Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Полусинтетические эксперименты с фрагментами парвальбумина

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Полусинтетические эксперименты с фрагментами парвальбумина"

г* 4 и ''

ОРДЕНА ЛЕНИНА И ОРДЕНА ДРУЖБЫ НАРОДОВ АКАДЕМИЯ НАУК- УКРАИНСКОЙ ССР ИНСТИТУТ МОЛЕКУЛЯРНОЙ ШОЛОГИИ И ГЕНЕТИКИ

На правах рукописи

МЩВВДКИН Вячеслав Николаевич

УДК 577.112.824.4.012 547.962; 547.964

ПОЛУСИНТЕТИЧЕСКИЕ ЭКСПЕРИМЕНТЫ С ФРАГМЕНТАМИ ПАРВАЛЬБУМИНА

03.00.03 - молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Киев - 1988

Работа выполнена в лаборатории химии пептидов Института белка АН СССР, г.Пущино Московской области.

Научный руководитель:

Доктор химических наук, профессор Ю.В.ШТИН ' Официальные оппоненты:

Доктор биологических наук, ст. научн. сотр. В.К.КИБИРЕВ Кандидат химических наук,, ст. научн. сотр. В.И.ДЕЙГИН

Ведущая организация: Институт молекулярной биологии АН СССР Защита состоится Л^ЬО.//^ Х988 г. в

<0 час

на заседании Специализированного совета К 016.11.01 Института молекулярной биологии и генетики АН УССР по адресу: 252627, г.Киев - 143, ул. Заболотного, 24.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института молекулярной биологии и генетики АН УССР.

Автореферат разослан "°2(" ^¿ЖагУ]/«? 198 г.

Ученый секретарь Специализированного совета К 016.II.01 кандидат биологических наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Диссертация посвящена вопросу развития полусинтез^ одного из перспективных направлений белковой инженерии-и-решению с использованием полусинтетического подхода конкретных задач по выяснению структурно-функциональных особенностей строения кальцийсвязывающих белков. Работа завершает цикл доследований, посвященных выяснению структурно-функциональных особенностей строения кальцийсвязывающих белков, проводимых в ла-5оратории химии пептидов Института белка АН СССР. Эти исследова-{ия, начатые с проверки гипотезы о существовании общего эволюци-)нного предшественника кальцийсвязывающих белков получили даль-[ейшее развитие в получении и изучении свойств полусинтетических >рагментов парвальбумина, содержащих один или два кальцийсвязы-;ающих домена.

Полусинтез фрагментов белков является одним из направлений елковой инженерии. Этот метод возник на основе сочетания и разним методов пептидной химии и химии белка сравнительно недавно, оэтому неудивительно, что в диссертации уделяется большое вни-ание решению задач, принципиально важных для развития методоло-ш полусинтеза, прежде всего - определению границ применимости эдорастворимых активированных эфиров для получения полусинтета-зских фрагментов.

Цель и задачи работы. Цель настоящей работы заключалась в элучении фрагментов парвальбумина, содержащих замены аминокислот 1 гг-конце и изучении их физико-химических характеристик длявыяс-!ния удельного вклада ионных и гидрофобных взаимодействий в фор-[рование пространственной структуры кальцийсвязывающих белков. В »ответствии с этим были сформулированы следующие задачи:

1. Выделить в чистом виде парвалъбумшы из белых мышц щуки охарактеризовать их методом собственной флуоресценции.

2. Синтезировать пептиды участка 28-37 парвальбумина, полу-ть их активированные производные, а также активированные прош-дные различных аминокислот для последующей их конъюгации с при-цными фрагментами парвальбумина.

3. Выбрать подходящую защитную группу для модификации пар-льбуминапо ~е-аминогруппам остатков лизина, блокировать с по-цью выбранной защитной группы все остатки лизина. Убедиться,

э после деблокирования белок полностью восстанавливает свои эйства.

4. Расщепить модифицированный парвальбумин и выделить фраг-гаы 75-108 и 38-108 парвальбумина, пригодные для полусинтеза,

т.е. имеющие свободную с<-аминогруппу и блокированные ¿-аминогруппы.

5. Получить полуеинтетические фрагменты парвальбумина и сравнить их свойства с природныш фрагментами парвальбумина и мезду собой в соответствии с поставленной целью.

Научная новизна и практическая ценность. Методом собственной флуоресценции охарактеризованы два ранее мало изученных парвальбумина - парвальбумин II и парвальбумин Ш щуки. Изучены кальциисвязывающие свойства фрагментов парвальбумина Ш и их аце-тимидированных производных. Разработан метод, позволяющий присоединять к и-концу фрагментов парвальбумина производные аминокислот с помощью этого метода получены полусинтетические фрагменты парвальбумина, содержащие различные аминокислотные остатки на м-кон-це; проведено сравнительное изучение полученных фрагментов. Синтезированы фрагменты участка 28-37 полипептидной цепи парвальбумина, получены их активированные производные и проведены экспери менты по присоединению синтетических пептидов к Н-концу фрагмент 38-108 парвальбумина.

Для химического синтеза пептидов предложен новый реагент -дипентафторфенилкарбонат, который внедряется в промышленное производство.

Публикации и апробации. Результаты работы докладывались на УТ Всесоюзном симпозиуме по химии белков и пептидов (Рига, 1983] на 16 конференции Федерации европейских биохимических обществ (Москва, 1984) и научных семинарах Института белка АН СССР. Основные результаты диссертации опубликованы в 8 печатных работах получено I авторское свидетельство на изобретение.

Объем и структура работы. Диссертация изложена на 383 стра ницах и состоит из введения, литературного обзора, теоретическо части, экспериментальной части и выводов. Работа содержит 8 таб лиц,'27 рисунков. Список литературы включает 235 наименований.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Парвальбумина - небольшие кальцийсвязывающие белки, в болз шом количестве содержащиеся в мышцах животных. Особенности стр ния парвальбуминов - их доменная организация, высокая степень г мологии аминокислотных последовательностей как меаду доменами, так и между различными кальцйззязываадими белками послужили ос» ванием для выдвижения гипотезы о существовании общего эволщио: ного предшественника кальцийсвязываюцих белков, который по вел

чине соответствует одному кальцийсвязыващеыу домену (Гудман, Пешер, 1977).

Для проверки этой гипотезы различными авторами проделана большая работа по выделению и изучению различных фрагментов парвальбумина. В ходе этих исследований, особенно после получения данных о пространственной структуре тропонина с, взгляды на эволюционное развитие парвальбуминов в значительной степени изменились. Стало ясно, что для эволюционных построений-необходима дополнительная информация о связи мевду пространственной структурой парвальбуминов, их способностью связывать ионы кальция и аминокислотной последовательностью.

Приступив к изучению фрагментов парвальбумина мы столкнулись с необходимостью заново измерить константы связывания кальция различными фрагментами, так как приведенные в литературе данные относились к фрагментам, выделенным из различных парвальбуминов, константы связывания кальция были измерены разными методами. С самого начала эксперименты были спланированы таким образом, чтобы после изучения известных, описанных в литературе фрагментов парвальбумина из них можно было получить гибридные полусинтетические фрагменты, присоединяя к н-концу фрагментов парвальбумина остатки различных аминокислот, и тем самым получить дополнительную информацию о строении парвальбуминов. Проведение таких экспериментов необходимо по ряду причин. Во-первых, как это будет показано на примере ер-домена парвальбумина, участок расщепления полипептидной цепи не всегда расположен там, где это необходимо для более полного изучения свойств фрагмента. Во-вторых, полусинтез позволяет осуществлять направленные замены аминокислотных остатков, что дает возможность проводить сравнительное изучение фрагментов белков, содержащих такие замены.

В качестве объекта мы выбрали парвальбумин Ш из белых мышц щуки. Выбор этого парвальбумина объясняется тем, что парвальбумин Ш щуки имеет удобные участки расщепления полипептидной цепи, расположенные между кальцийсвязывающими доменами. Выбрав белок по этому критерию, мы столкнулись с необходимостью охарактеризовать парвальбумин и сравнить его с другими парвальбуминами.

I. Определение характеристик парвальбуминов щуки методом собственной флуоресценции

Первым этапом диссертационной работы является характеризацш парвальбумина Ш щуки методом собственной флуоресценции. Белок был охарактеризован по флуоресценции остатков фенилаланина (других хромофоров белок не имеет). Свойства парвальбумина 111 сравнивают-

3

ся со свойствами парвальбумина П щуки, изученного по флуоресценции остатка Туг 47, и со свойствами других парвальбуминов.

рН-зависимость спектров флуоресценции парвальбуминов. На рис.1 представлены результаты экспериментов по рН-титрованию парвальбуминов. Парвальбумины стабильны в интервале рН 4-1-8. При титровании парвальбумина П вводилась поправка на изменение спектра флуоресценции остатка тирозина при превращении его в тирозинат.

РН

РисЛ. рН-зависимость квантового выхода флуоресценции для кальциевой формы парвальбумина Ш (кривая 1) и парвальбумина П (кривая 2). На кривой 3 представлено измерение адсорбции (X =300 нм) остатка Туг 47 парвальбумина П, вызванное образованием тирозината.

Денатурация парвальбуминов как в кислой, так и в щелочной среде обратима.

Температурные эффекты. Контролируя тепловую денатурацию парвальбуминов методом собственной флуоресценции, приходится учитывать температурное гашение флуоресценции и необходимость постулировать, что обмен энергией мевду остатками фениналанина впарваль-бумине Ш эффективен и эти остатки осциллируют как один эмиттер. В табл.1 приведены результаты расчета термодинамических характеристик тепловой денатурации парвальбуминов. Видно, что белки весьма устойчивы при нагревании. Полученные данные находятся в хорошем соответствии с результатами, полученными микрокалориметрическим методом, что свидетельствует о том, что метод собственной флуоресценции достаточно объективен.

Денатурация мочевиной. На рис.2А представлены результаты

Таблица I

Параметры термической денатурации парвальбуминов щуки (в присутствии Са2+). рассчитанные из кривых плавления

Парвальбумин

Ш (р1 5,0) 5? 226+95 690+10 78 268+5 76-1+ИО П (р! 4,2) 52 192+42 590+30 80 230+21 653+50

дн.,, кД ж/моль

ДЗ ДжИ^олЬ'

т

Т рср'

! ДНр, ! ДЭр, ! ! !кД ж/моль! Дж/моль • К

1 I

о 5 10 0 100 200

Мочевина, М [Са2+]/ро

Рис.2. А. Зависимость квантового выхода флуоресценции от концентрации мочевины в растворе.

1 - фенилаланиновая флуоресценция парвальбумина Ш.

2 - тирозиновая флуоресценция парвальбумина П.

Б. Титрование парвальбумина Ш (I) и парвальбумина П (2) ионами кальция в 9,7 М мочевине.

эксперимента по денатурации парвальбуминов мочевиной. Видно, что белки начинают денатурировать при концентрации мочевины >6 М. На рис.2Б представлены результаты титрования парвальбуминов кальцием в 10 М мочевине. При 100-кратном избытке ионов кальция белок способен переходить в кальциевую форму.

Определение констант связывания ионов кальция и магния.Коне-танты связывания ионов кальция и магния определяли как по результатам прямого титрования ионами металлов, так и по резуль-

5

татам обратного титрования белка с помощью ЭГТА. Кроме того, константы связывания ионов кальция и магния определяли из экспериментов по рН-титрованию парвальбуминов. Константы рассчитывались, исходя из ступенчатой схемы связывания ионов металлов белком. Для того чтобы измеренные константы можно было использовать при изучении поведения белков в мышцах, нами также измерены константы связывания ионов кальция и магния на фоне физиологических концентраций ионов натрия и калия. Результаты экспериментов приведены в таблицах 2 и 3. С наибольшей точностью значения к^ и могут быть определены для парвальбумина в экспериментах по флуориметрическому титрованию белка с помощью ЭГТА, поскольку в этом случае они сравниваются с известным значением константы связывания кальция.

Таблица 2

Равновесные константы связывания Са2+ со- и ЕР-участками парвальбуминов щуки, определенные тремя различными способами при 20°С, рН 8Д*

Способ ! Парвальбумин Ш Парвальбумин П

определения констант | (м-1) 4 (,г1) (м-1) ; 4 (м~1)

Титрование Са^+ Титрование ЭГТА рН-титрование 106 1,2.ТО8 6,3-ТО8 -ю6 7,5-Ю8 4,3-Ю8 106 3,1-Ю8 2,6-Ю8 2,2-Ю5 2,2-Ю4 6,9-Ю5

Таблица 3

Равновесные константы связывания ионов Са2+, На+

и к+ парвальбуминами щуки при 20°С, рН 8,1м

Парвальбумин Связывание Са2+ ! Связывание м 1 КНа+ | V

ю5 к^ ! 1ос ! 1о6К™ !1овК^ \

Ш (р1 5,0) 8,6+0,8 8,8+0,8 5,6+0,5 5,1+0,5 39+5 9+3

П (р! 4,2) 8,5+0,8 ■5,3+0,8 5,4+0,5 3,6+0,5 36+5 19+5

к3десь и далее константы связывания ионов определены с точностью +0,5 порядка измеряемой величины.

Таким образом, было показано, что парвальбумины щуки являются типичными представителями парвальбуминов и результаты последующих экспериментов с фрагментами парвальбумина Ш щуки могут быть отнесены ко всему классу этих белков.

2. Обратимая модификация аминогрупп парвальбумина защитными группами Парвальбумин Ш щуки блокировали по £-аминогруппам остатков лизина с помощью различных защитных групп с целью определить их пригодность для полусинтетических экспериментов. К защитной группе предъявлялись следующие требования: мягкие условия модификации белка, полнота блокирования -аминогрупп белка, стабильность защитной группы при расщеплении белка на фрагменты, деблокирование ь -аминогрупп в условиях, исключающих необратимую денатурацию белка. Из изученных защитных групп перечисленным требованиям отвечают Вое- и Ао1ш—группы (табл.4). После модификации по ¿-аминогруппам и последующего деблокирования белок сохраняет способность связывать кальций. Ацетимидированный парвальбумин не отличается по способности связывать ионы кальция от немодифицирован-ного белка.

Таблица 4

Модификация и деблокирование парвальбумина Ш щуки

Защитная группа !Полнота !модифика- !ции !Полнота •¡деблокирования ! • ! Условия деблокирования

'¿Ш2)~ + - безводн. нр, I ч н2/?а, -10 ч

Ъ{С1)~ + - безводн. нр, 1ч н2/рй, 10 ч

- тра, 40 мин

Вое- + + тра, 40 мин

мзо- - а) ШР (0,7) - метанол (0,25) -- 4 М ИаОН (0,05), 10 мин б) метанол (0,5) - 0,05 М Ш4нсо3 (0,5) - 4 М НаОН (0,05), рИ И,5; 10 ч

Асхт- + + ■I М метиламин, рН -12, 72 ч

Нрэ- - + тра , 40 мин

3. Выбор способа присоединения производных аминокислот и пептидов к фрагментам парвальбумина

Мы остановили свой выбор на использовании Н-оксисукцинимид-ных и 2-нитро-4-сульфофениловых активированных эфиров производных аминокислот и пептидов, к-оксисукциншвдные эфиры широко используются для полусинтеза фрагментов белков. Недостатком этого типа активированных эфиров является необходимость использовать для проведения реакции смесь воды с органическими растворителями. 2-нитро-4-сульфофениловые эфиры, предложенные для синтеза пептидов в водной среде сравнительно недавно (Гершкович, Серебрянный, 1977), в экспериментах по полусинтезу не использовались. Их высокая гидрофильность, возможность проводить реакцию образования пептидной связи в воде делают их привлекательными для этой цели. Сравнение ацилирующей способности н-оксисукцшшмидных и 2-нитро--4-сульфофениловых эфиров (рис.3) указывает на то, что 2-нитро--4-сульфофениловые эфиры могут быть использованы для получения полусинтетических фрагментов белков.

Рис.3. Сравнение скорости гидролиза и аминолиза н-оксисукцин-имидного и 2-нитро-4-сульфафенилового эфира Вос-лейцина в 50$ диоксане.

•I - Взаимодействие активированного эфира с эквивалентом лейцинамида (реакция аминолиза), рН 8.0.

2 - Гидролиз активированного эфира, рН 9,0.

3 - Гидролиз активированного эфира, рН 8,5.

4 - Гидролиз активированного эфира, рН 8,0. С = 0,1 М; титрование 0,25 М На2со3.

4. Влияние остатка Агк 74 на формирование структуры с-концевого домена парвальбумина

Типичной процедурой получения ЕР-домена парвальбумина является расщепление белка трипсином по единственному остатку аргинина

в положении 74. Однако расщепление парвальбумина трипсином по остатку Arg приводит к разрушению функционально важного солевого мостика мезвду остатками Arg и Glu на N-конце EF-домена парвальбумина (рис.4). Мы предположили, что реконструкция инвариантной для всех парвальбуминоз пары Arg и Glu на N-конце существенно улучшит кальцийсвязыванцие свойства ЕР-домена парвальбумина.

Рис.4. Схематическое изображение ЕР-домена парвальбумина карпа pi 4,25 (Согзоп D.c. et al., Ï985). В центре петли черным кружком обозначен ион кальция. Выделенные на рисунке остатки валияа, фенилаланина, а также ионная пара, образованная остатком Arg 75 и Glu 81, в нативном белке расположены внутри белковой глобулы.

Для этого мы получили полусинтетический фрагмент парвальбумина, присоединив к и-концу ЕР-домена остаток аргинина по схеме, приведенной на рио.5. Константа связывания кальция полусинтетическим фрагментом увеличивается примерно на порядок и составляет I670+Î00 W^, тогда как аналогичная константа для ЕР-домена, не содержащего остатка, составляет 220+50 М-1. Спектры кругового дихроизма EF-домена, содержащего и не содержащего остаток аргинина на N-конце, представлены на рис.6. Видно, что эллиптичность при 220 нм, характеризувдая степень спиральности, имеет большее абсолютное значение для полусинтетического фрагмента. Можно предположить, что такое изменение свойств домена вызвано взаимодействием положительно заряженной гуанидиновой группировки с карбоксил-ионом остатка Glu 80 или с карбоксил-ионом остатка Asp 78, расположенном на расстоянии одного полного витка сх-спирали от

Ас ±

Tt TT

IL

А * В *

Arg 741 Glu 80

Л-Х I

D | * E

Ас-Г

I

у Трипсин

74 75

—I I-

108

-1

I Деблокирование Arg 74

Агд

1) ZjArgONSu

2) Деблокирование

Glu 80 108

(ZZbqCID E (6A P

Рис.5. Схема получения фрагментов 1-74, 75-108 и полусинтетического Arg 74-фрагмента 74-108 парвальбумина.

210

гзо нн

Рис.6. КЦ-спектры фрагментов парвальбумина Щ щуки 74-108 (А) и 75-108 (Б) в присутствии (Ю мм Саа+) и отсутствие (5 мМ ЗГТА) ионов кальция. Концентрация фрагментов 0,08 М, 50 мМ трис-НС1, рН 7,3, 20°С. Пунктирная линия: +Са|+. Сплошная линия: -Са2+.

остатка Arg.

Получение Ala 74-Фрагмента 74-108. Не исключена возможность того, что сам факт увеличения длины ЕР-домена парвальбумина на один аминокислотный остаток может существенно изменить свойства ВР-домена. Чтобы выяснить, в какой степени это справедливо, мы провели контрольный эксперимент, присоединив к N-концу фрагмента 75-108 (Евдомен парвальбумина) остаток аланина. Для ацилирова-ния о.-аминогруппы £ -Воо^-фрагмента 75-108 мы использовали водорастворимый 2-нитро-4-сульфофениловый эфир Воо-аланина. После деблокирования и очистки Ala 74-фрагмент 74-108 связывает кальций с константой 500+50 М-^. Это подтверждает предположение о том, что в улучшение способности связывать ионы кальция гуанндиновая группа аргинина вносит больший вклад, чем увеличение длины фрагмента на один аминокислотный остаток.

5. Свойства ацетимидированных фрагментов парвальбумина

Для фрагментов парвальбумина ацетимидирование аминогрупп представляло для нас самостоятельный интерес. Дело в том, что ацетимидируя парвальбумин и его фрагменты, мы тем самым нарушаем ионный баланс молекулы, так как рК аминогрупп после модификации смещается в щелочную область, приближаясь к рК гуанидиновой группировки аргинина. Поскольку факт влияния остатка аргинина на формирование структуры ЕР-домена наш был установлен, представлялось интересным изучить, насколько изменятся кальцийсвязывающие свойства исходного белка, а также фрагментов 75-108 (EF-домен, один кальцийсвязывающий участок) и 38-108 (два кальцийсвязывающих участка). При этом ацетимидированный по £-аминогруппам фрагмент 38-108 можно было использовать для проведения полусинтетических экспериментов, так как его получали расщеплением ацетимидирован-ного парвальбумина бромцианом по остатку Met 37. <х -Аминогруппа фрагмента, полученного по такой схеме, остается немодифищрованней:

Точками отмечены ацетимидированные £.-аминогруппы остатков лизина. Результаты экспериментов по ацетимидированию белка и фрагментов приведены в табл.5.

Из таблицы видно, что ЕР-домен после модификации его аминогрупп метилацетимидатом полностью утрачивает способность связывать ионы кальция. В то же время, ацетимидированные фрагменты 1-74 и 38-108 парвальбумина, а также ацетимидированный парваль-

108

Р

Таблица 5

Равновесные константы связывания Са2+ (20°С)

Белок (фрагмент)

CD-участок'ЕР-участок .'Буферный ! „ h i к?

к1 (М"Ъ

Парвальбумин Ш щуки Acim18~парвальбумин Фрагмент 1-74 ас1яи-фрагмент 1-74

3,4.10е

3,5-ÍO8

4,0*10'"

2-104

3.9.Í06

3

Фрагмент 38-108 С -Acim10-фрагмент 38-108 1,5*10''

Boc-Met 37-£-Аом10-4регмент37-108 4,6-Ю5 Воо-Тгр 37-£-Асм10-фршденг 37-108 КуСред Фрагмент 75-108 Ащ 74-фрагмент 74-108 Ala 74-фрагмент 74-108 &-Aoim^-фрагмент 75-108 Acim5~(Ala 74-фрагмент 74-108) Тгр 74-4рагмент 74-108 of-Дансил-фрагмент 75-108

6,3-10'

2,5*10"

í.í-ICf 1,4-Ю7 7,7-Ю4 9,8.Ю4 220 -1670 500 0 0 О* 830

|8

А,Б Б

А,Б Б

А,Б Б Б Б

А,Б

А

Б

Б

Б

Б

А

Состав буферных растворов: А - 0,05 М трис-НС1, рН 7,5;

Б - 0,05 М НЕРЕЭ/НС!, рН 7,5.

*По данным флуоресценции и-концевого остатка триптофана.

бумин сохраняют способность связывать кальций, причем в ряде случаев константа связывания кальция оказывается более высокой, чем аналогичная константа для немодифицированного аналога. Поскольку ацетимидированный ЕР-домен парвальбумина в составе белка и фрагмента 38-108 связывает кальций с высокой константой, а в изолированном виде полностью утрачивает эту способность, можно предположить, что в коротком Е?-домене белка ионные взаимодействия вносят больший вклад в формирование структуры, чем гидрофобные взаимодействия. В то же время, у фрагментов 1-74 и 38-108, а также у целой молекулы белка гидрофобные взаимодействия доминируют.

6. Присоединение флуоресцентных зондов к И-концу фрагментов парвальбумина

В наших экспериментах введение флуоресцентных зондов в л-

конец фрагментов парвальбумина позволило оценить степень гидро-

фобного окружения N-концевой части молекулы и получить таким образом дополнительную информацию об удельном вкладе ионных и гидрофобных взаимодействий в формирование пространственной структуры фрагментов парвальбумина по мере увеличения их длины.

Тгр 74-фрагмент 74-108 парвальбумина был получен взаимодействием BocTrpONsp с е-Вос^-фрагментом 75-108, последующим деблокированием и очисткой. ВосТгр-е-Ас1т10-фрагмент 37-108 получали взаимодействием BocTrpONsp с £-Ас1ш10-фрагментом 38-108 и после выделения из реакционной смеси изучали без деблокирования Boo- и Acim-защитных групп. Для контроля по аналогичной методике был синтезирован полусинтетический BocMet-¿-Acim^-фрагмент 37-108.

Изучение спектров флуоресценции полученных фрагментов показало, что остаток триптофана, присоединенный к N-концу EF-домена, совершенно не реагирует на титрование ионами кальция, маскируя своей флуоресценцией изменение спектров флуоресценции остатков фенилаланина. Селективное дансилирование ЕР-домена парвальбумина по о<-аминогруппе приводит к получению с*-дансил-фрагмента 75-108. По изменению спектров флуоресценции дансильной группы удается рассчитать константу связывания кальция, которая оказалась 800 Г.С*. Остаток триптофана, присоединенный к N-концу фрагмента 38-108 парвальбумина, реагирует, хотя и слабо, на титрование ионами кальция, смещая спектр флуоресценции в коротковолновую область, отчетливо демонстрируя наличие гидрофобного участка у фрагмента 38-108. Результаты экспериментов приведены в табл.5.

7. Синтез пептидов, входящих в гидрофобное ядро парвальбумина

Участок 28-37 парвальбумина представляет собой почти целиком гидрофобную часть в-спирали парвальбумина с соединяющей перемычкой. Именно в этом участке наблюдаются наиболее сильные различия в пространственной структуре парвальбумина и калмодулина, у которого данный элемент структуры кальцийсвязывающего кластера отсутствует. Отсюда понятен интерес получить полусинтетические фрагменты парвальбумина, соответствующие практически полному кальцийсвя-зывающему кластеру с хорошо сформированным гидрофобным ядром. Нами проведена подготовительная работа в этом направлении.

Синтез пептидов, соответствующих участку 28-37 парвальбумина осуществили методом пентафторфениловых эфиров (рис.7).

Химический синтез пептидов имеет следующие особенности:

I. Для получения пентафторфениловых эфиров аминокислот предложен новый реагент - дипентафторфенилкарбонат. Этот реагент по

28 РЬв

Вос-Вос-Вое

Вое ■

окр а -

*1а 1**1

I I

4РЛ1ЫИП 25-33

Боевое

ВОС—¡ОРТ? Н-

Воо' Эос-Вое4-ОРГр Н—

Вос-

оргр н -

"7

ОРГр К—}ОРас ОРас

ОРас ОРас

ОРас Воа-ОРас Воег ОРае ОРае ■ЙРае

■ОРГр

ОРас

17а 11а

I I

«РАПЕНТ 34-37

Вое В

Вое — ОРГр н- -он

Вое -

И»

Вое—ОРГр Н ,Ма

«а

«РАШНТ 35-37 г

Вое Вое

37 Каг

Лг8 35-4РШШТ 35-37

Аге

Ю

- ОРГр н ■

1л>

11а«

оа оа

Рис.7. Схема синтеза пептидов, соответствующих участку 28-37 полипептидной цепи парвальбумина Ш щуки.

эффективности не уступает к,11-дициклогексилкарбодиимиду, но в отличие от последнего не вызывает аллергических реакций, что делает его привлекательным для промышленного использования.

2. В процессе синтеза нами было найдено удачное сочетание: фенациловый эфир для защиты с*-карбоксила синтезируемого пептида - пентафторфениловые эфиры аминокислот для образования пептидной связи. Фенацильная защита в значительной степени улучшает способность синтезируемого пептида кристаллизоваться, в то время каквы-сокореакционноспособные пентафторфениловые эфиры н-защтценных аминокислот позволяют свести к минимуму нежелательные побочные процессы на стадии синтеза дипептидов и трипептидов. После окончания синтеза фенацильная защита селективно удаляется в специально подобранных условиях (цинковая пыль - 20% АсСН в ДМФ) в течение 1-2 ч при температуре 20°С. Наш были получены активированные 2--нитро-4-сульфофениловые эфиры синтезированных пептидов. К сожалению, все синтезированные пептиды и их активированные эфиры имели плохую растворимость в водно-органической среде и совершенно не растворялись в воде. Поэтому нам не удалось добиться полного взаимодействия «^-аминогруппы ацетимидированного по £. -аминогруппам фрагмента 38-108 с активированными производными пептидов

г

участка 34-37 парвальбумина.

вывода

1. Методом собственной флуоресценции охарактеризованы два мало изученных парвальбумина из белых мышц щуки. Получены фрагменты парвальбумина Ш, содержащие один и два кальцийсвязывающих участка. Константы связывания кальция всеми фрагментами и белками измерены одним методом, что позволяет сравнивать их между собой.

2. Синтезированы пептиды участка 28-37 парвальбумина, получены их активированные производные. Для синтеза пептидов предложен новый реагент - дипентафторфенилкарбонат, который внедряется в промышленное производство.

3. Разработана методика, позволяющая присоединять к N-концу белковых фрагментов производные аминокислот в водной среде. С помощью разработанной методики синтезированы полусинтетические фрагменты парвальбумина и изучены их физико-химические свойства с целью выяснения удельного вклада ионных и гидрофобных взаимодействий в формирование пространственной структуры фрагментов парвальбумина.

4. Доказана важность остатка Arg 74 для формирования пространственной структуры Е^домена парвальбумина. Это подтверждает предположение, что в EP-домене парвальбумина ионные взаимодействия вносят большой удельный вклад в формирование пространственной структуры.

Основные материалы диссертации опубликованы в работах:

1. Медведкин В.Н., Митин Ю.В., Пермяков Е.А. Полусинтетический фрагмент 74-108 парвальбумина Ш щуки: получение и изучение спектральных характеристик. - Тезисы УТ Всесоюзн. симп. по химии белков и пептидов. Рига, -1983.

2. Медведкин В.Н., Митин Ю.В., Пермяков Е.А. Получение полусинтетического фрагмента 74-108 парвальбумина Ш щуки. - Тезисы стенд, сооощ. 16-ой конф. ФЕБО. Москва, 1984.

3. Медведкин В.Н.„Способ получения пентафторфениловых эфиров аминокислот. - Авт. св. СССР № 724501, МКИ CÖ7C 103/52, 1978.

4. Юнг Р., Гречишко B.C., Запевалова Н.П., Попова О.Ю., Медведкин В.Н. Использование фенациловых эфиров в пептидном синтезе. - Тезисы У Всесоюзн. симп. по химии и физике белков и пептидов. Баку, 1980.

5. Медведкин В.Н., Митин Ю.В. Модификация и деблокирование аминогрупп парвальбумина Ш щуки. - Биоорган, химия, 1987, т.13,

Je 2, с.183-188.

6. Медведкин В.Н. Митин Ю.В., Пермяков Е.А. Влияние остатка

Arg 74 на формирование структуры с-концевого домена парваль-

15

бумина Ш щуки. - Биоорган, химия, -1987, т.'13, № 2, с.-177-182.

7. Медведкин В.Н., Митин Ю.В., Пермяков Е.А. Получение аналога фрагмента 74-108 парвальбумина Ш щуки, содержащего остаток аланина в положении 74 и его ацетимидированного производного. - Биоорган, химия, 1987, тЛЗ, № 7. с.1019-1022.

8. Permyakov Е.А., Medvedkin V.N., Kalinichenko 1.Р., Burstein Е.А. Comparative study of physicochemical properties of two pike parvalbumins by means of their intrinsic tyrosyl and phenylalanyl fluorescence. - Arch. Biochem. Biophys., 1983, v.227, No.1, p.9-20.

9. Permyakov E.A., Medvedkin V.N., Gerday Ch., Kalinichenko L.P., Burstein E.A. Sodium and potassium binding of two parvalbumins measured by means of intrinsic protein fluorescence. -Biochim. et biophys. acta, 1983, v.749, No.1, p.185-191.

Т2П02 . 25.11.87 г. Тираж 125 экз. Заказ 719Р. Уч.-изд.л.1,и. Отпечатано на ротапринте в Отделе научно-технической информации Научного центра биологических исследовании АН СССР в Пущине