Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Терапевтический эффект совместной экспрессии генов тимидинкиназы вируса простого герпеса и ГМ-КСФ в опухолях

ВАК РФ 03.01.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Терапевтический эффект совместной экспрессии генов тимидинкиназы вируса простого герпеса и ГМ-КСФ в опухолях"

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки ИНСТИТУТ БИООРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ ИМ. АКАДЕМИКОВ М. М. ШЕМЯКИНА И Ю. А. ОВЧИННИКОВА РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК

На правах рукописи

АЛЕКСЕЕНКО ИРИНА ВАСИЛЬЕВНА

ТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЭФФЕКТ СОВМЕСТНОЙ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ ТИМИДИНКИНАЗЫ ВИРУСА ПРОСТОГО ГЕРПЕСА И ГМ-КСФ В ОПУХОЛЯХ

03.01.03 - Молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва-2013

21 НОЯ 2013

005538765

Работа выполнена в лаборатории структуры и функций генов человека Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института биоорганической химии им. академиков М. М. Шемякина и Ю. А. Овчинникова Российской академии наук (ИБХ РАН)

Научный руководитель:

Свердлов Евгений Давидович, доктор химических наук, профессор, академик РАН Официальные оппоненты:

Ларин Сергей Сергеевич, кандидат биологических наук, заведующий лабораторией генной терапии Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института биологии гена Российской академии наук

Лебедев Юрий Борисович, доктор биологических наук, заведующий лабораторией сравнительной и функциональной геномики ИБХ РАН

Ведущая организация:

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт молекулярной биологии им. В.А.Энгельгардта Российской академии наук

. . ^ Ор

Защита состоится г. в часов на заседании Диссертационного Совета

Д002.019.01 при ИБХ РАН по адресу: 117997, Москва, ул. Миклухо-Маклая 16/10

С текстом диссертации можно ознакомиться в библиотеке ИБХ РАН

Автореферат разослан 2013 г.

Ученый секретарь Диссертационного Совета, доктор физ.-мат. наук В.А. Олейников

ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы

Рак представляет собой одну из наиболее серьезных проблем медицины: он занимает второе место по смертности в мире и, по прогнозам, имеет перспективу перейти на первое. Генная терапия рака, в основе которой лежит доставка генов в опухоль, вызывающих ингибирование роста или гибель клеток опухоли, в настоящее время - одно из наиболее активно развивающихся направлений. Одной из важных стратегией генной терапии злокачественных новообразований является терапия с использованием, так называемых, генов-убийц (генная хирургия). Генная хирургия направлена на уничтожение опухолевых клеток, путем использования их свойств, которые характерны для всех раковых клеток, например, повышенная скорость митотических делений. Подход заключается в доставке в раковые клетки генов-убийц, кодирующих фермент, как правило, вирусного или бактериального происхождения, который в клетках, где он экспрессируется, модифицирует свой субстрат, превращая его из нетоксичного пролекарства в токсичный для клетки метаболит.

Генная хирургия является двустадийной. На первом этапе в опухолевые клетки вводится ген-убийца с требуемой системой экспрессии (Рис.1), на втором вводят пролекарство, которое под действием фермента, образующегося в результате экспрессии гена-убийцы, превращается в токсин внутри раковых клеток, что резко уменьшает токсичность терапии. Токсин может высвобождаться из клетки, экспрессирующей ген-убийцу, и проникать в соседние клетки, вызывая их гибель, что многократно усиливает терапевтический эффект. Данное явление получило название «эффекта свидетеля» (bystander effect). «Эффект свидетеля» заключается в том, что опухолевые клетки, не получившие ген-убийцу, но соседствующие с таковыми, оказываются подверженными цитотоксическому эффекту со стороны высвобождающегося токсина. Наиболее перспективными в настоящее время являются две системы ген-убийца/пролекарство, обладающие «эффектом свидетеля» и достигшие поздних стадий клинических испытаний: тимидинкиназа вируса простого герпеса (HSVtk)/ranuHicioBnp(GCV) и цитозиндезаминаза/5-фторцитозин.

Эффективность системы HSVtk/GCV для лечения широкого спектра опухолей была показана в экспериментах на животных. Однако в клинических испытаниях на пациентах пока получают худшие результаты, чем на животных. В значительной степени это связано с недостаточно высокой специфичностью экспрессии терапевтических генов в раковых клетках и с недостаточно высоким уровнем «эффекта свидетеля» при проведении испытаний на пациентах. «Эффект свидетеля» может быть дополнительно усилен за счет работы иммунной системы, поскольку гибель раковых клеток и высвобождение из них опухолевых антигенов

активируют способность иммунной системы уничтожать раковые клетки, которые не экспрессируют ген-убийцу.

Таким образом, эффективность действия системы ген-убийца/пролекарство можно повысить, стимулируя противоопухолевый иммунный ответ, например, с помощью цитокинов. В ряде работ показано, что регрессия опухоли значительно возрастает при совместном использовании гена-убийцы и отдельно вводимого в виде белка цитокина, в частности, гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора (ГМ-КСФ или СМ-С8Г). В некоторых исследованиях продемонстрировано развитие специфического противоопухолевого иммунитета после совместной экспрессии двух отдельных генов Н5И и СМ-СЗТ7 в клетках опухоли. Предполагается, что совместная экспрессия гена-убийцы и СМ-СЗТ^ в клетках опухоли будет приводить к уничтожению раковых клеток и высвобождению из них опухолевых антигенов, которые будут эффективно представляться ГМ-КСФ-активированными антиген-представляющими клетками Т-клеткам иммунной системы, обеспечивая активацию специфического противоопухолевого иммунитета, в результате чего возрастет гибель опухолевых клеток и снизится вероятность возникновения метастазов.

Одним из важных элементов успеха генной терапии рака является система контроля экспрессии терапевтических генов. В генных противораковых препаратах, предназначенных для внутривенного введения, экспрессия терапевтического гена должна контролироваться опухолеспецифичным промотором. В идеальном случае опухолеспецифичный промотор должен обеспечивать максимально тканеспецифичную и достаточно сильную экспрессию трансгена, чтобы с одной стороны обеспечить безопасность, а с другой - эффективность системы. Обычно используемые для этих целей природные опухолеспецифичные промоторы значительно слабее, чем конститутивные промоторы, такие как промоторы цитомегаловируса (СМУ) или вируса 8У40. Они активны в ограниченном числе типов раковых клеток, и их активность сильно варьирует в разных опухолях, затрудняя подбор доз пролекарства и снижая терапевтический эффект. Например, сравнительно сильные опухолеспецифичные промоторы с достаточно широким спектром активности, такие как промотор гена ВШС5 (Ь8игу), кодирующего ингибитор апоптоза сурвивин и промотор гена обратной транскриптазы теломеразы человека (ЬТЕЯТ) проявляют ее не во всех раковых клетках. При этом наблюдается значительная вариабельность относительной активности данных промоторов в различных опухолевых клеточных линиях. Так активность промотора гена сурвивина человека варьирует в пределах от 0,3 до 16% от активности промотора СМУ, а эффективность работы промотора ИТЕЯТ может различаться до 20 раз в зависимости от типа раковых клеток.

Для увеличения эффективности опухолеспецифичных промоторов описано два подхода: 1) использование систем регулируемой экспрессии трансгенов, 2) использование гибридных промоторов. Гибридные промоторы могут включать в себя комбинации известных промоторов друг с другом или с отдельными гетерологичными регуляторными элементами с целью увеличить силу и специфичность экспрессии в раковых клетках. Как правило, исследователи при создании гибридных промоторов идут по пути максимального увеличения эффективности и специфичности экспрессии в определенном типе раковых клеток. Использование строго специфичных к опухоли определенного типа промоторов и других регуляторных элементов имеет в качестве преимущества максимальное снижение побочных эффектов за счет снижения экспрессии трансгенов в нормальных тканях. Однако, недостатком таких подходов является их неуниверсальный характер и связанная с этим вероятность инактивации промотора в метастазах, поскольку нет строгой гарантии, что узкоспецифичный промотор, хорошо работающий в первичной опухоли, сохранит эту способность во всех ее метастазах.

Цель работы

Целью данной работы являлось создание эффективной противоопухолевой генно-терапевтической системы, содержащей гены HSVtk и GM-CSF. Работа проводилась в двух направлениях: 1) создание конструкций, несущих терапевтические гены HSVtk и GM-CSF под контролем одного промотора с последующим исследованием их цитотоксического эффекта в экспериментах in vitro, ex vivo и in vivo, 2) конструирование и тестирование двойных опухолеспецифичных промоторов для экспрессии терапевтических генов в широком спектре опухолей.

В ходе работы были поставлены следующие задачи:

1. Создать экспрессионные конструкции, содержащие гены HSVtk и GM-CSF мыши или человека под контролем одного промотора.

2. Провести оценку экспрессии и биологической активности HSVtk и GM-CSF в составе полученных конструкций в экспериментах in vitro.

3. Оценить противоопухолевый эффект полученных конструкций в экспериментах ex vivo и in vivo на животных.

4. Сконструировать двойные тандемные промоторы на основе модифицированных промоторов генов обратной транскриптазы теломеразы человека (hTERT) и сурвивина человека (hSurv) и мыши (mSurv).

5. Провести анализ активности и специфичности созданных двойных тандемных промоторов на панели клеточных линий человека и оценить эффективность наиболее активного промотора в терапевтической системе ex vivo на мышах.

Научная новизна и практическая значимость работы

Настоящая работа была направлена на создание и тестирование генно-терапевтических конструкций, несущих под контролем одного промотора ген-убийцу HSVtk и ген цитокина GM-CSF, а также на создание эффективных универсальных опухолеспецифичных промоторов, активных в широком спектре раковых клеток вне зависимости от их типа. Были созданы и охарактеризованы генные конструкции, содержащие гены HSVtk и GM-CSF как по отдельности, так и в составе одного вектора. Цитотоксическая активность полученных конструкций была продемонстрирована в экспериментах in vitro на панели раковых клеточных линий человека и мыши. В экспериментах ex vivo и in vivo на животных было показано, что бицистронная конструкция, содержащая два терапевтических гена HSVtk и GM-CSF, обладает более сильным противоопухолевым эффектом, чем конструкции, несущие одиночные гены HSVtk и GM-CSF. На основе бицистронной конструкции был создан генно-терапевтический противоопухолевый препарат с коммерческим названием «АнтионкоРАН-М», его безопасность и эффективность были доказаны в ходе доклинических испытаний, проводимых на базе Московского научно-исследовательского онкологического института им. П.А.Герцена, Москва.

С целью создания универсальных опухолеспецифичных промоторов, активных в широком спектре раковых клеток, впервые были сконструированы искусственные двойные тандемные промоторы PhSurv-PhTERT (PhST) и PhTERT-PhSurv (PhTS) на основе модифицированных промоторов генов hTERT и BIRC5 (hSurv) человека. Было показано, что транскрипция в тандемных промоторах PhST и PhTS инициируется только с прилежащего к гену (проксимального) промотора. Транскрипция с дистального промотора подавляется. Данный тип промоторной интерференции обнаружен и описан впервые. Предложен и экспериментально подтвержден возможный механизм возникновения промоторной интерференции в двойных Spl-богатых промоторах. На панели раковых клеточных линий человека показано, что активность созданного двойного промотора PhTERT-PhSurv269 (PhTSurv269) превосходит активность одиночных PhTERT, PhSurv, PhSur269 и двойных PhTS, PhST промоторов, при этом промотор PhTSurv269, в отличие от одиночных, сохраняет стабильный уровень активности во всех исследованных клеточных линиях. В экспериментах in vitro и ex vivo показана противоопухолевая эффективность конструкции, несущей терапевтические гены HSVtk и GM-CSF под контролем промотора PhTSurv269.

Полученные в работе результаты имеют как фундаментальное, так и прикладное значение. В рамках работы были впервые получены двойные тандемные опухолеспецифичные промоторы. Был описан новый вид промоторной интерференции, выдвинута и подтверждена гипотеза ее возникновения. Были созданы генно-терапевтичеекие конструкции, на основе одной из них был разработан новый генный противоопухолевый препарат «АнтионкоРАН-М». Препарат будет использован для клинических исследований с перспективой внедрения в производство и клиническую практику. Также, полученные в работе данные могут быть использованы для рационального дизайна противоопухолевых генно-терапевтических препаратов нового поколения.

Апробация работы

Результаты работы были представлены на российских и международных конференциях: Научная конференция, посвященная 25-летнему юбилею Института химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН: «Химическая биология - Фундаментальные проблемы бионанотехнологии» (Новосибирск, 2009), Международный форум по нанотехнологиям (Москва, 2009), FEBS Advanced Lecture Course (Спецес, Греция, 2010); 14-я Международная школа молодых учёных (Пущино, 2010); The 4th International IMBG Conference for young scientists "Molecular Biology: Advances and Perspectives" (Киев, Украина, 2011); Научная конференция по биоорганической химии и биотехнологии «X чтения памяти академика Юрия Анатольевича Овчинникова» (Москва, 2011); XXIV Зимняя молодежная научная школа «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (Москва, 2012); XXV Международная зимняя молодежная научная школа «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (Москва, 2013); FEBS CONGRESS 2013 "Mechanisms in Biology" (Санкт-Петербург, 2013); 21st Int. Symp. "Nanostructures: Physics and Technology" (Санкт-Петербург, 2013).

Объём работы

Диссертационная работа изложена на ... страницах и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, результатов и их обсуждения, основных выводов и списка литературы из .... наименований. Диссертация содержит ... таблицы и ... рисунков.

Публикации

По теме диссертации опубликовано 6 печатных работ и получен патент РФ на изобретения.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Данная работа проводилась в рамках проекта по разработке генно-терапевтических противораковых препаратов. Работа проводилась параллельно в двух направлениях: 1) создание и тестирование генно-инженерных конструкций, несущих под контролем конститутивного промотора гены НЭУЙс и ОМ-СЭР. 2) создание двойных тандемных опухолеспецифичных промоторов на основе модифицированных промоторов генов 5«п> и ТЕНТ для контроля экспрессии терапевтических генов в опухолях.

Создание генно-инженерных конструкций, несущих гены HSVtk и GM-CSF под контролем одного промотора

Тимидинкиназа вируса простого герпеса (HSVtk) (Рис.1 Б) - фермент, который способен фосфорилировать низкотоксичный аналог гуанозина - ганцикловир (GCV, РисЛБ) до ганцикловирмонофосфата. Когда в опухолевые клетки доставляется извне ганцикловир, клетки, трансформированные HSVtk, погибают, поскольку HSVtk превращает его в ганцикловирмонофосфат, который затем клеточные киназы фосфорилируют до ганцикловиртрифосфата. Последний при клеточном делении включается во вновь синтезированную цепь ДНК и обрывает ее дальнейший синтез.

Очень важной особенностью данного подхода является способность вновь образуемого ганцикловиртрифосфата проникать в клетки, не экспрессирующие ген HSVtk, приводя к их гибели (<оффект свидетеля»).

Рис. 1. А. Схема работы системы ген-убийца/пролекарство. Ген-убийца доставляется в клетки в комплексе с носителем. В результате экспрессии гена-убийцы в клетке продуцируется фермент, превращающий нетоксичное

пролекарство, вводимое внутривенно, в токсин. Наработка в раковой клетке токсина приводит к ее гибели. Токсин может высвобождаться из клетки, в которой он был образован, и проникать в соседние раковые клетки, вызывая их гибель. В. Схематическое

изображение механизма работы системы тимидинкиназа вируса простого герпеса (HSVtk) /ганцикловир (GCV). Вверху химическая формула пролекарства ганцикловира; внизу — HSVtk катализирует реакцию фосфорилирования ганцикловира с образованием ганцикловирмонофосфата (GCVp). Клеточные киназы переводят ганцикловирмонофосфат в форму трифосфата. Ганцикловиртрифосфат (GCVppp) встраивается в растущую цепь ДНК, останавливая репликацию и вызывая апоптоз. (по David Kerr, Nature reviews Cancer 3, 2003).

Доставка конструкции с гепоч-убийпей

Выход токсина из клетки, попадание в соседние клетки, гибель соседних раковых клеток

В ряде работ показано, что регрессия опухоли значительно возрастает при совместном использовании двух раздельных векторов, содержащих ген-убийцу и GM-CSF. Однако, вероятность совместного попадания генов HSVtk и GM-CSF, находящихся в отдельных (разных) конструкциях, в одну раковую клетку низка, что приводит к снижению эффекта совместной экспрессии данных генов в опухоли. Этот эффект может быть повышен за счет сведения данных генов в состав одного вектора.

Поскольку белок GM-CSF видоспецифичен, а эффективность генно-терапевтичееких конструкций необходимо тестировать на животных с привитыми опухолями, мы создали два варианта конструкции, один из которых содержит ген GM-CSF мыши и предназначен для модельных экспериментов на мышах, другой содержит ген GM-CSF человека и предназначен для клинических испытаний (mGM-CSF и HGM-CSF, соответственно).

Для одновременной экспрессии двух генов под контролем одного промотора был использован сайт внутренней посадки рибосом - IRES (Internal ribosome entry site).

Нами были получены и протестированы экспрессионные конструкции, содержащие гены

HSVtk и mGM-CSF или hGM-CSF под контролем конститутивного промотора CMV как по

отдельности, так и в составе одной экспрессирующей плазмиды (Рис.2).

Рис.2. Схема полученных ллазмидных конструкций.

Слева указаны названия конструкций. Для простоты представления приводится структура экспрессионных кассет, сигнал polyA SV40 на схеме не указан. CMV промотор цитомегаловируса, hGM-CSF и mGM-CSF - ген гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора человека и мыши, соответственно, HSVtk -ген тимидинкиназы вируса простого герпеса. IRES - сайт внутренней посадки рибосом вируса энцефаломиокардита.

Анализ экспрессии генов HSVtk и GM-CSF в составе полученных конструкций

Для анализа совместной экспрессии генов HSVtk и GM-CSF в составе полученной конструкции CMV-HSVtk-GM-CSF-pGL3 (обозначим TK.GM) были проведены транзиентные трансфекции клеток линий НЕК293 (трансформированные клетки почки эмбриона человека), Calu-1 (эпидермоидная карцинома легкого), LLC (карцинома легкого Льюис). В качестве контролей использовали экспрессионные конструкции CMV-HSVtk-pGL3 (обозначим ТК) и CMV-GM-CSF-pGL3 (обозначим GM), несущие одиночные гены HSVtk и GM-CSF. Эукариотические клетки трансфицировали полученными конструкциями, используя липосомный перенос, далее собирали клеточные осадки и ГМ-КСФ-содержащую кондиционированную среду для анализа. Уровень экспрессии HSVtk определяли методом

CMV-hGM-CSF*pGL3 (hGM) CMV-mGM-CSF-pGU (mGM) CMV-HSVtk-pGL3 <TK) CMV-HSVtk-hGM-CSF-pGL3 (TKhGM) CMV-HSVIk-mGM-CSF-pGL3 (TKmGM)

| CMV |hGM-CSfl

I CMV ^TlGM-CSH

CMV |

Ф>

I CMV | HSV(k 1 IRES |hGM-CSFj

I CMV | HSVtk I IRES jmGM-CSF[

вестерн-блот анализа. Было показано, что конструкции TKhGM и TKmGM обеспечивают высокий уровень белка HSVtk в клетках линий НЕК293, Calu-1, LLC, сопоставимый с уровнем HSVtk, образующимся при трансфекции клеток плазмидой ТК.

Уровень продукции GM-CSF определяли методом ELISA. Он составлял в клетках НЕК293, трансфицированных плазмидой TKhGM, - 110 нг GM-CSF на 106 клеток в день, трансфицированных контрольной плазмидой hGM - 115 нг, плазмидами TKmGM и mGM -182 и 190 нг mGM-CSF, соответственно. При этом в кондиционированной среде, полученной от нетрансфицированных клеток, GM-CSF не детектировался, что позволяет сделать вывод, что GM-CSF образуется только в результате экспрессии гена GM-CSF в составе полученных векторов. Таким образом, было показано, что уровень экспрессии генов HSVtk и GM-CSF мыши и человека в составе созданных бицистронных экспрессионных конструкций не ниже, чем в конструкциях, содержащих одиночные данные гены.

Анализ биологической активности белков HSVtk и GM-CSF, синтезируемых в клетках, трансфицированных полученными конструкциями

Для проверки биологической активности HSVtk полученных векторов проводили тест на функциональную активность HSVtk в присутствии ганцикловира. Клетки линий НЕК293 и LLC трансфицировали анализируемой TKGM и контрольной ТК конструкциями, затем инкубировали в питательной среде, содержащей ганцикловир в различной концентрации. Цитотоксический эффект оценивали через 196 часов после добавления раствора GCV посредством MTS теста (Promega, США).

120 100 80 60 40 20 о

LLC

НЕК293

□ 0 мкМ а 12,5 мкМ В 50 мкМ

Рис.3. Выживаемость клеток линий НЕК293 и LLC, трансфицированных конструкциями ТК и TKmGM, в присутствии GCV.

Высота столбцов отражает процент живых клеток через 196 часов после добавления GCV. Сверху указаны клеточные линии. Снизу приведены названия конструкций. Сбоку указаны концентрации раствора ганцикловира (0; 12,5; 50 мкМ). Приведено стандартное отклонение среднего

Как видно на приведенной диаграмме (Рис. 3), инкубация клеток с ганцикловиром приводит к гибели трансфицированных клеток и не влияет на выживаемость нетрансфицированных клеток. Выживаемость клеток, трансфицированных конструкциями ТК и ТКггЮМ, практически не различается в обеих клеточных линиях.

Биологическую активность ОМ-СЭК мыши подтверждали по способности кондиционированной среды, содержащей тСМ-СБР, вызывать дифференцировку клеток-предшественников костного мозга мыши, поскольку известно, что тОМ-СБР индуцирует рост и дифференцировку незрелых костномозговых клеток в разные типы клеток миелоидного ряда. В ходе эксперимента клетки-предшественники костного мозга мыши культивировали в среде с добавлением ГМ-КСФ-кондиционированной среды в разных разведениях, полученной от клеток линии НЕК293, трансфицированных конструкцией ТКиЮМ. Было показано, что под воздействием полученной кондиционированной среды происходит дифференцировка клеток-предшественников, что свидетельствует о наличии в опытном образце биологически активного тОМ-С5Р.

Биологическую активность ОМ-СЭР человека определяли по уровню стимуляции пролиферации КОМ-СБ Р-зависимой линии клеток эритролейкоза человека ТР-1. Для проведения эксперимента клетки ТР-1 культивировали в кондиционированной среде, полученной от клеток линии НЕК293, трансфицированных конструкциями ТКЬОМ и НОМ, или в среде, не содержащей ОМ-СБР (отрицательный контроль). Степень стимуляции пролиферации ТР-1 клеток определяли с помощью МТБ-теста (Ргоп^а, США), результаты которого приведены на Рис.4. Видно, что уровень пролиферации клеток ТР-1 в кондиционированной среде значительно выше, чем в контроле, а увеличение разведения кондиционированной среды приводит к снижению пролиферации клеток. При этом пролиферативное действие ИОМ-СБР конструкции ТКЬОМ и ЬОМ-СЭР контрольной плазмиды ЬвМ практически одинаковы.

Рис.4. Биологическая активность ЬвМ-СвЕ конструкций ЬСМ и ТКЬОМ.

По оси абсцисс приведена кратность разведения ЬОМ-СЯГ-кондиционированной среды, полученной от клеток НЕК293, трансфицированных конструкциями ТКЬОМ и ЬОМ. По оси ординат - стимуляция пролифирации клеток ТР-1. За 100% принимали количество живых клеток в контроле (клетки культивируемые без добавления ЬОМ-С8Г-кондкционировапной среды).

Оценка терапевтического потенциала полученных конструкций ex vivo на животных

Мышам линии C57BI/6 были подкожно трансплантированы клетки линии LLC, транзиентно трансфицированные конструкциями ТК и TKmGM в комплексе с Липофектамином-2000 (Invitrogen, США). Как видно из представленных на Рис.5А данных, на 18 день эксперимента (последний день, когда были живы все животные) у животных,

I 800 •

о. 700 ■

4 600 -

| 500-& 400 ■ I 300 ■ g 200 -Ж 100 ■ ! 0-

Разведение кондиционированной среды

получивших систему TKmGM/GCV или TK/GCV, не было обнаружено признаков развития опухоли. Динамика роста опухоли в группе животных, получавших комбинацию TKmGM/PBS, была значительно медленнее, чем в группе TK/PBS и контрольных группах. Животные групп TRmGM/PBS и TK/PBS в качестве плацебо получали раствор фосфатного буфера (PBS), поэтому эффект подавления роста опухолей в группе TKmGM/PBS обеспечивался только работой гена mGM-CSF. На момент окончания эксперимента (60-ый день) в группе TKmGM/GCV были живы все животные, в группах TK/GCV и TKmGM/PBS выжило 90% и 50% животных, соответственно. В группах TK/PBS, K/PBS, K/GCV все животные погибли (Рис.5Б).

Таким образом, противоопухолевый эффект был выявлен у обеих конструкций ТК и TKmGM, однако выраженность эффекта у конструкции TKmGM была значительно выше, чем у конструкции ТК.

Рис.5. Влияние трансформации клеток LLC конструкциями ТК и TKmGM в сочетании с введением раствора GCV на А) скорость роста опухолей, вызванных трансплантацией данных клеток мышам C57BI/6 и Б) продолжительность жнзни животных. Данные представляют собой средние значения для группы из 10 животных. Всего было сформировано 6 групп мышей: две контрольные группы, получившие нетрансфицированные клетки (группы K/GCV и K/PBS); две опытные группы, получившие клетки LLC, трансфицированные конструкцией ТК (группы TK/GCV и TK/PBS) и две опытные группы, получившие клетки LLC, трансфицированные конструкцией TKmGM (группы TKmGM/GCV и TKmGM/PBS). Животные из групп K/GCV, TK/GCV и TKmGM/GCV в течение 10 дней дважды в день внугрибрюшинно получали раствор ганцикловира в дозе 75 мг/кг, животным групп K/PBS, TK/PBS и TKmGM/PBS вводили внугрибрюшинно раствор фосфатного буфера (PBS) в качестве плацебо. Начиная с шестого дня после трансплантации клеток, определяли размер развившихся опухолей. Критерием эвтаназии животного был размер опухоли, превышающий 10% от массы животного. А) По оси ординат указан средний размер опухоли в группе (мм3). По оси абсцисс указано время, прошедшее с момента трансплантации клеток. Приведены стандартные ошибки среднего (SEM).

Б) По оси абсцисс указано время, прошедшее с момента трансплантации клеток. По оси ординат - процент выживших животных.

Оценка терапевтического потенциала полученных конструкций in vivo на животных

Для доставки терапевтических конструкций в клетки опухоли пациента используют вирусные и невирусные системы. Основным недостатком невирусных систем доставки по сравнению с вирусными является их более низкая трансфекционная эффективность. При этом невирусные системы доставки обладают рядом преимуществ таких как высокая пакующая емкость, низкая иммуногенность, высокая безопасность и возможность экономичного

3000

m

s a 2500

ts 5 2000

о 1500

а

о

s 1000

tí

* vo 500

О

о —»

Дни эксперимента

—♦—K/GCV -O-TKmGMTBS

TKPBS ■TKmCXrCCV

10 20 30 40 5t

Дни эксперимента

производства. В качестве системы доставки полученных терапевтических конструкций в экспериментах in vivo мы использовали разработанные в рамках совместного проекта с лабораторией проф. Соболева А.С., ИБГ РАН блок-сополимеры ПЭГ-ПЭИ-ТАТ, включающие линейные поликатионы полиэтиленимин (ПЭИ) и полиэтиленгликоль (ПЭГ), а также пептид GRKKKRRQRC (ТАТ-пептид). Разработанные блок-сополимеры - неиммуногенны, низкотоксичны и легко модифицируемы для направленной доставки.

Терапевтический эффект конструкций ТК, mGM и TKmGM в комбинации с ПЭГ-ПЭИ-ТАТ был оценен in vivo в отделе проф. Якубовской Р.И., МНИОИ им. П.А. Герцена.

Противоопухолевый эффект конструкций оценивали по уровню торможения роста опухоли (ТРО,%), увеличению продолжительности жизни (УПЖ,%) животных и индексу торможения метастазирования (ТМ,%). ТРО, УПЖ и ТМ вычисляли по следующим формулам:

Ук _ у0п

ТРО =-* 100%, где V - средний объем опухоли (мм ) в опытной (Vop) и контрольной

Vk

(Щ группах животных; УПЖ - СПЖ<-~) ~ СПЖ(контроль) ^ ^ спж _ ^^

СПЖ(контроль)

продолжительность жизни животных в опытной и контрольной группах, соответственно;

ТМ = Vmts(O) ^ |qqo/0 ^ где Vmts(K) - средний объем пораженных лимфоузлов в

Vmts(K)

контрольной группе, Vmts(O) - средний объем пораженных лимфоузлов в опытной группе.

Минимальным критерием активности противоопухолевых препаратов по показателю ТРО является величина > 50%, по показателю ТМ>25%.

Опухолевый штамм саркомы S37 прививали мышам F1 подкожно. Лечение начинали на 7-е сутки роста опухоли, когда опухоль в среднем имела объем ~ 100 мм3. Конструкции в комплексе с ПЭГ-ПЭИ-ТАТ вводили внутриопухолево 3 раза за курс каждые 5 дней в разовой дозе 0,04 мкг ДНК/мм3 опухоли. GCV вводили внутрибрюшинно дважды в день в суточной дозе 150 мг/кг в течение 15 дней. Как видно из представленных данных (Табл.1), внутриопухолевое введение конструкций ТК и TKmGM в сочетании с GCV приводит к биологически значимому противоопухолевому эффекту. На 30 сутки наблюдения ТРО у животных, получавших конструкции TKmGM и ТК в сочетании с GCV составило 82% и 78%; УПЖ - 70% и 62%, соответственно. При этом введение комбинаций mGM/GCV, TKmGM/PBS, TK/PBS и mGM/PBS или GCV не оказывало существенного влияния на рост опухоли и продолжительность жизни животных.

Саркома S37 обладает высоким потенциалом к метастазированию по лимфогенному пути, приводя к поражению регионарных лимфоузлов. Для оценки влияния внутриопухолевого

введения конструкций в сочетании с внутрибрюшинным введением вСУ на метастазирование саркомы 837 было проведено измерение пораженных лимфоузлов на 30-е и 35-е сутки роста опухоли. Было показано, что объем лимфоузлов в группах животных, получавших конструкции ТКтСМ, ТК и твМ в сочетании с вСУ, значительно меньше, чем в контрольной группе и группах сравнения (Табл.1). Наибольшее ТМ (82%) наблюдалось в группе животных, получивших комбинацию ТКетЮМ/ОСУ, у животных, получивших комбинации Т К/О СУ и тСМЛЗСУ торможение метастазирования составило 67% и 66% соответственно. При этом в группах животных, получивших индивидуальные конструкции, торможение метастазирования наблюдалось только для конструкций ТКтСМ и ггЮМ (47% и 38%, соответственно), что свидетельствует о существенной роли ГМ-КСФ в процессах торможения метастазирования опухоли. Из представленных данных видно, что сочетание генов Н8У1к и СМ-С5Р в составе одной конструкции обеспечивает наиболее высокие УПЖ, ТРО и ТМ.

Таблица 1. Влияние внутриопухолевого введения конструкций ТК, ТКяЮМ и твМ в сочетании с ганцикловиром и без ганцикловира на рост опухоли, ее метастазирование и продолжительность жизни животных с привитой опухолью 837.

Конструкция СПЖ УПЖ, % TPO, % V лимфоузлов TM, %

TKmGM +GCV 60,5 ±21,6 70* 82 99,9±44,9 82*

TK + GCV 57,5±15Д 62* 78 186,0±80,2 67*

mGM + GCV 38,7±13,4 9 19 189,0±91,0 66*

TKmGM+PBS 41,2±7,1 16 11 297,7±264,4 47

TK+PBS 38,5±4,2 8 22 459,2±339,2 18

mGM+PBS 47,8±4,0 35 14 349,2±241,6 38

GCV 39,8±3,2 6 14 456,6±121,0 19

Контроль 35,5±2,9 - - 562,2±316,5 -

Эксперимент проводили на мышах БЦсамки) с привитой опухолью S37 (в группах - по 12 животных). TKmGM (конструкция CMV-HSVtk-mGM-CSF-pGL3), ТК (CMV-HSVtk-pGL3), mGM (CMV-mGM-CSF-pGL3); PBS -фосфатный буфер (плацебо), GCV - ганцикловир. *- отличие от группы животных, которым вводили PBS (Контроль) статистически значимо (р<0,05). СПЖ - средняя продолжительность жизни животных в группе, УПЖ -увеличение продолжительности жизни, ТРО — торможение роста опухоли, ТМ — торможение метастазирования.

На основе конструкции TKGM был создан препарат «АнтионкоРАН-М», представляющий собой комплекс плазмиды TKGM и носителя ПЭГ-ПЭИ-ТАТ. Терапевтический потенциал препарата оценивали на аллографтных моделях мышей с привитыми опухолями S37, С26 и РШМ5 и ксенографтах с привитыми опухолями Нер2, HeLa, НТ1080.

Опухоли прививали животным подкожно. Штаммы саркомы S37 и рака шейки матки РШМ5 прививали мышам F1, штамм аденокарциномы толстого кишечника С26 - мышам линии

BALB/c, гетеротранспланты опухолей человека Нер2, HeLa (аденокарцинома шейки матки), НТ1080 (фибросаркома) прививали иммунодефицитиым мышам nude/c. Лечение начинали на 7-е сутки роста опухоли, когда объем опухоли в среднем составлял ~ 100 мм3, в случае Нер2 лечение начинали на 10-е сутки. Препарат вводили внутриопухолево, трехкратно в дозе 0,04 мкг ДНК/мм3 опухоли. Интервал между введением - 5 дней. GCV вводили внутривенно дважды в день в суточной дозе 100-150 мг/кг в течение 15 дней.

Как видно из представленных данных (Табл.2), введение животным-опухоленосителям препарата «АнтионкоРАН-М» в сочетании с ганцикловиром приводит к биологически значимому противоопухолевому эффекту у животных с привитыми опухолями S37 и С26. ТРО у животных с привитой S37 составило 88%, УПЖ - 83% на 35-е сутки наблюдения. Для животных с привитой С26 на 26 сутки наблюдения ТРО составило 68%, УПЖ - 42%. В случае РШМ5 противоопухолевый эффект препарата выражался в биологически значимом торможении роста опухоли (53%) без биологически значимого увеличения продолжительности жизни животных (УПЖ=23%). Это может быть связано как с особенностью опухоли РШМ5, так и с не оптимальным режимом введения препарата для данного типа рака. Индивидуальное введение препарата или GCV не оказывало существенного влияния на рост опухоли.

Таблица 2. Влияние препарата «АнтионкоРАН-М» в сочетании с ганцикловиром на рост опухоли, ее метастазирование и продолжительность жизни животных с привитыми опухолями С26, Б37 и РШМ5.

С26 S37 РШМ5

Комбинация УПЖ, % ТРО, % УПЖ, % ТРО, % ТМ, % УПЖ, % ТРО, %

AM+GCV 42 68* 83* 88* 79* 20 53

AM -4 36 2 -8 17 - -

GCV -12 0 15 23 17 0 0

Контроль - - - - - - -

С26 — мыши BALB/c, самки с опухолью С26 (в группах - по 10 животных), S37 — мыши F1, самки с опухолью S37 (в группах - по 12 животных), РШМ5 - мыши F1, самки с опухолью PLLIM5 (в группах по 18 животных), AM — препарат «АнтионкоРАН-М»; GCV- гаицикловир. * - отличие от группы животных, которым вводили буферный раствор (контрольная группа) статистически значимо (р<0,05). УПЖ - увеличение продолжительности жизни, ТРО - торможение роста опухоли, ТМ - торможение метастазирования.

Также было показано (Табл.3), что введение препарата вызывает статистически значимое подавление роста опухоли у иммунодефицитных мышей. ТРО у мышей nude/c в зависимости от типа опухоли колеблется в пределах 66-78%. Таким образом, противоопухолевый эффект препарата «АнтионкоРАН-М» выявлен на аллографтных и ксенографтных моделях животных со всеми изученными перевиваемыми опухолями.

Терапевтические гены в препарате «АнтионкоРАН-М» контролируются сильным, но неспецифичным промотором СМУ. Препараты такого рода предназначены для внутриопухолевого введения при лечении местно-распространенных видов рака. Однако внутривенное введение препарата, необходимое при появлении отдаленных метастазов, требует опухолеспецифичной экспрессии терапевтических генов.

Таблица 3. Торможение роста опухоли у иммунодефицитных мышей пис1с/с после введения препарата «АнтионкоРАН-М» в сочетании с ганцикловиром.

Клет. линия Воздействие Объем опухоли (мм3)/торможение роста опухоли (%)

День роста опухоли, сутки

10 14 18 23 28

НеЬа АМ+ОСУ 120+36/14 405+88/-4 206+86/16 203+22/78* 437+65/69

Контроль 140+70 389+221 246+167 936+145 1404+325

НТ1080 АМ+ОСУ 105+45/9 323+132/0 350+98/65* 425+45/70* 634+196/67*

Контроль 115+69 327+330 986+204 1400+465 1896+522

Нер2 АМ+ОСУ 46+45 78+56/40 78+61/60* 131+75/66* 196+104/71*

Контроль 42+35 131+98 194+112 389+67 687+138

Мыши пиёе/с, самки с опухолью НеЬа, НТ1080, Нер2, АМ - препарат «АнтионкоРАН-М»; ЄСУ - ганцикловир.

Жирным шрифтом выделено значение ТРО. *- отличие от группы животных, которым вводили буферный раствор (контрольная группа) статистически значимо (р<0,05).

Следующим этапом нашей работы было создание универсальных опухолеспецифичных промоторов, поскольку природные опухолеспецифичные промоторы значительно слабее, чем конститутивные промоторы и обычно активны только в определенном типе рака, то есть не являются универсальными. Наиболее универсальными природными промоторами считаются промоторы генов ИТЕКТ и ВШС5 (И8ип>). Промотор гена сурвивина обладает высокой опухолеспецифичностью и активен в подавляющем большинстве (85-90%) опухолей. Ген ИТЕКТ кодирует каталитическую субъединицу теломеразы человека. Транскрипционная активность данного гена наблюдается во время эмбрионального развития и примерно в 85% случаев присутствует в опухолевых клетках, тогда как в подавляющем большинстве нормальных клеток организма экспрессия ЪТЕКГ подавлена.

Мы исследовали, является ли комбинация промоторов генов Н5иг\ и КГЕЯТ более эффективным промотором для экспрессии трансгена в клетках опухоли по сравнению с одиночными промоторами.

Характеристика промотопов. используемых для исследования

Мы использовали следующие промоторы: РИБигу - промоторный участок гена сурвивина человека (-1456...+42), РЬ5игу2б9 - фрагмент промоторного участка гена сурвивина человека (-268...+1); РтБигу, фрагмент промотора гена сурвивина мыши (-196...+1). РЬТЕЛТ, фрагмент

промотора гена теломеразы обратной транскриптазы человека (-191.. .+48).

Все используемые промоторные фрагменты активны в раковых и не активны в нормальных клетках человека. На основе данных промоторов были сконструированы двойные тандемные промоторы PhTERT-PhSurv (PhTS), PhSurv-PhTERT (PhST), PhTERT-PhSurv269 (PhTSurv269), PhTERT-PmSurv (PhTmSurv). Для оценки активности промоторов были получены конструкции, содержащие репортерный ген люциферазы светлячка (LUC) под контролем созданных промоторов (Рис.6).

PhTERT-pGL3 PhSurv-pGL3

PhSurv269-pGL3 PmSurv-pGL3 PhTSurv269-pGL3 PhTmSurv-pGL3

| PhTERT | LUC

| PhSurv « твюттт | LUC

iPhSurv | PhTERT | LUC

|PhSurv(m2) •»•»» 1 PhTERT | LUC

|PhSurv(m4) • | PhTERT | LUC

| PhTERT | PhSurv m штттт*| LUC

L PhSuiv269 | LUC

1 PmSurv | LUC

| PhTERT | PhSurv269 | LUC

| PhTERT | PmSurv | LUC

Pne.6. Схематическое изображение экспрессионных конструкций.

Приведена структура экспрессионных кассет в составе плазмиды pGL3. Слева приведено название конструкций. Черными овалами обозначено количество сайтов связывания Spl в промоторных областях. PhSurv - промотор гена сурвивина человека (1498 п.о), PhSurv269 -фрагмент промотора гена сурвивина человека (269 п.о.); PhTERT - фрагмент промотора гена обратной транскриптазы теломеразы человека (269 п.о.); PhSurv(m2) - модифицированный промотор гена сурвивина человека содержащий два мугантных Spl сайта, PhSurv(m4) -модифицированный промотор гена сурвивина человека, содержащий четыре мугантных Spl сайта, LUC - ген люциферазы светлячка.

Сравнительный анализ транскрипционной активности двойных тандемных и одиночных промоторов

Полученные конструкции (Рис.6) тестировали на панели опухолевых клеточных линий человека различного генеза. Выбранные клеточные линии различались по происхождению и по р53-статусу, так как известно, что активность полноразмерных промоторов РИБигу и РЬТЕЯТ зависит от р53-статуса клетки. Относительная активность исследованных промоторов в разных клеточных линиях приведена в Табл.4. В результате проведенного анализа было установлено, что активность двойных тандемных промоторов РЬТБ и РН8Т часто превосходит активности обоих одиночных РЬТЕЯТ и РЬБигу промоторов, уровень активности которых резко различается в зависимости от клеточной линии.

Полученные данные (Табл.4) позволяют сделать следующие заключения: 1) Профили изменения активности одиночных промоторов РЬБигу и РЬТЕЯТ в разных клеточных линиях в обоих случаях примерно однотипны. Исключение составляет клеточная линия Са1и-1, в которой резко повышена активность промотора РЬЗигу. Это, по-видимому, связано с отсутствием в линии Са1и-1 функционального белка р53, который ингибирует активность промотора РЬБигу; 2) Активность тандемных промоторов РЬТБ и РЬБТ как правило выше, чем активность одиночных

промоторов, и примерно соответствует сумме активностей отдельных промоторов (за исключением линии А549). Особенно это соблюдается для РЬ5Т тандема. Промоторы РЬТ8 и РЬ8Т имеют минимальную активность в нормальных фибробластах легкого человека, то есть сохраняют опухолеспецифичность, присущую одиночным промоторам тандема.

Таблица 4. Относительная активность исследованных промоторов в различных клеточных линиях.

Calu-l A375 A549 PANC-1 HT 1080 I IVL-1 INS

Р53 status null wt wt mut wt wt

PhTERT 0,80±0,1 2,38±0,2 1,68±0,2 0,78±0,1 1,23±0,2 1,37 0,02±0,002

PhSurv 6,31±0,7 1,46±0,2 1,15±0Д 038±0,1 0,84±0Д 2,03 0,12±0,014

PhTERT+PhSurv 7,11±0,8 3,84±0,4 2,83±0,4 1,16±0,2 2,07±0,4 3,39 0,14±0,004

PhST 5,08±0,4 4,07±0,4 2,12±0,2 1,44±0Д 2,18±0,2 2,98 0,23±0,004

PhTS 7,02±0,4 3,70±0,2 1,17±0,4 1,99±0Д 0,86±0,1 2,95 0,06±0,011

PhSurv269 9,1±1,0 2,20±0,2 6,11±2,7 2,98±0,1 1,08±0,3 4,38 0,19±0,014

PhTERT+PhSurv269 10,9±1,1 4,58±0,4 7,79±2,9 3,76±0,2 2,31±0,3 5,86 0,21±0,016

PhTSurv269 8,80±0,1 3,89±0,8 10,91 ±0,9 3,96±0Д 5,47±1,5 6,61 0,40±0,034

PmSurv 5,05±0,7 1,70±0,1 4,24±1,9 2,96±0,1 0,63±0,1 2,99 0,18±0,037

PhTERT+PmSurv 5,85±0,8 4,08±03 63±2,1 3,74±0Д 1,86±0,3 4,37 0,20±0,039

PhTmSurv 2,88±0,7 1,06±0Д 1,93±0,9 1,38±0,02 0,64±0,2 1,58 0,14±0,008

Значения представляют собой относительную активность промоторов, которую определяли как отношение нормированной люциферазной активности в экстрактах клеток, трансфицированных плазмидой, содержащей ген LUC под контролем тестируемого промотора, к люциферазной активности в клетках, трансфицированных вектором pGL3-PV, содержащим ген LUC под контролем промотора SV40. Стандартная ошибка среднего (± SEM) вычислена по трем независимым экспериментам. Знак «+» в первой колонке означает, что данные представляют собой арифметическую сумму активностей наблюдаемых для отдельных промоторов в данных клетках. Средняя активность промоторов (£) была рассчитана для пяти раковых клеточных линий (Calu-l, А375, А549, PANC-1, и НТ1080) как сумма активностей в каждой линии, деленная на 5. Крайняя правая колонка - нормальные фибробласты легкого человека IVL-1 INS. В первой строке указан р53 статус клеточных линий, null - белок р53 не экспрессируется в клеточной линии, mut - мугантный р53 белок, wt - дикий тап р53 белка. Серым выделены созданные двойные промоторы.

В двойных промоторах PhTS и PhST инициация транскрипции происходит только с проксимального промотора

Мы определили точки инициации транскрипции гена LUC конструкций PhSurv-pGL3, PhTERT-pGL3, PhST-pGL3, PhTS-pGL3 в клеточных линиях Calu-l и А375, имеющих различный р53 статус, с помощью метода 5' RLM-RACE.

Было показано, что одиночные промоторы PhSurv и PhTERT являются фокусированными, поскольку имеют ярко выраженные точки инициации транскрипции. Для двойных промоторов PhTS, PhST было продемонстрировано рассеивание точек инициации транскрипции, то есть тандемные промоторы становятся дисперсными промоторами с

размытым пиком сайтов инициации транскрипции. В ходе работы нами не было детектировано транскриптов, инициация которых происходит с дистального промотора тандема. Таким образом, было показано, что имеет место промоторная интерференция между проксимальным и дистальным промоторами тандема. Наличие промоторной интерференции показано для различных эукариотических, прокариотических и вирусных систем, также описан ряд ее предположительных механизмов. В нашем случае, в отличие от всех известных моделей, происходит подавление активности дистального промотора, которое не зависит от характеристик подавляемого промотора, а зависит только от положения промотора в тандеме.

Промоторы РЬЭигу и РЬТЕЯТ содержат семь и пять сайтов связывания транскрипционного фактора 8р1, соответственно (Рис.6). Бр1 принадлежит к семейству транскрипционных факторов, содержащих домен цинковых пальцев, который позволяет белку Бр 1 напрямую связываться с ДНК и увеличивать уровень транскрипции генов, имеющих ОС-богатые промоторы. Известно, что белки 8р1, связанные с дистальной областью, могут взаимодействовать с 8р1, связанными с проксимальной областью промотора, и синергически активировать транскрипцию. С помощью анализа Бр1/ДНК комплексов посредством электронной микроскопии показано, что образование Бр1 мультимера, связанного с проксимальным и дистальным сайтами, приводит к формированию петлевой структуры ДНК. Считается, что образование таких высокоорганизованных комплексов ДНК-8р1 приводит к облегчению сборки преинициаторного комплекса и увеличению эффективности инициации транскрипции. Мы предположили, что в двойных промоторах РЬТБ и РЬБТ 5р1-мультимеры, связанные с дистальным промотором, могут взаимодействовать с молекулами Бр1, ассоциированными с проксимальным промотором, в результате чего происходит образование петли участка ДРПС, включающего проксимальную часть дистального промотора (Рис.7). Данное взаимодействие белков Бр1 может способствовать увеличению эффективности инициации транскрипции с проксимального промотора за счет образования петлевой структуры и препятствовать сборке преинициаторного комплекса на дистальном промоторе.

Для проверки этой гипотезы нами были созданы дополнительные двойные промоторы РЬТ5игу269 и РЬТтЯигу (Рис.6), в которых проксимальный промотор РЬБигу был заменен на 1) укороченный вариант промотора сурвивина человека длиной 269 п.о. (РЬ5ир/269); данный вариант промотора содержит также как и РЬБигу кластер из 7 сайтов связывания Бр1; 2) фрагмент промотора гена сурвивина мыши (РтБигу), содержащий 4 сайта связывания Бр1. Использование таких укороченных вариантов промоторов делает невозможным образование петли ДНК между Бр1 сайтами, поскольку длина образующейся гипотетической петли меньше персистентной длины ДНК (Рис.7).

Рис.7. Гипотетическая модель иигибирования активности дисталыюго промотора тандема. А, В и

С — гипотетические вторичные структуры двойных промоторов РЬБТ, РЬТБ и РЬТ5иг/269, соответственно. Промоторы РЬЗигу, РЬ5игу269 и РЬТЕЯТ, составляющие двойной промотор, обозначены серыми и черными линиями, соответственно. Серые и черные овалы обозначают 8р1 транскрипционные факторы, связанные с 5р1 сайтами в РЬ5 игу/РИЗ игу2 69 и РЬТЕЯТ промоторах. Черными точками со стрелками обозначены старты инициации транскрипции. Координаты -268 и -1456 на панели В ограничивают часть последовательности промотора РЬБип/, отсутствующую в промоторе РЬ8игу269. Ь200, 1280 и 120 (п.о.) обозначают длину предполагаемой петли, ограниченной положением 8р1 сайтов. 8р1 сайты обозначены буквами А-в. Жирным шрифтом выделены 8р1 сайты, выбранные для мутагенеза. Активность дистального промотора в тандеме предположительно подавлена за счет формирования ДНК-петли, включающей проксимальную часть дистального промотора. В промоторе РЬ5игу269 (панель С) длина предполагаемой петли 120 п.о., что недостаточно для формирования петлевой структуры ДНК.

РИЗигу269У

Мы оценили активность промоторов РЬ5игу269, Ргг^игу, РЬТ8игу269 и РЬТтЗигу в раковых клеточных линиях человека. Как видно из Табл.4, практически во всех исследованных клеточных линиях промотор РЬТ8игу269 имеет наибольшую активность среди проанализированных промоторов. В среднем активность РЬТ5игу269 в 4,8 раза выше, чем активность промотора РЬТЕЯТ, в 3,3 раза выше, чем активность РЬБигу и в 1,5 раза выше, чем активность промотора РЬ5игу269. Промотор РИТ5игу269 не проявляет активности в нормальных фибробластах легкого человека, то есть является опухолеспецифичным.

Инициация транскрипции с укороченных и мутантных тандемных промоторов происходит как с проксимального, так и с дистального промоторов

Способность одиночных промоторов инициировать транскрипцию в составе тандема была проанализирована на двойных промоторах РЬТЭ, РЬТ5игу269 и РЬТтЗигу методом полуколичественного ОТ-ПЦР. Было показано, что транскрипционная интерференция исчезала при уменьшении длины проксимального промотора. Это подтверждает нашу гипотезу о том, что активность дистального промотора подавлена из-за образования ДНК петли, включающей часть этого промотора.

Для дальнейшего подтверждения нашей гипотезы нами были созданы дополнительные мутантные тандемные промоторы PhSurv(m2)-PhTERT (PhSm2T) и PhSurv(m4)-PhTERT (PhSm4T) (Рис.6), содержащие: 1) модифицированный промотор hSurv, включающий два мутантных Spl сайта (F и G, Рис.6 и 7А); 2) модифицированный промотор hSurv, включающий четыре мутантных Spl сайта (В, С, F и G, Рис.6 и 7А). Методом полуколичественного ОТ-ПЦР было показано, что в тандеме PhSm4T дистальный промотор активен, тогда как в тандеме PhST его активность подавлена.

Исчезновение интерференции вследствие уменьшения числа Spl сайтов в гипотетической петле подтверждает гипотезу о том, что инактивация дистального промотора происходит из-за ее образования. Тем не менее, роль других факторов в подавлении транскрипционной активности дистального промотора не может быть исключена.

Далее активность промоторов PhSurv и PhTSurv269 была проанализирована в системе с использованием терапевтических генов.

Анализ активности промоторов PhSurv и PhTSurv269 в системе с использованием терапевтических генов HSVtk и GM-CSF

Для сравнения активности промоторов PhSurv и PhTSurv269 были созданы конструкции PhTSurv269-HSVtk-mGM-CSF-pGL3 (TSurv269TKmGM) и PhSurv-HSVtk-mGM-CSF-pGL3 (SurvTKmGM). В качестве положительного контроля использовали конструкцию TKmGM, содержащую генную кассету HSVtk-mGM-CSF под контролем промотора CMV. Эффективность полученных конструкций была оценена in vitro на клеточных линиях Calu-1, НТ1080 и ex vivo на мышах линии C57BI/6.

В in vitro экспериментах клетки линий Calu-1 и НТ1080 транзиентно трансфицировали полученными конструкциями в комплексе с Липофектамином-2000 (Invitrogen, США), и затем оценивали уровень экспрессии белков HSVtk и mGM-CSF, а также цитотоксичность HSVtk полученных конструкций. Результаты проведенных экспериментов приведены в Табл.5.

Количество ГМ-КСФ, продуцируемое трансфицированными клетками за 24 часа различалось в зависимости от используемой конструкции. Так в случае конструкции CMVTKmGM клетки нарабатывали в 4.5 раза (клетки Calu-1) или 11,4 раз (клетки НТ1080) больше ГМ-КСФ, чем клетки трансфицированные конструкцией TSurv269TKmGM, ив 11,5 раз (Calu-1) или в 46,3 раза (НТ1080) больше, чем клетки, трансфицированные конструкцией SurvTKmGM.

При этом выживаемость клеток линии Calu-1, трансфицированных полученными конструкциями и обработанных ганцикловиром, практически не различалась. Данный эффект,

вероятно, обусловлен высокой активностью опухолеспецифичных промоторов РЬБигу и РЬТ8игу269 в данной клеточной линии и наличием эффекта свидетеля.

Таблица 5. Выживаемость клеток линий Са1и-1 и НТ1080, трансфицированных конструкциями, содержащими кассету ТКігЮМ под контролем промоторов СМУ, РЬБигу или РЬТ8игу269.

Количество живых клеток, % Количество mGM-CSF, нг

Клеточная линия Calu-1 НТ1080 Calu-1 НТ1080

Ганцикловир, мкМ 0 2 12,5 50 0 2 12,5 50

g SurvTKmGM 100 35.4 21.3 9.7 100 33,1 29,8 13,7 0.57 0.27

3 и TSurv269TKmGM 100 25.4 14.4 9.4 100 18,3 14,7 10,8 1.43 1.097

но X CMVTKmGM 100 25.1 15.9 8.7 100 56 38,5 32,5 6.5 12.5

и Контроль 100 99,6 99,1 96,0 100 102 102 97 - -

Числа в строках обозначают процент выживших клеток линий Calu-1 и НТ1080 после трансфекции конструкциями, указанными в правом столбце, и обработки раствором ганцикловира с концентрацией 0, 2, 12,5, 50 мкМ. Контроль - нетрансфицированные клетки. Приведено количество GM-CSF в нг, продуцируемого 105 трансфицированных клеток за 24 часа.

Выживаемость клеток линии НТ1080, трансфицированных конструкцией TSurv269TKmGM, была в каждой из групп приблизительно в 2 раза ниже, чем выживаемость клеток, трансфицированных конструкцией SurvTKmGM. Полученные результаты (Табл.5) согласуются с данными по относительной активности промоторов (Табл.4), поскольку активность промотора PhTSurv269 в клеточной линии Calu-1 выше активности PhTSurv только в 1,4 раза, тогда как в линии НТ1080 - в 5,8 раз.

Сравнительный анализ активности промоторов PhSurv, PhTSurv269 и СМУ ex vivo на мышах

Мышам линии C57BI/6 были подкожно трансплантированы клетки LLC, трансфицированные конструкциями SurvTKmGM, TSurv269TKmGM и TKmGM. Было сформировано 4 группы животных: 1) Группа PhSurv - мыши с трансплантированными клетками LLC, транзиентно трансфицированными конструкцией SurvTKmGM 2) Группа PhTSurv269 - мыши с трансплантированными клетками LLC, трансфицированными конструкцией TSurv269TKmGM, 3) Группа CMV - мыши с трансплантированными клетками LLC, трансфицированными конструкцией TKmGM, 4) Контроль - контрольная группа, мыши с трансплантированными нетрансфицированными клетками LLC. Каждая группа состояла из 10 животных, получавших после трансплантации в течение 10 дней дважды в день внутрибрюшинно раствор ганцикловира в дозе 75 мг/кг. Как видно на Рис.8 рост опухоли в контрольной группе начинается на 10 день эксперимента, тогда как в опытных группах опухоль

появляется у животных только на 20 сутки. На 36 день эксперимента в группе CMV опухоль пальпировалась у 1 из 10 животных, в группе PhSurv - у 2 животных, в группе PhTSurv269 не наблюдалось животных с пальпируемыми опухолями.

Таким образом, тандемный промотор PhTSurv269 в системе с терапевтическими генами HSVtk и mGM-CSF обладает достаточной эффективностью для обеспечения терапевтического эффекта. В отличие от промотора CMV, он является опухолеспецифичным и активен в более широком спектре раковых клеточных линий, чем промотор PhSurv.

Рис.8. Влияние трансформации клеток LLC конструкциями TKmGM,

TSurv269TKmGM, SurvTKmGM на скорость роста опухолей, вызванных трансплантацией данных клеток мышам C57BI/6. Данные представляют собой средние значения для группы из 10 животных. По оси ординат указан средний размер опухоли в группе (мм3). По оси абсцисс указано время, прошедшее с момента трансплантации клеток. Графики прерываются в день гибели первого животного в группе.

Заключение

В данной работе были созданы и охарактеризованы бицистронные конструкции, несущие под контролем одного промотора два терапевтических гена: HSVtk и GM-CSF. Созданные бицистронные кострукции обладали более сильным противоопухолевым эффектом, чем конструкции, содержащие одиночные гены HSVtk или GM-CSF. На основе полученной бицистронной конструкции CMV-HSVtk-GM-CSF-pGL3 был создан генно-терапевтический противоопухолевый препарат «АнтионкоРАН-М», эффективность и безопасность которого была показана в экспериментах in vivo на животных в ходе доклинических испытаний.

Для контроля экспрессии терапевтических генов были сконструированы искусственные двойные тандемные промоторы на основе опухолеспецифичных промоторов генов hTERT и hSurv. Показано, что в тандемных промоторах PhTS и PhST транскрипты инициируются только с проксимального промотора, активность дистального промотора подавлена. Предложена и экспериментально подтверждена гипотеза возникновения промоторной интерференции в двойных Spl-богатых промоторах. В экспериментах in vitro показано, что созданный двойной промотор PhTSurv269 обладает наиболее высокой активностью в широком спектре раковых клеточных линий среди всех исследованных промоторов при низкой активности в нормальных фибробластах. Активность данного промотора в 2,5-10 раз выше, чем активность промотора

Контроль CMV PhSurv PhTSurv269

6 8 1013151720222527293134363841

Дни роста опухоли, сутки

PhSurv, и в среднем в 3,5 раза выше активностей остальных протестированных промоторов. Противоопухолевый потенциал конструкции, несущей терапевтические гены под контролем промотора PhTSurv269, показан in vitro и ex vivo.

ВЫВОДЫ

1. Получены экспрессионные бицистронные конструкции, содержащие терапевтические гены HSVtk и GM-CSF мыши или человека под контролем одного промотора. Ex vivo и in vivo показано, что бицистронные конструкции обладают более сильным противоопухолевым эффектом, чем конструкции, содержащие одиночные гены HSVtk или GM-CSF.

1. На основе конструкции, содержащей гены HSVtk и GM-CSF человека под контролем промотора цитомегаловируса, создан новый противоопухолевый генно-терапевтический препарат «АнтионкоРАН-М». В ходе доклинических испытаний препарата на животных доказана его эффективность и безопасность.

3. Сконструированы двойные тандемные промоторы на основе модифицированных опухолеспецифичных промоторов генов обратной транскриптазы теломеразы человека (hTERT) и сурвивина человека (hSurv). На панели раковых клеточных линий человека показано, что активность двойного промотора PhTERT-PhSurv269 превосходит активности одиночных промоторов PhTERT, PhSurv и PhSurv269. Промотор PhTERT-PhSurv269, в отличие от одиночных, сохраняет стабильный уровень активности во всех исследованных опухолевых клеточных линиях при низкой активности в нормальных фибробластах.

4. Показано, что транскрипция в Spl-богатых двойных тандемных промоторах PhTERT-PhSurv и PhSurv-PhTERT инициируется только с проксимального промотора. Транскрипция с дистального промотора подавлена. Данный тип промоторной интерференции обнаружен и описан впервые.

5. Предложен и экспериментально подтвержден возможный механизм возникновения промоторной интерференции в Spl-богатых двойных промоторах.

6. В экспериментах ex vivo на мышах показано, что терапевтическая эффективность двойного промотора PhTERT-PhSurv269 и конститутивного промотора CMV сравнима, при этом промотор PhTERT-PhSurv269 опухолеспецифичен, что снижает токсичность генных конструкций при его использовании.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ ДИССЕРТАЦИИ ИЗЛОЖЕНЫ В СЛЕДУЮЩИХ

ПУБЛИКАЦИЯХ

Статьи

1. Алексеенко И.В.. Виноградова Т.В., Копанцев Е.П., Свердлов Е.Д. Разработка генно-терапевтичеекого способа уничтожения опухолевых клеток посредством совместной экспрессии генов HSVtk и GM-CSF. Медицинский академический журнал, 2010, Т.10, № 5, С. 204.

2. И.В. Алексеенко. Е.П. Копанцев, Т.В. Виноградова, академик Е.Д. Свердлов. Бицистронный вектор для совместной экспрессии гена-убийцы HSVtk и цитокина GM-CSF в раковых клетках. Доклады академии наук, 2011, Т. 439, № 4, С. 551-554.

3. В.В. Плешкан, И.В. Алексеенко. М.В. Зиновьева, Т.В. Виноградова, Е.Д. Свердлов. Промоторы со специфической активностью в раковых клетках при генной терапии меланомы. Acta Naturae, 2011, T. 3, № 2, С. 14-23.

4. Alekseenko I.V.. Zinovyeva M.V., Pleshkan V.V., Sverdlov E.D. Gene targeting in melanoma therapy: exploiting of surface markers and specific promoters. Biopolymers and Cells, 2012, V.28 (1), p. 3-13.

5. Alekseenko TV. Pleshkan VV, Kopantzev EP, Stukacheva EA, Chernov IP, Vinogradova TV, Sverdlov ED. Activity of the Upstream Component of Tandem TERT/Survivin Promoters Depends on Features ofthe Downstream Component. PLoS One, 2012, V.7(10):e46474.

6. И.В. Алексеенко. Д.В. Кузьмин, B.B. Плешкан, M.B. Зиновьева, Е.Д. Свердлов Цитотоксичные эффекты генов цитозиндезаминазы и тимидинкиназы вируса простого герпеса в клетках меланом не зависят от силы промоторов. Биоорганическая химия, 2013, №6, С. 745-748.

Патенты

1. Алексеенко И.В., Виноградова Т.В., Демидюк И.В., Костров C.B., Плешкан В.В., Чернов И.П., Митяев М.В., Зиновьева М.В., Георгиев Г.П., Соболев A.C., Розенкранц A.A., Уланов A.B., Кузьмин Д.В., Храмцов Ю.В., Копанцев Е.П., Успенская Н.Я., Костина М.Б., Монастырская Г.С., Свердлов Е.Д. Многопрофильный промотор, экспрессирующий вектор и способ избирательного убийства раковых клеток с их использованием. Патент на изобретение № 2476596. Зарегистрирован в Государственном реестре изобретений РФ 27.02.2013 г. Тезисы конференций

1. Алексеенко И.В., Копанцев Е.П., Виноградова Т.В., Свердлов Е.Д. Создание генной основы вирусоподобных наночастиц для доставки генов-убийц HSVtk и GM-CSF в клетки опухоли. Научная конференция, посвященная 25-летнему юбилею Института химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН: "Химическая биология - Фундаментальные проблемы бионанотехнологии", Новосибирск, 2009. Сборник тезисов, с. 61.

2. I. Alekseenko, Т. Vinogradova, E. Kopantzev, E. Sverdlov. Construction of bicistronic vectors for suicide genes HSVtk and GM-CSF delivery in tumor cells. Международный форум по нанотехнологням 2009, второй международный конкурс научных работ молодых ученых в области нанотехнологий, Москва, 2009. Сборник тезисов, с. 888.

3. Alekseenko V.I. Combined HSVtk and GM-CSF gene therapy for cancer. FEBS Advanced Lecture Course. Greece, Island of Spetses, 2010. Abstract book, p.24.

4. Алексеенко И.В., Виноградова T.B., Копанцев Е.П., Свердлов Е.Д. Разработка генно-терапевтического способа уничтожения раковых клеток посредством экспрессии гена-убийцы HSVtk и иммуномодулятора GM-CSF. 14-ая Международная Пущинская школа - конференция молодых ученых «Биология-Наука XXI века», Москва, Пущино, 2010. Сборник тезисов, с. 77-78

5. Алексеенко И.В., Виноградова Т.В., Копанцев Е.П., Свердлов Е.Д. Исследование терапевтического эффекта совместной экспрессии гена-убийцы HSVtk и иммуномодулятора GM-CSF в клетках опухоли. Научная конференция по биоорганической химии и биотехнологии «X чтения памяти академика Юрия Анатольевича Овчинникова». Москва-Пущино, 2011. Сборник тезисов. Том 2. Конкурс молодых ученых, с. 5

6. Alekseenko I., Sverdlov Е. Construction of bicistroning vectors carrying therapeutic genes HSVTK and GM-CSF for cancer gene therapy. The 4th International IMBG Conference for young scientists «Molecular Biology: Advances and Perspectives». Ukraine, Kyiv, 2011. Abstract book, p. 148.

7. Алексеенко И.В., Виноградова T.B., Копанцев Е.П., Свердлов Е.Д. GM-CSF повышает эффективность суицидной генной терапии рака. XXIV Зимняя международная молодежная научная школа "Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии", Москва, 2012. Сборник тезисов докладов и стендовых сообщений, с. 15

8. Алексеенко И.В., Плешкан В.В., Свердлов Е.Д. Создание эффективных опухолеспецифичных промоторов для использования в генной терапии рака. XXV Международная зимняя молодежная научная школа "Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии", посвященная 30-летию научно-образовательного центра ИБХ РАН, Москва, 2013. Сборник тезисов. Том 2. Конкурс молодых ученых, с 17.

9. М.О. Durymanov, A.V. Ulasov, А.А. Rosenkranz, Y.V. Khramtsov, T.A. Slastnikova, I.V. Alekseenko, A.I. Kuzmich, O.A. Bezborodova, E.R. Nemtsova, R.I.Yakubovskaya, E.D. Sverdlov and A.S. Sobolev. Polyplex nanoparticles for cancer gene therapy. 21st Int. Symp. "Nanostructures: Physics and Technology" Saint Petersburg, Russia, June 24-28,2013. Abstract book, p.l 13

10. Eugene Sverdlov , I.V. Alekseenko , V.V. Pleshkan , I.P. Chernov , K.N. Kashkin In search for pan-cancer promoter FEBS CONGRESS 2013 "Mechanisms in Biology", July 6th - 11th 2013, St. Petersburg, Russia. Abstract book, p.375.

Заказ № 21-аЛ 1/2013 Подписано в печать 07.11.2013 Тираж 110 экз. Усл. п.л. 1,2

ООО "Цифровичок", тел. (495) 649-83-30 www.cfr.ru; е-таИ:zak@cfr.ru

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Алексеенко, Ирина Васильевна, Москва

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки

Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук

На правах рукописи

0420145027?

АЛЕКСЕЕНКО ИРИНА ВАСИЛЬЕВНА

ТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЭФФЕКТ СОВМЕСТНОЙ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ ТИМИДИНКИНАЗЫ ВИРУСА ПРОСТОГО ГЕРПЕСА И

ГМ-КСФ В ОПУХОЛЯХ

03.01.03 - Молекулярная биология

ДИССЕРТАЦИЯ

на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Научный руководитель: академик РАН Свердлов Е.Д.

Москва-2013 г.

ОГЛАВЛЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ..............................................................................................7

1.1 Введение...................................................................................................................................7

1.2 Современные подходы к лечению онкологических заболеваний....................................10

1.2.1 Молекулярная таргетная терапия рака......................................................................10

1.2.2 Генная терапия рака....................................................................................................13

1.2.3 Способы повышения эффективности ГНЭПТ систем.............................................22

1.2.4 Транскрипционный контроль экспрессии терапевтических генов........................29

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ....................................................................................37

2.1 Материалы.............................................................................................................................37

2.1.1 Культуры клеток и образцы тканей человека..........................................................37

2.1.2 Бактериальные клетки................................................................................................37

2.1.3 Реактивы.......................................................................................................................38

2.1.4 Ферменты.....................................................................................................................38

2.1.5 Антитела.......................................................................................................................39

2.1.6 Буферные растворы.....................................................................................................39

2.1.7 Микробиологические среды.......................................................................................40

2.1.8 Среды для культивирования эукариотических клеток............................................40

2.1.9 Наборы реактивов.......................................................................................................40

2.1.10 Маркеры.....................................................................................................................40

2.1.11 Оборудование............................................................................................................40

2.1.12 Олигонуклеотиды......................................................................................................41

2.2 Методы...................................................................................................................................43

2.2.1 Стандартные процедуры.............................................................................................43

2.2.2 ПЦР...............................................................................................................................43

2.2.3 Расщепление плазмидной ДНК эндонуклеазами рестрикции................................44

2.2.4 Лигирование фрагмента ДНК с вектором.................................................................44

2.2.5 Выделение ДНК из агарозного геля..........................................................................44

2.2.6 Введение плазмидной ДНК в клетки E.coli..............................................................44

2.2.7 Анализ содержания плазмидной ДНК в клетках колоний E.coli методом ПЦР... 44

2.2.8 Определение нуклеотидной последовательности ДНК...........................................45

2.2.9 Получение аналитических/препаративных количеств плазмидной ДНК.............45

2.2.10 Выделение и очистка РНК из клеточных линий человека....................................45

2.2.11 ОТ-ПЦР......................................................................................................................45

2.2.12 Введение плазмидной ДНК в эукариотические клетки.........................................45

2.2.13 Приготовление осадков эукариотических клеток..................................................46

2.2.14 Получение клеточных экстрактов для проведения иммуноблотинга..................46

2.2.15 Анализ содержания белков в клеточных экстрактах методом иммуноблотинга 47

2.2.16 Получение GM-CSF- кондиционированной среды................................................47

2.2.17 Анализ содержания ГМ-КСФ в кондиционированной среде...............................47

2.2.18 Функциональный тест на цитотоксичность HSVtk...............................................47

2.2.19 MTS-тест....................................................................................................................48

2.2.20 Функциональный тест биологической активности hGM-CSF на клеточной линии TF1..............................................................................................................................48

2.2.21 Определение биологической активности mGM-CSF............................................49

2.2.22 Оценка терапевтического эффекта плазмидных конструкций ex vivo на мышах49

2.2.23 Доклинические испытания препарата «АнтионкоРАН-М»..................................50

2.2.23.1 Оценка терапевтического эффекта препарата «АнтионкоРАН-М» in vivo на мышах....................................................................................................................................50

2.2.24 Статистический анализ.............................................................................................52

2.2.25 Создание плазмидных конструкций, несущих ген люциферазы светлячка под контролем исследуемых промоторов.................................................................................52

2.2.26. Создание плазмидных конструкций, несущих гены HSVtk и GM-CSF под контролем промотора CMV................................................................................................53

2.2.27 Создание плазмидных конструкций, несущих гены HSVtk и GM-CSF под контролем промоторов PhSurv и PhTSurv269................................................................... 54

2.2.28 Сайт-направленный мутагенез и создание двойных промоторов, содержащих мутантный промоторгена сурвивина человека.................................................................55

2.2.29 Анализ транскрипционной активности промоторов.............................................55

2.2.30 Определение точек инициации транскрипции.......................................................56

2.2.31 Интернет ресурсы......................................................................................................56

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ...................................................................57

3.1 Создание генно-инженерных конструкций, несущих гены HSVtk и GM-CSF под контролем одного промотора......................................................................................................57

3.2 Анализ экспрессии генов HSVtk и GM-CSF в составе полученных конструкций..........58

3.3 Анализ биологической активности белков HSVtk и GM-CSF, синтезируемых в клетках, трансфицированных полученными конструкциями.................................................................59

3.4 Оценка терапевтического потенциала полученных конструкций ex vivo на животных. 63

3.5 Оценка терапевтического потенциала полученных конструкций in vivo на животных . 66

3.6 Доклиническое изучение специфической (противоопухолевой) активности препарата «АнтионкоРАН-М» в составе системы «АнтионкоРАН-М»/ Ганцикловир..........................77

3.7 Доклиническое изучение общетоксических свойств препарата «АнтионкоРАН-М».....80

3.8 Создание искусственных универсальных опухолеспецифических промоторов.............86

3.9 Сравнительный анализ транскрипционной активности двойных тандемных и одиночных промоторов...............................................................................................................88

3.10 В двойных промоторах PhTS и PhST инициация транскрипции происходит только с проксимального промотора.........................................................................................................90

3.11 Промоторная интерференция между проксимальным и дистальным промоторами тандема..........................................................................................................................................93

3.12 Сравнительный анализ транскрипционной активности тандемных промоторов с укороченной гипотетической neraeñPhTSurv269 и PhTmSurv...............................................97

3.13 Инициация транскрипции с укороченных тандемных промоторов происходит как с проксимального, так и с дистального промоторов...................................................................97

3.14 Сравнительный анализ транскрипционной активности тандемных промоторов, содержащих полноразмерный промотор гена hSurv с мутантными Spl сайтами.................99

3.15 Анализ активности промоторов PhSurv и PhTSurv269 в системе с использованием терапевтических генов HSVtk и GM-CSF................................................................................101

3.16 Сравнительный анализ активности np0M0T0p0BPhSurv, PhTSurv269 и CMV ex vivo на

мышах..........................................................................................................................................102

ГЛАВА 4. ВЫВОДЫ................................................................................................................105

СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ............................................................................107

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АСУ - acyclovir, ацикловир

araT -1-P-D-arabinofuranosylthymine, l-P-D-арабинофуранозилтимин

BIRC5 - Baculoviral IАР Repeat-Containing protein 5, белок, содержащий повторяющиеся

домены бакуловирусного ингибитора апоптоза

BVDU - (E)-5-(2-Bromovinyl)-2'-deoxyuridine, (Е)-5-(2-бромовинил)-2'-дезоксиуридин

CD - Cytosine Deaminase, цитозиндезаминаза

CD86 - Cluster of Differentiation 86, кластер дифференцировки 86

CDE - cycle dependent elements

CHR - cell cycle homology region

CMV - CytoMegaloVirus, цитомегаловирус

CNTF - Ciliary neurotrophic factor, цилиарный нейротрофический фактор Сге-белок - Causes REcombination, топоизомераза класса I бактериофага PI Сх - connexin, коннексин Еро - erythropoietin, эритропоэтин

GALV - Gibbon Аре Leukemia Virus, вирус лейкимии гиббона

GAPDH - glyceraldehyde-3 -phosphate dehydrogenase, глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа

GCV - Ganciclovir, ганцикловир, 9- [(1,3-дигидрокси-2-пропокси)метил]гуанин

GM-CSF - Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor, гранулоцитарно-

макрофагальный колониестимулирующий фактор

GR-1 - granulocyte differentiation antigen 1

F4/80 - белок семейства EGF-фактора роста эпидермиса

HSVtk - Herpes Simplex Virus-1 thymidine kinase, тимидинкиназа вируса простого герпеса первого типа

hTERT - human TElomerase Reverse Transcriptase, обратная транскриптаза теломеразы человека

IFN-a2a - interferon, интерферон альфа 2а IFN-a2b - interferon, интерферон альфа 2Ь IL - interleukin, интерликин

IRES - Internal Ribosome Entry Site, участок внутренней посадки рибосомы LD - lethal dose, летальная доза

LIF - Leukemia inhibitory factor Лейкемия-ингибирующий фактор

LoxP - locus of X-over Bacteriophage PI, сайт узнавания Сге-рекомбиназы бактериофага PI LUC - luciferase, люцифераза светлячка

MDR - Multiple Drug Resistance, множественная лекарственная устойчивость MTT - 3-4,5-диметилтиазол-2-ил-2,5-дифенилтераразола

MTS - 3- [4,5- диметилтиазол-2-ил]-5-(3-карбоксиметоксифенил)-2-(4-сульфофенил)-2Н-тетразолий

b-NGF - Nerve growth factor Фактор роста нервов

NF-kB - Nuclear Factor kappa В, ядерный фактор кВ

OSM - Oncostatin M онкостатин M

PBS - phosphate buffered saline, натрий-фосфатный буфер

PolyA - polyadenylation signal, сигнал полиаденилирования

PSA - Prostate Specific Antigen, простата-специфический антиген

Rb - Retinoblastoma tumor suppressor gene, ген-супрессор ретинобоастомы

SCF - Stem cell factor фактор стволовых клеток

Spl - specificity protein 1, фактор транскрипции человека, кодируемый геном SP SV40 - Simian Virus 40, обезьяний вирус 40

TAR - TransActivation response Region, район трансактивации промотора ВИЧ

Tat - Transcription tans-AacTivator, трансактиватор транскрипции генов ВИЧ

UPRT - Uracil PhosphoRibosylTransferase, урацилфосфорибозилтрансфераза

VP22 - Virus Protein 22 kDa, вирусный белок вируса простого герпеса с массой 22 кДа

АПК - антиген-представляющие клетки

а.о. - аминокислотный остаток

5FC - 5-fluorocytosine, 5-фторцитозин

5FC - 5-fluorouracil, 5-фторурацил

ГМ-КСФ - гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор

ГНЭПТ - ген-направленная энзиматическая пролекарственная терапия

ГТ - генная терапия

кДНК - Комплементарная ДНК

ДКИ - доклинические испытания

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

ДПД - дигидропиримидиндегидрогеназы

ДФУ - дигидрофторурацил

ед. - единиц

и/т - интратуморально (внутриопухолево)

кДа - килоДальтон

КИ - клинические испытания

мин. - минут

мРНК - матричная РНК

МТТ - молекулярная таргетная терапия

НК - натуральные киллеры

об/мин - оборотов в минуту

п.н. - пар нуклеотидов

ПААГ - полиакриламидный гель

ПЦР - полимеразная цепная реакция

ПЭГ - полиэтиленгликоль

ПЭИ - полиэтиленимин

РНК - рибонуклеиновая кислота

с - секунда

СПИД - Синдром приобретённого иммунного дефицита

ТД - терапевтическая доза

ТМ - торможение метастазирования

т.п.н. - тысяч пар нуклеотидов

ТНПК - терапия направленная на пролиферирующие клетки

ТРО - торможение роста опухоли

ТЕМЕД - тетраэтиленметилендиамин

УПЖ - увеличение продолжительности жизни

ФНО-а - факторанекроза опухоли альфа

ч - час

ЭДТА - этилендиаминтетраацетат

ЭТД - эквивалентная терапевтическая доза

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Введение

Рак представляет собой одну из наиболее серьезных проблем медицины: он занимает второе место по смертности в мире и, по прогнозам, имеет перспективу перейти на первое. Онкологическая заболеваемость имеет тенденцию к росту. По прогнозам ВОЗ заболеваемость и смертность, обусловленные онкологическими заболеваниями, в мире вырастут в 2 раза за период с 1999 года по 2020 год: с 10 до 20 млн. новых случаев и с 6 до 12 млн. регистрируемых смертей.

Несмотря на громадные усилия, затрачиваемые во всём мире на поиск новых подходов к лечению рака, и некоторые несомненные успехи, проблема терапии рака в целом остаётся нерешенной. В настоящее время рак обычно рассматривается как заболевание, минимально поддающийся контролю средствами современной медицины, особенно при сравнении с другими распространенными болезнями.

Существующие на сегодняшний день лекарственные методы лечения онкологических заболеваний можно разделить на две широких категории: иммунная и неиммунная терапия. Иммунная терапия подразумевает введение в организм больного иммуностимуляторов, вызывающих развитие специфического противоопухолевого иммунного ответа. Одним из наиболее активно развивающихся направлений неиммунной терапии является генная терапия рака, в основе которой лежит доставка в опухоль генов, вызывающих ингибирование роста или гибель клеток опухоли.

Одной из важных стратегий генной терапии рака является генная хирургия, которая направлена на уничтожение опухолевых клеток путем использования их свойств, которые характерны для всех раковых клеток, например, повышенная скорость митотических делений. Подход заключается в доставке в раковые клетки генов-убийц, кодирующих фермент, как правило, вирусного или бактериального происхождения, который в клетках, где он экспрессируется, модифицирует свой субстрат, превращая его из нетоксичного пролекарства в токсичный для клетки метаболит.

Генная хирургия является двустадийной. На первом этапе в опухолевые клетки вводится ген-убийца с требуемой системой экспрессии, на втором вводят пролекарство, которое под действием фермента, образующегося в результате экспрессии гена-убийцы, превращается в токсин внутри раковых клеток, что резко уменьшает токсичность терапии. Токсин может высвобождаться из клетки, экспрессирующей ген-убийцу, и проникать в соседние клетки, вызывая их гибель, что многократно усиливает терапевтический эффект. Данное явление получило название «эффекта свидетеля» (bystander effect). «Эффект

свидетеля» заключается в том, что опухолевые клетки, не получившие ген-убийцу, но соседствующие с таковыми, оказываются подверженными цитотоксическому эффекту со стороны высвобождающегося токсина. Наиболее перспективными в настоящее время являются две системы ген-убийца/пролекарство, обладающие «эффектом свидетеля» и достигшие поздних стадий клинических испытаний: тимидинкиназа вируса простого герпеса (Н8У1:к)/ганцикловир(ОСУ) и цитозиндезаминаза/5-фторцитозин.

Эффективность системы ШУ^к/вСУ для лечения широкого спектра опухолей была показана в экспериментах на животных. Однако в клинических испытаниях на пациентах пока получают худшие результаты, чем на животных. В значительной степени это связано с недостаточно высокой специфичностью экспрессии терапевтических генов в раковых клетках и с недостаточно высоким уровнем «эффекта свидетеля» при проведении испытаний на пациентах. «Эффект свидетеля» может быть дополнительно усилен за счет работы иммунной системы, поскольку гибель раковых клеток и высвобождение из них опухолевых антигенов активируют способность иммунной системы уничтожать раковые клетки, которые не экспрессируют ген-убийцу.

Таким образом, эффективность действия системы ген-убийца/пролекарство можно повысить, стимулируя противоопухолевый иммунный ответ, например, с помощью цитокинов. В ряде работ показано, что регрессия опухоли значительно возрастает при совместном использовании гена-убийцы и отдельно вводимого в виде белка цитокина, гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора (ОМ-СБЕ).

Предполагается, что совместная экспрессия гена-убийцы и СМ-СБР в клетках опухоли будет приводить к уничтожению раковых клеток и высвобождению из них опухолевых антигенов, которые будут эффективно представляться ОМ-СБР-активированными антиген-представляющими клетками Т-клеткам иммунной системы, обеспечивая активацию специфического противоопухолевого иммунитета, в результате чего возрастет гибель опухолевых клеток и снизится вероятность возникновения метастазов.

Одним из важных элементов успеха генной терапии рака является система контроля экспрессии терапевтических генов. В генных противораковых препаратах, предназначенных для внутривенного введения, экспрессия терапевтического гена должна контролироваться опухолеспецифичным промотором. В идеальном случае опухолеспецифичный промотор должен обеспечивать максимально тканеспецифичную и достаточно сильную экспрессию трансгена, чтобы с одной стороны обеспечить безопасность, а с другой - эффективность системы. Обычно используемые для этих целей природные опухолеспецифичные промоторы значительно слабее, чем конститутивные

промоторы, такие как промоторы цитомегаловируса (CMV) или вируса SV40. Они активны в ограниченном числе типов раковых клеток, и их активность сильно варьирует в разных опухолях, затрудняя подбор доз пролекарства и снижая терапевтически