Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Аналитическое описание спектров низкотемпературной триптофановой люминесценции белков на основе физической модели

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Аналитическое описание спектров низкотемпературной триптофановой люминесценции белков на основе физической модели"

РГБ о,

^ [¡ОЯ ¡с^. На правах рукописи

УДК 577.322

ДЕЙКУС Гинтарас Ювенциевич

АНАЛИТИЧЕСКОЕ ОПИСАНИЕ СПЕКТРОВ НИЗКОТЕМПЕРАТУРНОЙ ТРИПТОФАНОВОЙ ЛЮМИНЕСЦЕНЦИИ БЕЛКОВ НА ОСНОВЕ ФИЗИЧЕСКОЙ

МОДЕЛИ

03.00.02 - биофизика

АВТОРЕФЕРАТ ДИССЕРТАЦИИ НА СОИСКАНИЕ УЧЕНОЙ СТЕПЕНИ КАНДИДАТА ФИЗИКО-МАТЕМАТИЧЕСКИХ НАУК

Пущино 1996

Работа выполнена в Институте теоретически и экспериментальной биофизики и в Институте биологического приборостроения Российской Академии Наук.

Научный руководитель: доктор биологических наук

Е.А. Пермяков

Официальные оппоненты: доктор физико-математических

наук В.В. Климов

кандидат физико математических наук Е.П. Бусел

Ведущая организация: Институт биофизики клетки

РАН

Защита состоится ¿».О'рл, 199йг в У5"" час 30 Мин

на заседании диссертационного совета Д 200.22.01 в Институте теоретической и экспериментальной биофизики РАН по адресу: 142292. г. Пущино, Московской области. Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института теоретической и экспериментальной биофизики РАН.

Автореферат разослан № М^О&^С^иЬ_199 (. 1

Ученый секретарь в / А диссертационного совета^Л+уп/р П.А.Нелипович

кандидат биологических наук | Ь^им^Сиси! .

й

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Люминесцентная (флуоресцентная и фосфоресцентная) спектроскопия является одним из мощных инструментов исследования структурных, физико-химических и функциональных свойств белков [Бурштейн, 1976, 1977а; Lakowicz, 1983]. В большинстве случаев использования люминесцентной спектроскопии исследователи измеряют лишь флуоресценцию - излучение, вызываемое переходами между синглетными уровнями возбужденной молекулы, и чаще всего, при температурах выше 0°С.

Флуоресценция при низких температурах и фосфоресценция - излучение, обусловленное переходами между триплетными и синглетными уровнями возбужденной молекулы, не получили широкого применения [Permyakov, 1993]. Только триптофановая фосфоресценция белков в растворах при температурах выше 0°С, а также в стеклующихся средах при низких температурах применялась для изучения структурной динамики белков [Geacintov & Brenner, 1989; Strambini & Galley, 1980], выявления гетерогенности окружения триптофанилов [Domanus et al., 1979; Purkey & Galley, 1970] и регистрации конформационных изменений в белке [Gabellieri et al. 1988; Li & Galley, 1989].

В то же время, благодаря хорошему разрешению колебательной структуры в спектрах низкотемпературной флуоресценции и особенно фосфоресценции белков, их было бы заманчиво использовать для получения физической информации, касающейся окружения хромофоров в белках. Особенно богатую информацию можно бы было получать из спектров триптофановой люминесценции белков. К сожалению, до сих пор мы не имеем достаточно развитой теории для однозначной интерпретации спектров низкотемпературной люминесценции триптофановых остатков в белках.

Это связано как с отсутствием возможности использовать в качестве адекватных модельных систем замороженные растворы триптофана при изучении низкотемпературной люминесценции белка, гак и с наличием ряда специфических спектральных эффектов в замороженных растворах белков, обусловленных вымораживанием белка с молекулами неводной добавки [Бурштейн, 1976, 1977а; Фшгенко, 1977]. Это осложняет задачу

выявления связи между параметрами люминесценции и свойствами окружения индольного хромофора при низких температурах.

Существенное уменьшение динамичеких факторов влияния на параметры флуоресценции и фосфоресценции а также значительное улучшение разрешения колебательной структуры в спектрах излучения при низких температурах, по сравнению с комнатными, требует другого подхода для интерпретации низкотемпературных спектров, нежели тот, который обычно используетя в люминесцентной спектроскопии белка в случае растворов при температурах выше 0°С.

Остается открытым вопрос о чувствительности параметров триптофановой флуоресценции и фосфоресценции при низких температурах к конформационному состоянию белка. Ответ на него мог бы быть важной предпосылкой для расширения возможностей метода собственной люминесценции белка.

Интерпретацию спектров излучения триптофановых остатков в белках при низких температурах существенно затрудняла и сложная электронная структура длинноволновой полосы поглощения триптофана, а также неопределенность в количестве участвующих электронных .переходов в излучении. До сих пор гак и не удалось однозначно ответить на вопрос сколько электронных переходов (один или два) формируют полосу флуоресценции индола и его производных [Конев, 1965; Черницкий, 1972; Бурштейн, 1976; Ьахш, 1977; Ьгкотсг, 1983; Демченко, 1988].

Анализ современной литературы показывает, что несмотря на имеющийся значительный прогресс в технике измерения высоко разрешенных спектров возбуждения и излучения, а также в методах квантовохимических расчетов, пока не удается однозначно ответить на все вопросы, касающиеся природы флуоресценции и фосфоресценции триптофана в белке.

Надо отметить, что большинство работ, посвященных исседованиям низкотемпературной люминесценции белков, было выполнено в то время, когда теория электронно-колебательных переходов в органических молекулах не была достаточно развита. Более того, выбор белков, содержащих один остаток триптофана и пригодных для модельных спектральных измерений, был довольно ограниченным и все это затрудняло количественные исследования низкотемпературной люминесценции белков.

Полуколичественная теория электронно-колебательных переходов была создана позднее несколькими авторами [Франк-

Каменецкий и Лукашин, 1975; Морозов и Бажулина, 1989] и получила широкое применение для анализа спектров излучения и поглощения многоатомных молекул. Было показано, что для излучательных переходов, затрагивающих низшие возбужденные состояния молекул, эффективным является использование адиабатического Франк-Кондоновского приближения [Франк-Каменецкий и Лукашин, 1975], в рамках которого распределение интенсивности излучения по частоте в спектре многоатомной молекулы удается выразить аналитически достаточно простой формулой.

Для анализа электронно-колебательных спектров сложных молекул был предложен теоретико-экспериментальный подход [Морозов, Савин, 1985]. Измеренный электронно-колебательный спектр сложной молекулы раскладывают на компоненты на основе физической модели. В результате этого становится возможным сравнивать рассчитанную теоретическую кривую с экспериментальным спектром, выполняя варьирование параметров выбранной физической модели. Такой подход в ряде случаев помогает получить дополнительную иинформацию по сравнению с прямым анализом экспериментального спектрального контура [Морозов и Бажулина, 1989]. Математическим критерием оптимального описания экспериментального электронно-колебательного спектра на базе выбранной физической модели в пределах данной точности измерения считают соизмеримость минимальной среднеквадратичной ошибки разложения с погрешностью измерения спектра [Морозов, Савин, 1985].

В настоящее время мы располагаем набором подробно изученных белков, содержащих по одному остатку триптофана на молекулу (для некоторых из них известна даже трехмерная структура). Кроме того, существует относительно разработанная и проверенная для ряда органических молекул теория электронно-колебательных спектров.

Эти два обстоятельства привели нас к решению возобновить исследования низкотемпературной люминесценции белков на новом уровне, используя достижения современной спектроскопии и физики белка, в надежде расширить возможности метода собственной люминесценции белка.

Цели и задачи исследования Главной целью настоящей работы явилось попытка аналитического описания электронно-колебательных спектров остатков триптофана в белках на основе физической модели и выявление связи между параметрами

низкотемпературной триптофановой флуоресценции и фосфоресценции белка и структурно-физическими свойствами окружения его индольного хромофора. Для достижения этой цели решены следующие задачи:

1. Измерены спектры низкотемпературной триптофановой

флуоресценции и фосфоресценции белков в различных состояниях, отличающихся локализацией их единственного триптофанила.

2. Найден способ адекватного аналитического описания спектров

триптофановой флуоресценции и фосфоресценции белка, измеренных при температуре 77 К.

3. Проверена чувствительность параметров низкотемпературной

триптофановой люминесценции к изменениям конформационного состояния белка. Для этого использовали хорошо известные конформационные переходы в белках, в ходе которых затрагивается окружение индольного хромофора.

4. Выявлено наличие взаимосвязи между отдельными

параметрами триптофановой люминесценции белка при температуре 77 К. Проанализирована их связь с локализацией индольного хромофора в белке. Научная новизна полученных результатов. Впервые к исследованиям низкотемпературной триптофановой флуоресценции и фосфоресценции белков применен теоретико-экспериментальный подход, основанный на теории электронно-колебательных спектров многоатомных молекул. Показано, что электронно-колебательные спектры фосфоресценции и флуоресценции остатков триптофана в белках при (температуре 77 К лучше всего описываются теоретической кривой, рассчитанной согласно модели, предполагающей существование двух независимых серий нормальных компонент, причем в каждой серии проявляется по одному типу колебаний. Впервые таким способом показано, что в полосе фосфоресценции остатков триптофана в белках, по-видимому, проявляются колебания двух типов, частоты которых лежат в диапазонах 650800 см-1 и 1350-1500 см*1. Предложена интерпретация этих двух типов колебаний, базирующаяся на литературных экспериментальных и расчетных данных и основывающаяся на собственных экспериментальных результатах по замене Н2О на D2O. Показано, что серия 1350-1500 см-1 в спектрах фосфоресценции белков соответствует колебаниям типа W5 (колебания бензольного кольца типа B19d), а серию 650-800 см"1

можно отнести к колебаниям типа W18, т.е. к дыхательным колебаниям индольного кольца. Впервые на примере хорошо известных конформационных переходов в белках, содержащих по одному остатку триптофана (N~>F перехода в сывороточном альбумине человека, кислотного перехода в парвальбумине трески и тетрамеризации мелиттина из пчелиного яда), показано, что параметры низкотемпературной триптофановой люминесценции белков чувствительны к изменениям окружения индольного хромофора. В этих исседованиях использовали как традиционные спектральные параметры, так и дополнительные, полученные в результате подгонки экспериментальных спектров теоретическими кривыми, рассчитанными согласно модели, предполагающей существование в электронно-колебательных спектрах флуоресценции и фосфоресценции двух независимых колебательных серий. Впервые выявлена четкая корреляция между отдельными параметрами низкотемпературной триптофановой фосфоресцении и флуоресценции белков, что дает возможность проведения в дальнейшем более глубоких экспериментальных и теоретических исследований природы этого излучения.

Практическая ценность. Разработанные алгоритмы анализа электронно-колебательных спектров излучения триптофановых остатков в белках при температуре 77 К можно использовать как для дальнейших исследований природы люминесценции белка, так и для регистрации структурных переходов в белке. Показана целесообразноть использования низкотемпературной люминесценции для исследований природы структурных перестроек в белках.

Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы были доложены на научных семинарах лаборатории функциональной биофизики белка Института теоретической и экпериментальной биофизики РАН, Пущино 1993, 1994 и 1996 г., на ежегодных научных конференциях Институтов теоретической и экпериментальной биофизики и биологического приборостроения РАН, Пущино 1994 и 1995 г. соответственно, на VII Всесоюзной конференции по спектроскопии биополимеров (Харьков, 1991), на II Международной конференции "Успехи современной криобиологии" (Харьков, 1992), на Международной конференции "Физика и химия органических люминофоров-95" (Харьков, 1995).

Публикации Основной материал диссертации опубликован в 5-ти печатных работах.

Объем и структура работы. Диссертационная работа изложена на 4&1) страницах текста, содержит 31 рисунок, 3 таблицы, 300 ссылок на используемую литературу и включает: введение, обзор литературы (главы I-III), методическую часть, результаты и обсуждение (глава ГУ), выводы, заключительные замечания и список цитируемой литературы.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Белки. В работе использовали лиофилизованные препараты парвальбуминов трески и мерланга, сывороточного альбумина человека, мелитгина из пчелиного яда, L. аспарагиназы E.coli, оц-антитрипсина и соматотропина человека, кальмодулина крупного рогатого скота, фосфолипаз А2 быка и свиньи, а также раствор азурина. Парвальбумин из мышц трески ( Gadus callarius L.) выделен д-рами Калиниченко и Дережковым по методу, описанному ранее [Haiech et al., 1979] с модификациями, предложенными д-ром Калиниченко в Лаборатории функциональной биофизики белка Института теоретической и экспериментальной биофизики РАН. Мелиттин выделяли из пчелиного яда д-р Орлов и д-р Грищенко там же, согласно методике, разработанной Кингом [King et al., 1976]. Кальмодулин из мозга крупного рогатого скота выделяли в той же лаборатории по методике, описанной в работе [Yazawa et al.,1980]. Парвальбумин мерланга был получен от д-ра Жердея (Льежский университет, Бельгия). Аспарагиназа Е. coli была любезно предоставлена нам д-ром Жагат (Институт органического синтеза, Рига, .Латвия). Обезжиренный сывороточный альбумин человека любезно предоставил нам д-р Иванов (Институт биоорганической химии, Минск, Белорусь). Соматотропин человека мы получили от д-ра Нактиниса (Вильнюс, Литва). Ингибитор сериновых протеаз любезно предоставила д-р Планчюнене (Институт биомедицинских исследований, Каунас, Литва). Азурин из Pseudomonas aeruginase куплен от Института биохимии (Ереван, Армения). Фосфолипазы А2 свиньи и быка получены от фирмы Sigma. Все белковые препараты были хроматографически чистые.

Препараты. Химические препараты были получены от следующих коммерческих источников: HEPES, MES, TAPS и ЭГТА - от фирмы Sigma; лимонную кислоту и глицин - от фирмы

Reanal; трис - от фирмы Serva. Все препараты были аналитической чистоты.

Методы. Измерения стационарной люминесценции при низких температурах производили на установке, сконструированной в Лаборатории функциональной биофизики белка Института теоретической и эксперименталной биофизики РАН.

Монохроматическое возбуждение белковой люминесценции обеспечивали ртутная кварцевая лампа сверхвысокого давления СВД-120 и зеркальный монохроматор SPM-2 (Карл Цейс, Иена, Германия).

Фотоумножитель ФЭУ-39А, смонтированый в светонепроницаемом кожухе, служил детектором света люминесценции после анализирующего светосильного монохроматора МДР-2 (J10M0, Санкт-Перербург, Россия). Точность определения волнового числа для фосфоресценции и флуоресценции была не хуже 20 см"1 и 50 см"1 соответственно. Воспроизводимость измеренной интенсивности флуоресценции и фосфоресценции при 77 К была не хуже 5 %.

Спектральные ширины щелей монохроматоров при измерении спектров люминесценции не превышали 1-2 нм. Во все спектры вносили поправки на спектральную чувствительность прибора и светорассеяние.

Спектры флуоресценции белков при комнатных температурах регистрировали на спектрофлуориметре, описанном ранее [Permyakov et al., 1977]. Спектры поглощения белков измеряли на спектрофотометре Specord UV-YIS (Карл Цейс, Иена, Германия).

Разложение спектров люминесценции на элементарные колебательные компоненты выполнено на персональном компьютере с использованием схемы нелинейной регрессии (алгоритм Маркуарта [Marquardt., 1963]), согласно программе, предложенной в работе Райха [Reich et al., 1972].

Математическим критерием правильности выбранной физической модели для разложения служила соизмеримость средне-квадратичной ошибки разложения с погрешностью измерения спектров, как было предложено ранее [Морозов, Савин, 1985].

Кривые затухания интенсивности фосфоресценции раскладывали на две экспоненциальные компоненты аналогичным образом по формуле:

/= k (Л&хpi-Z/tO+zfeexpO-i/rO),

варьируя вклады А\ и Л2 и времена жизни Т) и 12 компонент. Точность определения времени жизни фосфоресценции была не хуже ±0.25 сек.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Аналитическое описание электронно-колебательных спектров

белков.

Для облегчения интерпретации экспериментальных результатов нами были отобраны белки, содержащие лишь по одному остатку триптофана на молекулу. Их спектры люминесценции были измерены при 77 К в диапазоне длин волн 295-500 нм. Спектры измеряли для различных состояний белков, соответствующих различной локализации их единственного остатка триптофана.

Рис. 1. Спектры люминесценции L. аспарагиназы Е. coli в шкале длин волн (А) и волновых чисел (Б). Температура 77 К. Цифрами и стрелками обозначено положение 0-0 перехода фосфоресценции.

На рисунке 1 представлен спектр люминесценции аспарагиназы Е. coli, измеренный при температуре 77 К, в шкале длин волн (А) и волновых чисел (Б). Широкая полоса с острым максимумом и двумя плечами в интервале 300-400 нм соответствует флуоресценции единственного остатка триптофана аспарагиназы. Полоса излучения с несколькими максимумами в интервале длин волн от 400 до 500 нм соответствует триптофановой фосфоресценции. Острый пик при 24360 см~* соответствует 0-0 переходу в спектре фосфоресценции. Полагают,

что фосфоресценция индольного хромофора происходит с уровня 3La [Конев, 1965; Song, Kurtin, 1969]. Измеренные спектры

низкотемпературной триптофановой люминесценции исследованных нами белков отличались друг от друга степенью разрешенности колебательной структуры в полосе флуоресценции а также количеством пиков, их относительной интенсивностью и положением в шкале длин волн (волновых чисел) в полосе фосфоресценции.

Хорошее разрешение колебательной структуры в спектрах фосфоресценции, а в некоторых случаях и флуоресценции остатков триптофана в исследованных нами белках при температуре 77 К позволило для аналитического описания этих спектров использовать теорию электронно-колебательных взаимодействий.

Согласно этой теорий, развитой Франк-Каменецким и Лукашиным [Франк-Каменецкий, Лукашин, 1975], относительное распределение интенсивностей в электронно-колебательном спектре молекулы, обладающей N типами нормальных колебаний, в Франк-Кондоновском приближении подчиняется закону:

K(v)-Ko I ц. 12Z5(v0.0-SvkVk-v)nGk2V>cexp(-Gk2/Vk!), (1) где Ко- постоянная, ^ - дипольный момент электронного перехода, vq.o -частота 0-0 перехода, vk - частота к-ого нормального колебания, V=n'-n; п'нп - номера колебательных подуровней возбужденного и основного состояний соответственно. (В (1) формуле предполагается, что весь спектр молекулы обусловлен только одним электронным переходом.)

Gk=(2^2Mvk/h)1/2AQk<°), (2)

где М - приведенная масса, vk - собственная частота, AQk(0) -изменение равновесного расстояния вдоль нормальной координаты при электронном возбуждении, h-постоянная Планка.

В формуле (1) предполагается, что элементарная вибронная компонента имеет нулевую ширину, что не позволяет рассчитать весь спектральный контур и затем сравнить его с экспериментальным спектром. Поэтому мы формулу (1) модифицировали, дополнив ее выражением для формы вибронной компоненты.

Форму элементарной вибронной компоненты описывали Гауссовым или лог-нормальным [Siano, Metzler, 1969] распределениями. После учета формы вибронной компоненты в

-¡п^риа

^-^-^ПЗг^-о»'). СЗ)

виде распределения Гаусса, формула (1) приобрела следующий вид:

Г/ ХГ \2

К(у) = К0|це|2Хехр

При описании спектров использовали литературные рассчетные и экспериментальные данные как о количестве электронных переходов, формирующих полосу люминесценции, так и о количестве типов колебаний, проявляющихся в спектрах флуоресценции и фосфоресценции.

Оказалось, что формулой (3) не удается хорошо описать экспериментальные спектры, сколько колебательных мод ни использовать-одну, две или три. Не улучшалось описание и при замене Гауссовых компонент на лог-нормальные.

Оказалось также, что наилучшим образом экспериментальные спектры описываются моделью, предполагающей существование двух независимых (относящихся к двум разным электронным переходам) серий нормальных компонент с разным вибронным расщеплением каждая: К(у)=£Г1(С12п1/п1!)ехр[-(у0.0(1)-Ау1пгу)2/2су12]+

+Щ022п7п2!)ехр[-^о-о(2>^2п2-у)72с722}, (4)

где у0.0(1) и уо-о^ -частоты 0-0 переходов, Ау] и - колебательные частоты, Ст1 и стг - ширины элементарных нормальных компонент, щ и ~ номера колебательных подуровней, ^ и Ъ - постоянные, пропорциональные силам осцилляторов переходов. При этом полагали, что От и ат (т=1,2) линейно связаны с п^ [Морозов, Бажулина, 1989]:

От=От(°)(1+-ртпк) (5)

ат(°)(1+отпк). (6)

Формулы (5) и (6) учитывают возможную зависимость соответственно фактора Ст и'ширины элементарной вибронной компоненты ст от номера электронно-колебательного перехода. Разумно предположить, что с его ростом, т.е. с увеличеием запаса электронно-колебательной энергии молекулы, величины возможных деформаций могут возрастать, что приведет к увеличению фактора Ст и ширины компоненты от. Спектры фосфоресценции. Оказалось, что в случае спектров триптофановой фосфоресценции белков наилучшая подгонка экспериментальных данных распределением (4) достигается при

У() 0(2) Использование лог-нормального распределения для

описания элементарных компонент не улучшало подгонку.

На рисунке 2 представлены спектры низкотемпературной фосфоресценции насыщенного ионами магния парвальбумина трески при рН 7.5 и тетрамера мелитгйна из пчелиного яда. На том же рисунке показана подгонка экспериментальных спектров

ю

Д, %о -10-

Рис. 2. Спектры фосфоресценции насыщенного ионами магния парвальбумина трески, рН 7.5 (А) и тетрамера мелиттина из пчелиного яда в 1.64 М КС1, рН 6.5 (Б), измеренные при температуре 77 К (точки) и их аппроксимация теоретическими кривыми, рассчитанными согласно уравнению (4) (две серии вибронных компонент гауссовой формы с различным вибронным расщеплением (первая- толстые сплошные, вторая- тонкие пунктирные линии)), и подогнанными к экспериментальным точкам (нижние рисунки). На верхних рисунках показана разница между экспериментальными и теоретическими значениями, выраженная в процентах.

теоретическими кривыми, рассчитанными согласно распределению (4). Подгонка выполнена путем варьирования параметров Гт, у0.0(т), Дут, От<°>, стт(°>, ат и рт (т=1,2). Из рисунка видно, что спектры фосфоресценции описываются

распределением (4) достаточно хорошо - теоретическая кривая повторяет все особенности экспериментальных спектров, хотя и существуют небольшие расхождения, которые могут быть вызваны слегка некорректной поправкой экспериментальных спектров на присутствие рассеянного света.

Все измеренные спектры фосфоресценции белков в различных состояниях были разложены на две серии нормальных колебаний согласно упомянутой выше модели и для каждого из них были оценены параметры fm, vo-o<m), Avm, Gm<°), am<°\ am и Pm (m=l,2). Результаты такого анализа спектров позволили заключить, что полоса фосфоресценции белков обусловлена, по-видимому, двумя сериями колебательных полос с частотами Avi=650-800 см*1 и Av2= 1350-1500 см-1. Этот результат хорошо согласуется с данными, полученными Сонгом и Куртином для производных индола [Song, Kurtin, 1969]. Эти авторы выявили в спектре фосфоресценции индола колебательные серии с вибронным расщеплением 650±100 см"1 и 1500-1600 см-1. |

Отметим, что в спектрах комбинационного рассеяния производных индола, замещенных в 3-положении, в интервале частот 1350-1500 см-1 наблюдают несколько линий: W4 (1496 см-1), W5 (1462 см"1) и W6 (1434 см1) [Harada, Takeuchi, 1986]. W4 и W5 являются колебаниями бензольного типа В19ь и В19а, соответственно, a W6 - колебание смешанного типа, включающее в себя симметричное растяжение N1C2C3, изгиб NjH и изгиб СН-связей бензольного кольца.

Известно, что полоса W6 в спектре комбинационного рассеяния производных индола чувствительна к NH-»ND обмену в индольном кольце [Miura et al., 1988], а линия W4 - очень слабая в спектрах комбинационного рассеяния белков [Harada, Takeuchi, 1986]. Наши эксперименты на растворах мелиттина, сывороточного альбумина человека и триптофана в 1 М КС1 показали, что замена Н2О на D2O не вляет на вибронное расщепление серий 1350-1500 см*1 и 650-800 см-1 в спектрах их фосфоресценции. По этой причине разумно предположить,что серия с Av=1350-1500 см"1 соответствует скорее всего колебаниям типа W5. Серию же с Av=650-800 см-1 можно приписать типу колебаний W18 (762 см"1 в спектрах комбинационного ряссеяния триптофана), т.е. "дыхательным" колебаниям индольного кольца [Harada, Takeuchi, 1986].

Частоты 0-0 переходов в спектрах всех исследованных белков находятся в интервале 24200-24550 см"1. Ширина 0-0 полосы первой колебательной серии 100-250 см-1,

А, % о -6

v, х103 см"1

Рис.3. Спектры флуоресценции L-аспарагиназы Е. coli, pH 8.0 (А) и насыщенного ионами кальция парвальбумина трески, pH 7.5 (Б), измеренные при температуре 77 К (точки) и их аппроксимация теоретическими кривыми (тонкие сплошные линии), рассчитанными согласно уравнению (4) (две серии вибронных компонент гауссовой формы с различным вибронным расщеплением: (первая-толстые сплошные, вторая- тонкие пунктирные линии)), и подогнанными к экспериментальным точкам (нижние рисунки). На верхних рисунках показана разница между экспериментальными и теоретическими значениями, выраженная в процентах.

второй - 250-500 см-1. Значения параметра пропорционального изменению равновесного расстояния вдоль нормальной координаты при электронном возбуждении, составляет для первой серии 1.1-1.5, а для второй они близки к 1. Разумно полагать, что две колебательные серии принадлежат, по-видимому, к двум разным электронным переходам в индольном хромофоре.

Спектры флуоресценции. Наши исследования показали, что лишь белки, содержащие внутренние остатки триптофана (кроме мономера мелиттина из пчелиного яда), обладают спектрами низкотемпературной флуоресценции с хорошо разрешенной колебательной структурой.

На рисунке 3 представлены спектры низкотемпературной флуоресценции L. аспарагиназы Е. coli, pH 8.0 и насыщенного ионами кальция парвальбумина трески, pH 7.5. На том же рисунке показаны теоретические кривые, рассчитанные согласно распределению (4) и подогнанные к экспериментальным точкам путем варьирования fm, v0.o(m\ Avm, Gm(°>, am<°>, am и ßm (m=l,2). Из рисунка видно, что распределение (4) описывает экспериментальные спектры довольно хорошо, однако подгонка в этом случае существенно менее однозначна, по сравнению со спектрами фосфоресценции.

Все измеренные спектры флуоресценции белков при 77 К были разложены на компоненты, соответствующие модели (4), в результате чего для каждого из спектров были оценены параметры fm, v0.0(m), Avm, Gm<°), cm(°>, am и ßm (m=l,2). Полученные результаты говорят о наличии двух типов колебаний в полосе флуоресценции, частоты которых лежат в диапазонах 900-1500 см*1 и 900-1400 см"1. Возможно, что эти типы колебаний относятся к двум разным электронным переходам lLa->A и 'Lb-^A.

2. Взаимосвязь параметров низкотемпературной тршггофановой флуоресценции и фосфоресценции белков.

Мы исследовали взаимосвязь между параметрами низкотемпературной триптофановой флуоресценции и фосфоресценции белков и обнаружили в ряде случаев довольно четкие корреляции между параметрами. В частности, обнаружена хорошая корреляция между положением 0-0 перехода в спектре фосфоресценции и отношением квантовых выходов фосфоресценции и флуоресценции 7^У(рис. 4). Для простейшей трехуровневой схемы

P/F— ¿p4T/WP + + Wl) (7)

[Теренин А.Н., 1967; Мак-Глинн и др., 1972], где Xtst- константа скорости интеркомбинационной конверсии с возбужденного синглетного уровня на возбужденный триплетный уровень; Xjs- константа скорости обратной интеркомбинационной конверсии с триплетного уровня на синглетный уровень; ¿р- константа скорости флуоресценции; Хгр -

константа скорости излучательной дезактивации гриплетного состояния (фосфоресценции); - сумма констант скоростей безызлучательной дезактивации возбужденного триплетного состояния.

Поскольку время жизни фосфоресценции для простейщей трехуровневой схемы выражается формулой

тР= + (8)

выражение (7) можно переписать в виде:

Р/К? = ^РДР- (9)

1.2

0.8 P/F 0.4

0.0

А

о а о с@

о Оо оо

о 04

24.8

1 24.4

24.0

О rfb о

Л

24

24.4

24.8

30.0

31.0

Vf,103CM"

32.0

Рис. 4. Зависимость отношения квантовых выходов фосфоресценции и флуоресценции от положения 0-0 перехода в спектре фосфоресценции для однотриптофановых белков (А) и зависимость положения 0-0 перехода в спектре фосфоресценции от положения спектра флуоресценции для однотриптофановых белков (Б). Температура 77 К.

Б

Из рис. 4 видно, что отношение ^/'возрастает со сдвигом положения 0-0 перехода в спектре фосфоресценции от 0.36 (мономер мелитгина в воде, полностью экспонированный в воде триптофанил) до 1.06 (Са2+-насыщенный парвальбумин трески, внутренний триптофанил). В большинстве случаев поверхностные триптофанилы характеризуется более низкими величинами P/Fи более длинноволновым положениеим 0-0 перехода. Поскольку тр достаточно слабо зависит от vq-o фосфоресценции, зависимость P/Pгр от положения 0-0 перехода vo-op имеет тот же характер, как и зависимость P/Fax положения 0-0 перехода v0_0P.

Для внутренних триптофанилов в большинстве случаях характерно более высокое отношение P/Fxр (0.14-0.18) чем для поверхностных - (0.08-0.14).

На рис. 4Б представлена зависимость положения 0-0 перехода в спектре фосфоресценции от среднего положения спектра флуоресценции vp, которое определяется как частота середины хорды, проведенной на уровне 90% от максимальной интенсивности флуоресценции. Хорошо видно, что чем короче положение спектра флуоресценции, тем короче и положение 0-0 перехода в спектре фосфоресценции-экспериментальные точки довольно хорошо ложатся на единую прямую. Эти результаты противоречат довольно распространенному в литературе мнению, что 0-0 полоса в спектре фосфоресценции белков с втутренними остатками триптофана лежит в интервале 410-415 нм, а в случае белков с поверхностными остатками триптофана она расположена в интервале 405-409 нм [Purkey, Galley, 1970, Hershberger et al. 1980].

Возможно, что это противоречие возникает из-за того, что упомянутый вывод был получен на белках, содержащих несколько триптофановых остатков на молекулу, в то время как мы в своей работе использовали лишь однотриптофановые белки, что существенно упрощает интерпретацию экспериментальных результатов. Другой причиной противоречия может быть использование различных сред при регистрации фосфоресценции: мы работали в поликристаллических , а выше упомянутые авторы - в стеклующихся. Добавляемые ими для стеклования органические компоненты могли влиять на гидрофобные взаимодействия в белковой молекуле и вызывать специфические спектральные эффекты [Бурштейн, 1976, 1977а; Филенко, 1977].

3. Исследование конформацнонных переходов в белках по изменениям параметров их трнптофановой флуоресценции

и фосфоресценции при низких температурах.

Для облегчения интерпретации экспериментальных результатов в качестве объектов исследования нами были выбраны однотриптофановые белки с хорошо изученными конформационными изменениями, затрагивающими окружение остатков триптофана. Для исследования этих изменений было использовано аналитическое описание спектров флуоресценции и фосфоресценции триптофана в белках при 77К.

Кроме того, мы проверяли также чувствительность к изменениям окружения хромофора и традиционно используемых параметров (отношения квантовых выходов фосфоресценции и флуоресценции Р/Гн времени жизни фосфоресценции тр).

На рис. 5 представлены результаты люминесцентного исследования известного N->5 перехода в сывороточном альбумине человека [Ивкова и др., 1971]. Уменьшение рН от 5 до 3 вызывает перемещение единственного остатка триптофана сывороточного альбумина с поверхности белка во втутреннюю гидрофобную область, что отражается в сдвиге спектра триптофановой флуоресценции в коротковолновую сторону. Этот спектральный сдвиг выражен существенно больше при комнатных температурах по сравнению со сдвигом при температуре 77 К. Это объясняется тем, что при комнатной температуре длинноволновое положение спектра флуоресценции при рН 5 определяется в основном наносекундной релаксацией полярного окружения остатка триптофана, а при низких температурах этот эффект отсутствует [Бурштейн, 1976, 1977а, Регтуакоу, 1993]. На том же рисунке Б показаны и спектры фосфоресценции этого белка при разных значениях рН: 6.5 и 3.0. Виден небольшой сдвиг спектра в сторону меньших частот.

Спектры низкотемпературной триптофановой фосфоресценции сывороточного альбумина, измеренные при различных значений рН (рН измеряли при комнатной температуре, а затем раствор белка быстро замораживали до температуры 77 К), подгоняли теоретическими кривыми; рассчитанными по формуле (4), соответствующей модели, предполагающей существование в спектрах двух серий колебательных линий.

На рис. 6 представлена зависимость от рН некоторых параметров спектра триптофановой фосфоресценции сывороточного альбумина человека. Из рисунка следует, что переход индольного хромофора с поверхности белка во втутреннюю область вызывает сдвиг 0-0 перехода (определяющего энергию электронного взаимодействия хромофора с его окружением) в длинноволновую сторону на 70 см"1 и увеличение обеих частот колебаний индольного кольца Ау] и А\2 на 40 см-1 и 70 см*1 соотвественно.

Интересно, что эти параметры чувствительны не только к ГЧ->Р переходу, но и к структурному переходу,

происходящему в белке при изменении рН от 7 до 5. При комнатной температуре этот переход по изменеию параметров триптофановой флуоресценции сывороточного альбумина человека не удается зарегистрировать. Однако он обнаружен в случае некоторых других альбуминов, например, в сывороточном альбумине верблюда [Вш^ет й а1. 1990].

350

340

К

330

320-

310

1.1 -,

0.9

*н 0 7

0.5

0.3

Д д

ЛДДДДл

ДД Д

Д Д ДД

с^о лп00 ООО00 о 45 оЪ° °

—I—1—1—'—I—1—I—1—I—1—I

2 3 4 5 6 7 8

рН

рНЗ.О

—1—'—I—1—I—1—I—'—1

20 21 22 23 24 25 V, х103 см"1

24.42

Я 24.37 Р»'

ч

24.32

> <

0.78-, 0.76 0.74 0.720.70

> <

1.45 1.43 1.41 -1.391.371.35

X °

2

-1—1 I ' I ' I—1—1—'—1

3 4 5 6 7 8

о о о

о ОСо°0 О О _

О о о

Б

2

—1—'—I—1—! '—1—1—1—'—I

3 4 5 6 7 8

*Р

ПЛ

В

Рис. 5. Зависимость от рН положения максимума спектра триптофановой флуоресценции сывороточного альбумина человека , измеренная при температуре 77 К (О) и 293 К (Д) (А). Спектры фосфоресценции К- (рН=6.5) и Р- (рН=3.0) форм сывороточного альбумина человека (Б). Температура 77 К.

—,——I I . |—|—|—I—!

2 3 4 5 6 7 8

рН

Рис. 6. рН-зависимость параметров триптофановой фосфоресценции сывороточного альбумина человека: А- положение 0-0 перехода, Б - частота первой колебательной серии, В - частота второй колебательной серии. Температура 77 К.

о

о

о

о

о

о

При температуре 77 К этот переход легко регистрировать по изменениям параметров Уоц,, Ду, о(°).

1Ч->Р переход в сывороточном альбумине человека детектируется и по изменению параметра Р/Р, но никак не сказывается на времени жизни фосфоресценции.

На рис 7 представлена зависимость от рН положения максимума спектра триптофановой флуоресценции парвальбумина трески, измеренная при комнатной температуре и при температуре жидкого азота. Парвальбумин трески является связывающим кальций белком, имеющим два центра связывания Са(П) на молекулу. Поскольку два иона Са(И) в этом белке образуют координационные связи с атомами кислорода карбоксильных и карбонильных групп, протоны конкурируют с Са(Н) за кислороды карбоксилов и при низких значениях рН могут полностью вытеснить Са(Н). Это вызывает изменение конформации парвальбумина (так называемый "кислотный переход"), что приводит к перемещению единственного остатка триптофана из жесткого гидрофобного окружения белка на его поверхность. Это в свою очередь приводит к сдвигу спектра триптофановой флуоресценции в длинноволновую сторону [Регшуакоу е1 а1., 1982]. Из-за отсутствия динамических эффектов при 77К индуцируемый изменением рН сдвиг спектра флуоресценции в этом случае Меньше, чем при комнатной температуре.

На рис. 7Б показаны спектры фосфоресценции парвалбумина трески при разных значениях рН 6.2 и 2.8. Кислотный переход отражается в длинноволновом сдвиге всего спектра, уширении пиков и ухудшении разрешения колебательной структуры. Зависимости от рН параметров триптофановой фосфоресценции парвальбумина трески приведены на рис. 8. Изменение рН от 3 до 5 вызывает сдвиг 0-0 перехода в длинноволновую сторону на 350 см*1 и увеличение одной из частот колебаний (ДуО на 45 см-1.

Кислотный-переход в парвальбумине трески четко детектируется и по изменению величины Р/Т и времени жизни фосфоресценции тр (рис. 9). Видно, что переход остатка триптофана на поверхность вызывает резкое уменьшение Р/Р и времени жизни фосфоресценции тр.

Спектр низкотемпературной флуоресценции парвальбумина трески обладает хорошо выраженной колебательной структурой, что позволяет провести корректный анализ на основе аналитического описания. Изменение рН от 5 до 3 вызывает сдвиг 0-0 переходов обеих колебательных серий у(|)о_о и у(2)о-о в длинноволновую сторону и противоположное изменение частот колебаний ДУ1 и Ду2.

а.,

340-1

330-

320-

310

а'

°°осРо

А 1 4 Д ° О о о О

2 3

5

рН

в 7

21 22 23 V, хЮ3 см'1

Рис. 7. Зависимость от рН положения максимума спектра триптофановой флуоресценции насыщеного ионами кальция парвальбумина трески, измеренная при температуре 77 К (О) и 293 К (Д)- (А). Спектры фосфоресценции кальциевой (рН=6.8) и кислой (рН=2.8) форм парвальбумина трески (Б). Температура 77 К

24.6 -I

те 24.4

о

>

24.2-

ооо О О о

о о

> <

24.0 0.80-1 0.78 0.760.74 0.720.70

2

4 5 6

о о Оэ

о о°о О 0 о

Б

2 3 4 5 6 7

> <

1.50 1.451.40 1.35 1.30

83 О

О о

о о

В

2

8

4 5 6

рН

Рис. 8. рН-зависимосгь параметров триптофановой фосфоресценции парвальбумина трески: А- положение 0-0 перехода, Б - частота первой колебательной серии, В - частота второй колебательной серии. Температура 77 К.

8

4

8

I

в

о

На рис. 10 показана зависимость параметров низкотемпературной люминесценции мелиттина из пчелиного яда от концентрации КС1. Известно, что увеличение концентрации соли вызывает образование тетрамеров мелиттина [King et al, 1976] и переход единственного остатка триптофана из водного окружения в белковое, что отражается в сдвиге спектра в

7.0-

1.0

0.8 0.60.4 0.2

о о

оо

б.о Н

Тр, с 5.0

I ' I 1 I ' I 1 I |—~1

2 3 4 5 6 7 8

4.0

,о о О

o°0od>°

—I—1—I—1—I—1—I—1—I—1—I

2 3 4 5 6 7 8

рН рН

Рис. 9. рН-зависимостъ параметров тршггофановой люминесценции насыщенного кальцием ларвальбумина трески: отношения квантовых выходов фосфоресценции и флуоресценции (А) и долгоживущей компоненты времени жизни фосфоресценции тр (Б).

24.32

™ 24.28-1 ft*

24.24

О

О О

P/F

о

о о

0.7

о.бН

0.5 0.4

О

0.3

о

о

о

о о

о

Б

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0

КС1, м

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0

КС1, м

Рис. 10. Зависимость от коценграции КС1 положения 0-0 перехода фосфоресценции (А) и отношения квантовых выходов фосфоресценции и флуоресценции Р/Р (Б) мелиттина из пчелиного яда. Температура 77 К.

о

коротковолновую сторону на 15 нм при комнатной температуре [Демченко и др., 1987].

При низких температурах процесс тетрамеризации мелиттина отражается лишь на положении 0-0 перехода в спектре фосфоресценции (рис. 10А), частоты колебаний при этом не меняются. К тетрамеризации мелиттина чувствителен параметр P/F, который увеличивается с ростом концентрации KCl от 0.36 до 0.6 (рис. 10Б). Время жизни фосфоресценции при этом не меняется.

Отметим, что направленность изменения таких параметров, как положение 0-0 перехода в спектре фосфоресценции и отношения P/F, в случае кислотного перехода в ларвальбуминах трески и мерланга, тетрамеризации мелиттина, одинаковым образом коррелирует с изменением локализации остатка триптофана. В то же время, при N->F переходе в спектре фосфоресценции при таком же изменениии локализации остатка триптофана противоположно, хотя направление изменения параметра P/F при этом совпадает. Исходя из этих результатов можно сделать вывод, что параметры низкотемпературной люминесценции остатков триптофана в белках определяется, в основном не их локализацией на поверхности или внутри белковой глобулы, а специфическими взаимодействиями хромофоров с их ближайшим окружением.

В заключение отметим, что низкотемпературная триптофановая люминесценция белков может быть с успехом использована для изучения структурных переходов, в белках. В ряде случаях эта информация не только дополняет флуоресцентные данные, полученные при комнатной температуре, но и позволяет обнаружить новые особенности этих переходов.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ВЫВОДЫ

1. Электронно-колебательные спектры фосфоресценции и флуоресценции остатков триптофана в однотриптофановых белках при температуре 77К лучше всего описываются теоретической кривой, рассчитанной согласно модели, предполагающей существование двух независимых серий нормальных компонент, причем в каждой серии проявляется по одному типу колебаний.

2. Спектры фосфоресценции и флуоресценции ряда белков с

различной локализацией единственного остатка триптофана подгоняли кривой, рассчитанной согласно указанной модели. Полученные результаты показывают, что в полосе фосфоресценции остатков триптофана в белках проявляются колебания дчух типов, частоты которых лежат в диапазонах 650-800 см-1 и 1350-1500 см-1.

3. На основании того, что замена НгО на D20 не влияла на

величину вибронного расщепления обеих серий в спектрах фосфоресценции сывороточного альбумина человека, мелитгина из пчелиного яда и триптофана в 1 М KCl, можно полагать, что серия 1350-1500 см"1 соответствует колебаниям типа W5 (колебания бензольного кольца типа В19а). Серию 650-800 см-1 в спектрах фосфоресценции белков можно отнести к колебаниям типа W18, т.е. к дыхательным колебаниям индольного кольца.

Исследования хорошо изученных другими методами

информационных переходов в белках, содержащих по одному остатку триптофана (N-»F перехода в сывороточном альбумине человека, кислотного перехода в парвальбумине трески и тетрамеризации мелиттина из пчелиного яда) показали, что параметры низкотемпературной триптофановой люминесценции белков чувствительны к изменениям окружения хромофоров и могут быть использованы для получения полезной физической информации о белке. Обнаруженная чувствительность характерна как для традиционно используемых параметров, так и для параметров, определенных при помощи разложения спектров на две независимые серии нормальных компонент с разным вибронным расщеплением каждая.

>. Впервые зарегистрирована хорошо выраженная колебательная структура в спектре низкотемпературной триптофановой флуоресценции белков: гормона роста (соматотропина) человека и мелиттина из пчелиного яда, индольный хромофор которых образует в возбужденном состоянии эксиплекс 2:1.

¡. Выявлена четкая корреляция между отдельными параметрами низкотемпературной триптофановой фосфоресценции и флуоресценции однотриптофановых белков: положением 0-0 перехода фосфоресценции и положением максимума

спектра флуоресценции, отношением квантовых выходов фосфоресценции и флуоресценции и положением 0-0 перехода фосфоресценции. Отношение квантовых выходов фосфоресценции и флуоресценции коррелирует с локализацией индольного хромофора в белке. 7. Несмотря на обнаруженную корреляцию некоторых параметров низкотемпературной триптофановой люминесценции белка с доступностью хромофора растворителю, параметры спектров фосфоресценции и флуоресценции белков при температуре 77 К определяются, по-видимому, в основном специфическими взаимодействиями индольного хромофора с его окружением.

Работы, опубликованные по теме диссертации

1. Дейкус Г.Ю., Веденкина Н.С., Бурштейн Э.А., Пермяков Е.А.

Анализ тонкой структуры спектров низкотемпературной флуоресценции и фосфоресценции однотриптотфановых белков. Тез. докл. VII Всесоюзной конференции по спектроскопии биополимеров, Харьков, 1991, стр. 81-82.

2. Дейкус Г.Ю., Пермяков Е.А. Анализ колебательной структуры в

низкотемпературных спектрах люминесценции белков с одним остатком триптофана. Тез. докл. II Международной конференции , "Успехи современной криобиологии", Харьков, 1992,стр. 56.

3. Пермяков Е.А., Г.Ю. Дейкус. Аналитическое описание

электронно-колебательных спектров белков. Молекулярная биология, 1995, т. 29, в. 1, стр. 159-167.

4. Пермяков Е.А., Г.Ю. Дейкус. Исследование конформационных

переходов в белках по триптофановой флуоресценции и фосфоресценции при низких температурах. Молекулярная биология, 1995, т. 29, в. 2, стр. 339-344.

5. Deikus G. Yu., Permyakov E. A. Study of electron-vibrational

émission spectra of single tryptophan proteins using analytical description of the spectra. Тез. докл. Международной конференции "Физика и химия органических люминофоров-95", Харьков, 1995, стр. 130.

10.11.96 г. 3. 7290Р. Т. 100 экз. Усл. печ. л. 1,5.

Отпечатано на ротапринте в ОНТИ ПНЦ РАН.