Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Состояние структуры и функциональные свойства сывороточного альбумина при нарушении функции молочной железы

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Состояние структуры и функциональные свойства сывороточного альбумина при нарушении функции молочной железы"

£4

СИМФЕРОПОЛЬСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ УКРАИНЫ

°"> На правах рукописи

ЛЫСЕНКО Ирина Ннколаевна

СОСТОЯНИЕ СТРУКТУРЫ И ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ СВОЙСТВА СЫВОРОТОЧНОГО АЛЬБУМИНА ПРИ НАРУШЕНИИ ФУНКЦИИ МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ

03.00.04 — биохимии

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Симферополь —■ 1997

Работа выполнена на кафедре биохимии Симферопольского госуниверситета.

Научный руководитель — доктор биологических наук,

профессор Толкачева Н. В.

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор Ажицкий Г. Ю., доктор биологических наук, доцент Ев. стафьева Е. В.

Ведущее учреждение: Киевский государственный университет им. Т. Шевченко, кафедра биохимии.

Зашита диссертации состоится « 7 г.

ь А Я. часов на заседании специализированного ученого совета К.20.02.02 при Симферопольском государственном университете.

Адрес университета: 333036, Крым, г. Симферополь, ул.

Ялтинская, 4.

С диссертацией-можно ознакомиться в библиотеке университета.

Автореферат разослан « -1997 г.

Ученый секретарь специализированного совета, кандидат биологических наук,

У

В. ЯНЦЕВ

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Аигуаль«оста проблемы. В настоящее время глубокие нарушения координации метаболических процессов рассматриваются как один ип важнейших мех.шизмов развития многих заболеваний, в том число онкологических. Среди систем, участвующих в регуляции различным Фунгадай оргачигма существенное значение имеет сывороточный альбумин, как переносчик большого количества экзогенных и эндогенных метаболитов й, таким образом, обеспечивающий усвоение . клетками разнообразных биологически активных соединений.

При разных функциональных состояниях организма'альбумин приобретает физико-химическую гетерогенность, связанную., в основном, с изменением количества и состава лигантов и конформапиончыми модификациями белка.' В системе теоретических и практических проблем, раскрывающих характер транзиторных изменений сывороточного альбумина, особое значение имеют исследования, начатые в Ш-э годы Г.В.Троицким и получившие продолжение в работах биохимиков его школы. ■ Впервые высказанное им предположение о постсинтетической модификации молекул альбумина нашга свое подтверждение- в дальнейших исследованиях, в которых приведены убедительные доказательства гетерогенности СЛ. кз: в условиях разлития заболевания, так л при адаптации организма к физическим нагрузкам С Г.В.Троицкий, 1959, 1972, Соркш В.М. , 1988, Соркина Д.Л. , 1938, Ахицкий Г.Ю. . ' 1038,- С. Н.Сорисешсо, 1990, II.В. Толкачева, 1391).

Пристальное внимание исследователей натфачлено на биохимические изменения в организме при онкологических заболеваниях. В сывороточном альбумине больных со з.югачестлешшми опухолями разных логлхнзашп показаны значительные- изменения лигаялного, в частности углеводного и жирлокислотлого состава, а Также конфор-машюшше повреждения, что делает его перспективным объектом исследования (С.Н.Ворисеико, Г.В. Троицкий, 1934, Соркин В.М. с со-апт., 1885, Г.Ю.Ажицкнй, '1988, II. В .Толкачева с соавт., 1991 ).Тем

г- Л -

не менее, >ie имеет пока достаточного освещения в литературе описание транспортной роли сывороточного альбумина и его кои|&рмани-онных изменений на разных-стадиях аиулалевого процесса, особен но на ракш«, а ткже у больных в состояниях, оценивающихся как прэд^коые. Большой плгерес представляет динамика связывания си ьороточмы ааи'бушиом жщишх .кислот семейств кб и <-3, оссАт -рсш. к-гз'o;.i>\ и развитии pcüüi неодиократио ^подчеркивается ь последнее npöua ( Kannali et-а). ,1084, Trosco et öl., 1991, Hasler, Gonzales, 1092, Б. С.Хышктуев с соавт., 1ЖШ.

Цель и задачи нсояэдоаанья

Цйдьв настоящей p&Odru явилось изучение структуры к $ viaaufo-ральнаго сос годам сшйроточиого ихьбуыина в транспорте ¿игаидоб дшшдиой и углеводной природу у бодыкк с• дс0ро»сачестьёниыш опухолями н гзкеш шлоч'цой жедеьи разиш степсм&й tsisoctu. 8 конк-(.ulliiie ¿¿дачи ИоеЛь'ДСШСииШ ехолило:

-- маучешге i аорта синоротошш азьб^ншоы .¡¡цгавдет ли.шд ной и углеьодиои природы »'уровня его микозидированн» в зависимости от характера л сгздии варолевашя;

- определение функциональных. во&шнпстеА лиедхжганэго *ьль-Оуиина ь связывании жирник кисло» различных семейств ирн развитии овухояевого процесса;. . . '

- выявлений аавиеввоегги -реаарйшЛ Яуыадопашюй ата'нссуи синороточпого альбумина' и уровни его ыоди&нтрашшной цорш т Харэяера и степани тяжести заболевания; . •

- определение, структуры и терыостабшшас-са'м сшороточаого альбумина в зависимости от его лйгявднон нагрузки'« характера заболевали». 1 - ' •

Научная иогцэйа. Ььучена фуиьцил<::иьиа!1 рсш»-CA" li транспорте мпщов -в оашкшосз'и от характера и степени гяяоети ohkoiwtojo-гии ыоночной' желеэь. Дана Сценка качественного и ксумчесгвешгого состава жирны* кислот, скязьэдемих рльб^ышом на разиих стадиях рака полочной хемеви и у б&яьнах мастопатией; Установлен факт из-

— о ~

Оиратслыгаго тргшслсрта альбумином г.ириых кислот разных семейств в ходе развития опухолевого процесса. Показала зависимость резервной функциональной■активности и содержания Модифицированной Форш белка от '.ллести заболевания, Вперше дана оценка термостабиль мости сывороточного альбумина при опкопатологпи.

Практическое и гйсргхической значение работы.

Характер связываемых альбумином стороткм крови полинеиасы-щешшх «грнчх кислот различных семейств, уровень лигандов липнд-иой природы, а тнтае содержание модпфтадтагаюй Формы альбумина и резервная функциональная активность белел являются показателями, отрэжштет леспецпфичесиуо реакцию ап.бумвна на метаболические единги, происходяине в организме под плитном опухоли:

Полученные результаты свидетельствует о чем, чго .определение содержания в енвороточном альбумине лирт,-: кислот семейства ыЗ и соотношения ПН2Ж семейств «в/ыЗ шлет быть использовало, наряду с другими исследованиями,, в процессе-отбора лиц с неггсяекным онкологическим риском И в качестве дифференциального теста начальных стадий развития рака молочной железы, а также могут, служить основанием для разработки коррекции питания онкологических'больных.

Данные. о функциональных и структурных особенностях сывороточного альбумина при онкопатологии молочной железы используются в лекционном материале при чтении спецкурсов "Биохимия крови", "Висхимия углеводов и липидов", "Структура й функциональные свой-ппа белков" та кафедре биохимии Симферопольского гог.учиябрсигета.

Основное палотакст, ЕКТ10СИП» КИ ВгЗфГУ,

- Содержание' лигачдов лвшвдноЯ и углевоцной природи в сывороточном альбумине повышается по мере развития опухолепого заболевания и не зависит от характера патологического процесса. .

- На начальных стадиях злокачественного роста отмэчяется дефицит альбумин-связанных полтепасыщетых жирных кислот, в основном незаменимых 'жирных кислот семейства ыЗ

- По мере распространения опухолевого процесса выявлен рост

уровня модифицированной Форш сывороточного альбумина и снижение резервной функциональной активности белка; что свидетельствует сб актиБЦ&ациии его транспортной функции.

. - !1а поздних стадиях развития злокачественной опухоли отмечено изменение вторичной структуры альбумина крови по типу де-сш)р£ш1зации, коррелирующее о содержанием я белке метаболитов углеводной природы.

- Терьюстаоилыюсть сывороточного альбумина снижена на начальных стадиях оака молочной желевы.

АпроГ-.-ация работа.

Материалы диссертации докладывались на сгезде Американского Физического Общества, 21-25 марта 1994 г., Щттсбург, ка симпозиуме "Биологические механизмы старения", 12-14 мат 1994 г., Харьков, на VI Международном■симпозиуме по биохимии лилидов, 3-6 октября 1994 г., 'Санкт-Петербург, на научных конференциях профессорски- преподавательасого состава Симферопольского госуниьерснте-та ¡,1094, Ю&5, 1926 г.г.) и на.расширенном заседании кафедры биохимии СРУ.

Личный вклад автора заключается в самостоятельном выделении альбумина сыворотки кроьи, проведении экспериментальных исследований, статистической и "Компьютерной обработке полученных данных, анализе и изложении материала. Обсуадение результатов гаао-жид-костной хроматографии хиркых кислот, кругового, дихроизма, диффе-реш\иал.ьной сканирующей микрокалориыётрни было осуществлено при консультации специалистов Института Питания РАМН, Института Иммунологии РАН и Института Пищевых веществ РАН, соответственно.

Структура и объем работы. Диссертация состоит иа введения, обзора литературы (4 раздела), описания материалов и методов, ре аультатов исследования (Ь разделов)., заключения, 6 выводов и списка литературы (232 источников, иа них 118 - иностранных авторов) Диссертационная работа изложена на 128 страницах машинописного текста, включая 25 страниц описка литературы. Текст проил-

люстрирован 14 таблицами и 20 рисунками.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ Б работе использовали сывороточный альбумин больных фиброаденомой, очаговой мастопатией и раком молочной делезы первой -четвертой стадий. Взятие крови проводили по медицинским показаниям,' диагнозы бчли поставлены лечащими врачами онкологического центра г.Симферополя и подтверждены во время операции и пато-гистологическими исследованиями. Контрольную группу составили препараты альбумина, выделенные из сыворотки крови практически здоровых лиц (доноров). Кровь'доноров получали на станции переливания крови г.Симферополя. Всего обследовано 40 доноров и 187 больны;;.

Альбумин сыворотки крови выделяли при помощи препаративного электрофореза в 7Z полиакриламидшм геле (МАГ) (/Ъкицкий Г.Ю., Бягдасарьян С.Н., 1975). Анализ чистоты и гомогенности полученных препаратов белка проводили методом дискзлектрофореза в ПААГ (Davis, 1964). Количественное содержание альбумина определяли по методу Лоури (Дж. Миллер, 1976).

Содержание общих липидов в альбумине определяли методом Блюра в'модификации Брагдон, о экстракцией липидов по ' методике Солча (Folch et al., 1957 ). Количество общих углеводов (гексоз), связанных альбумином определяли орщшовым методом по Винндеру ( Готтшалк А., 1969)

Определение содержания модифицированной формы в белке проводили методом переосатадения в системе ТХУ-этанол, предложенным Багдасарьян С.Н. с соавт. (1979 г.). Содержание модифицированной формы представлено в процентах от общего содержания альбумина.

Газо-хроматографический анализ метиловых эфиров жирных кислот проводили на хроматографе "Intersmat"(Франция) с пламенно-ионизационным-детектором. Экстракт липидов из альбумина-получали по методу Фолча, жирные кислоты метилировали с применением те-трафлуоридбора 14% в метаноле ( Morris, Smith. 1964 ). Состав жир-

■ у "

пых кислот рассчитывали методом внутреннего нормирования на интерпретаторе- пристаьке "Intersmt", индивидуальные мирные кислоты представлены в процентах, от общей суммы. Для уточнения химической природы ряда компонентой смесей лирных кислот использовали хрома-то-масс-спектрометрию, которая позволила с высотой точности* идентифицировать состналикшцие иириогсислотного спектра Исследования проводили на хромато-мьсо-спектрометре "СТинниган 3200 Г" с автоматической системой обработки данных. Эксперименты проведеаи в лаборатории миттога обмена Института Питания РАМН, г.Москьа.

Резервную функциональную активность алъОумина определяли с помощью $иуоресцемтных зондов АНЮ (1-аюшшонафгааин- 8-сульфонат) и К-37, входящего в диагностический набор "йонд-31". Интенсивность флуоресценции зонда в белковых растворах оценивали на установке "30нд-31". Концентрация растворов белка составлял:» 3,?'10~бМ, раствора АНС - 1,?-10~5М (Остоловскнй ЕЛИ. с соавт., 1990) Результаты представлены в процентах'от нормы.

Собстненную флуоресценцию альбумина,обусловленную наличием остатка триптофана, в норме и при патологических состояниях организма определяли на спектрсфлуориыетре конструкции К.К.Туроверова и соант. С Туроверов К.К. и др., 19?4, Мн-т Цитологии РАН, Г.Санкт-Петербург ) при той же концентрации белка. -Степень' ани-вотропии лшинесцентного излучения определяли по интенсивности свечения, измеренной в'максимуме соответствующей полосы флуоресценции при параллельном и перпендикулярном положении поляризаторов.

Вторичную структуру солка оценивали методом кругового дихроизма (КД). Спектры КД регистрировали на дихрографе "Jasco" J-500A (Япония) в 1,0 мм кювете при температуре 20°С'. Спектры снимали в диапазоне длин волн от 240 до 200 им. По полученным спектра!,! строили кривые в единицах уде Явной эллиптичности. Процентное со-* держание различных структур й белке оценивали по методу Янга (Chen, 4ong, Mertinez, 1971) с помоцью программного пакета

- д -

"GTRUCTURE" (Институт Иммунологии, г.Любучаны, Московская обл.).

Термостабильность сывороточного альбумина определяли методом дифференциальной сканирующей микрокалориметрии на установке DASM-4 на базе Ун-та Пищевых веществ, г.Москза. Белок растворяли в 0,02 М фосфатном буфере. Математическая обработка кривых плавления и расчет удельной теплоты денатурации осуществляли ' с- по-мо',№ю программ "DASM" и "ES1PL0T".

Полученные в результате исследований данные обрабатывали методом малых выборок по Ойвину (ОйвинИ.А., 1965). Коэффициенты корреляции рассчитывали с помощью пакета программ "STATGRAF",

РЕЗУЛЬТАТ« ИССЛЕДОВАНИЙ И ЧХ ОБСУЖДЕНИЕ 1. Влияние характера и стадии опухолевого лроцесса на содержание лилидов и углеводов в сывороточном альбумине ■

Уровень обмих липидов (ОЛ) в сывороточном альбумине при всех изученных патологиях был достоверно выие, чем в норме (табл.1) При раке отмечено последовательное увеличение концентрации этих лигандов в CA в зависимости от степени распространения опухоли, уровень достоверности различий По сравнению с нормой во всех случаях был не более 0,05. Следует отметать, что у больных фиброаденомой и мастопатией содержание' ОЛ была достоверно выше, чем на первой стадии рака, и примерно соответствовало таковому на второй и третьей стадиях. Таким.образом, несмотря на явную зависимость данного показателя от тяжести заболевания, характер опухолевого процесса - доброкачественный или злокачественный - существенно не отражается на его уровне. Нельзя также не отметить, что при, раке молочной железы содержание ОЛ даже на поздних стадиях заболевания значительно ниже, чем у больных раком печени, кишечника, легких (Н.В.Толкачева с соавт., 1991, Бабусайли A.A., 1995 ) . По-видимому, существеннее значение имеет степень участия -пораженного органа в метаболизме липилов.

Таблица 1

Содержание общих дипвдов в сывороточном альбумине в норме и при онкопатологии молочной железы (МЖ), (М±ш)

' Обследуемые группы . Число обследованных Общие липиды, мгМООмг белка PI Р2

Доноры 20 2,65±0,13

Больные:

'фиброаденомой 20 4,06±0,16 <0,01 н/д

мастопатией 25 3,89±0,22 <0,05 н/д

ракоц МЖ:

Т1 5 ' 3,8410,17 <0,05 -

Тг 17 4,2410,33 <0,01 Н/Д

Тз 30 4,9510,30 <■0,01 <0,05

Т4 5 • 7,27±0,43 <0,01 <0,03

Примечание: Р1 - уровень достоверности различий по сравнению с контрольной группой, Р2 - уровень достоверности различий по сравнению с группой баш пых раком-Ш первой стадии.

Для йолеа полной характеристики лигаиднсй пагру&ки СА шш» было определено содержание гексоз в белке,- при этом выявлена ак-тиьизашш гдиковидированиа в СА больных- с онкозаболеваниями молочной железы, причем уае при доброкачественных опухолях и в пред расовом состоянии , ( У практически аьорашк людей - 8,ЫЗ±0,2б иг/ 100 мг белка, 4,82+0,33 и 3,14±0,£С1 мг/100 мг белка у больных фиброаденомой и мастопатией, соответственно"1)'. Из выраженных ста-злокачественного процесса содержание гексоа в СА Рыло значительно выше и составило в среднем 7,8ЕИ0,71 мг/100 мг альбумина. В диофилцзированшк препаратах СА содецканне углеводов било чем ь свежевыделешшх, что, по-видимому, объясняется поте-иен недованенгцо-'опйэадицх углеводных остатков (Троицкий Г.В., ' 10911. В норме данный показатель составил 2,1010,17 иг/100 мг белка, у больных фиброаденомой и мастопатией - 2,46+0,29 и 2,13±0, 13 мг/100 иг белка, соогватствешга, на первой и второй

-lt-

стздпнх рака - 2,ñii-'CJ,40 и 2,26JQ,20 мг/иЮ мг альбумина. Однако lia поздних стадиях pnica уровень гекйоа в лисфриакроьанни» альбумине Сил достоверно ише. чем в норме (o.l>ôin.28 на третьей и 2,0й±0,20 fir/100 иг бедка на четвертой стадия, р<ft,Ой) . Ио-шц-л-ыоиу, в датой случае проявляется когаленгное лигандщетвьыю ¡;а По.девятому дмашоюлу оотату, ыиьдатгое-при онкологических за полевалиях С. Н.Еагдасарьин с соавт. ( 1USQ)

2. Определение спектра лирник кислот и ааьбумнне больны* с онкозаболеваниями молочной иелези

Газо-дидксстная хроматография а»ьСу;.ын-связании;с жирник кислот шшла 25 насиненных н ненашдемьк жирных кислот с»т C]¿ до С22 £,таОл. 2,3).. В альбумине больных и здоровш людей содер:к.-ш:сь одинаковые - xnpiuie. кислотн, однако их количвственсие cotJVHOsuciiita nueiiií существенные различая. Так, Бияилс-ио сшшеше содержа,r.:,i альбуuiiii-евдгашш ШИК у болыш- раком полочной ьдоэаи ¡ю сравнению с нормой (в основной, • ьа счет семейств ий и ыЗ), особенно шрэдошое на первой стадии забол-■.п;иш (ряс.' 1). lipa агем зае.:у-мавает ВШ943НШ тот факт, что содержание иасиценних мнрнмк кислот (юмепяегси'обратно уровни IJHKK, ■ на первой стадии рака отношение ¡ШК/П1КК ночти б 2 раза ирешмает норму, Jipis атом с..','.¡на иэиоеш-Ш1Х ».К остается щау« ¡¡чески лоияыеыюй. В предракс&ом состоянии подобных иачеиешы но выявлено.

Спменне количества ПШК при раке. показано многими исследователями, как аиьбумин-связашшх - у бодьних с онкояатологией roil ато-дуоденальной зоны, легких, так и ъ мембранах опухолешк клч-ток, эритроцитах при ■ раке молочной железы / Влюдвин Ю. А. с соавт., 1994, Хшшктуев B.C. с соавт., 1994, Wngt. et al., 1992 /. Данное лление объясняется авторами как результат активизации процессов перекисного окисления. Однако выявленный наш факт низкого содержания этих метаболитов'на первой стадии р;жа, даже по сравие-

\z ~

Таблица 2

Состав и некоторые суммарные показатели альбумин-связанных жирных кислот в норме и у больных с онкопатологией молочной железы (Mim)

Жирные Доноры Больные Вольные

кислоты мастопатией раком молочной железы, Т1

12:0" 2,82+0,22 0,44±0,04 2,15+0,20

14:0 4,92+0,48 3,32+0,29 4,25+0,37

14:1 1,08+0.09 0,71+0,06 0,54±0,05

15:0 2,29+0,21 0,70±0,08 1,00+0,09

16:0 25.0Ы2,40 26,29+2,60 32,18+3,00

16:1 11,00+1,10 10.06+1,00 10,02+1,00

17:0:1 ■ 0,56+0,05 0,34+0,03 0,30+0,02

18:0 8,42+0,78 9,48+0,93 9,38+0,09

18:1 21,44+2,10' 23,75+2,27 26,44+2,59

18:2- 12,04+1,15 12,02+1,18 7,25±0,71

18:3 3,13+0,31 2,00+0,15 0,30+0,02

20:0 0,20+0,03 0,50+0,05 0,3710,01

20:1 1,60+0,14 2,00+0,21 • 0,3510,03

20:2 0,47+0,04 0,14+0,01 0,3310,02

20:3 0,5910,05 0,38+0,03 0,3010,02

20:4 1,60+0,09 1,10+0,09 1,43+0,13

22:2 0,32+0,03 1,12+0,09 0,60+0,04

20:5 - 0,15+0,01 0,47+0,04 0,35+0,03

23:0 0,30+0,02 1,10+0,10 0,30+0,02

22:3 0,24+0,02 0,47+0,03 0,3010,03

22:4+24:1 1,34+0,12 2,8710,28 1,7610,15

22:5 0,171:0,01 0,32+0,03 1,1010,01

22:6 . о,14+0;01 0,«421:0,03 ■ 0,1510,005

НЖК

ПНЖК 2,27 2,11 4,18

Екб

(18:2+20:4) 13.64+1,30 3,12+1,33 о ро+п.ро Í-1, W—w ,

ЕмЗ

(18:3+20:5 3,59+0,35 3,21+0,32 0,9010,08

+22:5+22:6) .

fc)6\w3 3,80 4,09 9,64

£»9

(18:1+20:3) 22,03+2,15 24,13+2,30 26,7512,61

* - первое число соответствует количеству атомов углерода в молекуле кислоты, второе - после двоеточия - числу двойных связей/

Таблица 3

Состав и некоторые суммарные показатели альбумин-связанных лирных кислот у больных раком молочной аелезн

(М±Ш)

Жирные кислоты Больные со злокачественными опухолями

Г2 ТЗ и

12:0 2,91.10,21 2,6710,25 4,0810,31

14:0 1,62+0,10 2,9810,30 4,29+0,42

14:1 0,7010,055 0,30+0,03 0,4710,04

15:0 3,4710,43 1,40+0,16 0,7210,07

16:0 ■ 32,4413,09 26,71±2,62 . -33,0113,30

16:1 12,00±1,10 10,7311,04 6,7010,68

17:0:1 - 0,2УЮ,02 0,4310,03 0,75Ю.07

18:0 10,55+0,97 7,51±0,1/5 • .10,9611,08

18:1 20,78+2,05 25,7812,Ь2 20,8811,96

18:2 9,1310,87 10,9711,03 9,3210,93

18:3 1,0910,08 ' 0,4410,04 , 0,4410,04

£0:0 0,4010,04 1,2010,10 0,5110,05

20:1 0,70+0,05 0,03Ю,06 0,1610,01

20:2 0,4110,03 . 0,0310,007 0,7210,07

20:3 ' 0,25+0,02 0,0910,009 0,4410,02

20:4 0,2510.02 2,4110,24 1,7410,15

22!: 2 0,1810,01 0,95Ю,0Э 0,5210,05

20:5 0,0610,003 0,08±0,006 0,2010.01

23:0 0,0710,007 0,5410,04 0,45+0,04

22:3 0,1810,01 , 0,10+0,01 0,3510,03

22:4+24:1 1,8710,17 2,4110,22 2,9010,23

22:5 0',Й5Ю,02 ' ' 0,5010,04 0,1510,01

22:6 111VI/ 0;40Ю,04 0,8910,03 1 0,2010,02

Ш1ЖК з.ео - 2,44 3,05

БЛ

(18:2+20:4) 9,3810,90 13, £811,10 11,0611,05

ЕыЗ

(18;3+£0:5 1,8010,15 1,0110,19 1,0010,09

^2:5+22:6)

ы6\мЗ . 5,21 7,00 11,06

Еи9

(18:1+20:3). 20,0312,08 25,8812,53, 21,3211,98

'О

30

го

10

■!-Ьг

ft

I

1......

rih

ь:

Л ■■

Рис. 1. Дикзмкка суммарных показателей альбумин-связзннь;:« жирных кислот у больных с онкопатологией молочной жепээы. 1 - доноры, 2 - больные мастопатией, 3-6 - больные раком молочной железы 1й-4й стадий, соответственно

□нжк а мвжк 8 пнжк

нию с более выраженными стадиями, по-видимому, имеет другое объяснение. •

Обращает на себя внимание то, что динамика ПНЖК при рада связана с падением парциальных долей жирных кислот семейств w6 и ыЗ, причем, в основном, ва счет линолевой и линоленовой кислот, особенно на начальных стадиях рака. Недостаточность 18:2 и 18:3 в сывороточном альбумине была отмечена ранее у больных раком внепе-ченочных желчных путей и забрюиинного пространства (Н.В.Толкачева,- 1991) . Низкое содержание 18:2 выявлено татае в липидах плазмы крови при раке легких С Хышиктуев Б.С. с соавт., 1994 ). Недостаточность незаменимых жирных кислот на начальных стадиях рака молочной железы, по-видимому, свидетельствует об активном их потреблении клетками злокачественного новообразования из русла кро-

- 1R

цтнако, Даниил $аст подтверждает мнение о тем, что развитие зложместош« опухолей данной локализации может быть СК.".'уЛНрС>-в;шо жирлокнелотным составом пищи Влюдзин Ю.А. с солит, 1994).

На первой стадии рака молочной железы отмечен резкий рост отношения спи жирных кислот ыб/«3, почти в 2,5 раза но сравнению с донорами (табл. 2). Значительное увеличение этого показателя было выявлено также и на начальных стадиях-рака легких, однако в этом случае рост наблюдался уже в.предраковом.состоянии (Кабусай-ли A.A., 1995). Возможно, дшПшй показатель является перспективным в качестве диагностического теста начальных стадий развития ' злокачественной опухоли.

Таким образом, в сывороточном альбумине больных раком молочной железы выявлены нарушения жирнокнелотпого состава но сравнению с нормой и больными мастопатией, в сторону снижения количества нолинепасыщенных жирных кислот, в основном, за счет семейств w6 а й>3. Низкое- содержание тлкнх жирных кислот, как линолевая и линоленовая, особенно выраженное, на первой стадии рака, а также высокий уровень соотношения вб/ыЗ' свидетельствует об угнетении метаболизма ЖК этих семейств у онкологических больных, /что показывает роль -альбумина как. возможного индикатора капкрофилии.

3. Состояние резервной функциональней активности CA вольных,с онкопатологией молочной железы

Изучение РФА сывороточного альбумина больных с онкопатологией молочной железы показало последовательное снижение интенсивности' флуоресценции в растворах белка в ¡зависимости от тяжести заболевания ( рис. 2). Так, резервная■функциональная активность альбумина, определённая с помощью АНС, у больных фиброаденомой составила 80,2±Z,24Z от Нормы, тогда как при мастопатии, расценивающейся, как предраковое, состояние, интенсивности флуоресценции АНС составила 69,?i2,10%. У больных со злокачественными опухолями мОЛОЧЯОЙ ЛёЯёоУ ПрОСЛОлйва^ТСЯ ПОСЛОДОБЗГ&ЛшнОё уйёйЪЕёКйЭ P-I-A от

1 2 3 4 5-6.7

. Обследуемые группы

Рис. 2. Резервная функциональная активность сывороточного альбумина у больных с онкопатологией молочной железы.'

1 - доноры, 2 - больныо фиброаденомой, 3 - больные мастопатией, 4-7 - больные раком молочной железы 1й-4й стадий, соответственно

ЫК-ЗТОАНС

68,2*3,252. на первой стадии заболевания до 52,8Ю,65£ на четвертой стадии. Аналогичная зависимость получена при использовании воида К-37: в этом случае интенсивность флуоресценции изменялась от 64,4*1,90Х у Сольных фиброаденомой до 44.6±1,60Х на четвертой стадии рака ( рис. 2). Таким обрааои, при онкопатологии молочной железы отмечается уменьшение числа свободных мест, связывания на молекуле альбумина, что, по-видимому объясняется ростом лигандной нагрузки белка, либо его модификацией. Снижение связывающей способности ДЛЯ флуоресцентных бондов показано и для других заболеваний - для почечной недостаточности, вирусного гепатита, цирроза речщ1. .. некоторых онкологических патологий. / Иванов А.И. с сорит., 1003, Толкачева Н.В., 1994 /. Очевидно, что данное явление носит ¡¡'¿инещф1ческщ характер и завист\ ■ в основном, от тяжести еайолевалия.

- w -

4. Состояние структуры и термостзбильность сывороточного альбумина при онкопатологии молочной железы

В налих исследованиях представляло интерес сравнить стеьспь структурной модификации СА при онкопатологии в зависимости от тяжести заболевания и функционального состояния белка. Общая оценка содержания модифицированной формы альбумина была проведена методом переосаждения в системе ТХУ-этанол, исследование структурных параметров СА - методами кругового дихроизма (КД) и флуоресцентной спектроскопии.

У больных со злокачественными новообразованиями молочной железы отмечен последовательный рост уровня модификации сывороточного альбумина в зависимости от ст;о;ии заболевания, В альбумине больных с первой стадией рака содержание модифицированной формы было в 2,6 раза вше, чем в норме (табл. 4). Лльбумиин

Таблица 4

Уровень модифицированной формы альбумина в норме и при патологии (Mtm).

Обследуемые группы п Уровень М5>А. V Р1 Р2

Доноры 20 5,31+0,33 .

Больные

фиброаденомой 20 24,43^0,93 <0,001 <0,01

мастопатией 23 27,91+2,40 <0,001 <0,01

раком МЖ:

Т1 5 13,64+1,10 <0,001 -

Та 15 22,58+1,99 <0,001 <0,01

Тз 27 24,32+0,05 <0,001 <0,01

Т4 5 44,41+0,93 <0,001 <0,01

Примечание: Р1 - уровень достоверности различий по сравнению с нормой; Р2 - уровень достоверности различий по " сравнению с Т^; п - число обследованных.

- 1в -

бсаьиьй со второй и третьей 'стадией рала но даьниму иогм^мель исши ь дьа (ias.ii превмаог Т[ , однако практически не различаются миаду собой. Щ-и _ обварном распространении ыскачестибннога процесса- содержали* Ш>А весьма зньчпуелько, что говорит о существенное шдекудеряси шврездекии альбумина на данном этапе рааытя аабодсбаний.

У больных фиброаденомой п мастопатией уровень ША был достоверно вше, чем на дарьой стадии рала, и пршерио соответсгьовад ташны:) дая здьбушш бшьпих второй л третьей огадией рака полочной Ас-логи. Молучзниш результат!), а т&сяз иизгочисяонйие дан-ьаь еаидотсльсгиумзтг о росте Ш-А при друпи пач-сло-

гилх, подтверадаш- неси^м-.!Чп:>оть этого показателе.

В данной районе получена Ь&сьиа одджи» корреляция уровня ША я солорлаяия огадпя дшшцеи на рпиаш стадиях опухолевого процесса, коафи»!«!«»»1 кэррейицан составил ОДий (ряс. 3). Подобная взаимосвязь ьиаьаана "¿илу между содержанием шдг^ициркшшки! формы и ВМ сывороточного альбумина (коэффициент корреляции --й./'пй) (рн;. 4). Таким обрагем, (сак и сшшшие резервной (уызда-стальиой дотадюсги, рост уровня шдифшеашш Ш-А сыщетедьствует об усидошм транспортной функции аяьбушна и перетруденносгн 6вл~ кь мигшлши при паюлопн!.'

При .-дшпдо собственной флуоргсценцнм. альбумина у больных раком молочной ашдеэи но сраьнешш о донорам^»» Оошдош мьглоан тпен сила пиншеиа теьдан.м« »: с»8б(»ш опог.тра ь крьсну» сторожу (•«»л.$.>>. Диетоьерно*,- изыешенш! данного нокавачелл оодшиио па Т1«и'ьс» спгиив рака, что сыоил-ыьигъует о рдьбон "разричлйини" ¡■идгл^Оногд гдфух&шм остатка чришодаиа ( иерилкоь Е.Д.» Яей-¡сус Г.Ю., 1995 ). Однако нолйрлзадш собственной цлуоросцонцпн СА практически не изменилась. . Таким образом, существенных изменений укладки гидрофойнот мдра моле'кулы альбумина при изученных заболеваниях не обнаружено.

Исследование спектров КД тагане показало достоверное измене-

ОЛ, мг/100 мг белка 8

7 в 5 4

3 -2 1 О

МФА,

/О

Т 50 45 40 35 30 25 20 15 10 5 0

.лц..

а 4 б

Обспадуемые группы

Рис. 3. Зависимость уроеня модифицированной формы альбумина от содержания лигамдов лилидной природы. 1 - доноры, 2 - больные фиброаденомой, 3 - бопьныа мастопатией, 4-7 - больныа раком молочной железы 1Й-4Й

стадий, соответственно Е2Э Содержание общих липидов Уровень МФА

100

.80

ео

2 40

20

0

0

.... +----------

10

20 30 МФА, %

40

Рис. 4. Зависимость резервной функциональной активности сывороточного альбумина от уровня его модифицированной формы

,. , Таблица Б

некоторое флуоресцентные параметры сывороточного альбумина ДОНОРОВ И 0НК0Л0ГИЧесК1Ц ООЛЬНЫХ, (М±Л1)

Обследуемые группы п Поляризация собственной Флуоресценции СА Смещение спектра Р

Доноры 10 '0,22410,001 1,05710,009 „

Больные:

мастопатией 10 0,22810,001 1,039+0,029 н/д

раком МЖ,

т2 10 0,22710,001 1,084+0,028 'н/д

Тз 10 0,22610,003 4 1,10510,017 <0,05

Примечание: Р - уровень достоверности различий величины смещения спектра флуоресценции в сторону увеличения длили волны ]ю сравнению с нормой

ние вторичной структуры белка только на вырашшых стадиях какце-рогенева (табл.. 6). Так, на третьей стадии рака содержание «-спиралей было почти на 20 X ниже, чем у доноров, что свидетельствует о нарушении конформзши аяьбумича по типу деспирализации. У больны х фиброаденомой, мастопатией, ц раком молочной келезы первой стадии разница по сравнению с нормой не достоверна.

Обращает на себя внимание весьма существенная корреляция концентрации гексоз и содержания а-спиралей в СА, коэффициент корреляции составил -0,88. Полученная закономерность согласуется с выводами С.Н.Ворисенко (1978) о том, что основное количество альбумин-связанных углеводов регистрируется во фракции модифицированного белка. По-видимому, именно коватентно связанные углеводы в наибольшей степени способствуют структурной модификации СА.

Методом дифференциальной сканирующей микрокалориметрии выявлена общая тенденция к снижению термостабильности СА при раке молочной железы, причем наименьшая удельная энтальпия денатурации

Таблица ¡->

Содержание ^-спиральных структур в нр(Ш|>ат<1Х сиьороточного альбумина в норме и при опконатологии полочной ■ жслрш

Обследуемые группы К- во образцов Сод е рлп1 мо < ¿-1' п и рал (■ й, X

Доноры 5 М), 011,5 -

■Вольные:

фчброадмюмой 5 Ы,013,0 п/д

мастопатией Б 50,01-3,5 н/'д

раком МК,. Тт .5 53,011,5 н/д

радам Ш, Тз 0 43,611,0 <0,05

Примечянж»• Р - уровень достоверности различий по сравнению с 'донорами

Таблица 7

Удельная теплота денатурации сывороточного альбумина в норме и при снкснатологии молочной делезь

Обследуемые группы К-ВО обравцов УД(льная теплота денатурации," 0., ЦуУг Р

Доноры б 22,9010,09 -

'Больнь ->: фиброаденомой Б Й1,0110,18 <0,05

мастопатией 5 21,9010,90 Н/д

раком Мй£ Т1 5 14,9010,13 <о,ог.

Та б 18,2510,16 <.0,05

Тз 5 <о,оь

Т4 5 18,К2!0,17 <о,оь

Примечание: Р - уровень достоверности различий по сравнен!® с контрольной группой.

белка получена на первой стадии рака - почти в 1,5 раза ниже, че в норме (табл. 7). У больных фиброаденомой и мастопатией удельнг теплота денатурации СА близка к норме. На выраженных стадиях кан церогенеза показано снижение температуры денатурации белка, чт также свидетельствует об уменьшении его термостабильности.

Таким образом, в результате проведенных исследований выявле ны существенные изменения лигандного состава и структуры сыворо точного альбумина онкологических больных в зависимости от стади. опухолевого процесса, а также от характера заболевания. Получен ные данные расширяют имеющиеся представления о характере метаболических сдвигов в организме и роли сывороточного■альбумдна к& транспортного белка при развитии злокачественных новообразований.

ВЫВОДИ

1. Показтю достоверное увеличение альбумин-связанных липидов \ больных с доброкачественными и злокачественными новообразованиями молочной железы, что отражает неспецифический характер данной реакции организма.

2. Выявлено, снижение содержания ПНЖК шв и кЗ в липид-альбуминовом комплексе, сопровождающееся выраженным ростом отношения жирных кислот этих семейств при paite молочной железы преимущественно за счет дефицита жирных кислот шЗ.

3. Установлено, что резервная функциональная активность сывороточного альбумина при оякопатсшогии молочной железы снижается последовательно в зависимости от степени тяжести заболевания.

4. Показано, что содержание модифицированной формы белка возрастает по мере распространения опухоли и коррелирует с уровнем его лигандной нагрузки.

5. Методом кругового дихроизма выявлены структурные изменения молекул , сывороточного альбумина на поздних стадиях рака мо-

лочной железу, сопровождающиеся достоверным уменьшением процента а-спиралей.

6, Установлено снижение термостайяльности сывороточного альбуми на при онкопатологии молочной железы, наиболее ревко выра*.ен

• ное на начальных этапах развития злокачественного процесса.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ Ю ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Onsovichl.fi., Tolkacheva N..V., BerjansklL М. A stud! of яегшп albumin in patients withvarious diseases of тадвпагу gland by fluorescent sondes method //' 1994 March Meeting cf

. Amer.Phys. Soc., 21-25 March 1994, Pittsburg (USA): Bull.of " the Amer.Physic. Soc,- 1994,- v.39,- N 1,- P.424.

2. Онсович И.Н. Функциональное состояние сывороточного альбумина .у онкологических больных разного возраста // Биологические механизмы старения, 12-14 мая 1994 г.: тез. симпозиума.- Харьков, 1994. - С.иг

3. Толкачева Н.С.,' Левачев М.-М.. Кулакова С.(I.. Онсович И.Н. Альбуминзависиыый транспорт лигандоа лчявдной природы при различных состояниях организма // Материалы VI Симпозиума по биохимии липидса, З-В октября. 1994, Санкт-Петербург.-- М.. 1995,- С. ЮЗ!

4. Толкачева И.В., Борисенко С.Н., Левачев М.М., Кулакова С, Н. Онсович И.И. Характеристика транспортной функции и структурь сывороточного альбумина у онкологических Сольных //■ Вопр.он КОЛ.- 1995. -- Т. 41. - N 1. - С. 29-32.

6 Структурно-функциональные свойства макромолекул и особенност, метаболических процессов при различных состояниях организма < / Толкачева Н.В. Доновецко С.В.,Мартышек B.C., Заленская И.Н. Гемберг 0.11., Лысенко И.Н. и др. //В кн.:Записки ученых университета. --Симферополь, 1996. - С. 137-1Й7.

6. Толкачева H.В., Кулакова С.II., Лысенко И.H., Вабусайли ЛС5дул-ла Ахмед, Стогова Э.Г. Кирногавдотни» состав сывороточного алъбушша онкологических больных в зависимости от стадии и локализации злокачественной опухоли //.Вопросы мед.химии.- . Т. 43.- Вшь 4. - С. 261-266. ■

1.ь. Lysewo. i he state of struowj and functional peculiarities of seruin albumin In noini and at the breach of junction . of mammary gland. The dissertation work to obtain the decree of; Candidate of Biological Sciences (specialty 03.00.04 - biochemist-ty/, the Simferopol State University.

Using t.M circular dichrolsm and fluorescent spectroscopy n:'jLtiods the ¡jreach of' structure. ■ of serum albumin dependind of ifs ilgand load has been established.; By the differential'scan-ning- mcrocaiorymetry method it vas discovered the fall of ther-nostr.bi'ity of prctein at- initial stages of cancerogenesis. 1 he qualitative aid quantitative composition of albumin-bourid fatty acids наг estimated and deficiency of polyunsaturated <»»6 and u3 fatty acids in disease condition has been revealed.- It was shown the increas of modified form level of albumin and thé decrease of it's reserve functional activity -In disease development, that, evidence about Sctivisation of albumen's transport function

Ключевые слова: сывороточный альбумин, структура белка, ли-' пиды, жирные кислоты, мо&юнаг аелевз.