Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Влияние связывания катионов металлов на кооперативность тепловых переходов в парвальбумине

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Влияние связывания катионов металлов на кооперативность тепловых переходов в парвальбумине"

:: 4г

На правах рукописи

БАКУНЦ АНУШ ГАМЛЕТОВНА

ВЛИЯНИЕ СВЯЗЫВАНИЯ КАТИОНОВ МЕТАЛЛОВ НА КООПЕРАТИВНОСТЬ ТЕПЛОВЫХ ПЕРЕХОДОВ В ПАРВАЛЬБУМИНЕ

03.00.02 - биофизика

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Пущино 2009

003476800

Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Институте биологического приборостроения РАН

Научные руководители: доктор биологических наук, профессор

Пермяков Евгений Анатольевич

кандидат физико-математических наук, доцент Пермяков Сергей Евгеньевич

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Зинченко Валерий Петрович

доктор физико-математических наук, профессор Кутышенко Виктор Павлович

Ведущая организация: Московский Государственный Университет

биологический факультет, кафедра биохимии

Защита диссертации состоится « 7 » октября 2009 г. в 13-30 часов на заседании совета Д 002.093.01 по защите докторских и кандидатских диссертаций при Учреждении Российской академии наук Институте теоретической и экспериментальной биофизики РАН по адресу: 142290, г. Пущино, ул. Институтская, 3, ИТЭБ РАН.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НЦБИ РАН по адресу: 142290, г. Пущино, ул. Институтская, 3, ИТЭБ РАН.

Автореферат разослан

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат физико-математических наук

Н.Ф. Ланина

Список сокращений

бис-АНС - 4,4'-бис (1-анилиннафталин 8-сульфонат);

ДТПА - диэтилентриаминпентауксусная кислота;

в<1тС1 - гуанидингидрохлорид;

НЕРЕБ - К-2-гидроксиэтилпиперазин-Ы'-2-этансульфоновая

кислота;

ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота;

ДСК - дифференциальная сканирующая калориметрия;

КД - круговой дихроизм;

ПА - парвальбумин;

УФ - ультрафиолетовый;

Ср-удельная теплоемкость белка;

Т- абсолютная температура, К;

[в] — молярная эллиптичность

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы

Стабильность к воздействию различных факторов внешней среды является одной из важнейших характеристик макромолекул, обеспечивающих их успешное функционирование в живой клетке. Стабильность структуры белка определяется хрупким балансом различных физических взаимодействий на внутримолекулярном и межмолекулярном уровнях. Направление исследования факторов, влияющих на стабильность белка (в том числе, его термостабильность), имеет не только академическое значение, но и огромный прикладной потенциал. Дело в том, что направленное увеличение стабильности белков очень важно при решении множества прикладных биотехнологических задач. К примеру, ферменты, сохраняющие активность при высокой температуре, дают существенные преимущества при применении в различных биотехнологических процессах: они обладают большей продуктивностью вследствие ускорения химических реакций при повышенной температуре; при этом культуральная среда в меньшей степени подвержена загрязнению чужеродными микроорганизмами; термостабильные белки менее склонны к образованию агрегированных форм, препятствующих протеканию биотехнологических процессов. Следует отметить, что и низкая стабильность молекулы белка может обеспечивать определенные преимущества. Например, отсутствие жесткой третичной структуры у представителей семейства белков с внутренней неупорядоченностью позволяет эффективно взаимодействовать с несколькими различными мишенями.

Одной из ключевых характеристик теплового поведения белка является свойство молекулы белка претерпевать согласованные конформационные изменения, что принято называть структурной (или глобальной) кооперативностью. Степень структурной кооперативности белка обуславливает путь, по которому будет протекать структурный переход в белке: это может быть простой переход между двумя состояниями или сложный процесс, включающий в себя формирование промежуточного

( : "'7'

состояния (интермедиата), возможны и более сложные варианты. Как наличие, так и отсутствие структурной кооперативности чрезвычайно важно для функционирования белков.

Несмотря на огромные успехи в установлении трехмерных структур белков, знание пространственной структуры белка не позволяет однозначно судить ни о его термостабильности, .ни, тем более, о наличии возможных интермедиатов тепловой денатурации. Показано, что даже структурно схожие белки могут обладать как существенно различной термостабильностью, так и разной структурной кооперативностью. Ситуация дополнительно осложняется в случае металл-связывающих белков, поскольку подавляющее большинство работ, посвященных исследованиям факторов, влияющих на стабильность структуры белка, если и рассматривают металл-связывающие белки, то вне контекста их металл-связывающей способности.

Цели и задачи исследования

Цель работы - изучение особенностей теплового поведения металл-связывающих белков, на примере «классического» представителя семейства кальций-связывающих белков, парвальбумина.

В соответствии с целью и выбором объекта исследования были поставлены следующие задачи:

1) Исследовать структурные переходы, происходящие в апо-форме парвальбумина под воздействием температуры и денатурирующих агентов.

2) Изучить влияние связывания физиологически значимых катионов металлов на тепловые переходы в парвальбуминах.

Научная новизна

Впервые получена апо-форма парвальбумина, т.е. форма, свободная от

каких-либо катионов металлов. С помощью спектральных и теплофизических

методов, а также теоретических предсказаний показано, что она лишена

жесткой третичной структуры, т. е. является белком с внутренней

неупорядоченностью.

Обнаружен непрерывный тепловой переход в апо-форме ПА.

Показано, что структурная кооперативность ПА определяется видом

связанных катионов металлов, варьируя в широчайших пределах: от отсутствия

тепловых переходов первого рода, до простого перехода между двумя

состояниями, а также сложного механизма тепловой денатурации с участием,

по меньшей мере, одного интермедиата. Показано, что наличие двух

2+

термодинамических доменов в Са -насыщенной форме а-ПА щуки является следствием стабилизации промежуточного состояния связанными ионами Са , а также ослабления взаимодействий между субдоменами СБ и ЕЙ за счет увеличения объема изолированных полостей.

Научно-практическая зиачимость

Результаты, полученные в настоящей работе, показывают, что при изучении ало-форм металл-связывающих белков, обладающих предельно

высоким сродством к ионам металлов, необходимо обеспечивать полный отрыв от белка всех связанных катионов металлов, включая моновалентные. Результаты работы свидетельствуют о том, что дополнительный термодинамический домен может возникать не только вследствие больших размеров белка, но и благодаря стабилизации промежуточного состояния, вызываемой связыванием лиганда. Примененная в работе комбинация теоретических методов исследования структуры белков может быть успешно применена для оценки стабильности белков, а также предсказания наличия в них дополнительных термодинамических доменов. В целом, работа способствует пониманию структурных факторов, влияющих на тепловое поведение металл-связывающих белков, что может быть востребовано при решении многих прикладных задач: создания лекарственных средств белковой природы, различных биотехнологических применений, и пр.

Апробация работы

Основные положения диссертационной работы были доложены и обсуждены на симпозиумах и конференциях:

- 11-ая международная школа-конференция «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2007)

- 12-ая международная школа-конференция «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2008)

- Intl. Symposium «Biological motility: achievements and perspectives» (Pushchino, 2008)

Структура и объем диссертации

Диссертация изложена на_страницах машинописного текста, состоит

из введения, обзора литературы, методической части, полученных результатов

и их обсуждения, выводов, списка цитируемой литературы (_источник).

Работа иллюстрирована_рисунками и содержит_таблиц.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Материалы. Парвальбумины щуки (Esox lucius), ПА трески (Gadus morhua) и рекомбинантные ПА крысы (Raitus norvegicus) были выделены как описано ранее (Rao and Gerday, 1973; Henzl and Graham, 1999) с некоторыми изменениями. Степень чистоты реактивов была не ниже «хч». Для приготовления буферных растворов использовали реактивы степени «осч». Проводимость используемой воды составляла не более 0,05 мкСм/см. Очистка парвалъбуминов от ионов кальция. Очистку ПА от Сопроводили с помощью гель-фильтрации смеси белка с хелатором ионов Ca+ (10 мМ хелатора, pH -10,5) на носителе Сефадекс G-25 (pH ~8,7)(Blum et al., 1977). Дифференциальная сканирующая калориметрия. Измерения избыточного теплопоглощения белков проводили на дифференциальном сканирующем микрокалориметре ДАСМ-4М (ИБП РАН, г. Пущино, Россия), при скорости нагрева 0,94°С/мин в 10-20 мМ Н3ВО3-КОН или глициновом буфере, pH 9,0. Концентрация белка составляла 1,5-2,2 мг/мл. Удельную теплоемкость белка

(Ср) рассчитывали по методу, описанному Приваловым и Потехиным (Privalov and Potekhin, 1986). Удельный объем белка рассчитывали на основе его первичной последовательности (Hackel et al., 1999b). Аналогично рассчитывали удельную теплоемкость полностью развернутого белка (Makhatadze and Privalov, 1990). Температурную зависимость Ср анализировали в рамках схемы двух состояний [1], либо схемы двух последовательных переходов [2]:

n-N n-D [1]

n-N *-» n-I «->n-D, [2]

где N, I и D обозначают нативное, промежуточное и денатурированное состояния белка, соответственно; п - количество молекул, вовлеченных в переход (аналог отношения энтальпии Вант-Гоффа к калориметрической энтальпии, ДНун/ДНои).

Подгонка экспериментальных данных осуществлялась с помощью программного обеспечения Microcal OriginPro 8.0 (OriginLab Corporation, Northampton, MA). Анализ проводили, считая, что разность теплоемкостей денатурированной и нативной форм белка не зависит от температуры. Круговой дихроизм. Измерения кругового дихроизма (КД) проводили на спектрополяриметре JASCO J-810 (JASCO Inc., Япония), оборудованном термостатируемым кюветодержателем. Концентрация белка составляла 130-220 мкМ и 5-11 мкМ для ближней и дальней УФ областей, соответственно. Из экспериментальных спектров белка вычитали вклад растворителя. Ширина щели - 2 км, время усреднения - 1-2 с. Конечный спектр являлся результатом усреднения трех независимых измерений.

Количественная оценка содержания элементов вторичной структуры белка проведена при помощи пакета программ CDPro (Sreerama et al., 2000).

Измерение тепловой денатурации проводили, регистрируя эллиптичность на нескольких длинах волн одновременно. Средняя скорость нагрева была 0,5°С/мин.

Флуоресцентные измерения. Флуоресцентные измерения проводили на спектрофлуориметре Сагу Eclipse (Varian Inc.), оснащенном термостатируемым кюветодержателем и автоматическим микротитратором (ИБП РАН, Пущино, Россия). Длина волны возбуждения флуоресценции белков составляла 259 нм; флуоресценцию бис-АНС возбуждали на 385 нм. Средняя скорость нагрева составляла 0,5°С/мин.

Оценка равновесных констант связывания Са2+. Связывание ионов Са2+ двумя центрами ПА щуки хорошо описывается схемой последовательного связывания (Permyakov et al., 1983b):

Белок + Са2т <Н> Белок Са2+

Кг L-iJ

Белок -Са2+ + Са2+ <-> Са2+- Белок -Са2+,

где К\ и К.2 - константы связывания Са2+ парвальбумином для двух активных центров связывания Са2+ белка.

Сродство ПА к катионам металлов вычисляли из данных спектрофлуориметрического титрования белка, предварительно очищенного от катионов металлов, стандартными растворами катионов с последующим титрованием металл-загруженного белка калиевой солью ЭДТА при фиксированном pH. Оценку констант связывания кальция проводили с учетом конкуренции между белком и хелатором за ионы металла. Кажущаяся константа связывания катиона металла ЭДТА была вычислена по методу Шварценбаха и Флашки (Schwarzenbach and FJaschka, 1965). Подгонку данных проводили с помощью программы FluoTitr v.1.2 (ИБП РАН, г. Пущино, Россия), по методу наименьших квадратов по алгоритму Маркуардта (Marquardt, 1963). Подгонка достигалась путем варьирования величин констант связывания К\ и Кг- Абсолютная ошибка полученных констант связывания не превышала ±!Л порядка величины.

Электростатические расчеты. Энергии заряд-зарядовых взаимодействий были рассчитаны с помощью метода конечных разностей Пуассона-Больцмана (FDPB), реализованного в модуле Delphi (Honig et al., 1993) среды молекулярного моделирования Insight П (Insight II 2005, Accelrys Software Inc., San Diego). Расчеты проводили на основе данных рентгеноструктурного анализа а и ß ПА щуки (коды PDB 1PVA и 1PVB, соответственно (Declercq et al., 1991)). Использовали стандартные величины зарядов и радиусов атомов, предустановленные в модуле DelPhi. При оценке величины электростатического потенциала на отдельном атоме величину его заряда приравнивали к нулю, изменением поляризации молекулы пренебрегали. Предсказания внутренней неупорядоченности. Предсказания внутренней неупорядоченности полипептидной цепи были выполнены с помощью программы PONDR®-VSLl (Various Short-Long, version 1 Predictor Of Natural Disordered Regions), предсказывающей вероятность нахождения каждого аминокислотного остатка белка в неупорядоченном состоянии на основе анализа первичной аминокислотной последовательности белка (Obradovic et al., 2005b; Peng et al., 2005).

Анализ полостей белка. Координаты кристаллических структур Са2+-связанных ПА были взяты из Protein Data Bank (Berman et al., 2000); коды: IP VA - ct-ПА щуки; 1RWY - а-ПА крысы; 1RRO - ß-ПА крысы и 4CPV - ПА pi 4,25 карпа. Изолированные полости белка (полые внутренние пространства, недоступные молекулам растворителя) были определены с помощью онлайн сервера CASTp (Dundas et al., 2006). Площадь и объем каждой полости были аналитически рассчитаны методом Коннолли. Молекулы растворителя моделировались сферами радиуса молекулы воды. Рисунки были сделаны с помощью программы MolScript (Kraulis, 1991).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ОБСУЖДЕНИЕ

Получение апо-формы парвальбумшюв щуки

Отрыв ионов Са2+ от ПА проводили с помощью гель-фильтрации смеси белка с хелатором ионов Са2+ на носителе Сефадекс С-25. Исследование сродства ПА, тщательно очищенного от катионов металлов, к ионам Ка+ показало, что величины констант ассоциации ионов составляют 37 М"1 и 14 М"1 для аир изоформ, соответственно. Поэтому присутствие в составе буфера в качестве противоиона может приводить к эффективному заполнению натрием металл-связывающих центров ПА. Учитывая ощутимо меньшее сродство к белку ионов К+ (4-5 М"1), при получении апо-формы ПА в качестве противоиона использовали К+вместо Для защиты апо-белка от связывания ионов Са2+ использовали в составе буфера миллимолярные концентрации сильных хелаторов Са2+, ЭДТА или ДТПА. В работе использовали рН 9, при котором ПА щуки не претерпевают выраженных рН-переходов (РсппуакоУ с1 а1., 1983), а эффективная константа связывания Са2+ хелаторами составляет 1 х 10® М"1. Максимальное значение эффективной константы ассоциации Са2+ ПА щуки составляет ~1хЮ10 М"1. Учитывая, что молярная концентрация хелатора в экспериментах, в которых не использовалась процедура очистки от ионов Са2+, превышала концентрацию белка, по меньшей мере, в 200 раз, используемая комбинация экспериментальных условий обеспечивает эффективное удаление всех катионов металлов, включая моновалентные.

Отсутствие жесткой третичной структуры в апо-пареальбуминах щуки Измерения методом ДСК не выявили измеримого пика теплопоглощения

для апо-ПА щуки,

О

1-

апо,теоретическая апо„

10мМ CaCI

очищенного от ионов Ca , как описано в (Blum et al., 1977), в диапазоне температур от 12°С (Рис. 1).

удельной апо-белка

20

60

30 40 50 Температура, °С

Рис. 1. Температурная зависимость удельной теплоемкости а-ПА щуки. Данные ДСК, рН 9,0.

Величина

теплоемкости

значительно

теплоемкость

свернутого,

насыщенного,

превышает полностью Са2+-белка

(Permyakov et al., 1988) и близка к теоретической теплоемкости полностью развернутого белка.

Поскольку абсолютная величина удельной теплоемкости белка отражает степень гидратации его гидрофобных аминокислотных остатков (Privalov and Dragan, 2007), полученные результаты говорят о высокой степени сольватированности остатков белка, указывая на отсутствие в апо-ПА жесткой третичной структуры.

Отсутствие жесткой

третичной структуры в апо-ПА подтверждается также

экспериментами по разворачиванию белка под действием вс1тС1 (Рис. 2). Отсутствие плато в начале кривой денатурации показывает, что структура белка чувствительна к воздействиям даже относительно низких концентраций денатуранта, что характерно для гибкой, флуктуирующей структуры.

Экспонирование гидрофобных остатков белка подтверждено экспериментами по флуоресценции гидрофобного зонда бис-АНС (Рис. 3). Дезорганизация третичной структуры апо-ПА подтверждена экспериментами, проведенными методом КД в ближней УФ области (Рис. 3).

Данные ДСК, КД, флуоресценции бис-АНС и исследования по разворачиванию белка Ос1тС1 убедительно показывают, что апо-ПА не обладает жесткой третичной структурой. Белки, не обладающие жесткой третичной структурой, в настоящее время относят к семейству белков с внутренней неупорядоченностью. Это семейство включает в себя белки с различным уровнем структурной дезорганизации, как полностью развернутые полипептидные цепи, так и более компактные состояния белка (расплавленная глобула и т. п.).

Интересно, что использование в составе буфера солей натрия вместо солей калия приводит к частичному заполнению металл-связывающих центров ПА и сворачиванию белка, что видно по снижению удельной теплоемкости белка и появлению выраженного пика тегаюпоглощения (Рис. 1). По-видимому, именно этот переход принимали за тепловой переход апо-ПА в предшествующих работах. При исследовании физико-химических свойств ПА для моделирования физиологических условий в растворы часто добавляют до 250 мМ КаС1 или КС1 (Регтуакоу, 2006), поэтому большая часть данных, полученных до сих пор для «апо>>-ПА, в действительности относится к Иа+-загруженным или К+-загруженным формам белка. Таким образом, данная работа является первым исследованием ПА, действительно свободного от всех ионов металла.

Внутренняя неупорядоченность апо-формы ПА, по-видимому, служит причиной того, почему пространственная структура до сих пор не определена ни для одного апо-ПА, существующая структура «апо»-белка в действительности получена на Ка^-загруженном ПА, что признают сами авторы.

Сложное тепловое поведение апо-парвальбуминов

Для детального изучения структурных изменений, протекающих в апо-ПА в ходе тепловой денатурации, были проведены спектральные измерения,

Рис. 2. Разворачивание апо-ПА щуки, вызываемое действием вётС), по данным КД. 20°С, рН 8,9,1,5 мМ ЭДТА.

показавшие, что, несмотря на отсутствие измеримого пика теплопоглощения, при увеличении температуры в апо-белке происходят определенные структурные изменения (Рис. 3 и 4).

Измерения методом КД в дальней УФ области не выявили каких-либо кооперативных тепловых переходов в апо-Р-ПА щуки (Рис. 36), в то время как апо-а-ПА при нагревании демонстрирует и-образные изменения молярной эллиптичности (Рис. За) с экстремумом в области 20°С. Аналогичный эксперимент для Са2+-формы а-ПА не выявил каких-либо изменений в этой области температур.

Рис. 3. Тепловое поведение ПА щуки по данным КД в дальней УФ области и флуоресценции бис-АНС. рН 8,7, 1,5-2,7 мМ ЭДТА (ano), либо 1 мМ СаС12 (Са2+-форма).

Известно, что квантовый выход флуоресценции бис-АНС возрастает при взаимодействии со структурированными денатурированными формами белков (например, расплавленной глобулой), в то время как с полностью развернутыми и нативными формами белков краситель взаимодействует существенно хуже, и квантовый выход флуоресценции бис-АНС в их присутствии ниже (Daughdrill et al., 2005). Измеряя температурную зависимость интенсивности флуоресценции бис-АНС на 500 нм (Рис. 3), мы не выявили достоверных отклонений для апо-ПА от обычного температурного тушения. При этом интенсивность флуоресценции бис-АНС для апо-ПА в десятки раз превышает таковую для свернутой, Са2+-насыщенной, формы, что характерно для белка в состоянии расплавленной глобулы (Рис. 3).

Необычное тепловое поведение апо-ПА щуки также регистрируется методом КД в ближней УФ области (Рис. 4). Наблюдаются кооперативные изменения молярной эллиптичности в диапазоне от 3°С до 30°С (у Са2+-форм изменения отсутствуют), схожие с изменениями, наблюдаемыми при переходах первого рода. Тем не менее, отсутствие измеримых пиков теплопоглощения в ходе этих тепловых переходов (Рис. 1) указывает на то, что изменения, наблюдаемые методом КД, соответствуют фазовому переходу, отличному от перехода первого рода.

На основе данных КД была построена теоретическая кривая плавления апо-ПА (Рис. 1) (на основе схемы двух состояний [1]). Сравнение теоретической и экспериментальной кривых

теплопоглощения показывает, что экспериментальная точность

определения удельной теплоемкости белка (0,1 Дж/г) достаточна для установления различия между этими двумя кривыми. Таким образом, тепловой переход, наблюдаемый методом КД в ближней УФ области, не относится к разряду переходов первого рода.

Обнаруженное отсутствие скрытой теплоты в ходе фазового перехода является признаком перехода второго рода или непрерывного перехода (Ландау и Лифшиц, 1976). Во время переходов второго рода различные фазы не сосуществуют в точке перехода, как при переходах первого рода, вместо этого, состояние системы изменяется непрерывно. Вследствие непрерывности изменений термодинамические функции системы не демонстрируют скачкообразного изменения при температурах перехода. В то же время, для классических переходов второго рода характерным является скачкообразное изменение теплоемкости и других производных термодинамических функций. Переходы не первого рода, происходящие в белках, также иногда сопровождаются изменениями теплоемкости. В то же время, в нашем случае и в некоторых других такие изменения теплоемкости отсутствуют. По-видимому, наблюдаемые в белках фазовые переходы, в ходе которых отсутствует скрытая теплота, отличаются от непрерывных фазовых переходов, рассматриваемых в классической физике. Тем не менее, принимая во внимание то, что особенности таких переходов в белках до сих пор еще очень мало изучены, мы будем называть их непрерывными просто на основании отсутствия скрытой теплоты перехода.

Непрерывный переход, наблюдаемый методом КД в ближней УФ области (Рис. 4), не сопровождается значительными изменениями в дальнем УФ диапазоне (Рис. 3). Следовательно, переход затрагивает окружение ароматических групп ПА, Phe и Туг, (Рис. 4) в то время как его вторичная структура в основном не меняется.

Структурная характеризация апо-пареальбуминов

На Рис. 5 показаны спектры КД в дальней и ближней УФ области для ano- и Са2+-загруженных форм ПА щуки при 3°С. Отрыв ионов металлов сопровождается уменьшением содержания a-структуры на 8% для а-ПА и на 30% для р изоформы. Таким образом, вторичная структура Р-ПА претерпевает намного более выраженные изменения при связывании Са2\ Отрыв ионов Са2+ от а-ПА увеличивает симметрию окружения остатков Phe белка, что

Рис. 4. Тепловая денатурация апо-форм ПА щуки по данным КД в ближней УФ области. рН 8,2, 3 мМ ЭДТА.

выражается в уменьшении абсолютного значения молярной эллиптичности (Рис. 56). Такое поведение согласуется с вышеописанными данными, свидетельствуя о дезорганизации жесткой третичной структуры апо-ПА.

а-ПА

200 220 240

Длина волны,им

200 220 240

Длина волны,нм

о

J»

1 -10

V20

|-30 аГ -40

250

260 270

Длина волны,нм

280

/ м 7 \ ano „у

/ V/ i ' ~~ "1—^

/ да у/*1 мМ СаС12

i i! (б)

250 260 270 280 290 Длина волны,нм

зоо

Рис. 5. Спектры КД ano- и Са +-форм ПА щуки в дальней (а) и ближней (б) УФ областях при 3°С, рН 8,2.

Совокупность экспериментальных данных показывает, что апо-а-ПА щуки обладает целым набором структурных признаков классического состояния расплавленной глобулы (Dolgikh et al., 1981):

1) отсутствует жесткая третичная структура;

2) сохранность вторичной структуры;

3) интенсивность флуоресценции гидрофобного красителя бис-АНС в десятки раз превышает таковую для свернутого белка.

В апо-Р-ПА вторичная структура в значительной степени нарушена, что не позволяет классифицировать этот белок как классическую расплавленную глобулу.

Стоит отметить, что известные случаи непрерывных переходов в белках были зарегистрированы в расплавленных глобулах или сходных состояниях с высоким содержанием остаточной вторичной структуры. Наши результаты хорошо вписываются в эту тенденцию. По-видимому, одним из необходимых условий для проявления таких переходов является сохранность элементов вторичной структуры. Можно предположить, что непрерывные переходы происходят на уровне вторичной структуры, либо вследствие разрушения оставшихся связей между стабильными элементами вторичной структуры. Возможно, что непрерывные переходы происходят и в белках, обладающих жесткой третичной структурой, но их регистрация затруднена из-за наложения основного денатурационного перехода.

и

Предсказания неупорядоченных областей в пареальбуминах щуки на основе аминокислотной последовательности

Хотя структурные свойства ПА изучаются на протяжении десятилетий дезорганизованность третичной структуры апо-формы белка оставалась неизвестной. Тем не менее, неупорядоченность ПА может быть предсказана теоретически. Количественно оценить вероятность отдельных аминокислотных остатков белка быть включенными в жесткую третичную структуру можно с помощью баллов PONDR, оцениваемых на основе аминокислотной последовательности белка: чем выше балл PONDR для данного остатка, тем ниже вероятность того, что он включен в жесткую третичную структуру белка.

На Рис. 6 показаны результаты расчетов PONDR® VSL1 для а-ПА щуки (результаты для Р-изоформы аналогичны). ПА обладают выраженной склонностью к внутренней неупорядоченности: 61% и 53% остатков аир изоформ, соответственно, обладают величиной PONDR, превышающей 0,5 балла, что соответствует их включению в неупорядоченные участки.

Совершенно иная ситуация наблюдается в случае «незаряженных» форм ПА, в которых все остатки Asp и Glu, координирующие ионы Са2+, заменены на остатки Asn и Gin, соответственно. В соответствии с предсказаниями, доля неупорядоченных остатков в них составляет лишь -34% для обоих ПА. Изменения балла PONDR, вызванные компенсированием зарядов Са2+ -петель белка, указывают на то, что внутренняя неупорядоченность апо-ПА обусловлена неблагоприятными заряд-зарядовыми взаимодействиями внутри Са2+-связывающих петель белка.

Оценка заряд-зарядовых взаимодействий в пареальбуминах щуки

Предсказания PONDR не позволяют учесть взаимодействия между участками белка, разнесенными по аминокислотной последовательности. По этой причине мы провели расчет электростатических взаимодействий в белке на основе трехмерных структур ПА методом Пуассона-Больцмана.

На Рис. 6 показаны вклады отдельных аминокислотных остатков а-ПА щуки в электростатическую энергию белка (результаты для Р-изоформы аналогичны). Анализ результатов этих расчетов выявляет несколько особенностей, справедливых для обеих изоформ ПА щуки:

1) У зарядов АВ домена (остатки 1-40) низкий вклад в заряд-зарядовые взаимодействия. Напротив, в CD и EF субдоменах присутствует множество зарядов, привносящих значительный вклад в электростатические взаимодействия в белке.

2) Консервативные остатки Arg75 и Glu81, образующие солевой мостик, существенно стабилизируют структуру белка, вне зависимости от связывания катионов.

3) Электростатическое отталкивание между карбоксильными группами, расположенными в функционально активных петлях EF-рук, сильно дестабилизирует структуру апо-ПА.

4) Связывание ионов кальция

ь-

ГС

|зон

S

о «-30

g-60-l О

g"-90

Дестабилизация

ЧЛЙ

CD-петля Стабилизация

0.8

EF-петля

с белком приводит к существенной стабилизации структуры. В результате почти все электростатические взаимодействия в Са2+-связанном ПА являются стабилизирующими, что, по-видимому, объясняет высокую стабильность Са2+-загруженной формы белка (Регтуакоу е! а1., 1983).

Проведенный анализ электростатических взаимодействий в апо-ПА основывается на структурах Са2+ -загруженных белков в предположении, что

конформация апо-белка не отличается от таковой для Са2+-формы, что не вполне

Са2+-

" 20 40 60 80 100

Номер аминокислотного остатка Рис. 6. Энергии заряд-зарядовых взаимодействий (столбцы) и баллы РОЖЖ (кривые) для а-ПА щуки. Ионы Са2+ либо оставлены на месте (черные столбцы) либо удалены из структуры (белые столбцы). Пунктиром показана кривая, вычисленная для ПА с нейтрализованными связывающими петлями.

корректно. Удаление Са^ из центров связывания должно вызывать конформационный переход белка в термодинамически более выгодное состояние. Полученные в нашей работе данные показывают, что в результате этих перестроек молекула ПА теряет жесткую третичную структуру.

Неблагоприятным электростатическим взаимодействиям в области ЕБ-петель ПА сопутствуют высокие значения балла РОЖЖ (Рис. 6). В то же время, Ы-концевая область обеих изоформ ПА по предсказаниям РОЫОЯ сильно неупорядочена, несмотря па малые энергии заряд-зарядовых взаимодействий в этой области. Кроме того, область вокруг очень выгодного электростатически солевого мостика Аг§75-С1и81 демонстрирует выраженную склонность к неупорядоченности. Таким образом, наблюдается лишь частичная корреляция между оценками заряд-зарядовых взаимодействий и РОЖЖ. Все особенности кривой РОЖЖ. нельзя объяснить лишь электростатическими взаимодействиями, необходимо принимать во внимание и другие факторы.

Тепловое разворачивание кальций-насыщенных парвальбуминов

Исследование тепловой денатурации Са2*-форм ПА из различных организмов (ПА трески, а-ПА щуки, а и ß ПА крысы), проведенное методом ДСК (Рис. 7), обнаружило две труппы ПА, обладающих качественно различным тепловым поведением. Первая группа включает в себя оба ПА крысы, демонстрирующих единичный пик теплопоглощения. Аналогичное поведение ранее было описано для ПА зеркального карпа III (Filimonov et al., 1978). Вторая труппа состоит из ПА трески и а-ПА щуки, неожиданно продемонстрировавших два отдельных пика теплопоглощения. Такое поведение не было показано ни для одного из представителей семейства ПА.

40 60 80 Температура,

Рис. 7. Температурные зависимости удельной теплоемкости Са +-форм (1 мМ СаС12) ПА по данным ДСК, рН 8,1-9,0.

Термодинамический анализ одиночного пика теплопоглощения, регистрируемого для Са2+-форм аир ПА крысы (Рис. 7), в соответствии со схемой перехода между двумя состояниями (Рис. 8а) показал, что кооперативность теплового перехода, п, ниже 1: п. равно 0,53 и 0,79 для изоформ аир, соответственно. Отметим, что параметр п соответствует калориметрической энтальпии

p-крыса \ (а)

п = 0,79 / \

У V

_____ ----

>0 90

Температура,°С

a-щ ука

п = 1

(б)

отношению энтальпии Вант-Гоффа к (ДНун/ДНы), часто используемому для термодинамического анализа тепловых переходов. Величина п ниже 1 указывает на формирование промежуточного состояния в ходе денатурации (Рпуа1оу, 1979).

В то время как данные ДСК для ПА трески искажены агрегационными процессами, первый (низкотемпературный) переход а-ПА щуки полностью обратим, что делает его пригодным для термодинамического анализа. Анализ этого пика в соответствии со схемой перехода между двумя состояниями дает п=0,93, что характерно для переходов типа «все-или-ничего» (0,93-0,98 (РпуаЫ, 1979)). Второй (высокотемпературный) переход а-ПА щуки необратим, однако полная кривая теплопоглощения хорошо описывается схемой двух последовательных переходов с фиксированным п=1 (Рис. 86). Таким образом, процесс тепловой денатурации а-ПА щуки можно рассматривать как два последовательных перехода типа «все-или-ничего». Нужно отметить, что все термодинамические параметры,

характеризующие первый тепловой переход, не зависят от того, на основе какой схемы проведен анализ ([1] или [2], фиксированное п=1), из-за значительной (~30°С) разнесенности тепловых переходов в температурной шкале.

Са2+-формы ПА группы 1 также могут содержать два термодинамических домена, обладающих, в отличие от термодинамических доменов а-ПА щуки, схожей стабильностью.

60

so юа izo Теиперэтура,°С

Рис. 8. Анализ данных ДСК для Са2+-форм (З-ПА крысы (а) и а-ПА щуки (б) в соответствии со схемами [1] и [2] (фиксированное п=1),

соответственно. Теоретические кривые показаны пунктирными линиями.

Поскольку тепловая денатурация небольших глобулярных белков, обладающих жесткой третичной структурой, в подавляющем большинстве случаев представляет собой обычный переход между двумя состояниями, сложное многостадийное разворачивание Са2+-связанного ПА, не имеющего очевидной доменной структуры, неожиданно. Термодинамические домены ПА, обнаруженные методом ДСК, по всей видимости, соответствуют разрушению структурной целостности субдоменов белка (АВ, СО или ЕР) и/или разделяющих их поверхностей. В то же время, термодинамический домен может представлять собой более сложный ансамбль элементов вторичной структуры, принадлежащих различным субдоменам белка, объединенных в жесткую третичную структуру.

Структурные особенности интермедиата тепловой денатурации Са2*-насыщепного а-ПА щуки

Поскольку структурные изменения, сопровождающие второй тепловой переход а-ПА щуки (Т0=120оС; Рис. 7, 86), становятся заметными лишь при температурах свыше 100°С, а первый переход близок к завершению при 100°С, спектральные измерения при температурах, приближающихся к 100°С, позволяют получить информацию о структурных свойствах интермедиата.

(а)

—....... апо

.апо

У

Са2* Са2*

а зо

45 60 75 90 Температура, "С

■10 q О

г

-205

-toe-

*J

о.

450

10 9 (б)

а8 £ 6

s\

4-

2.8

3.0 3.2

103Я,К"'

3.4

3.6

Рис. 9. Температурные изменения ano- и Са -форм (1 мМ СаС12) а-ПА щуки по данным КД (а); температурная зависимость равновесных констант связывания ионов Са2+ а-ПА щуки (б). рН 8,0-8,7.

Данные КД показывают, что первый тепловой переход а-ПА щуки сопровождается снижением абсолютной величины молярной эллиптичности на 222 нм и 268 нм (Рис. 9а), что отражает снижение содержания а-спиралыюй структуры и образование более симметричного окружения остатков РЬе белка, соответственно. Экстраполяция величин [9] к 100°С показывает, что переход ПА из нативного в промежуточное состояние приводит к снижению разницы в значениях [9] между апо- и Са2+- формами белка приблизительно на 20% и 27%, для дальней и ближней УФ областей, соответственно. Таким образом, наиболее значительных структурных изменений в белке следует ожидать в ходе второго теплового перехода.

Поскольку ионы Са2+ важны для сохранения жесткой третичнои структуры ПА, потеря третичной структуры, сопровождающая первый

тепловой переход, может быть следствием диссоциации иона (или ионов) Са2+. Измерения сродства к Са2+ обеих активных ЕР-рук а-ПА щуки обнаруживают сильную температурную зависимость при повышенных температурах (Рис. 96), при этом величины констант ассоциации Са2+ при 95°С (К)=2хЮ4 М"1 и К2=1,1*105 М"1) достаточны для эффективного (>95%) заполнения обоих центров связывания в присутствии 1 мМ СаС12. Таким образом, интермедиат а-ПА щуки в условиях эксперимента при 95°С заполнен ионами Са2+, однако дальнейшее увеличение температуры может привести к диссоциации Са2+ вследствие сильной температурной зависимости К] и К2 (Рис. 96). В этом случае увеличение концентрации Са2+ должно приводить к высокотемпературному сдвигу второго теплового перехода. Действительно, кривые ДСК, полученные в присутствии 10 мМ СаСЬ (Рис. 10), демонстрируют сдвиг второго теплового перехода в область более высоких температур на 2,0°С (первый переход не изменяет своего положения). Этот факт говорит о том, что денатурированное состояние белка не насыщенно ионами Са2+ в присутствии 1 мМ СаС12.

Влияние ионов Са2+ на положение второго теплового перехода указывает на то, что, по меньшей мере, один из Са2+-связывающих доменов а-ПА щуки разрушается в ходе второго перехода, что подтверждается экспериментами по разворачиванию белка гуанидингидрохлоридом. Дестабилизирующее действие

85 мМ СМтС! преимущественно затрагивает второй тепловой переход а-ПА щуки (Рис. 10). Увеличение концентрации Са+ приводит к обращению этого эффекта: добавление 10 мМ СаСЬ существенно

восстанавливает положение второго перехода, в то время как положение первого перехода практически неизменно (Рис. 10). Таким образом, насыщение ЕР-рук ПА ионами Са2+ снижает чувствительность второго

теплового перехода к действию 0(1тС1. Избирательность наблюдаемого эффекта по отношению ко второму тепловому переходу означает, что, по меньшей мере, один из Са2+-связывающих центров претерпевает структурные перестройки в ходе этого перехода. Следовательно, в промежуточном состоянии сохранен один или оба Са2+-связывающих домена ПА (СБ и/или ЕБ). Этот вывод согласуется с предыдущим о том, что интермедиат насыщен ионами Са2+ в присутствии 1 мМ СаСЬ (Рис. 96). Повышенная стабильность, по крайней мере, одного из Са2+-связывающих доменов белка может служить причиной появления дополнительного термодинамического домена.

Рис. 10. Обращение действия Ос1тС1, вызываемое СаСЬ, по данным ДСК, рН 9,0.

Тепловая денатурация магний- и натрий-связанных форм а-ПА шуки

Связывание а-ПА щуки таких физиологически значимых катионов, как М§2+ и Ыа+, приводит, в отличие от связывания Са2+, к появлению единичного пика теплопоглощения (Рис. 11).

Стабилизирующий эффект ожидаемо ниже (по сравнению со связыванием Са2+) в случае связывания

1 мМ MgCI Д iMMCaCI,

i \ < \ ' < /

!

&*- i \ f 3- ЗМмИН.С! /

1-1 развернутый ___L , г. V--------

О _____

1 -

ионов Mg2+, и еще ниже в случае связывания Na+. В отличие от Са2+-формы, тепловое разворачивание как Mg2+- так и №+-форм а-ПА

20 40 60 80 100 120 ЩУКИ ХОРОШО описывается Температура, °С схемой перехода между двумя

Рис. 11. Термограммы металл-загруженных состояниями (фиксированное

форм а-ПА щуки, по данным ДСК, рН 9,1. Рис- п)> 4X0

Штриховые линии: теоретические кривые свидетельствует о том, что (п=1) наблюдаемый процесс

является переходом типа «все-или-ничего». Таким образом, механизм теплового разворачивания ПА полностью определяется связыванием катионов металлов и варьирует от отсутствия видимых переходов первого рода до простого перехода между двумя состояниями, а также сложного механизма тепловой денатурации с участием, по меньшей мере, одного интермедиата. Металл-связываклцие белки, обладающие этой уникальной особенностью, не были описаны ранее. По всей вероятности, изменение механизма денатурации при замене Mg2+ на Са2+ возникает вследствие дополнительной стабилизации ионами по меньшей мере, одного из металл-связывающих доменов интермедиата.

Отличительной чертой а-ПА щуки является то, что его можно рассматривать как белок с внутренней неупорядоченностью (в апо-форме), мезофильный (в Ма+-форме), термофильный (в Мд2+-форме) или как гипертермофильный белок (в Са2+-форме).

Структурные детерминанты интермедиата тепловой денатурации Са}+-насыщенного а-ПА щуки

Хотя экспериментальные данные свидетельствуют о наличии двух отдельных термодинамических доменов в а-ПА щуки, рассмотрение его трехмерной структуры не позволяет дать очевидное структурное объяснение этого факта (Рис. 126,в). Появление дополнительного пика теплопоглощения в некоторых Са2+-насыщенных ПА (а-ПА щуки и ПА трески; будем называть их представителями «группы 2») является следствием большей стабильности интермедиата в этих белках, в сравнении с ПА, имеющими один пик теплопоглощения (белки «группы 1»: ПА pl 4,25 карпа и оба ПА крысы). Разумно предположить, что области полипептидной цепи ПА группы 2,

обладающие меньшими, по сравнению с белками группы 1, величинами балла Р(ЖГЖ, составляют области, сохраненные в интермедиате белков группы 2.

Номер аминокислотного остатка

Рис. 12. Диапазон возможных значений балла PONDR для ПА, демонстрирующих либо один (пунктирные линии) либо два (сплошные линии) пика теплопоглощения в Са2*-форме (а); пространственное распределение атомов, формирующих два типа полостей (показаны темно-серыми шариками) (б) и (в). Номера аминокислотных остатков ПА группы 2, для которых величины балла PONDR ниже таковых для ПА группы 1, отмечены на рисунке (а).

Анализ величин баллов PONDR (Рис. 12а) обнаруживает в ПА группы 2 две области, для которых балл PONDR ниже в сравнении с белками группы 1: остатки 34-40 (расположены между субдоменами АВ и CD) и 81-105 (входят в состав субдомена EF и включают в себя петлю EF-руки). Вовлеченность EF-домена в область, которая, вероятно, сохранена в интермедиате, согласуется с выводом о том, что, по меньшей мере, один из Са2+-связывающих доменов сохранен в интермедиате.

В то время, как связывание Са2~ потенциально может обеспечить стабильность CD и EF доменов ПА, электростатически неактивный АВ домен а-ПА щуки внутренне неупорядочен (Рис. 6), поэтому можно предположить,

что он разворачивается в ходе первого теплового перехода.

Увеличение стабильности определенных областей третичной структуры белка само по себе не может привести к появлению дополнительного термодинамического домена без, по меньшей мере, частичного ослабления взаимодействий между термодинамическими доменами. Одним из подходов, позволяющих выявить области ослабления взаимодействий в белке, является исследование изолированных полостей белка. Результаты сравнительного анализа распределения полостей в ПА, относящихся к группам 1 и 2, показаны в Табл. 1.

Очевидно, что а-ПА щуки, содержащий 9 изолированных полостей, сильно отличается от остальных проанализированных ПА, в которых было обнаружено 4-6 полостей: общая площадь (S) и объем (V) полостей а-ПА щуки

ПА Общее количество полостей S а2) V (Л3)

Щука, а 9 398 215

Крыса, а 6 265 153

Крыса, р 4 158 92

Карп, pl 4,25 6 222 126

Табл. 1. Характеристики изолированных полостей различных ПА.

более. чем на 40% превышают аналогичные величины для других исследованных ПА (Табл. 1). Следовательно, общая плотность упаковки аминокислотных остатков в а-ПА щуки ниже, чем в других ПА.

Энергетический проигрыш вследствие превышения общего объема изолированных полостей внутри а-ПА щуки относительно средней величины V для всех ПА группы 1 на ~91 А3 можно оценить с помощью известной величины изменения свободной энергии разворачивания белка при удалении одной метиленовой группы из его гидрофобного ядра (V^27 А3; -1,3±0,5 ккал/моль (Jackson et al., 1993)):

AAGp =s -4,4±2 ккал/моль (соответствует 3,4 -CHг- группам).

В то же время, различие между свободными энергиями разворачивания ПА, сопровождающими два тепловых перехода Са2+-насыщенного а-ПА щуки, AG;(T) (i=l,2), можно оценить с помощью изменения свободной энергии в ходе первого теплового перехода, AGj(T):

AAGi_2 = AG2(T) - AGi(T) = - AGi(T0,2) = 6,7 ккал/моль, где Т02 обозначает температуру середины второго перехода белка.

Близость абсолютных значений AAGP и MGi_2 показывает, что энергетическое различие между двумя тепловыми переходами а-ПА щуки может объясняться энергетической «стоимостью» увеличенного объема изолированных полостей белка. Таким образом, полости а-ПА щуки являются, по всей видимости, основным фактором, обуславливающим нарушение структурной кооперативное™ белка.

Анализ расположения изолированных полостей в а-ПА щуки показывает, что они в основном сосредоточены на границах раздела между субдоменами АВ, CD и EF. Особенно сильно нарушена граница раздела между Са2+-связывающими доменами CD и EF (атомы, формирующие полости между этими доменами, показаны на Рис. 126,в). Множество изолированных полостей, расположенных между EF и CD субдоменами а-ПА щуки, по всей вероятности, ослабляют стабилизирующие взаимодействия между ними, что может приводить к потере структурной кооперативности в белке. Следовательно, граница раздела между доменами EF и CD может разделять два термодинамических домена белка. На основании анализа PONDR (Рис. 12а) можно ожидать, что наиболее стабильный из термодинамических доменов белка включает в себя EF субдомен, в то время как CD и АВ субдомены составляют менее стабильный термодинамический домен.

ВЫВОДЫ

1. Показано, что механизм теплового разворачивания парвальбуминов определяется связыванием катионов металлов. У апо-белков полностью отсутствуют видимые переходы первого рода, в то время как М§ - и На -

насыщенные формы обнаруживают одиночный переход типа «все-или-ничего»,

2+

а Са -насыщенная форма демонстрирует сложный механизм денатурации с участием, по меньшей мере, одного интермедиата. Показано, что Са -

связанная форма а-ПА щуки претерпевает два последовательных перехода типа «все-или-ничего».

2. Показано, что апо-парвальбумины щуки относятся к семейству белков с внутренней неупорядоченностью, а апо-а-ПА щуки обладает структурными свойствами, характерными для состояния расплавленной глобулы.

3. Показано, что интермедиат, возникающий в ходе тепловой денатурации 2+

Са -связанной формы а-ПА щуки, стабилизируется связанными ионами Са .

4. Анализ структурных особенностей ПА показывает, что наличие двух термодинамических доменов в а-ПА щуки является следствием ослабления междоменных взаимодействий за счет изолированных полостей, расположенных между субдоменами ЕБ и СО белка.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ

1. Permyakov, S.E., Pershikova, I.V., Zhadan, А.Р., Goers, J., Bakunts, A.G., Uversky, V.N., Berliner, L.J., and Permyakov, E.A. Conversion of human a-lactalbumin to an apo-like state in the complexes with basic poly-amino acids: toward understanding of the molecular mechanism of antitumor action of HAMLET. J. Proteome Res. 2005, V. 4, N 2, p. 564-569.

2. Permyakov, S.E., Nazipova, A.A., Denesyuk, A.I., Bakunts, A.G., Zinchenko, D.V., Lipkin, V.M., Uversky, V.N., and Permyakov, E.A. Recoverin as a redox-sensitive protein. J. Proteome. Res. 2007, V. 6, p. 1855-1863.

3. Permyakov S.E., Bakunts A.G., Denesyuk A.I., Knyazeva E.L., Uversky V.N., Permyakov E.A. Apo-parvalbumin as an intrinsically disordered protein. Proteins. 2008, V. 72, N. 3, p. 822-836.

4. Permyakov S.E., Karnoup A.S., Bakunts A.G., Permyakov E.A. Sequence microheterogeneity of parvalbumin pi 5.0 of pike: A mass spectrometric study. Biochim. Biophys. Acta. 2009, V. 1794, N. l,p. 129-136.

5. Permyakov S.E., Bakunts A.G., Permyakova M.E., Denesyuk A.I., Uversky V.N., Permyakov E.A. Metal-controlled interdomain cooperativity in paralbumins. Cell Calcium. 2009, in press (doi: 10.1016/j.ceca.2009.07.001).

6. Permyakov S.E., Pershikova I.V., Zhadan A.P., Goers J., Bakunts A.G., Uversky V.N., Berliner L.J., Permyakov E.A. Apo-like state of human a-lactalbumin (LAMPA) in the complexes with basic poly-amino acids. Book of contributions of 4th conference on Structure and Stability of Biomacromolecules SSB 2005, Kosice, Slovak Republic, Sept. 2005, p. 25-26.

7. Permyakov S.E., Pershikova I.V., Zhadan A.P., Bakunts A.G., Uversky V.N., Makhatadze G.I., Brooks C.L., Berliner L.J., Permyakov E.A. Electrostatic interactions of a-lactalbumin with histones and poly-aminoacids. Proceedings of

international meeting "Protein complexes in normal and pathological conditions", St.Petersburg, Moscow, 2006, p. 22-23.

8. Бакунц А.Г., Уверский B.H., Денесюк А.И., Пермяков С.Е. Ало-парвальбумин щуки - белок с внутренней неупорядоченностью. 11-ая международная школа-конференция «Биология - наука XXI века», Пущино, 29 октября - 2 ноября 2007 г., стр. 5.

9. Bakunts A.G., Permyakov S.E., Denesyuk A.I., Knyazeva E.L., Uversky V.N., Permyakov E.A. Thermally induced transitions in parvalbumin, regulatory calcium binding protein of fast muscles. Intl. Symposium «Biological motility: achievements and perspectives», Pushino, Russia, May 11-15,2008, p. 28.

10. Бакунц А.Г., Пермякова M.E., Князева E.JI., Пермяков С.Е., Пермяков E.A. Исследование влияния связывания катионов металлов на процессы тепловой денатурации парвальбумина. 12-ая международная школа-конференция «Биология - наука XXI века», Пущино, 10-14 ноября 2008 г., стр. 167.

Подписано в печать:

11.08.2009

Заказ № 2393 Тираж -100 экз. Печать трафаретная. Объем: 1 усл.п.л. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 \vw\v. autoreferat.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Бакунц, Ануш Гамлетовна

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

Состояния белка и переходы между ними.

Состояния белка.

Развернутое состояние белка.

Состояние расплавленной глобулы.

Предшественник расплавленной глобулы.

Тепловые переходы в белках.

Тепловые переходы в металл-связывающих белках.

Структурная кооперативность белка.

Белки с внутренней неупорядоченностью.

Физико-химические свойства белков с внутренней неупорядоченностью . 19 Особенности аминокислотного состава белков с внутренней неупорядоченностью.

Некоторые представители семейства.

Функции белков с внутренней неупорядоченностью.

Структурирование белков с внутренней неупорядоченностью.

Парвальбумины.

Функции парвальбуминов.

Структура парвальбуминов.29"

Механизм связывания ионов кальция парвальбумином-.36'

Влияние связывания ионов кальция на структурные свойства парвальбумина.

Равновесные константы связывания катионов.

Кинетика связывания катионов.42"

Влияние различных участков парвальбумина на его сродство к Са2+.

Тепловые переходы в парвальбуминах.

ЦЕЛИ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

Материалы.

Реактивы.

Выделение парвальбуминов крысы.

Выделение парвальбуминов щуки и трески.

Методы.

Очистка белка от ионов кальция.

Дифференциальная сканирующая калориметрия.

Круговой дихроизм.

Флуоресцентные измерения.

Оценка равновесных констант связывания Са2+ белком.

Расчет электростатических взаимодействий в белке.

Предсказания внутренней неупорядоченности белка.

Анализ полостей белка.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

Тепловое поведение апо-парвальбумина.

Измерение сродства парвальбуминов щуки к металлам и получение апоформы белков.

Отсутствие тепловых переходов первого рода в апо-форме парвальбумина щуки.

Сложное тепловое поведение апо-парвальбуминов.

Структурная характеризация апо-парвальбуминов.

Предсказания неупорядоченных областей в парвальбуминах щуки.

Энергетические оценки заряд-зарядовых взаимодействий в парвальбуминах щуки.

Тепловое поведение металл-насыщенного парвальбумина.

Тепловое разворачивание кальций-насыщенных парвальбуминов.

Структурные особенности интермедиата тепловой денатурации Са2+насыщенного а-ПА щуки.

Изменение кооперативности тепловых переходов а-парвальбумина щуки, вызываемое гуанидингидрохлоридом.

Тепловая денатурация магний- и натрий-связанных форм а-парвальбумина щуки.

Структурные детерминанты интермедиата тепловой денатурации Са2+насыщенного а-ПА щуки.

Заключение Диссертация по теме "Биофизика", Бакунц, Ануш Гамлетовна

ВЫВОДЫ

1. Показано, что механизм теплового разворачивания парвальбуминов определяется связыванием катионов металлов. У апо-белков полностью отсутствуют видимые переходы первого рода, в то время как Mg2+- и Na+-насыщенные формы обнаруживают одиночный переход типа «все-или-ничего», а Са2+-насыщенная форма демонстрирует сложный механизм денатурации с участием, по меньшей мере, одного интермедиата. Показано, что Са2+-связанная форма а-ПА щуки претерпевает два последовательных перехода типа «все-или-ничего».

2. Показано, что апо-парвальбумины щуки относятся к семейству белков с внутренней неупорядоченностью, а апо-а-ПА щуки обладает структурными свойствами, характерными для состояния расплавленной глобулы.

3. Показано, что интермедиат, возникающий в ходе тепловой денатурации

2+

Са -связанной формы а-ПА щуки, стабилизируется связанными катионами Са2+.

4. Анализ структурных особенностей ПА показывает, что наличие двух термодинамических доменов в а-ПА щуки является следствием ослабления междоменных взаимодействий за счет изолированных полостей, расположенных между субдоменами EF и CD белка.

БЛАГОДАРНОСТИ

Выражаю глубокую признательность моим руководителям Евгению Анатольевичу и Сергею Евгеньевичу Пермяковым за неоценимую помощь в работе, доброжелательность, внимание и терпение.

Большое спасибо Владимиру Николаевичу Уверскому за интересные научные беседы, ценные советы и помощь в оценках внутренней неупорядоченности белков. Александра Ильича Денесюка хочу поблагодарить за помощь в расчетах электростатических взаимодействий в белке и анализе полостей белка. Я очень признательна Майклу Хенцлу из Университета штата Миссури за предоставление плазмид парвальбуминов крыс.

Хочется поблагодарить Геннадия Павловича Серегина за починку некстати ломающихся приборов и, особенно, за разработку и техническое воплощение многих очень полезных устройств и приспособлений.

Я также глубоко признательна Екатерине Князевой и Марии Пермяковой за помощь в выделении белков и дружеское отношение, Антону Карнупу и Татьяне Хохловой за помощь в работе и поддержку, а также всему коллективу лаборатории Новых методов в биологии за внимание и участие.

И, конечно, хочу поблагодарить мою маму за то, что она самая лучшая.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Результаты, полученные в настоящей работе, показывают, что при изучении апо-форм металл-связывающих белков, обладающих предельно высоким сродством к ионам металлов, необходима тщательная оптимизация экспериментальных условий, обеспечивающая удаление от белка всех катионов, включая моновалентные.

В1 своей работе мы обнаружили, что отсутствие жесткой третичной структуры у апо-ПА обусловлено комбинацией особенностей аминокислотного состава белка, а также дестабилизирующим вкладом заряд-зарядовых взаимодействий карбоксилатов, участвующих в- координации кальция: При связывании» карбоксилатов с катионами кальция заряд-зарядовые взаимодействия становятся стабилизирующими (абсолютные величины энергий практически не- изменяются), что, по-видимому, в значительной степени обуславливает высокую термостабильность металл-загруженной формы белка.

Вызывает интерес возможная физиологическая'роль обнаруженной нами внутренней неупорядоченности апо-парвальбуминов. На первый взгляд, достаточно, высокие концентрации катионов металлов в цитозоле и высокие константы их связывания белком приведут к эффективной загрузке парвальбумина катионами металлов in vivo. Однако, некоторые ткани и клетки позвоночных, содержащие ПА, содержат также высокие концентрации мочевины (Yancey, 1994), что может снижать сродство белка к металлам, в предельном случае вызывая переход белка в апо-форму. Любопытно также то, что недавно ПА был обнаружен в нефронах мыши и человека (Beige et al., 2007), а именно в нефронах происходит концентрирование мочевины.

Обнаруженный в нашей работе непрерывный внутримолекулярный фазовый переход апо-ПА регистрируется в других бежах крайне редко и, по-видимому, является следствием значительной- сохранности вторичной структуры белка. Наблюдаемые в. белках непрерывные фазовые переходы отличаются от аналогичных фазовых переходов, рассматриваемых в классической физике. По этой причине необходимо создание формализованного описания таких переходов в белках.

Удивительной чертой а-ПА щуки является то, что его можно рассматривать как белок с внутренней неупорядоченностью (в апо-форме), как мезофильный белок (в №+-связанной форме), как термофильный (в Mg2+-загруженной форме) и даже как гипертермофильный (в Са2+-насыщенной форме) белок. Эта уникальная способность белка изменять термостабильность в таких широких пределах в ответ на достаточно небольшие изменения заряда и размера лиганда требует проведения дальнейших более детальных структурных исследований- каждой из форм белка, а также энергетики переходов между ними.

Не менее интересной особенностью а-ПА щуки, не обнаруженной ранее ни для одного металл-связывающего белка, является его способность изменять механизм тепловой денатурации в зависимости от вида связанного катиона металла. В то время, как тепловой переход Na и Mg форм, соответствует простому переходу между двумя, состояниями, Са2+-насыщенная форма демонстрирует два последовательных перехода типа «все-или-ничего», что свидетельствует о- наличии двух термодинамических доменов. Остальные исследованные парвальбумины также демонстрируют сложный механизм

9 -4тепловой денатурации в Са -насыщенной форме, однако сильное перекрытие отдельных тепловых переходов не позволяет судить о механизме денатурации. Возможно, что эти парвальбумины также обладают двумя термодинамическими доменами, обладающими, в отличие от доменов а-ПА щуки, сходной термостабильностью.

Термодинамический домен может состоять всего лишь из 20 аминокислотных остатков, как показывают исследования белка Trp-cage (Streicher and Makhatadze, 2007). Наши результаты,свидетельствуют о том,.что дополнительный термодинамический домен может возникать не только вследствие больших размеров белка, но и благодаря стабилизации промежуточного состояния, вызываемой связыванием лиганда. В этом смысле, появление дополнительного термодинамического домена ПА обусловлено не столько самой полипептидной цепью, сколько взаимодействием с лигандом.

Интересно, что наличие и приблизительное расположение термодинамических доменов- в структуре ПА можно предсказать на основе недавних наблюдений (Garbuzynskiy and Kondratova, 2008), свидетельствующих о существенном перекрытии расположения- ядер сворачивания и так называемых «корневых структурных мотивов», обладающих уникальной укладкой и хиральностью (Efimov, 1994). Каждый из кальций-связывающих доменов; ПА (как и тобой- кальций-связывающий центр типа «EF-рука») представляет собой корневой структурный-мотив типа «а-а уголок», который формируется- двумя- последовательными а-спиралями, расположенными крестообразно и образующими, левую суперспираль. Таким образом, субдомены EF и CD должны соответствовать двум различным ядрам сворачивания. Хотя наличие двух ядер сворачивания не обязательно означает, что белок- будет обладать двумя термодинамическими доменами, вероятно, что такая ситуация- возможна в условиях ослабления- взаимодействий между двумя субдоменами.

Известно, что ПА, являясь растворимым фактором- релаксации, ускоряющим фазу мышечного расслабления, переключается между Mg2+-связанным (клетка находится в состоянии покоя) и Са -связанным состояниями. Как мы показали, эти состояния ПА отличаются структурной кооперативностью, что проявляется в возникновении дополнительного термодинамического домена в Са2+-форме. Тем не менее; не ясно, проявляется ли наблюдаемое in vitro металл-зависимое переключение структурной кооперативности белка в клеточных условиях. Такая особенность парвальбумина может благоприятствовать ассоциации с неизвестной мишенью (или мишенями). Недавние экспериментальные работы (см. обзор (Schwaller, 2009)) указывают на то, что, по крайней мере, некоторые из представителей парвальбуминового семейства могут участвовать в опознавании мишени и, таким образом, не являются «чистыми» буферами катионов металлов.

Обнаруженный в данной работе дополнительный высокотемпературный

0 Аti/2~120°C) переход Са -насыщенного а-парвальбумина щуки может объяснить высокую аллергенность представителей парвальбуминового семейства. Общепринятая в домашних условиях термообработка (100°С) не уменьшает аллергенность ПА - такой нагрев недостаточен для необратимого разрушения нативной структуры белка, поскольку первый тепловой переход в Са2+-насыщенном белке полностью обратим. В'то же время, консервирование рыбы с применением высокотемпературной обработки (свыше 120°С) снижает ее аллергенность, что можно объяснить необратимостью высокотемпературного теплового перехода в белке. Крайне высокая термостабильность Са2+-загруженной- формы ранее наблюдалась для другого представителя семейства EF-руки, аллергена тимофеевки луговой, белка Phi р 7, температура середины перехода которого превышает 120°С (Henzl et al., 2008).

Представляет интерес дальнейшее исследование структурных особенностей молекулы ПА, обуславливающих, формирование двух термодинамических доменов. Одним из наиболее прямых методов экспериментальной проверки сделанного в работе вывода о дестабилизации границы раздела между субдоменами EF и CD а-ПА щуки может служить исследование мутантных форм ПА с аминокислотными заменами, приводящими к изменению размеров обнаруженных изолированных полостей белка.

Совокупность полученных в работе данных показывает, что металл-связывающие белки обладают рядом структурных особенностей, которые могут обуславливать необычное тепловое поведение белка. В целом, работа способствует пониманию структурных факторов, влияющих на тепловое поведение металл-связывающих белков, что может быть востребовано при решении многих прикладных задач: создания лекарственных средств белковой природы, различных биотехнологических применений, и пр.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Бакунц, Ануш Гамлетовна, Пущино

1. Acharya, K.R., Stuart, D.I., Walker, N.P., Lewis, M., Phillips, D.C., 1989. Refined structure of baboon alpha-lactalbumin at 1.7 A resolution. Comparison with C-type lysozyme. J.Mol.Biol. 208, 99-127.

2. Agah, S., Larson, J.D., Henzl, M.T., 2003. Impact of proline residues on parvalbumin stability. Biochemistry. 42, 10886-95.

3. Ahmed, F.R., Przybylska, M., Rose, D.R., Birnbaum, G.I., Pippy, M.E., MacManus, J.P., 1990. Structure of oncomodulin refined at 1.85 A resolution. An example of extensive molecular aggregation via Ca2+. J Mol Biol. 216, 12740.

4. Ahmed, F.R., Rose, D.R., Evans, S.V., Pippy, M.E., To, R., 1993. Refinement of recombinant oncomodulin at 1.30 A resolution. J Mol Biol. 230, 1216-24.

5. Altschul, S.F., Madden, T.L., Schaffer, A.A., Zhang, J., Zhang, Z., Miller, W., Lipman, D.J., 1997. Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs. Nucleic Acids Res. 25,3389-402.

6. Annoh, H., Inokuchi, Т., Ohta, K., Wakimoto, M., Ueda, Т., 1995. Immunohistochemical investigations of parvalbumin localization in the skeletal muscle fibers of rats. Okajimas Folia Anat Jpn. 72,221-6.

7. Aune, K.C., Tanford, C., 1969. Thermodynamics of the denaturation of lysozyme by guanidine hydrochloride. II. Dependence on denaturant concentration at 25 degrees. Biochemistry. 8,4586-90.

8. Baum, J., Dobson, G.M., Evans, P.A., Hanley, C., 1989. Characterization of a partly folded protein by NMR methods: studies on the molten globule state of guinea pig alpha-lactalbumin. Biochemistry. 28, 7-13.

9. Berchtold, M.W., Means, A.R., 1985. The Ca2+-binding protein parvalbumin: molecular cloning and developmental regulation of mRNA abundance. Proc Natl Acad Sci USA. 82, 1414-8.

10. Berman, H.M., Westbrook, J., Feng, Z., Gilliland, G., Bhat, T.N., Weissig, H., Shindyalov, I.N., Bourne, P.E., 2000. The Protein Data Bank. Nucleic Acids Res. 28, 235-242.

11. Blum, H.E., Lehky, P., Kohler, L., Stein, E.A., Fischer, E.H., 1977. Comparative properties of vertebrate parvalbumins. J.Biol.Chem. 252, 28342838.

12. Bottoms, C.A., Schuermann, J.P., Agah, S., Henzl, M.T., Tanner, J.J., 2004. Crystal structure of rat alpha-parvalbumin at 1.05 Angstrom resolution. Protein Sci. 13, 1724-34.

13. Breen, P.J., Hild, E.K., Horrocks, W.D., Jr., 1985a. Spectroscopic studies of metal ion binding to a tryptophan-containing parvalbumin. Biochemistry. 24, 4991-7.

14. Breen, P.J., Johnson, К.A., Horrocks, W.D., Jr., 1985b. Stopped-flow kinetic studies of metal ion dissociation or exchange in a tryptophan-containing parvalbumin. Biochemistry. 24, 4997-5004.

15. Brew, K., Vanaman, T.C., Hill, R.L., 1967. Comparison of the amino acid sequence of bovine alpha-lactalbumin and hens egg white lysozyme. J.Biol.Chem. 242, 3747-3749.

16. Burstein, E.A., 1971. Mol.Biol.(Mosk). 5, 214-225.

17. Burstein, E.A., 1977. Intrinsic protein fluorescence: Origin and applications, Vol. 7, VTNITI, Moscow.

18. Bussell, R., Jr., Eliezer, D., 2001. Residual structure and dynamics in Parkinson's disease-associated mutants of alpha-synuclein. J Biol Chem. 276, 45996-6003.

19. Bychkova, V.E., Ptitsyn, O.B., 1993. The state of unfolded globules of protein molecules is more quickly becoming a rule, rather than an exception., Biofizika. 38, 58-66.

20. Cates, M.S., Teodoro, M.L., Phillips, G.N., Jr., 2002. Molecular mechanisms of calcium and magnesium binding to parvalbumin. Biophys J. 82, 1133-46.

21. Cave, A., Pages, M., Morin, P., Dobson, C.M., 1979. Conformational studies on muscular parvalbumins cooperative binding, of calcium (II) to parvalbumins. Biochimie. 61, 607-13.

22. Celio, M.R., 1986. Parvalbumin in most gamma-aminobutyric acid-containing neurons of the rat cerebral cortex. Science. 231, 995-7.

23. Chaffotte, A.F., Guijarro, J.I., Guillou, Y., Delepierre, M*., Goldberg;. M.E., 1997. The "pre-molten globule," a new intermediate in protein folding. J Protein Chem. 16,433-9.

24. Chandra, N., Brew, K., Acharya, K.R., 1998. Structural evidence for the presence of a secondary calcium binding site in human alpha-lactalbumin. Biochemistry. 37,4767-4772.

25. Closset, J., Gerday, C., 1975. Conformational studies on parvalbumins by circular dichroism. Biochim Biophys Acta. 405,228-35.