Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Полиморфизм у литобионтных микромицетов: индуцирующие факторы и адаптивная роль

ВАК РФ 03.00.24, Микология

Автореферат диссертации по теме "Полиморфизм у литобионтных микромицетов: индуцирующие факторы и адаптивная роль"

На правах рукописи

БОГОМОЛОВА РГб Ой

Евгения Валентиновна ,, , . ..

1 » VI. ,

Полиморфизм у литобионтных микромицетов: индуцирующие факторы и адаптивная роль

03.00.24 - микология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт-Петербург - 2000

Работа выполнена на кафедре Ботаники Биолого-почвенного факультета Санкт-Петербургского государственного университета

Научные руководители: кандидат биологических наук Власов Д.Ю. доктор биологических наук, профессор Павленко В.К.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук Нюкша Ю.П. доктор биологических наук Каратыгин ИВ.

Ведущая организация; Институт биохимии и физиологии микроорганизмов

РАН (Пущино)

Защита состоится 23 февраля 2000 года в 14 часов на заседании диссертационного Совета Д 002.46.01 по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора биологических наук при Ботаническом институте им. В.Л. Комарова РАН по адресу: 197376, Санкт-Петербург, ул. Проф. Попова, 2.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Ботанического института им. В.Л. Комарова РАН.

Автореферат разослан

января 2000 г.

Ученый секретарь диссертационного Совета, кандидат биологических наук

Чаплыгина О.Я.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Литобионтные микромицеты являются специфической экологической группой грибов, обладающих целым рядом морфологических приспособлений для обитания в жестких условиях минерального субстрата. До последнего времени изучение этой группы касалось, главным образом, видового состава, экологии и биоповреждающей способности по отношению к памятникам искусства, выполненным из камня (КгитЬет, 1спз 1981; БЫеу ег а1., 1982, Рпейтапп, Осатро-РпеЙтапп, 1984; 51егАп^ег, КгитЬет, 1995; \VolIenzien е! а1., 1995; ига е1 а1., 1991; 1995; Горбушина и др.,1996; Богомолова и др., 1996, 1997; Зеленская и др., 1997, 1999; 51егЯищег, КттЬет, 1997; Бе Ьео (Л а1., 1999; 81егШп$ег ег а1., 1999). В последние годы были описаны общие черты строения микроколониальных литобионтных грибов, однако детального исследования природы и механизмов морфогенеза (особенно в связи с обитанием на труднодоступном субстрате) не проводилось. Вместе с тем, высокая морфологическая пластичность может служить одним из важнейших защитных механизмов, характеризующих адаптивный потенциал литобионтных микромицетов. Исследование процессов морфогенеза и цитодифференцировки у этих организмов имеет существенное значение для понимания универсальных механизмов приспособления грибов к меняющимся условиям внешней среды.

Адаптивные возможности вида наиболее ярко проявляются в экстремальных условиях или близких к ним. Именно в таких условиях находятся микромицеты, обитающие на поверхности камня, что делает их крайне интересными объектами для экспериментального морфологического исследования. Для представителей этой группы, обладающих ди- и полиморфизмом, все еще остаются неразработанными морфологические критерии, имеются неясности и разночтения при трактовке таксономических признаков. Поэтому особое значение приобретает подробное описание различных форм роста и введение некоторых количественных показателей в систему определения качественных признаков, важных с таксономической точки зрения. Кроме того, исследование морфогенетических процессов актуально в связи с тем, что механизмы внутриклеточных преобразований едины у разных групп грибов, в том числе они распространяются и на грибы-патогены человека, среди которых большинство -диморфные виды.

Цель и задачи исследования. Цель исследования заключалась в составлении целостной картины морфогенеза микроколониальных литобионтных грибов и оценке влияния внешних условий на характер морфогенетических преобразований. Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

1. Провести сравнительный статистический анаша видовых списков грибов, обнаруженных на поверхности мрамора в различных географических условиях, и установить ядро группы типичных обитателей данного субстрата.

2. Выявить основные типы морфологических структур, формирующихся у литобионтных грибов под воздействием внешних факторов, и определить их биологическое значение на примере Phaeococcomyces exophialae de Hoog.

3. Оценить возможности экспериментального получения мицелиально-дрожжевых переходов у Р. exophialae и определить основные факторы, индуцирующие данный процесс.

4. Выявить основные сигнальные системы, вовлеченные в морфогенетические преобразования изучаемых грибов.

5. Изучить влияние ряда фармакологических агентов, микробных ауторегуляторов и освещенности на морфологию некоторых литобионтных грибов.

6. Составить целостное описание процессов развития микроколониальных литобионтных грибов в естественных условиях на основе экспериментально полученных данных.

Научная новизна. Впервые составлен статистически подтвержденный список микромицетов, типичных для кальций-содержащего каменистого субстрата, и показана малая зависимость ядра микобиоты от географической зоны. На основании экспериментального исследования морфогенетических процессов у литобионтных грибов предложено и экспериментально подтверждено понятие адаптивного морфологического потенциала вида. Выявлены пять возможных форм роста дрожжеподобного гриба Phaeococcomyces exophialae и установлены условия их взаимопереходов. Впервые обнаружена мицелиальная форма роста у ряда штаммов Р. exophialae, что позволило дополнить характеристику данного вида. Разработан численный критерий для разграничения морфологических структур у грибов (морфологический индекс). Предложена и экспериментально проверена схема возможных путей прохождения морфогенетического сигнала от внешней среды в грибную клетку. Экспериментально выявлены способы управления мицелиально-дрожжевыми переходами у Р. exophialae, и определены факторы, индуцирующие такие переходы. Составлено целостное описание процессов развития микромицетов в условиях минерального субстрата и предложено объяснение причин возникновения микроколониальности у литобионтных грибов.

Практическое значение работы. Результаты данной работы могут быть использованы в разработке мер борьбы с микробным разрушением камня (в частности, произведений монументального искусства). В связи с тем, что среди диморфных микромицетов немало возбудителей микозов человека и животных, полученные в настоящей работе данные могут быть использованы в медико-биологических исследованиях. В работе показаны возможности применения для микологических целей метода анализа изображения, апробированы и развиты современные компьютерные методы морфологического анализа, введен усовершенствованный численный критерий для разграничения мицелиальной и псевдомицелиальной форм роста у грибов. Ряд полученных результатов используется в курсе лекций "Проблемы биоповреждений" и "Биологическая синергетика" (СПбГУ).

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались на семинарах кафедры ботаники СПбГУ, конференции STREMA'95 (Крит, 1995), конференции 'Экология и охрана окружающей среды" (Пермь, 1995), Международной конференции по эволюционной физиологии (Санкт-Петербург, 1996), конференции "Университеты в канун третьего тысячелетия" (Санкт-Петербург, 1997), конференции "Современные проблемы микологии, альгологии и фитопатологии" (Москва, 1998), Международных Микологических Конгрессах IUMC6 (Иерусалим, 1996, 1998), Международной школе "Проблемы теоретической биофизики" (Москва, 1998), Международной конференции "Nonlinear phenomena in biology" (Пущино, 1998), конференции "Human Fungal Pathogenes: Dimorphism and Disease" (Гранада, 1999), XIII Congress of European Mycologists (Мадрид, 1999), П Съезде биофизиков России (Москва, 1999), Международной конференции "Фуллерены и атомные кластеры" IWFAC'99 (С-Петербург, 1999).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 8 статей и 16 тезисов.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, 6 глав, выводов и списка литературы, содержащего 253 публикации. Работа изложена на 132 страницах и иллюстрирована 29 рисунками и 15 таблицами.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ ВВЕДЕНИЕ. Обоснована актуальность темы диссертации, сформулированы цели и задачи исследования, кратко проанализировано содержание работы.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ. Глава содержит сведения о некоторых экологических и морфологических особенностях литобионтных грибов. Проанализированы литературные данные о влиянии внешних факторов на морфологические преобразования у различных видов ди- и полиморфных грибов, рассмотрены основные стратегии развития грибов. Специальное внимание уделено вопросам внутриклеточной сигнализации и механизмам восприятия и преобразования грибной клеткой внешнего сигнала, приводящим к изменению формы роста. Представлен критический анализ терминологии, существующей в данной области, и обосновано применение в настоящей работе основных терминов и понятий, связанных с полиморфизмом у грибов.

ГЛАВА II. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ. Сбор материала проводился в 1994-1999 годах в Херсонееском историко-археологичсском заповеднике (Крым, Севастополь), в Александро-Невскон лавре (С-Петербург). Кроме того, исследовались образцы, полученные из Керченского лалвдария (Крым), а также любезно предоставленные А.Н. Щегловым образцы мрамора с территории Афинского Акрополя. Большинство обследованных памятников экспонировалось на открытом воздухе десятки и сотни лет. Всего исследован 221 образец мрамора (в том числе 100 образцов из Херсонеса, 26 из Афин, 65 из Керчи и 30 образцов из С-Петербурга).

Изоляцию грибов в культуру с образцов мрамора осуществляли методами прямого отсева микологической иглой, агаровых отпечатков с поверхности камня, а также посевом мелкой каменной крошки на плотную питательную среду. Для отбора грибов с поверхности ценных

памятников "щадящим" способом (без повреждения поверхности камня) нами был разработан метод липких пленок.

Полученные толяты культивировались на агаризованной среде Чапека-Докса, на картофельно-дскстразном, дрожжевом и овсяной агаре. Идентификацию микромнцегов-обктателек камня проводили с использованием отечественных и зарубежных определителей (Литвинов, 1967; Пидошшчко, 1978; Бабьева, Голубев, 1979; Егорова, 1986; Baroett, 1960; Barron, 1968; Boerema, 1973; Von Arx, 1974; Gams, 1976; de Hoog, Hermanides-Nijhof, 1977; McGinnis et al, 1985; Ellis, 1993; de Hoog, 1995), а также отдельных оригинальных статей в периодической печати.

При проведении экспериментальной части работы в качестве основы были использованы стандартные агаризованные к жидкие среды (картофельно-глюкозная, овсяный отвар, среда Чапека), модифицировавшиеся нами в соответствии с задачами экспериментов. Для наблюдения за ростом грибов в процессе экспериментов применяли метод агаровых пленок, культивирование в висячей капле на кольцах Ван-Тигема, а также культивирование грибов в лунках микротитрационных планшетов (по 200 икл хчдкой питательной среды на лунку объемом 300 мкл). Опыты проводились не менее, чем в 3 сериях и в 3 повторностях.

Детальное исследование морфологических особенностей литобионтных грибов осуществляли с использованием световой (на микроскопах SMP-6 OPTON, БИОЛАМ) и электронной сканирующей микроскопии (на микроскопах НПАСШ S-3200N и JEOL GSM 35С). СЭМ-анализ препаратов, приготовленных по стандартной методике, проводился в Ольденбургском университете (Германия).

Морфомстричесюш анализ получаемых структур грибов осуществляли на оборудовании фирмы Leica (Биологический НИИ СПбГУ, Центр "Хромое"). Изображения сохранялись в электронном виде, что позволяло впоследствии проводетъ точные измерения параметров клеток. Значение каждого параметра усреднялось по данным примерно 250 измерений. Статистическая обработка результатов экспериментов проводилась стандартными методами. ГЛАВА III. МИКРОКОЛОНИАПЬНЫЕ ДРОЖЖЕПОДОБНЫЕ ГРИБЫ -ПОСТОЯННЫЕ ОБИТАТЕЛИ МРАМОРА. Задача данной части работы состояла в статистическом выявлении ядра группы литобионтных грибов, наиболее приспособленных к каменистому субстрату. Для этого было проведено сравнение видовых списков грибов, полученных при исследовании образцов мрамора из различных географических точек. Обнаруженные микромицеты отнесены к 99 видам, 55 родам, 7 семействам, 5 порядкам и 3 классам (табл. 1). Безусловное первенство по числу видов и родов принадлежит классу Hyphomycetes, пор. Hyp hales, сем. Dematiaceae: Это же семейство включает наиболее богатые по числу видов рода (Altemaria, Cladosporium). Составление корреляционной матрицы, сравнение сходства видовых составов по Сёренсену и сравнение сходства спектров ведущих родов по коэффициенту Спирмена во всех случаях показало наибольшее сходство для пар Афины - Херсонес, Афины - Керчь, и наименьшее - для пары Керчь - Петербург. В то же время обнаружено, что основной вклад в различие видовых списков исследуемых микобиот вносят рода с малым показателем встречаемости.

Таблица 1.

Список родов микромицетов, изолированных с поверхности мрамора _из разных регионов ___

Класс Род (разные виды обозначены буквами) Афины Керчь Херсонес Петербург

Zygo- Мисог(а,б) б б а б

raycetes Rhizopus (а) - - а а

Hypho- AcrtmoBiella (а) - - - а

mycetes Acrodyctis (а,б) - - а,б -

Altcmaria (а,б,в,г,д) а-д а-в, д а,в а

Alyadium (а) - - - а

Aspergillus (а,б,в,г) в а," а,б г

Aureobasidium (а) а - а а

Botiytis (аДв) б,в б б

Chloridiiim (а) - а - -

Ciliciopodium (а) а - - а б,в

CUdosporium (а,6,в,г,д) ад а,в,г а,в-д

Coniosporimn (а) • а а -

Curvulaiia(a) - - а -

Drechslera (а, б) а а,б - -

Epicoccum (а) - - а а

Eiophiala (а,б) а а а,б -

Fusarium (а,б,в,г) а-г - а-г б,г

Gilmaniella (а) а - - -

Gliomastix (а,б) - а,б - -

Hormiscium (а) - - а -

Поппопета (а) а - а -

Humicola (а) - - а -

Memnoniella (а) • а - -

Monodiclys (а,б,в) а-в в а,в а

Paecilomyces (а,б) - - а,б -

Penicillium (аДв,г,д,е,ж) в б а-ж б

Pestalotia - - а -

Phaeococcomyces (а.6) а а а,б а

Phacosclera (а) а - а *

Phaeotbeca (а) - - а -

Phialophora (а) - - а -

Pithomyces (а) а а - -

Pseudoboöytis (а) - а - -

Rhinocladiella (а) - а - -

Rhinodadium (а) а - - -

Sarcinomyccj (а) а - а -

Sclcrococcum (а) - - - а

Scopulariopsis (а,в) - а,б - -

Scytalidium (а,б) - ■ а,б -

Stachybonys (а,б) а - - а,б

Staphylotrichum (а) а ■ •

Stemphylium (а,б,в,г) б г - .а^

Taenioltll» (а) - ■ а а

Tetiacoccosporium (а) а - ■ -

Torula (а,6) а,б а,б а,б б

Trichocladium (а) а - •

Trichodenna (а,б) а б а а,б

Trimmatostroma (а,б) а а б,в

Ulocladium (3,6,в) б а-в

Virgaria (а) ■ а '

Coelo- Aposphaeria (а) - - ■ а

mycetes Camaiospoiium (а) - - а -

Phoma (аДв) б - а-в б

Phyllosticta (а) - - - а

Суммарное число родов: 55; число видов: 99 41 35 58 29

Для выявления ядра микобиоты мрамора вначале были отобраны рода с высокой встречаемостью, общих для всех, или, по крайней мере, 3-х микобиог. В эту группу вошли: Acrodictys, Allemaria, Aspergillus, Aureobasidium, Botrytis, Cladosporium, Exophiala, Fusarium, Hormonema, Monodictys, Pénicillium, Phaeococcomyces, Phaeosclera, Sarcinomyces, Taeniolella, Torula, Trimmalostroma, Ulocladium. Эта группа, по нашему мнению, распадается па факультативных и постоянных обитателей мрамора. К числу первых можно отнести быстрорастущие виды Ahemaria, Aspergillus, Botrytis, Cladosporium, Fusarium, Pénicillium, Ulocladium, для развития которых необходимо наличие влаги. Выявление постоянных обитателей мрамора (т.е. растущих, размножающихся и формирующих колонии в поверхностном слое камня) проводилось путем точенной изоляции грибных микроколоний. Это позволило скорректировать полученные статистическим методом данные и получить список видов - истинных обитателей минерального субстрата. Они обладают высокой встречаемостью, склонны к формированию микроколоний, способны существовать в условиях избыточной инсоляции и отсутствия влаги, образуя специфические защитные и приспособительные структуры. Среди них виды родов Aureobasidium, Cladosporium, Exophiala, Hormonema, Monodictys, Phaeococcomyces, Phaeosclera, Sarcinomyces, Taeniolella, Torula, Trimmalostroma. Именно эта группа родов может быть признана ядром микобиоты, типичной для каменистого кальций-содержащего субстрата.

ГЛАВА IV. МОРФОЛОГИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ ИЗУЧАЕМЫХ ГРИБОВ.

При детальном морфологическом исследовании литобионтных грибов в условиях культуры и на природном субстрате нами был отмечен ряд общих морфологических структур, присущих различным видам. Среди них хламидоспоры (отдельно лежащие, ингеркалярные, терминальные),, спиральные загибы мицелия, мицелиальные тяжи, утолщенный псевдомицелий, слизистые обвертки, сарциноподобные и склероциапьные образования, анастомозы и др. Помимо адаптивной роли их формирование, возможно, частично компенсирует недостаточность или отсутствие развитых конидиальных спороношений, а также отсутствие половых стадий в жизненном цикле этих грибов. В работе приводятся микрофотографии и рисунки всех перечисленных структур с указанием штаммов, у которых они отмечены, а также подробное описание их строения и функций.

Постановке основных экспериментов предшествовал теоретический анализ возможных морфогенегических воздействий на грибы со стороны субстрата обитания. Была составлена схема, показывающая возможную связь важнейших клеточных "мишеней" и основных факторов, потенциально способных вызывать характерные морфологические изменения (рис. 1). Эта схема послужила отправной точкой для экспериментального поиска факторов, влияющих на морфологию грибов.

Изучение морфологической пластичности лшобионтных грибов в условиях эксперимента проводилось на примере одного из типичных представителей ядра микобиоты мрамора - Phaeococcomyces exophialae. С целью экспериментального

получения морфологических изменений у этого гриба (шт. СЬ 49) применяли ряд веществ, известных своей морфогенетической активностью и соответствующих разработанной схеме (рис. 1).

Рис. 1. Влияние различных факторов среды обитания литобионтных микромицетов на внутриклеточные механизмы, являющиеся ключевыми в процессах морфогенеза у грибов.

Было установлено, что добавление в среду солен тяжелых и переходных металлов-примесей мрамора (Си, Fe, Zu, Mn, Mg), а также сАМР стимулирует образование дрожжевых клеток; добавление олеиновой кислоты и сублетальных (от 100 мг/л до 500 мг/л в зависимости от степени токсичности) концентраций ионов тяжелых металлов приводит к массовому образованию хламидоспор и к лизису оставшейся части клеток. Обедненные среды, изопропиловый спирт (1 % v/v), дрожжевой экстракт (1 %), плотность инокулюма около 102-103 клеток/мл приводят к формированию мицелия и псевдомицелия.

Таким образом обнаружено, что основными структурами, образуемыми Р. exophialae, являются мицелий, дрожжеподобные клетки, псевдомицелий, хламидоспоры и микроколонии. По результатам экспериментов составлена схема взаимопереходов различных форм штамма Ch 49 (рис. 2). В работе представлены полные характеристики всех форм, ниже они даны в сокращенном виде.

1. Мицелий истинный, слабо ветвящийся, хотя род Phaeococcomyces de Hoog описан как способный лишь к формированию простейшего псевдомицелия. Данная стадия нестабильна и возникает как реакция на ряд изменений среды, в частности, при ее обеднении по минерально-органическому составу.

2. Лсевдомицелий легко возникает в ответ на самые различные воздействия. Может появляться спонтанно. Являет собой, по-видимому, экологически выгодное неустойчивое

равновесие между мицелиальной и дрожжевой формами. Отмечена способность к ветвлению; часто дает боковое почкование.

3. Дрожжевая фаза наиболее стабильна. Почкование мульткполярное, иногда множественное. Дрожжевые клетки склонны к образованию хламидоспор.

4. Хламндоспоры возникают при старении культуры или наступлении неблагоприятных условий. Преимущественно образуются из дрожжевых клеток, реже на псевдомицелии. Предположительно, клетки подобного типа участвуют в формировании микроколоний.

5. Микроколонии являются многоклеточным образованием, однако мы включаем его в число форм развития штамма СЬ 49. Представляют собой кластеры, состоящие из толстостенных округлых клеток, часто способных к почкованию (дрожжеподобных); либо составлены плотно уложенными гифами, клетки которых обладают толстыми и сильно пигментированными стенками. Образуются в естественных условиях.

Рис. 2. Схема, отражающая возможные для Р. ехорЫа!ае (СЬ 49) типы морфологии (морфологический потенциал) и их взаимопереходы.

На основании анализа полученных данных нами введено понятие адаптивного морфологического потенциала - совокупности форм, к образованию которых.способен конкретный вид. Схема взаимопереходов различных форм штамма СЬ 49 (рис. 2) представляет собой пример реализации такого потенциала. Возможные превращения форм показаны стрелками. Переход от одной формы к другой - сложный процесс, зависящий от многих составляющих внешней среды и происходящий при изменении окружающих условий. При этом возможны различные взаимопереходы форм - как обратимые, так и нет. Смена форм роста в данном случае не является прохождением жизненного цикла. Вероятно, каждая из форм наиболее приспособлена к определенному интервалу изменений

микроколонии

условий экотопа (сезонных и пр.), а в целом такое явление можно рассматривать, как особый механизм адаптации, обеспечивающий выживание вида в меняющейся среде.

До настоящего времени в определителях вид Phaeococcomyces exophialae описан как не способный к мицелиалыюму росту. Но, учитывая полученные нами экспериментальные данные по индукции мицелиальной формы у 7 штаммов этого вида, предлагается ввести следующее дополнение в характеристику вида: отдельные штаммы вида способны к формированию простейшего, иногда ветвящегося псевдомицелия, а также истинного неветвящегося или слабо ветвящегося мицелия.

Для количественной оценки морфологических параметров P. exophialae и выявления его возможной вариабельности нами было проведено морфометричёское сравнение 9 штаммов гриба, выделенных с Херсонесского мрамора. При их культивировании в различных условиях было обнаружено, что у штаммов Ch 3 и Ch 24 отсутствует способность к мицелиальному росту. Остальные штаммы обладали всеми исследуемыми формами роста (мицелий, псевдомицелий, дрожжевые клетки,

Устранил, существующие разночтения в разграничении мицелиальной и псевдомицелиальной форм роста мы попытались с использованием

количественного критерия

морфологического индекса (MI) (Merson-Davies, Odds, 1989). Приведенная авторами формула была переработана с учетом наших задач и получила следующий вид: MI = 1 + 5 lg [1 + la/d2], где 1 - длина клетки, s - диаметр в септе, d -срединный диаметр.

Схематическое изображение принципов измерения показателей Ц s, d представлено на рис. 3. Значения всех параметров для клеток псевдомицелия, мицелия, дрожжей и хламидоспор (на примере 4-х штаммов) представлены в таблицах 2,3,4, 5.

Таблица 2.

Параметры псевдомнцелня исследуемых штаммов P. exophialae.

ШТАММ Средний d, micm Септальный диаметр s, мкм Длнпа I, мкм Морфологический индекс, Ml Дисперсия Ml, мкм Медиана МТ, мкм

Ch 12 3.35 2.01 5.01 2.34 0.41 2.28

Ch 21 3.97 2.35 6.15 2.43 0.35 2.18

Ch 24 4.26 2.43 5.78 2.31 0.32 2.20

Ch 49 3.87 1.83 5.77 2.21 0.48 2.10

хламид оспоры).

Рис. 3. Принцип измерения показателей I, s, d для расчета ML

Таблица 3.

Параметры мицелии исследуемых штаммов Р. асоркШаг.

ШТАММ Длина Средний Септальвыи Морфоло- Дисперсия Медиана

клетки 1, (1, мкм диаметр », гический М1, мкм .VII, мкм

мкм мкм индекс, Ш

СЬ 12 5.13 2.30 2.10 3.40 0.13 3.42

СЬ 21 7.93 2.52 2.38 3.87 0.43 3.82

СЬ 24 - - - - - -

СЬ 49 8.11 2.25 2.01 4.31 0.55 3.65

Таблица 4.

Параметры дрожжевых клеток исследуемых штаммов Р. ехорЫа1ае.

ШТАММ Средний (1, мкм Мода М1, мкм Мода М2, мкм Медиана мкм Дисперсия мкм

СЬ 12 4.33 5.2 4.2 4.1 0.72

СЬ 21 4.81 5.1 4.2 4.9 0.77

СЬ 24 4.25 5.0 4.2 4.1 0.56

СЬ 49 4.55 5.1 3.9 4.9 0.88

Таблица 5.

Параметры хламидоспор исследуемых штаммов Р. ехорЬШае.

ШТАММ Средний (I, мкм Мода М1, мкм Медиана, мкм Дисперсия мкм

СЬ 12 6.00 5.8 6.0 0.44

СЬ 21 6.83 - 6.2 1.00

СЬ 24 5.73 - 5.7 0.46

СЬ 49 6.83 7.0 6.8 0.79

Применение М позволило разделять мицелий и псевдомицелий на численной основе -к мицелию относятся цепочки клбток с М1> 3.3.

При проведении измерений диаметров дрожжевых клеток и хламидоспор каждого штамма нами была выявлена полимодальность распределения их размеров, выражающаяся в наличии нескольких пиков наиболее часто встречающихся значений. Огибающая кривая выявляет три пика, соответствующие: (0 молодым клеткам, не достигшим среднего размера; (и) зрелым клеткам; (ш) формирующимся и зрелым хламидоспорам. По величине этих пиков и их количеству можно судить о состоянии популяции в целом.

Выявление морфологической корреляционной структуры изучаемой группы штаммов. Сравнение 9 штаммов Р. ехорЫЫае по нескольким морфологическим параметрам было проведено с использованием метода корреляционных плеяд (Шмидт, 1984). Пользуясь полученными морфометрическими данными, мы рассчитывали расстояния между всеми совокупностями свойств сравниваемых штаммов (то есть между формами роста) (Славин, 1989):

с1 {Е [(Хда - Хт)/а,]2 а2)}1/2 Здесь с! - расстояние между совокупностями свойств сравниваемых штаммов; п - число свойств, х; - обозначение 1-го свойства, а; - коэффициент весомости ¿-го свойства,

устанавливаемый экспертным методом; а-, - среднеквадратическое отклонение 1 -го свойства по всей выборке объектов, в которую входят оба сравниваемых штамма.. Рассчитанные значения с1 составили матрицу сходства, на основе которой по принципу выбора наименьших расстояний была построена система корреляционных плеяд (рис. 4).

Рис. 4. Корреляционная система, построенная для 9 штаммов Р. ехорЫа1ае по морфологическим признакам. Расстояния менее 0.63 выделены жирными линиями.

Таким образом было проведено группирование штаммов, близких по морфологии. Обнаружено, что в целом большая часть штаммов незначительно отстоит друг от друга. Выявлено ядро группы и штаммы, отстоящие от него по причине отсутствия мицелиальной стадии (СЬ 3 и СЬ 24). Полученные данные свидетельствуют об определенной гетерогенности популяции Р. ехорЫЫае на Херсонесском мраморе.

ГЛАВА V. ИЗУЧЕНИЕ МЕХАНИЗМОВ МОРФОЛОГИЧЕСКИХ ПРЕОБРАЗОВАНИЙ. МИЦЕЛИАЛЬНО-ДРОЖЖЕБОЙ ДИМОРФИЗМ.

Данная часть работы посвящена исследованию механизмов взаимопереходов мицелиальной и дрожжевой форм роста у литобионтных грибов и поиску возможностей экспериментального получения таких переходов.

Экспериментальная индукция мипелиальна-дрожжевого перехода у Р. ехорЬШае. Одной из важных задач исследования была проверка предположения о том, что компоненты мрамора оказывают морфогенетическое влияние на грибы. Анализ химического состава мраморов из различных месторождений (Иооз й а1., 1988) показал, что все они содержат определенное количество ионов металлов, которые могут легко вымываться под действием как атмосферных явлений, так и за счет продуктов метаболизма самих микроорганизов (КгитЬет, 1епз, 1981; (ЗогЪизЫпа Й а!., 1993). Задача заключалась в подтверждении активной роли ионов металлов-компонентов мрамора в инициации и стабилизации дрожжевой формы роста, являющейся основой для формирования микроколоний.

Для тестирования были выбраны следующие ионы: Мп2*, Ре3*, Zn2+, Си2* , в

виде соответствующих сульфатов; кроме того, оценивалось влияние Са2* (в виде СаСЬ). Опьггы проводились на культуре, содержащей как мицелий, так и дрожжевые клетки. В результате проведенных экспериментов установлено, что все использованные ионы

металлов индуцировали переход большей части клеток мицелия к росту в дрожжевой форме уже при концентрациях 50 мг/л (рис. 5):

концентрация ионов, кг/л

Рис. 5. Мицелиально-дрожжевые переходы/1. ехорЫЫае (СЬ49), индуцированные добавлением в среду культивирования ионов металлов. Стрелками обозначены: А -область перехода мицелий-дрожжи, В - область сублетальных (М& Бе, Мп) и летальных (Си, ¿п) концентраций ионов, С - область лизиса основной части клетов и формирования

хламид оспор.

На графике отражено состояние культуры после 28 суток роста. Содержание ионов свыше 100-250 мг/л приводила к практически полному переходу клеток в дрожжевую форму. Наиболее эффективными с этой точки зрения оказались ионы 2а, Си, и Мп. Переход под их влиянием происходит более резко и при меньших концентрациях, чем для Бе и М& где эффект оказался менее четким. Кальций не вызывал подобного перехода, и рост культуры в его присутствии носил смешанный характер. Дальнейшие эксперименты и наблюдения за культурами микроколониальных грибов свидетельствовали о том, что эффект от воздействия ионов металлов (в данном случае - возможного морфогенетического сигнала) может иметь пролонгированное действие, то есть дрожжевая форма роста стабилизируется и сохраняется при нескольких последующих пассажах через питательную среду с малым содержанием катионов, прежде чем снова появится мицелий.

Интересно отмстить, что сублетальные концентрации таких металлов, как медь, железо и цинк, вызывали не только дрожжеподобмый рост, но и образование клеток, подобных хламидоспорам, на фоне частичного лизиса остальных клеток. По своему строению эти покоящиеся структуры чрезвычайно близки к тем, что встречаются на мраморе в естественных условиях.

В работе приводится разработанная автором схема предполагаемого действия ионов металлов на морфогенез грибоной клетки, где, в частности, отражено возможное вовлечение в этот процесс систем основных вторичных мессенджеров - кальция и сАМР.

Индукция обратного перехода: дрожжи —> мицелий. В экспериментах, проведенных на трех штаммах Р. ехорЫаЬзе, мицелиальная форма была получена под воздействием изопропилового спирта. Результаты опытов оценивались качественно, после 21 дня культивирования (табл. б):

Таблица 6.

Индукция перехода дрояски->мицелий у трех штаммов Р. ехорИШае под действием изопропилового спирта.

Штамм Концентрация спирта, % (v/v) Контроль

10 5 1 0,5 0,1

Ch 12 у, pm* V ш, pm pm,y y, pm y.pm У

Ch 21 - - ~ m, pm pra,y y,pm У

Ch 56 - - m, pm . pm,y y.pm У

* у - дрожжевая форма роста, т - мицелий, рга - псевдомицелий, у, рт; т, рт - смешанный рост,"-" - отсутствие роста.

Последовательность этапов формирования мицелия (там, где он появлялся) была достаточно специфической (рис. б). Вначале отмечалось образование аномально увеличенных в размерах клеток (в 1,5 - 4 раза). Затем такие клетки начинали формировать слабо ветвящийся псевдомицелий, состоящий из округлых клеток, приближающихся к среднему размеру. Псевдомицелий постепенно переходил в истинный мицелий.

' Рис.6. Морфологические

" * изменения, вызванные у Р.

Vj Л1 < * V * V ¿5,

' % ШОГТРОГО1ЛОБОГО спирта-^ЩЙЗД1V< #ч -Стрелки с ш,фрами обозначагот

^IrV'l^ ^ 7 х . дрожжевые клетки, 2

/ « %J х

последовательные этапы изменения морфологии. I - исходные

Ч аномально увеличенные клетки,

** 3 - формирование псевдомице-

s лия, переходящего в мицелий.

Из литературы (Suzuki et al., 1998) известно, что полностью аналогичная последовательность морфологических изменений происходит у гриба Candida albicans при воздействии на него этанолом. Предполагается, что в данном случае в процесс морфологических изменений вовлечена инозитол-фосфолипидная система проведения сигнала, в которой важную роль в качестве вторичного посредника играет кальций.

Кроме того, вами была отмечена способность ряда штаммов Р. ехорЫа1ае к росту в виде мицелия или псевдомицелня на средах, бедных по содержанию органических и минеральных элементов. В результате опытов по культивированию этого гриба на средах, содержащих ионы марганца и И-глюкозу в различных концентрациях, построена фазовая диаграмма (рис. 7).

Р - глюкоза, г/л

25

Показано, что существуют области концентраций, где: А- исследуемый штамм разви-виваегтся преимущественно в виде мицелия; Б - рост-слабый, встречаются только сарциноподобные кластеры клеток и утолщенный псевдомицелий; В - область обильного развития севдо-мицелия и дрожжей; Г -перекрывается с ней, добавляют-

Рис. 7. Зависимость формы роста Р. ехорЫЫае (СЬ 49) от минерально-органического состава среды.

¡00 1001 Мп , мг/л

ся крупные многочисленные "сарцины" и утолщенный псевдомицелий; Д - рост очень слаб, практически отсутствует.

Отмечено хорошее соответствие некоторых экспериментально полученных форм роста грибов тем структурам, которые образуются на камне в природе. Это микроколонии или плотные кластеры клеток ("сарцины"), иногда дополненные утолщенными темно-коричневыми гифами, часто состоящими из клеток неправильной формы. Следует отметить, что такая форма и окраска грибных структур, полностью идентичная природной, была нами получена только в упомянутых экспериментальных условиях.

Диморфизм и его возможные механизмы. Проверка потенциальной возможности участия основных вторичных мессенджеров - кальция и сАМР в проведении морфогенетических сигналов из внешней среды проводилась при помощи ряда фармакологических агентов, изменяющих уровни этих веществ в цитозоле, а также путем добавления самих веществ. Были использованы: атропин, хинин, имидазол, гистамин, гепарин, ЭГТА, ЭДТА, кальций, <1ЬсАМР, тапсигаргин, дрожжевой экстракт (как содержащий большое количество адениновых нуклеотидов). Принципы действия этих веществ показаны на схеме, представленной в диссертации.

В экспериментах были использованы следующие микромицеты, изолированные с поверхности мрамора (Херсонес, Афины): РИаеососсотусез зр., Р. ехорНЫае (СЬ 49), ЕхорЫа1а }еате1тг\, Сопюяропит яр., Тпттсаошота аЫеШ. Все грибы, кроме Р.

exophialae (Ch 49), были предоставлены для опытов АА. Горбушиной. Опыты проводились на базе Ольденбургското Университета (Германия). Следует отметить, что мицелиально-дрожжевым диморфизмом помимо Р. exophialae (Ch 49) обладает Е. jeanselmei; Phaeococcomyces sp. растет в форме дрожжевых почкующихся клеток; Coniosporium sp., и Т. abietis формируют типичный мицелий.

Оценка влияния примененных фармакологических агентов проводилась по происходящим морфологическим изменениям. Наряду с формированием мицелия и псевдомицелия из дрожжевых клеток под действием кальций- и (П)-катион-хелатирующих агентов (у двух штаммов Phaeococcomyces; Exophiala jeanselmei), в ряде опытов были получены аномально увеличенные клетки и почкование спор (Т. abietis), отмочено изменение степени ветвления мицелия у Т. abietis и Coniosporium sp. Полученные результаты подтверждают возможность передачи сигнала из окружающей среды через аденилатциклазную систему (cAMP¡) и фосфоинозитидный путь (с участием Caí). Тем не менее сигнальная роль кальция, как вторичного мессенджера, представляется более значимой.

Поскольку уровень сАМР в цитозоле может зависеть и от освещенности (Gradisnik-Grapulin, Legjsa, 1998), нами исследовано действие света на морфогенетические процессы у литобионтных грибов. На свету и в присутствии кальция у ряда штаммов наблюдалось почкование спор, формирование хламидоспор, образование компактных гиф в общей слизистой обвертке. В темноте у некоторых штаммов увеличивалась степень ветвления и практически отсутствовали споры, наблюдалось обильное выделение пигмента в среду. Таким образом, в большинстве случаев переизбыток освещения, который может иметь место в естественных условиях обитания литобионтных грибов, вызывает у них образование адаптивных или. переживающих структур. Полученные результаты подтверждают существование взаимосвязи между конкретным фактором внешней среды (избыточным светом) и морфологическими особенностями литобионтных грибов. ГЛАВА VI. ПРОЦЕССЫ ФОРМИРОВАНИЯ КОЛОНИЙ ЛИТОБИОНТНЫХ МИКРОМИЦЕТОВ. Форма колонии, очевидно, находится в прямой зависимости от формы и направления деления слагающих ее клеток. Дрожжевые клетки формируют округлые, гомогенные колонии, в то время как мицелиальный тип строения вегетативного тела соответствует радиальным, часто распростертым колониям. В наших экспериментах были получены колонии Р. exophialae (Ch 49) как первого, так и второго типов.

Микроколонии, составленные исключительно дрожжевыми клетками, образовывались в следующих случаях:

- богатая по источникам углерода среда - картофельно-глюкозная среда; овсяный агар; среда Чапека-Докса; агар с содержанием глюкозы 2.5 - 3 %;

- присутствие ионов тяжелых металлов (Cu, Mg, Mn, Fe, Zn) в концентрациях от 50 мг/л и выше.

По мере роста таких колоний в них наблюдалась тепденция к накоплению покоящихся толстостенных клеток.

Микроколонии, изначально развивающиеся только из дрожжевых клеток, но формирующие мицелиальные (псевдомицелиальные) отростки при достижении размеров 25-100 клеток, образовывались в следующих условиях:

- бедная по источникам углерода среда (агар на дистиллированной воде); агар на основе разбавленного более чем вдвое картофельного отвара;

- агаризованная среда с добавлением 1%-го дрожжевого экстракта; кукурузный агар;

- в краевых областях агаровой капли, а также в случае особо тонкого слоя среды;

- при низкой плотности инокулюма ( около 100 - 200 кл/мл).

Полученные данные свидетельствуют о том, что выбор альтернативы развития микроколонии тесно связан с присутствием в среде веществ, способных индуцировать у изучаемых грибов мицелиально-дрожжевые переходы. Вторым фактором, вносящим существенный вклад в морфогенез микроколонии, является общее состояние окружающих гриб условий. Образование мицелиальных отростков в ответ на обеднение субстрата может рассматриваться как реализация стратегии выживания. В ряде случаев их появление можно трастовать с точки зрения общей жизненной стратегии захвата и освоеши свободного пространства.

Результаты проведенной работы говорят в пользу того, что субстрат обладает ярко выраженным

морфогенетическим действием на литобионтные грибы, и является первопричиной сходства формируемых ими структур. Вероятно, именно этим можно объяснить практически полную идентичность природных микроколоний большинства видов литобимггных

Рис. 8. Типичная природная микроколония микромицетов (рис. 8). литобионтного гриба на мраморе.

ВЫВОДЫ

1. На основании статистического анализа видовых списков грибов, встречающихся на поверхности мрамора в различных географических условиях, выявлено ядро эпилитной микобиоты. Из 99 отмеченных нами видов микромицетов в его состав входят около 10 видов, формирующих микроколонии на камне.

2. Изучены морфологические особенности микроколониальных литобионтных грибов в условиях культуры и на природном субстрате. У одного из представителей данной группы - Р. ехорЫакге выявлено пять типов морфологических структур и прослежены

их взаимопереходы. На основании полученных данных введено понятие адаптивного морфологического потенциала вида-

3. Проведен сравнительный морфометрический анализ серии штаммов Р. ехорЫакге, позволивший выявить морфологическую гетерогенность херсонесской популяции данного вида. Разработаны новые методические приемы изучения морфологии грибов, предложен численный критерий для разграничения различных форм роста (морфологический индекс).

4. В ходе экспериментов установлен не отмечавшийся ранее у Р. ехорЫЫае мицелиально-дрожжевой диморфизм. На основании полученных данных предложено дополнение к диагнозу вида. Показана возможность экспериментального получения мицелиально-дрожжевых переходов у ряда штаммов Р. ехорЫакге.

5. Установлено стимулирующее влияние ионов тяжелых металлов в концентрациях свыше 50 мг/л на переход Р. ехорЫа1ае к дрожжевой фазе роста. Наиболее сильным влиянием обладают ионы 2п, Си, Мп. Концентрации свыше 100 мг/л вызывают массовое образование хламидоспор, усиление меланиногенеза и лизис части вегетативных клеток.

6. Впервые для индукции мицелиального роста Р. ехорЫаЬе успешно использован изопропиловый спирт (от 1 % до 5 % \Ы). В начальной стадии процесса обнаружено формирование аномально увеличенных (в 3-4 раза) сферических клеток, дающих затем псевдомицелий и мицелий нормальных размеров.

7. Изучено влияние содержания в среде глюкозы (от 0 до 25 г/л) и ионов Мп (от 0 до 1000 мг/л) на форму роста Р. гхорЫа1ае. Установлены области концентраций этих элементов, определяющие доминирование в культуре сарциноподобных микроколоний, мицелия, дрожжевых клеток, псевдомицелия. Подобраны условия экспериментального получения морфологических структур, хорошо соответствующих таковым на природном субстрате в естественных условиях.

8. В серии экспериментов с использованием 11 фармакологических агентов проверена роль вторичных мессенджеров - кальция и сАМР в прохождении морфогенетического сигнала в грибную клетку и его реализации в виде генерации формы. Показано, что основную роль в данном случае играет кальций.

9. Изучено влияние освещенности и содержания кальция в среде на морфологию видов РИаеососсотусе.% ЕхорЫЫа, ТгттаЮ^ота и Сотохропит. Установлено, что избыточный свет (иногда в сочетании с кальцием) стимулирует почкование, формирование утолщенных сгенок, слизистых обверток и артроспор у некоторых видов.

10. На основании полученных данных предложено целостное описание процессов развития микроколониальных литобионтных грибов в естественных условиях. Высказано предположение об эволюционной древности этой группы организмов, прекрасно адаптированных к условиям своего существования.

СЛИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи:

1. Богомолова Е.В., Власов ДЮ., Зеленская М.С., Панина Л.К., Сагуленко Е.С. Видовой состав микромицетов, обитающих на поверхности древнего мрамора в Херсонесе// Вестник СПбГУ. 1996. Сер. 3, Биология, вып. 4. С. 49-54.

2. Богомолова Е.В., Власов Д.Ю., Сагуленко Е.С. Сравнительный анализ специфичных для мрамора мижобиот// Микология и фи^патология. 1997. Т. 31, вып. 5. С. 9-15.

3. Панина Л.К., Бадалян А.Г., Богомолов Е.В., Волленцнсн У., Горбушина А., Крумбайн В., Сухаржевский С.М. Спектры ЭПР темноок^ашенных микромицетов, изолированных с мрамора// Микология и фитопатология. 1997. Т. 31, вып. J. С. 46-51.

4. Богомолова ЕЛ., Власов Д.Ю., Панина Л.К. О природе михроколониалыгай морфологии эпшштных черных дрожжей рода Phaeococcomyces ¿е Hoog // Докл. РАН. 1998. Т. 363(5). С. 707-709.

5. Богомолова Е.В. Морфологический потенциал Phaeococcomyces sp. (штамм Ch 49) - типичного представителя литобионгных микромицетов// Микология к фитопатология. 1999. Т. 33(2). С. 95100.

6. W.E. Krumbem, Е. Bogomolova, A. Gorbushina, L. Panina, О. Pybalcheoko, S. Ryshov, E. Sagulenko, D. Vlasov. Biodeterioration and conservation status of maitie monuments on Crimea// In: Architechtural Studies, Materials and Analysis. (Eds. CA. Brebbia, B. Leflheris). IV Int. Conf. on structural studies of historical buildings STREMA'95. Southampton & Boston, 1995. P. 195-204.

7. Богомолова E.B., Власов ДЮ., Павленко В.К., Панина Л.К. Диморфные переходы у микроколониальных грибов: индуцирующие факторы, возможные мехавдзмы и адаптивная роль// В сб.: "Актуальные проблемы современной микологии", СПб, 1999 (в печати).

8. Власов Д.Ю , Богомолова Е.В., Зеленская М.С., Горбушина АА. Обзор методов изоляции микромицетов, повреждающих мраморные памятники архитектуры // В сб.: "Актуальные проблемы современной микологии", СПб, 1999 (в печати).

Тезисы докладов:

9. Bogomolova Е., Gorbushina A., Krumbein W., Panina L., Sagulenko E., Vlasov D., Zelenskaya M. Investigations of fungal growth on and attack of the marbles of the archaeological site of Chersoncssus, Crimea// Abstr. of IUMC Congresses'96, 8th Int. Congress of Mycology Division, Jerusalem, Israel, August 18-23, 1996. P.104.

Ю.Власов ДЮ., Панина Л.К., Сагуленко Е.С., Зеленская М.С., Богомолова Е.В. Пути адаптации меланиисодержащих грибов к труднодоступным субстратам// Тез. 2-ой Междунар. Конфер. "Экология и охрана окружающей среды", Пермь, 1995, ч. 3. С. 9-10.

Н.Панина Л.К., ПогребниковаИ.Л., Богомолова Е.В., Сагуленко Е.С. Роль меланина в адаптации грибов к изменяющейся среде// Тезисы докл. 1(Х1) Международного Совещания и Школы по Эволюционной физиологии памяти ак. ДА. Орбели, Санкт-Петербург, 1996. С. 175-176.

12. Панина Л.К., Богомолова Е.В., Павленко В.К. Пространственная организация колоний диморфных микромицетов// Тезисы докл. Межд. школы "Проблемы теоретической биофизики", М„ МГУ, 1998. С. 157.

13. Panina L.K., Bogomolova E.V. The description of fungal dimorphous transition in terms of the critical phenomena theory// Abstr. Intern. Conference "Nonlinear Phenomena in Biology", Puschino-na-Oke, 1998.

14. Богомолова Е В., Борисова Ю.А., Власов Д.Ю., Панина ЛК. Экология грибов, заселяющих мраморные памятники архитектуры. Тез. конф."Университеты в канун третьего тысячелетия", С-Пстербург, янв. 1998. С.

15. Bogomolova Е., Gorbushina АА. The growth and morphology of rock inhabiting microcolonial fungi: changes caused by morphogenetic agents// Abstr. of 6th Int. Mycological Congress (IMC 6), Jerusalem, Israel, August 23-28, 1998. P. 113.

16. Bogomolova E., Parana L., Vlasov D. Microcolonial morphology of rock-inhabiting fungi: the cooperative cell response on the environment// Abstr. of 6th Int Mycological Congress (MC 6), Jerusalem, Israel, August 23-28, 1998. P. 150.

17. Богомолова E.B. Морфологический потенциал гробов-обитателей камня// Тез. междунар. конф. "Современные проблемы микологии, альгологии и фитопатологии", Москва, апрель 1998. С.

18.Борисова Ю.А., Богомолова Е.В., Панина Л.К. Меланиногенез и поверхностные свойства клеток микромицетов// Тез. конф. "Современные проблемы микологии, альгологии и фитопатологии", Москва, апрель 1998 . С. 166.

19. Богомолова Е.В., Горбушина А.А. Рост и развитие грибов, изолированных с камня, в присутствии различных морфогенов//Тез. междунар. конф. "Современные проблемы микологии, альгологии и фитопатологии", Москва, апрель 1998. С. 156-157.

20.Борисова Ю.А., Богомолова Е.В., Панина Л.К. Роль поверхностных свойств клеток микромицетов в освоении субстрата // Микол. и фитопатология. 1999. Т. 33(2). С. 134.

21.Bogomolova Е., Panina L, Vlasov D. The induction of dimorphic transitions in three strains of Phaeococcomyces exophialaeH Abstr. of Intern. Conf. "Human fungal pathogens: fungal dimorphism and disease", Granada, Spain, 4-8 Sept., 1999. P. 30.

22.Bogomolova E., Panina L., Vlasov D. The investigation of the dimorphic black yeasts local population heterogeneity by morphometric analysis// Abstr. of XIII Congress of European Mycologists, Madrid, Spain, 21-28 Sept, 1999. P. 15.

23.Богомолова E.B., Панина Л.К. Процессы самоорганизации у диморфных грибов// Тез. докл. П Съезда биофизиков России, Москва, МГУ, 23-27 августа 1999. Т. 2. С. 392-393.

24. Ivanov-Omskii V.I., Panina L К., Yastrebov S.G., Zvonareva Т.К., Bogomolova E.V. Carbon clusters based protective coatings for the cultural valuables // Abstr. of 4nd Int. Workshop IWFAC'99 "Fullerenes and atomic clusters". St.Petersburg, Russia, 1999. P. 308.

155.