Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Термодинамические и структурные аспекты связывания белками ионов металлов

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Термодинамические и структурные аспекты связывания белками ионов металлов"

1:: -м •"*'

На правах рукописи

Вепринцев Дмитрий Борисович

Термодинамические и структурные аспекты связывания белками ионов металлов

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

03.00.02-биофизика

Пущино - 1997

Работа выполнена в Институте теоретической и экспериментальной биофизики РАН, Институте биологического приборостроения РАН и на химическом и ветеринарном факультах Университета штата Огайо, США (Ohio State University, Columbus, ОН).

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор Е.А.Пермяков

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Д.И. Левицкий кандидат физико-математических наук, В.Н. Уверский

Ведущая организация:

Биологический факультет МГУ им. М.В. Ломоносова, г. Москва.

Защита диссертации состоится _

часов на заседании Диссертационного совета Д 200.22.01 в Институте теоретической и экспериментальной биофизики РАН по адресу: Московская область, г. Пущино, ИТЭБ РАН.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИТЭБ РАН. Автореферат разослан

Ученый секретарь Диссертационного совета, Л 4 6

кандидат биологических наук 1с1ССИи ^ Нелипович

ктуалыюсть темы.

Ионы металлов играют огромную роль во многих биологических процессах, таких ак мышечное сокращение, тромбообразование, функционирование гемоглобина, отосинтетического комплекса растений, гормональные ответы, синтез ДНК, и т.д. Металлы огутбыть внутриклеточными мессенджерами, работать в активном центре ферментов, частвовать в связывании субстратов реакции или образовании комплексов белковых олекул. В большинстве случаев ионы металлов участвуют в функционировании иологических систем, связываясь белками и модулируя тем самым их свойства. Очень ногие белки являются металл-связывающими белками, и количество белков, ринадлежащих к этому классу, растет с каждым годом. Несмотря на обилие известных еталл-связывающих белков и довольно подробную информацию об их структуре и зойствах, многие важные детали влияния связывания ионов металлов на структуру и юйства белков все еще неизвестны.

[ели и задачи исследовании.

Цель данной работы состояла в исследовании некоторых важных деталей мимодействия катионов металлов с белками и попытке сформулировать принципы, пределяющие влияние ионов металлов на структуру и стабильность молекулы белка на римере а-лактальбумина.

В задачи исследования входило:

1) исследование деталей механизма связывания кальция а-лактальбумином, с использованием белков, содержащих точечные мутации в центре связывания кальция;

2) детальное исследование тепловой денатурации а-лактальбумина и влияния на нее ионов кальция;

3) исследование и идентификация других металл-связывающих центров а-лактальбумина, на примере взаимодействия ионов свинца и ртути с а-лактальбумкном, и влияния связывания этих катионов металлов на структуру и стабильность а-лактальбумина.

ау»шая новизна и значимость работы.

В работе детально исследован процесс денатурации апо-формы а-лактальбумина (а-А), и показано существование не обнаруженного ранее промежуточного состояния белковой олекулы, по своим свойствам промежуточного между нативным состоянием и состоянием оплавленной глобулы. Показана идентичность структуры нативной формы белка в ano- и

кальций-насытенном состоянии, а также идентичность денатурированных теплом ano- и кальций-насыщенной форм.

Впервые исследовано взаимодействие ano- и кальций-насышенной форм а-ЛА с ионами свинца и ртути, токсичными катионами металлов. Определены константы и стехиометрия связывания, выяснено влияние связывания ионов на структуру молекулы а-ЛА. На основе собственных н полученных другими исследователями данных предложена схема металл-связывающих центров молекулы а-ЛА, a также механизм влияния заполнения этих центров на структуру молекулы белка.

Практическая ценность работы.

В процессе работы для решения поставленных в настоящем исследовании задач был сконструирован автоматический спектрофлуориметр для изучения белковой флуоресценции на базе описанного ранее (Burstein et al. 1973). Разработан прибор - компьютерный рН-метр, который запускается в серию на базе ИБП РАН. Разработаны прецизионные титраторы, управляемые компьютером. Все это представляет безусловный интерес для экспериментаторов.

Разработан набор компьютерных программ Fluo (DOS) и FluoMan (Win95) для обработки данных белковой флуоресценции, активно используемый в нашей и взаимодействующих с нами лабораториях.

Данные по связыванию а-ЛА ионов свинца и ртутн могут быть полезны в выяснении механизма токсического действия ионов тяжелых металлов.

Апробация работы.

Материалы исследований опубликованы в 4 научных статьях, а также представлялись на 5 конференциях. Програмное обеспечение, разработанное для анализа флуоресцентных данных, используется в нескольких лабораториях и доступно для использования всеми желающими (http://fluor.iteb.serpukhov.su/dmitry/fluo/).

Структура и объем диссертации.

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, раздела по материалам и методам, экспериментальной части, обсуждения результатов, выводов и списка цитируемой

литературы. Диссетация содержит_страниц,_рисунков и библиографический

список из_ссылок.

КРАТКИЙ ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

(X-JIA- это небольшой глобулярный белок с молекулярным весом 14,2 кД, состоящий з 123 аминокислотных остатков. Его функциональная роль - модификация фермента шактозилтрансферазы, который в норме катализирует перенос D-галактозильных групп DP-галактозы на N-ацетилглюкозоамин (Ленинджер, 1985). В лактирующей же молочной елезе млекопитающих (Hill & Brew, 1975) UDP-галактоза играет роль предшественника в кнтезе лактозы. Ассоциация a-JIA с галактозилтрансферазой ведет к смене специфичности ермента и переносу D-галактозильных групп UDP-галактозы на D-глюкозу и синтезу актозы.

(Х-ЛА имеет один Са2+-связывающий центр (Permyakov et al. 1981b; Hiraoka et al. 980b), также связывающий Mg2*, Na+, K+, Mn2* (Пермяков и др., 1982) (Hiraoka & Sugai, 984; Desmet et al. 1989; Desmetet al. 1991; Permyakov et al. 1981; Permyakov & Kreimer, 1986), по крайней мере ещё один 7пг+-связывающий центр (Murakami & Berliner, 1983; Permyakov I al. 1991; Ren et al. 1993). Обнаружено также взаимодействие ионов Cd2t (Desmet et al. 991a), Co2+(Permyakov & Berliner, 1994) и Cu2+ (Tieghem et al. 1991a; Tieghem et al. 1991a;

ermyakov et al. 1988a) с молекулой (Х-ЛА Связывание иона Ca2* существенно повышает

габильность (Х-ЛА (Kuwajima et al. 1986; Ikeguchi etal. 1986; Permyakov et al. 1985; Dolgikh

о о

tal. 1981): середина теплового перехода сдвигается о 30 С до 60-70 С, а середина перехода ри денатурации мочевиной сдвигается с 3.5 до 5.5 М. Обратный эффект на стабильность

альций-насыщенного Ct-ЛА оказывают ионы цинка (Murakami & Berliner, 1983). Связывание этих ионов вызывает образование «апо-подобного» состояния. Медь и кобальт ызывают аналогичные эффекты. Показано что Ми2' связывается как кальциевым, так и инковым центрами (Lindaiii & Vogel, 1984). Согласно данным по переносу энергии озбуждения между ионом лантанида в кальциевом центре и кобальта в цинковом оба центра югутбыть заняты одновременно (Permyakov & Berliner, 1994; Musci & Berliner, 1986; Musci

: Berliner, 1985). Исследование связывания ионов цинка флуорометрическим методом Ct-ЛА Permyakov et al. 1991) показало наличие нескольких центров связывания цинка (для самого

ильного центра K„S=5X105 М"1) заполняющихся последовательно, причем насыщение ильного центра не сказывается на параметрах собственной флуоресценции белка, но снижает ермостабильность и уменьшает константу связывания бис-АНС. Дальнейшее увеличение

онцентрации цинка приводит к дестабилизации и агрегации СХ-ЛА. По данным ИК пектроскопии (Prestrelski et al. 1991) и рентгено-структурного анализа (Ren et al. 1993), вязывание иона цинка сильным центром не приводит к существенному изменению

конформацин белка.

Интересной и важной особенностью молекулы (Х-ЛА является её переход в состоянш «расплавленной глобулы» (Гильманшин и др., 1982XOhgushi & Wada, 1983; Dolgikh et al. 1981). Это состояние характеризуется как компактное, сохранившее вторичную структуру, но практически полностью потерявшее нативную третичную структуру. Классическим npHMepoN

«расплавленной глобулы» является молекула ОС-ЛА при кислых значениях pH (Nozaka et al. 1978; Kuwajima et al. 1976). Это состояние может быть получено также в результате тепловой денатурации (Dolgikh et al. 1981) и денатурации под действием умеренных концентраций денатурантов, таких как мочевина или Gnd-HCl (tkeguchi et al. 1986) при нейтральных pH. Предполагается, что «расплавленная глобула» является интермедиатом при сворачивании белка (Kuwajima et al. 1993; Kuwajima, 1989; Kuwajima, 1977). Более того, подобное состояние зарегистрировано для большого количества белков, и его наличие является скорее правилом, чем исключением (Ptitsyn & Uversky, 1994).

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

Использованные реактивы.

Коровий Ct-ЛА, использованный для КД-исследований температурной стабильности,

был приобретен у фирмы Sigma, лот 128F-8140. Человеческий СХ-ЛА, использованный в данной работе, был выделен по методике Капланаса и Антанавичюса (1975) доктором Л.П.Калиниченко (ИТЭБ РАН). Бис-АНС был приобретен у фирмы Molecular Probes, Oregon, USA. Sephadex G-25 фирмы Pharmacia. ЭГТА, ЭДТА, ХЕПЕС, Трис, глицин- были куплены у фирмы Sigma Chemical Со. Ацетат свинца и ацетат ртути- были от фирмы Mallinckrodt Chem. Works, St. Louis, MO.

Общие процедуры.

Все растворы были приготовлены на дистиллированной деионизованной (пропущенной через ионообменную колонку со смолой Elgostat Deioniser Type 810, UK) воде, с удельным сопротивлением > 2Мом*см. Пластиковая посуда была использована во всех случаях, когда концентрация кальция в растворе была критична для измерений.

Концентрация белка определялась спектрофотометрически, с использованием следующих коэффициентов эксгинкции: E(i%)28o=20.1 (Kronman & Andreotti, 1964) для

коровьего и 18.2 (Nozaka et al. 1978) для человеческого СС-ЛА. Молекулярную массу белка полагали равной 14200 Да,

Очистку Ct-ЛА от Саг* проводили по методике, описанной Блюм с соавт. (Blum et al. 977). Остаточную концентрацию кальция определяли по данным контрольного пектрофлуорнметрического титрования расгговора белка кальцием и ЭГТА.

Ьмерсше кругового дихроизма.

Исследования КД были выполнены на спектрополяриметре JARCO-500C при корости сканирования 200 нм/мин и постоянной времени 0.25 сек, причем каждый спектр среднён из 16 повторных спектров. Полученные данные были использованы без альнейшего сглаживания. Из всех спектров вычтен спектр буфера. Молярная эллиптичность елка была рассчитана на один аминокислотный остаток.

Дифференциальная сканирующая калориметрия.

Измерения избыточной теплоемкости были проведены на микрокалориметре ДАСМ-М (Институт Биологического Приборострения РАН, Пущино, Россия), при скорости каиирования 0.5 и 1 К/мин. Данные накапливались на компьютере и сглаживались. Из ривых теплоемкости была вычтена базовая линия калориметра. Теплоемкость белка была асчитана как

Q>«cj»a= (Ср К» enea

те Мбуф = Мбиж.*Vn^u (Ята'плотность буфера, Míel(a=C6™*V„tat

Чувствительность прибора определялась по высоте калибровочной метки. Обьем чеек калориметра был измерен теплофизическим (по разнице скоростей прогрева пустых и шолненных водой камер) способом и практически соответствовал объему, отсекаемому ;пловым экраном. В качестве теплоемкости и плотности буфера были использованы ;плоемкость и плотность воды. Парциальный объем белка был взят 0.709 см3/гр (Griko ét al. Ж).

Концентрация белка в калориметрических измерениях была в диапозоне 1-3 мг/мл. змерения проводились в 10 мМ боратном буфере, рН 8.0, содержащим соответственно 1 мМ аС12 или 1 мМ ЭГТА.

змерение собственной флуоресценции белков.

Измерение флуоресценции проводилось на спектрофлуориметре Perkin Elmer LS-50B на установке лабораторного изготовления, описанной ранее (Permyakov et al. 1977; Burstein al. 1973). Заданную температуру образца поддерживали с помощью термостатированного оветодержателя и измеряли термопарой непосредственно в кювете.

В процессе работы установка была существенно модифицирована и полностью >мпьютеризирована: автоматическая развертка спектра, разработано новое

термостатированное юоветное отделение с элементом Пельтъе, электромагнитный привод шторок, прецизионные титратор и 2х-канальный рН-титратор, магнитная мешалка. Это позволило полностью автоматизировать типичные эксперименты по титрованию и измерению температурной зависимости флуоресценции.

Типичная концентрация белка при флуоресцентных измерениях была в диапазоне 10'б-2*Ю"3 М. Во всех случаях использовали кварцевые кюветы с длиной оптического пути 1 см. Спектры собственной флуоресценции белка регистрировали в диапазоне 300-400 нм при возбуждении в области 280 нм или 296 нм.

Исследование зависимости флуоресценции от концентрации лиганда (ионов металла' проводили путем небольших (1-10 мкл) добавок сток-растворов лиганда при постоянной температуре.

При исследовании температурной зависимости кювету герметизировали для предотвращения испарения и, соответственно, изменения концентрации образца во время эксперимента.

Изменение флуоресценции белка за счет тепловой денатурации происходит на фоне температурного тушения флуоресценции растворителем и соседними группами (Бурштейн, 1977), и этот факт необходимо учитывать при анализе данных. Используемый в данной работе метод анализа температурной зависимости флуоресценции белка базируется на том, что в отсутствии переходов температурное тушение флуоресценции белка (триптофанов) является диффузионно лимитируемым процессом и, соответственно, его эффективность прямо пропорциональна T/h (h - вязкость растворителя при данной температуре). В координатах 1/F от T/h (где F - интенсивность флуоресценции при выбранной длине волны, Т- абсолютная температура и h - вязкость растворителя при данной температуре) эта зависимость линейна (Bushueva et al. 1980; Bushueva et al. 1978). Анализ проводился с помощью программы FLUO, основанной на методе, описанным Пермяковым (1993).

Равновесные параметры связывания ионов металлов с белками определяли из данных, полученных методом спектрофлуориметрического титрования (Permyakov et al. 1980' [Пермяков Е.А., 1993] путем варьирования параметров теоретической модели, используя метод Маркуардта (Marquardt, 1963) с помощью программы FLUO.

Исследование pH-зависимостей флуоресценции проводили путем добавления маленьких (1-4 мкл) аликвот концентрированной кислоты или щелочи в кювету с образцом.

Методы молекулярной биологии.

Плазмида дикого типа (w.t. СС-ЛА) была создана Т. Андерсон (Anderson et al. 1997;

Anderson, 1996) на основе гена коровьего Ot-ЛА, выделенного из молочной железы коровы, встроенной в РТ7-7(+) вектор, содержащий fl ориджмн репликации (подарок Stan Tabor,

h.D., Harvard School of Medicine). Большая часть рекомбинантных белков, использованных в анной работе, также была выделена Т. Андерсон.

Ферменты рестрикции. Tag полимераза, полинуклеотидкиназа Т4 ДНК лигаза были шрм Boehringer Mannheim, New England Biolabs и Gibco BRL. R408 хелпер-фаг бьит фирмы 'romega, Inc. сДНК cycle-kit был фирмы Invitrogen, Inc. Триптон и дрожжевой экстракт были )ирмы Difco, Inc (Detroit,MI). Праймеры были синтезированы фирмами Oligos, Etc. Wilsonville, OR), Genosys (The Woodlands, TX) или Integrated DNA Technologies (Coralville, А) и использованы без дальнейшей очистки. Набор для секвенирования ДНК был фирмы Jnited States Biochemicals.

Направленный мутагенез был проведен с использованием одноцепочечной урацил-.•одержащей ДНК по методике Кункеля (Kunkel et al. 1991) с использованием урацил-

:одержащей одноцепочечной ДНК (ssDN A) w.t. (X-LA плазмиды.

Для конструтрования праймеров использовались программы CMUTANT [OligoMutantMaker, ver. 1.0, Beadles, К., Canter, D., Berk, А.) и GCG-sofVware (University of Winsconsin, Madison, WI).

Плазмиды, содержащие мутантный ген (Х-ЛА, были трансформированы в компетентные клетки Е. coli линии BL21(DE3). Экспрессию белка инициировали

добавлением 1 мл 0.4 М раствора IPTG (isopropyl ß-D-thiogalactopyranoside). Экспрессию и очистку белка проводили как описано в работе (Anderson, 1996). Полученный белок

о

лиофилизировалн и хранили в морозильной камере (-18 С).

41

3-

U

& 2-

и 1-

0-

А

О 20 40 60 80

J -100 1 -200-1

Ф

Ъ-300-R

-400 345

V

в

20 40 60 SO

f 3401 335 g

1 330"

" 325

Ою

<J- i

%

°с

-700 -600 -500 400 300

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ.

Исследование денатурационных переходов апо-формы а-лактальбумина.

На Рис. 1 представлены результаты экпериментов по тепловой денатурации коровьего а-ЛА, наблюдаемой методами сканирующей калориметрии, КД и собственной флуоресценции белка. Результаты экспериментов с а-ЛА человека аналогичны и не показаны для экономии места.

Денатурационный переход регистрируется всеми примененными методами, в отличии отданных Ютани с соавт. (Yutani et al. 1992). При сравнении степеней завершенности перехода, определенных различными методами (Рис. 2), видно, что положение середины перехода варьирует: 12-15 по КД, 20 по калориметрии,

о

и 29 С по флуоресценции. Это является доказательством существования промежуточного состояния, возникающего в процессе тепловой денатурации (Cantor & Schimmel, 1980). Практически такие же данные получены и для а-ЛА человека (данные не показаны).

Это промежуточное состояние характеризуется повышенной подвижностью хиральных остатков, что следует из уменьшения (по модулю) эллиптичности, но с другой стороны, доступность остатков триптофана растворителю (воде) близка к таковой для нативного состояния (по данным флуоресценции). В этих условиях денатурированным состоянием а-ЛА является состояние расплавленной глобулы (Dolgikh et

0 20 40 60 80 Temperature °С

Рис. 1. Температурная денатурация коровьего апо-а-лактальбумина исследованная методами (А) сканирующей калориметрии, [а-ЛА]-=1.75 mg/ml, прямые линии теплоемкости; нативного и денатурированного состояний; (В) кругового дихроизма, 0.4 mg/ml, эллиптичность при 270 им (•-апо-а-ЛА, ♦- Са2+-форма а-ЛА); и (С) собственной флуоресценции белка, 2.6 mg/ml, положение максимума (■) и интенсивность 350 nm (О).

Л. 1981).

Полученные данные позволяют федположить следующую модель денатурации 1-ЛА при нейтральных pH и низкой ионной силе. Лолекула а-ЛА набухает, давая вращательную :вободу хиральным остаткам. Этот процесс юпровождается гидратацией гидрофобных 1Статков (по данным калориметрии), но при этом >кружение остатков триптофана остается ■еполярным и не доступным растворителю (Тгр26 i Тгр104 принадлежат гидрофобному ядру юлекулы). На следующей стадии, триптофан-одержащее гидрофобное ядро становится менее ¡сестким, экспонируя отстатки триптофана гастворителю. При этом общая гидратация юлекулы изменяется несущественно и для громежуточного состояния близка к таковой для «сплавленной глобулы.

Данные других авторов по [сследованию тепловых денатурацинных [ереходов для а-ЛА (Vanderheeren & Hanssens, 994; Griko et al. 1994) хорошо согласуются с нашими, но различное положение этих [ереходов не было замечено ранее. Существование интермедиата между нативным остоянием и состоянием расплавленной глобулы также было предложено для кислотной ;енатурации по данным циркулярно-поляризованной флуоресценции (Gussakovsky & Haas, 995) и Рамйновской спектроскопии (Wilson et al. 1995).

Следует отметить, что зависимость теплоемкости от температуры одинакова как дя нативных, так и денатурированных форм а-ЛА в ano- и кальций-насыщенной формах, [анные КД подтверждают идентичность денатурированных форм. По данным шуоресцентной спектроскопии (фазовых графиков, данные не показаны), спектральные араметры нативных и денатурированных форм также одинаковы. Таким образом, можно твервдать, что структурно ano- и кальций-иасышенная формы, как нативные, так и енатурированные, эквивалентны.

-г-

20 40 60 80 Теш pe ra tu re, °С

Рис. 2. Степень завершенности перехода, рассчитанная по данным КД, (О- эллиптичность Са2+ формы а-ЛА как эллипт. "нативного" состояния; начальная эксп. точка как эллипт. "нативного" состояния); собственной флуоресценции белка, (□); и калориметрии, ( ■ ).

0

100 о

В -юо

О. ф

s -200

Е -300

-400

1 1

V - VU tv ¿-л

\ к ч ч f-"

\| /

V -/ г

250 260 270 280 290 300 310 320 nm

гг -5000 --

Е -10000

Исследование кальций-связывающих свойств мугантных а-ЛА.

Для выяснения роли отдельных остатков в координировании иона кальция (структура молекулы и кальциевого центра известна по данным рентгено-структурного анализа (Ren et al. 1993)), были получены мутанты а-ЛА с заменами отдельных остатков на аланины: К79А, D82A, D84A, D87A, D88A, D82-87-88A, M90V. M90V был получен в качестве контроля, так как этот мутант был использоан в качестве базового в лаборатории Brew (Grobler et al. 1994). В качестве критерия оценки нативности структуры мы использовали КД при 18°С, ImM СаС12, ЮтМ HEPES, рН 8.0. Как видно из данных на Рис. 3, не все рекомбинантные белки имеют нативную структуру. Белок дикого типа и D82A имееют спектральные свойства, схожие с нативным белком, ■тогда как D87A, D88A, D82-87-88A очевидно не имеют нативной структуры, спеюрально напоминая неупорядоченную белковую молекулу. В мутантах К79А и D84A замененные остатки участвуют в координации иона кальция кислородами основной цепи и поэтому мутации не должны влиять на связывание кальция. Эти мутанты тоже имеют нативно-подобную структуру.

Все к)утанты, имееющие нативную структуру, в присутствии кальция (ЮтМ HEPES, 1тМ СаС12, рН 8.0) демонстрируют денатурационный переход с серединой в области 55-

о о

63 С, что ниже, чем для нативного белка (70 С). Для апо-форм мугантных а-ЛА положение

-15000

200 210

220 230 nm

240 250

Рис. 3. Спектры КД нативной и мугантных форм а-ЛА в далеком (нижняя панель) и близком УФ. Сверху вниз: (D87A, D88A, D82-87-88А); M90V; (apo-native для нижней панели); (native, w.t., D82A).

герехода адекватно определить не удается, так как даже при температурах, близких к О С, эелок в основном находится в денатурированном состоянии. Такую дестабилизацию чолекулы белка можно объяснить термодинамическими эффектами мутаций - замена Зольшого полярно го остатка на маленький неполярный на поверхности белковой глобулы может снизить стабильность белка (вШйеуап!, 1994). Белки, не обладающие нативной структурой, не демонстрируют тепловых переходов и не связывают иоиы кальция.

Исследование связывания кальция затруднено малым количеством белка и, соответственно, трудностями получения апо-формы. Константы связывания (М-1),

о

определенные при 37 С, ЮшМ НЕРЕЭ, рН 8.0 по данным спектрофлуориметрического тирования представлены в таблице (с точностью до 0.5 порядка величины).

native w.t. К79А DS2A D84A M90V

3x107 4x106 3x10" 5x10' 2х105 5х106

Видно, что константа связывания кальция рекомбинантных белков примерно на порядок ниже, чем нативного белка в тех же условиях. Неожиданным результатом является то, что константа связявания для D82A равна константе для w.t., в то время как для D84A - на порядок ниже. Возможное объяснение этого факта заключается в том, что карбоксильная группа D84, не участвующая в координации иона кальция, образует водородную связь, необходимую для поддержания нативной структуры. Более низкая константа связывания для рекомбинантного белка дикого типа по сравнению с нативным белком может быть объяснена взаимодействием МеЮ (следствие экспрессии в прокариотах) с кальций-связывающей петлей. По данным рентгено-структурного анализа (Pike et al. 1996), MetO рекомбинантных a-JIA находится в непосредственной близости от кальций-связывающей петли и с учетом конформационной подвижности, может образовать водородную связь с остатками петли, нарушая ее нативную конформацию и приводя к снижению константы связывания.

Исследование связывания a-JIA ионов ртути и свинца.

Кривые титрования апо-ОС-ЛА ионами свинца представлены на Рис. 4. Кривая титрования состоит из двух участков. Первый участок (при [РЬ2+]/[а-ЛА]<4) характеризуется коротковолновым сдвигом максимума спектра и уменьшением квантового выхода

о

флуоресценции как при 10, так и при 37 С. Этот участок хорошо описывается простой одноцентровой схемой связывания

P+L <=> PL

-g E 400 §1

га ю 300^

<D CL > (Я ^ 200

10 20 30 40

10 20 30 40

340

£

i E 336-1 x c ra r-" E 8 332

2 '55

"G о 328

Ф "" сл 324

-'-1-1-г

10 20 30 40 [Pb2+]/[a-LA]

10 20 30 40 [Pb2+]/[a-LA]

Рис. 4 Титрования апо-(Х-ЛА (A,B) и Са2+-формы (C,D) ионами свинца при 10 С (□) и 37 С (О). А,С- площадь под спектром флуоресценции в относительных единицах, B,D- положение

максимума флуоресценции. 20 тМ Трис, рН 7.15, [0С-ЛА]=9.7 (J.M Возбуждение флуоресценции при 280 им.

и при подгонке дает КШ=2ХЮ6М"'. Связывание ионов свинца вызывает такие же изменение параметров флуоресценции, как и связываие ионов Са2+ (отражающие уменьшение подвижности полярного окружения остатков триптофана). Разумно предположить, что ионы РЬ2+ связываются сильным Са2+ центром. Отсутствие аналогичного участка на кривых

титрования Са2+-насыщенной формы С6-ЛА подтвеждает это предположение. Дальнейшее увеличение концентрации РЬ2+ приводит к сильному длинноволновому сдвигу и увеличению интенсивности (квантового выхода) флуоресценции. Эти измения флуоресценции сопровождаются сильной агрегацией белка. Интересно, что длинноволновый сдвиг и

о о

агрегация белка не проявляются в экспериментах при 10 С. Кривые титрования при 37 С описывагася схемой с двумя классами центров связывания:

P+L <=> PL+nL <==> PLn+r Подгонка дает значения K„=104 M'1 and n=3 для второго класса центров связывания на Рис. 4. Длинноволновый сдвиг положения максимума флуоресценции и сигмоидный характер кривой титрования (говорящий о кооперативном связывании), сопровождающийся

агрегацией белка, аналогичен эффектам, возникающим при титрованиии (Х-ЛА цинком или

медью. Можно сделать вывод о том, что слабые центры связывания свинца соответствуют

*

цинковым центрам. На кривых титрования Са3+-насыщенной формы СС-Л А ионами свинца участок, соответствующий насыщению сильного центра, отсутствует. Это является дополнительным аргументом в пользу идентификации сильного Ph2+ центра как Ca2* центра. Вторая группа центров связывания, насыщение которых вызывает длинноволновый сдвиг и

о

увеличение интенсивности (квантового выхода) флуоресценции, проявляется при 37 С, но не при 10°С.

При внимательном рассмотрении начальных участков кривых титрования видно существование еще одного центра связывания свинца, насыщение которого вызывает незначительный сдвиг положения максимума флуоресценции (Рис. 4В) и практически не изменяет квантовый выход флуоресценции. При связывании ионов цинка (Permyakov et al. 1991) также был идентифицирован сильный центр связывания, насыщение которого не

приводило к существенным изменениям параметров собственной флуоресценции (Х-ЛА. Этот центр был поставлен в соответствие (Permyakov & Berliner, 1994) цинковому центру связывания обнаруженному методом ренттено-структурного анализа (Ren et al. 1993). При использованных в экспериментах концентрациях кальция (1мМ) и свинца (<1мМ), с учетом разницы констант связывания на 2 порядка, кальций в кальциевом центре не может замещаться свинцом, и обнаруженный дополнительный сильный центр связывания свинца, по-видимому, соответствует сильному цинковому центру.

По данным спектрофлуориметрического рН-титрования, в центрах связывания меди имеются остатки гистидина (Permyakov et al. 1988). По данным КД-спектроскопии гистидины участвуют в координации ионов меди (Van Dael et al. 1992). pK боковой цепи гистидина 6.0 (6-7 в белках), тогда как рК боковых цепей аспарагиновой и глутаминовой кислот около 4.0 (Cantor & Schimmel, 1980). Поскольку координация катиона осуществляется не протонированным гисгидином, уменьшение pH до 4.3 сильно снижает сродство гистидин-содержащих центров, однако не сказывается на свойствах кислород-содержащих центров и

молекула ОС-ЛА находится в нативной конформации (Gussakovsky & Haas, 1995; Permyakov et

il. 1981). На Рис. 5 представлены кривые титрования Са2+-насыщенного (Х-ЛА ионами

о

:винца (37 С) при pH 4.3 (□) и 7.0 (О). На кривой титрования при pH 4.3 становится более

з 180

400

заметным связывание свинца дополнительным (сильным цинковым) центром и отсутствует длинноволновый сдвиг и увеличение интенсивности флуоресценции, соответствующие

насыщению слабых центров. При описании начального участка кривой титрования, соответствующего заполнению сильного цинкового центра (Рис. 5, □), одноцентровой схемой связывания

получается, что Ки,=9.3Х104 М'1. Слабые центры, по-видимому, практически не связывают при рН 4.3. Основываясь на такой рН завимости сродства слабых центров связывания, их однозначно можно идентифицировать как гистидин-содержащие центры. Поскольку в

человеческом ОС-ЛА только 2 остатка гистндина, оба они участвуют в формировании метал-связывающих центров.

На Рис. 6 представлены кривые

тирования (Х-ЛА ионами ртути. Связывание ртути приводит к уменьшению интенсивности и длинноволновому сдвигу максимума флуоресценции. Дальнейшее повышение концентрации ртути при рН 8.0 приводит к коротковолновому сдвигу флуоресценции, происходящему на фоне увеличения светорассеяния образца. Такой коротковолновый сдвиг флуоресценции и рост светорасеяния характерны для процессов агрегации белка. Хотя кривые титрования при рН 8.0 могут быть удовлетворительно описаны одним классом центров связывания, Р+пЬ ри рассмотрение фазовых графиков (не приведены) и зависимости положения

«326

400

[РЬ2+]/[а-1_А]

Рис. 5 Титрование Са -насыщенного (X

о

-ЛА ионами свинца при 37 С и рН 4.3 (ЮтМ глициновый буфер) или рН 7.0 (ЮтМ НЕРЕв). А- площадь под спектром флуоресценции в относительных единицах, В- положение максимума флуоресценции. (П)- рН 4.3 ([

а-ЛА]= з.1 (1М), (0)-рн го ([а

-ЛА]=3.9 |1М). Возбуждение флуоресценции при 280 им.

максимума спектра (Рис. 6В) предполагает наличие двух классов центров.

Р+Ь РЬ+пЬ РЬт,

Подгонка данных дает следующие значения параметров: К„,=5 X104 М"1, <„й=104 М"1 и п=3. Титрование при рН 4.3, в условиях, когда связывание ионов металлов "истидин-содержащими центрами конкурирует со связыванием протонов и поэтому гораздо

4'444

i Л

'Ц^Осо

А

О 20 40 60 80 100

344

0 20 40 60 80 100 [Hg2+]/[a-LA]

0 20 40 60 80

340 336 332 328 324

т—1—г 20 40 60 80

[ H g 2+]/[сх- L А]

Prie. 6 Титрования ano- (А,В) и Са^-насыщенного (C,D) (X-J1A ионами ртути. А,С- площадь тод спектром флуоресценции в относительных единицах, B,D- положение максимума

о

флуоресценции. 50 mM HEPES, рН 8.1 или 20 тМ глициновый буфер, рН 4.3. (О)-Ю С,

о о

рН 8.1 ([(Х-ЛА]= 3.8 (J.M); (ü>37 С, рН 8.1 ([а-ЛА]= 6.9 |iM); (Д)-36 С, рН 4.3 ([а-ЛА]= 4.1 (-1М). Возбуждение флуоресценции при 280 нм.

слабее, чем при pH 8.0, также четкс показывает наличие двух классов центров. Подгонка начального участка кривой титрования (Рис. 6А, Л) одноцентровой схемой

(5.2.1) дает K„si=3.3X10'1 М"1.

Повышении концентрации ртути,

как и при pH 8.0, вызывает

длинноволновый сдвиг и

дальнейшее уменьшение

интенсивности флуоресценции,

однако эти эффекты вызываются

гораздо большим избыком ртути.

Сильный центр связывания

ртути следует отнести к сильному

цинковому центру: нысыщение

этого центра практически не -ЛА, Были использованы координаты lHML(Ren

смещает положение максимума

etal. 1993), версия от 29 сентября 1994 г., из

флуоресценции, а снижение pH с

Protein Data Bank at Brookhaven National

8.0 до 4.3 не сказывается на

Laboratory (Bernstein et al. 1977), для

константе связывания, что

молекулярной графики была использована

предполагает координацию иона

программа RasMol v. 2.6b, (Sayle & Milner-White,

j jgj^ металла кислородными лигандами.

Слабые центры связывания однозначно идентифицируются как гистидин-содержащие. Насыщение

этих центров приводит к дестабилизации и агрегации (Х-ЛА.

Нами была исследована кинетика ассоциации (Х-ЛА с ионами ртути (данные не

показаны) при pH 8.0 и 4.3. При добавлении к раствору (Х-ЛА ртути до концентрации [Hg2+]/[

Ot-LA]=22:1 в обоих случаях имеется быстрая кинетика ассоциации, не разрешенная во времени (<2 сек) и приводящая к 10% снижению интенсивности флуоресценции. При pH 8.0 наблюдается медленная кинетика ассоциации либо конформационных изменений (возможно, агрегации), вызванных связыванием ионов ртути, причем кривая хорошо описывается суммой двух экспонент с временами 100 и 720 секунд, но не одной экспонентой. В экпериментах при pH 4.3 имеется быстрый начальный спад интенсивности флуоресценции,

Рис. 7 Схема металл-связывающих центров (X

о отсутсвуют дальнейшие медленные процессы. Эти данные также подтверждают уществование гнстиднн-содержащих центров, заполнение которых дестабилизирует

олекулу Ot-ЛА.

На Рис. 7 представлена предложенная схема металл-связывающих центров а-ЛА. [оны Са2+ и Zní+, идентифицированные в рентгеновской структуре, соответствуют сильным альциевому и цинковому центрам. His32 и Hísl 07 (и Glu68(His68)) участвуют в 5разовании слабых центров свызывания, насыщение которых приводит к дестабилизации олекулы а-ЛА. По-видимому, гистидины, находящиеся в гидрофобном ядре молекулы, частвуют в образовании ионных связей, стабилизирующих молекулу. Связывание ионов еталлов блокирует (конкурирует за) эти связи, и, таким образом, приводит к вворачиванию молекулы.

ОБСУЖДЕНИЕ

Для рассмотрения свзязывания ионов металлов белками мы предлагаем использовать тостую схему, описывающую денатурацию белка и связывание ионов металлов. Эта схема »ша применена ранее (Segawa & Sugai, 1983), атаюке (Permyakov et al. 1985) для описания ¡аимодействия ионов кальция и а-ЛА.

Р D

К\ Z 1К2

Р-Ме D-Me

и р - константы денатурации ano- и металл-связанной форм соответственно. К1 и К2 ->нстанты связывания ионов металла нативной и денатурированной формами ответственно. Константы денатурации можно определить из прямых экспериментов по татурации ano- и металл-связанной форм белка. В спектрофлуориметрическом титровании нсгически наблюдается процесс

(P+D) + Ме<- -»(P-Me+D-Me) Kapp=([P-Me]+[D-Me])/([P]+[D])=Kl*(l+P)/(l+a)

В случае денатурации апо-формы а-ЛА из-за дополнительного интермедиата, ¡наруженного нами, эту схему следует дополнить ano- и металл-связанной формами этого [термедиата. С практической точки зрения такое усложнение, однако, не оправдано, так как рмодинамические параметры интермедиата определить не удалось, а введение еще скольких переменных не позволит однозначно подогнать данные.

Справедливость этого подхода для взаимодействия кальция и а-ЛА была показана

ранее (Permyakov et al. 1985), где удалось определить термодинамические параметры связывания ионов кальция, магния, натрия и калия, и показано хорошее соответствие экспериментальной кривой тепловой денатурации белка при промежуточной концентрации кальция теоретически расчитанной кривой.

В настоящей работе показано, что в случае а-ЛА флуоресцентные свойства нативной и денатурированной апо- и кальций-насышенных форм одинаковы и в процессе денатурации фактически наблюдается переход

Р+Р-Ме «--»IHD-Me

и, соответственно, Kapp=([D]+[D-Me])/([P]+[P-Me]), или Карр=а»(1+К2*[Ме])/(1+К1»[Ме]). Очевидно, что если К1>К2 и [Ме]>0, то КаррСа, то есть денатурационное равновесие смещается в сторону нативного конформера. Аналогично, ври повышении концентрации катиона металла, равновесие будет смещаться в сторону конформера с большой константой связывания данного катиона.

ВЫВОДЫ

1) С помощью точечных мутантов а-ЛА К79А, D82A, D84A, D87A, D88A, D82-87-88A, M90V с мутациями в центре связывания кальция иследованы детали механизма связывания ионов кальция а-лактальбумином. Обнаружено, что мутанты D87A, D88A, D82-87-88A не имеют упорядоченной нативной структуры и не связывают кальций, в то время как мутанты D82A и D84A сохраняют структуру, близкую к нативной, хотя мутант D84A связывает кальцин, по меньшей мере, на порядок величины слабее рекомбинантного белка дикого типа.

2) Обнаружено связывание ионов свинца и ртути а-ЛА. Показано, что ионы свинца

связываются кальциевым центром а-ЛА с константой связывания 2 Х10б М'1, сильным цинковым центром с константантой 105 M'1, а также тремя слабыми цинковыми центрами с константами порядка 104 М"1. Показано также, что ионы ртути связываются сильным цинковым центром с константантой 5X1Q4 M"1, а также слабыми цинковыми центрами с константами порядка 104 М"1.

3) Исследовано влияние катионов металлов на тепловую денатурацию а-ЛА и его мутантов. У мутантов D87A, D88A, D82-87-88A, не обладающих упорядоченной нативной структурой, теплового перехода не обнаружено. В присутствии ионов кальция, у мутантов К79А, D82A, D84A, M90V, а также у белка дикого типа тепловой переход

о о

сдвинут в область 55-63 С, что ниже, чем для нативного белка (70 С). Ало-формы рекомбинантных белков также демонстрируют меньшую термостабильность, чем

о

нативный белок, и при 4 С равновесие сдвинуто в сторону денатурированного состояния.

Связывание катионов свинца кальциевым центром а-ЛА приводит к увеличению

термостабилыюсти белка, тогда как заполнение цинковых центров при дальнейшем

1

повышении концентрации свинца приводит к уменьшению термостабильности белка. Связывание катионов ртути также приводит к уменьшению термостабильности белка.

♦) На основе полученных данных, а также данных других исследователей, предложена

схема металл-связывающих центров а-ЛА, включающая в себя идентифицированные по данным рентгено-структурного анализа кальциевый и цинковый центры, и дополнительные "слабые цинк-связывающие" центры, содержащие в качестве одного из лигандов ионов металла остаток гистидина. Эти центры связывают ряд катионов металлов (Zn2*, Cu2+, Mn2*, Hg2+, Pb2* и т.д.), насыщение которых приводит к дестабилизации молекулы а-ЛА.

5) В ходе тепловой денатурации апо-а-ЛА обнаружено наличие промежуточного состояния белка, по своим свойствам промежуточное между нативным и денатурированным (состоянием расплавленной глобулы в данном случае) состояниеми. Оно характеризуется вращательной подвижностью хиральиых остатков, свойственной денатурированному состоянию, но доступностью остатков триптофана, свойственной нативному состоянию. Общая гидратация молекулы для промежуточного состояния близка к таковой для расплавленной глобулы.

6) Показана эквивалентность нативных форм апо- и Са2+-насышенного а-ЛА То же самое верно и для денатурированных теплом апо- и Са2*-насыщеиного а-ЛА.

7) Данные по тепловой денатурации а-ЛА рассмотрены с точки зрения схемы связывания катионов металлов как нативным, так и денатурированным конформером. Сделан вывод о том, что связывание катионов металлов белками не приводит к существенному изменению структуры молекулы, но вызывает сдвиг существующего равновесия в сторону конформера с большей константой связывания этого катиона.

СПИСОК ЦИТИРОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ.

Бурштейн Э. А. Собственная люминесценция белка (природа и применение). Итоги науки и техники. Биофизика. Москва: ВИНИТИ, 1977, т. 7, с. 1-187.

Ленинджер А. Основы биохимии, Москва: Мир, 1985.

Пермяков Е.А. Кальцийсвязывающие белки, Москва: Наука, 1993.

Anderson, P.J. (1996) PhD dissertation, Ohio State University, Columbus, OH, USA 1-210.

Anderson, P.J., Brooks, C.L., & Berliner, L.J. (1997) Biochemistry 36,11648-11654.

Bemstein, F.C., Koetzle, T.F., Williams, G.J.B., Meyer, E.F., Jr., Brice, M.D., Rodgers, J.R., Kennard, O., Shimanouehi, T., & Tasumi, M. (1977) J. Mol. Biol. 112, 535-542.

Blum, H.E., Lehky, P., Kohler, L., Stein, E.A., & Fisher, E.H. (1977)7. Biol. Chem. 252,2834-

2838.

Burstein, E.A., Vedenkina, N.S., & Ivkova, M.N. (1973) Photochem. Photobiol. 18, 263-279. Bushueva, E.P., Busel, E.P., & Burstein, E.A. (191%) Biochim. Biophys. Acta 534, 141-152. Bushueva, E.P., Busel, E.P., & Burstein, E.A. (1980)Arch. Biochem. Biophys. 204, 161-166. Cantor, C.R. & Schimmel, P.R. (1980) in Biophysical Chemistry, W.H.Freeman and company, San Francisco.

Desmet, J„ Vandael, H., Van Cauwelaert, F., Nitta, K., & Sugai, S. (1989) J. Inorg. Biochem. 37, 185-191.

Desmet, J., Haezebrouck, P., & Van Cauwelaert, F. (1991a) J. Inorg. Biochem. 42,139-145. Desmet, J., Tieghem, E., Van Dael, H., & Van Cauwelaert, F. (1991b)£w. Biophys. J. 20, 263-268. Dolgikh, D.A., Gilmanshin, R.I., Brazhnikov, E.V., Bychkova, V.E., Semisotnov, G.V., Venyaminov,

S.Y., & Ptitsyn, O.B. (19%\) FEBS Lett. 136, 311-315. Griko, Y.V., Freire, E„ & Privalov, P.L. (1994) Biochemistry 33, 1889-1899. Grobler, J.A-, Wang, M„ Pike, A.C., & Brew, K. (1994) J. Biol. Chem. 269, 5106-5114. Gussakovsky, E.E. & Haas, E. (1995) Protein Sei. 4, 2319-2326. Hill, R.L. & Brew, K. (1975) Adv. Enzymol. 43, 411-490.

Hiraoka, Y., Segawa, T., Kuwajima, K., Sugai, S., & Murai, N. (1980) Biochem. Biophys. Res.

Commun. 95, 1098-1104. Hiraoka, Y. & Sugai, S. (1984) Int. J. Peptide Protein Res. 23, 535-542. Ikeguchi, M., Kuwajimt, K., & Sugai, S. (1986) J. Biochem. 99, 1191-1201. Kronman, M.J. & Andreotti, R.E. (1964)Biochemistry 3, 1145-1151. Kunkel, T.A., Bebenek, K., & McClaiy, J. (1991) Methods Enzymol. 204, 125-139. Kuwajima, K., Nitta, K., Yoneyama, M., & Sugai, S. (1976) J. Mol. Biol. 106,359-373. Kuwajima, K. (1977) J. Mol. Biol. 114,241-258.

Kuwajima, K., Harushima, Y„ & Sugai, S. (1986) Int. J. Peptide Protein Res. 27, 18-27. Kuwajima, K. (1989) Protein-Struct. Fu.nct. Genet. 6, 87-103.

Kuwajima, K„ Semisotnov, G.V., Finkelstein, A.V., Sugai, S., & Ptitsyn, O.B. (1993) FEBSLett. 334,265-268.

Lindahl, L. & Vogel, H.J. (19Z4) Anal. Biochem. 140,394-402.

Marquardt, D.W. (1963)/. Soc. Indust. Appl. Math. //,431-441.

Murakami, K. & Berliner, L.J. (1983) Biochemistry 22, 3370-3374.

Musci, G. & Berliner, L.J. (1985) Biochemistry 24,3852-3856.

Musci, G. & Berliner, L.J. (19K6) Biochemistry 25, 4887-4891.

Nozaka, M., Kuwajima, K., Nitta, K., & Sugai, S. (1978) Biochemistry 17,3753-3758.

Ohgushi, M. & Wada, A. (1983) FEBS Lett. 164,21-24.

Permyakov, E.A., Burstein, E.A., Sawada, Y., & Yamazaki, I. (1977) Biochim. Biophys. Acta 491,

149-154.

ermyakov, E.A, Yarmolenko, V.V., Emelyanenko, V.l., Burstein, E.A, Closset, J., & Gerday, C.

(\9ЩЕиг. J.Biochem. 109, 307-315. ermyakov, E.A, Kalinichenko, L.P., Morozova, L.A, Yarmolenko, V.V., & Burstein, E.A (1981a)

Biochem. Biophys. Res. Commun. 102,1-7. ermyakov, E.A, Yarmolenko, V.V., Kalinichenko, L.P., Morozova, L.A, & Burstein, E.A (1981b)

Biochem. Biophys. Res. Commun. 100, 191-197. ermyakov, E.A, Morozova, L.A, & Burstein, E.A (1985)Biophys. Chem. 21, 21-31. ermyakov, E.A, Morozov?, L.A, Kalinichenko, L.P., & Derezhkov, V.Y. (1988) Biophys. Chem. 32, 37-42.

ermyakov, E.A, Shnyrov, V.L., Kalinichenko, L.P., Kuchar, A, Reyzer, I.L., & Berliner, L.J.

(1991) J. Protein Chem. 10, 577-584. srmyakov, E.A & Berliner, L.J. (1994)7. Protein Chem. 13, 277-281. :rmyakov, E.A & Kreimer, D.I. (1986) Gen. Physiol. Biophys. 5, 377-390. ke, AC., Brew, K., & Acharya, K.R. (1996) Structure 4,691-703. estrelski, S.J., Byler, D.M., & Thompson, M.P. (1991) Biochemistry 30, 8797-8804. itsyn, O.B. & Uversky, V.N. (1994) FEBS Lett. 341, 15-18. ;n, J.S., Stuart, D.I., & Acharya, K.R. (1993)7. Biol. Chem. 268, 19292-19298. lyle, R.A & Milner-White, E.J. (1995) TIBS 20, 374 :gawa, T. & Sugai, S. (1983) J. Biochem. 93, 1321-1328. urtevant, J.M. (1994) Curr. Opin. Struct. Biol. 4,69-78.

eghem, E„ Van Dael, H., & Van Cauwelaert, F. (1991a) Biochem. International 23, 119-126. eghem, E„ Van Dael, H., & Van Cauwelaert, F. (1991b) J. Inorg. Biochem. 42, 119-131. in Dael, H., Tieghem, E., Haezebrouck, P., & Van Cauwelaert, F. (1992)Biophys. Chem. 42, 235242.

inderheeren, G. & Hanssen's, I. (1994)7. Biol. Chem. 269, 7090-7094. ilson, G„ Ford, S.J., Cooper, A, Hecht, L., Wen, Z.Q., & Barron, L.D. (1995)7. Mol. Biol. 254, 747-760.

itani, K., Ogasahara, K., & Kuwajima, K. (1992)7. Mol. Biol. 228, 347-350.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

printsev, D.B., Permyakov, S.E., Permyakov, E.A, Rogov, V.V., Cawthern, K.M.& Berliner, L.J.,

(1997). Cooperative thermal transitions of bovine and human apo-(X- lactalbumins: evidence for a new intermediate state. FEBS Lett. 412(3), 625-628.

Permyakov, E.A., Veprintsev, D.B., Deikus, G.Y., Permyakov, S.E., Kalinichenko, L.P.,

Grishchenko, V.M. & Brooks, C.L., (1997). pH-induced transition and Zn2+ binding properties of bovine prolactin. FEBS Lett. 405(3), 273-276.

Veprintsev, D.B., Berliner, L.J. & Permyakov, E.A., (1996). Pb2+ and Hg2"1" binding to (X-lactalbumin. Biochem. Mol. Biol. Intern. 39(6), 1255-1265.

Grishchenko, V.M., Kalinichenko, L.P., Deikus, G.Y., Veprintsev, D.B., Cawthern, K.M., Berliner,

L.J. & Permyakov, E.A., (1996). Interactions of (X-lactalbumin with lipid vesicles studied by tryptophan fluorescence. Biochem. Mol. Biol. Intern. 38(3), 453-466.

Вепринцев, Д.Б., Пермяков, E.A. Применение методов собственной флуоресценции белка, спектроскопии кругового дихроизма и дифференциальной сканирующей микрокалориметрии для исследований температурной денатурации а-лактальбумина. Труды конференции: Физика и химия органических люминофоров, Харьков, Украина, 1995.

Veprintsev, D.B., Permyakov, Е.А., Berliner, L.J. "Two-step denaturation transition from native to

molten globule state of apo-a-lactalbumin." 21st Lome Conference on Protein Structure & Function, Lome, Australia, 1996.

Вепринцев, Д.Б., Пермяков, E.A. Исследование взаимодействия ионов свинца и ртути с а-лактальбумином, Труды конференции молодых ученых Пущино, Пущино, Россия, 1996, стр. 20.

Пермяков, С.Е., Дейкус, Г.Ю., Грищенко, В.М., Вепринцев, Д.Б., Пермяков, Е.А.

"Исседование эффектов УФ-облучеиия а-лактальбумина на его физико-химические свойства", тезисы конференции: конференция молодых ученых, Пущино, Россия, 1996, стр.68.

Veprintsev, D.B., Permyakov, Е.А., Berliner, L.J. "Non two-state denaturation transition from native to molten globule state of apo-a-lactalbumin." 41st Biophysical Society Annual Meeting, New Orlean, USA, 1997.

Научное издание

Автореферат Вепринцева Д.Б.

ТЕРМОДИНАМИЧЕСКИЕ И СТРУКТУРНЫЕ АСПЕКТЫ СВЯЗЫВАНИЯ БЕЛКАМИ ИОНОВ МЕТАЛЛОВ

Налоговая льгота - общероссийским классификатор продукции СЖ-005-93; том 2; 953000 - книги н брошюры.

[одпнсано в печать 26.12.97 г. Заказ 7819Р. Тираж 100 экз. Усл. неч. л. 1,5. Отпечатано на ротапринте в ОНТИ ПНЦ РАН.