Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Стрессовые белки ксилотрофных базидиомицетов при гипотермии

ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Яковлев, Андрей Юрьевич, Иркутск

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК

СИБИРСКОЕ ОТДЕЛЕНИЕ СИБИРСКИЙ ИНСТИТУТ ФИЗИОЛОГИИ И БИОХИМИИ

РАСТЕНИЙ

На правах рукописи УДК 581.12:577.3

Яковлев Андрей Юрьевич

СТРЕССОВЫЕ БЕЛКИ КСИЛОТРОФНЫХ БАЗИДИОМИЦЕТОВ

ПРИ ГИПОТЕРМИИ

03.00.12 - физиология и биохимия растений диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научные руководители:

доктор биологических наук,

профессор Войников Виктор Кириллович

кандидат биологических наук, Боровский Геннадий Борисович

Иркутск, 2001

4.1. МОРФОЛОГИЯ И ВЫЖИВАЕМОСТЬ МИЦЕЛИЯ И ПЛОДОВЫХ ТЕЛ В УСЛОВИЯХ ДЕЙСТВИЯ НИЗКИХ ТЕМПЕРАТУР 68

4.1.1. Полевые наблюдения за морфологией и жизнеспособностью плодовых тел 68

4.1.2. Ростовые характеристики мицелия и жизнеспособность плодовых тел при действии низких температур в лабораторных условиях 71

4.2. ВЛИЯНИЕ ПОНИЖЕННОЙ ТЕМПЕРАТУРЫ НА СОСТАВ И СИНТЕЗ БЕЖОВ МИЦЕЛИЯ И ПЛОДОВЫХ ТЕЛ БАЗИДИОМИЦЕТОВ 79

4.2.1. Изменения состава полипептидов грибов при охлаждении мицелия и плодовых тел 79

4.2.2. Действие низких температур на синтез белков мицелия и плодовых тел 91

4.3. СТРЕССОВЫЕ БЕЛКИ ГРИБОВ, ИММУНОХИМИЧЕСКИ РОДСТВЕННЫЕ ДЕГИДРИНАМ, РАЗОБЩАЮЩИМ ПОЛИПЕПТИДАМ РАСТЕНИЙ И АНТИФРИЗНЫМ БЕЖАМ РЫБ 95

4.3.1. Особенности накопления дегидриноподобных полипептидов в мицелии и плодовых телах грибов при действии низкой температуры и водного дефицита 95

4.3.2. Антифризная активность грибного белка 105

4.3.3. Разобщающие белки грибов, иммунохимически родственные PUMP и БХШ 310 растений 111

4.4. ВЛИЯНИЕ ОБЩЕГО ВОДОРАСТВОРИМОГО ГРИБНОГО БЕЖА НА ЭНЕРГЕТИЧЕСКУЮ АКТИВНОСТЬ ИЗОЛИРОВАННЫХ РАСТИТЕЛЬНЫХ МИТОХОНДРИЙ 118

5. ЗАКЛЮЧЕНИЕ 128

6. ВЫВОДЫ 139

7. ЛИТЕРАТУРА 141

1. ВВЕДЕНИЕ

Грибы широко распространены в природе и обнаружены в тропиках, средних широтах, во льдах Антарктиды и на крайнем севере (Мюллер, Леффлер, 1995). Способность этих организмов обитать в самых различных климатических зонах на разных субстратах является результатом формирования в процессе эволюции специфических структур, защищающих мицелий от разрушительного действия биотических и абиотических факторов окружающей среды (Белозерская, 2001). Высокие температуры (до 60°С) и сильный холод не исключают присутствия грибов. Температурные пределы жизнедеятельности отдельных видов грибов непостоянны, что является следствием приспособления гриба к условиям обитания (Рипачек, 1967). Пассивно, т.е. без роста, большинство грибов может переносить очень низкие температуры, а многие виды - и относительно высокие, однако чаще всего в виде не вегетативных структур, а покоящихся образований (склероциев, хламидоспор, конидий, других споровых форм). Известно также, что очень многие грибы переносят резкие перепады температуры (эвритермия), хотя развиваются в основном при ее более высоких значениях (термотолерантность). В то время как одни виды грибов нуждаются в тепле (облигатная термофилия), другие - не выдерживают нагревания даже в "физиологической области": Herpotrichia juniperi (возбудитель черной снежной плесени на хвойных в Альпах) и Dothideaceae - примеры чувствительности к теплу в сочетании с низкой оптимальной температурой (психрофилия) (Мюллер, Леффлер, 1995). Подобное широкое распространение грибов и их отношение к температуре должно было наложить отпечаток на адаптационные возможности данных организмов. По всей видимости, организация механизмов защиты от неблагоприятных факторов среды, и в первую очередь от температурных воздействий, должна осуществляться на

нескольких уровнях, включая морфологический, физиологический и биохимический. В зависимости от уровня организации меняется биохимическая стратегия адаптации организмов к стрессовым воздействиям, причем особенно заметно это проявляется при изменениях окружающей температуры (Феофилова и др., 2000а). На то, как динамична бывает способность грибов адаптироваться к различным температурным условиям, может указывать факт, что температурный оптимум и максимум для культур одного и того же вида гриба, взятого из разных местообитаний, не всегда бывает один и тот же. Особенно это заметно на культурах, выделенных из грибов, взятых из местообитаний на разной высоте над уровнем моря или вообще с большой разницей температурных условий (Рипачек, 1967).

Несмотря на большую значимость понимания механизмов адаптации, отводимую в современной физиологии растений и грибов, в литературе достаточно редко встречаются работы посвященные вопросам защиты грибных клеток от неблагоприятных условий существования, и в первую очередь, экстремальных температур. Еще меньшую долю из числа подобного рода работ, составляют исследования в области воздействия на грибы низких положительных и отрицательных температур. В то же время было бы интересно сравнить существующие растительные механизмы адаптации клеток и целого организма с таковыми же у грибов как представителей другого царства живых организмов.

Анализ биохимических критериев, основанных на химическом составе клеток грибов, в сравнении с клетками растений и животных, не позволяет согласиться с гипотезой о примитивности грибной клетки (Феофилова, 2001). Некоторые основные отличия организации и биохимического статуса клеток грибов и растений, как то: исключительная гетеротрофность, отсутствие аппарата Гольджи, апикальный тип роста клеток; наличие в клеточной оболочке хитина, а

также участие в метаболизме гликогена и мочевины, ставит грибы в весьма своеобразную группу организмов (Беккер, 1988). Обладая высокой устойчивостью к стрессовым факторам, они как бы собрали от эу- и прокариот все наиболее надежные механизмы защиты от внешних воздействий. Именно это, видимо, привело к тому, что грибы по своей численности и ареалу обитания занимают сейчас второе место в мире среди других живых организмов (Феофилова, 2001).

Процесс адаптации к холодовому шоку у клеток растений представляет собой сложноорганизованную систему с участием многих компонентов: специфических белков БХШ (белков холодового шока), различного рода криопротекторов, липидов, углеводов и их изменением под действием отрицательных температур. Согласно литературным данным, подобной системой защиты, включающей многие из вышеперечисленных составляющих, должны обладать и грибы (Феофилова, 1994; Феофилова и др., 1994; Феофилова и др., 2000а,б; Феофилова, 2001; Яковлев и др., 1998; Matsumoto, 1994; Matsumoto, 1997; Newsted et al., 1994; Hoshino et al., 1998). Однако до сих пор остается открытым вопрос о работе стрессовых белков и их роли в адаптивных ответах у грибов. Удобными объектами для таких исследований являются ксилотрофные базидиомицеты, и в первую очередь виды порядка Agaricales, поскольку представляют собой достаточно гетерогенную группу по устойчивости к низким температурам, а также позволяют с достаточной легкостью получать в лабораторных условиях, как мицелий, так и плодовые тела.

Учитывая недостаточную изученность механизмов холодовой адаптации грибов, а также участия белков в этих процессах, в данной работе мы сфокусировали внимание на изучении стрессовых полипептидов некоторых видов высших базидиальных дереворазрушающих грибов при действии на них низкотемпературного

стресса, а также сравнении между собой механизмов устойчивости к гипотермии у растений и грибов.

Автор выражает огромную благодарность и признательность своим научным руководителям д.б.н., профессору В.К. Войникову и к.б.н. Г.Б. Боровскому за внимательное отношение к данной работе, также д.б.н. Т.П. Побежимовой, к.б.н. О.И. Грабельных, А.И. Антипиной за помощь в проведении ряда экспериментов, к.б.н. А.Н. Петрову и Т.А. Пензиной за консультации и практическую помощь в вопросах микологии, а кроме того, всему коллективу лаборатории физиологической генетики за помощь и создание творческой атмосферы.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

2.1. ЭКОЛОГО-ФИЗИОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ И ХАРАКТЕРИСТИКА ГРИБОВ, УСТОЙЧИВЫХ К ДЕЙСТВИЮ НИЗКОТЕМПЕРАТУРНОГО СТРЕССА. ТИПЫ СТРАТЕГИИ ХОЛОДОВОЙ АДАПТАЦИИ ГРИБОВ

Температура как важнейший климатический фактор окружающей среды влияет на многие физиологические процессы грибов - рост и жизнеспособность мицелия, формирование базидиокарпов, спороношение, жизнеспособность спор (Мухин, 1993). Мицелий ксилотрофных базидиомицетов способен к росту в широком диапазоне температур от 0 до 46°С, с оптимумом 20-30° (Рипачек, 1967; Трембач, 1974; Любарский, Васильева, 1975; Бойко, 1979; Mizumoto, 1978; Boddy, 1983; Schmidt, Koternik, 1985; Palmer, Payne, 1986). При этом обнаруживаются не только известные видовые отличия, но и внутривидовые вариации (Рипачек, 1967; Бойко, 1979). Мицелий этих организмов сохраняет жизнеспособность в еще более широком диапазоне температур. Во влажной среде дереворазрушающие грибы погибают при температурах свыше 50°С (Адо, 1935, 1955; Бондарцев, 1953), а при отсутствии влаги способны выдержать, по крайней мере, отдельные представители, температуру до 100°С (Бондарцев, 1953; Klein, 1978). Высока устойчивость мицелия рассматриваемой группы грибов и к низким температурам (Бондарцев, 1953; Негруцкий, 1962).

По своим способностям развиваться при разных температурах выделяют три группы грибов, обнаруженных в Западной Сибири: 1) виды, развитие которых возможно при температурах 0-5°С (Piptoporus betulinus, Trametes ochracea, Т. versicolor, Т. hersuta и др.), 2) виды, требующие для развития минимальных температур 6-10°С (Fomitopsis pinicola, Fomes fomentarius, Ganoderma applanatum, Pleurotus ostreatus и др.), 3) виды, развивающиеся при температуре свыше 10°С (Fomitopsis rosea,

Bjercandera adusta, Lentinus lepideus, Schizophyllum commune, Panus tigrinus) (Мухин, 1993). По всей видимости, вышеуказанная классификация в большей степени касается нижних порогов значения температур, при которых возможно нормальное развитие мицелия. В то же время каждый гриб требует определенного температурного промежутка с характерной температурой наивысшего роста (Рипачек, 1967), чаще всего этот диапазон укладывается в рамки температурного оптимума. Некоторые авторы делят грибы на три группы в зависимости от оптимальной температуры (цит. по Рипачек, 1967): 1) грибы, требующие низкой температуры (20-24°С), например Fomes annosus, Phellinus pini, Serpula lacrymans и др., 2) грибы, требующие средней температуры (от 24 до 32°С), например, Trametes versicolor, Lentinus lepideus, Schizophyllum commune, Pleurotus ostreatus и др., 3) грибы, требующие температуры выше 32°С, например, Gloeophyllum sepiarium, Ganoderma lucidum и др.

Интересен тот факт, что многие грибы, мицелий которых по данной классификации нуждается в оптимальной температуре свыше 10 и даже 24°С, тем не менее, выдерживают значительные перепады температур, в том числе долговременные отрицательные. Так, например, Bjercandera adusta, относимая В.А. Мухиным к третьей группе грибов, в мягкие зимы не теряет жизнеспособность. Вообще, по литературным данным и собственным экспериментам, оказывается, что небольшие и даже достаточно резкие перепады температур зачастую не только не тормозят рост мицелия, но напротив вызывают его интенсивное развитие (Jensen, 1969; Яковлев и др., 2000). Такие же данные известны для простейших, бактерий, водорослей, микромицетов, дрожжей и растений (Аксенов и др., 1976; Заар и др., 1977; Константинов и др., 1998; Долгова, Зданович, 1997; Позмогова., 1983; Вент, 1964; Хайкин, 1964). Так, умеренные (в 3-6°С) колебания температуры стимулируют активность ростовых процессов

Stereum gausapatum, S. frustulatum, Laetiporus sulphureus, Trametes versicolor, а при более значительных (±11°C) - наступает их угнетение (Jensen, 1969). Промораживание некоторых штаммов Pleurotus ostreatus (до -37°С), выращенных при "контрольной" температуре 21°С, не только не являлось летальным, но и давало толчок к увеличению скорости роста и ростового коэффициента мицелия в течение двух первых суток после возвращения в "контрольные" условия (Яковлев и др., 2000).

Особым образом стоит группа грибов, оптимум развития которых составляют низкие положительные температуры. Систематически это достаточно гетерогенная группа, включающая ряд микромицетов, аскомицетов, грибов из группы порядков дискомицетов и некоторые виды базидиомицетов. В литературе время от времени появляются работы, сообщающие о находках таких грибов в антарктических и субантарктических районах. Так, образцы Dictyostelium mucoroides были собраны в феврале-апреле во всех представленных растительных сообществах на субантарктическом острове Macquarie (Stephenson et al., 1998). Другие авторы (Weinstein et al., 1997) описывают экологические и физиологические характеристики нового психрофильного вида - Humicola marvinii, выделенного в декабре - феврале с болотистых почв острова Signy в антарктической зоне. Ряд работ аналогичного характера (Wilson, 1951; Longston, 1973; Fenton, 1983; Hawksworth, 1973; Longston, 1985; Pegler et al., 1980; Hoshino et al., 1999) содержат описания многочисленных находок ряда паразитических грибов (Thyronectria antarctica var. hyperantarctica, Coleroa turfosorum, Bryosphaeria megaspora, Epibrion chorisodontii, Pythium ultimum Trow var. ultimum), развивающихся на мхах в антарктической зоне и Норвегии. В Эстонии и средней полосе России по сообщению В.П. Прохорова (Прохоров, 2000) было найдено более 30 видов жизнеспособных зимних и ранневесенних дискомицетов, собранных в январе, конце марта - апреле, соответственно, способных

расти и образовывать нормальные апотеции в зимне-весенний период. Температура воздуха в ранние весенние месяцы еще остается ниже нуля по ночам, хотя днем может повышаться до 5-7°С. Микроскопирование Lachnellula calyciformis (семейство Hyaloscyphaceae) показало, что это живые, нормальные апотеции с полноценными сумками и спорами. Вызывает интерес то, что количество плодоносящих грибов в зимние и ранневесенние месяцы составляло подавляющее большинство по сравнению с летним периодом, а начало данного процесса приходилось на осенние месяцы (конец ноября, начало декабря) вне зависимости от температуры воздуха, включая и отрицательные значения. Все элементы апотеция были заполнены цитоплазмой, что говорит о достаточной оводненности клеток, несмотря на действие отрицательных температур.

Другую группу составляют так называемые низкотемпературные базидиомицеты (LTB - low-temperature basidiomycetes) - грибы, способные развиваться при температурах около 0°С (Inglis et al., 2000). С достаточной степенью условности сюда же можно отнести некоторые виды базидиальных грибов, оптимум мицелиального роста которых находиться в пределах 15-20°С, но которые способны плодоносить в диапазоне температур от 0 до 5°С и выдерживать кратковременные осенне-весенние заморозки. К таковым относятся Flammulina velutipes -зимний опенок. Этот гриб образует плодовые тела в относительно холодное время года. Их можно найти на пнях лиственных пород умеренной зоны в ноябре и даже декабре - перед и после первых ночных заморозков, но еще до наступления постоянных морозов. Этот вид развивается при среднесуточной температуре, хотя и близкой, но все же выше 0°С (Прохоров, 2000). Другим примером такого же типа грибов может являться Discula pinicola, вызывающий засинение сосновой древесины. Мицелий этого гриба может расти при -2°С со скоростью 0.2

мм в сутки, а температурный минимум его роста равен -4°С (Рипачек, 1967).

Наконец, существует еще одна своеобразная группа грибов, объединяющая ряд микромицетов из рода Fusarium, дискомицетов (род Sclerotinia, Myriosclerotinia), а также некоторые базидиальные грибы (Coprinus psichromorbidus, Typhula incarnata Lasch exFr., T. ishikariensis S. Imai, T. phacorrhiza Fr., T. trifolii Rostr). Все из перечисленных выше видов относят к группе "снежной плесени" (snow mould) (Newsted et al., 1994; Matsumoto et al., 2001). Конвергентный характер эволюции данных видов привел к тому, что эти достаточно различные по своему систематическому положению грибы, занимают одну узкую экологическую нишу, паразитируя под снежным покровом на многолетних травах, культурных озимых злаках и некоторых голосеменных. Широтное распространение "снежной плесени" во многом ограничивается условиями мест обитания: достаточным по толщине снежным покровом и продолжительностью его залегания. В это время температура под снегом должна быть близка к нулю или чуть выше. В связи с этим оптимальные температуры для роста мицелия составляют в среднем 2-10°С (в зависимости от группы штаммов) (Matsumoto et al., 2001). Столь низкие оптимумы роста, высокий уровень устойчивости к отрицательной температуры (Hoshino et al., 1998) (до -40°С в лабораторных экспериментах), а также большое количество штаммов, рознящихся по криоустойчивости (Tkachenko et al., 1997) делают данную группу грибов уникальным объектом для исследования механизмов низкотемпературной адаптации.

Анализируя физиологические параметры грибов, как то: скорость роста, сроки и особенности плодоношения, продолжительность жизненных циклов или температурные оптимумы, можно выделить

несколько типов стратегии адаптации грибных организмов к действию низких температур.

К первому типу мы бы отнесли грибы с коротким жизненным циклом, быстрой скоростью роста и повышенным уровнем метаболизма. Таким характеристикам соответствует целый ряд микромицетов. Устойчивость к низким температурам у таких грибов в состоянии вегетации может быть достаточно слабой, однако, за счет того, что от фазы прорастания споры до нового спороношения бывает достаточно нескольких суто�