Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Взаимодействие кальцийсвязывающих белков с катионами цинка и меди

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Взаимодействие кальцийсвязывающих белков с катионами цинка и меди"

АКАДЕМИЯ НАУК СССР ИНСТИТУТ БИОЛОГИЧЕСКОЙ ФИЗИКИ

На правах рукописи

УДК 577.352.335

Дережков Владимир Юрьевич

ВЗАШОДЕИСТВИЕ КАЛЬЩШСВЯЗЫВАЩИХ БЕЛКОВ С КАТИОНАМИ ЦИНКА И МЕДИ

(03.00.02 - биофизика)

Азт реферат диссертации на >. лсканке ученой степени кандидата биологических наук

Минск -1392

Работа выполнена в Институте биологической физики АН СССР

Научные руководители: доктор биологических наук

Е.А. Пермяков доктор биологических наук В.Л.Шныров

Официальные оппоненты: доктор биологических наук

С.Л.Аксенцев кандидат биологических наук Н.И.Покудин

Ведущая организация: биологический факультет МГУ

им. М.В.Ломоносова

Защита состоится "с?4" ¿хи^Л-й 1992 г. в ° часов на заседании Специализированного совета Д006.05.01 по защите докторских диссертаций по специальности "биофизика" при Институте фотобиологии АН Беларуси по адресу: 220733, г.Минск, ул. Ф.Скорины 27, Институт фотобиологии АН Беларуси

С диссертацией монно ознакомиться в библиотеке Института фотобиологии АН Беларуси

Автореферат разослан " 23 * ллд\>тя 1992 г.

Ученый секретарь -

Специализированного соЕета Л/м

кандидат биологических наук ЦщА' ' Л.М.Шейко

I. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТУ.

Актуальность проблемы. Самке различные биологические процессы, такие, как мышечное сокращение и секреция гормонов, деление клетки и фосфоршшрование белков, минерализация тканей и образование микротрубочек, а также целый ряд других подчиняются одному и тому же сигналу. Этим сигналом является локальное

О л,

повышение концентрата: ионов кальция (Са ). В организме кальций служит одним из "вторичных мессенджеров" - он передает внутриклеточным биохимическим системам сигналы, которые з форме электрических импульсов или химических соединений поступают к клетке извне на ее мембрану. Для того, чтобы кальций эффективно управлял клеточными процессами, его функционирование, в свою очередь, должно подвергаться регуляции. Поэтому в клетке в ходе эволюции возникла сложная система белков, которые взаимодействуют с Са2+, тем самым, управляя передачей и приемом внутриклеточных сообщений. Вследствие связывания одного или нескольких Са2+, конформация молекулы белка изменяется так, что последний переходит из неактивного состояния в активное или наоборот, тем самым, запуская или останавливая целую цепь биохимических реакций. В некоторых случаях Са2т-связывэюпще белки нитозоля сами осуществляют ответ на кальциевый сигнал, однако чаще они служат посредниками, активируя тот или иной фермент. К настоящему времени известно несколько десяткоз таких Са2+-связывающих белков. Структура и свойства части из них достаточно подробно изучены, но есть и такие, чья- биологическая роль известна лишь предположительно или не установлена' вообще (Пермяков, 1985).

Из всего пула известных Са2+-связываюших белков

2+

можно выделить группу белков с наивысшим сродством к Са (константа диссоциации ТО-6 - 1СГ9 м-1), так называемые Са2+-модулируемые Са2+-связываюшие белки в классификации Ван Элдик (Van Eldlk et al., 1982). Большинство этих белков являются цитоплазматическими и bw> они характеризуются особым отроением кальцийсвязывающих облг&ет-вй: а-спираль-петля-а-спираль.. К белкам этой группы относятся такие как: парвальбумин, тропсшш С, кальмодулин, белок S-JCG, витамин D-зависимый Са-"-связызаюший белок (кальбиндин), легкие цепи миозина, онкомодулин. а-лактальбумин и другие. Часть этих Сас -модулируемых шелков

являются эволюционно родственными друг другу с высокой степенью гомологичности. Есть белки, принадлежащие другим семействам. Мишени большинства Са2+-связывающщих белков не выявлены.

В последние года в литературе стали появляться сообщения о связывании некоторыми Са2+-связыванвдими белками катионов цинка (Zn2+) и меди (Си2+), причем, центрами, не совпадающий с центрами связывания ионов кальция и магния (Mg24"). Например, обнаружено, что такими центрами связывания обладают субъединицы белка S-100: S-ЮОа и S-100b (Baudier, Gerard, 1983), кальрегулин (Khana et al., 1986), а-лактальбумин (Murakami, Berliner, 1983).

Медь и цинк, наряду с другими микроэлементами, жизненно необходимыми организму, входят в состав ряда металлоферментов, участвующих в окислительно-востановительных и других биохимических реакциях. Достаточно высокая концентрация этих катионов наблюдается в таких тканях как печень, кости, головной мозг, предстательная железа, сетчатка. Так например, в цельной крови концентрация Си2+ и Zn2+ достигают значений 6,Э-1СТ5-1,17-1СГ4 и 5-10~4-1,275-10~4 г/100 мл, соответственно. Учитывая широчайший спектр распределения Са2+-связывашцшс белков по самым различным тканям (например, кальмодулин обнаружен во всех исследованных эукариотических клетках) можно объяснить интерес ряда исследователей к вопросу взаимодействия Са2+-связываквдх белков с катионами меди и цинка.

Исходя из вше сказанного, нам представлялось необходимым

проверить насколько широко среди Са2+-связываадих белков

распространена способность взаимодействия с катионами Си2+ и 2+

Zn , а так же более подробно и систематически изучить параметры связывания этих катионов Са2+-связываюшими белками и их влияние на физико-химические свойства этих белков, что в конечном счете может привести к уточнению регуляторных схем некоторых биохимических процессов с участием катионов цинка и меда.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы являлось исследование взаимодействий растворимых внутриклеточных Са2+-модулируемых Са2+-связывающих белков (на примере а-лактальбумина, парвальбумина и кальмодулина) с катионами цинка и меди. При этом были поставлены следующие задачи:

1. Определить параметы связывания и Си2+

парвальбумином, а-лактальбумином при разных условиях.

2. Исследовать влияние Са2+ на связывание ионое цинка и

меди этими белками.

3. Выяснить какие группы участвуют в связывании катионов

р > о «

Ъхг и С1Г в случае парвальбумина и а-лактальбумина.

4. Определить структурные изменения в белках при связывании

гп2+ и Си2+.

Научная.новизна и практическая ценность работы. Впервые

показано, что парвальбумин, может связывать ионы цинка и меди.

Оценены стехиометрия и эффективные константы связывания и

2 +

Си для парвальбумина и а-лактзльбумина. Исследования показали, что такое связывание изменяет физико-химические свойства белков: влияет на характер тепловых переходов, устойчивость белков к действию денатурирующих агентов, переводит белки в аго-подабное состояние. Обнаружено взаимодействие ' кальциевых и цинк-медных центров связывания бежа.

Полученные данные важны как для выяснения общих принципов кальциевой регуляции в биологических системах с относительно высоким содержанием ионов цинка и меди (печень, мозг, предстательная железа, сетчатка и т.д.), так и для установления биологических функций конкретных белков в клетке. Результаты позволяют учитывать влияние гп2+ и Си2+ при построении различных схем кальциевой регуляции с участием внутриклеточных Са2+-связывавдих белков, что может представлять практический интерес при решении определенных экологических проблем.

Апробация работы. Основные результаты работы были доложены на Всесоюзной конференции по спектроскопии биополимеров (Харьков, 1988), научных семинарах в группах спектроскопии биополимеров и молекулярной динамики и спектроскопии биологиче'ских систем Института биологической физики АН СССР (Пущино, 1988, 1989) и опубликованы в трех работах в отечественной и зарубежной научной печати: 3 статьи и 1 тезисы в материалах конференции.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, 3 глав, выводов и списка цитированной литературы. Работа изложена на 132 страницах, включает б таблиц и 25 рисунков. Список цитированной литературы состоит из 165 наименований.

II. МАТЕРИАЛЫ Я МЕТОПЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

В работе использовались электрофоретически чистые

лиофилизованные препараты кальмодулина из мозга быка,

а-лактальбумина из молока коровы, парвальбумина трески (ОайиБ

Callrias L.) pi 4,1.

Кальмодулин из мозга быка был выделен по стандартной: методике (Watterson et al., 1976; Burgess et al., 1980).

а-лактальбумин из коровьего молока, был выделен по методике Капланаса с соавторами (1975).

Парвальбумин трески (Gados Callrias L.) pi 4,1 выделяли по методике Хаеш с соавторами (Haiech et al., 1979) модифицированной к.О.н. Л.П.Калиниченко (ИБФ АН СССР). На начальной стадии проводили гомогенизацию белах спинных мышц и экстрагирование 15 мМ Tris-HCL, рН 7,5, и быстрое нагревание экстрата на газовой горелке до 70°С с последующим быстрым охлаждением. Сугорнатант после центрифугирования при 7Q00g в течении 15 минут наносили на колонку с Sephadex-75 (Pharmacia, Швеция). Гель-фильтрация шла с соблюдением стандартных правил со скоростью элюции до 1 мл/мин. Собранный второй пик, содержащий парвальбумин, для дальнейшей очистки наносился на колонку с ионообменной смолой DEAE-52 (Reanal, Венгрия или Serva, Германия). Элвдию проводили со скоростью 0,2-0,3 мл/мин линейным градиентом NaCl (0-0,3 М).

Получение апо-форм белков проводили по методике, предложенной Блюмом с соавторами (Blum et al., 1977) с использованием гель- хроматографии на колонке с SephadSx G-25 Fine (Pharmacia, Швеция), применяя в качестве хелаторов EGTA и EDTA. Для работы использовали только деионизованную воду и пластиковую посуду.

Чистоту препаратов проверяли электрофоретически,

спектрофотометрически и спектрофлуориметрически. Концентрацию

белков определяли спектрофотометрически, используя известные из

литературы коэффициенты экстинции £^=3300 М ■ см для

кальмодулина (К1ее,1977), Е,™=28540 М-1см-1 для а-лактальбумина

-i -i

(Kuwajimma et al.,1978) и E280=7189 M см ' для парвальбумина (Closset et al.,1976).

За изменениями, ггооисходящими в структуре белка следили методом собственной белковой флуоресценции с помощью спектрофлуориметра, сконструированного и построенного в Группе спектороскопии биополимеров ШЗФ АН СССР. Конструкция установки позволяет возбуждать флуоресценцию монохроматическим- светом, регистрировать излучение с передней стенки кюветы, проводить термостатирование или изменение температуры исследуемого образца з диапазоне 0-100°С. Ошибка при снятии спектра не превышала \%,

воспроизводимость по интенсивности -2%. Во все спектры вводили поправку на спектральную чувствительность установки.

При использовании в экспериментах соединений, поглощающих свет в области поглощения белковых хромофоров (экранировка) и (или) в области флуоресценции белковых хромофоров (реабсорбция), в спектры вносили соответствующие поправки при каждой длине волны (Бурштейн, 1968).

Первичную обработку спектров, а также подгонку экспериментальных данных теоретическими кривыми при определении стехиометрии и констант связывания проводили с использованием программы оптимизации по нелинейной регрессивной схеме (алгоритм Маркуарта) (Reich et al., 1972). Константы связывания EGTA-Ca2+ использованные в расчетах, брали из работ Шварценбаха и Фланка (Schwarzenbach., Flaschka, 1965).

Зависимость избыточной теплоемкости растворов белков от температуры определяли на дифференциальном адиабатическом сканирующем микрокалориметре ДА.СМ-4 (НПО "Биоприбор" АН СССР). Скорость прогрева образцов составляла 1 К/мин.

III. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

Парвальбумин - это небольшой (молекулярная масса 12 KDa), кислый (pi 3,5-5,0) белок, обладающий двумя центрами связывания ионов кальция (равновесные константа связывания лежат з диапазоне КСа = 107-109 М-1), за которые могут конкурировать ионы магния (KMg = 104-105 М-1 , натрия (KNa = 100 м-1) и калия (Ку. = 10 м~1). Согласно данным рентгеноструктурного анализа, молекула парвальбумина содержит шесть а-спиральных участков (обозначаемых буквами от А до F), причем петли между спиралями с и D, а также Ей? образуют два центра связывания ионов кальция. В наибольших концентрациях этот белок встречается в быстрых скелетных мышцах позвоночных, хотя измеримые количества его находят и в других тканях, например, в мозге.

а-лактальбумин, входящий в лактозосинтетазную систему, является белком, родственным лизоциму. Его молекулярная масса 14 KDa, изоэлектрическая точка лекит в диапазоне pi 4-5. Как и парвальбумин, а-лактальбумин имеет хорошо выраженное гидрофобное ядро. Его структура очень близка структуре лизоцима (Smith et al., 1987). а-лактальбумин имеет один центр связывания ионов кальция, так называемый Са2+-связываюшй "локоть", несколько отличающийся по своей структуре от "ЕР-руки" парвальбумина. Равновесная константа связывания Са2+ а-лактальбумином имеет

величину = 5"108 fT1, этот центр может быть занят ионом

1 — Л — 1

магния (К^ = 2" Ю-5 М ), ионом натрия (KNa = 100 м ) или калия (Кд = 10 ЬГ1).

В работе, кроме парвальбумина и а-лактальбумина, был использован и такой Са2+-связывающий белок, как кальмодулин. Кзльмодулин - универсальный Са2+-регуляторный белок, родственный парвальбумину. Его молекулярная масса 19 kDa, рГ 4,5. Согласно данным рентгеноструктурного анализа,-кальмодулин состоит из двух глобулярных частей, соединенных длинной а-спиралыо, причем каждая из глобулярных частей связывает по два иона кальция (КСа ="Ю6 М-1) • Ионы магния, калия и натрия кальмодулин связывает этими центрами слабо (К^ = 103 Ы~1, Кк = ККа = 50 М-1).

Наш была проверена возможность связывания парвальбумином ионов меди и цинка. Флуоресценция парвальбумина трески pl 4,1 обусловлена излучением единственного остатка триптофана. На Рис. 1а,б приведены результаты спектрофлуориметрического титрования ионами меда Са2+-насыщенной" формы парвальбумина. Увеличение концентрации Си2+ в растворе не влияет на положение и форму белкового спектра, однако уменьшает квантовый выход флуоресценции, причем кривая тушения выходит на плато при

Ъ

322 320 318

2.0

1.5

12 20 40

Рис.1. Спектрофлуориметрическое титрование парвальбумина трески

pl 4,1 ионами Си2+ (а,б), а затем - ионами Zn2+ (а',б').

Х~ (аТа')-положение максимума триптофановой флуоресценции;

а-(ö,б')- относительный квантовый выход флуоресценции. 10 мМ

-5

Hepes, pH 7,0; 20"С; 2 мМ СаС12; концентрация белка Р0=1,46*10 М; длина золны возбуждения 280,4- нм.

а а'

• • •

^^^ с 20 б-

молярном соотношении Сц2+:белок, равном 1:1. Это говорит о том, что парвальбумин связывает один ион меди на молекулу и этот процесс отражается в изменении лишь тушащих свойств окружения остатка триптофана. Последующее титрование кальций-медь-насыщенного белка ионами цинка (Рис.1 а',б'> почти полностью возвращает величину относительного квантового выхода излучения до первоначального значения. По-видимому, это говорит о том, что ионы меда и цинка конкурируют за один и тот же центр связывания, но окружение остатка триптофана в белке, связавшем Си2+ и , различно по тушащим свойствам. Спектрофлуориметрическое титрование Са2+-насыщенного парвальбумина ионами цинка вызывает лишь очень слабый рост выхода излучения.

Подгонка экспериментальных данных по флуориметрическому титрованию Са2+-насыщенного парвальбумина ионами меди с помощью теоретической кривой, отвечающей простейшей одноцентроЕой схеме

связывания, ***

дает значение константы 5 МО М

-1

Константа

Рис.2. Спектрофлуориметрическое титрование парвальбумина трески р1 4,1 , предварительно очищенного от катионов (0,1 моль Са2+ на 1 моль белка), ионами Си2+ (1) и ионами Са2+ (2). а-положение максимума флуоресценции; б-относитель-ный квантовый выход флуоресценции; 1-относи-тельная интенсивность флуоресценции при 320 нм (1320).10 мМ Нереэ, рН 8,0; 20 С. Концентрация белка 1,25*10~5 М.

связывания гп2н\ оцененная, исходя из схемы конкуренции От

гп2+ за один и тот же центр, составляет 5-104 М 1.

На Рис. 2 приведены данные по спектрофлуориметрическому титрованию парвальбумина трески р1 4,1^ предварительно очищенного от ионов кальция (не более 0,1 М Са т на 1 М белка, судя по положению спектра флуоресценции), ионами меди и для сравнения ионами кальция. Хорошо видно, что насыщение белка как Са2+, так и Си2+ вызывает коротковолновый сдвиг спектра флуоресценции и рост относительного выхода излучения, однако величина эффекта в случае титрования медью значительно меньше. Кроме того, кривые выходят на плато при соотношении катион:белок, равном 2:1 в случае кальция и 1:1 в случае меди, что особенно отчетливо видно по кривым относительного квантового выхода и относительной интенсивности флуоресценции (Рис. 26). Константа связывания Си2+, оцененная как и в предыдущем случав, составляет 106 м-1, т.е. немного выше , чем для Са2+-насыщенного белка.

На Рис. 3 приведены результаты спектрофлуориметрического титрования ионами меди Са2+-насыщеиного а-лактальбумина коровы.

''отн - 2.0

- 1.5

1.0 0.5

-1-,-1-,-г

4 8 12

16 Си/Р„

Рис.3. Спектрофлуориметрическое титрование Са1^ -насыщенного а-лактальбумина ионами А-положение максимума флуоресценции

(2); q-относительный квантовый выход флуоресценции (1); 10 мМ Hepes, „pH 8,0; 1 мМ СаС12; 20°С. Концентрация белка 2,3*W~5 М.

Хорошо видно, что связывание Си2+ белком приводит к длинноволновому сдвигу спектра триптофановой флуоресценции (как

при освобождении белка от Са2+ или при связывании 2п2+) а ^к-э к уменьшению выхода излучения (напротив, в случае овязиетя ¿п и при освобождении бежа от Са2+ выход излучечи* увеличивается). Кривые титрования имеют Б-обпазный характер -о' говорит о том, что белок связывает несколько ионов мрда молекулу. По этой причине экспериментальные точки ч* относительного квантового выхода флуоресценции аппроксимиров!™ теоретическими зависимостями, расчиганными согласно схеме:

Р + nCu2+

PCV

(1 )

где Р - белок. Подгонку осуществляли путем варьирования пи к. Наилучшая подгонка получается при п = 2,2 и К = 4*103 м-1.

На Рис. 4 приведены данные титрования ионами меди

Рис.4. Спектрофяуориметрическое титрование апо-формы а-лактальбумина ионами Си2+. Х-положение максимума флуоресценции (1); q-относительный квантовый выход флуоресценции (2). 10 мМ Hepes, pH 3,0. Концентрация белка 2,5*10 М.

К

а-лактальбумина, предварительно очищенного от ионов кальция (0,2 М Са2+ на 1 М белка). Кривые имеют сложный характер: спектр 'флуоресценции сдвигается сначала в коротковолновую, а затем з длинноволновую сторону; уменьшение выхода излучения происходит также в два этапа. Это указывает, по-видимому, на то, что белок

в этом состоянии связывает вначале один ион меди, а затем еще несколько:

К1

F + Cu2+ - РСи

(2)

ч

рСи + nCu2+ rrrr: РСип+1

Экспериментальные данные для квантового выхода излучения аппроксимировали теоретическими зависимостями, расчитакшми согласно схеме (2). Наилучшая подгонка теоретической кривой к экспериментальной достигается при К1 = вЧО4 М-1, К2 = 4МО3 М~1 и п = 3,2, т.е. в отсутствии Са2+ у а-лактальбумина появляется дополнительный более сильный центр связывания ионов меди.

Попытки титрования ионами цинка а-лактальбумина, насыщенного Са2+ и Си2+, довольно быстро приводят к сильной агрегации белка.

Согласно результатам, полученным методом ЭПР в работах (Murakami, Berliner,1983; Muscl, Berliner,1985), константа связывания ионов цинка Са2+-насыщензшм а-лактальбумином составляет 1,8"105 М-1. По нашим данным, она почти на порядок меньше. По-видимому, в силу каких-либо причин, метод собственной белколовой флуоресценции не "видит" заполнение ионами Zn2+ сильного центра а-лактальбумина. Для проверки этого предположения было проведено калориметрическое титрование Са2+-формы а-лактальбумина ионами Zn2+, которое показало, что этот белок имеет центры связывания ионов цинка с константой большей чем 1Сг М , заполнение которых не изменяет собственную флуоресценцию а-лактальбумина.

На Рид. 5 приведены результаты спектрофлуориметрического титрования Са2+-насыщенного кальмодулина из мозга крупного рогатого скота ионами меда, а затем ионами цинка. Флуоресценция кальмодулина определяется излучением двух остатков тирозина. Полученные результаты могут быть интерпретированы так же, как отражение конкуренции Си2+ .и Zn2+ за одни и те же центры связывания. Слабая S-образность кривой титрования белка ионами Си2+ говорит о том, что кальмодулин связывает больше одного иона меди на молекулу. Оценки показывают, что константы связывания йоное меди и цинка кальмодулином лежат в диапазоне 103-Ю4 м-1.

Для того, чтобы выяснить какие группы в исследованных

белках участвуют в связывании ионов меди и цинка, мы провели ряд экспериментов по измерению рн-зависимостей параметров флуоресценции белков в присутствии Са2+ и в присутствии Са2+ и Си (Рис. 6). Из графика хорошо видно, что в присутствии меди,

'но г.о

1.5 1.0

0 1 2 3 4 0 5 10 15 г^о

Рис.5. Спектрофлуориметрическое титрование Са -насыщенного кальмодулина ионами Си2+ (а), а затем ионами гп2+ (б). 10 мМ Нереэ, рН 7,0; 2 мМ СаС12; 20°С. Концентрация белка 6*10~5 М.

Рис.6. Спектрофлуориметри-ческое титрование а-лакт-альбумина в присутствии Са2+(2,5*1М) (1); и в присутствии Са2+ и Си2+ (3,4*10~5 М) (2); 10 мМ МеэТарз; концентрация белка 2,5*10~5 М.

при зэкислении раствора от рЯ 7,5 до рН 5 спектры флуоресценции а-лактальбуминз сдвигаются з коротковолновую сторону, что сопровождается ростом выхода излучения. Для растворов белка в

присутствии только Са2+ изменений параметров флуоресценции в этой области рН не наблюдается. При дальнейшем зэкислении растворов белка, как кальций-» так и кальций-медь-насшценного а-лактальбумина наблюдается рост выхода флуоресценции и сдвиг в длинноволновую область спектра флуоресценции. Этот, так называемый, кислый переход, подробно описанный в работах Пермякова с соавторами (Регтуакоу ег а!., 1981; 1985), обусловлен вытеснением из центра связывания Са2+ ионами водорода.

По-видимому, изменение флуоресцентных параметров в области рН 7,5-5,0 для кальций-медь-нагруженного бета, обусловлены освобовдением белка от связанных ионов меди в результате протонирования остатков гистидина (коровий а-лактальбумин содержит 3 остатка гистидина: 32, 86 и ЮТ). Эффективная константа связывания Сц2+ ' а-лактальбумином при рН 4,5, расчитанная из простейшей одноцентровой схемы связывания, имеет значение 5*10^ м-1, т.е. сродство а-лактальбумина к ионам меди при рН 4,5 (при этом значении рН остатки гистидина протонированы) примерно на порядок величины ниже, чем при нейтральных рН. Данные Берлннера с соавторами (Вег11пег а1.,1986), полученные методом ЗПР, также говорят о том, что именно гистидинк принимают участие в связывании иона меди. Те же авторы измерили расстояние между кальциевым центром и центром связывания меди § а-лактальбумине: эта величина, по их оценкам составляет ~ 10 А.

В первичной последовательности парвальбумина трески р1 4,1 остатков гистидина нет, т.е. в этом случае центр связывания ионов Си2+ и гп2+, по-видимому, организован по иному. Скорее всего, в случае парвальбумина в связывании этих катионов принимают участке лишь атомы кислорода карбоксильных и карбонильных групп.

Для того, чтобы сравнить состояние белков, насыщенных Са24, и белков, насыщенных Са2+ и Си2+ или гп2+, мы исследовали влияние этих катионов на тепловую денатурацию белков. На Рис. 7 приведены данные методов собственной флуоресценции и микрокалориметрии по тепловой денатурации Са2+-насышенного парвальбумина трески в отсутствии и присутствии ионов меди. Денатурационное разворачивание белка приводит к увеличению степени экспонированности остатка триптофана, что отражается в длинноволновом сдвиге спектра флуоресценции (Рис. 7а). На Рис.

76 приведена температурная зависимость степени завершенности денатурациокного перехода в белке (Л), определенная из флуоресцентных данных по ранее описанному методу (Permyakov et ai., 1984; 1985).

Рис.7. Тепловая денатурация парвальбумина трески в присутствии ионов Са2+, Си2+ и гп2+: а) -положение максимума флуоресценции; в) -степень заверщенности теплового перехода в белке; концентрация белка 2*10-5 М; концентрация ионов, соответственно: 0,1 мМ СэС12, 3*10~5 М Си2+ и 3,1* 10~5 М Znг^. с) -избыточное теплопоглощение как функция температуры для парвальбумина трески (Р0=1,1*10~4 М). 0,1 мМ СаС1р, 5,7*10-3 М Си2+, 5,з*ю_ м гп2+.

Из полученных данных следует, что связывание ионов меди приводит к тому, что тепловая денатурация начинается примерно на 10°С раньше, хотя максимум пика тешюпоглощения з присутствии Си2+ сдвинут почти на 3°С в сторону более высоких температур. Экспонирование остатков триптофана в присутствии ионов меди происходит существенно медленее, чем в их отсутствие. Обращает на себя внимание очень .большой рост площади под пиком

В

теплопоглощения (энтальпии денатурации) в присутствии Си' настоящий момент этот эффект пока не понятен.

На Рис. 8 приведены аналогичные данные по тепловой денатурации Са2+-насыщенного а-лактальбумина в отсутствии и присутствии ионов меди. В этом случае связывание

Си2+ также

Рис.8. Тепловая денатурация а-лактальбумина: Я-положение максимума флуоресценции (а); ^-нормированная степень завершенности теплового перехода в белке, расчитанная из флуоресцентных данных (б); в отсутствии (1) и присутствии ионов Си2+(3,5*1СГ4 М) (3*10-5 М СаС!,); концентрация белка Р0=2*1О М. в-термограммы для а-лактальбумина (Р =1,1 »1СГ4" М) в отсутствии (1) и

О '^4. _2

присутствии ионов Си"' (5,7*10 М) (2); 10 мМ Нереэ, рН 7,5.

приводит к сдвигу теплового перехода б сторону более низких температур, что хорошо видно из флуоресцентных данных (Рис. 8 а,б). Термограмма для а-лактальбумжна в присутствии Си2+ (Рис.

8 в) измерена в условиях, когда белок еще не полностью насыщен

?+

ионами меди, так как увеличение концентрации Си вызывает агрегацию белка,, а понижение концентрации белка возможно лишь на небольшую величину из-за методических ограничений. В этих условиях пик теплопоглощения разделяется по меньшей мере на два, один из которых сдвигается в сторону более низких, а другой - в сторону более высоких температур.

Проведение аналогичных измеаений на кальмодулине осложняется тем обстоятельством, что нальмодулин обладает несколькими

тепловыми переходами, положение и форма которых сложным образом зависят от концентрации катионов в растворе.

Связывание ионов цинка парвальбумином и а-лактальбумиком вызывает качественно такое же действие на тепловые переходы в этих белках, как и связывание ионов меди. Следует добавить, что связывание Си2+ и Zn2+ этими белками делает их менее устойчивыми к воздействию денатурирующих агентов, например, таких как мочевина. Денатурадаонное разворачивание белков в присутствии этих катионов начинается при значительно меньших концентрациях денатуранта, чем для белка в Са2+-нагруженном состоянии ( 3-4 М мочевины для Zn2+ и 6,5-7,5 М для Си2+).

Результаты нашей работы в совокупности с литературными данными показывают, что связывание ионов меди и цинка является,

р4.

повидимому, свойством, общим для многих Ca -связывающих белков. Возможно, что для некоторых из них это свойство имеет физиологическое значение. Например, авторы работы (Murakami, Berliner, 1983) предположили, что в случае а-лактальбумина связывание Са2+ необходимо для стабилизации структуры белка, а

Oi

связывание Zn необходимо для перевода его з активное состояние. Вполне возможно, что в настоящее время мы недооцениваем роль ионов цинка и меди в функционировании многих систем.

Нам представляется также, что результаты нашей работы важны с точки зрения решения некоторых проблем, связанных с загрязнением окружающей среды ионами тяжелых металлов, поскольку показывают какое серьезное влияние на структуру, а следовательно и на функции белков, оказывают такие ионы, как медь и цинк.

вывода.

1. Обнаружено специфическое связывание ионов цинка и меди парвальбумином трески, причем связывание происходит по центру, отличному от центров связывания ионов кальция.

2. Б присутствии Са2+ константа связывания Си2+ для

S — 1

парвальбумиЕа трески составляет ь*10- М , в отсутствии кальция-IG6 М-1.

3. Обнаружено, что коровий а-лактальбумин связывает несколько ионов меди (цинка) на молекулу: минимум 2 Си2+ с константой ¿«'О-3 М-1 в присутствии Са2+; один Си2+ с константой

** _ "* 0 4- ~ _ "1

3*!ж ' л минимум 2-3 Си1-1 с константой 4*IG'' М в отсутствии Ca-"1". Обнаружены более сильные центры связывания Zrr~ (Cu2+) в i-лэк?альбумине с константой выше 'С~ М~:, связывание по котооым

не изменяет собственную флуоресценции белка.

4. Зависимость параметров связывания ионов меди и цинка от концентрации Са2+ свидетельствуют о существовании взаимодействий между центрами связывания Ca и центрами связывания Znc- и Си"' з парвальбумине и а-лактальбумяне.

5. Показано, что в координации ионов цинка и меди в а-лактальбумине принимают участие боковые цепи остатков гистидина.

6. Показано, что связывание ионов цинк.-: и меди Саг+-насы2ценным парвальбумином и а-лактальбумином существенно сказывается на их структуре, что отражается в понижении их термостабильности и стабильности к действию такого денатурирующего агента, как мочевина.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 1 Пермяков Е.А, Каликиченко Л.П., Морозова Л.А., Дережков В.Ю., Багелова Я., Анталик М.. Взаимодействие катионов меди и цинка с кальцийсвязывающими белками. -Молекулярная биология, 1988, т.22, вып. 4, с. 984-991.

2. Permyakov Е., Morozova L., Kaliníchenco L., D^rszhkov V. Interaction oí a-lactalbumin with Cu2+. -Biophysical Chemistry, 1988, v. 32, p. 37-42.

3. Пермяков E.A., Морозрва Л.А., Калиниченко Л.П., Л-режков В.Ю. Использование методов флуоресцентной спектрос.-.опии для исследования взаимодействий кальпийСЕЯзывающих белков с катионами меди и цинка. В кн.: Тез. докл. VI Всесоюз;-:. кокф. по спектроскопии биополимеров. Харьков, 1988, с. 235-22--..

4. Permyakov е., Kalinichenco I., Derezhkov v., -ntalik M., Meinholtz С and Berliner L. Interaction of cupr'. - ion with parvalbumin. -Biophysical Chemistry, 1991, (в печати .