Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Транзиторные формы альбумина крови и способы их выявления

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Транзиторные формы альбумина крови и способы их выявления"

2 О ИЛИ >997

МІНІСТЕРСТВО ОСВІТИ УКРАЇНИ СІМФЕРОПОЛЬСЬКИЙ ДЕРЖАВНИЙ 0 д УНІВЕРСИТЕТ ім. М.В. ФРУНЗЕ

На правах рукопису

КАСИМОВА Галина Олексіївна

ТРАНЗИТОРН1 ФОРМИ АЛЬБУМІНУ КРОВІ ТА СПОСІБИ ЇХ ВИЯВЛЕННЯ

03.00.04.- Біохімія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук

Сімферополь - 1997

Робота є рукописом

Роботу виконано на кафедрі біохімії Кримського державного медичного інституту ім. С.І.Георгієвського

Наукові керівники: доктор біологічних наук, професор Г С.М.Борисенкої

доктор медичних наук, професор Г.Ю.Ажицький

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор Н. В .Толкачова,

кандидат медичних наук, Ю. Л. Криворутченко

Провідна установа: Національний медичний університет ім.акад. О.О.Богомольця.

Захист відбудеться 1997р. о (^год, на

засіданні Спеціалізованої Ради К 20.02.02. у

Сімферопольському державному університеті (333036, м.Сімферопіль, вул.Ялтинська, 4).

З дисертацією можна ознайомитися у бібліотеці Сімферопольського державного університету

Автореферат розіслано ^ <^/о.1-Л^997р.

Вчений секретар спеціалізованої ради, кандидат біологічних наук, доцент

Якісні зміни білків відбуваються під впливом різноманітних причин. Білки, поява яких не запрограмована організмом, а є наслідком хвороби, або ж поява їх пов’язана із впливом медикаментів, отрут та інших причин, називають транзиторними. Вважають, що в основі появи таких тимчасово присутніх білків лежать процеси постсинтетичноГ модифікації. (Троицкий Г.В. ,1991).

Дані про існування транзиторних форм альбуміну й можливості їх виділення стали визначальними у вивченні ушкоджених форм цього білка (Багдасарьян С.Н. и соавт.,1972; Борисенко С.Н., Селиванова К.Ф. и соавг. ,1978). Раніше було проведено дослідження в аспекті модифікації білків як неспецифічної реакції у відповідь на загальну реакцію при захворюванні (Ажнцкий Г.Ю. и соавт. 1984; Иванов О.И.«соавт.,1£"; >; Троицкий Г.В. и соавт.,1982; Шевцов В.Д., 1978), вивчені модифіковані форми альбуміну крові, які вдалося відділити від нормального білку й показати, що саме змінена частина сироваткового альбуміну зумовлює конформаційні зміни, спостережні для всього альбумінового пула при патологічних станах організму (Борнсенко С.Н. ,1990; Рибалка А.Н. и соавт.,1984; Соркин В.М.и соавт.,1987). .

На даний час встановлено факт присутності різноманітних форм альбуміну, названих транзиторними, які виникають з різних причин. Великий медичний та екологічний інтерес являє собою вивчення негайних захисних реакцій організму на різноманітні пошкоджуючі впливи що виявляється зокрема в глибоких структурно-молекулярних змінах альбуміну приклади яких багаточисельні (Ажнцкий Д.Г. и соавт,1995; Багдасарьян С.Н., 1969; \*/іс!етап Ь.аі аі.,1979).

Перелічені проблеми підтверджують актуальність вивчення процесів модифікації альбумину крові при різноманітних впливах на організм що вимагає розробки та використання нових інформативних методів для

виявлення та врахування якісних і кількісних характеристик сироваткового альбуміну.

1. Розробити больш простий і доступний метод виявлення транзиторних форм альбуміну та їх кількісного аналізу.

2.Оцінити можливість використання запропонованого методу для виявлення "бісальбумінеміП як модифікації альбуміну у вигляді транзиторної лікарської форми.

3.Показати, що виявлення кількісного складу модифікованої, частини альбумі ну крові може служити додатковим діагностичним тестом при різноманітних захворюваннях.

4.Підтвердити практичну значимість методу як токсикологічної, проби при контакті з екологічно шкідливими речовинами.

І.На значному клінічному матеріалі встановлено, що структурні зміни сіроваткового альбуміну можна виявити додатково новим розробленим вами методом і уточнити наявність патологічного процесу, що має велику значність при мінімальніму ступені активності захворювання, коли загальноприйнята! біохімічні та імунологічні показники активності недостатньо інформативні.

2.Здійснена розробка нового способу електрофорезу сироватці крові в поєднанні з ТХО - етаноловою (трихлороцетова кислота - спирт) обробкою електрофореграм, який дозволяє безпосередньо на носієві розділяти й визначати кількісно АмСмодифікований альбумін). Метод може застосовуватися практично в будь-якій біохімичній лабораторії.

3. Продемонстровано можливість доцільного використання кількісного визначення транзиторних форм білку як допоміжного діагностичного, прогностичного та токсикологічного тесту.

Основні положення, які виносяться на захист.

♦ - Нативний сироватковий альбумін здатний оборотно переосаджувати-ся в системі ТХО-етанол, модифікований in vitro чи in vivo альбумін випадає у вигляді нерозчинного осаду.

♦- "Транзиторш" форми альбуміну сироватці крові в умовах впливу токсичних речовин і при різноманітних захворюваннях відрізняються за своими фізико-хімічними властивостями, яки обумовлені здогадно перевантаженням альбумінової молекули різними метаболітами.

♦ -Розроблений новий метод оцінки кількісного вмісту Ам дозволяв, розподіляти нативну і модифіковану частини альбуміну на носіеьі і встановлювати відмінність між ними.

♦ Новий метод сполучного електрофорезу на ацетатцелюлозних плівках з ТХО-етаноловою обробкою електрофореграм можна використовувати як прогностичний і токсикологічний тести.

Апробація роботи

Матеріали дисертацій доповідалися на трьох обласних медико-біологічних конференціях молодих учених Криму (Сімферополь, 1980, 1982, 1984), на V-iii Всесоюзній конференції з спектроскопій біополімерів (Харків,1984), на V-ому Всесоюзному біохімічному з’їзді (Київ, 1986), на VII-ому Республіканському з’їзді онкологів (Сімферополь, 1985), на V-ому Міжнародному Дунайському симпозіумі з хроматографії (Ялта, 1995), яа V-ому Українському біохімічному з’їзді

(Івано-Франківськ, 1987), на засіданнях Кримського відділення Українського біохімічного товариства, а також на наукових конференціях кафедри біохімії Кримского медичного інституту (Сімферополь).

Метод запроваджено на хімічних заводах м.Саки й м.Сімферополя, Республіканському онкологічному диспансері, в Білогірській центральній

районній лікарні, на дитячих курортах м.ЕвпаторіН і в хірургічному відділенні 6-оі міської лікарні м.Сімферполя.

Основні результати дослиджень опубліковані в 27 друкованих працях. У процесі роботи було отримано два посвідчення на відповідні раціоналізаторськи пропозиції.

Дисертація викладена на 147 сторінках і включає Встуи, 7 розділів, висновки, список цитованої літератури. Бібліографія представлена 190 працями, з яких 124 російською мовою. Роботу ілюстровано 18 малюнками

і 9 таблицями.

Основним матеріалом для досліджень послужили комерційні препарати людського сироваткового альбуміну (ЛСА) фірми ^Reanal" (Угорщина), бичачого сироваткового альбуміну (БСА) фірми „Sigma (США), альбумін, отримуваний станцією переливання крові м.Сімферополя, та альбумін, виділений із сироватки крові індивідуальних донорів- контрольна група, а також від хворих на різні захворювання і альбумін людей, зайнятих на шкідливому хімічному виробництві. Крім того вивчено препарати кролячого сироваткового альбуміну (КСА).

Проводили виділення альбуміну крові людей і тварин методом препаративного електрофорезу в гелі агару і поліакріламіду. Також використана мелодика виділення альбуміну з допомогою трихлороцтової кислоти (ТХО) і спирту (Борисенко С.Н., Троицкий Г.В., Вершинин А.Я.,1979). Виділені препарати сивороткового альбуміну аналізували аналітичним електрофорезом у поліакріламідному гелі за загальноприйнятою

МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ

методикою (Маурер Г., 1971). Імунохімічну чистоту альбуміну оцінювали методом імунодифузії (Ouchterlony 0.,Nihson L., 1957).

В роботі застосовували оптичні методи дослідження: дисперсію оптичного обертання (ДОО) та коловий дііхроьзм (КД) для встановлення конформаційних змін у белку. Вимірювання ДОО препаратів альбуміну проводили на спектрополяриметрі 241-МС фірми^Регкіп-Е1гпег"( Швеція) в 5 см кюветі при концентрації білку не нижче 0,2 %. Оптичну густину білків вимірювали при довжинах хвиль: 579, 546, 436, 405, 365, 334, 313 ммк. Спектри колового дихроизму прописували на дихрографі ^Mark-Ill

фірми Joben Ivon"(Франція) в кюветах 1 мм і 0,1 мм при концентраціях

h • '

білка відповідно 0,5 мг/мл і 5 мг/мл.За даними КД разраховували видсо-ток а-спіралі . . ..

Ізоелектричне фокусовання (ІЕФ) проводили у борат-поліольному pH гра,дієнті у середовищі поліакріламиного гелю (ПААГ), застосовуючи апарат для диск-електрофорезу. Умовами електрофорезу при цьому були: 200-300 В/см та сила струму від 0,5 мА до 1 мА на трубку протягом чотирьох годин. Розчини для одержання гелю готували за прописами (Троицкий Г.В., Ажицкий Г.Ю., 1984). Кількісний вміст білковіх фракцій визначали деяситометричним способом.

В експерименті разроблено новий спосіб сполученого електрофорезу сироватки крові з ТХО-етаноловою обробкою електрофореграм з метою кількісного визначення модифікованої форми альбуміну в крові. Вмнст альбуміну після електрофорезу на ацетатцелюлозних плівках (після елюювання) визначали на спектрофотометрі l(Spektromom-204 (Угорщина) при 620 ммк в 1 см кюветі. Денситограми з ацетатцелюлозних плівок одержували на денситометрі^Becman (СІНА) і разраховували концентрацію білкових фракцій за площами відповідних піків (Пушкарев И.О., Удрис

О.Ю., 1980).

Для судження про характер протеолізу проводили триптнчний гідроліз альбуміну протягом 24 годин при фермент-субстантному відношенні 1:50 М/М і пептичний гідроліз альбуміну протягом ЗО хвилин при фермент- субстантному відношенні 1:1000 М/М. В дальиішому використовували гель-фільтрацію на колонках з сефадексами. Поглинання при 220 ммк регістрували на спектрофотометрі,8ресог(1*(НДР).

Поєднання методу електрофорезу сироватки крові з ТХО-етаноловою обробкою електрофореграм нами використовувалось з метою кількісного визначення модифікованої форми альбуміну в крові. При цьому з’явилась можливість виділяти лише конформаційно відозмінешш альбумін,в той час як нативна його форма цілком або майже цілком вимивається з носія. Тобто, можна розділяти нативну та модифіковану форми альбуміну без попереднього виділення білка і одразу ж проводити кількісний аналіз білкових фракцій (мал. 1).

РЕЗУЛЬТАТИ ВЛАСНИХ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

шпаках*

і

7

І

С82МВ>

д

є

Мал.І Електрофореграми сироватки крові на ацетатцелюлозшіх плівках

А- сироватка здорового донора

1 - до обробки ТХО-етанолом (контроль),

2 - те ж після впливу ТХО-етанолом (дослід),

Б - сироватка крові хворого па рак шлунка

1,2- відповідно контроль і дослід (у разі нормального альбуміну в досліді білкова пляма практично відсутня)

Для електрофорезу користувались апаратом ПЕФ-3. Для електрофорезу застосовували ацетагцелгалозні плівки, що випускаються Владимирським заводом Всесоюзного науково- дослідного інституту синтетичних смол і Виробничими Об'єднанням Тасма, м.Казань. Розмір плівок 25 мм х 90 мм і 90 мм х 80 мм. Сироватку крові наносили, опередньо разбавивши вдвоє дистильованою водою а кількості 4 мкл. Умови електрофорезу були 120 В та сила струму 0,4 мА/см протягом 60 хвилин з використанням 0,05 М мединал- цитратного буфера з pH 8,6.

Розроблений метод кількісного визначення модифікованої форми альбуміну в сироватці крові можна подати у вигляді схеми послідовних маніпуляцій:

контроль

фарбування елекгрофореграм І

відмивання барвника І

збезводнювання в 96 % етанолі 1

проясшовашія плівок І

прогрівання прн плюс 80-90 °С

І

дослід

обробка елекгрофореграм в 10 % ТХО

відмиванім в 70 % етанолі І

фарбування' елекгрофореграм І

відмивання барвника І

збезводнювання в 36%

І

прояснювання плівок

І

прогріванім при плюс 80 - 90 °С

‘ ^ —

КІЛЬКІСНА ОБРОБКА ЕЛЕКТРОФОРЕГРАМ

Промивання і підсушивання електрофореграм. Денситометрувания в проходячому світлі. Розрахунок плац піків на денситограмах і співвідношення між ними.

Промивання і підсушуваная електрофореграм. Елюювання досліджуваних білкових фракцій. Вимірювання поглинання при 620 ммк у відношенні до контролю. Визначення Ам за калібровочним графіком.

Нами проведено по 11 повторностей для кожного препарату альбуміну донорів. В результаті виявлена відтворюваність і помилка методу складала чотири відсотки.

Електрофорез характеризується високою продуктивніс- тю, економиєю реактивів та електроенергії, забеспечує можливість масового аналізу без попереднього виділення альбуміну із сироватки крові. Можливо використання різноманітної взаємозамінюваної апаратури, проведення електрофорезу у мікроваріанті.

ДОСЛІДЖЕННЯ ТРАНЗИТОРНИХ ФОРМ АЛЬБУМІНУ

Метод ТХО-етанолового переосідання був запропонований для встановлення конформаційних змін альбуміну при появі нерозчинного осаду. В цьому випадку в осаді може знаходитись його модифікована частина, що виникла або при патології, або в результаті звичайного комплексування в умовах in vitro. Як показали спектрополяриметричні дослідження різних препаратів конформаційно видозміненого альбуміну до і після переосад-жеїшя ТХО-етанолом можна цілком розділяти такий білок на нативний і конформаційно змінений.

Отримані результати з вивчення альбуміну виявленого нами у хворих що одержували більші дози пеніциліну також свідчать про появу електрофоретично більш рухомоі форми цього білку. Аналіз досліджень показав відсутність такого альбуміну по закінченні введення препарату, від п’яти до 10 днів, що дозволяє говорити про тимчасову присутність в

організмі подібної форми білку (транзиторної), котра відрізняється за деякими властивостями.

Дані колового дихроїзму показали, що спектри нормального білка і альбуміну хворих, яких лікували пеніциліном, практично не відрізняються. Кількісний вміст а-спіралі при лікуванні пеніциліном становив 36 %. Після лікування і зникнення анодноі форми альбуміну через 10 днів рівень а-спіралі досяг 40%. Переосадзкення білку ТХО-етанолом під час лікування виявило значення близькі до результатів дослідження альбуміну здорової людини - 45 % а-спіралі.

Таблиця 1

Характеристика вивчених параметрів ДОО та КД альбуміну і вмісту Ам до і після введення пеніциліну (М+тІ_____________________________________

Досліджені зразки Число випа — ДКІВ по ДОО по КД Ам,%

Яс -а0 -в. а-спі-раль, % а-спі-раль, %

in vitro .

Ліофілізований ЛСА 5 263±2 284+1 284±2 44±1 45+2 4.0+0.2

Ліофілізований ЛСА + пеніцилін (1:100 М/М) 5 260+4 279±3 210+5 37+3 38+2 16,0+1,5

Розчинена фракція ліофілізованого ЛСА + пеніцилін після ТХО еганолу 5 262+2 282±1 275+3 44+2 44+3 2.0+0.4

JOLYiYQ.

Нормальний КСА 7 265±1 284±2 285+2 45+2 44+1 9,0+3,0

КСА + пеніцилін 7 263±2 282±4 192+2 32±2 33±2 19,0+2,0

Розчинена фракція КСА + пеніцилін після ТХО-етанолу 7 264±3 283±3 280+3 40±3 42±2 8,5±3,0

Нормальний ЛСА 10 266+1 286+1 286+1 46+1 46+2 2,0+0,2

ЛСА хворих + пеніцилін 10 264+2 280+2 220+2 36+2 Зб±2 48,0+5,0

Розчинена фракція ЛСА хворих + пеніцилін після ТХО-етанолу 10 265±2 283+2 280+2 43+1 45±2 5,0+1,0

ЛСА хворих через 10 днів після відміни пеніциліну 10 265+2 285±2 271±3 40+2 40+3 15,0+1,5

• ■ - ■ >........ • • 12

При лікуванні пеніциліном з подальшою відміною препарату при відсутності електрофоретично більш рухомоі форми альбуміну суттєво змінюється склад модифікованого альбуміну зменшуючись практично вдвоє. В окремих випадках альбумін (анодна форма) має низьке значення в яке дорівнює мінус 192 якй.однак наближається до норми після ТХО-етанолової обробки такого білка ( в яке дорівнює мінус 280). Результати подано вище в таблиці 1. ■

Наявність великих доз пеніциліну в огранізмі при використанні ізоелектричного фокусування дозволяють виявити додаткові більш лужні фракції альбуміну в діапазоні рН від 5,4 до 5,6 та в діапазоні рН від 6,0 до 7,0. Одночасно був присутній головний компонент з рі від 4,9 до 5,15. Поява мінорних компонентів у лужній області може служити критерієм перевантаження білка пеніциліном.

■ Як встановлено раніше (Троицкий Г.В. и соавт., 1976; Ажицкий Г.Ю., 1988; Борисенко С.Н., 1990) альбумін при патології навантажений природними продуктами метаболізму порівняно в більшій мірі, при цьому присутня завжди модифікована форма. Тобто мінливість альбуміну можна пояснити кількістю модифікованого альбуміну який надає білку незвичних властивостей.

Метод ТХО-етанолового переосадження дозволяє відокремити модифіковану форму альбуміну, що переходить в осад, а частина білка, що залишається в розчині, набуває після цього своих нативних властивостей.

Як показано нашими дослідженнями за допомогою описаного модифікованого методу визначення Ам у крові в обстежених людей при різних патологічних станах і під впливом деяких факторів (вплив детергентів, антибіотиків) модифікована форма альбуміну присутня в значно більшому числі випадків, ніж у донорів. Розроблений нами метод підтверждує, що склад модифікованої форми альбуміну, знаходиться в

прямій залежності від локалізації розповсюдженості патологічного процесу і клінічного стану хворих. Результати досліджень дозволяють чітко пов’язати конформаційні зміни альбуміну при патології скоріш за все з комплексуванням ніж із зміною його біосинтезу. Це в свою чергу може послужити доказом переважаючої ролі комплексоутворення в умовах патології, що розвивається, тим більше, якщо мати на увазі, що вищеописані результати експериметів встановили структурні зміни альбуміну, характерні тільки для визначеної частини його молекули.

Таблиця 2

Порівняльні дані кількісного складу Ам при різноманітних захворюваннях_________________________________________________________________________

Групи обслідуваних людей Число випадків Кількість Ам, % (М±т) Р

Донори 42 2,20+0,24 -

Хворі на різноманітні непухлинні захворювання (виразка 12-палоі кишки шлунку, поліартрит, сепсис, хвороби серця, цукровий діабет, ниркова недостатність, гіпертонія, ларингіт) 96 19,6+0,86 ^0,02

Хворі на цироз печінки 8 36,0+0,11 *0,01

Хворі на онкогінекологічні захворювання 37 27,8±1,10 <0,01

Хворі хронічним атрофічним гастритом 50 24,0+0,20 <-0,01

Хворі на рак шлунка ІІ-ої і Ш-ої стадії 48 39,4±0,17 .<0,01

Хворі на рак шлунка ІУ-ої стадії 19 49,7±0,40 <0,01

Р- вірогідність різниці показників в порівнянні з контрольною

групою.

Як показано раніше методами колового дихроізму і дисперсії оптичного обертання практично при всіх захворюваннях виникає форма альбуміну із зміненими конформаційнимн властивостями, що свидчать про неспецифічний характер цих змін (Багдасарьян С.Н., Косяк О.Г., Толкачева Н.В., 1978; Троицкий Г.В., Ажицкий Г.Ю., Багдасарьян С.Н., 1976; Клишевич И.Б., Багдасарьян С.Н. , 1974). При виявленні складу модифікованого альбуміну показано що найбільш високими виявились показники при пошкодженні печінки і метастазах в цей орган. Поява

модифікованої форми альбуміну в крові може бути наслідком різноманітних причин що призводять до запального процесу в печінці а отже такий альбумін можна використати як тест раннього вияву порушення функції печінка і розвитку печінкової недостатності що безперечно набуває практичної значущості. Хворих цирозом печінки ми виділили в окрему групу оскільки печінка * місцем синтезу сироваткового альбуміну й активним учасником метаболізму (табл. 2- див. вище).

В цій групи вміст Ам був вищим (36,0 %) порівняно з групою хворих на інші захворювання (19,6 %). Кількість Ам у контрольній групі склала 2,2 %. При аналізі динаміки зміни складу Ам у сироватці крові хворих до радикального лікування з приводу раку шлунка і через рік після лікування при відсутності рецидивів і метастазів встановлено зниження Ам до 20,2 % порівняно з доопераційним періодом колі кількість Ам складала 38,9 %. Вивчення сироваткового альбуміну в онкологічних хворих до і після оперативного лікування показало, що до операцій виявляється значне збільшення Ам, деспіралізація і зниження мінус Вц . Сироватковий альбумін тих же хворих у післяопераційний період практично досягав нативних характеристик по ДОО що в свою чергу співпадало з даними клінічного аналізу про стан хворих. При гострих захворюваннях із сприятливим ходом структура альбуміну має тенденцію до швидкої нормалізації. При затяжному ході особливо при неухильному прогресуванні захворювання (злоякісні новоутворення) виявляються значно більші зміни конфонрмації альбуміну і часто без позитивної динаміки незважаючи на тривале лікування, що очевидно відображає глибину, а можливо і необоротність порушень, що виникли в організмі.

При обстеженні онкологічних хворих з використанням нового розробленого нами методу були випадки, колі при підозрі на рак шлунка вмист Ам до операції склав всього лише 10,4 %, а після дослідження операційного матеріалу встановили діагноз поліпоза шлунка. У деяких

хворих через рік після операції з приводу раку шлунка виявлено різке зростання рівня вмісту Ам до 60,5 %. У процесі клінічного обстеження у цих пацієнтів виявлені рецидиви пухлини. Це також служить підтвердженням більш високої чутливості показника Ам порівняно із загальноприйнятими лабораторними показниками.

Ам, %

Мал. 2 Графік залежності параметра ДОО (мінус в0) від кількості Ам, який міститься в крові .

в-пухлинні захворювання,

^-різноманітні непухлішяі захворювання, •

д-бісальбумінемія (лікування пеніциліном)

Зміна одного із головних білків крові, альбуміну, є наслідком хвороби. Проведені дослідження підтвержують можливість специфічності структурних змін альбуміну для певних типів патології. У ролі метаболітів можуть бути найрізноманітніші речовини (пеніцилін із лікарських препаратів, продукти хімічного виробпицтва - марганець, бромистий метил, ксілол, діхлофос). Це й показано нашими експериментами. Без

сумніву, всі ці ліганди можуть викликати ті перетворення, яки спостерігаються при патології.

Нами встановлено достовіряи зміни між просторовою структурою сироваткового альбуміну, що визначається методом ДОО і кількісним складок Ам у білку, який свідчить про те, що структурні зміни сироваткового а/г'.-буміну в значній мірі залежать від співвідношення нативної форми білка і модифікованої його частини. Чим більше у сироватці крові Ам, тим більш глибокі зміни вторинної структури альбуміну регіструються методом ДОО (мал. 2- див. вище).

56 43 ЗО

з»

10 о

Грули обслідуваних людей

Мал. З Порівняльні дані Ам у людей при патології і при . воздействиї різноманітних хімічних речовин

Хворії

1 - на рак різної* локалізації, 2 - на цироз печінки, 3 -гастритом, 4 - на інші захворювання,

Працівники цехів по виробництву!

5 - СМЗ (використання сннтанолу, сульфанолу), 6 -марганцю, 7 - брому, 8- аерозолів (використання ксілолу, діхлофосу.метаціду), 9 - бромістого метилу,

10 - службовці, не повязані з хімічним виробництвом;

11 - здорові донори.

Появу модифікованого альбуміну таким чином можна використати як прогностичний і діагностичний тест.

Вплив умов шкідливого хімічного виробництва і контакт з токсичними речовинами дозволяє виявити зміни властивостей альбуміну. Вивчене раніше впливання детергентів на білок спектральними методами (Заречная И.П., Троицкий Г.В., 1978) підтвержене і нашими дослідженнями, яки свідчать про те, що при погіршенні стану робітників при тривалому впливі токсичних речовин на організм, коли обстежені особи знаходяться у несприятливих умовах спостерігається збільшення концентрацій Ам. У зв’язку з цим можна виявляти групи риску для осіб з хронічною інтоксикацією на даному хімічному виробництві і внкрястовувати модифікацію альбуміну при санітарній оцінці виробництва (мал .3- див. вище).

Дія ксенобіотиків на альбумін також як і при патології, викликає однотипні конформаційні перетворення, що виражаються у частковій деспиралізації альбумінової молекули і зниженні розчинності білка після обробки підкисленим етанолом. Основуючись на цьому, ми пропонуємо використовувати розроблений метод для визначення міри токсичного впливу ксенобіотиків на організм людини і тварин. Таким чином з’являється можливість екологічної оцінки впливання на організм зовнішніх факторів на молекулярному рівні.

Як показано нашими дослідженнями властівости альбуміну після хімічної модифікації in vitro пеніциліном нагадують такі в умовах

патології. Така модифікація в обох випадках спричиняється до зміни на-тивної, структури в альбуміну. Для цього білка значення констант мінус в0 знижуються, що свідчить про деспіралізацію молекули альбуміну. В експериметі вияснено, що зміна білків сироватки крові в переважній більшості випадків полягає у зменшенні концентрації альбуміну і збільшенні тих або інших фракцій глобулінів.

Аналіз отриманих результатів досліджень переконує в тому, що змінення фізико-хімічних властивостей альбуміну обумовлене тою частина ;о білка,яка залишається на носієві після електрофорезу. та обробки 'і, О-етанолом (модифікований альбумін) в той час як розчинна частина альбуміну уберігає свои лативиі характеристики. Вказані зміни альбуміну крові при патології і при впливанні ксенобіотиків обумовлені перевантаженням білка різними метаболітами, тобто структурні зміни альбуміну можна розглядати з точки зору процесів комплексоутворення з продуктами метаболізму.

ВИСНОВКИ

1. Розроблено новий метод виявлення транзиторних фори сироваткового альбуміну та их кількісного аналізу з використанням комбінації методів електрофорезу на ацетатцелюлозних плівках і ТХО-етанолового переосадження. ,

. . 2. Зазначеним методом вперше вивчено раніше виявлені транзиториі форми сироваткового альбуміну при патології.

3. Показаного модифікований альбумін крові, який наявний в незначних кількостях у нормі, широко зустрічається при різноманітних захворюваннях і його кількість залежить від тяжкості хвороби.

4. Показано ,що розроблений спосіб дозволяє виявити групи риску дну, осіб з хронічкою інтоксикацією при діянні різноманітних несприятливих екологічних факторів.

5.Розроблений метод рекомендується як токсикологічний тест длч прогнозування результат хронічних інтоксикацій під впливом несприятливих екологічних факторів і при лікуванні пеніциліном.

Список робіт,надрукованих за темою дисертації

1. Багдасарьян С.Н., Касымова Г.А., Троицкий Г.В. Протеолиз сывороточного альбумина человека в норме и при заболеваниях печени //Укр. биох. журн. - 1982. - т. 54, X? 6. - с. 679 - 632.

2. Троицький Г.В., Борисенко С.М., Касимова Г.О., Тетін С.Ю. Аналіз процесів денатурації і комплексоутворевня альбуміну крові за допомогою колового дихроизму, диференціальної спектрофотометрії і фракціонування в кислому етанолі // Доповіді АН УРСР.- 1982. - >Г° 8. -с. 82 - 84.

3. Рыбалка А.Н., Багдасарьян С.Н., Гарнна Т.И., Карпиленхо Т.А, Касымова Г.А. Транзиторные формы альбумина крови человека при онхо-гинекологических заболеваниях // Бюл. эксп. биол. и медиц. - 1984. - №

1. - с. 76 - 78.

4. Троицкий Г.В., Борисенко С.Н., Касымова Г.А. Инвертированный метод обработки электрофореграмм для выявления модифицированных форм альбумина / / Лаб. дело. - 1986. - № 4. -с. 229 - 231.

5. Троицкий Г.В., Касымова Г.А., Борисенко С.Н. Степень модификации сывороточного альбумина как токсикологический тест // Вопр. мед. химии. - 1987. - № 2. - с. 38-41.

6.Борисенко С.Н., Касымова Г.А., Троицкий Г.В. Метод выявления модификации тирозиновых остатков // Лаб. дело. - 1988. - № 5 . - с. 53 -54.

7. Борисенко С.Н., Соркин В.М., Касымова Г.А. Модифицированный альбумин в качестве диагностического и прогностического теста / / Вопр. онкол. - 1988. - т. 34, № 9. - с. 1123 - 1125.

8. Borisenko S.N., Kasymova G. A. Cromatographic and electrophoretic methods of modificated albumin revealing // V-Danube symposium on cromatography. - Yalta, 1985. - P. 198 - 199.

9. Соркік В.М., Борисенко С.М., Касимова Г.О., Фрейнак С.М. Переросподил фукози серед білків сироватки крові в процесі розвитку злоякісної пухлини шлунка // Тези доп. V-ro Укр. біохім. з'ізду. - Івано - Франківськ, 1987. - ч. 2. - с. 225 - 226.

10. Ажицкий Г.Ю., Борисенко С.Н., Касымова Г.А. и др. Дальнейшие исследования сорбционных свойств альбумина крови человека / / Сб. трудов Крым. мед. ин-та, Симферополь, 1995. - т. - 131. - с. 56 - 60.

АННОТАЦИЯ

Касымова Галина Алексеевна. Транзиторные формы альбумина крови и способы их выявления. Рукопись. Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03. 00.

04.-Биохимия. Симферопольский государственный университет, специализированный Совет К 20.02.02, Симферополь, 1997.

На основании проведенных исследований разработан новый метод сочетанного электрофореза сыворотки крови на ацетатцеллюлозных пленках с ТХУ-этаноловой обработкой элктрофореграмм с целью количественного определения модифицированной формы альбумина. Изученные физико- химические свойства транзнторных форм альбумина при патологии и при воздействии ксенобиотиков связывают с перегрузкой белка различными продуктами метаболизма. Рекомендуется использование нового метода в качестве токсикологического и прогностического теста.

SUMMARY

Kasimova Galina Alekseevna. Transitory Forms of blood albumin and the Ways of their Revealing. Manuscript. Thesis for the competition of the degree of candidate of biological sciences on the speciality of 03. 00. 04- Biochemistry. Simferopol State University , Speciat council K 20. 02. 02, Simferopol, 1997.

On the base of carried out experiments the new method of associative electrophoresis on the acetatcellulose films with TCA-ethanol treatment of electroforegramm with aim of quantitative determination of modified blood albumin forms has been worked out. Studied physicochemical properties of transitory albumin forms in pathology and in xenobiotic influence are associated with the overloading of albumin with different products of metabolism. The application of the new method is recommended as toxicologic and prognostic test.

Кючові слова: сироватка крові, електрофорез, захворювання,

модифікована форма альбуміну.