор A. bispoms

Была установлена еще одна интересная закономерность: температура и продолжительность хранения базидиоспор (2 С и 20°С) оказывали влияние на их всхожесть. Показано, что при температуре хранения 2-4°С дольше сохраняется жизнеспособность базидиоспор и эффект от стимулирующего влияния термошока при 45°С больше почти в два раза, чем у базидиоспор, хранившихся при 18-22°С. В базидиоспорах, хранившихся на холоду, всхожесть снижалась примерно на 20% к 150 суткам хранения, в то время как хранение при 18-22°С приводило к резкому снижению способности к прорастанию (вдвое) уже к 60 сут, а через 150 дней - к полной ее утрате. При хранении базидиоспор на

холоду наблюдается снижение уровня углеводов цитозоля примерно вдвое, тогда как при комнатной температуре - в 4-5 раз, что сопровождается увеличением соотношения маннит/трегалоза, т.е. более быстрым использованием трегалозы (табл. 10). Напротив, при хранении на холоду в течение 150 суток соотношение двух основных углеводов цитозоля практически не отличалось от исходного. Поэтому можно заключить, что снижение всхожести базидиос-пор положительно коррелирует с количеством трегалозы, а не маннита.

Таблица 10

Состав углеводов цитозоля базидиоспор A. bisporus и их всхожесть при хранении в различных температурных условиях.

Время Темпе- Всхо- Углеводы, ман- Углеводы, % от суммы

хране- ратура, жесть, % % от сухой нит/тре

ния, сут С массы галоза Арабит Маннит Трегалоза

17 — 13,2 12,0 2,9 - 74,1 25,9

60 2-4 11,8 5,1 1,5 7,8 54,9 37,3

60 18-22 6,7 2,35 4,9 - 82,8 17,2

150 2-4 10,7 5,9 2,9 - 74,3 25,7

150 18-22 0,0 3,2 4,5 - 81,5 18,5

Известно, что ряд гетероциклических соединений, например фурфурол, оказывают стимулирующее влияние на прорастание многих спор, имеющих эндогенный покой [Mills, Eilers, 1973; Sussman, 1976]. Нами установлено, что добавление фурфурола не оказывает стимулирующего действия на прорастание базидиоспор A. bisporus, причем даже в сочетании с тепловой обработкой.

Таким образом, установлено, что тепловой шок при 45°С значительно (в 3-4 раза) стимулирует прорастание, что проявляется не только в количестве проросших базидиоспор, но и в сокращении времени I фазы прорастания. Эти данные свидетельствуют о том, что базидиоспоры находятся в эндогенном покое, особенностью которого является нечувствительность к фурфуролу. При хранении базидиоспор наблюдается последовательное снижение содержания углеводов. Хранение при низкой температуре лучше сохраняет всхожесть базидиоспор в течение 5 месяцев, что обусловлено более медленным снижением количества трегалозы.

Анализ полученных данных об особенностях углеводного состава спор грибов при хранении позволяет выявить различия между экзогенно и эндогенно покоящимися клетками. Установлено, что конидии А. п^ег имеют механизмы контроля уровня трегалозы в клетке при хранении, так как после его снижения до 3-4% наблюдается подъем практически до исходного уровня. Напротив, при хранении базидиоспор наблюдается постепенное снижение количества трегалозы, что сопровождается снижением жизнеспособности клеток.

Ш. Углеводы цитозоля и липиды в процессе прорастания спор грибов.

Процесс прорастания спор грибов является возвратом из покоящегося состояния к активному метаболизму. Как и когда используются разнообразные углеводы и липиды при прорастании спор? Поскольку трегалоза является одним из основных углеводов спор, возникает вопрос о взаимосвязи активности трегалазы, количеством трегалозы и скоростью прорастания спор.

Для исследования первого вопроса был выбран аскомицетный гриб А.

niger, в конидиях которого кроме трегалозы содержится ряд сахароспиртов. Предварительно были подобраны среды и изучены факторы, способствующие активному прорастанию конидий в жидкой среде.

В жидкой среде Блюменталя-Роземана I фаза прорастания (набухание) продолжается 4-6 часов, появление ростковых трубок (II фаза) происходит несинхронно в течение следующих 4-5 часов. К 12 часам роста ростковые трубки начинают ветвиться.

Углеводы цитозоля покоящихся конидий составляют 10-14% от сухой массы и представлены рядом сахароспиртов (глицерином, эритритом, араби-том, маннитом), глюкозой и трегалозой (табл. 11). Самые заметные изменения в составе и количестве углеводов цитозоля связаны с I фазой прорастания

Таблица 11

Состав углеводов цитозоля конидий А. пщег в процессе прорастания

Время, Углеводы, % от Углеводы, % от суммы

прорас тания, глицерин эритрит арабит X глюкоза маннит трегалоза

ч сухой массы

0 13,6 5,9 6,4 11,6 - 2,9 42,1 31Д

4 4,5 45,7 2,3 5,1 3,0 6,1 25,3 12,5

8 3,4 38,7 1,2 4,5 4,9 12,5 27,2 11,0

12 4,9 33,3 - 2,7 - 5,8 48,3 9,9

Примечание: — не обнаружен; Х- неидентифицированныйуглевод

На фоне резкого снижения общего количества углеводов (в три раза) происходит смена одного из основных углеводов цитозоля - трегалозы (в покоящихся спорах) на глицерин (в прорастающих). Снижение количества углеводов цитозоля наблюдается до стадии появления ростковых трубок, затем начинается подъем их уровня.

Конидии А.т§ег в состоянии покоя содержат 5-7 % легко экстрагируемых липидов, причем в процессе прорастания не наблюдается резкого снижения их количества (табл. 12).

Таблица 12.

Состав липидов конидий А. niger в процессе прорастания.

Время прорастания, ч. Липиды, % от сухой массы Липиды, %от суммы Основные нейтральные липиды, % от суммы Основные фосфоли-пиды, % от суммы

НЛ:ФЛ:ГЛ, Ст СЖК ТАГ ФХ ФС ФЭА

0 6,7 73,9:16,5:9,6 7,8 2,9 73,3 78,8 9,5 9,5

4 5,3 72,7:17,7:9,6 12,5 19,3 44,6 60,7 25,5 13,8

8 6,4 57,4:23,2:19,4 19,7 29,5 36,1 39,3 46,9 13,8

12 5,2 65,1:20,6:14,3 28,8 21,4 27,1 44,5 34,1 21,1

Характерной особенностью покоящихся конидий является преобладание ТАГ (74% от суммы) в составе нейтральных липидов и ФХ (79% от суммы) в составе фосфолипидов. На стадии набухания (4 часа) наблюдается резкое увеличение доли СЖК, ДГ, МГ и Ст на фоне снижения таковой ТАГ. При появлении ростковых трубок основными HJI становятся Ст, СЖК и ТАГ. В составе фосфолипидов на всех стадиях прорастания наблюдается рост долей ФС и ФЭА и снижение - ФХ.

Общей закономерностью в жирнокислотном составе всех фракций липидов в процессе прорастания является увеличение доли С)8 В покоящихся конидиях самыми ненасыщенными являются жирные кислоты фосфолипидов (СН - 1,52), самыми насыщенными - гликолипидов (0,70). СН жирных кислот нейтральных и особенно гликолипидов в процессе прорастания возрастает, тогда как фосфолипидов - изменяется мало. Из результатов исследования липид-ного и углеводного состава коншЯРФЛв/ЦШрижснияВРЦессе прорастания: (а)

[ библиотека | j ;

< о» т иг

количество углеводов цитозоля снижается в 2-3 раза, тогда как уровень липи-дов изменяется несущественно; (б) основными углеводами цитозоля становятся глицерин и маннит (в) в составе липидов увеличивается доля фосфо- и гли-колипидов на фоне снижения количества нейтральных липидов; (г) в составе HJI резко снижается количество ТАГ, что сопровождается ростом уровня СЖК и Ст; (д) в составе фосфолипидов наблюдается увеличение доли ФС и ФЭА на фоне снижения доли ФХ; (е) в фосфо-, глико- и нейтральных липидах возрастает доля линоленовой кислоты; (ж) степень ненасыщенности глико- и нейтральных липидов возрастает, а фосфолипидов практически не изменяется.

Результаты исследования углеводного и липидного состава в процессе прорастания нашли практическое применение. Установлено, что на заводе «Цитрабел» (г. Белгород), получающем лимонную кислоту с помощью A. niger, в производственных партиях спор, утративших всхожесть, увеличивается содержание ФЭА в составе фосфолипидов и изменяется соотношение ман-нит/трегалоза, что характерно при прорастании. Предложены биохимические критерии для определения жизнеспособности конидий и даны практические рекомендации по хранению конидий, исключающие индукцию прорастания.

На примере мукорового гриба С. japónica показано, какое важное значение имеет способ выделения спор. Проведенное сравнительное исследование спор, собранных стандартным способом - путем смыва водой (В-споры) при температуре 4°С и безводным - путем смыва тетрадеканом (Т-споры) обнаружило, что в В-спорах, по сравнению с Т-спорами, существенно снижается количество липидов, водо- и щелочерастворимого белка и углеводов цитозоля. В составе фосфолипидов вдвое возрастает доля ФЭА, в нейтральных липидах -количество стеринов, ДГ и МГ. Таким образом, по биохимическим критериям В-споры находятся не в покоящемся состоянии, а на ранней стадии прорастания.

В процессе прорастания спор С. japónica ростковые трубки в бидистил-лированной воде условиях интенсивной аэрации появляется через 2,5-3 часа. Добавление к воде 2% глюкозы сокращает этот период до 1 час. Результаты,

представленные на рис. 10, свидетельствуют о том, что в бидистилляте уже через 20 мин количество трегалозы снижается в 9-10 раз.

I ■ 1

60

—а—2

время, мин

Рис. 10. Использование трегалозы в процессе прорастания спор С. japónica в дистиллированной воде (1) и в присутствии 2% глюкозы (2).

В среде с глюкозой использование трегалозы также происходит, но медленнее, самое низкое ее содержание наблюдается через 40 мин. Характер изменения уровня трегалозы на обеих средах имеет общую закономерность - после резкого падения следует процесс восстановления ее содержания. Эти данные позволяют сделать предположение о том, что одна из функций трегалозы в спорах -энергетическое обеспечение ранних процессов прорастания. Когда споры становятся способными усваивать углеводы из питательной среды, наблюдается восстановление запаса трегалозы.

Для понимания характера изменений в уровне трегалозы в процессе прорастания было проведено исследование локализации, свойств и активности фермента, гидролизующего дисахарид трегалозу, - трегалазы. Установлено, что в покоящихся спорах этот фермент локализован в клеточных стенках, где находится в активном состоянии. В микросомальной фракции и в цитозоле спор активности трегалазы не обнаружено. Полученные данные о локализации, рН-оптимумах в различных буферах и об отсутствии ингибирования трегалазы детергентами показывают, что этот фермент относится к нерегуляторному типу.

В процессе прорастания спор наблюдается резкое снижение уровня тре-галозы, сопровождающееся ростом активности трегалазы. На среде с биди-стиллятом обнаружен один пик активности трегалазы, совпадающий по времени (20 мин) с минимальным содержанием трегалозы (рис. 11).

время, мин

Рис. 11. Активность трегалазы С. japónica в процессе прорастания спор.

Обозначения: активность трегалазы в клеточных стенках - (!) - в воде; (2) - в присутствии глюкозы: активность трегалазы вмикросомальнойфракции-(3) -вводе: (4) - в среде с глюкозой.

В среде с глюкозой пик активности трегалазы наблюдается уже через 10 минут, далее следует небольшой спад (20 мин) и возрастание активности (40 мин) прорастания, где фиксируется минимальное содержание трегалозы. Нужно отметить, что, в отличие от активности трегалазы на бидистилляте, на среде с глюкозой не происходит снижения активности трегалазы даже при росте уровня трегалозы в клетке (на 60 минут). Еще одно отличие в действии трегалазы на этих средах: в бидистилляте наблюдается активность только в клеточных стенках, тогда как в присутствии глюкозы отмечается активность фермента в микросомальной фракции и пик активности приходится как раз на ее небольшой спад в клеточных стенках.

Для выяснения вопроса, как влияет количество трегалозы и активность трегалазы на скорость прорастания спор, были получены мутанты С. japónica, образующие в 20-25 раз меньше спор. Результаты показывают, что в мутант-ных спорах наблюдается более низкое содержание трегалозы и меньшая активность трегалазы (табл. 13). Показано также, что мутантные споры намного медленнее прорастают - появление ростковых трубок задерживается на 3-4 ча-

са по сравнению с диким штаммом. Поэтому можно заключить, что количество трегалозы в клетках коррелирует с активностью трегалазы и скоростью прорастания спор.

Таблица 13

Спорообразование, активность трегалазы и содержание трегалозы _ в мутантных штаммах С. japónica_

Штамм количество спор / см2 Углеводы, % от сухой массы Трегало-за, % от сухой массы Активность трегалазы, нмоль глюкозы/мин х мг белка

Покоящихся спор Прорастающих спор*

Исходный 5,3 х 10" 12,6 П,2 353,9 394,7

Мутант 32-2 2,1 х 105 10,1 7,1 314,2 306,3

Мутант 32-4 2,7 х 105 8,2 5,6 214,4 223,5

* - Через 20 минут в среде с 2% глюкозой

Итак, в процессе прорастания конидий A. niger особенно резкое снижение уровня углеводов цитозоля наблюдается на стадии набухания. При этом происходит смена одного из основных углеводов покоящихся клеток - трегалозы на глицерин. Напротив, количество липидов в процессе прорастания изменяется слабо. Характерными признаками прорастания являются снижение уровня ТАГ в составе нейтральных липидов и возрастание доли ФЭА и ФС в фосфолипидах. Проведенное исследование позволило предложить биохимические критерии оценки жизнеспособности конидий.

У зигомицетного гриба С. japónica, в составе углеводов которого отсутствуют полиолы, обнаружено резкое снижение уровня трегалозы на ранней стадии набухания, после чего уровень этого дисахарида восстанавливается практически до исходного. На мутантах по интенсивности спорообразования показано, что скорость прорастания спор прямо коррелирует с количеством в них трегалозы и активностью трегалазы.

IV. Практическое применение результатов исследования

Проведенное исследование показало, как состав углеводов и липидов взаимосвязан с термостабильностью, продолжительностью хранения и скоростью прорастания спор грибов. Изменяя условия спорогенеза ( различные питательные среды, облучение светом различного спектрального состава, варьирование температурных условий), можно получить споры с различным химическим составом. Эти результаты позволили предложить новые подходы в разработке биотехнологий, основанные на «воспитании» спорового посевного материала в процессе спорогенеза. Используя эти подходы, на основе мицелиаль-ного гриба В. trispora были разработаны биотехнологии получения полисаха-ридного комплекса (первичный метаболит) и ликопина (вторичный метаболит), что показывает универсальность этих подходов для биотехнологий, использующих в качестве посевного материала споры грибов.

4.1. Разработка биотехнологии получения противоожогового препарата Микоран из биомассы мукорового гриба В. trispora.

Хитин и хитозан, получаемые из ракообразных, широко используются в промышленности и медицине [Muzzarelli, 1977]. Известно, что в состав клеточных стенок грибов входят полиаминосахариды хитин и хитозан, глюканы и различные гетерополисахариды [Феофилова, 1983; Farkas, 1990]. Характерной особенностью клеточных стенок грибов является образование комплексов из различных полисахаридов, связанных ковалентными связями, что затрудняет выделение отдельных компонентов. Идея настоящего исследования заключалась в получении из различных мицелиальных грибов полисахаридных комплексов, основными компонентами которых были хитин/хитозан и хи-тин/глюкан, с целью изучения их ранозаживляющего действия.

Разработаны способы получения полисахаридных комплексов (ПК) из биомассы мицелиальных грибов и определения степени деацетилирования хитина. Критерием степени химической очистки служило отсутствие белка в конечном продукте. В результате из биомассы были получены полисахаридные комплексы клеточных стенок, сохранившие свою микрофибриллярную структуру и форму фрагментов гиф двух мукоровых грибов - В. trispora, С. japónica, аскомицета A. niger и базидиомицета Р. ostreatus.

Испытания на модели экспериментального ожога у крыс, проведенные в Институте хирургии им A.B. Вишневского РАМН, показали, что наиболее эффективным является ПК, полученный из мицелиального гриба В. trispora, который приводит к более быстрому созреванию грануляционной ткани, обусловленному увеличением количества фибробластов, ускоряющих образование коллагеновых фибрилл. Интересно отметить, что ПК из Р. ostreatus и С. japónica оказывали меньшее ранозаживляющее действие, а ПК из A. niger тормозил заживление ран по сравнению с контрольными животными.

Данные этого сравнительного исследования позволили выбрать для дальнейшей работы ПК из мицелия В. trispora, названный Микораном. На основе разработки был создан опытно-промышленный регламент получения пре-

парата Микоран. В микробиологической части регламента были использованы результаты данного исследования по регуляции типа спороношения, увеличению интенсивности спорообразования, влияния состава углеводов спор на скорость прорастания и продолжительность хранения. Была проведена селекция пар гетероталличных штаммов, названных (+) Т и (-) Т, которые отличались высокой спорогенной активностью. Выращивание проводили в течение 3 сут., выход Микорана - 4-5 г/л.

Активное начало препарата "Микоран" составляют полиаминосахариды (хитин и хитозан), содержание D-глюкозамина должно быть от 8 до 20%, что предусмотрено разработанными фармакопейными статьями на субстанцию «Микоран» и препарат «Микоран 4,0 г».

Токсикологические испытания «Микорана», проведенные в лаборатории лекарственной токсикологии НИИ экспериментальной кардиологии РАМН, показали, что препарат не токсичен и не вызывает аллергических реакций. Высокое ранозаживляющее действие «Микоран» подтверждено в клинических испытаниях (Институт хирургии им A.B. Вишневского РАМН, НИИ скорой помощи им. Н.В.Склифосовского, Детский ожоговый центр при больнице № 9 г. Москвы), после которых, согласно приказу Минздрава РФ от 1996 г., этот препарат был разрешен к применению в клиниках и ожоговых центрах, как ранозаживляющее средство для лечения ожогов 11-1П а,б, степеней и при подготовке к аутодермапластике. Дополнительные клинические испытания Микорана (Институт хирургии им. A.B. Вишневского РАМН) выявили высокую эффективность препарата для лечения ран различной этиологии у больных диабетом.

2.2. Разработка биотехнологии получения препарата Миколикопин из ми-целиального гриба В. trispora.

В 90-е годы XX века возник интерес к каротиноиду ликопину, так как оказалось, что он обладает более сильным антиоксидантным действием, чем ß-

каротин, а также подавляет пролиферацию клеток [Mortensen, Skibsted, 1997]. Основным источником для получения ликопина служили томаты.

В настоящей работе разработан способ получения ликопина, используя суперпродуцент Р-каротина - гетероталличный мукоровый 1риб В. trispora. Поскольку ликопин у грибов является промежуточным, а не конечным продуктом, единственным способом получения ликопина является использование ингибиторов его циклизации [Ninet et.al., 1969; Spurgeon, Porter, 1983]. Поэтому нами был проведен скрининг ряда гетероциклических соединений, полученных от проф. П.Б. Терентьева (химфак МГУ). В результате было установлено, что самый сильный ингибирующий эффект на циклизацию ликопина оказывают производные пиридина с введением одновременно метальных и амино-групп. Например, по сравнению с 2-аминопиридином, 2-амино-5 метилпиридин оказывает втрое больший эффект в одинаковой концентрации (0,5 г/л), тогда как 2-амино-6-метилпиридин вызывает пятикратный эффект при концентации 0,1 г/л. Этот ингибитор был выбран для разработки технологии получения ликопина из мицелия В. trispora.

Для создания биотехнологии были использованы высокоспорогенные Т(+) и Т(-) штаммы В. trispora. Установлено, что для значительной интенсификации каротиногенеза можно достигнуть, используя споры из спорангиолей, полученные в результате облучения спорогенной культуры зеленым светом. На основе результатов по составу углеводов были выработаны рекомендации по хранению посевного материала. Разработанная биотехнология позволила получить 1,3-1,5 г/л ликопина в результате 4-суточной ферментации.

Вторая часть работы была направлена на разработку эффективного способа извлечения ликопина из мицелия гриба и создание на его основе лекарственного средства. Целью было извлечение не только ликопина, но и липидов гриба, которые содержат большое количество эссенциальных жирных кислот, убихинон Q9 и другие липофильные биологически активные вещества.

В диссертации подробно описаны способы получения липидного концентрата грибов с высоким содержанием ликопина (3-4%), который нормали-

зовали подобранным подсолнечным маслом до 2% суспензии ликопина (субстанция). Совместно с сотрудниками лаборатории по созданию нетоксичных иммуномодуляторов РОНЦ им. H.H. Блохина РАМН был разработан способ микронизации кристаллов ликопина в суспензии до 5 мкм, создана лекарственная форма в виде желатиновых капсул, содержащих 5 мг микронизирован-ного ликопина в масле. Это лекарственное средство названо Миколикопином. Отработан способ хранения Миколикопина, обеспечивающий срок годности в течение трех лет.

Испытания, проведенные совместно с РОЩ РАМН, показали, что Ми-коликопин не токсичен и обладает антимутагенным, радиопротекторным и иммуномодулирующим действием. В испытаниях на модели рака простаты у крыс, проведенных в лаборатории экспериментальной эндокринной терапии опухолей РОНЦ им. H.H. Блохина РАМН, показан лечебный эффект Миколикопина, что открывает перспективы для разработки лекарственного препарата и его использования в профилактике и комплексной терапии рака простаты.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В онтогенезе грибов трегалоза практически отсутствует в трофофазе, в небольшом количестве появляется в идиофазе и достигает высокого уровня (415% от сухой массы) в покоящихся клетках грибов. Как показывают наши и литературные данные под воздействием теплового шока, независимо от фазы развития, количество трегалозы в вегетативных клетках резко возрастает, достигая примерно такого же уровня, что и в покоящихся клетках. Кроме того, обнаружено, что у термофильного гриба М. thermophila в оптимальных температурных условиях в трофофазе количество трегалозы составляет около 4%, что соответствует таковому в вегетативных клетках мезофильных грибов в условиях теплового шока. Примечательно, что у этого гриба в условиях ТШ отмечен также значительный рост уровня инозита. Новый факт обнаружен у базиди-ального гриба P. ostreatus - в адаптации к ТШ участвует сахароза. Таким образом, полученные данные показывают, что повышение уровня трегалозы является универсальным ответом на тепловой шок у мицелиальных грибов, относящихся к различным отделам Fungi. Кроме того, впервые показано, что у некоторых грибов, наряду с трегалозой, в термоадаптации могут участвовать инозит и сахароза.

Проведенное нами изучение состава мембранных липидов под воздействием ТШ обнаружило несоответствие наблюдаемых изменений существующим

гипотезам об изменениях в мембранах при адаптации клеток к температурным флуктуациям в зоне толерантности. Во-первых, под воздействием ТШ не происходит заметного изменения состава фосфолипидов, а именно замены ФЭА на ФХ, что постулируется гипотезой Hazel (1995). Во-вторых, обнаружено, что степень ненасыщенности жирных кислот фосфолипидов не только не снижается, а даже немного возрастает, что противоречит гипотезе Sinensky (1974). Однако, у всех изученных вегетативных (С. japónica, A. niger) и покоящихся клеток (конидии A. niger) грибов под воздействием ТШ, а также в спорах из стилоспорангиев, образующихся при повышенной температуре, обнаружено увеличение содержания стеринов.

Полученные результаты позволяют предложить новую гипотезу «стабилизации» существующих мембран при ТШ, в которой основная роль отведена стеринам и углеводам - трегалозе, сахарозе и инозиту. Трегалоза и стерины, по приведенным в литературном обзоре данным, имеют ряд общих свойств: (а) способны встраиваться в мембрану (трегалоза взаимодействует с гидрофильными группами фосфолипидов, а стерины встраиваются между их ациль-ными цепями); (б) могут изменять температуру фазового перехода липидного бислоя; (в) в клетках имеются механизмы быстрого повышения уровня этих соединений. В пользу предложенной гипотезы свидетельствуют также последовательность биосинтеза жирных кислот у эукариотных организмов [Weete, 1982], согласно которой первоначально синтезируются насыщенные жирные кислоты, а затем происходит их модификация десатуразами, что в условиях ТШ может затруднить быстрое снижение степени ненасыщенности существующих жирных кислот.

В ответ на холодовой шок у грибов Ascomycota и Basidiomycota наблюдается повышение количества низкомолекулярных полиолов. Кроме того, обнаружено, что состав полиолов зависит от конкретной температуры ХШ - чем она ниже, тем более малоатомные полиолы накапливаются в мицелии. Установлено, что жизнеспособность плодовых тел F. velutipes в условиях слабых отрицательных температур обусловлена аккумуляцией глицерина и арабита. Показано, что триггерное действие ХШ на плодообразование у базидиальных грибов включает аккумуляцию арабита и глицерина, что позволяет предположить их индуцирующее действие на этот процесс. Совокупность полученных данных позволяет предположить, что ациклические полиолы выполняют не только протекторную функцию при воздействии низких температур, но и регу-ляторную.

С позиций биохимической адаптации споры грибов по количеству трега-лозы аналогичны вегетативным клеткам грибов в состоянии теплового шока. С другой стороны, тот факт, что в составе фосфолипидов всех изученных типов спор преобладает фосфатидилхолин, можно рассматривать как адаптивную реакцию к температурным колебаниям в зоне толерантности. Это позволяет предположить, что при образовании спор используются оба механизма адаптации. В связи с этим представляют интерес данные о том, что в условиях теплового шока в экзогенно покоящихся спорах наблюдаются очень слабые изменения в содержании трегалозы, тогда как в составе липидов происходят изме-

нения, характерные для вегетативных клеток как в условиях шока, так и при модуляциях температуры в зоне толерантности. Сравнительное исследование биохимических параметров эндогенного (на примере зигоспор В. йТБрога и ба-зидиоспор А. Ыярогиз) и экзогенного (конидии А. г^ег и споры В. йтврога) покоя позволило выявить общие признаки: высокое содержание трегалозы и преобладание ФХ в составе фосфолипидов. Основное различие между типами покоя касается СН мембранных липидов - в ФЛ спор с эндогенным покоем преобладают насыщенные жирные кислоты (СН - 0,5-0,7), а в спорах с экзогенным типом покоя - ненасыщенные (СН - 1,2-1,4), что сравнимо с вегетативными клетками. В связи с этим представляет интерес обнаруженный нами факт относительного постоянства степени ненасыщенности жирных кислот фосфолипидов в процессе прорастания у конидий А. т§ег. Кроме того, для эндогенно покоящихся спор характерно высокое содержание запасных ТАГ (до 15-35% от сухой массы), тогда как для экзогенно покоящихся клеток - больше мембранных липидов. Установлено, что количество трегалозы коррелирует с термоустойчивостью спор.

Еще одно отличие между состояниями покоя обнаружено при изучении состава углеводов при хранении спор. Установлено, что при хранении спор с экзогенным покоем наблюдаются существенные колебания количества углеводов, что позволило предположить наличие механизмов, контролирующих уровень трегалозы в спорах. В базидиоспорах А. ЫэрогиБ с эндогенным покоем при хранении наблюдается последовательное снижение уровня трегалозы, что коррелирует со снижением их жизнеспособности. На примере конидий А. ш§ег было установлено, что высокое содержание трегалозы и отсутствие малоатомных полиолов и глюкозы в исходных конидиях способствует сохранению всхожести при хранении.

Изучение процесса прорастания конидий показало, что на ранних стадиях набухания наблюдается резкое снижение уровня углеводов цитозоля и глицерин становится одним из основных углеводов прорастающих конидий на фоне снижения уровня трегалозы. На мутантных штаммах С.]арошса установлено, что количество трегалозы в спорах коррелирует с активностью трегалазы и скоростью прорастания спор.

Таким образом, настоящее исследование показывает, что углеводы цитозоля играют важную роль в процессе адаптации клеток к температурному шоку на всех стадиях развития, в сохранении жизнеспособности спор, их термоустойчивости и прорастании.

Было показано, что условия спорогенеза влияют не только на скорость роста мицелия, но и синтез каротиноидов. Полученные данные о «воспитании» спор, были использованы при разработке двух биотехнологий получения ранозаживляющего препарата Микоран и лекарственного средства Миколико-пин на основе мукорового гриба В. йтврога.

ВЫВОДЫ

1. Впервые обнаружено, что в условиях теплового шока не наблюдается изменений состава фосфолипидов, характерных для адаптации к тепловым воздействиям в зоне толерантности. Предложена гипотеза, согласно которой в ответ на действие теплового шока происходит стабилизация существующих мембран с помощью протекторных соединений, к которым относятся углеводы и стерины. Впервые показано, что механизм адаптогенного действия антиоксиданта в условиях теплового шока также включает рост уровня тре-галозы н стеринов.

2. У грибов отделов Авсоту^а и Ва51(Нотусо1а в адаптации к холодовому шоку участвуют полиолы - арабнт и глицерин. Высокое содержание этих по-лиолов обнаружено в плодовых телах гриба, сохраняющего жизнеспособность в условиях слабых отрицательных температур. Впервые установлено, что у базидиальных грибов индукция плодообразования Холодовым шоком сопровождается ростом уровня арабита и глицерина.

3. Впервые выявлено, что глубина покоя спор грибов связана с составом мембранных фосфолипидов. Для спор с эндогенным покоем характерно преобладание насыщенных жирных кислот в фосфолипидах. В экзогенно покоящихся спорах, как и в вегетативных клетках, в фосфолипидах основными являются ненасыщенные жирные кислоты.

4. В отличие от вегетативных клеток в ответ на действие теплового шока в экзогенно покоящихся спорах практически не изменяется количество трегало-зы, тогда как в составе мембранных липидов возрастает доля стеринов я фосфатидилхолина.

5. Впервые показано, что при хранении экзогенно покоящихся конидий поддерживается определенный уровень и соотношение основных углеводов цитозоля, тогда как в эндогенно покоящихся спорах количество трегалозы постепенно снижается.

6. Чем больше трегалозы в экзогенно покоящихся спорах, тем выше их термоустойчивость и короче стадия прорастания.

7. Результаты фундаментальных исследований покоящихся клеток В. Ызрога использованы при разработке двух новых лекарственных средств. Раноза-живляннций препарат Микорая, активным началом которого являются по-лиаминосахариды хитин н хитозан, включен в Фармакопею РФ и разрешен к применению в медицинской практике. Разработана биотехнология получения ликопина, на основе которого создано лекарственное средство Миколи-копнн. В его испытаниях на модели рака простаты у крыс установлена' задержка роста опухоли на 50-70%, что открывает перспективы для его использования с целью профилактики и лечения рака простаты.

Основные публикации по теме работы. Экспериментальные статьи

1. Полотебнова М.В., Терешина В.М., Широкова Е.А Феофилова Е.П. Влияние ультрафиолетового облучения на спорообразование, рост и состав липидов Cunninghamella japónica // Микология и фитопатология. 1987. Т.21. № 3. С. 246-253.

2. Феофилова Е.П., Терешина В.М., Полотебнова М.В. Влияние способа получения спор Cunninghamella japónica на их липидиый и углеводный состав // Прикладная биохимия и микробиология. 1987.T. 23. № 4. С. 500-505.

3. Терешина В.М., Полотебнова М.В., Феофилова Е.П. Активность трегалазы спор дикого штамма Cunninghamella japónica с пониженной способностью к синтезу трегалозы // Микробиология. 1987.T. 56. № 5. С. 753-758.

4. Полотебнова М.В., Феофилова Е.П., Терешина В.М., Широкова Е.А. Действие света на образование липидов и процесс спорообразования у мукорового гриба Cunninghamella japónica // Микробиология. 1988.Т. 57_№ 3. С. 379-384.

5. Феофилова Е.П., Терешина В.М., Садовова Н.В., Грязнова М.В., Михайлова М.В. Тер-мофнлия мицелиальных грибов и адаптация к температурному стрессу // ДАН СССР. 1990.TJ13. № 5. С. 1250-1253.

6. Феофилова Е.П., Садовова Н.В., Грязнова М.В., Терешина В.М.,Хомидов Х.С., Егорова Г.А. Особенности биохимической адаптации термофильного гриба М. thermophila к температурному стрессу // Прикладная биохимия и микробиология. 1990. Т. 26. № 4. С. 551-559.

7. Терешина В.М., Михайлова М.В., Феофилова Е.П. Физиологическая роль трегалозы и антиоксиданта у Cunninghamella japónica при высокотемпературном стрессе // Микробиология. 1991.Т.60. № 5. С. 781-789.

8. Горнова И.Б., Феофилова Е.П., Терешина В.М., Головина Е.А., Кроткова Н.Б., Холодова В.П. Влияние углеводного состава спор A. japonicus на их способность к хранению и прорастанию. // Микробиология, 1992, Т. 61, №. 4, С. 549-554.

9. Гориова И.Б., Феофилова Е.П., Терешина В.М. Действие света на состав резервных углеводов клеток Aspergillus japonicus в процессе спорообразования // Микробиология. 1992.Т. 61. № 2. С. 208-213.

10. Терешина В.М., Киселева А.И., Феофилова Е.П., Кашпорова Е.В О стимулирующем эффекте зеленого света на образование ß-каротина гетероталлнчным грибом Blakeslea trispora// Микробиология. 1993.Т.62. X« 1. С. 56-61.

11. Феофилова Е.П., Терешина В.М., Михайлова MB. Изменения в углеводном и липид-ном составе мицелия Cunninghamella japónica во время длительного высокотемпературного стресса // Микробиология. 1993.Т.62. № 1. С. 62-69.

12. Феофилова ЕЛ., Терешина В.М., Горнова И.Б. Изменения в углеводном составе клеток грибов в связи с адаптацией к температурному стрессу // Микробиология, 1994, Т. 63, В.

5, С. 792-798.

13. Феофилова Е.П., Терешина В.М., Вакулова JI.A. О биологической функции триспоровых кислот у мукоровых грибов //Микробиология. 1994.Т.63. № 1. С. 17-22.

14. Терешина В.М., Меморская A.C., Феофилова Е.П. Экспресс-метод определения содер-ясания ликопина и ß-каротина // Микробиология. 1994.Т.63. № 6. С. 1111-1116.

15. Феофилова Е.П., Терешина В.М., Ивакин А.Ф., Киселева А.И. Действие зеленого света на образование каротина и триспоровых кислот у мукорового гриба Blakeslea trispora И Прикладная биохимия и микробиология. 1994. Т. 30. № 3. С. 415-419.

16. Терешина В.М., Феофилова Е.П. Морфологические особенности двух типов спороноше-ння у мукорового гриба Blakeslea trispora // Микробиология. 1995.Т.64. № 5. С. 681-685.

17. Феофилова Е.П., Терешина В.М., Меморская A.C. Регуляция синтеза ликопина у мукорового гриба Blakeslea trispora производными пиридина // Микробиология. 1995.Т.64. №

6. С. 734-740.

18. Феофилова Е.П., Терешина В.М., Меморская A.C. Хитин мицелиальиых грибов: методы выделения, идентификации и физико-химические свойства // Микробиология. 1995.Т.64. № 1. С. 27-31.

19. Терешина В.М., Феофилова Е.П. О биологической функции двух типов спороиошения у мукорового гриба Blakeslea trispora // Микробиология. 1996.Т.65. Jfe 6. С. 777-781.

20. Терешина В.М., Феофилова Е.П., Меморская A.C., Вакулова JI.A., Теревтьев П.Б. Влитие азииов на образование лмсопиаа мицелиальным грибом Blakeslea tris рога // Прикладная биохимия и микробиология. 1996. Т. 32. № 4. С. 427-429.

21. Терешина В.М., Меморская A.C., Феофилова Е.П., Немцев Д.В., Козлов В.М. Получение из мицелиальных грибов полисахаридных комплексов и определение степени их деаце-тнлировання // Микробиология. 1997. Т.66. № 1. С. 84-89.

22. Феофилова Е.П., Терешина В.М., Меморская A.C. Гетероталлизм мукоровых грибов: фнзнолого-биохимическне особенности (+) и (-) штаммов В. trispora // Микробиология. 1997. Т.66. № 6. С. 835-839.

23. Феофилова Е.П., Терешина В.М., Кочкнна Г.А.О филогенетических связях грибов семейства Cboanephoraceae с позиций гетероталлизма // Микробиология. 1997. Т.66. № 6. С. 840-845.

24. Немцев Д.В., Козлов BJL, Терешина В.М., Меморская A.C., Феофилова Е.П. Изменения в составе структуриых компонентов клеточной стенки Aspergillus nlger в зависимости от условий культивирования И Прикладная биохимия н микробиология. 1998. Т. 34. № 1. С. 95-98.

25. Александрова Е.А., Завьялова Л.А., Терешина В.М., Гарнбова Л.В., Феофилова Е.П. Получение плодовых тел и глубинного мицелия L. edodes (Berk.) Sing [Lentinula edodes (Berk.) Pegler] // Микробиология, 1998, Т. 67, №. 5, С. 649-6S4.

26. Феофилова ЕЛ., Терешина В.М., Меморская A.C., Завьялова Л.А., Марышова Н.С. Изменения в составе углеводов цнтозоля в процессе цитодифференцнровки грибов порядка Agaricales // Микробиология. 1999.Т. 68Jft 3. С. 356-361.

27. Терешина В.М., Марьнн А.П., Косяков В.Н., Козлов В.П., Феофилова Е.П. Различная способность полисахаридов клеточной стенки Aspergillus niger к сорбции металлов // Прикладная биохимия и микробиология. 1999. Т. 35. № 4. С. 432-436.

28. Феофилова Е.П., Терешина В.М., Меморская A.C., Алексеев A.A., Евтушенков В.П., Ивановский А.Г. Новая отрасль биотехнологии - ранозаживляющие препараты на основе полнамнносахаридов // Микробиология. 1999. Т. 68. № 6. С. 834-837.

29. Терешина В.М., Меморская A.C., Морозова ЕЛ., Козлов В.П., Феофилова Е.П. Изменения в составе углеводов цнтозоля спор грибов в связи с температурой обитания и в процессе хранения // Микробиология. 2000.Т. 69 JA 4. С. 511-517.

30. Феофилова Г..П., Терешина В.М., Хохлова Н.С., Меморская A.C. О различных механизмах биохимической адаптации мицелия грибов к температурному стрессу: изменения в составе углеводов // Микробиология. 2000.Т. 69. № 5. С. 597-605.

31. Феофилова ЕЛ., Терешина В.М., Меморская A.C., Хохлова Н.С. О различных механизмах биохимической адаптации мицелия грибов к температурному стрессу: изменения в составе лнпндов // Микробиология. 2000.Т. 69 J6 5. С. 606-612.

32. Feofilova Е.Р., Mar'in А.Р., Tereshina V.M., Nemsev D.M., Kozlov V.P. Role of component of cell walls in metal nptake by A. niger // Resource and Environmental Biotechnology. 2000. V. 3. P. 61-69.

33. Морозова E.B., Баранова M.B., Козлов B.IL, Терешина B.M., Меморская A.C., Феофилова Е.П. Особенности экзогенного покоя конидий A. niger // Микробиология. 2000. Т. 70. №5. С. 611-619.

34. Алексеев A.A., Феофилова ЕЛ., Терешииа В.М., Меморская A.C., Евтушенков ВЛ., Ивановский А.Г. Микоран - новый препарат для лечения ожогов // Комбустнология. 2000. С. 5-7.

35. Морозова Е.В., Козлов В.П., Терешина В.М., Меморская A.C., Феофилова ЕЛ. Изменения в лнпидном н углеводном составе конидий Aspergillus niger в процессе прорастания.// Првкл. биохимия н микробиология. 2002.Т. 38., № 2. С. 149-154.

36. Терешина В.М., Меморская A.C., Кочкнна Г.А., Феофилова Е.П., Покоящиеся клетки в цикле развития Blakeslea trispora: отличия в липидном и углеводном составе // Микробиология. 2002.Т. 71 Jfe 6. С. 794-800.

37. Феофилова ЕЛ., Терешина В.М., Меморская A.C. Достижения и проблемы новой отрасли биотехнологии: получение медицинских препаратов на основе биологически активных веществ мицелиальных грибов II В: Успехи медицинской микологии. 2003. Мат-лы I Всерос. Конгр. По медицинской микологии, п/ред Ю.В. Сергеева. Т. 1. С. 254256.

38. Феофилова Е.П., Терешина В.М., Гарибова Л.В., Завьялова Л.А., Меморская A.C., Ма-рышова Н.С. Прорастание базидносаор Agaricus bisporus // Прикл. биохим. микробиол.

2004.Т. 40 № 2 С. 220-226.

39. Терешина В.М., Ковтуненко A.B., Меморская A.C., Феофнлова Е.П. Влияние углеводного состава цнтозоля конидий Aspergillus niger на их жизнеспособность в процессе хранения // Прикл. биохимия и микробиология. 2004. Т. 40. № 5. С. 527-532.

40. Терешина В.М., Меморская A.C., Феофилова Е.П. Состав липидов гетероталличных штаммов в цикле развития Blakeslea trispora // Прикл. биохимия и микробиология.

2005. Т.41. № 4.С.449-453.

41. Терешина В.М., Меморская A.C. Адаптация Flammulina velntipes к гипотермии в природных условиях: роль липидов и углеводов // Микробиология. 2005. Т. 74. № 3. С. 329334.

42. Е.П.Феофилова, В.М.Терсшина, А.С.Меморская О биохимических механизмах адаптации к температуре у (+) и (-) штаммов Blakeslea trispora // Микробиология. 2005. Т. 74. №6. С. 750-755.

Авторские свидетельства и патенты

1. Феофилова Е.П., Тарасова P.E., Казаков Г.А., Иванова Н.И., Цветкова Г.Е. Терешина

B.М. Способ получения хитина // A.C. № 628700.1978.

2. Феофилова Е.П., Волохова М.В., Величко Б.А., Полотебнова М.В., Терешина В.М., Широкова Е.А., Дараган-Сушова М.В. Способ получения посевного материала для культивирования грибов рода Aspergidas, продуцирующих экзоферменты. II A.C. № 1449584. 1988.

3. Феофилова Е.П., Терешина В.М., Алексеев A.A., Гришина И.А. Способ получения ранозаживляющего препарата. // Патент РФ № 2086247,1997.

4. Козлов В.П., Наумов Е.Г., Немцев Д.В., Немцева В.В., Феофилова Е.П., Терешина В.М. Способ получения хитозанглюканового комплекса // Патент РФ № 2121505,1998.

5. Феофилова Е.П., Терешина В.М., Меморская A.C. Способ получения ликопина. // Патент РФ № 2115678,1998.

6. Феофнлова Е.П., Терешина В.М., Алексеев АЛ, Гришина И.А., Кудзоев O.A., Скуба Н.Д., Евтушенков В.П., Ивановский А.Г. Биотехнологический способ получения рано-заживляющего препарата //Патент РФ № 2155812.2000.

7. Феофилова Е.П., Терешина В.М., Меморская А.С, Вакулова JI.A., Шашкина М.Я. Способ получения биологически активного средства // Патент РФ № 2166868.2001.

8. Морозова Е.В., Козлов В.П., Терешина В.М., Меморская A.C., Феофилова Экспресс-способ определения жизнеспособности конидий грибов // Патент РФ № 2177993.2002. Обзоры

1. Феофилова Е.П., Михайлова М.В., Шумская Г.Г., Терешина В.М., Гарибова J1.B. Изменения в липидиом и углеводном составе клеток грибов в процессе онтогенеза н использование зтих данных в хемотаксономии // Микология и фитопатология. 1991.Т.25. № 4.

C. 348-353.

2. Феофилова Е.П., Немцев Д.В., Терешина В.М., Козлов В.П. Полиамлносахарнды мице-лиальиых грибов: новые биотехнологии и перспективы практического использования //Прикладная биохимия н микробиология. 1996. Т. 32. № 5. С. 483-492.

3. Феофилова Е.П., Терешина В.М. Термофилия мицелиальиых грибов с позиций биохимической адаптации к температурному стрессу // Прикладная биохимия и микробиология. 1999. Т. 35. № 5. С. 546-556.

4. Терешина В.М. Термоустойчивость у грибов: роль белков теплового шока и трегалозы // Микробиология. 2005. Т. 74. № 3. С. 293-304.

Тезисы конференций

1. Feofilova Е.Р., Velichko, Tereshina V.M., Volochova The modification of the inoculum in bio-technological processes by means monochromatic light // Abstr. XVEŒ-th FEBS Meeting Yugoslavia. 1987. P. 98.

2. Feofilova E.P., Terechina V.M., Michailova M.V. The biochemical mechanism of adaptation of the mycelial fungi for the temperature stress // IV Int. Mycological Congress. Regensburg, 1990. P. 183.

3. Feofilova E.P., Tereshina V.M. Biochemical abstracts of the regulation of metabolism in yeasts and mycelial fungi nnder conditions of heat shock // Absr. XV-th Int Symp. of yeasts Riga. 1991. P. 43.

4. Feofilova E.P., Tereshina V.M. On the biological function of the two sporangium types in the fungus Blakeslea trispora IIVI Int. Fungal Spore Conference, Konstanz, 1996.P. 39.

5. Feofilova ЕЛ*., Tereshina V.M., Gornova I.B. Photosporogenesis and "light memory" of aseomycete fungi IIVI Int Fungal Spore Conference, Konstanz, 1996. P. 40.

6. Феофилова ЕЛ., Терешана B.M., Меморская А.С. Новая отрасль биотехнологии - медицинские препараты на основе полиамнносахарндов грабов. // VI Межа. Конф. «Новые достижения в исследовании хитина и хнтозана». Репино- С-Петербург, 2001, С. 204-205.

7. Терешана В.М., Меморская А.С., Феофилова Исследование состава углеводов цитозоля в процессе цитодиффернцаровки грибов порядка Agaricales II Тезисы Межд. конференция «Физиология и биохимия культивируемых грнбов» Саратов. 2002. С. 8.

8. Феофилова Е.П., Терешана В.М., Меморская А.С. Достижения и проблемы новой отрасли биотехнология: получение медицинских препаратов на основе биологически активных соединений мицелаальных грабов // Мат-лы I Всероссийского конгресса по медицинской микология, 2003, Т. 1, С. 254-256.

9. Е.П. Феофилова, В.М. Терелина, А.С. Меморская, Н.Г.Гончаров Миколнкопин - новое природное лекарственное средство II Материалы конференции «Фундаментальные науки - медицине», Москва. 2005. С. 180-182.

Список сокращений

гл гликолипиды ТАГ триацилглицерины

дг диацилглицерины ТШ тепловой шок

зс зигоспоры ФЛ фосфолипиды

КЛ кардиолипин ФХ фосфатидилхолин

ЛФХ лизофосфатидилхолин ФС фосфатидилсерин

мг моноацилглицерины ФЭА фосфатидилэтаноламин

НЛ нейтральные липиды УВ углеводороды

пхг 5-метил-2-этил-3-дксипиридин ХШ холодовой шок

сжк свободные жирные кислоты ЭСт эфиры стеринов

см сфингомиелин

сн степень ненасыщенности

СП споры из спорангиолей

Ст стерины

СТ споры из стилоспорангиев

I

N

Подписано в печать 09.03.2006 Формат 60x88 1/16. Объем 1.5 п.л. Тираж 120 экз. Заказ № 499 Отпечатано в ООО «Соцветие красок» 119992 г.Москва, Ленинские горы, д.1 Главное здание МГУ, к. 102

¿00g ft S77-Í

S?? t

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Терешина, Вера Михайловна

Список сокращений

Общая характеристика работы

Глава I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Влияние температурного шока на метаболизм грибов: 11 торможение жизнедеятельности и антистрессовая

Ф защита

1.1.1. Белки теплового шока и их функция в грибной клетке.

1.1.1.1. Основные семейства HSPs.

1.1.1.2. Регуляция синтеза HSPs

1.1.1.3. Конститутивный синтез HSPs. 17 Ф 1.1.1.4. Синтез HSPs при тепловом шоке в процессе развития грибов.

1.1.2. Влияние физического состояния внутриклеточной воды на термоустойчивость.

1.1.3. Сохранение функции мембран при температурном 24 шоке ф 1.1.3.1. Состав и функции мембран в грибной клетке

1.1.3.2. Температурный шок и функционирование мембран

1.1.4. Синтез низкомолекулярных шапероноподобных 32 соединений - протекторных углеводов для защиты мембран и макромолекул

1.1.4.1. Современные представления о биологичекой функции 32 трегалозы.

1.1.4.1.1. Физико-химические свойства

1.1.4.1.2. Распространение в природе.

1.1.4.1.3. Метаболизм трегалозы.

1.1.4.1.4. Доказательства участия трегалозы в 40 термоустойчивости, полученные в экспериментах in vitro и in vivo.

1.1.4.1.5. Участие других углеводов в адаптации к термошоку.

1.1.5. Защита от активных форм кислорода при термострессе.

1.2. Споры грибов как защита от термошока. 61 1.2.1 Разнообразие спор грибов

• 1.2.2. Типы покоя грибных спор 64 1.2.3. Биохимия покоящихся клеток

1.3. Прорастание спор грибов.

Глава И. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

2.1. Объекты исследований.

2.2. Методы культивирования грибов 86 ф 2.3. Биохимические методы анализа

2.4. Наблюдение и фотографирование объектов 101 % исследования.

Глава III. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

3.1. БИОХИМИЧЕСКАЯ АДАПТАЦИЯ 103 МИЦЕЛИАЛЬНЫХ ГРИБОВ К ТЕМПЕРАТУРНОМУ ШОКУ.

3.1.1. Особенности адаптации к температурному шоку у 103 мукорового гриба С. japónica.

3.1.2. Возрастные особенности в адаптации мицелия A. niger 109 к температурному шоку.

3.1.3. Термоустойчивость конидий A. niger и биохимические 120 изменения в них в условиях температурного шока.

3.1.4. Холодовая адаптация у базидиомицетных грибов и ее 126 роль в плодообразовании.

3.1.4.1. Состав углеводов цитозоля в процессе 126 плодообразования базидиальных грибов.

3.1.4.2. Влияние холодового шока на состав углеводов 134 поверхностного мицелия и примордиев L. edodes.

3.1.4.3. Температурозависимый синтез углеводов и липидов у 137 психрофильного гриба F. velutipes.

3.1.4.4. Влияние температурного шока на состав углеводов 146 цитозоля погруженного мицелия P. ostreatus.

3.1.4.5. Биохимический ответ на температурный шок у 148 термофильного гриба М. thermophila.

3.2. ПОКОЙ И ПРОРАСТАНИЕ СПОР ГРИБОВ: РОЛЬ 150 ЛИПИДОВ И УГЛЕВОДОВ ЦИТОЗОЛЯ.

3.2.1. Покоящиеся клетки в цикле развития В. trispora.

3.2.1.1. Два вида бесполого размножения: морфологические 150 особенности спорообразования.

3.2.1.2. Факторы, регулирующие вид бесполого размножения.

3.2.1.3. Половое размножение: цитология и физиология 158 зиготообразования.

3.2.1.4. Липидный и углеводный состав покоящихся клеток В. 168 trispora.

3.2.1.5. О биологической роли двух типов бесполого 180 спороношения.

3.2.2. Особенности спорообразования, прорастания и 183 химического состава спор мукорового гриба С. japónica.

3.2.2.1. Влияние света различного спектрального состава на 183 интенсивность спорообразования и состав фосфолипидов.

3.2.2.2. Способ получения экзогенно покоящихся спор С. 186 japónica и их биохимический состав.

3.2.2.3. Ключевая роль трегалозы в прорастании спор 189 C.japonica.

3.2.3. Особенности экзогенного покоя конидий аскомицетов на примере А.

§ег.

3.2.3.1. Морфологические изменения в процессе прорастания 194 конидий.

3.2.3.2. Условия прорастания конидий А.

§ег.

3.2.3.3. Липидный и углеводный состав конидий в процессе 202 прорастания.

3.2.3.4. Влияние углеводного состава цитозоля конидий А.

§ег на их жизнеспособность в процессе хранения.

3.2.4. Эндогенный покой базидиоспор А. Ызрогив 218 3.2.4.1. Особенности прорастания базидиоспор - роль теплового шока.

3.3. ПРАКТИЧЕСКОЕ ПРИМЕНЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

ИССЛЕДОВАНИЯ

3.3.1. Разработка биотехнологии противоожогового препарата 227 Микоран.

3.3.2. Разработка биотехнологии получения препарата 235 Миколикопин из мицелиального гриба В. ^рога.

Глава IV. Обсуждение результатов

ВЫВОДЫ

Введение Диссертация по биологии, на тему "Покоящиеся клетки и адаптация мицелиальных грибов к температурному шоку"

Актуальность проблемы. Проблема криптобиоза - скрытой жизни или состояния «физиологического покоя» имеет общебиологическое значение в связи с широким распространением этого феномена в природе. В таком состоянии находятся споры грибов, низших растений и прокариот, почки растений, насекомые в диапаузе, животные в спячке [Ушатинская, 1990]. Актуальность этой проблемы связана с необходимостью изучения явлений скрытой жизни и длительного существования в экстремальных условиях для сохранения биоразнообразия на Земле, освоения Космоса и территорий с неблагоприятными условиями, борьбы с патогенными грибами, использования спор в биотехнологии и разработки методов их хранения.

Индукторами спорогенеза являются многие факторы (истощение питательных веществ, снижение влажности, изменение температурных условий и др.), которые вызывают торможение жизненной активности [Феофилова, 2003]. В онтогенезе грибов спору рассматривают как конечную точку цикла, т.е. как ключевую структуру, обеспечивающую сохранение жизни во времени и пространстве [Sussman, 1976; Osherov, May, 2001]. Для этого необходима устойчивость к абиотическим факторам, среди которых наиболее опасным является тепловой шок.

Верхний предел витальной зоны, который определяется тепловой коагуляцией белков, довольно узок, тогда как нижняя граница более широка в связи с тем, что холод не разрушает органических соединений. В вегетативных клетках грибов адаптация к температурным колебаниям в зоне толерантности осуществляется имеющимися регуляторными механизмами. Однако, когда воздействие отличается от оптимальной температуры на 8-12°С, что называется тепловым шоком [Lindquist, 1986], происходит индукция особой защитной системы. Такая система включает: синтез белков теплового шока, аккумуляцию трегалозы, детоксикацию активных форм кислорода, структуризацию и перераспределение воды в компартментах цитозоля, изменение состава мембран и поддержание внутриклеточного pH [Piper, 1993]. В результате организм переходит в другое дискретное стационарное состояние метаболизма, называемое стрессом [Веселова и др., 1993], характерным признаком которого является термоустойчивость.

Ранее трегалозу считали лишь одним из запасных углеводов, но по современным представлениям этому соединению присущи следующие функции: (а) резервного углевода (б) протектора мембран при разнообразных типах стресса: тепловом, окислительном, осмотическом, действии тяжелых металлов, лекарств, метаболических ингибиторов; (в) регулятора процесса гликолиза, концентрации глюкозы и АТФ в клетке; (г) транспортируемой формы углеводов в мицелии [Thevelein, 1996; Arguelles, 2000]; (д) шапероноподобного соединения, участвующего в стабилизации и фолдинге белков [Singer, Lindquist, 1998; Sampedro, Uride, 2004]; антиоксиданта [Oku et.al., 2003].

В связи с участием трегалозы в защите мембран от теплового шока возникает вопрос о роли фосфолипидов - основных компонентов липидного бислоя. Известно, что в зоне толерантности адаптация к температурным колебаниям осуществляется путем изменения состава мембранных липидов и (или) их жирных кислот [Sinensky, 1974; Hazel, 1995]. Происходят ли подобные изменения в составе липидов в условиях ТШ, учитывая резкое торможение жизнедеятельности, или достаточно термопротекторного действия трегалозы - оставалось неясным. Такое исследование состава углеводов цитозоля и липидов грибов в условиях теплового шока может содействовать пониманию биохимических механизмов термоустойчивости не только вегетативных, но и покоящихся клеток, так как известно, что трегалоза в значительном количестве накапливается в спорах грибов [Thevelein, 1996]. Кроме того, разнообразный состав внутриклеточных углеводов грибов, включающий и сахароспирты, позволяет предположить их участие в адаптации к температурному шоку.

Новое понимание функций углеводов определило идею данной работы -изучение различных состояний покоя спор с позиций биохимической адаптации к тепловому шоку. Кроме того, это может способствовать более глубокому пониманию природы клеток с различными типами покоя и процессов, происходящих в них при хранении и прорастании, что представляет большую ценность не только для фундаментальной науки, но и для создания биотехнологий, использующих споры грибов.

Целью настоящей работы являлось изучение состава растворимых углеводов и липидов в вегетативных клетках мицелиальных грибов в условиях температурного шока и в спорах с различными типами покоя. Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

1. Изучить состав углеводов цитозоля и липидов в условиях температурного шока в вегетативных клетках грибов, относящихся к различным отделам Fungi.

2. Провести сравнительное исследование состава углеводов цитозоля и ли-пидов в спорах с экзогенным и эндогенным типами покоя.

3. Выявить отличия в ответе экзогенно покоящихся спор грибов на температурный шок по сравнению с вегетативными клетками.

4. Изучить изменения в составе углеводов цитозоля при хранении спор грибов с различными типами покоя.

5. Исследовать состав углеводов и липидов в процессе прорастания экзогенно покоящихся спор.

6. Использовать результаты фундаментальных исследований в разработке биотехнологий получения лекарственных средств из мицелиальных грибов.

Научная новизна работы. На примере изученных грибов впервые доказано, что защита мембран вегетативных клеток грибов от теплового шока осуществляется, в основном, с помощью мембраностабилизирующих соединений, к которым относятся стерины и углеводы (трегалоза, сахароза и инозит), а не путем изменения фосфолипидного состава. Механизм адаптации вегетативных клеток грибов (Аэсотус^а, Ва81с1ютусо1а) к холодовому шоку включает аккумуляцию полиолов. Впервые обнаружено, что жизнеспособность плодовых тел базидиальных грибов в природных условиях слабых отрицательных температур связана не только с увеличением доли полиненасыщенных жирных кислот в фосфолипидах, но с высоким уровнем этих полиолов. Впервые установлено, что у базидиальных грибов механизм индукции плодообразования Холодовым шоком включает накопление полиолов - арабита и глицерина.

С позиций биохимической адаптации, независимо от типа покоя, в защите спор от тепловых воздействий сочетаются две стратегии защиты - от теплового шока (высокий уровень трегалозы) и от тепловых модуляций в зоне толерантности (большое количество фосфатидилхолина). Впервые установлено, что основным отличительным критерием типа покоя является степень ненасыщенности жирных кислот фосфолипидов: если она высокая, как в вегетативных клетках, то споры находятся в состоянии экзогенного покоя, если низкая - то в эндогенном покое. Новым фактом является установление биохимического ответа экзогенно покоящихся спор на температурный шок. Выявлена прямая корреляция между термостабильностью и количеством трегалозы в спорах. Впервые показано, что при хранении экзогенно покоящихся спор поддержива8 ется определенный уровень термопротекторных углеводов цитозоля, тогда как в спорах с эндогенным покоем количество трегалозы уменьшается, что сопровождается снижением их всхожести. Установлено, что от количества трегалозы в экзогенно покоящихся клетках зависит длительность I фазы прорастания.

Практическая значимость и реализация результатов работы. Проведенные фундаментальные исследования дают теоретические предпосылки для разработки новых подходов к созданию биотехнологий получения лекарственных средств на основе мицелиальных грибов. Один из таких подходов — «воспитание» спорового посевного материала в процессе спорогенеза, позволяющее получить споры с определенным химическим составом, что влияет не только на процессы хранения и прорастания, но и на синтез биологически активных веществ, в частности каротиноидов.

Разработаны способы подготовки спорового посевного материала с новыми свойствами для биотехнологии. Предложены биохимические критерии оценки жизнеспособности спорового посевного материала на примере конидий А. niger - продуцента лимонной кислоты.

Автор был ответственным исполнителем в проектах, возглавляемых профессором Е.П. Феофиловой, по разработке лекарственных средств из мицелиальных грибов. На основе мукорового гриба В. trispora. нами созданы два лекарственных средства - Микоран (совместно с Институтом хирургии им A.B. Вишневского РАМН) и Миколикопин (совместно с РОНЦ им. H.H. Блохина РАМН). Разработан опытно-промышленный регламент, проведены токсикологические и клинические испытания, получены временные фармакопейные статьи на субстанцию и ранозаживляющий препарат Микоран. Активным началом препарата являются полиаминосахариды хитин и хитозан. Препарат Микоран разрешен к применению в медицинской практике приказом Минздрава РФ № 368 от 1996 г. и включен в Фармакопею РФ. Разработана биотехнология получения ликопина из гриба. На основе ликопина и других биологически активных соединений гриба создано адаптогенное средство Миколикопин с противораковым эффектом, установлены его радиопротекторные, антимутагенные и иммуномодулирующие свойства, создана лекарственная форма в виде желатиновых капсул. В испытаниях на модели рака простаты у крыс показан лечебный эффект Миколикопина, что открывает перспективы его использования в профилактике и лекарственной терапии заболеваний простаты.

Предложены два новых метода исследования: экспресс-метод определения ликопина и ß-каротина в смеси и способ определения степени деацети-лирования хитина в полисахаридных комплексах грибов.

Апробация работы. Основные результаты работы были представлены доложены и обсуждены на: IV-th Int. Mycological Congress (Regensburg, Germany, 1990), XV-th Int. Symposium of yeasts (Riga. 1991), Vl-th Int. Fungal Spore Conference, (Konstanz, Germany, 1996), VI Международной конференции «Новые достижения в исследовании хитина и хитозана" (Москва, 2001), Конференции «Физиология и биохимия культивируемых грибов» (Саратов. 2002), I Всероссийском Конгрессе по медицинской микологии (Москва, 2003), VII Международной конференции «Современные перспективы в исследовании хитина и хитозана (Санкт-Петербург-Репино, 2003).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 63 научные работы, в том числе 42 экспериментальные статьи, 4 обзора, 9 тезисов конференций, 2 авторских свидетельства и 6 патентов.

Основные защищаемые положения

1. Защита мембран грибов вегетативных клеток в условиях теплового шока осуществляется, в основном, с помощью мембраностабилизирующих соединений — углеводов и стеринов, а не путем изменения состава фосфоли-пидов.

2. Глубина покоя спор грибов связана с жирнокислотным составом фосфоли-пидов - насыщенные жирные кислоты преобладают в эндогенно покоящихся клетках, а ненасыщенные - в экзогенно покоящихся спорах.

3. В экзогенно покоящихся спорах поддерживается определенный уровень и соотношение основных углеводов цитозоля, тогда как в клетках с эндогенным покоем наблюдается постепенное снижение количества трегалозы.

4. Чем больше количество трегалозы в с экзогенно покоящихся спорах, тем выше их термоустойчивость и короче стадия прорастания.

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Терешина, Вера Михайловна

выводы

1. Впервые обнаружено, что в условиях теплового шока не наблюдается изменений состава фосфолипидов, характерных для адаптации к тепловым воздействиям в зоне толерантности. Предложена гипотеза, согласно которой в ответ на действие теплового шока происходит стабилизация существующих мембран с помощью протекторных соединений, к которым относятся углеводы и стерины. Впервые показано, что механизм адаптогенного действия антиоксиданта в условиях теплового шока также включает рост уровня тре-галозы и стеринов.

2. У грибов отделов Аэсотус^а и Ва51сПотусо1а в адаптации к холодовому шоку участвуют полиолы - арабит и глицерин. Высокое содержание этих полиолов обнаружено в плодовых телах гриба, сохраняющего жизнеспособность в условиях слабых отрицательных температур. Впервые установлено, что у базидиальных грибов индукция плодообразования Холодовым шоком сопровождается ростом уровня арабита и глицерина.

3. Впервые выявлено, что глубина покоя спор грибов связана с составом мембранных фосфолипидов. Для спор с эндогенным покоем характерно преобладание насыщенных жирных кислот в фосфолипидах. В экзогенно покоящихся спорах, как и в вегетативных клетках, в фосфолипидах основными являются ненасыщенные жирные кислоты.

4. В отличие от вегетативных клеток в ответ на действие теплового шока в экзогенно покоящихся спорах практически не изменяется количество трегало-зы, тогда как в составе мембранных липидов возрастает доля стеринов и фосфатидилхолина.

5. Впервые показано, что при хранении экзогенно покоящихся конидий поддерживается определенный уровень и соотношение основных углеводов цитозоля, тогда как в эндогенно покоящихся спорах количество трегалозы постепенно снижается.

6. Чем больше трегалозы в экзогенно покоящихся спорах, тем выше их термоустойчивость и короче стадия прорастания.

7. Результаты фундаментальных исследований покоящихся клеток В. йчэрога использованы при разработке двух новых лекарственных средств. Раноза-живляющий препарат Микоран, активным началом которого являются по-лиаминосахариды хитин и хитозан, включен в Фармакопею РФ и разрешен к применению в медицинской практике. Разработана биотехнология получения ликопина, на основе которого создано лекарственное средство Мико-ликопин. В его испытаниях на модели рака простаты у крыс установлена задержка роста опухоли на 50-70%, что открывает перспективы для его использования с целью профилактики и лечения рака простаты.

Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Терешина, Вера Михайловна, Москва

1. Ашмарин И.П., Воробьёв A.A. Статистические методы в микробиологических исследованиях. 1962. Л.: Гос. Изд-во мед. Лит. 180 с.

2. Барабой В.А. Меланин: структура, биосинтез, биологические функции // Укр. Bíoxím. Журн. 1999. т. 71. № 4. С. 5-14.

3. Белов А.П., Зинченко Г.А., Ефременко A.A. Изучение путей обмена жирными кислотами между фосфолипидами и триацилглицеринами у термотолерантных дрожжей Candida rugosa // Микробиология. 1990. Т. 59. Вып. 6, С. 976-981.

4. Белозерская Т.А. Гидрофобины грибов: структура и функции // Микология и фитопатология. 2001. Т. 35. Вып. 1. С. 3-11.

5. Бехтерева М.Н. Физиолого-биохимическое изучение микроорганизмов в связи с биосинтезом биологически активных и других соединений. Автореф. дисс. докт. биол. наук 1973.121 С.

6. Бриттон Г. Биохимия природных пигментов. 1986. М.: Мир. 424 с.

7. Бробст K.M. Газожидкостная хроматография триметилсилильных производных Сахаров // В: Методы исследования углеводов. П/ред Ф.Я. Хорлина. М: «Мир», 1975. С.9-13.

8. Брусков В.И., Масалимов Ж.К., Черников A.B. Образование активных форм кислорода в воде под действием тепла // ДАН. 2002. Т. 384. № 6. С. 821-824.

9. Вакулова Л. А., Кузнецова В.П., Колот Ф.Б., Бабьева И.П., Самохвалов Г.И. Быстрый метод количественного определения ß-каротина у микроорганизмов // Микробиология. 1964.Т. 33.№ 6. С. 1061.

10. Ю.Веселова Т.В., Веселовский В.А., Чернавский Д.С. Стресс у растений. М.: Изд-во МГУ, 1993. 144 с.

11. П.Воробьева Л.И. Стрессоры, стрессы и выживаемость клеток // Прикл. Био-хим. Микробиол. 2004. Т.40. № 3. С. 261-269.

12. Гаврилов A.C., Киселева А.И., Матушкина С.А., Кордюкова Н.П., Феофило-ва Е.П. Получение ликопина микробиологическим способом в условиях завода // Прикл. Биохим. Микробиол. 1996. Т. 32. № 5. С. 545-548.

13. Геннис Р. Биомембраны. Молекулярная структура и функции. М.: Мир, 1997. 622с.

14. Гесслер H.H., Соколов Ф.В., Белозерская Т.А. Начальные этапы синтеза триспоровых кислот у Blakeslea trispora // Прикл. Биохим. Микробиол. 2002. Т. 38. №6. С. 625-633.

15. Головин Ю.И. Вода и лед знаем ли мы о них достаточно? // Соросовский Образовательный Журнал. 2000. Т. 6. № 9. С. 66-72.

16. Грязнова М.В. Образование липидов и экзогенный покой клеток в цикле развития мукорового гриба Cunninghamella japónica. Дисс. канд. биол. наук. 1988. 173 с.

17. Гусев Н.Б., Богачева Н.В., Марстон С.Б. Структура и свойства малых белков теплового шока (sHsp) и их взаимодействие с белками цитоскелета // Биохимия. 2002. Т. 67. В. 5. С. 613-623.

18. Денисова Н.П. Лечебные свойства грибов. Этномикологический очерк. С.-П.: Изд-во СПбГМУ, 1998. 58с.

19. Евстигнеева З.Г., Соловьева H.A., Сидельникова Л.И. Структура и функции шаперонов и шаперонинов // Прикладная биохимия и микробиология. 2001. Т. 37. № 1.С. 5-18.

20. Кейтс М. Техника липидологии. 1975. М: Мир. 322 с.

21. Клюшникова Е.С Экспериментальное цитологическое изучение двуспоро-вой формы культурного шампиньона // Учёные записки МГУ. 1940. вып. 36. Ботаника. С. 136-171.

22. Корниенко И.В., Клецкий М.Е., Олехнович Л.П., Внуков В.В., Корниенко• И.Е., Вейко В.П., Синичкин A.A. Механизм антиоксидантного действия полипептидов: экспериментальное и теоретическое изучение // Биотехнология. 2001. №2. С. 83-88.

23. Кузнецова Л.С. Влияние антиоксидантов на состав липидов Cunninghamella japónica в норме и в состоянии стресса. Автореф. канд. биол. наук. 1990. 24 с.

24. Лущак В.И. Окислительный стресс и механизмаы защиты от него у бактерий ф // Биохимия. 2001. Т. 66. № 5. С. 592-609.

25. Михайлова Н.П., Вьюнов К.А. Стерины грибов: биосинтез и функции в клетке // Успехи совр. биол. 1987. Т. 104. В. 1. 3. 89-103.

26. Михайлова М.В., Феофилова Е.П., Розанцев Э.Г. Способ получения ликопина АС 1080479. 1982.

27. Михальчик Е.В., Шиян С.Д., Бовин Н.В. Новый тип углевод-углеводного взаимодействия // ДАН,. 1997. Т. 354. № 2. С. 261-264

28. Мюллер Э. Леффлер В. Микология. 1995. М.: Мир, 343 с. 35.Наградова Н.К. Сворачивание белков в клетке: о механизмах его ускорения

29. Биохимия. 2004. Т.69. № 8. С. 1021-1037. Зб.Овчинников Ю.А. Биоорганическая химия. М.: Просвещение, 1987. 815с.

30. Писаревская И. В. Изменения в липидном и углеводном составе клеточной стенки в связи с процессом реподукции.// Дисс. . канд. биол. наук, 1985, М., Ин-т Микробиологии АН СССР, 163 с.

31. Полотебнова М. В., Феофилова Е.П., Шадрина И.А., Машковцева А.В., Влияние физико-химических факторов на прорастание кониди Cunning-hamellajaponica//Микробиология. 1987. Т. 56. В. 3. С 381-386.

32. Рихванов Е.Г., Войников В.К. Функции Hspl04p в развитии индуцированной термотолерантности и прионном наследовании у дрожжей Saccharomyces cerevisiae // Успехи Совр. Биол. 2005. Т. 125. № 1. С. 115-128.

33. Ротанова Т.В., Абрамова Е.Б., Шарова Н.П. От парадокса к нобелевской премии // Биологические мембраны. 2005. Т.22. № 2. С. 151-156.

34. Рощина В.В. Хемосигнализация у пыльцы // Успехи Совр. Биол. 1999. Т. 119. №6. С. 557-566.

35. Садовова Н.В. Термофилия мицелиальных грибов и адаптация к температурному стрессу // Дисс. канд. биол. наук. 1992. 185 с.

36. Сафрай А.И. Биологические особенности некоторых видов рода Agaricus Fr. em. Karet. // Дисс. .канд. биол. наук. М.: Изд-во МГУ, 1977.235 с.

37. Синицкая Н.С., Хавинсон В.Х. Роль пептидов в свободнорадикальном окислении и старении организма // Успехи совр. биол. 2002. Т. 122. № 6. С. 557568.

38. Скулачев В.П. Снижение внутриклеточной концентрации О2 как особая функция дыхательных систем клетки // Биохимия. 1994. Т. 59. В. 12. С. 910912.

39. Скулачев В.П. Возможная роль активных форм кислорода в защите от вирусных инфекций // Биохимия. 1998. Т. 63. В. 12. С. 1691-1694.

40. Скулачев В.П. Феноптоз: запрограмированная смерть организма // Биохимия. 1999. Т. 64. В. 12. С. 1679-1688.

41. Скулачев В.П. Н202-сенсоры легких и кровеносных сосудов и их роль в ан-тиоксидантной защите организма // Биохимия. 2001. Т. 66. В. 10. С. 14251429.

42. Степаненко Б.Н. Химия и биохимия углеводов (полисахариды). 1978. М.: «Высшая школа».256 с.

43. Терешина В.М. Сравнительное изучение структуры и компонентов клеточной стенки грибов семейства Choanephoraceae в процессе дифференциации. Дисс. . канд. наук 1983. М.: ИНМИ АН СССР. 143 С.

44. Терешина В.М., Меморская A.C., Феофилова Е.П. Экспресс-метод определения содержания ликопина и ß-каротина // Микробиология. 1994.Т.63. № 6. С. 1111-1116.

45. Терешина В.М., Меморская A.C., Феофилова Е.П., Немцев Д.В., Козлов

46. B.М. Получение из мицелиальных грибов полисахаридных комплексов и определение степени их деацетилирования // Микробиология. 1997. Т.66. № 1.1. C. 84-89.

47. Турпаев К.Т. Активные формы кислорода и регуляция экспрессии генов // Биохимия. 2002. Т. 67. В. 3. С. 339-352.

48. Феофилова Е.П. Особенности вторичного метаболизма микроорганизмов в связи с процессом пигментообразования. Дисс. . докт. наук 1977. М. ИНМИ АН СССР. 432 с.

49. Феофилова Е.П., Тарасова P.E., Казаков Г.А., Иванова Н.И., Цветкова Г.Е. Терешина В.М. Способ получения хитина // A.C. № 628700.1978.

50. Феофилова Е.П., Терешина В.М., Иванова Н.И., Генин Н.В., Гопенгауз Ф.Л. Физико-химические свойства хитина крабов и некоторых микроскопических грибов // Прикладная биохимия и микробиология. 1980. Т. 16. № 3. С. 377382.

51. Феофилова Е.П. Клеточная стенка грибов. 1983. М.: Наука.247 с.

52. Феофилова Е.П. Биологические функции и практическое использование хитина // Прикл. Биохим. Микробиол. 1984. Т. 20. № 2. С. 147-160.

53. Феофилова Е.П., Бурлакова Е.Б., Кузнецова Л.С. Значение реакций свобод-норадикального окисления в регуляции роста и липидообразования эукари-отных организмов // Прикл. Биохим. Микробиол. 1987. Т. 23. № 1. С. 3-13.

54. Феофилова Е.П. Трегалоза, стресс, анабиоз // Микробиология. 1992. Т. 61. И. 5. С. 741-755.

55. Феофилова Е.П. Торможение жизненной активности как универсальный биохимический механизм адаптации микроорганизмов к стрессовым воздействиям // Прикл. Биохим. Микробиол. 2003. Т. 39. № 1. С. 5-24.

56. Усов А.И. Олигосахарины новый класс сигнальных молекул в растениях // Успехи химии. 1993. Т. 62. № 11. С. 1119-1144.

57. Ушатинская Р.С. Скрытая жизнь и анабиоз. 1990. М.: Наука. 180 с.

58. Хочачка П., Сомеро Дж. Биохимическая адаптация. М.: Мир, 1988, 586 с.

59. Хукстра Ф.А., Головина Е.А. Поведение мембран при дегидратации и устойчивость ангидробиотическх организмов к обезвоживанию // Физиология растений. 1999. Т. 46. № 3, С. 347-361.

60. Щербухин В.Д., Миронова JI.H., Кондырева А.В., Грюнер B.C. Определение глюкозы в патоке глюкозооксидазным методом с использованием ферроцианида калия // Прикл. биохим. микробиол. 1970. Т. 60. № 4. С.467

61. Ж0шлев А.Ю. Стрессовые белки ксилотрофных базидиомицетов при гипотермии//Автореферат дисс. канд. биол. наук 2001.22 с.

62. Ainsworth J., Bisby Н. Dictionary of the Fungi Eds.: Kirk P., Cannon P., David J., Stalpers J. CAB Int. 2001. 655 p.

63. Alexandre H., Rousseaux I., Charpentier C. Relationship between athanol tolerance, lipid composition and plasma membrane fluidity in Saccharomyces cere-visiae and Kloeckera apiculata // FEMS Microbiol. Lett. 1994. V. 124. P. 17-22.

64. Araki Y, Ito E. A pathway of chitosan formation in Mucor rouxii // Eur. J. Bio-chem. 1975. V. 55. P. 71-78.

65. Argiielles J.C., Gacto M. Differential location of regulatory and nonregulatory trehalases in Candida utilis cells // Antonie van Leeuwenhoek. 1988. V. 54. P. 555-565.

66. Arguelles J.C. Thermotolerance and trehalose accumulation induced by heat shock in yeast cells of Candida albicans // FEMS Microbiol. Lett. 1997. V. 146. P. 6571.

67. Argiielles J.C. Physiological roles of trehalose in bacteria and yeast:a comperative analysis // Arch. Microbiol. 2000. V. 174. P. 217-224.

68. Atkinson A.W., Gunning B.E.S., John P.C.L. Sporopollenin in the cell wall of Chlorella and other algae: ultrastructure, chemystry, and incorporation of 14C-acetate, studied in synchronous cultures // Planta. 1972. V. 107. P. 1-32.

69. Avigad G. Accumulation of trehalose and sucrose in relation to the metabolism of a-glucosides in yeast of defined genotype // BBA. 1960. V.40. P. 124-134.

70. Bartnicki-Garcia S. Cell wall chemistry, morphogenesis and taxonomy of fungi //

71. Ann. Rev. Microbiol. 1968. V. 22. P. 81-103.

72. Bartnicki-Garcia S., Lindberg B. Partial characterisation of mucoran: the glu-curonemannan component // Carbohyd. Res. 1972. V. 23. N. l.P. 75-85.

73. Barton J.K., Den Hollander J.A., Hopfield J.J., Shulman R.G. ,3C nuclear mag* netic resonance study of trehalose mobilization in yeast spores // J. Bacteriol.1982. V. 151.N. l.P. 177-185.

74. Baenziger J., Jarrell H.C., Smith I.C.P. Molecular motions of a diunsaturated acyl chain in a lipid bilayer: implication for the role of polyansaturation in biological membranes // Biochemistry. 1992. V. 31. P. 3377-3385.

75. Barrera C.R., Formation and germination of fungal arthroconidia // CRC Crit. Rev. Microbiol. 1986. V. 12. N. 4. P. 271-292.

76. Beever R.E., Dempsey G.P., Function of rodlets on the surface of fungal spore //• Nature. 1978. V. 272. P. 608-610.

77. Bell W., Sun W., Hohman S., Wera S., Reinders A., De VirgilioC., Wiemken A,m Thevelein J.M. Composition and functional analysis of the Saccharomyces cerevisiae trehalose synthase complex // J.Biol.Chem. 1998. V. 273. N 11. P. 3331133319.

78. Beltran F.F., Castillo J., Vicente-Soler J., Cansado J., Gacto M. Role for the trehalose during germination of spores in fusion yeast Schizosaccharomyces pombe // FEMS Microbiol. Lett. 2000. V. 193. P. 117-121.

79. Birch G.G. Trehaloses // In: Adv. Carbohyd. Chem. 1963. Ed: Wolfrom M.L. Acad. Press: N. Y., London. V. 18. P. 201-225.

80. Blazquez M.A., Lagunas R., Gancedo C., Gancedo J.M. Trehalose-6-phosphate, a new regulator of yeast glycolysis that inhibits hexokinases // FEBS Lett. 1993. V. 329. N1,2. P. 51-54.

81. Blumental N.J., Roseman S. // J. Bacteriol. 1967. V. 74. P. 222-225.

82. Boas N.F. Method for the determination of hexosamines in tissues // J. Biol.Chem. 1953. V. 204. N. 2. P. 553-563.

83. Bonnen A., Brambl R. Germination Physiology of Neurospora crassa conidia // Exp. Mycol. 1983. V. 7. P. 197-207.

84. Brambl R. Fungal spore germination and mitochondrial biogenesis // In: Molecular Genetics of Filamentous Fungi. 1985. Ed: Liss A.R. N.Y.: William E. Timbarlake. P. 207-223.

85. Bramley P.M. Is lycopene beneficial tu human health? // Phytochem. 2000. V. 54. P. 233-236.

86. Brana A.F., Manzal M.B., Hardisson C. // Can. J. Microbiol. 1982. V. 28. P. 1320-1323.

87. Brown A.D. Compatible sulutes and extreme water stress in eukaryotic microorganisms // Adv. Microbial. Physiol. 1978. V 17. N 3. P. 181-242.

88. Burton G.W., Ingold K.U. Beta-carotene: an unusual type of lipid antioxidant // Science. 1984. V. 224. P. 569-573.

89. Cabib E., Leloir L. The biosynthesis of trehalose phosphate // J. Biol. Chem. 1958. V. 231. P. 259-275.

90. Calvo-Mendez C., Martinez-Pacheco M., Ruiz-Herrera J. Regulation of ornithine decarboxilase activity in Mucor bacilliformisand Mucor rouxii // Exp. Mycol. 1987. V. 11. P. 270-277.

91. Carratu L., Franceschelli S., Pardini C.L., Kobayashi G.S., Horvath I., Vigh L., Maressa B. Membrane lipid perturbation modifies the set point of the temperature of heat shock response in yeast // Pros. Natl. Acad. Sci. USA. 1996. V. 93. P. 3870-3875.

92. Carrillo D., Vicente-Soler J., Fernandez J., Soto T., Cansado J., Gacto M. Activation of cytoplasmic trehalase by cyclic-AMP-independent signalling pathways in the yeast Candida utilis // Microbiol. 1995. V. 141. P. 679-686.

93. Carruthers A., Melchior D.L. How bilayer affect membrane protein activity // TIBS 1986. V. 11. P. 331-335.

94. Cerami A. Aging of protein and nucleic acids: what is the role of glucose // TIBS. 1986. V. 11. N. 8. P. 311-314.

95. Chandrasekhar I., Gaber B.P. Stabilization of the bio-membrane by small molecules: interaction of trehalose with the phospholipid bilayer // J. Biomol. Strusture and Dynamics. 1988. V. 5. N. 6. P. 1163-1968.

96. Chatterjee M.T., Khalavan S.A., Curran P.G. Alteration in cellular lipids may be responsible for the transient nature of the yeast heat shock response // Microbiol. 1997. V. 143. P. 3063-3068.

97. Chatterjee M.T., Khalavan S.A., Curran P.G. Cellular lipid composition influences stress activation of the yeast general response element (STRE) // Microbiol. 2000. V. 146. P. 877-884.

98. Collinson L.P., Dawes I.W., Inducibility of the response of yeast cells to peroxide stress//J. Gen. Microbiol. 1992/V. 138. P. 329-335.

99. Costa V., Reis E., Quantanilha A. Moradas-Ferreira P. Acquisition of ethanol tolerance in Saccharomyces serevisiae: the key role of the mitochondrial superoxide dismutase //Arch. Biochem. Biophys. 1993. V. 300. N. 2. P. 608-614.

100. Craig E.A., Kramer J., Kosic-Smithers J. SSC1, a member of the 70-kDa heat shock protein multigene family of Saccharomyces serevisiae, is essential for growth Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1987. V. 84. P. 4156-4160.

101. Craig E.A., Gross C.A. Is hsp70 the cellular thermometer? // TIBS. 1991.V. 16. P. 135-140.

102. Cronan J.E., Gelman E.P. Physical properties of membrane lipids: biological relevance and regulation // Bacteriol. Rev. 1975. V. 39. N 3. P. 232-256.

103. Crowe L.M., Womersley C., Crowe J.H., Reid D., Appel L., Rudolph A. Prevention of fusion and leakage in freeze-dried liposomes by carbohydrates // Bio-chim. Biophys. Acta 1986. V. 861. P. 131-140.

104. Crowe J.H., Crowe L.M., Carpenter J.F., Rudolph A.S., Wistrom C.A., Spargo B.J., Anchordoguy T.J. Interaction of sugars with membranes // BBA. 1988. V. 947. P. 367-384.

105. Crowe J.H., Panek A.D., Crowe L.M., Panek A.C. de Araujo P.D. Trehalose transport in yeast cells // Biochem. Int. 1991. V. 24. P. 721-730.

106. Crowe J.H., Hoekstra F.A., Crowe J.M Anhydrobiosis // Annu. Rev. Physiol. 1992. V.54.P. 549-599.a

107. Crowe J.H., Hoekstra F.A., Nguen K.H.N., Crowe L.M. Is vitrification involved in depression of the phase transition temperature in dry phospholipids? // Biochim Biophys. Acta. 1996. V. 1280. P. 187-196.

108. Cruz A.K., Terenzi H.F., Jorge J.A., Terenzi H.F. Cyclic AMP-dependent, constitutive thermotolerance in the adenylate cyclase-deficient cr-1 (crisp) mutant ofNeurospora crassa // Curr. Genet. 1988. V. 13. P. 451-454.

109. Cutter V.M., Nuclear behavior in the Mucorales 1. The Mucor pattern // Bull.Torrey Bot. Club. 1942. V. 69. N. 7. P. 480-508.

110. Davies B. H. Analysis of carotenoid pigments // Chem. Biochem of Plant Pigment. Ed. Goodwin T. W., London, N.-Y.: Acad. Press., 1965. P. 489-532.

111. Davis R.H., Polyamines in fungi // In: The Mycota. Ill Biochemistry and Molecular biology. Eds. Vol. Brambl R., Marzluf G.A. Berlin, Heidelberg, N.Y.: Springer-Verlag. 1996. P. 347-356.

112. De Araujo P.S., Panek A.C., Crowe J.H., Crowe L.M., Panek A.D. Trehalose-transporting membrane vesicles from yeasts // Biochem. Int. V. 24. N. 4 P. 731737.

113. De Araujo P.S., Panek A.D. The interaction of Saccharomyces cerevisiae trehalase with membranes // Biochim. Biophys. Acta. 1993. V. 1148. P. 303-307.

114. De Kruijff. B. Biomembranes: lipids bejond the bilayer // Nature. 1997. V. 386. N. 6621. P. 129-130.

115. Dennis C., Blijham J.M., Effect of temperature on viability of sporangiophores of Rhizopus and Mucor species // Trans. Br. Mycol. Soc. 1980. V. 74. N. 1. P. 8994.

116. De Smet K.A.L., Weston A., Brown I.N., Young D.B., Robertson B.D. Three pathways for trehalose biosynthesis in mycobacteria // Microbiol. 2000. V. 146. P. 199-208.

117. De Virgilio C., Piper P., Boiler T., Wiemken A. Asquisition of thermotolerance in Saccharomyces cerevisiae without heat shock protein hsp 104 and the absence of protein synthesis // FEBS Lett. 1991. V. 288. N 1,2. P. 86-90.

118. De Virgilio C., Müller J., Boller T., Wiemken A. A constitutive, heat shock-activated neutral trehalase occurs in Schizosaccharomyces pombe in addition to the sporulation-specific acid trehalase // FEMS Microbiol. Lett. 1991. V. 84. P. 85-90.

119. De Virgilio C., Hottiger T., Dominguez J., Boller T., Wiemken A. The role of• trehalose synthesis for the acquisition of thermotolerance in yeast: 1. Genetic evidence that trehalose is a thermoprotectant // Eur.J. Biochem. 1994. V. 219. P. 179-186.

120. Dewerchin M.A., Van Laere A.J. Trehalase activity and cyclic AMP contentduring early development of Mucor rouxii spores // J. Bacteriol. 1984. V. 158. N. 2. P. 575-579.

121. Dijkema C., Kester H.C., Visser J. ,3C NMR studies of carbon metabolism in• the hyphal fungus Aspergillus nidulans // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 1985. V. 82. P. 14-18.

122. Drinkard L.C., Nelson G.E., Sutter R.P. Growth arrest: a prerequisite for sexual development in Phycomyces blakesleeanus // Exp. Mycol. 1982. V. 6. P. 52» 59.

123. Dubois M., Gilles K.A., Hamilton J.K. Reber P.A., Smith T. Calorimetric method for determination of sugar and related substances // Anal. Chem. 1956. V. 28. N3. P. 350-356.

124. Duplus E., Glorian M., Forest C. Fatty acid regulation of gene transcription // ^ J. Biol. Chem. 2000. V. 275. N. 40. P. 30749-30752.

125. Edelman R.E. Klomparens K.L. Zygosporogenesis in Zygorhynchus hetero-hamis with a proposal for standartization of structural nomenclature // Mycologia.• 1995. V. 87. N3. P. 304-318.

126. Elliot C.G. Sterols in fungi: their functions in growth and reproduction // Adv. Microbial. Physiol. 1977. V. 15. P. 121-173.

127. Farkas V. Fungal cell walls: their structure, biosynthesis and biotechnological aspects // Acta Biotechnol. 1990. V. 10. N 3. P. 225-238.

128. Felenbok B., Kelly J.M. Regulation of carbon metabolism in mycelial fungi // In: The Mycota. Ill Biochemistry and Molecular biology. 1996. Eds. Vol. Brambl R., Marzluf G.A. Berlin, Heidelberg, N.Y.: Springer-Verlag. S. 369-380.

129. Finley D., Özkaynak E., Varshavsky A. The yeast polyubiquitin gene is essential for resistance to high temperatures, starvation, and other stresses // Cell. 1987. V. 48. P. 1035-1046.

130. Folch J., Lees M., Sloane-Stanlet G.H.S. A simple method for the isolation and purification of total lipids from animal tissues // J. Biol. Chem. 1957.V. 226. N. 1. P. 497-529.

131. Foppen F.H. Tabes for the identification of carotenoid pigments // Chromatograph. Rev. 1971. V. 14. P. 133-298.

132. Francois J., Parrou J.L. Reserve carbohydrates methabolism in the yeast Saccharomyces cerevisiae //FEMS Microbiol. Rev. 2001.V. 25. P. 125-145.

133. Furch B., Gooday G.W. Sporopollenin in Phycomyces blakesleeanus // Trans. Br. Mycol. Soc. 1978. V. 70. P. 207-209.

134. Furch B., Pambor L. Cell wall constituents of Phycomyces blakesleeanus. 3. Carbohudrate and protein composition of sporangiospore cell walls in relation to heat-induced germination //Microbios Lett. 1978. V. 8. P. 71-80.

135. Galbraith J.C., Smith J.E. Changes in activity of certain enzymes of the tricar-boxilic acid cycle and the glyoxilate cycle during the initiation of conidiation of Aspergillus niger//Can. J. Microbiol. 1969. V. 15. P. 1207-1211.

136. Gann P.H., Ma J., Giovannucci E., Willet W., Sacks F. M., Hennekens C.H., Stampfer M.J. Lower prostate cancer risk in men with elevated plasma lycopene levels: results of prospective analysis // Cancer Res. 1999. V. 59. P. 1225-1230.

137. Garton C.U., Goodwin T.W., Lijinsky V. Studies in carotenogenesis of Phycomyces blakesleeanus // Biochem. J. 1961. V. 48. N 2. P. 154-163.

138. Ghosh R., Seelig J. The interaction of cholesterol with bilayers of phosphati-ylethanolamine//Biochim. Biophys. Acta. 1982. V. 691. P. 151-160.

139. Good B.H., Chapman R.L. The ultrastructure of phycopeltis (Chroolepidaceae: Chlorophyta). 1. Sporopollenin in the cell walls // Amer. J. Bot. 1978. V. 65. N. 1. P. 27-33.

140. Gooday G.W., Fawcet P., Green D., Shaw G. The formation of fungal sporopollenin in the zygospore wall of Mucor mucedo: a role for the sexual carotenogenesis in the Mucorales // J. Gen. Microbiol. 1973. V. 74. P. 233-239.

141. Gooday G.W. Sporopollenin formation in the ascospore wall of Neurospora crassa // Arch. Microbiol. 1974. V. 101. P. 145-151.

142. Goodrich-Tanriculu M., Howe K., Stafford A., Nelson M.A. Changes in fatty acid composition of Neurospora crassa accompany sexual development and ascospore germination//Microbiology. 1998. V. 144. P. 1713-1720.

143. Gounalaki N., Thireos G. YAP lp, a yeast transcriptional activator that mediates multidrug resistance, regulates the metabolic stress response // EMBO J. 1994. V. 13. N17. P. 4036-4041.

144. Green J.L., Angell C.A. Phase relations and vitrification in saccharide-water solutions and trehalose anomaly // J. Phys. Chem. 1989. V. 93. P. 2880-2882.

145. Gregory P.H. The fungus spore: What it is and what is does. I I In: The Fungus Spore. 1966. Ed: Madelin M.F. London: Butterworths. P. 1-13.$

146. Gunasekaran M., Weber D.J., Hess W.M. Changes in lipid composition during spore germination of Rhizopus arrhizus // Trans. Br. Mycol. Soc. 1972. V. 59. N. 2. P. 241-248.

147. Guzman-de-Pena D., Ruiz-Herrera J. Relationship between aflatoxin biosynthesis and sporulation in Aspergillus parasiticus // Fungal Gen. Biol. 1997. V. 21. P. 198-205.

148. Hackett C.J., Chen K.C. Quantitative isolation of native chitin from resistantstructures of Sordaria and Ascaries species // Anal. Biochem. 1978. V. 89. N. 2. P. 487-500.

149. Hackman R.H., Goldberg M. Studies on chitin. VI. The nature of a- and P• chitins // Aust. J. Boil. Sci. 1965. V. 18. N. 4. P. 935-946.

150. Hafker T., Techel D., Steier G., Rensing L. Differential expression of glucose-regulated (grp78) and heat-shock-inducible {hsp70) genes during asexual development ofNeurospora crassa // Microbiol. 1998. V. 144. P. 37-43.

151. Hakomori S. Carbohydrate-carbohydrate interaction as an initial step in cell recognition // Pure Appl. Chem. 1991. V. 63. N 4. P. 473-482

152. Hall B.G. Yeast thermotolerance does not require protein synthesis // J. Bacterid. 1983. V. 156. N. 3. P. 1363-1365.

153. Hallsworth J.E., Magan N. Effect of carbohydrate type and concentration on polyhy-^ droxy alcohol and trehalose content of conidia of three enthomopathogenic fungi // Microbiol. 1994 V. 140. P. 2705-2713.

154. Hallsworth J.E., Magan N. Manipulation of intracellular glycerol and erytritol en* hances germination of conidia at low water availability // Microbiol. 1995 V. 141. P.1109-1115.

155. Hammond B.W., Nichols R. Changes in respiration and soluble carbohydrates during the post-harvest storage of mushrooms (Agaricus bisporus) // J. Sci. Fd. Agric. 1975. V.• 26/P. 835-842.

156. Hammond B.W., Nichols R. Carbohydrate metabolism in Agaricus bisporus (Lange) Sing.: Changes in suluble carbohydrates during growth of mycelium and sporophore // J. Gen. Microbiol. 1976. V. 93. P. 309-320.

157. Hawker L.E., Madelin M.F. The dormant spore // In: The fungal spore. Form and function. 1976. Eds: Weber D.J., Hess W.M. N.Y., L., Sydney, Toronto: John Wiley and Sons. P. 1-70.

158. Hazel J.R. Thermal adaptation in biological membranes: is homoviscous adaptation the explanation? // Annu. Rev. Physiol. 1995. V. 57. P. 19-42.

159. Hazel J.R., Williams E.E. The role of alteration in membrane lipid composition in anabling physiological adaptation of organisms to their physical environment // Prog. Lipid Res. 1990. V. 29. P. 167-227.

160. Hecker L.I., Sussman A.S. Activity and heat stability of trehalase from the mycelium and ascospores of Neurospora // J. Bacterid. 1973. V. 115. N. 2. P. 582591.

161. Hecker L.I., Sussman A.S. Localization of trehalase in the ascospores of Neurospora: relation to ascospores dormancy and germination // J. Bacterid. 1973. V. 115. N. 2. P. 592-599.

162. Heslop-Harrison J. The pollen wall: structure and development // In: Pollen: development and physiology. Ed. J. Heslop-Harrison. London: Butterworths, 1971. P. 75-98.

163. Hess W.M., Weber D.J. Form and function in basidiomycete spores // In: The Fungal Spore. 1976. Eds: WeberD.J., Hess W.M. N.Y. ets.: John Wiley and Sons. P. 643-713.

164. Hong D., Gunn J., Ellis R.H., Jenkins N.E., Moore D. The effect of storage environment on the longevivy of conodia of Beauveria bassiana // Mycol. Res. 2001. V. 105. N. 5. P. 597-602.

165. Horikoshi K., Ikeda Y. Trehalase in conidia of Aspergillus oryzae // J. Bacterid. 1966. V. 91. N. 5. P. 1883-1887.

166. Biochem. J. 1996. V. 318. P. 187-193.

167. Jennings D.H. Polyol metabolism in fungi // Adv. Microbial. Physiol. 1984. V. 25. P. 149-193.

168. Jorge J.A., Polizeli M.L.T.M., Thevelein J.M. Terenzi H. F. Trehalases and trehalose hydrolysis in fungi // FEMS Microbiol. Lett. 1997. V. 154. P. 165-171.

169. Kaibushi K., Miyajima A., Arai K., Matsumoto K. Possible involvement of

170. RAS-encoded proteins in glucose-indused inositolphospholipid turnover in Sac-charomyces cerevisiae // Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1986. V. 83. P. 8172-8176.

171. Kandror O., DeLeon A., Goldberg A.L. Trehalose synthesis is induced upon exposure of Escherichia coli to cold and is essential for viability at low temperatures//Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2002. V. 99. N 15. P. 9727-9732.

172. Korshunov S.S., Korkina O.V., Ruuge E.K., Skulachev V.P., Starkov A.A. Fatty acids as natural uncouplers preventing generation of CV" and H2O2 by mitochondria in the resting state // FEBS Letters. 1998. V. 435. P. 215-218.

173. Koster K.L., Leopold A.C. Sugars and dessication tolerance in seeds // Plant Physiol. 1988. V. 88. P. 829-832.

174. Krinsky N.I. Antioxidant functions of carotenoids // Free Radical Biol. Med.1989. V. 7. P. 617-635.

175. Krinsky N.I. The biolgical properties of carotenoids // Pure Appl. Chem. 1994. V. 66. N. 5. P. 1003-1010.

176. Landau E.M., Rosenbusch J.P. Lipidic cubic phases: a novel concept for the ^ crystalization of membrane proteins // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1996. V. 93. P.14532-14535.

177. Lee C.W.B., Das Gupta S.K., Mattai J., Shipley G.G., Abdel-Mageed O.H., Makriyannis A., Griffin R.G. Characterization of the L^ Phase in trehalosestabilized dry membranes by solid-state NMR and X-ray diffraction // Biochem. 1989. V. 28. P. 5000-5009.

178. Lee A.G. Lipids and their effects on membrane proteins: evidence against a• role for fluidity // Prog. Lipid Res. 1991. V. 30. N 4. P. 323-348.

179. Lee D.H., Goldberg A.L. Proteasome inhibitors cause induction of heat shock proteins and trehalose, which together confer thermotolerance // Mol. Cell. Biol.1998. V. 18. N. 1. P. 30-38.

180. Lewis D.H., Smith D.C. Sugar alcohols (polyols) in fungi and green plants // New Phytol. 1967. V. 66. P. 143-184.

181. Lingappa B.T., Sussman A.S. Endogenous substrates of dormant, activated and• germinating ascospores of Neurospora tetrasperma // Plant Physiol. 1959. V. 34. P. 466-473.

182. Lindquist S. The heat-shock response // Ann. Rev. Biochem. 1986. V. 55. P. 1151-1191.

183. Lopez-Gallardo Y., Garsia-Soto J., Novoa-Martinez G., Martinez-Cadena. Membrane-associated trehalase activity in Phycomyces blakesleeanus spores // Mycol. Res. 1995. V. 99. N11. P. 1317-1320.

184. Lösel D.M. The stimulation of spore germination in Agaricus bisporus by living mycelium//Ann. Bot. N.S. 1964. V. 28. P. 541-554.

185. Lösel D.M. The stimulation of spore germination in Agaricus bisporus by organic acids // Ann. Bot. N.S. 1967. V. 31. N. 122. P. 417-425.

186. Lowry O.H., Rosenbrough HJ., Farr A.L., Randall R.J., Protein measurement• with Folin phenol reagent//J. Biol. Chem. 1951. V. 193. N. 1. P. 265-275.

187. Lucio A.K.B., Policeli M.L.T.M., Jorge J.A., Terenzi H.F. Stimulation of hy-phal growth in anaerobic cultures of Mucor rouxii by extracellular trehalose. Relevance of cell wall-bound activity of asid trehalase for trehalose utilization //

188. FEMS Microbiol. Lett. 2000. V. 182. P. 9-13.

189. Mager W. H., Ferreira P.M.M. Stress response of yeast // Biochem. J. 1993. V. 290. P. 1-13.

190. Mager W. H., De Kruijff A.J.J. Stress-induced transcriptional activation // Microbiol. Rev. 1995. V. 59. N. 3. P. 506-531.

191. Managbanag J.R., Torzilli A.P. An analysis of trehalose, glycerol, and manni-tol accumulation during heat and solt stress in a solt marsh isolate of Aureo-basidium pullulans //Mycologia. 2002. V. 94. N. 3. P. 384-391.

192. Mandels G.R., Vitols R., Parrish F.M. Trehalose as an endogenous reserve in spores of the fungus Myrothecium verrucaria // J. Bacteriol. 1965. V. 90. N. 1. P.1589-1598.

193. Marchant H.J. Cell division and colony formation in the green alga Coelastrum (Chlorococcales) // J. Phycol. 1977. V. 13. P. 102-110.

194. Martinez-Pacheco M., Rodriguez G., Reyna G., Calvo-Mendez C., Ruiz-Herrera J. Inhibition of yeast-mycelial transition and phorogenesis of Mucorales by diamino butanone // Arch. Microbiol. 1989. V. 151. P. 10-14.

195. Marzluf G.A. Regulation of nitrogen metabolism in mycelial fiingi // In: The Mycota. Ill Biochemistry and Molecular biology. 1996. Eds. Vol. Brambl R., Marzluf G.A. Berlin, Heidelberg, N.Y.: Springer-Verlag. S. 357-368.

196. Matos H.R., Di Mascio P., Medeiros M.H.G. Protective effect of lycopene on lipid peroxidation and oxidative DNA damage in cell culture // Arch. Biochem. Biophys. 2000. V. 383. N 1. P. 56-59.

197. Matthews C.R. Pathways of protein folding // Annu. Rev. Biochem. 1993.V. 62. P. 653-683.

198. Mayne S.T. Beta-carotene, carotenoids, and disease prevention in humans // FASEB J. 1996. V. 10 N. 7. P. 690-701.

199. Medwid R.D., Grant D.W. Germination of Rhizopus oligosporus sporangio-spores //Appl. Environ. Microbiol. 1984. V. 48. N. 6. P. 1067-1071.

200. Mills Y.L., Eilers F. J. Factors influencing the germinationof Basidios pores of Coprunus radiatus // J. Gen. Microbiol. 1973. V. 77. P. 393-401.

201. Minami S., Okamoto Y., Migatake K., Mutsuhashi A. Kitamura Y. Chitin induces type IV collagen and elastic fiber in implanted nonvolen fabric of polyester // Carbohydrate polymers. 1996. V. 29. Iss. 4. P. 295-299.

202. Mortensen A., Skibsted L.H. Importance of carotenoid structure in radical-scavenging reaction // J. Agric. Food Chem. 1997. V. 45. P. 2970-2977.

203. Neves M.-J., Francois J. Jorge J.A., Terenzi H.F. Effect of heat shock on thelevel of trehalose and glycogen, and on the induction of thermotolerance in Neu-rospora crassa //FEBS Lett. 1991. V. 283. N. 1. P. 19-22.

204. Neves M.J., Francois J. On the mechanism by which a heat shock induces trehalose accumulation in Saccharomyces cerevisiae // Biochem. J. 1992. V. 288. P. 559-564.

205. Nguyen M.L., Schwartz S.J. Lycopene: chemical and biological properties // Foodtechnol. 1999. V. 53. N 2. P. 38- 45.

206. Nishimura K., Nishimura S., Seo H., Nishi N., Tokura S., Azuma I. Macrophage activation with multi-porous beads prepared from partially deacetilated chitin //J. Biomed. Mater. Res. 1986. V. 20. P. 1359-1372.

207. Noventa-Jordao M.A., Couto R.M., Goldman H.S., Aguirre J., Iyer S., Caplan A., Terenzi H.F., Goldman G.H. Catalase activity is necessary for heat-shock recovery in Aspergillus nidulans germlings // Microbiology. 1999. V. 146. P. 32293234.

208. Nwaka S., Kopp M., Burgert M., Deuchler I., Kienle I., Holzer H. Is thermo-tolerance of yeast dependent on trehalose accumulation? // FEBS Lett. 1994. V. 344. P. 225-228.

209. Oberson J., Rawyler A., Brandie R., Canevascini C. Analysis of the heat-shock response displayed by two Chaetomium species originating from different thermal environment //Fungal Gen. Biol. 1999. V. 26. P. 178-189.

210. Osherov N., May G.S. The molecular mechanisms of conidial germination // FEMS Microbiol. Lett. 2001. V. 199. P. 153-160.

211. Panek A.C., De Araujo P.S., Neto V.M., Panek A.D. Regulation of trehalose-6-phosphate synthase complex in Saccharomyces // Curr. Genet. 1987. V. 11. P. 459-465.

212. Panek A.C., Vânia J.J.M., Paschoalin M.F., Panek D. Regulation of trehalose metabolism in Saccharomyces cerevisiae mutants during temperature shifts // Biochimie 1990. V. 72. P. 77-79.

213. Paschoalin V.M.F., Silva J.T., Panek A.D. Identification of an ADFG-dependent trehalose synthase in Saccharomyces // Curr. Genet. 1989. V. 16. P. 8187.

214. Pechan P.M. Heat shock proteins and cell proliferation // FEBS. 1991. V. 280. N. l.P. 1-4.

215. Pedreno Y., Gimeno-Alcaniz E. M., Argiielles J-C. Response to oxidative stress caused by H2O2 in Saccharomyces cerevisiae mutants deficient in trehalase genes //Arch. Microbiol. 2002. V. 177. P. 494-499.

216. Petko L., Lindquist S. Hsp26 is not required for growth at high temperatures, nor for thermotolerance, spore development, or germination // Cell. 1986. V. 45. P. 885-894.

217. Picket-Heapps J.D., Staehelin The ultrastructure of Scenedesmus (Chlorophy-ceae) II. Cell division and colony formation // J. Phycol. 1975. V. 11. P. 186-202.

218. Piper P.W., Lockheart A. A temperature-sensitive mutant of Saccharomyces cerevisiae defective in the specific phosphatase of trehalose biosynthesis // FEMS Microbiol. Lett., 1988. V. 49. P. 245-50.

219. Piper P. W. Molecular events associated with acquisition of heat tolerance by the yeast Saccharomyces cerevisiae // FEMS Microbiol. Rev. 1993. V. 11. P. 339356.

220. Plesofsky-Vig N., Brambl R. Heat shock response of Neurospora crassa: protein tsynthesis and induced thermotolerance // J. Bacterid. 1985. V. 162. N. 3. P. 1083-1091.

221. Plesofsky-Vig N. The heat-shock protein and stress response // In: The my-cota. Ill Biochemistry and Molecular biology. 1996. Eds. Vol. Brambl R., Marzluf G.A. Berlin, Heidelberg, N.Y.: Springer-Verlag. S. 171-190.

222. Potts M. Dessication tolerance of prokariotes // Microbiol. Rev. 1994. V. 58. N 4. P. 755-805.

223. Qadota H., Python C.P., Inoue S.B., Arisawa M., Anraku Y., Zheng Y., Wata-nabe T., Levin D.E., Ohya Y. Identification of yeast Rho lp GTPase as a regulatory subunit of 1,3-P-glucan syntase // Science. 1996. V. 272. P. 279-281.

224. Quinn P.J., Joo F., Vigh L. The role of unsaturated lipids in membrane structure and stability// Prog. Biophys. Molec. Biol. 1989. V. 53. P. 71-103.

225. Rao A. V., Agarval S. Role of antioxidant lycopene in cancer and heart disease //J. Amer. Coll. Nutr. 2000. V. 19. N. 5. P. 563-569.

226. Rast D., Stauble E J. On the mode of action of isovaleric acid in stimulating the germination of Agaricus bisporus spores // New Phytol. 1970. V. 69. P. 557-566.

227. Riley P.A. Melanin // Int. J. Biochem. Cell Biol. 1997. V. 29. N. 11. P. 12351239.

228. Rudolph A.S., Crowe J.H., Membrane stabilization during freezing: the role of two natural cryoprotectants, trehalose and prolin // Cryobiol. 1985. V. 22. P. 367377.

229. Russell N.J. Mechanism of thermal adaptation in bacteria: blueprint for survival //TIBS. 1984. V. 9. P. 108-112.

230. Ryan C.A. Oligosaccharide signaling in plants // Ann. Rev. Cell Biol. 1987. V. 3.P. 295-317.

231. Sakamoto Y, Ando A., Tamai Y., Miura K., Yajima T. Protein expression during fruit body induction of Flammulina velutipes under reduced temperature // Mycol. Res. 2002. V. 106. N 2. P. 222-227.

232. Sampedro J.G., Uribe S. Trehalose-enzyme interactions result in structure stabilization and activity inhibition. The role of viscosity // Mol. Cell. Biochem. 2004. V. 256/257. P. 319-327.

233. Sanchez Y., Taulien J., Borkovich K.A., Lindquist S. Hspl04 is required for tolerance to many forms of stress // EMBO J. 1992. V. 11. N. 6. P. 2357-2364

234. Sanchez O., Magidin M., Stringer M., Aguirre J. Nutrient starvation stress and asexual development in Aspergillus nidulans // In: Book of Abstracts VII Int. Fungal Biology Conf. Groningen. 1999. P. 17.

235. Schlesinger M.J. Heat shock proteins: the search for functions // J. Cell Biol. 1986. V. 103. P. 321-325.

236. Schlesinger MJ. Heat shock proteins // J. Biol. Chem. 1990. V. 265. N. 21. P. 12111-12114.

237. Schmit J.C., Brody S. Neurospora crassa conidial germination: role of endogenous amino acis pools //J. Bacteriol. 1975. V. 124. N. 1. P. 232-242.

238. Seddon J.M. Structure of the inverted hexahonal (Hu) phase, and non-lamellar phase transition of lipids // Biochim. Biophys. Acta. 1990. V. 1031. P. 1-69.

239. Seymour I.J., Piper P.W. Stress induction of HSP30, the plasma membrane heat shock protein gene of Saccharomyces cerevisiae, appears not to use known stress-regulated transcription factors //Microbiology. 1999. V. 145. P. 231-239.

240. Shaw G., Yeadon A. Chemical studies on the constitution of some pollen and spore membranes // J. Chem. Soc. (C). 1966. V. 18. P. 16-22.

241. Shaw G. Sporopollenin // In: Phytochemical Phylogeny. Ed.: Harborne J.B. London, N.Y.: Acad.Press., 1970. P. 31-58.

242. Shaw G. The chemistry of sporopollenin // In: Sporopollenin. Eds. Brooks J., Grant P. R., Muir M., Gjizel and Shaw G. London: Acad. Press, 1971. P. 305-350.

243. Shobert B. Is there an osmotic regulatory mechanism in algae and higher plants? I I J. Theor. Biol. 1977. V. 68. P. 17-26.

244. Silvius J.R., Brown P.M. Role of head group structure in the phase behavior of amino phospholipids. 1. Hidrated and dehydrated lamellar phases of saturated phosphatidylethanolamine analogues // Biochemistry. 1986. V. 25. P. 4249-4258.

245. Sinensky M., Homeoviscous adaptation a homeostatic process that regulates the viscosity of membrane lipids in Escherichia coli // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1974. V. 71. N2. P. 522-525.

246. Singer M.A., Lindquist S. Multiple effect of trehalose on protein folding in vitro and in vivo // Mol. Cell 1998. V. 1. P. 639-648.

247. Smith J.E., Berry D.R. An introduction to biochemistry of fungal development. 1976. L., N.Y: Acad. Press.

248. Somero G.N. Protein and temperature // Annu. Rev. Physiol. 1995. V. 57. P. 43-68.

249. Somogui M. Determination of blood sugar // J. Biol. Chem. 1945. V. 160. P. 69.

250. Song C.H., Cho K.Y. Effect of low temperature shock treatment on sporofore initiation, lipid prifile and nutrient transport in Lentinula edodes // Mycologia. 1991. V. 83, N1, P. 24-29

251. Sorger P.K. Heat shock factor and heat shock response // Cell. 1991. V. 65. P. 363-366.

252. Soto T., Fernandez J., Vicente-Soler J., Cansado J., Gacto M. Posttranslational control of trehalase induced by nutrients, metabolic inhibitors, and Physical agents in Pachysolen tannophylus // Fungal Gen. Biol. 1996. V. 20. P. 143-151.

253. Souza N.O., Panek A.D. Location of trehalase and trehalose in yeast cells // Arch. Biochem. Biophys. 1968. V. 125. P. 22-28.

254. Spurgeon S.L., Porter J.W. Biosynthesis of carotenoids // In: Biosynthesis of Isoprenoid Compounds. Eds.: Porter J.W., Spurgeon S.L. N.Y. ets.: John Wiley and Sons, 1983. V. 2. P. 1-122.

255. Stahl W., Sies H. Lycopene: a biologically important carotenoid for humans? // Persp. Biochem. Biophys. 1996. V. 236. N. 1. P. 1-9.

256. ST Leger R.J., Roberts D.W., Staples R.S. Calcium- and calmodulin-mediated protein synthesis and protein phosphorylation during germination, growth and protease production by Metarhizum anisopliae // J. Gen. Microbiol. 1989. V. 135. P. 2141-2154.

257. Strohl W.R., Larkin J.M.m Good B.H., Chapman R.L. Isolation of sporopol-lenin from four mixobacteria // Can. J. Microbiol. 1977. V. 23. P. 1080-1083.

258. Sumner J.L., Morgan E.D. The fatty acid composition of sporangiophores and vegetative mycelium of temperature-adapted fungi in order Mucorales // J. Gen. Microbiol. 1969. V. 59. P. 215-221.

259. Sussman A.S. Dormansy and spore germination // In: The Fungi: an advanced treatise. Eds.: Ainsworth G.C., Sussman A.S. 1966. V. 2. P. 733-764.

260. Sussman A.S., Halvorson H.O. Spores their dormancy and germination. 1966. N.Y., L.: Harper& Row. 315 p.

261. Sussman A.S. as of fungal spore germination // In: The fungal spore. Form and function. 1976. Eds: Weber D.J., Hess W.M. N.Y., L., Sydney,Toronto: John Wiley and Sons. P. 101-137.

262. Swan T.M., Watson K. Membrane fatty acid composition and membrane fluidity as parameters of stress tolerance in yeast // Can. J. Microbiol. 1997. V. 43. P. 70-77.

263. Swan T.M., Watson K. Stress tolerance in a yeast sterol auxotroph: role of er-gosterol, heat shock proteins and trehalose // FEMS Microbiol. Lett. 1998. V. 169. P. 191-197.

264. Tabor C.W., Tabor H. Polyamines in microorganisms // Microbiol. Rev. 1985. V. 49. N1., P. 81-99.

265. Takebe I. Choline sulfate as a major soluble sulfur component of conidiospores of Aspergillus niger // J/ Gen. Appl. Microbiol. 1960. V. 6. N. 2. P.83-89.

266. Tanaka K., Matsumoto K., Toh-e A. Dual regulation of the expression of the polyubiquitin gene by cyclic AMP and heat shock in yeast // EMBO J. V. 7. N. 2. P. 495-502.

267. Thevelein J.M., Van Laere A.J., Beullens M., Van Assche J.A., Carlier A.R. Glucose-induced trehalase activation and trehalose mobilization during early germination of Phycomyces blakesleeanus spores // J. Gen. Microbiol. 1983. V. 129. P. 719-726.

268. Thevelein J.M. Regulation of trehalase activity by phosphorylation-dephosphorylation during developmental transition in fungi // Exp. Mycol.

269. Thevelein J.M., Beullens M. Cyclic AMP and the stimulation of trehalase activity in the yeast Saccharomyces cerevisiae by carbon sources, nitrogen sources and inhibitors of protein synthesis // J. Gen. Microbiol. 1985. V. 131. P. 31993209.

270. Thevelein J.M. Regulation trehalose mobilization in fungi // Microbiol. Rev. 1984. V. 48. P.42-59.

271. Thevelein J.M., Hohman S. Trehalose synthase:guard to the gate of glycolysis in yeast? // Trends in Biological Scienses. 1995. V. 20. N 1. P. 3-10.

272. Thevelein J.M. Regulation of trehalose metabolism and its relevance to cell growth and function // In: The Mycota. Ill Biochemistry and Molecular biology. 1996. Eds. Vol. Brambl R., Marzluf G.A. Berlin, Heidelberg, N.Y.: SpringerVerlag. S. 395-420.

273. Tokoro M., Yanagita T. Physiological and biochemical studies on the longevity of Aspergillus oryzae cinidia stored under various environmental conditions // J. Gen. Appl. Microbiol. 1966. V. 12. N 2. P. 127-145.

274. Turian G. Spores in Ascomycetes, their controlled differentiation // In: The fungal spore. Form and function. 1976. Eds: Weber D.J., Hess W.M. N.Y., L., Sydney,Toronto: John Wiley and Sons. P. 715-786

275. Van Doom J., Schölte M.E., Postma P.W., Van Driel R., Van Dam K. Regulation of trehalase activity during the cell cycle of Saccharomyces cerevisiae // J. Gen. Microbiol. 1988. V. 134. P. 785-790.

276. Vandercammen A., Francois J., Hers H.-G. Characterization of trehalosee-6-phosphate synthase and trehalose-6-phosphate phosphatase of Saccharomyces cer-evisiae // Eur. J. Biochem. 1989. V. 182. P. 613-620.

277. Van Laere A., Fransen M. Metabolism of germinating teliospores of Ustilago nuda // Arch. Microbiol. 1989. V. 153. P. 33-37.

278. Van Laere A.J., Hendrix P., Ciclic AMP-dependent in vitro activation of treha-lase from dormant Phycomyces blakesleeanus spores // J.Gen.Microbiol. 1983. V. 129. P. 3287-3290.

279. Vigh L., Maressa B., Harwood J.L. Does the membrane's physical state control the expression of heat shock and other genes? // TIBS. 1998. V. 23. P. 369-374.

280. Vuorio O.E., Kalkkinen N., Londesborough J. Cloning of two related genes encoding the 56-kDa and 123-kDa subunits of trehalose synthase from the yeast Saccharomyces cerevisiae // Eur.J. Biochem. 1993. V. 216. P. 849-861.

281. Wallis G.L.F., Hemming F.W., Peberdy J.F. p-galactofuraniside glycoconju-gates on conidia and conidiophores of Aspergillus niger // FEMS Microbiol.Lett. 2001. V. 201. P. 21-27.

282. Watanabe K., Parbery D.G., Kobayashi T., Doi Y. Conidial adhesion and germination of Pestalotiopsis neglecta // Mycol. Res. 2000. V. 104. P. 962-968.

283. Watt R., Piper P.W. U14, the polyubiquitin gene of Saccharomyces cerevisiae, is a heat shock gene that is also subject to catabolite derepression control // Mol. Gen Genet. 1997. V. 253. P. 439-447.

284. Weber D.J., Hess W.M. Form and function in basidiomycete spores // In: The fungal spore. Form and function. 1976. Eds: Weber D.J., Hess W.M. N.Y., L., Sydney,Toronto: John Wiley and Sons. P. 643-713.

285. Weete J.D. Lipid biochemistry of fungi and other organisms. 1982. N.Y., L.: Plenum Press. P. 301-312.

286. Weete J.D., Gandhi S.R. Biochemistry and molecular biology of fungal sterol // In: The Mycota. Ill Biochemistry and Molecular biology. 1996. Eds. Vol. Brambl R., Marzluf G.A. Berlin, Heidelberg, N.Y.: Springer-Verlag. S. 421-438.

287. Weinstein R.N., Montiel P.O., Johnstone K. Influence of growth temperature on lipid and soluble carbohydrate synthesis by fungi isolated from fellfield soil in the maritime Antartic//Mycologia. 2000.V.92. N2. P.222-229.

288. Welch W.J., Brown C.R. Influence of molecular and chemical chaperones on protein folding//Cell Stress Chaperones. 1996. 1:209-215.

289. Wells K. Light and electron microscopic studies of Ascobolus sterconarius II. Ascus ans ascospore ontogeny // Univ. California Publ. Bot. 1972. V. 62. P. 1-93.

290. Wera S., Schrijver E., Geyskens I., Nwaka S., Thevelein J.M. Opposite roles of trehalase activity in heat-shock recovery and heat-shock survival in Saccharomyces cerevisiae // Biochem. J. 1999. V 343. P. 621-626.

291. Werner-Washburne M., Becker J., Kosic-Smithers J., E.A. Yeast Hsp70 RNA Levels vary in responce to the physiological status of the cell // J. Bacteriol. 1989. V. 171. N5. P. 2680-2688.

292. Wessels J.G.H. Development of fruit bodies in Homobasidiomycetes // In: The Mycota. I. Growth, Differentiation and Sexuality. 1994. Eds. Vol. Wessels/Meinhardt Berlin, Heidelberg, N.Y.: Springer-Verlag. P. 351-366.

293. Wiemken A. Trehalose in yeast, stress protectant rather than reserve carbohydrate // Antonie van Leeuwenhoek. 1990. V. 58. P. 209-217.

294. Witteveen F.B., Visser J. Polyol pools in Aspergillus niger // FEMS Microbiol. Lett. 1995. V. 134. P. 57-62.

295. Wösten H.A.B., Richter M., Willey J.M. Structural proteins involved in emergence of microbial aerial hyphae // Fungal Gen. Biol. 1999. V. 27. P. 153-160.

296. Wösten H.A.B. Hydrophobins: multipurpose proteins // Annu. Rev. Microbiol. 2001. V. 55. P. 625-646.

297. Yu R.K., Koerner A.W., Scarsdale J.N., Prestegard J.H. Elucidation of glycol-ipid structure by proton nuclear magnetic resonance spectroscopy // Chem. Phys. Lipids 1986. V. 42. P. 27-48.

298. Zähringer H., Burgert M., Holzer H., Nwaka S. Neutral trehalase Nthl of Saccharomyces cerevisiae encoded by the NTH1 gene is a multiple stress responsive protein // FEBS Lett. 1997. V. 412. P. 615-620.

299. Zaragoza Ö., Gonzälez-Pärraga P., Pedreno Y., Alvarez-Peral F.J., Argüelles J-C. Trehalose accumulation induced during the oxidative stress response is independent of TRSImRNA levels in Candida albicans // Int. Microbiol. 2003. V. 6. P. 121-125.