Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Транскрипционная и транспозиционная активности ретротранснозона COPIA у DROSOPHILA MELANOGASTER

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Транскрипционная и транспозиционная активности ретротранснозона COPIA у DROSOPHILA MELANOGASTER"

На правах рукописи

ФИЛАТОВ Дмитрий Александрович

ТРАНСКРИПЦИОННАЯ И ТРАНСПОЗИЦИОННАЯ АКТИВНОСТИ РЕТРОГРАНСИОЗОНА

copia у Drosopiiila melanogaster. 03.00.03 - молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических, наук

Москва - 1998

Работа выполнена на Кафедре молекулярной биологии Биологического факультета

Московского государственного университета им. М.В.Ломоносова и в Отделе молекулярной генетики животных Института молекулярной генетики РАН

Научные руководители: доктор биологических наук, профессор В.А.Гвоздев кандидат биологических наук Е.Г.Пасюкова

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Н.А.Чуриков кандидат биологических наук А.Г.Имашева

Ведущая организация: Институт биологии развития им.Н.К.Кольцова РАН

Защита диссертации состоится ^ " 1998г. в ^"^Часов на

заседании Диссертационного совета Д.002.79.01 при Институте молекулярной биологии им. В.А.Энгельгардта РАН

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института молекулярной биологии им. В.А Энгельгардта РАН

Автореферат разослан

1998г.

Ученый секретарь Совега, кандидат химическизГиаук'

А МКрицын

Общая характеристика работы.

Актуальность темы. Ретротранспозоны найдены в геноме эукариот всех основных систематических групп от дрожжей до человека и составляют у Drosophila melanogaster более 10%, а у некоторых растений более половины генома. Перемещения ретроэлементов вызывают мутации, в том числе и у человека. Для ретротранспозонов Drosophila gypsy и torn доказана возможность инфекционной передачи. В некоторых случаях ретротранспозоны напрямую задействованы в таких клеточных процессах, как восстановление концов теломер и залечивание двуцепочечных разрывов п ДНК.

Несмотря на широкое распространение ретротранспозонов и их существенную роль в сохранении структурной целостности хромосом, многие аспекты регуляции m перемещений остаются неизучеными. Неясно, в частности, ограничивается ли частота перемещений числом копий ретроэлемента в геноме (саморегуляция) или геномом хозяина.

Исследование регуляции перемещений ретротранспозонов и факторов, влияющих на частоту транспозиций, затруднено тем, что эти события происходят с относительно низкой (Ю-3 - 10"s инсерций на гамету) частотой. Большая часть данных о частотах транспозиций получена косвеными методами (по накоплению инсерций в инбредных лабораторных линиях), а регуляция транспозиционной активности изучалась в основном на ретротранспозонах дрожжей или в культурах клеток Drosophila Исключение составляют I элемент, gypsy и copia, перемещения которых были обнаружены в отдельных линиях Drosophila melanogaster, что позволило изучать транспозиции в прямых экспериментах in vivo. В данной работе использовалась линия 2Ь Drosophila melanogaster, описанная Пасюковой и Нуждиным (Pasyukova and Nuzhdin 1993), в гаметах самцов которой были обнаружены перемещения ретротранспозона copia, происходящие с частотой, на 2-3 порядка превышающей спонтанную частоту транспозиций (Pasyukova et al. 1997). Это позволило изучить in vivo сопряженность интенсивности транскрипции ретротранспозонов и частоты их перемещений, а также зависимость частоты транспозиций от числа инсерций copia в геноме.

Цель и задачи исследования. Накоплено большое количество данных о влиянии различных факторов на уровень транскрипции ретротранспозонов, однако сопряженность интенсивности транскрипции ретротранспозонов и частоты их перемещений для высших эукариот in vivo ранее показана не была. В задачу работы входило изучение связи уровня транскрипции и частоты транспозиций

ретротранспозонов на примере copia в сублиниях с различными (от 2х10"2 до 5x10"' инсерций на гамету) частотами транспозиций этого ретроэлемента, а также у особей разного возраста, имеющих, как показано в данной работе, трехкратную разницу в частоте транспозиций.

В случае обнаружения положительной корреляции между уровнем транскрипции copia и частотой транспозиций предполагалось провести структурный анализ регуляторного района copia, активно перемещающейся в линии 2Ъ, с целью выявления возможных особенностей его строения.

Представляло интерес сравнить интенсивность транскрипции copia в генеративных тканях самцов, где ранее были обнаружены транспозиции, с транскрипцией в генеративных тканях самок и в соматических тканях, где транспозиции отсутствовали. Для этого предполагалось исследовать различия в интенсивности экспрессии репортерной конструкции, содержащей ген lacZ под промотором copia, в семенниках и яичниках имаго, а также в слюнных железах личинок.

Одна из наиболее распространенных гипотез, касающихся механизмов поддержания постоянного числа копий мобильных элементов в геноме, предполагает негативную связь между количеством копий ретротранспозона и частотой его транспозиций. Для проверки применимости этой гипотезы на примере copia предполагалось определить частоты транспозиций этого ретроэлемента в сублиниях, резко различающихся по числу его копий в геноме.

Научная новизна результатов исследования. Использование в данной работе линии с высокой транспозиционной активностью ретротранспозона copia позволило впервые изучить в прямых экспериментах влияние таких факторов, как копийность ретротранспозона, интенсивность транскрипции copia и возраст мух на частоту перемещений copia.

Зависимость частоты транспозиций ретротранспозона от возраста организма-хозяина была изучена впервые. Используя возрастную зависимость частоты транспозиций, впервые для высших эукариот в прямом эксперименте, свободном от влияния генетических межлинейных различий, удалось in vivo показать положительную корреляцию количества транскрипта и частоты транспозиций ретротранспозона copia.

С помощью трансформации мух Р-элементом, несущим репортерную конструкцию 1Щ\(сорш)-1ас2 (lacZ под контролем длинного концевого повтора copia, содержащего

промотор), впервые показано, что семенник-специфическая экспрессия обусловлена промоторным районом copia.

Зависимость частоты транспозиций ретротранспозона от копийности имеет принципиальное значение для понимания природы стабильности числа копий мобильных элементов в природных популяциях. Ранее корреляция копийности и транспозиционной активности ретротранспозонов была изучена лишь в одном случае (Nuzhdin et al. 1996), также для copia. Поскольку данные, приводимые в настоящей работе, получены на других линиях, отмеченная в обоих случаях положительная корреляция числа копий и частоты транспозиций значительно ослабляет гипотезу о саморегуляции частоты транспозиций ретротранспозонов, по крайней мере для copia.

Апробация работы. Работа была представлена на Всероссийском съезде российского генетического общества им Вавилова, Саратов, 1994, 37 ежегодной международной конфененции по генетике Drosophila, Сан-Диего (США), 1996, доложена на конференции «Эволюция и роль мобильных элементов», Жиф-сюр-Ивет (Франция), 1996, а также на студенческой конференции университета Лион 1 им. Клода-Бернара (Франция), 1997.

Публикации. По теме диссертации написано 4 статьи, из которых на момент защиты диссертации опубликованы три.

Структура и объём диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, изложения результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа содержит 80 страниц машинописного текста, 4 таблицы и 13 рисунков. Список литературы включает 112 источников.

Материалы и методы.

Линии Drosophila melanopaster. В работе использовались сублинии линии 2Ь н линия Oregon RC-iso Drosophila melanogaster. Линия 2b - это изогенная лабораторная линия дикого типа. В 1988, 1991 и 1994 гг. линия 2Ь была разделена на несколько отводок (рис.1). В исходной линии 2Ь присутствовало 24 фиксированных эухроматических сайта copia. Полиморфизм по этим сайтам отсутствовал во всех отводках этой линии на протяжении 10 лет (Pasyukova et al. 1997). В ряде отводок линии 2Ь были обнаружены активные перемещения ретротранспозона copia (Pasyukova and Nuzhdin 1993). В результате транспозиций сублинии 2Ь накопили различное (от единиц до нескольких десятков) количество дополнительных сайтов copia. По этим

сайтам в сублиниях линии 2Ь наблюдается полиморфизм. Сублиния w12Ы была получена путем длительных (более 10 поколений) возвратных скрещиваний линии white1 на сублинию 2Ь1. Линия Oregon RC-iso была получена в результате изогенизации линии Oregon RC и введения в нее маркера sparkling. Локализация сайтов copia в этой линии стабильна и гомогенна - полиморфизм по 14 сайтам локализации этого элемента отсутствует.

1986 1988 1991 1994 1995 1996

Рисунок 1. Родословная сублиний линии 2Ь. Овалом обведены сублинии, в которых было проведено измерение частоты транспозиций.

Измерение частоты транспозиций copia Частоту транспозиций copia измеряли в гаметах самцов сублинии 2Ы и нескольких отводок сублинии 2ЬЗ. Индивидуального самца тестируемой линии скрещивали с несколькими самками линии Oregon RC-iso и у гибридов первого поколения на личиночной стадии с помощью гибридизации in situ определяли локализацию copia на политенных хромосомах (рис.2). Поскольку рекомбинации между гомологами у самцов Drosophila melanogasler в норме не происходит, каждая особь F1 несет один из гомологов, имевшихся у тестируемого самца, и хромому линии Oregon RC-iso, все сайты copia в которой известны. Проанализировав значительное (не менее 10) количество потомков данного самца, можно охарактеризовать локализацию copia в каждом из гомологов всех хромосом самца. Сайты, отсутствовавшие в родительских хромосомах, возникли в результате

транспозиций в гаметах тестируемого самца. Среднее число таких сайтов на личинку принимали за частоту транспозиций в данной сублинии.

1с/2ь.

х ç Oregon RC-iso i

(-......В" ■В....... N

--------Р|.. -----J

■П—H-......------J

^лранспозиция

Рисунок 2. Схема измерения частоты транспозиций. Прямоугольниками обозначены сайты copia в линии Oregon RC-iso, овалами - сайты copia тестируемого самца. Треугольниками показаны транспозиции.

Нитогенетические методы. Гибридизацию in situ с политенными хромосомами слюнных желёз личинок D.melanogaster с использованием биотинилированных зондов на последовательность copia проводили по методике, описанной Ашбёрнером (1989)

Молекулярно-генетические методы. Выделение плазмидной ДНК из E.coli и геномной ДНК из D.melanogaster, обработку ДНК эндонуклеазами рестрикции, гель-электрофорез ДНК и РНК, southern-blot и northem-blot гибридизацию проводили по стандартным методикам, описанным Маннатисом и соавторами (1982, 1989).

Выделение РНК проводили по способу, описанному Чоникзинским и Саши (1987). Образцы РНК разделяли в 1% агарозных гелях с формальдегидом и переносили капилярным методом на фильтры Hybond N+ в 20xSSPE. Гибридизацию проводили с использованием 12Р меченных антисмысловых РНК зондов. В качестве матрицы для синтеза РНК-зонда использовали Apaf - Hindlll фрагмент copia (2 т.п.н), субклонированный в плазмиду рШ17б. Для синтеза антисмысловых РНК-зондов, специфичных к гену рибосомного белка гр49, использовали фрагмент этого гена размером 1 т.п.н., субклонированный в плазмиду pBlueScript. Фильтр гибридизовали сначала с РНК зондом copia, а затем с РНК зондом на ген рибосомного белка гр49 для контроля количества PiIK на дорожках. Автографы сканировали на планшетном сканере Paragon-600 с приставкой для прозрачных материалов. Количественный обсчет

интенсивности полос проводили с помощью программы Image Quant. Относительные количества полноразмерного транскрипта copia определяли по интенсивности полос на автографе с учетом количества нанесенной РНК.

Секвеиирование ДНК проводили по методу Сенгера, согласно инструкциям производителя набора реактивов для сиквенса (USB).

Инъекции ДНК в эмбрионы D.melanogaster с целью получения трансгенных мух с помощью Р-элемент зависимой трансформации, а также окраску тканей трансгенных мух для выявления экспрессии репортёрного гена lacZ проводили по методике, описанной Ашбёрнером (1989).

результаты исследований и их обсуждение.

Количество транскрипта copia в линиях с различной частотой транспозиций и числом сайтов copia Определение частоты транспозиций copia для нескольких сублиний 2Ь (рис. 3) показало, что частота транспозиций copia значительно варьирует от сублинии к сублинии, причем различие между наиболее стабильной сублинией 2Ы (0.02±0.02 инсерций на гамету за поколение) и сублинией 2ЬЗ-А, имеющей наибольшую частоту транспозиций copia (0.51±0.11 инсерций на гамету за поколение), составляет 25 раз. Всего в ходе данного эксперимента локализация сайтов copia была проанализирована у 431 личинки и было выявлено 142 транспозиционных события. В целом транспозиционная активность copia в линии 2Ь на 2-3 порядка превышает значения, характерные для природных популяций и лабораторных линий (Nuzhdin and Mackay, 1994).

Для изучения связи уровня транскрипции и частоты транспозиций ретротранспозонов было проведено сравнение содержания транскригтта copia в семенниках самцов четырех сублиний (2ЬЗ-А, 2ЬЗ-В, 2ЬЗ-С и 2Ы) для которых была измерена частота транспозиций copia, а также в семенниках самцов линии OregonRC-iso, взятой в качестве стабильной для сравнения (рис.3). Для линии OregonRC-iso измерения были повторены дважды, а для четырех сублиний 2Ь относительные количества РНК copia определяли в шести независимых экспериментах.

Минимальное содержание транскрипта copia было обнаружено в линии Oregon RC-iso, транспозиции в которой отсутствовали, а число эухроматических копий copia было минимальным - 28 на диплоидный геном. Максимальное количество РНК copia содержалось в сублинии 2ЬЗ-А, имеющей самую высокую частоту транспозиций (0 51 транспозиций на гамету за поколение) и большое (85) количество инсерций copia.

Меньшее содержание транскрипта было обнаружено в линии 2ЬЗ-В, демонстрировавшей промежуточную (0.11 транспозиций на гамету за поколение) частоту транспозиций, но имевшей максимальное (94) количество сайтов copia. Две другие сублинии (2ЬЗ-С и 2Ы) не отличались по содержанию РНК copia в семенниках, несмотря на достоверное (t=2.34, Р<0.05) различие в частоте транспозиций (соответственно, 0.14 и 0.02 транспозиции на гамету за поколение). Корреляция между числом сайтов и количеством транскрипта copia (г=0.88), а также между количеством транскрипта и частотой транспозиций (и=0.89) была достоверной по первому порогу. Следовательно, по-видимому, частота транспозиций copia в значительной мере зависит от содержания РНК copia в семенниках. Отметим, что приведенный материал не позволяет выявить достоверную корреляцию между числом сайтов и частотой транспозиций copia, однако в другом эксперименте подобная корреляция была достоверной (см. ниже).

25

¡0 а

S 20

ta -■-

х а.

S 5

2ta3-A 2ЬЗ-В 263-С 2М Oreçpn

n=8S n=94 n=59 n=54 n=28

tr-0,51 tr=0,11 tr=0,14 tr-0,02 tr=0

Рисунок 3. Сравнение количества транскрипта copia в тотальной РНК из семенников самцов пяти линий с различным числом копий на диплоидный геном (п) и разной частотой транспозиций (tr) ретротранспозона copia. Количество транскрипта copia в линии Oregon принято за единицу. Вертикальной чертой обозначен 95% доверительный интервал. Расположение дорожек на автографе совпадает с диаграммой.

Хотя корреляция была достоверной, не все точки хорошо ей соответствуют. Содержание транскрипта copia в сублиниях 2ЬЗ-С и 2Ы примерно одинаково, а по частоте транспозиций они отличаются почти на порядок. Сублинии 2ЬЗ-В и 2ЬЗ-С имеют сходную частоту транспозиций, в то время как количество транскрипта copia в 2ЬЗ-В вдвое выше, чем в 2ЬЗ-С. Подобные несоответствия могут быть вызваны тем, что в близкородственных сублиниях 2Ы, 2ЬЗ-А, 2ЬЗ-В и 2ЬЗ-С генетический фон может несколько отличаться за счет накопления мутаций, часть из которых может оказывать влияние на экспрессию copia.

Частоты транспозиций copia у особей разного возраста. Частоты транспозиций измеряли раздельно в гаметах самцов разного возраста линии 2ЬЗ-А (1996 г.), в семи возрастных группах: у 0-3, 4-7, 8-11, 12-15, 16-19, 20-23 и 24-27 дневных самцов. Измерения были проведены у 27 самцов разного возраста, причем для части самцов частота транспозиций была прослежена в нескольких возрастных группах. В каждой возрастной группе было проанализировано от 6 до 13 самцов. Анализ 545 личинок выявил 432 транспозиции copia. Средняя частота транспозиций составила 0.79±0.0б инсерций на гамету за поколение.

0-3 4-7 8-11 12-15 16-19 20-23 Возраст в днях

Рисунок 4.Частота транспозиций copia у самцов разного возраста сублинни 2ЬЗ-А.

Было обнаружено достоверное (по первому порогу) влияние возраста самцов на частоту транспозиций copia (рис.4), причем максимальная транспозиционная

0.6

активность была отмечена у самых молодых и самых старых самцов (1.09±0.2 и 1.17+0.23 у 0-3 и 24-27 дневных самцов соответственно), а минимальная (0.36±0 07) у самцов среднего возраста (12-15 дневных).

Поскольку частота транспозиций copia меняется с возрастом, можно предположить, что физиологическое состояние организма может модифицировать частоту транспозиций ретротранспозонов. Существование такой регуляции косвенно подтверждается тем, что большинство ретротранспозонов содержит те или иные регуляторные последовательности, с которыми взаимодействуют белки клетки-хозяина.

Корреляция между частотой транспозиций

и количеством транскрипта copia в семенниках

самцов разного возраста сублинии 2ЬЗ-А.

Чтобы исключить влняние различий

генетического фона разных, хотя и

близкородственных сублиний на экспрессию

copia и более точно изучить взаимосвязь

между частотой транспозиций и обилием

транскрипта copia, было использовано

описанное в данной работе различие частот

транспозиций copia у самцов разного возраста.

Количество РНК copia измеряли в

семенниках 0-3, 12-15 и 24-27 дневных самцов

в четырех независимых экспериментах. У 12-

Рисунок 5. Сравнение количества 15 дневных самцов количество РНК copia

транскрипта copia в семенниках 6ыло досговерно меньшим чем у м дневных самцов трех различных возрастов.

Количество транскрипта copia в 12-15 и 24-27 дневных самцов (соответственно,

дневном возрасте принято за единицу. t p<Q Q5 и ^ р<0 Q5) ( 5) Таким Вертикальной чертой обозначен 95%

доверительный интервал, образом, в этом эксперименте, свободном от

Расположение дорожек на автографе , л „„

^ v т влияния разницы в генетическом фоне, частота

совпадает с диаграммой.

транспозиций и количество РНК copia в

« -И

а

2 3,5 se

S % 3

аэ

g 2.5

т S

ё 2

0

s ^

л

1 1

S

о

g 0,5 о

0

copia -гр49-

12-15 24-2?

возраст (дни)

семенниках самцов демонстрируют положительную корреляцию.

Преимущественная транскрипция ретротранспозона copia в семенниках. Ранее было показано, что в сублинии 2ЬЗ транспозиции copia наблюдаются только в генеративных тканях самцов, но не у самок (Pasyukova et al. 1997). Определение

относительных количеств РНК copia у

m 9

•а

о

" 8

о 7

ю

и

S в

s

С

S 5

и

о

5 4 с

I)

S з

W

о г

5 2 1

о

copia

гр49

сайки (2)

самф1(5) семенники(Ю)

самок и самцов, а также в генеративных тканях самцов сублинии 2ЬЗ с помощью northern blot гибридизации позволило заключить, что содержание транскрипта copia в семенниках самцов в четыре раза выше, чем в тканях самцов в целом и в семь раз больше, чем в тканях самок (рис.6). Расчеты показывают, что на семенники приходится примерно 1020% общего содержания транскрипта copia в теле самца, тогда как эта ткань составляет не более 1-5% массы тела.

Межполовые различия в содержании транскрипта copia меньше различий в частотах транспозиций copia, составляющих 1.5-2 порядка.

Рисунок 6. Количество транскрипта copia в Можно предположить, что небольшие тотальной РНК самок, самцов и

семенников самцов линии 2ЬЗ-А. В скобках вариации в количестве транскрипта

указано количество повторносгей. copia могуг приводить к Содержание РНК copia у самок принято за

единицу. Вертикальной чертой обозначен значительным изменениям частоты

95% доверительный интервал. трансПозиций. Извесно, что

Расположение дорожек на автографе

совпадает с диаграммой. увеличение транскрипции

ретротранспозона дрожжей Ту1 в несколько раз приводит к стократному увеличению частоты транспозиций (Curcio and Garfmkel 1991). Действительно, зависимость между количеством транскрипта и частотой транспозиций может быть нелинейной, т.к скорость сборки вирусоподобных частиц, в которых происходит обратная транскрипция copia, являющаяся промежуточной стадией процесса транспозиций (Yoshioka et al. 1990), зависит от

концентрации не только PIEK copia, но также от концентрации gag и pol белков copia, количество которых в свою очередь определяется количеством транскрипта copia.

Специфическая экспрессия copia в семенниках определяется ЦКП ретроэлемента. Скрининг космидной библиотеки, полученной С.В.Нуждиным из сублинии 2ЬЗ, с помощью зонда copia позволил отобрать двенадцать клонов, содержащих последовательности copia в составе фрагментов геномного окружения размером 20-30 т.п.н. Для дальнейшего анализа была отобрана космида из района политенных хромосом 96D. Этот район не совпадал ни с одним из фиксированных сайтов copia в линии 2Ь, и, следовательно, содержал активную копию ретротранспозона, переместившегося туда в результате транспозиции. Остальные клоны, по-видимому, содержали гетерохроматические фрагменты генома. Проведенный рестриктный анализ показал, что космида содержала полноразмерную копию ретротранспозона copia. ДКП pi» copia из этой космиды был субклонирован в вектор

-ррш copia]—. для Р-зависимой трансформации эмбрионов

Drosophila melanogaster Casper-AUG-flgal (Thummel et al. 1988), содержащий репортерный ген lacZ (рис.7).

С помощью Р-зависимой трансформации эта

Рисунок 7. Репортерная конструкция была введена в сублинию w'2bl Было

конструкция JVKTl(copia)-lacZ. ,

г, _ получено четыре независимых трансформантна

Стрелками указаны концы Р

элемента, необходимые для рспортерной конструкцией PïCTl(copia)-lacZ. Кроме

трансформации эмбрионов. ,

того, эта же линия была трансформирована

вектором Casper-AUG-/^a/ (вектор без ДКП(серга)) для негативного контроля при сравнении экспрессии lacZ.

Уровень экспрессии /?-галактозидазы в семенниках был значительно выше, чем в яичниках и в слюнных железах личинок. Следовательно, половые и тканевые различия в количестве транскрипта copia обусловлены разной интенсивностью транскрипции copia, а не вариациями в стабильности транскрипта. Транскрипция copia действительно носит полоспецифический характер, причем полоспецифичность экспрессии определяется самим промотором, а не регуляторными последовательностями, локализованными вне ДКП copia.

Экспрессия рспортерной конструкции распределена но семеннику неравномерно. Максимум приходится на приапикальный район, однако в самом апексе экспрессия

отсутствует. По мере удаления от апекса интенсивность экспрессии постепенно убывает. Сходное распределение экспрессии copia было продемонстрировано с помощью гибридизации in situ с РНК тканей семенников (Pasyukova et al, 1997), показавшей, что максимальное количество транскрипта copia локализуется в части семенника, прилежащей к апексу, а в самом апексе, где находятся стволовые клетки, количество РНК copia невелико. Совпадение распределения полноразмерного транскрипта copia и паттерна экспрессии репортерной конструкции, содержащей лишь ДКП copia, является дополнительным подтверждением того, что специфическая регуляция экспрессии copia в семенниках осуществляется в основном на уровне промотора и последовательностей, лежащих внутри ДКП. Интересно, что подобная же локализация транскрипта в семенниках показана для ретротранспозона 1731 (Peronnet, 1996), что позволяет предположить, что такой паттерн экспрессии характерен и для других со/м'д-подобных ретротранспозонов Drosophila melanogaster.

Рисунок 8. Окраска генеративных тканей мух, трансформированных репортерной конструкцией ДКП(copia)-lacZ, па /?-галактозидазу. А) семенник Б) яичник.

Секвенирование активно перемещающейся copia из нестабильной линии 2Ь. ДКП copia содержит промотор, а в прилегающем к нему нетранслируемом районе обнаружены энхансер и сайты связывания гомеобелков (Cavarec and Heidman, 1993). Природа нестабильности copia в линии 2Ь неясна. Поскольку, как было показано выше, повышенная частота транспозиций copia в линии 2Ъ коррелирует с повышенным уровнем транскрипции copia в генеративных тканях самцов, можно предположить, что избыток транскрипта вызван усиливающей транскрипцию мутацией, в регуляторном районе активно перемещающегося элемента copia. Поэтому было проведено секвенирование 5'-концевого регуляторного района клонированной активной копии ретротранспозона copia из сублинии 2ЬЗ.

Секвенирование 5'ДКП copia и нетранслируемого района, прилегающего к ДКП вплоть до начала первой открытой рамки, показало, что последовательность

регуляторного района активно перемещающейся в сублинии 2ЬЗ copia практически идентична последовательности канонической copia. При сравнении отсеквенированного района с тремя разными copia из геномного банка (Mount and Rubin 1985; Emory et al 1985; Yoshioka et al 1985) было обнаружено одно единственное отличие между четырьмя последовательностями, заключающееся в нехватке в одном из клонов, взятых для сравнения (Yoshioka et al 1985), одного Т в блоке Т9 в последовательности района онхансера. Следует отметить, что регуляторный район copia, клонированной из гена whiteap"'"', имеет такую же последовательность, как регуляторный район copia, активно перемещающейся в сублинии 2ЬЗ. Транспозиции copia в линиях с мутацией white"'"'"'" не наблюдаются. Отсутствие отличий в регуляторной последовательности нестабильной copia опровергает предположение о том, что мутация в самой copia привела к возникновению нестабильности. По-видимому, нестабильность copia является результатом геномной мутации, регулирующей экспрессию copia.

Стадии гаметогенеза. на_которых происходят транспозиции copia.

Стадиеспецифичиость экспрессии copia была изучена как на уровне паттерна транскрипции в семенниках, так и на уровне транспозиционной активности copia по количеству «пучков» транспозиций и возрастной зависимости частоты транспозиций.

Обнаружение «пучков» транспозиций, т.е. нескольких гамет, несущих одну и ту же инсерцию, возникшую в результате одного транспозиционного события, говорит о премейотической природе транспозиций. Однако две гаметы, несущие одинаковые инсерции, могут также быть результатом двух независимых транспозиций в один и тот же цитологически неразличимый сайт. Доказательством того, что пучки действительно существуют, было бы достоверно большее количество транспозиций в один и тот же сайт одного и того же гомолога (сумма пучков и независимых транспозиций) по сравнению с числом транспозиций в одинаковый сайт разных гомологов (только независимые события). В процессе анализа было обнаружено 25 случаев транспозиций в одинаковые (не различающиеся цитологически) сайты. Из них 7 обнаруживались в разных гомологах и 18 в одном и том же гомологе. Сравнение с помощью х2 показало, что число транспозиций в один и тот же гомолог достоверно (Р<0.05) больше числа транспозиций в разные гомологи. Следовательно, можно утверждать, что пучки действительно имели место. Этот вывод подтверждается тем, что в одном из 18 случаев попадания в один и тот же гомолог, пучок состоял не из 2, а из 4 инсерций. Вероятность того, что этот пучок образовался в результате четырёх независимых

транспозиций, очень невелика. Таким образом, пучки транспозиций copia действительно имеют место и, следовательно, существенная часть транспозиций copia происходит на премейотических стадиях гаметогенеза.

Если транспозиции copia происходят в стволовых клетках, то с возрастом должно происходить постепенное накопление новых сайтов в делящихся стволовых клетках, приводящее к увеличению видимой частоты транспозиций у старых самцов. Однако, с 1 по 15 день частота транспозиций copia в сублинии 2ЬЗ снижается, а возрастание частоты транспозиций с 15 по 27 день можно объяснить увелтением количества транскрипта copia, а не накоплением инссрций в стволовых клетках. Следовательно, если транспозиции copia и происходят в стволовых клетках, то это достаточно редкое событие, и основная масса транспозиций происходит на более поздних стадиях гаметогенеза.

Таким образом, основная масса транспозиций copia происходит на премейотических стадиях, но не в стволовых клетках семенников. Это подтверждается распределением экспрессии /?-галактозидазы в семенниках мух, трансформированных репортерной конструкцией ДКП(сор;а)-1ас2 (рис.8-А): в апексе семенников, где располагаются стволовые клетки, экспрессия практически отсутствует, однако уже в приапикальной зоне наблюдается интенсивная экспрессия репортерной конструкции, причем по мере удаления от апекса интенсивность окраски падает.

Частоты транспозиций в сублиниях с различной копийностью copia. Саморыуляция частоты транспозиций регротранспозонов подразумевает обратную зависимость между числом инсерций ретротранспозона в геноме и транспозиционной активностью. Такой способ регуляции характерен для Р и I элементов и предполагается для ДКП содержащих регротранспозонов. С целью ответа на вопрос о характере связи между числом копий copia и частотой ее перемещений была измерена частота транспозиций copia в сублиниях с разным числом эухроматических копий на геном (N), а также у гибридов сублиний 2Ь1 и 2Ь3.1, имеющих промежуточную копийность. Всего в данном эксперименте локализация сайтов copia была проанализирована у 643 потомков 35 самцов, и было обнаружено 349 транспозиций. Максимальная частота транспозиций (1.5 транспозиции на гамету за поколение) была обнаружена в сублинии 2Ь3.1 с максимальным числом копий (N=79). Минимальная частота транспозиций (0.017 транспозиций на гамету за поколение) была обнаружена в сублинии 2Ы с минимальным числом копий (N=54). Частота транспозиций в сублинии 2b3-iso2, имеющей такую же копийность (N=54), достоверно не отличалась от частоты

транспозиций в сублинии 2Ы (0.028 транспозиций на гамету за поколение). В сублинии 2b3-isol с несколько большей копийностыо (N=58) частота транспозиций

оказалась выше (0.111

транспозиций на гамету за поколение), а в случае гибридов сублиний 2Ы и 2Ь3.1, имеющих более высокую копийность (N=70) частота транспозиций также была более высокой (0.45 транспозиций на гамету за поколение).

Положительная корреляция между частотой транспозиций и числом копий copia (рис.9) была

достоверной

(i=0.98,

50 55 60 65 70 75 00 85 Число копий нэ диплоидный геном

Рисунок 9. Частоты транспозиций copia у самцов с различным числом копий на

диплоидный геном. Ромбами указаны Р<0.01), т.е. частота транспозиций индивидуальные самцы 4 сублиний 2Ь,

треугольными метками обозначены гибридные C0Pia возрастала с увеличением

самцы от скрещивания сублиний 2Ы и 2Ь3.1. копийносги. Этот факт

противоречит широко распространённым популяционно-генетическим моделям,

подразумевающим обратную зависимость между копийностью и частотой

транспозиций, и ставит под сомнение корректность моделей, базирующихся на

предположении о саморегуляции транспозиций ретротрачспозонов

Выводы.

1) В линии 2b Drosophila melanogaster частота транспозиций ретротранспозона copia положительно коррелирует с количеством транскрипта copia. Частота транспозиций и количество транскрипта согласованно меняются с возрастом.

2) Регулягорные элементы длинного концевого повтора (ДКП) copia определяют специфичность транскрипции copia в семенниках.

3) Повышенная экспрессия copia в линии 2Ь не является результатом мутации в регуляторном районе copia (в ДКП и нетранслируемой области тела).

4) Транспозиции copia происходят на премейотических стадиях сперматогенеза, причем интенсивность экспрессии copia незначительна в стволовых клетках семенников и высока в сперматогониях.

5) Показано, что с увеличением числа инсерций copia в геноме частота

транспозиций copia возрастает, что противоречит распространённым популяционно-

генетическим моделям, предполагающим существование саморегуляции транспозиций

ретротранспозонов по типу обратной связи.

список публикаций по теме диссертации.

1) Филатов Д.А. и Е.Г.Пасюкова, Корреляция между числом сайтов, количеством транскрипта и частотой транспозиций реггротранспозона copia у Drosophila melanogaster. Генетика. 1998. Т. 34. № 3. Стр. 1-4.

2) Филатов Д А. и Е.Г.Пасюкова, Преимущественная транскрипция ретротранспозона copia в скитниках. Drosophila melanogaster. Молекулярная биология, в печати.

3) Filatov D.A., T.V.Morozova and E.G.Pasyukova, Age-dependent copia transposition rate is positively associated with copia transcript abundance in a Drosophila melanogaster inbred line. Mol.Gen.Genet., in press.

4) Pasyukova E.G., S.V.Nuzhdin and D.A.Filatov, The relationship between the rate of transposition and transposable element copy number for copia, Doc and roo retrotransposons. Genet.Res., submitted.

5) Пасюкова Е.Г. и Д.А.Филатов, Генетический анализ факторов, контролирующих частоту транспозиций ретротранспозона copia в изогенной линии Drosophila melanogaster. Генетика, т.ЗО (доп.), стр. 117, 1994.

6) Filatov D A. Transpositions of the retrotransposon copia are age-dependent., The materials of 37 Annual Drosophila research conference. San-Diego, 1996

7) Nuzhdin S.V., E.G. Pasyukova, D.A. Filatov and T.F.C. Mackay, Accumulation of transposable elements in laboratory lines of Drosophila melanogaster. The materials of the conference «Evolution and role of transposable elements», Gif-sur-Yvette, 1996.