Тимидинкиназа высших растений

Носов, Александр Владимирович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Тимидинкиназа высших растений
ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Тимидинкиназа высших растений"

гв од

> о т

На правах рукописи

Носов Александр Владимирович

ТНМНДННКННАЗА ВЫСШИХ РАСТЕНИЙ

03.00.12 - физиология растения

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Москва 1996

Работа выполнена в Отделе биологии клетки и биотехнологии Института физиологии растений им. К. А. Тимирязева Российской-Академии Наук

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор И. С. Кулаев

доктор биологических наук Э. Е. Хавкин

доктор биологических наук, профессор Д. Б. Вахмистров

Ведущая организация: Институт молекулярной биологии им. В. А. Энгельгардта Российской Академии Наук

Защита состоится 7 июня 1996 г. в И час. на заседании Диссертационного Совета Д 002.45.01. по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора биологических наук при Институте физиологии растений им. К. А. Тимирязева РАН (127276, Москва. Ботаническая ул.. 35)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке при Институте физиологии растений им. К. А. Тимирязева РАН

Автореферат разослан 5 мая 1996 года

Ученый секретарь Диссертационного Совета

кандидат биологических наук Н. В. Загоскина

Актуальность проблемы. В настоящее время большой поток исследований в физиологии растений связан с изучением процессов на молекулярном и клеточном уровнях. Очевидно такой подход будет и в дальнейшем плодотворным, поскольку жизнь клетки - её рост, деление и гибель - основа существования любого многоклеточного организма, в том числе высших растений. Индивидуальная программа развития организмов основана на различном сочетании указанных клеточных функций, важнейшей из которых является репродукция.

Создание концепции митотического цикла и открытие его периодов было сделано на клетках растений (Howard. Pele 1953), однако детальная разработка проблемы долгое время осуществлялась, в основном. на других объектах - бактериях, простейших, дрожжах, культивируемых клетках млекопитающих, яйцеклетках морских ежей и т.д. (см. Quastler. Sherman 1959; Мэзия 1963; Епифанова, Терских 1968; Baserga 1968; Prescott 1968; 1987).

Дальнейший успех в изучении репродукции клеток был связан с получением большого числа условно-летальных штаммов дрожжей - ede мутантов, что сформировало одно из направлений - изолирование генов, способных исправлять дефекты у этих мутантов. Центральное место среди таких генбв занял сдс2, кодирующий 34-кД белок (p34cdc2) - протеинкиназу, активность которой необходима для прохождения границ между G, и S. а также G2 и М периодами клеточного цикла. Другие с de гены кодируют различные протеинкиназы, протеин-фосфатазы, факторы транскрипции и белки (циклины). модулирующие активность р34с d с 2 и подобных ей протеинкиназ. Каскад протеинфос-фатазных и протеинкиназных реакций, управляющих клеточным циклом, вероятно является консервативным механизмом для многих организмов (Cross et al. 1989; Hurray. Kirschner 1989; Sherr 1994; Nagl 1994). Принцип универсальности продуктивно сработал, заставив искать функциональных двойников для ede генов в клетках растений (см. Jacobs 1992; Doerner 1994; Ferreira et al. 1994). Была обнаружена высокая степень гомологии cdc2-подобных генов растений и их прототипа из дрожжей, но в тоже время выявлено разнообразие цикли-нов. Кроме того, деление клеток растений имеет ряд особенностей -препрофазные пучки микротрубочек, пространственный контроль процесса и взаиморегулирующие связи с ростом клеток. Все это указывает на то, что обнаружение ede генов у растений - не финал истории (Francis, Haiford 1995).

Знание генетики клеточного цикла безусловно важно. Однако такой подход часто дает исследователю лишь номенклатуру генов, поскольку нередко отсутствует информация о функциях кодируемых, ими белков. Даже в благополучных случаях, когда известна первичная

структура генов и активность их продуктов (порой это только связывание с белками-мишенями или с цис-элементами генома), а также имеются молекулярные зонды и антитела, весьма нетривиальной задачей остается использование всего этого арсенала в повседневной практике физиологии растений.

Встречное направлением в изучении репродукции клеток - исследование биохимии отдельных фаз клеточного цикла, вовлеченных в эти события ферментов и структурных компонентов. Важно отметить, что предположения о наличии связующих звеньев между некоторыми хорошо изученными биохимическими процессами и механизмами, регулирующими клеточный цикл, начинают оправдываться. Яркий пример - репликация ДНК у эукариот (Huberman 1991; Stlllman 1994; Helchman, Roberts 1994; Chen et al. 1995). Давно известным биохимическим маркером активной пролиферации клеток животных, указывающим на репликацию ДНК, служит активность фермента тимидинкиназы (КФ 2.7.1.21.), которая стала одним из диагностических и прогностических признаков в онкологии и других областях практической медицины, этот вопрос ежегодно рассматривается в сотнях публикаций. Кроме очевидной функции, запасного механизма синтеза тимидилата путем АТФ-зависи-мого фосфорилирования тимидина, тимидинкиназа, вероятно, играет специальную роль в регуляции клеточного цикла, участвуя в мульти-ферментном комплексе - "реплитаза", сборку которого связывают с периодом репликации ДНК (Reddy, Pardee 1980; Pardee 1989). Однако в нескольких лабораториях были получены результаты, противоречащие "реплитазной" модели (см. Relchard 1988). Тимидинкиназе, вместе с другими нуклеозидкиназами и 5'-нуклеотидазами. отвели роль фермента субстратного цикла, регулирующего потоки дезоксинуклеозидов, направленные в клетку и из неб. Тем не менее, в первичной структуре клонированных тимидинкиназных генов 'животных были обнаружены специфические элементы, связывающие продукты известных cdc генов, и установлено, что экспрессия фермента в определенные периоды клеточного цикла регулируется на транскрипционном и посттранскрипционном уровнях (Sherley, Kelly 1988; Dou et al. 1992; LI et al. 1993: Chang et al. 1994). Кроме того, новые экспериментальные данные возвращают нас к "реплитазной" модели и подтверждают связь тимидинкиназы с аппаратом репликации ДНК (Xu. Plunkett 1993).

Что касается растений, то ранние работы (Hotta. Stern 1963; 1965) на микроспорах Li Hum longiflorm продемонстрировали, что тимидинкиназа появляется незадолго до синтеза ДНК, ее активность совпадает с нарастанием пула дезоксирибозидов и индуцируется тими-

дином. В других, немногочисленных к тому времени публикациях также рассматривалась корреляция активности фермента с репликацией ДНК. Однако, для многих организмов, включая растения, было показано, что фосфорилировать тимидин, по крайней мере in vitro, может нук-леозидфосфотрансфераза, КФ 2.1 АЛЛ (Brawerman, Chargaff 1955; Arlma et al. 1971). Этот факт послужил основанием для пересмотра роли тимидинкиназы у некоторых бактерий, простейших и растений. Считалось, что запасной путь образования тимидилата в клетках этих организмов осуществляется благодаря совместному действию АТФ-дег-радирующей и тимидин-АМФ фосфотрансферазной активностей. Само существование тимидинкиназы в высших растениях ставилось под вопрос, либо отрицалось (Deng and Ives 1972; Hofman and Schwarz 1978).

В настоящее время создалась двойственная ситуация. С одной стороны, до сих пор распространено мнение об отсутствии или малой значимости тимидинкиназы в высших растениях, что сдерживает работы по исследованию роли этого фермента в регуляции клеточного цикла. С другой стороны, в единичных случаях, активность фермента используют как значимый показатель пролиферации клеток растений или их способности реутилизировать тимидин (Georgleva et al. 1994; Wu, King 1994). В связи с этим, а также учитывая возросший интерес к тимидинкиназе клеток животных, решение вопроса о существовании фермента у высших растений и его функциональной значимости является одной из актуальных проблем физиологии клеток растений.

Цель и задачи работы. Основная цель настоящей работы состояла в исследовании функциональной значимости тимидинкиназы в клетках высших растений. В связи с этим были поставлены следующие задачи:

1. Выявить связь активности тимидинкиназы с пролиферацией клеток, используя различные ткани интактных растений, популяции культивируемых клеток и протопластов, контролируя возможный вклад неспецифической нуклеозидфосфотрансферазы (НФТ).

2. Определить приуроченность активности фермента к отдельным периодам клеточного цикла.

3. Исследовать функциональную топографию тимидинкиназы в клеточном цикле.

4. Провести выделение и очистку тимидинкиназы из проростков Vicia /aba и исследовать основные'физико-химические и кинетические свойства фермента.

5. Оценить соотношение тимидинкиназной и НФТ активностей in vivo, используя активно пролиферирующую суспензионную культуру клеток.

Научная новизна. Впервые из высших растений была выделена ти-мидинкиназа и исследованы ее основные физико-химические и кинетические свойства. Предполагается, что в нативном виде фермент существует в форме тетрамера, состоящего из 30-кД субъединиц, и собственно мономеров. Ряд свойств являются общими для тимидинкина-зы из кормовых бобов и других организмов, что позволяет рассматривать эти ферменты как представителей одного семейства.

Получены данные о положительной корреляции между активностью тимидинкиназы и уровнем пролиферации клеток. Показано наличие ферментной активности в ядрах клеток, синхронизированных по S периоду клеточного цикла и в хроматине синтезирующих ДНК клеток. Установлено. что вступление в S период сопровождается подъемом активности тимидинкиназы - раньше в цитозоле. чем в хроматине, где она сохраняется до конца G2 фазы.

Выявлено, что íп vivo экзогенный тимидин быстро транспортируется в клетки и фосфорилируется преимущественно за счет функционирования тимидинкиназы. При возрастании наружной концентрации тими-дина выше 100 мкМ предполагается подключение второго механизма фосфорилирования тимидина - неспецифической НФТ.

На основании обобщения собственного экспериментального материала и литературных данных представлена гипотеза о разделении функций между тимидинкиназой и НФТ в клетках растений. Специфичный к тимидину фермент связан с репродукцией клеток, в то время как НФТ осуществляет перераспределение фосфата между нуклеозидами, препятствуя непропорциональному возрастанию концентрации какого-либо одного нуклеотида.

Научно-практическое значение. Представленная работа является фундаментальным исследованием, показывающим структурно-функциональное сходство тимидинкиназы, впервые выделенной из высших растений. с аналогичными ферментами из клеток организмов других систематических групп. Полученные данные вносят новый вклад в представление од универсальности биохимических механизмов вовлеченных в важную для клеток функцию - деление.

Работа может быть адаптирована к повседневной практике физиологии растений, в которой предлагается использовать экспериментально-обоснованный маркерный признак пролиферации "клеток - активность тимидинкиназы. Кроме того.материалы диссертации могут быть рекомендованы для включения в лекционные курсы по физиологии и биохимии растений.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены или преде-

тавлены: на II и V Международных симпозиумах молодых ученых по регуляции метаболизма растений (Варна. 1981; София 1991): I и III Всесоюзных совещаниях "Клеточный цикл растений" (Канев. 1982; Паланга 1986); семинарах Института экспериментальной ботаники (Ческе Будеевице 1982; Прага 1983); IV Всесоюзной конференции "Культура клеток растений и биотехнология" (Кишинев, 1983); Объединенном конгрессе Европейского общества по культуре тканей (ETCS) и (EURES) - Ретикулоэндотелиального общества (Будапешт. 1983); Международном симпозиуме "Культура тканей и клеток растений в применении к сельскому хозяйству" (Оломоуц, 1984); II Всесоюзной конференции молодых ученых по физиологии растительной клетки (Москва. 1986); цитологическом семинаре им. И.Н. Свешниковой (Москва. 1986); VII Международном конгрессе по культуре тканей и клеток (Амстердам. 1990); семинаре научно-исследовательских лабораторий фармацевтической компании Wakunaga (Хирошима, 1991); II Российском симпозиуме "Новые методы биотехнологии растений" (Пущино. 1993); II Международной конференции "Биология культивируемых клеток растений и биотехнология" (Алматы, 1993); Конференции "Генетика соматических клеток в культуре" (Черноголовка. 1993); IV Международном конгрессе по молекулярной биологии растений (Амстердам, 1994); расширенном семинаре ИФР РАН (Москва. 1994).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 20 работ в отечественных и зарубежных изданиях.

Структура диссертации. Диссертация состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, объекты и методы исследований, результаты и обсуждение, заключение, выводы, литература. Работа изложена на 215 страницах машинописного текста, содержит 45 рисунков. 16 таблиц, список литературы включает 322 наименования.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

Растения. Оранжерейные растения. Диплоидный табак - Nícotiana tabacum var. Samsun выращивали при 26 °С, кормовые бобы - Vicia faba l., сорт Русские черные - при 20 °С (свет/темнота: 16/8 ч). Проростки ячменя Шогйеит vulgare L., сорт Винер) культивировали 10 дней в факторостатных условиях в темноте. Освещение этиолированных проростков проводили 9 ч (50 Вт/мг). Аксеничные проростки V. /aba выращивали в темноте на влажной фильтровальной бумаге при 22 - 24 "С. Для выделения фермента использовали 5-дневные свежие или замороженные в жидком азоте и хранившиеся при -70 °С проростки. В отдельной серии экспериментов проростки в возрасте 92 ч об-

рабатывали 5 мкМ раствором тимидина 2 ч, промывали и доращивали дополнительно 20 часов. Стерильные растения гаплоидного табака (JV.tabacum L.) размножали черенкованием и культивировали на агари-зованной среде при 26 0С (свет/темнота: 16/8 ч).

Суспензионные культуры клеток. Культуру клеток сахарной свеклы (Beta vulgaris L.), штамм 2N. выращивали в соответствии с описанной методикой (Смоленская, Ралдугина 1981). В экспериментах использовали суспензию на 5 - 9 сутки роста. Доля клеток, находящихся в это время в S-периоде варьировала от 25 до 35%. Культуры клеток V./aba и Triticum timopheevii Zhuk. выращивали по принятой схеме на стандартных средах (Смоленская и др. 1988; Зоринянц и др. 1993). Клетки Dtoscorea deltotdea. штамм ДМ-0.5 получали из Лаборатории физиологии культивируемых клеток и биотехнологии ИФР РАН.

Эксперименты по поглощению и фосфорилированию тимидина ин-тактными клетками. Кинетика поглощения тимидина. Суспензию клеток сахарной свеклы инкубировали при различных концентрациях [3Н]дТ. Через определенные интервалы времени клетки экстрагировали кипящей 5% ТХУ, суммарную радиоактивность определяли с помощью жидкостного сцинтилляционного счетчика. Поглощение тимидина и его включение в тимидин-ФосФаты и ДНК. Клетки инкубировали при различных концентрациях тимидина либо в комбинации с равными концентрациями адено-зина, уридина или 5'-амино-2\ 5'-дидезокситимидина [(5'NH2)дТ], затем промывали и экстрагировали холодными 5£ ТХУ или 60% метанолом. Экстракты наносили на ДЭАЭ-бумагу, промывали формиатом аммония и тимидин-фосфаты элюировали. Включение С3 HJ дТ в ДНК определяли после гидролиза клеток в хлорной кислоте. Сумму [3Н]дТ в растворимой и ДНК фракциях рассматривали как общее поглощение тимидина. Все концентрации рассчитывали на мг сырой массы клеток. Создание условий гипоксии. Через суспензию клеток в течение 2 мин продували гелий (2 л/мин), затем закрытые сосуды оставляли дополнительно на 20 мин. Измерение АТФ проводили люциферин-люциферазным методом в ТХУ-экстрактах клеток по модифицированной методике К1ш-mich et al. (1975), используя сцинтилляционный счетчик.

Изолирование и культивирование протопластов. Протопласты выделяли из листьев оранжерейных растений диплоидного табака, кормовых бобов и стерильных растений гаплоидного табака как было описано ранее (Nosov, Smolenskaya 1982; Смоленская, Носов 1988).

Выделение ядер. Синхронизацию культуры клеток сахарной свеклы проводили на 2-е сутки роста, используя оксимочевину в концентрации 5 мМ (Смоленская и др. 1983). Из синхронизированных клеток и

клеток, находящихся в стационарной фазе роста, изолировали ядра (Watson, Thompson 1986). Чистоту ядер определяли под флуоресцентным микроскопом.

Выделение фракций хроматина и цитозоля. Была использована основа метода Huang и Bonner (1962). Листья ячменя гомогенизировали в ножевом гомогенизаторе, а протошйсты и листья табака- в гомогенизаторе Поттера. Осадки растирали в буфере с 2% Тритон Х-100 и центрифугировали 5 мин при 2000 g. Процедуру повторяли 5 раз, затем дважды без Тритона Х-100. Для получения фракции постмитохонд-риального супернатанта ("цитозоля") гомогенаты центрифугировали 15 мин при 23000 g.

Основные буферные системы для очистки тимидинкиназы. А) гомогенизация : 50 мМ Трис-НС1. 20 мМ KCl, 5 MM MgCl2, 6 мМ ДТТ, 10% глицерин, 20 мкМ тимидина, 0.1 мМ ФМСФ. Б) обессоливание: 50 мМ Трис-НС1, 2 мМ ДТТ. 5 мМ MgCl2, 20 мкМ тимидина. В) хроматография на ДЭАЭ-целлюлозе, аффинная хроматография на Blue Sepharose и дТ(3'Ш2)-АсА 54 : 50 мМ Трис-НС1. 2 мМ ДТТ. 5 мМ MgCl2. 10 мМ KCl. Г) аффинная хроматография на дТ(5'Ш2)-Seph.: 20 мМ Трис-НС1. 2 мМ ДТТ, 10 мМ KCl. Д) хроматография на SP-Toyopearl: 12.5 мМ Трис-НС1, 6.9 мМ MES. 6 мМ ДТТ, 10 мМ KCl. Е) хроматография на Mono S: 50 мМ MES-NaOH. Ж) разделяющая гель-фильтрация: 50 мМ Трис-НС1, 250 мМ NaCl. Буферные растворы А,Б,В.Г.Ж имели pH 7.5; Д - pH 5.8 и Е - pH 6.8 при 20°С.

Приготовление аффинных матриц. 1. - Ultrogel АсА 54 активировали глутаральдегидом в 0.5 M Na-K фосфатном буфере (pH 7.6). Отмытую от глутаральдегида суспензию инкубировали с раствором лиган-да - дТ(3'Ш2). Один мл матрицы дТ(3'Щ>)-АсА 54 связывал 1.8 мкМ лиганда. 2. - Аминогруппу молекулы дТ(5'ЛН2) через пептидную связь присоединяли к карбоксильной группе спейсера сефарозы с помощью катализатора EDC при pH 4.5. Один мл матрицы flT(5'NH2)-Seph. связывал 9 мкМ лиганда. Аналоги тимидина были любезно предоставлены A.A. Краевским (Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгель-гардта РАН).

Получение исходного экстракта для выделения фермента. Часть проростков и три части (вес/объем) холодного (+2 °С) буфера А гомогенизировали в миксере Waring (Braun. Германия) 2 мин. Гомогенат фильтровали, центрифугировали 30 мин при 1000-2000 g, затем 30 мин при 23000 g для получения постмитохондриального супернатанта.

Сцинтилляционный вариант определения синтеза ДНК. Кусочки листьев ячменя и протопласты табака инкубировали с [3Н]дТ, матери-

ал фиксировали, гидролизовали при 70 °С в 0.5 N НС104 и определяли радиоактивность со сцинтиллятором Unlsolve-lOO (Koch-Light Lab.. Англия).

Радиоавтография. Метод применяли для определения числа клеток. синтезирующих ДНК. в экспериментах по конкуренции не меченых нуклеозидов с [3Н]дТ за включение в ядерную ДНК подсчитывали число зерен серебра над ядрами. Инкубацию останавливали добавлением избытка не меченого тимидина, клетки фиксировали и микроскопические препараты и радиоавтографы готовили по общепринятым методикам (Епифанова и др. 1977; Rogers 1979) используя жидкую эмульсию типа H (Хймфотопроект, Москва).

Определение активности тимидинкиназы. Активность определяли по количеству (3Н]-тимидинмонофосфата, связавшегося с ДЭАЭ-бумагой (DE-81, Whatman). Инкубационная смесь содержала 0.1 мл препарата фермента и 0.1 мл 100 мМ Трис-HCl буфера (pH 7.5) с 6 мМ дитиот-рейтола. 10 мМ MgCl2. 10 мМ АТФ. 10 мМ 3-фосфоглицерата и 5 мМ NaF. Конечная концентрация тимидина варьировала в различных экспериментах от 20 мкМ до 42 мкМ. с долей [3 Н]дТ (925 ГБк/мМ, Amers-ham) 4%-11%. Смесь инкубировали при 26 °С. затем 1 мин в кипящей водяной бане и центрифугировали 2 мин при 10000 g. Аликвоту 25 мкл наносили на ДЭАЭ-бумагу (15x15 мм) и промывали в этаноле (10 мл х 3 раза x 5 мин). Бумагу высушивали и радиоактивность определяли в толуольном сцинтилляторе. В отдельных экспериментах продукты реакции разделяли тонкослойной хроматографией либо сорбировали на ДЭ-АЭ-целлюлозе и элюировали. Удельную скорость реакции Ууд выражали в пмоль/мин мг белка. Нормированные значения - 'Ууд - даны в расчете на 50 мкМ тимидина. В экспериментах по кинетике - размерность скорости - мкМ/мин.

Аналитические и вспомогательные методы. Концентрацию белка измеряли по методу Лоури (Lowry et al. 1951) или Брэдфорд (Bradford 1976). Электрофорез нативных препаратов в трубках и пластинах ПААГ проводили в соответствии с Lee и Cheng (1976), в денатурирующих условиях - по Laemmll (1970). Гели окрашивали кумасси R-250 или AgN03 по модифицированной методике Москаленко (Москаленко, То-ропыгина 1988). Количество ДНК определяли с дифениламиновым реактивом (Burton 1956) после гидролиза проб в НС104. Активность РНК-полимеразы I (РП-I) определяли в соответствии с методом Сели-ванкиной и др. (1979). Экстракт культивируемых фибробластов мыши, линии L 929. содержащий тимидинкиназу, любезно предоставлен O.K. Глебовым (Институт Цитологии РАН. Санкт-Петербург). Цитофотометрию

ДНК проводили по ранее разработанной методике (Nosov et al. 1983). Для хроматографии при низком давлении применяли комплект приборов и стандартные колонки LKB (Швеция). Хроматографию при умеренном давлении проводили в системе FPLC (Fast Protein Liquid Chromatography) фирмы Pharmacia, используя сильный катионообменник Mono S и среду для гель-фильтрации Superóse'12 в соответствии с рекомендациями производителя.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

1. Независимое включение тимидина в различные компартменты растительной клетки. Возможность существования нескольких тими-дин-фосфорилирующих систем. Исследование роли какого-либо фактора в регуляции клеточного цикла требует использования синхронно делящихся популяций. В изучении тимидинкиназы растений это условие также актуально, поскольку одной из задач является выяснение связи активности фермента с пролиферацией. В интактном растении лишь незначительная часть клеток, организованных в специальные ткани, способна постоянно делиться, и синхронизировать этот процесс достаточно сложно. В связи с этим в исследованиях такого рода часто используют сообщества свободно живущих клеток.

Протопласты из мезофилла многих видов растений при благоприятных условиях (наличие необходимых компонентов питания и фитогор-монов в среде) способны вступать в первый после дедифференцировки митотический цикл (Butenko 1979). что позволяет изучать последовательность биохимических процессов, ведущих к инициации делений. Вероятно этот процесс видоспецифичен. поскольку, например, в популяциях протопластов из мезофилла и суспензионной культуры кормовых бобов с низкой эффективностью и очень редко удается стимулировать деления (Binding. Nehls 1978; Смоленская и др. 1988).

Радиоавтографические данные выявили различия в динамике включения С3Н]дТ в кислотонерастворимые фракции (Рис.1). Способные к индукции делений протопласты табака активно включают меченый предшественник, причем зерна серебра вначале появляются над цитоплазмой, а спустя 18-20 ч стартует включение [3 Н]дТ в ядра (Рис. 1-1). Протопласты из мезофилла бобов также активно накапливают метку над цитоплазмой, но включение [3Н]дТ в ядра идет на низком уровне и не превышает 2.5% в течение 7 суток культивирования (Рис.1-2).

Включение меченого предшественника в кислотонерастворимую фракцию цитоплазмы можно связать с синтезом ДНК в таких органел-лах. как митохондрии, увеличение сети которых связано с переходом

41 72 96 120 144 - 1U Вреия кулыиаиро|дм4й, ч

Рис. 1. Включение (3Н]-тимидина в кислотонерастворииую фракцию, локализованную в ядре и цитоплазме культивируемых протопластов. (П Протопласта из мезофилла диплоидного таОака. ©Протопласты из мезофилла кормовых бобов.

Рис. 2. Электрофоретическая подвижность белков с тимидн-фосфо-рилирусщей активностьи из пост-митохондриального супернатанта гомогената проростков кормовых бобов. Белок - * от максимального количества. Стрелкой указана граница между концентрирующим и разделяющим гелем.

Рис. 3. Изменение активности ти-мидиккиназы во Фракции постмито-хондриального супернатанта культивируемых протопластов гаплоидного табака.«Стандартный метод с ДЭАЭ-бумагой.¿Связывание таниновых нуклеотидов с ДЭАЭ-целлвло-зой. ■ Разделение продуктов реакции с помощью ТСХ: учет активности по количеству ТТФ.

Рис. 4. Зависимость тимидинки-назной активности от уровня пролиферации в разных штаммах суспензионных культур клеток. Суспензии клеток: 1- Vicia /aba. недельная культура. 2- Trttlcum ttmopfteevlt. трехнедельная культура. 3- Oioscorea deltoIdea, трехдневная культура. 4- Beta vulgaris, трехдневная культура. Вставка: Аппроксимация к линейной зависимости пролиферативной и ферментной активностей.

/ А

а-' 1

Рис. 2.

} f \ j \ А

I/ У \

i 'а

К0ЛНЧ4СТШ0 .....J

% 7S

Проб«* % Г«м ОТ Я*Т01*. ММ

\7 " Рис. з.

\ м

с, I S

144 192

24 72 120 1Ы

Вр«ыя кул»ти*иро«»«*я. ч

X т

г • амг.р < ом

s ¡o й

,0 g - щ

О 5

Í? *

• S

- i

12 3 4

Штаммы суспензионных культур к дето«

клеток в гетеротрофное состояние. Логично было предположить, что низкий уровень метки над ядрами протопластов бобов связан с отсутствием в них репликации ядерной ДНК и этот блок препятствует нормальному прохождению митотического цикла.

Однако результаты цитофотометрии выявили практически одинаковую динамику в изменении доли протопластов табака и бобов, удваивающих количество ядерной ДНК. К седьмым суткам культивирования такие протопласты составляли 22-28% от всей популяции. Кроме того, применение [3Н]-цитидина и РНК-азной обработки радиоавтографических препаратов показало активное включение этого предшественника в ДНК ядер протопластов бобов. Наконец, в постмитохондриальных су-пернатантах, полученных из культивируемых протопластов бобов, ти-мидин-фосфорилирующая активность была на два порядка ниже, чем в аналогичных препаратах из протопластов табака. Экспериментальные данные позволяют предположить, что:

1. Существует несколько тимидин-фосфорилирующих систем - по числу ДНК-синтезирующих компартментов клетки.

2. Функционирование этих систем может быть независимым.

Сравнение электрофоретической подвижности тимидин-фосфорили-

рующей активности, связанной с белками митохондрий и хлоропластов, не выявило стабильно повторяющихся йл, специфичных для этих орга-нелл. Однако везде присутствовали белки, практически с нулевой подвижностью (при рН разделяющего ПААГ - 8.8) и максимальной активностью. характерные для постмитохондриального супернатанта (Рис.2). Очевидно вопрос о наличии в клетках растений трех различных систем , фосфорилирующих тимидин,требует отдельного исследования. Тем не менее. Голашевский и др. (Golaszewskl et al. 1975) показали присутствие функциональной тимидинкиназы в цитозоле и хло-ропластах проростков Secale cereale, причем активность НФТ в этих фракциях была гораздо ниже. Предполагается, что в одноклеточной водоросли Acetabularla mediterránea тимидин фосфорилируется тими-динкиназой, синтезируемой исключительно в хлоропластах (Bannwarth et al. 1977а; 1977b). Здесь же следует отметить, что для клеток млекопитающих давно показано существование митохондриальной тимидинкиназы (Berk, Clayton 1973).

В связи с тем. что включение [3Н]дТ в ДНК ядер протопластов коррелирует с активностью тимидинкиназы в постмитохондриальном су-пернатанте и ранние исследования фермента проводили на аналогичных препаратах (Hotta, Stera 1963; 1965), в последующих экспериментах тимидин-фосфорилирующую активность в основном определяли в постми-

тохондриальном супернатанте и именно эту фракцию использовали для выделения тимидинкиназы.

2. Индукция тимидинкиназы субстратом и связь активности фермента с периодами митотического цикла и пролиферацией клеток. Реакция. катализируемая НФТ, зависит от наличия АМФ и других нуклео-зидмонофосфатов. В присутствии АТФ' функционирование НФТ определяется уровнем активности фосфатаз и АТФ фосфогидролаз. Если инакти-вировать АТФ-деградирующие ферменты и тем самым лишить НФТ субстрата, то на этом фоне можно определить активность тимидинкиназы. Для распознавания НФТ иприменяют NaF, поскольку фторид-ионы инги-бирует этот фермент; в условиях, благоприятных для НФТ активности, 10 мМ NaF ингибировали фосфорилирование тимидина в реакции с АТФ на 90% и более (Arima et. al. 1971; Grlvell, Jackson 1976; Yuyama 1978). В наших экспериментах 5 мМ NaF стандартно присутствовало в реакционной смеси для определения активности тимидинкиназы. В случае экстрактов из протопластов и других препаратов с малым количеством белка такой концентрации NaF было достаточно для снижения тимидин-фосфорилирующей активности до устойчивого уровня, очевидно обусловленного тимидинкиназой. При работе с гомогенатами проростков для подавления активности НФТ требовалась концентрация больше 15 мМ. Однако, добавление 50 мМ NaF в буфер для гомогенизации и 20 мМ в реакционную смесь позволило определить стабильный уровень активности, принадлежащий тимидинкиназе (Табл. .1).

Таблица 1. Влияние кратковременной предобработки проростков ти-мидином и включения ИаР в среду гомогенизации на активность тимидинкиназы в экстракте.

Получение экстракта NaF, мМа ' V 'уд пмоль мин мг белка Доля тимидинкиназы, %

Буфер А с NaFft 22 9.03 100

Буфер А 5-12.5 35.03 26

Обработка тимидином8, буфер А с NaF 22 29.6 100

Обработка тимидином, буфер А 5-12.5 61.2 48

Примечания: а Конечная концентрация ИаР в реакции. 6 Свежие охлажденные проростки растирали в стандартном буфере А или в буфере А с добавлением 50 мМ МаГ. постмитохондриальный супернатант использовали для определения активности тимидинкиназы. 6 Двухчасовая обработка проростков 5-мкМ тимидином за 20 ч до гомогенизации.

Одним из признаков, указывающих на субстратную специфичность тимидинкиназы. может служить ее индукция под влиянием тимидина. Этот факт давно установлен для фермента клеток млекопитающих (Stubblefield, Murphree 1967). В экспериментах на микроспорах лилии и зародышах пшеницы было установлено, что тимидин индуцирует тимидинкиназу (Hotta, Stern 1965). В работе MacLeod (1971) кратковременная обработка проростков кормовых бобов 3.3 мкМ тимидина вызывала, как минимум, двукратное увеличение активности тимидинкиназы в тканях первичного корешка.

Данные, представленные в Таблице 1. показывают, что после обработки проростков кормовых бобов 5 мкМ тимидина фосфорилирующая активность увеличивается почти в два раза. При этом дополнительная активность, индуцированная субстратом, не ингибировалась NaF, как и полагается тимидинкиназе.

Таким образом, полученные результаты доказывают, что проростки кормовых бобов имеют тимидинкиназную активность. При этом реакция фосфорилирования тимидина в экстракте определяется на- 74% НФТ и на 26% тимидинкиназой.

Для выяснения корреляции активности фермента с периодами ми-тотического цикла использовали протопласты из мезофилла гаплоидного табака, которые стабильно демонстрировали 60-70% фигур цитокинеза через 120 ч культивирования. Основываясь на данных радиоавтографии, цитофотометрии и химического анализа количества ДНК, в культивируемых протопластах были выявлены границы периодов митоти-ческого цикла. Сопоставление активности фермента, определявшейся различными методами, с хронологией митотического цикла (Рис. 3) показало, что тимидинкиназа начинает работать только через 50 ч, когда наступает S-период, её уровень сохраняется в течение Gz и снижается в начале следующего цикла. При использовании тонкослойной хроматографии для учета количества ТТФ, конечного продукта всей цепи тимидин-специфичных киназных реакций, снижения активности обнаружено не было, хотя более четко выявлена её стабилизация на протяжении S-G2 периодов (второй подъем относится к следующему митотическому циклу).

Таким образом результаты указывают на приуроченность функциональной тимидинкиназы к S-периоду и на некоторую стабилизацию активности фермента в G2-периоде митотического цикла.

На Рис.4 представлен корреляционный анализ зависимости уровня пролиферации разных штаммов суспензионных культур клеток и актив-

ности тимидинкиназы. Как видно из данных, выявлена достаточно жесткая зависимость, что подтверждает связь фермента с пролиферацией клеток в целом.

3. Функциональная топография тимидинкиназы в клеточном цикле. Наличие высокой степени сопряженности признаков пролиферативной и ферментной активностей, а также хронологическое совпадение последней с началом S-периода митотического цикла, предполагает участие тимидинкиназы в процессе репликативного синтеза ДНК. Это в свою очередь не исключает локализацию фермента в ядрах клеток. Для исследования функциональной топографии тимидинкиназы была поставлена серия экспериментов, в которой применены три различных подхода для синхронизации событий клеточного цикла.

В первом случае использовали ингибитор рибонуклеотидредуктазы - оксимочевину. останавливающую клетки в S периоде. Объектом была выбрана суспензионная культура сахарной свеклы, отвечающая высокой степенью синхронизации на действие ингибитора (Смоленская и др. 1983). Спустя два дня после пересадки в свежую питательную среду суспензия была синхронизирована оксимочевиной. После отмывки от ингибитора 8055 клеток вступало в стадию репликации ядерной ДНК. Из двух популяций - синхронной по S-периоду и находящейся в стационарной фазе роста (1-2% S-фазных клеток) - были выделены ядра. Активность тимидинкиназы в ядерном лизате синхронизированных клеток составляла 1.6 ± 0.17 пмоль/мг белка мин, в отличие от нулевой активности в лизате ядер трехнедельной культуры. Следует отметить, что фракция ядер была достаточно чистой, и возможный вклад цитозо-ля в ферментную активность можно считать минимальным. Обнаружение функциональной тимидинкиназы в ядрах клеток в S периоде клеточного цикла позволяет предположить, что для выполнения своей функции (в этот период) фермент локализуется в ядре. Для клеток животных вопрос о связи тимидинкиназы с различными компартментами клетки рассматривался неоднократно и. например, было показано наличие фермента и возрастание его активности в S-периоде в ядрах культивируемых фибробластов мыши и клеток печени крысы (Adams 1969; Хацернова, Силаева 1983).

Другие два метода синхронизации клеточного цикла сочетались с анализом ферментной активности хроматина, поскольку при любом способе выделения ядер можно предположить, что тимидинкиназа в этих органеллах является продуктом цитоплазменного загрязнения. Хроматин в большей степени свободен от загрязнений ввиду того, что его многократно отмывают буферным раствором с высокой концентрацией

Тритона Х-100. Кроме того известно, что номенклатура многих белковых компонентов хроматина достаточно консервативна, и большинство из них принимает участие в процессах репликации и транскрипции (Маб1 1982). Поэтому обнаружение тимидинкиназной активности, связанной с хроматином, - веский аргумент в пользу важной роли фермента в его функционировании. В работе получены данные об увеличении ассоциированной с хроматином активности тимидинкиназы ДНК-син-тезирующих клеток в двух различных системах.

В первой из них было использовано свойство света вызывать волну делений клеток при освещении этиолированных растений. Воздействие белого света (50 Вт/м2) в течение 9 ч активировало синтез ДНК в 10-дневных этиолированных проростках ячменя (Табл. 2). Как видно из Таблицы 2, прирост содержания ДНК хроматина составил 26% за 9 ч, что указывает скорее на репликативный, чем на репаративный характер синтеза. При этом свет индуцировал не только синтез ДНК. но и увеличение активности тимидинкиназы в хроматине. В качестве параметра, указывающего на корректность условий выделения хроматина. использовали прочно связанную с ним РП-1, которая также реагировала на воздействие света.

Таблица 2. Влияние света на активность ферментов в хроматине, включение [3Н]дТ и содержание ДНК в проростках ячменя.

Параметр Световой режим выращивания проростков

Темнота Темнота + 9 ч света

ДНК хроматина, мкг3 27.0 ±0.9 (100%) 34.0 ±1.3 (126%)

Включение ^ШдТ, ОЕ-8 10.7 ± 1.1 (100%) . 14.3 ± 0.5 (133%)

Активность тимидинкиназы. ОЕ 396.1 ± И (100%) 846.8 ±7.0 (214%)

Активность РП-1. ОЕ 24.7 ±3.4 (100%) 96.6 ±2.8 (390%)

Примечания: а В расчёте на г сырого веса проростков. 8 ОЕ = тыс. имп/мин в расчете на 1 мг ДНК.

Количественные показатели указывают на процесс репликации ДНК, но нельзя исключить синтез ДНК в формирующихся под действием света хлоропластах и процессы репарации; повреждение ДНК в этиолированных проростках может быть вызвано светом. Дополнительное образование рибосомных РНК, о чем свидетельствовало повышение активности РП-1 после воздействия света, вызвано к жизни измененными

20-1 Рис. 6.

100 у

50 *

25 ©

° 0 41 И 144 192

«1 I

Г2 120 16Л

Время культивирования, ч

Рис. 5.

рН

Рис. 5. Изменение активности тимидинкиназы во время культивирования протопластов из мезофилла гаплоидного табака. Представлены результаты двух характерных экспериментов (фи©). Активность фермента во фракции постмито-хондриального супернатанта ®, <7: активность фермента в хроматине • На временной оси отмечено расположение периодов первого клеточного цикла.

Рис. 6. Тимидин-фосфорилирующая активность в растворенных осадках. сформированных при различных значениях рН в постмитохонд-риальном супернатанте гомогената проростков кормовых бобов.

потребностями "домашнего хозяйства" клетки в связи с формированием хлоропластов, репликацией ДНК и вероятными процессами репарации. Повышение активности связанной с хроматином тимидинкиназы в этом случае может быть сопряжено с функцией ДНК-полимераз, ответственных как за репликацию ДНК, так и за ее репарацию.

Вторая система представляет собой культивируемые протопласты мезофилла гаплоидного табака, синхронно проходящие фазы клеточного цикла. Из протопластов выделяли фракции хроматина и цитозоля с последующим определением в них активности тимидинкиназы. На Рис.5 представлены данные двух характерных экспериментов. Подъем активности тимидинкиназы совпадал с вступлением клеток в Б-период мито-тического цикла, причем для цитозоля пик приходился ближе к началу Б-периода. В хроматине наибольшая активность была обнаружена в конце Б-периода и сохранялась до начала митоза. Возможно, предпо-

ложение. сделанное для клеток млекопитающих. - тимидинкиназа входит в белковый комплекс, обслуживающий процесс репликации (Reddy. Pardee 1980; Xu, Plunkett 1993b - справедливо и для высших растений. При этом авторы "реплитазной" модели подчеркивают, что синтез фермента происходит в цитоплазме и в нужный момент он транспортируется в ядро (Pardee 1989). Активность тимидинкиназы в системе изолированных протопластов табака сохранялась до конца G2 периода (Рис.5). Аналогичное явление отмечали и для клеток млекопитающих (Sherley, Kelly 1988; Не et al. 1991), причем падение активности фермента в митозе связывают с его гиперфосфорилированием в этой фазе (Chang et al. 1994). Во втором эксперименте (Рис. 5-2) во фракции цитозоля наблюдался еще один подъем активности тимидинкиназы, находящийся уже на "территории" следующего митотического цикла.

Таким образом, кроме обычно обнаруживаемой активности тимидинкиназы в цитоплазме, была показана ферментная активность в ядрах и в хроматине растительных клеток, находящихся в S/G2 периодах митотического цикла. Это дает основание связывать функциональную тимидинкиназу с процессом репликации ДНК.

4. Выделение и очистка тимидинкиназы из проростков кормовых бобов. Результаты, изложенные в предыдущих разделах, касаются активности тимидинкиназы и ее связи с пролиферацией клеток. Однако, несмотря на методические возможности отличать реакции, катализируемые тимидинкиназой и НФТ. самым убедительным доказательством функциональной значимости тимидинкиназы является ее выделение из высших растений.

Как уже отмечалось, использование NaF в реакционной смеси, а также достаточное количество АТФ и низкие концентрации тимидина (в связи с большими значениями нуклеозидной Км для НФТ) - непременные условия выявления тимидинкиназной активности. Добавление 20 мМ NaF в реакционную смесь позволяло выявлять активность тимидинкиназы в первичных гомогенатах (см. Табл. 1). В процессе очистки доля НФТ уменьшалась, и киназу можно было определять в присутствии 5 мМ NaF. Основные стадии дополнительно контролировали, измеряя активность при больших концентрациях NaF. Остаточную НФТ выявляли в присутствии 5 мМ ЭДТА и без двухвалентных катионов, поскольку фос-фотрансферазная реакция не зависит от Mg2* (Shiosaka et al. 1971; Deng. Ives 1972; Delseny et al. 1976; Brunngraber 1978).

Хорошо известно, что тимидинкиназа in vitro - очень лабильный фермент, это одинаково справедливо для клеток растений и животных

(Brunorl et al. 1974; Lee, Cheng 1976). Хранение экстракта приводило к значительному падению активности, наиболее резко фермент инактивировался в первые часы. Использование замороженного или охлажденного материала несколько повышало последующую стабильность тимидинкиназы при хранении (Табл. 3). Инактивация фермента в начале процедуры очистки, наряду с прочими возможными причинами, могла быть вызвана протеазами, присутствующими в экстракте. Кроме того, центрифугирование и другие манипуляции, занимающие продолжительное время при препаративной работе с большими объемами, неизбежно приводили к нагреванию экстракта. В первые часы активность тимидинкиназы падала в среднем в 6 раз.

Применение методов, основанных на коллигативных свойствах белков. В качестве первого этапа очистки тимидинкиназы использовали фракционирование сульфатом аммония. В области 40-60% от насыщения экстракта сульфатом аммония осаждалась 1/5, а в интервале 60-90% от насыщения (кратко эту фракцию будем называть - фракция 60-90) в осадок переходило 4/5 тимидин-фосфорилирующей активности. Очевидно, разделить с помощью сульфата аммония НФТ и тимидинкиназу трудно, возможно это зависит от исходного объекта. Так. НФТ из проростков Raphanus sativus высаливается в области 30-60%-го насыщения (Delseny et al. 1976). аналогичная ферментная активность из гипокотилей Arachis hypogaea переходила в осадок в интервале 50-80% от насыщения (Mullin. Fites 1978). Отметим, что после обес-соливания фракции 60-90 на Sephadex G-25 или G-50 оставалось лишь около 6% суммарного белка. В целом эта фракция имела 'Ууд в 2 раза выше, чем в свежем экстракте, если время от момента гомогенизации ткани до добавления сульфата аммония было минимальным. Ферментная активность хорошо сохранялась под сульфатом аммония при наличии в буфере гомогенизации ФМСФ. Нативный электрофорез диализованной фракции 60-90 в ПААГ показал, что около 25% суммарной тимидин-фосфорилирующей активности двигалось к катоду, а 75% - к аноду. Многие свойства очищаемого препарата тимидинкиназы указывают на то, что этот фермент является щелочным белком (см. ниже), поэтому можно предположить, что катодная активность представлена тимидинкина-зой или ее изоформами с изоэлектрической точкой (pi) в области высоких значений pH. К тому же, около 25% тимидин-фосфорилирующей активности фракции 60-90 не ингибировалось большими концентрациями NaF. то есть катализировалось тимидинкиназой.

Результат гель-фильтрации полученной фракции на Sephadex G-100 и Sephacryl S-300 зависел от концентрации солей в буфере

Таблица 3. Влияние исходного материала и условий хранения экстракта на тимидин-фосфорилирующую активность.

Исходные проростки Время, ч Температура, "С 'V пмоль/мг $ёлка мин

Свежие, охлажденные пои +2 °€ 2 ч ' +2 35

Свежие, комнатной тем-ператуш 12 ч +2 5

Замороженные при -70 20 ч +2 6

Свежие, охлажденные при +2С 216 ч -20 а 6

Свежие, охлажденные при +2 °С 432 ч -20 11 3.23

Замороженные при -70 6С 72 ч -70 а 0

Примечание: а Экстракт в 50% глицерине.

элюции. Матрицы на основе декстрана обладают способностью сильно задерживать щелочные' белки. Введение в элюент высоких концентраций солей, препятствующих сорбции, предполагает последующий этап -обессоливание. Диализ занимал продолжительное время и приводил к потере активности. Использование для обессоливания колонок с Бер-11ас1ех С-25 или С-50 возвращало нас к проблеме сорбции.

Белок, определявший тимидин-фосфорилирующую активность во фракции 60-90, будучи щелочным, не связывался с ДЭАЭ-целлюлозой. Препарат в буфере В свободно проходил через колонку с БЕ-52. Аналогичное поведение белка наблюдали в диапазоне рН 6.0-8.5. Увеличение 'Ууд в 1.8-2.1 раза происходило за счет удаления балластных белков и не сопровождалось концентрированием препарата.

Таким образом, фракционирование сульфатом аммония, хотя и незначительно обогащало препарат тимидинкиназой, было полезным для накопления и длительного хранения образцов. В тоже время использование приемов высаливания с последующим обессоливанием приводило к большим потерям фермента без увеличения 'Ууд. Анионообменная хроматография и гель-фильтрация на этом этапе также не давали большого эффекта. В связи с этим необходим был метод обработки исходного экстракта, сильно не изменявший ионную силу раствора и приводивший к удалению НФТ. Основой для разработки такого метода послужил предположительно щелочной характер белка тимидинкиназы.

Аналитический вариант эксперимента по изоэлектрическому осаждению белков состоял в измерении тимидин-фосфорилирующей активности во фракциях, полученных после растворения осадков, формирующих-

ся при различных значениях pH. На Рис.6 можно отметить уменьшение крутизны графика зависимости осажденной активности от pH в области 5.0-6.0. небольшой пик в районе 7.0 и, наконец, максимум активности наблюдали при pH 9.2. Известно, что, например, две субъединицы НФТ из корнеплодов моркови имеют pi 4.6 и 5.1 (Rodgers, Chargaff 1972). В связи с этим предположили, что в интервале значений pH 5. 0-6.0 в осадок возможно переходит НФТ активность, а остальные два пика (Рис.6) относятся к тимидинкиназе. Поэтому для изоэлект-рического осаждения белков в препаративном варианте выбрали pH 4.8. Наилучшим методом с точки зрения сохранности тимидин-фосфори-лирующей активности было титрование экстракта 0.5 M раствором MES буфера. Осветленный "кислый" супернатант имел '.Ууд в 2.7 раза большую, чем до титрования. MES (Табл.4). Хранение этой фракции вызывало быструю потерю активности.

Полученный препарат был готов для следующей стадии - катионо-обменной хроматографии. Эффективность очистки на колонке с SP-To-yopearl зависела от pH и ионной силы буфера, а также от скорости элюции. Окончательный вариант подготовки препарата для катионооб-менной хроматографии включал повышение pH раствором Трис (1 М) с 4.8 до 5.8. Нанесение большого объема препарата занимало 12-15 ч, что приводило к потере активности на этой стадии в среднем в 1.3 раза, однако увеличение скорости значительно снижало связывание белка с ионообменником. Элюцию проводили лилейным или ступенчатым градиентом NaCl в буфере Д. Активная фракция выходила из колонки при 150 мМ NaCl (фракция SP/150). Контроль с NaF и ЭДТА показал, что доля тимидинкиназы составляла 77%. и ее удельная активность во фракции SP/150 повышалась в 12 раз по сравнению с исходным экстрактом (Табл.4). Хранение препарата в течение нескольких суток было удовлетворительным. Возможно, присутствие NaCl стабилизировало фермент.

Таким образом, изоэлектрическое осаждение белков в кислой области позволило обогатить препарат щелочными белками, катионооб-менная хроматография которых привела к значительному повышению доли тимидинкиназы.

Использование системы FPLC позволяло сократить время хроматографии, что очень важно при работе с лабильными ферментами, такими как тимидинкиназа. Характерный профиль элюции белков фракции SP/150 с колонки Superóse 12 (буфер Ж, скорость 0.5 мл/мин) представлен на Рис.7-1. Доля тимидинкиназной активности в полученном после гель-фильтрации препарате составляла 99% (НФТ - 1%). При

Рис. 7. Очистка тимидинкиназы хроматографией в системе FPLC. Представлены профили элюции белков с колонок: ф Superóse 12; ф Mono S; @ Superóse 12 (повторно). (4)Определение молекулярной массы гель-фильтрацией на Superóse 12. Заштрихованные области -Фракции с тимидинкиназной активностью. Цифры вверху Рис. 7-1 и Рис. 7-3 - объемы выхода с колонки и мол. массы маркерных белков. кД.

Mono S M

Ai»""

-т.

Элехтроеоротимесхая подаихмостк

Рис. 8. Анализ методом денатурирующего электрофореза в Палг Фракций после повторной гель-фильтрации на Superóse 12. ©Окрашенный AgN03 гель с указанием молекулярных масс маркерных белков (М) и наименованием фракций (Mono S. а. б. el-вЗ): ©Определении молекулярных масс (кД) полинентидов по маркерным белкам.

этом 'Ууд фермента была в 16 раз выше, чем в исходном экстракте (Табл.4).

Фракции с. тимидинкиназной активностью (Рис.7-1, заштрихованная область) объединяли и обессоливали. Подготовленный препарат хроматографировали на Mono S в буфере Е. На Рис. 7-2 видно, что активность элюировалась с катионообменника в диапазоне 100-150 мМ концентрации линейного градиента NaCl. На этой и последующих стадиях очистки фактически вся тимидин-фосфорилирующая активность соответствовала тимидинкиназе. Падение коэффициента очистки с 16 до 12.5 (Табл.4) могло быть вызвано избирательной сорбцией щелочных белков на стадии обессоливания. Тем не менее, хроматография на Mono S, несмотря на потери, позволила сконцентрировать щелочные белки с активностью тимидинкиназы.

Таблица 4. Очистка тимидинкиназы из проростков кормовых бобов.

Стадия очистки, фракция 'Ууд. пмоль/ мг белка мин Доля тимидинкиназы, % Фактор потерь Фактор очистки Белок, мг%

Экстоакт 35 26 0 1 100

Центрифугиро-вание3- 5.5 26 6.4 0.17 100

Инкубация при dH 4.8 15 >26 _и 0.43 45-33

Повышение рН и др.6 11.5 >26 1.3 0.33 45-33

SP-TovoDearl 141 77 - 12 0.5-1. 1.

Концентрирование 94 11 1.5 8 0.5-1.1

FPLC, Superóse 12 146.2 99 — 16 0.2

FPLC. Mono S ИЗ 100 • 1.29 12.4 0.03

Концентрирование 75 100 1.5 8.3 0.03

FPLC, Superóse 12 157 100 17.5 0.02

Фактор очистки с учетом потерь 423

Примечания: а Центрифугирование и другие процедуры, занимающие продолжительное время при препаративной работе. 8 Длительное нанесение на колонку разбавленного в пять раз образца (см. текст). 3 На данной стадии параметр не определяли.

Объединенные фракции (Рис.7-2) дополнительно концентрировали и проводили повторную гель-фильтрацию на Superóse 12 в буфере Ж. В результате хроматографии активность разделилась на два пика - а и

в (Рис. 7-3). Расчет показал, что пик а соответствует выходу белков с молекулярной массой 112 кД и пик в - 33 кД (Рис.7-4). Следует отметить, что 'Ууд для тимидинкиназы в пике а была в 2 раза больше. чем в пике в, и превышала активность фермента в экстракте в 17.5 раз (Табл.4).

Электрофорез в денатурирующем ПААГ выявил идентичность полипептидного состава белков пика а и последовательных фракций 6i-e3 пика в (Рис.8-1). При этом белки, выходящие из колонки между пиками. имели резко отличный полипептидный состав (Рис.8-1, дорожка б). Отметим, что активность тимидинкиназы среди фракций пика в была наибольшей в е2, а на электрофореграмме этой фракции хорошо заметен только дублет полипептидов в области 30 кД.(Рис.8-1, дорожка е2). Вычисления с использованием маркерных белков показали, что верхняя полоса соответствует 33 кД, а нижняя - 32 кД полипептидам (Рис.8-2). Слабые полосы, расположенные в верхней части et-e3 и других дорожек ближе к маркеру 67 кД (см. Рис.8-1), выявляются при окраске геля AgN03 в отсутствии белка, но при наличии 2-меркаптоэ-танола. В связи с этим можно считать, что полученный препарат тимидинкиназы достаточно хорошо очищен и практически гомогенен во фракции в2.

Сопоставляя данные гель-фильтрации препарата тимидинкиназы (Рис.7-3,4) и денатурирующего электрофореза в ПААГ (Рис.8) можно сделать вывод, что, по крайней мере in vitro, фермент существует в форме тетрамера, состоящего из мономеров с молекулярной массой 30 кД, и собственно мономера. Наличие двух полипептидов близких молекулярных масс - 33 кД и 32 кД - может быть обусловлено тем, что либо легкий является продуктом специфического протеолиза более тяжелого полипептида, либо более массивный - модифицированная форма фермента (например фосфорилированная). Следует отметить, что одна из двух нативных форм тимидинкиназы Tetrahymena thermophila - 59 кД фермент - также состоит из 30 кД субъединиц, которые мигрируют в виде дублета при денатурирующем электрофорезе в ПААГ (Klnyanjul, Pearlman 1991).

Процедура выделения фермента, представленная в этом разделе, основана на коллигативных свойствах белковых молекул, определяемых суммарным зарядом и различиями в молекулярной массе. При этом степень очистки фермента с учетом контролируемых потерь составила 420 (Табл.4). Несомненно, что потери активности были и при хроматографии в системе FPLC, поскольку процесс проходил при комнатной температуре. Показатель степени очистки тимидинкиназы в связи с её

высокой лабильностью сильно зависит от длительности процедуры. Приемы аффинной хроматографии, как правило, не требуют большой предварительной работы с препаратом и поэтому занимают непродолжительное время. Кроме того, специфичность применяемого лиганда к выделяемому ферменту позволяет значительно повысить степень очистки. Рассмотрим результаты, полученные с помощью этого метода.

Аффинная хроматография. В работе использовали три варианта аффинных матриц с различным типом лигандов.

В первом варианте применяли матрицу с групповой специфичностью Blue Sepharose CL-6B. Лиганд этой матрицы - проционовый краситель Clöacron Blue F3GA - имеет сродство к пурин-связывающим белкам. Фракцию 60-90 обессоливали и наносили на колонку с голубой сефарозой. После промывки буфером В связавшийся с колонкой белок элюировали 400 мМ раствором KCl. Полученный препарат содержал практически всю тимидин-фосфорилирующую активность, при этом доля тимидинкиназы составляла 26%. Конкурентная аффинная элюция не дала положительных результатов. В среднем степень очистки фермента на голубой сефарозе была равна 9 в сравнении с фракцией 60-90 (Рис.9. вариант А). Очевидно, отсутствие избирательности в процессе связывания матрицы с ферментом определило столь же неизбирательную элю-цию.

Во втором варианте была использована матрица дТ(3'НН2)-АсА 54 с индивидуальной специфичностью к тимидинкиназе, поскольку лиган-дом служил аналог субстрата - дТ(3'Ш2). Аффинные матрицы на основе других модифицированных молекул тимидина применяли при выделении тимидинкиназы. в частности из клеток острой миелоцитарной лейкемии человека и клеток HeLa (Lee. Cheng 1976; Sherley, Kelly 1988). Белок фракции 60-90 после обессоливания наносили в буфере В на колонку с дТ(3'Ш2)-АсА 54. Связавшийся с матрицей белок (70% тимидин-фосфорилирующей активности) после промывки исходным буфером элюировали 5 мМ тимидина, затем 400 мМ KCl без тимидина. В результате во фракции, замещенной субстратом, было 4% белка с активностью тимидинкиназы в 2140 раз выше, чем в исходном образце. После концентрирования этой фракции 'Ууд обычно снижалась и превосходила исходную лишь в 400 раз. В среднем коэффициент очистки был равен 1270 (Рис.9, вариант Б). Этот показатель сильно зависит от точности определения концентрации белка, когда речь идет об исчезающих его количествах. На наш взгляд, такая "игра" малых цифр может быть причиной слишком высоких коэффициентов очистки при аффинной хроматографии (Lee, Cheng 1976).

5 х 10a IU>

10 ...........

9 П

4956 в

и пт

2 747 7- ....... и

5. 6 <p'-s:?>........ : п * 1 '

2 5- ✓ ' /! '•

13 4- '; о" / ;

3.9 / 3- ✓ 1 •

1 2-

Варианты аффинной хроматографии

РИС. 9.

ШЩЩШШР

IS 30 45 60 75 90 Расстояние от дно да, мм

Рис. 11.

Рис. 10.

Элоенти *ралции.-Трис/КО/тииидин

1. 0.02 М/10 им

2. 0.1 М/50 иМ

3. 0.1 U/S0 иМ/ /100 икМ

4. 0.2 М/0.1 М

5. 0.2 М/0.1 М/ /300 икМ

щттт ■ t

■ -гХГ

5 10 20 Время, мин

Рис. 12.

мшш

■ J 34

• ■ • jN;V _57

'"■iñ 43

" ' *

•" Г: 20.1

- : ¡4.4

Рис. 9. Результаты аффинной хроматографии белков фракции 60-90. А - хроматография на Blue Sepharose CL-6B. Б - хроматография на дТ(3'.ЧН2)- АсА 54. 3 - хроматография на дТ(5'NH2)-Sepharose. 1 - исходная активность тимидинки-назы во Фракции 60-90. 2 - активность тимидинкиназы после элвции с аффинной матрицы.

Рис. 10. Денатурирующий электрофорез в ПААГ фракций после аффинной хроматографии на дТ(5'NHZ(-Sepharose. Указана молекулярная масса двух маркерных (Ml белков, стрелкой отмечено положение полипептида тимидинкиназы (наиболее ярко представлен в 3-й фракции). И - исходный препарат.

Рис. И. Изоэлектрическое фокусирование препарата с тимидин-фосфорилирующей активностью из проростков кормовых бобов. Расположение в геле маркерных белков (-а-) с известными значениями pi (см. на оси значений оН): Распределение тимидин-фосфорилирующей активности (-*-). ассоциированной с белками, сфокусированными в геле.

Рис. 12. фосфорилирование полипептидов тимидинкиназы из проростков кормовых бобов, фракция SP/150. В среду инкубации не добавляли экзогенных протеинки-наз. В 200 мкл смеси содержалось 38 мкг белка. 10 мМ Mg2*. 20 мкм tК3 Р1АТФ. 12.5 мМ NaF. Смесь инкубировали 5. 10. 20 мин. добавляли 10 мМ немеченого ATO на 15 мин и осаждали белки 103! ТХУ. Электрофорез в градиентном С10-20%) денатурирующем ПААГ. экспозиция пленки 4 сут при -70 °С.

В третьем варианте также была использована матрица с индивидуальной специфичностью - дТ(5'Щ, )-Sepharose. Аналогичный сорбент применяли для. очистки тимидинкиназы из Т. thermophila (Kinyanjul, Pearlman 1991). После обессоливания белки фракции 60-90 наносили на микроколонку (0.64 мл), промывали буфером Г и элюировали сначала 100 мМ KCl , а затем 100 мМ KCl' с 100 мкМ тимидина. Основная масса белка выходила из колонки при солевой элюции с активностью тимидинкиназы в три раза меньшей, чем в исходной фракции 60-90. В препарате, вытесненном с аффинной колонки субстратом, было 2% от нанесенного на колонку белка с 'Ууд в 50 раз больше исходной (Рис.9, вариант В). Денатурирующий электрофорез в ПААГ (Рис.10) выявил среди других полос зону, характерную только для фракции, замещенной тимидином, и соответствующую 33-кД полипептиду, что совпадает с изложенными выше данными о полипептидном составе препарата тимидинкиназы.

Воспроизводимость методов аффинной хроматографии была не высокой. особенно при увеличении объема колонки.

Проведенные исследования позволили:

1. Сделать вывод о том, что суммарная тимидин-фосфорилирующая активность in vitro определяется тимидинкиназой и НФТ. Условия первичного экстракта как правило благоприятствуют преобладанию НФТ активности, поскольку экстракты, в отличие от ситуации in situ. обычно богаты фосфатазами и АТФ фосфогидролазами, которые снабжают НФТ субстратом реакции.

2. Получить очищенный препарат тимидинкиназы. свободный от НФТ активности. По-видимому это первое успешное выделнние фермента из высших растений. Материальное подтверждение тимидинкиназной активности резко увеличивает значимость данных о связи фермента с пролиферацией клеток.

5. Основные физико-химические свойства тимидинкиназы и кинетика ферментной реакции. Для того, чтобы провести сравнение тимидинкиназы. полученной из проростков кормовых бобов, с аналогичными ферментами из клеток организмов других систематических групп, необходимо изучить основные свойства фермента.

Некоторые Физико-химические свойства тимидинкиназы. Для белков с тимидин-фосфорилирующей активностью выявлены две изоэлектри-ческие точки равные 5.5 и 9.5. Область с пиком при значении pi 9.5 содержала около 70% от суммарной активности в геле (Рис.11). Следует отметить, что во фракции SP/150, которую подвергали ИЭФ, доля функциональной тимидинкиназы составляла около 77%. Это позволило

заключить, что величина pi основной формы фермента в данном препарате равна 9.5. Известно, что тимидинкиназа, обнаруженная в цито-золе эмбриональных клеток цыпленка, характеризуется изоэлектричес-кой точкой, равной 9.7 (Kit et al. 1975). тимидинкиназа из клеток китайского хомячка (клон 2с-16) имеет значение pi около 9.0 (Томи-лин и др. 1985), а фермент из цитозоля клеток печени плода крысы-pl, равное 8.3 (Baron et al. 1990). Принимая во внимание ширину пика и наличие "плеча" в области значений pH 7.5 - 8.5 (Рис.11), можно предположить существование нескольких изоферментов с близкими величинами pi в щелочной области. Множественные формы тимидинкиназы были обнаружены у Physarum polycephalim, причем варианты с низкими значениями pl. характерные для S-периода клеточного цикла, являлись фосфорилированными и после обработки фосфатазами превращались в варианты с высокими значениями pl (Gröbner 1979; Gröbner, Loidl 1984). Следует отметить, что в клетках асцитной опухоли Эр-лиха только "щелочные" изоферменты со значениями pi 6.9 и рГ 8.3 отвечали за изменение активности тимидинкиназы в клеточном цикле (Не et al. 1991), причем предполагалось, что форма с изоэлектри-ческой точкой, равной 8.3. является дефосфорилированным вариантом более "кислой". На культивируемых клетках человека линии HL-60 показано. что фосфорилированная тимидинкиназа более активна, однако гиперфосфорилирование фермента в митозе приводило к падению активности (Chang, Huang 1993; Chang et al. 1994).

Возможно, что в нашем случае также существуют фосфорилирован-ные варианты, но фосфатазы модифицируют фермент во время очистки, обогащая препарат дефосфорилированными, более "щелочными" формами. Эксперименты показали, что полипептиды тимидинкиназы во фракции SP/150, составляющие характерный дублет при • электрофорезе в ДДС-ПААГ. способны фосфорилироваться in vitro (Рис.12).

Первый пик (Рис.11) с изоэлектрической точкой 5.5. занимающий около 30% от суммарной тимидин-фосфорилирувдей активности в геле, вероятно принадлежит НФТ. поскольку, как уже отмечалось, во фракции, которую подвергали ИЭФ (фракция SP/150). активность НФТ составляла 23%.- Аналогичные "кислые" изоэлектрические точки, равные 4.1 и 5.0, были определены для двух изоформ НФТ эмбриональных клеток цыпленка и двух субьединиц H®f из корнеплодов моркови (pi -4.1 и pi = 5.0) (Kit et al. 1975: Brunngraber 1978).

Таким образом, тимидинкиназа из проростков кормовых бобов имеет значение pi в щелочной области pH, что характерно для этого фермента из клеток многих организмов.

Фермент из проростков Vicia faba быстро инактивировался при 55 0С. Препарат тимидинкиназы (фракция SP/150) терял более 80% активности в течение 3 мин (Рис.13) в отличие от фермента фиброблас-тсз мыши. Относительную термостабильность тимидинкиназы клеток животных и бактерий использовали в некоторых приемах очистки (Rohde. Lezius 1971; Bresnick 1978). Аналогично проросткам кормовых бобов, активность тимидинкиназы из яйцеклеток морского ежа сохранялась лишь на 30% после 5 мин прогревания при 50 0С (Nagano, Mano 1968). Низкая термостойкость тимидинкиназы растений может служить признаком. отличающим еб от НФТ. активность которой сохранялась после 20 мин прогревания при температурах до 65 0С (Mallin. Fites 1978).

Кинетика Ферментной реакции. На разных стадиях очистки, зависимость скорости реакции от количества фермента в реакционной смеси имела практически линейный характер при широком диапазоне концентраций белка (Рис.14-1). Однако при определении кинетических-параметров для полного насыщения фермента субстратом использовали низкие концентрации белка. Изучение зависимости скорости реакции от времени (Рис.14-2) показало, что для различных концентраций ти-мндина предстационарная фаза в основном завершается через 15 мин. поэтому "начальную" скорость определяли на участке 15-30 мин.

Тимидинкиназа клеток млекопитающих и £. coli - фермент с ал-лостерической регуляцией (Bresnick 1978: Chen M.S., Prusoff 1978: Cheng 1978). одним из активаторов которого служит АТФ. Для фермента Е. coll кооперативный эффект наблюдался лишь после димеризации субъединиц. При высоких концентрациях АТФ кинетика реакции нормализовалась и подчинялась уравнению Michaelis - Men ten. Выше было отмечено, что после повторной гель-фильтрации на Superóse 12 фракция. содержащая тимидинкиназу в форме тетрамера. в два раза активнее. чем Фракция, обогащенная мономером. Можно предположить, что аллостерический способ регуляции характерен и для фермента из проростков кормовых бобов. Этот вопрос требует отдельного экспериментального изучения. Б данной работе значение Кн фермента для тими-дина определяли при высоких концентрациях АТФ. что отчасти должно было снять аллостерические эффекты.

Полученные величины скоростей реакции имели гиперболическую зависимость от концентрации субстрата (Рис.15-1). Для вычисления Км строили графики, связывающие V и концентрацию тимидина, с использованием различных линейных преобразований уравнения Michaelis - Men ten (Рис.15-2.3,4). Значение Км. определенное методом Llnewe-aver - Burk (Рис.15-2). было равно 27-30 мкМ. По другому линейному

Время, цин

Рис. 13.

Рис. 13. Температурная инактивация фермента. Препараты тимидинкиназы из кормовых бобов и фибробластов мьши перед определением активности прогревали при 55 °С в течение указанного времени.

Рис. 14. Зависимость активности тимидинкиназы от количества фермента _и продолжительности реакции. ©-1- фракция 60-90 после обесеоливания. -2- фракция SP/150 после хроматографии на SP-Toyopearl. На оси X дано количество белка, мкг на 200 мкл. скорость реакции измеряли при разных концентрациях тимидина: 1- 20 мкМ. 2- 10 мкМ. 3- 5 нкМ. i- 1.25 мкМ.

Рис. 15. Зависимость скорости реакции от концентрации тимидина. Представлен характерный эксперимент(Т); количество белка - 8.3 мкг на 100 мкл. АТФ -10 мМ, Mg2*- 10 мМ. На рисунках© . QJ. ® даны графики различных линеиных преобразований уравнения Mlchaells-Menten. 1ДТ] - концентрация тимидина. В реакции использовали препарат после первой гель-фильтрации на Superóse 12.

Рис. 16. Зависимость активности фермента от рН. Щ1--значения активности при использовании MES-буфера: 2- активность в буфере Bls-Trls-Propane. ©Представлен график зависимости lg скорости реакции от рН и показан способ определения значений рК„.

Рис. 14.

РИС. 15.

Рис. 16.

варианту этого графика (Рис.15-4), а также по графику Eadle -Hofstee (Рис.15-3). были получены близкие величины Кн - 37.5 мкМ и 36.7 мкМ соответственно. Среднее значение Кн тимидинкиназы для ти-мидина равно 34 мкМ. Хотя эта цифра является крайней в ряду для ферментов из других источников (Табл. 6), тем не менее она почти на порядок меньше величин "нуклеозидных" Ки для нуклеозидфосфот-рансфераз (Grlvell, Jackson 1976: Brunngraber 1978). Несомненно, что значения констант зависят от рН, ионной силы, присутствия ингибиторов и температуры. Поскольку перечисленные параметры варьировали в разных работах, то приведенные величины Ки (Табл. 6) в основном полезны для ориентировки.

Каталитические свойства тимидинкиназы - влияние АТФ и катионов. Установлено, что при изменении концентраций АТФ и тимидина скорость ферментной реакции определяется в основном тимидином (Табл. 5). По предварительным расчетам значение Кц для АТФ равно 0.58 мМ. Очевидно, субстратом для тимидинкиназы является комплекс Nig2*-АТФ. Ионы Са2* и Cd2*. заменяя Mg2* в эквимолярном комплексе с АТФ, ингибировали тимидинкиназную реакцию (Табл. 5). При этом степень ингибирования была почти в шесть раз меньше, чем при двукратном избытке Mg2* по отношению к АТФ (при низких концентрациях тимидина и АТФ). Ионы натрия повышали активность: 245 мМ NaCl увеличивали V на 44% при рН 5.6 и на 10% при рН 7.96 (концентрации тимидина и Mg2*-АТФ были 29 мкМ и 6 мМ соответственно). Полученное значение Кн для АТФ соответствует пределам варьирования аналогичных констант для ферментов из клеток регенерирующей печени крысы -2.6 мМ и миелоцитарной лейкемии человека - 0.2 мМ (Bresnlck 1978; Cheng 1978).

Таблица 5. Зависимость скорости тимидинкиназной реакции от концентрации субстратов и ионов двухвалентных металлов.

Концентрации субстратов и ионов V. мкМ/мин

Тимидин, мкМ АТФ, ММ Mg2*. ММ Са2\ мМ Cdz\ ММ

43 5 5 0 0 0.0182 .

20 10 10 0 0 0.0118

1.25 10 10 0 0 0.0006

1.25 0.625 0.625 0 0 0.00029

1.25 0.625 1.25 0 0 0.00002

1.25 0.625 0.625 0.625 0 0.00013

1.25 0.625 0.625 0 0.625 0.00012

Каталитические свойства тимидинкиназы - оН-зависимость Ферментной активности. Использованные в работе буферные растворы МЕБ и В1з-Тг1з-Ргорапе. вплоть до концентрации 250 мМ. не изменяли активности тимидинкиназы при фиксированных величинах рН. Максимальную скорость ферментная реакция имела при значениях рН в диапазоне 7-8 (Рис.16-1). Условным "оптимумом" было выбрано значение 7.5. Зависимость активности фермента от рН изучали при достаточно высоких концентрациях тимидина для постоянного насыщения фермента. В таких условиях влияние рН на V определяется состоянием ионизации

Таблица 6. Некоторые свойства тимидинкиназ из разных организмов.

Организм или популяция клеток Структура фермента и молекулярная масса, кД PI Кц ДЛЯ тимидина, мкМ Источник данных®

нативная форма полипептиды (ДДС-ПААГ и др. методы)

Vicia faba тетрамер иг "дублет" полипептидов 32, 33 9.5 34 Собственные данные

Orthopoxvirus (вирус коровьей оспы) гомотет- рам8ее полипептид 20 _б - 1

Escherichia coli гомодимер полипептид 46.5 5.8 — 2

Escherichia coli - . - - 17 3

Escherichia coli олигомер (тетрамер) полипептид 23.5 — — 4

Physarum polyce-phalum полипептид 35 5.9 6.3 6.7 7.2. 7.8 5

Tetrahymena py-riformis — — 16 6

TetrcLhymena thermophila форма 1 гомодимер 80 полипептид 42 - - 7

форма 2 гомодимер "дублет". полипептидов 30 7

Strongylocentro-tus intermedius 66 5.2 8

Примечания: а Источники данных: 1 - (Black, Hruby 1990), 2 -(Rohde, Lezlus 1971), 3 - (Chen, Prusoff 1978), 4 - (Black, Hruby 1991), 5 - (Gröbner. Loldl 1984), 6 - (Fink 1980), 7 - (Klny-anjui, Pearlman 1991), 8 - (Терентьев и др. 1990). 6 В цитируемой работе параметр не определяли.

Таблица 6. Некоторые свойства тимидинкиназ из разных организмов. (Продолжение)

Организм или популяция клеток Структура фермента и молекулярная масса, кД pi К„ для тимиди-на, мкМ Источник дан-ныха

нативная форма полипептиды (ДДСгПААГ И др. методы)

Клетки эмбриона цыпленка, цито-плазматический Фермент _б 9.7 1

Клетки китайского хомячка, клон 2с-16 9.0 2

Фибробласты мыши, линия иак-. митохондриаль-ный Фермент 13 3

Клетки регенерирующей печени крысы 81 5.6 4

Клетки печени плода крысы олигомер 71 полипептид 24 8.3 — 5

Клетки линии НеЬа человека — полипептид 24 — 1.5 6

Клетки линии НеЬа человека тетрамер 96 полипептид 24 "" 7

Клетки линии НеЬа человека — полипептид 24 — 0.26 8

Миелоцитарная лейкемия человека, цитоплазма-тический фермент 90 2.6 Ö

Примечания: а Источники данных: 1 - (Kit et al. 1975), 2 - (То-милин и др. 1985). 3 - (Berk. Clayton 1973), 4 - (Bresnlck 1978), 5 - (Baron et al. 1990), 6 - (Chang et al. 1994), 7 -(Sherlev. Kelly 1988a), 8 - (Sherley; Kelly 1988b). 9 - (Cheng 1978). 6 В цитируемой работе параметр не определяли.

фермент-субстратного комплекса. По графику Dixon (Рис.16-2) можно определить значения показателей кислотной диссоциации фермент-субстратного комплекса pfCe3l и рКез2, отвечающих за "кислую" и "щелочную" ветви графика pH - активность. Для тимидинкиназы проростков кормовых бобов рКез1 = 6.О и рКеаг = 8.6, что соответствует значениям рКа аминокислотных остатков гистидина и цистеина. Известно (Robertson, Whalley 1988), что наиболее постоянный мотив консервативного участка аминокислотной последовательности тимидинкиназ нескольких представителей герпес-вирусов, отвечающего за

связывание с нуклеозидом, содержит остаток гистидина. Кроме того, важную роль в обеспечении каталитической активности фермента выполняет остаток цистеина, замена которого приво дит к утрате тими-динкиназной функции. Несомненно, что выяснение структуры активных центров и значения указанных аминокислот для.тимидинкиназы бобов требует полной расшифровки аминокислотной последовательности.

Таким образом, полученные характеристики позволяют рассматривать тимидинкиназу из проростков кормовых бобов, как нового представителя единого семейства. Следует подчеркнуть, что сходная оли-гомерная организация нативной формы фермента обнаружена у большинства организмов (Табл. 6).

6. Соотношение тимидинкиназной и НФТ активностей in vivo. Имея в руках материальное доказательство существования тимидинкиназы в высших растениях, можно подходить к выяснению следующего вопроса - каково соотношение активностей и разделение функций тимидинкиназы и НФТ in vivo ?

Экспериментальный подход для решения названной задачи был основан на двух фактах: 1. -Различные.нуклеозиды конкурируют in vitro с тимидином за связывание с ферментом в реакции, катализируемой НФТ: 2. АТФ, безусловно, необходим для тимидинкиназной реакции.

В качестве объекта для всех экспериментов, приведенных в этом разделе, была использована суспензионная культура клеток сахарной свеклы, имеющая стабильные параметры роста и высокую степень про-лиферативной активности.

Кинетика поглощения тимидина и превращения в тимидин-фосфаты и ДНК. Прежде чем выяснить влияние различных нуклеозидов на фосфо-рилирование тимидина in vivo и его включение в ДНК, необходимо определить динамику этих процессов без дополнительных воздействий. Начать следует с поглощения тимидина.

При 10 мкМ тимидина в среде его суммарная внутриклеточная концентрация уже через 3 мин достигает достаточно стабильного уровня, практически равного концентрации снаружи (Рис.17-1). Аналогичные результаты были получены при инкубации клеток с 5 мкМ тимидина - за 3 мин внутриклеточная концентрация достигала 5.5 - 6.4 мкМ и стабилизировалась. С увеличением концентрации проявлялось насыщение процесса, хотя и сохранялась его быстрота, как это показано для 100 мкМ (Рис.17-2).

Следует отметить, что фосфорилирование тимидина в клетках было так же быстрым, уровень фосфатов достигал равновесного состояния уже через 3 мин (Рис.17-2). В противоположность относительно

ЯОЯЫЛОЬТ) ОС X X

ОТИ Г31= я о ж о I •

о асе • гиб

4 П> ЙЮи

о с*» зэ о—- ы о -о ЗЗЯ *с 50' О

ОЭХ1-П нж со "<о> ж Е ж ятэ -о Ь ж

О Ж--*Ж *-ГО О ГО

О X СЛСС оч*< н ьш м» о о к

ГОЖ —

Ь Ч • Я П> 0> £г о ч £ ж

(5 СО

§• ыхМ-хо X X4-7 о т х в>ьж жь

Ш .С Ж Ь X Ж О

о шхьое •о X' ^ВП) рхж X

ХОМ О XX сн эож><» Хоьо ж ъ о-о 5 -з 1 X кг — ж о Е ь. х «< Ч и ж я> оэео*<х •о Ч^у^^Т! —

О X ПЧЛЯЗ О I О Ы X ж^^о эн Б я х ж х ш х

ХОЬЕО» X

5 НЬ о ж го*о X

X (В I X X XX

• кеь: о>ж ПО <0 о оп в> хона ж

ж—Ж" нго » з э о х ж ж -а 1это* —о го О ГО I ш со со ю а: ч го*о

О Ы О Ч X X 0>

ь»« х ье х ч о о> х в: го ЬаЕЧСка' X X "О X X X X 0> X X м X ол о >•

о х ж х ш ьь-о^ ж отэ о л х ч

о о Б о ооч ж »»ж I сп"< I

Суммарное поглоиение |5Н)«Т, пмоль/мг сирой массы

Фос*аты тимидина, пыодк/мг сырой массы

X си Ч-ГЯТ) о ж о о ож*< ж ж ж ш со о ь о с • 0> I ЯГ' ГО .-«XX МО ч Ж(КЭх В) Оки н о оса со •о СЛ го го •

СО № О их Ж С Ш >МР!

ж ж ч и зга ъ >■

Ж О X I № ГО Ж Ж X С» I С 4 В> Ю X Х<< X о ь ОЬХ О» X ж X О Ж 0) сох и очпох о о о* рз го р> •о ■ X X о

ЬОЯ И —(и СХ

X X лХ "о-о ж о эМЧгпж ю

(В*0 О Л "О ы

ЧОП СОЬя I яо р> о ь о> — ч со х ч о ш" ж о с» же X ХСОЖ ¡3 ГО О X го ж

ГС О О О Ж Ж ЕС

чех ОХР- н

X О «< НЬэ к

ш*а сгх—«жэе

Ф50

■оьно сооь

Р>Х

тэ со ас о ж х

X О «-5 О О СП £ I ООЕёI ф СПШ ПбиХО ихознох о

•О X X х Е

-сагоз з:«< V'

ХФ'ОЬ *о со зс Н X ГО I о X О-О ь со ьгоЗ соси ш

55оЬа Сл>ь» X О Ч X X о

Обратная скорость, мг мин/пмоль

Д1дТ-ФосФаты1/Д1поглошение дТ1

о к>

Э о о го юогуз: ^Пвх Ьэ О» Ы

«-■го о о ь X <г хтэ н х х о

ОЧХТ5 X X

тз ь й> а х х

0 0)5 ЖТЭ Е О Н I I 1X1»

- 9Б -

быстрой кинетике поглощения тимидина и его фосфорилирования. включение [3Н]дТ в ДНК при любых концентрациях имело линейный характер по крайне мере в течение 15 мин инкубации.

Обобщение данных показывает отсутствие больших отклонений при определении кинетических констант в различных экспериментах. В целом величины Кн для поглощения тимидина при 20 °С совпадают больше, чем Vmax (Табл. 7). Изучение влияния низкой температуры позволило рассчитать энергию активации процесса поглощения, она равна 66.7 кДж/моль.

Для оценки кинетических констант фосфорилирования тимидина in vivo использовали величины скоростей, рассчитанные для первых 3 мин процесса. Поскольку внутриклеточная концентрация тимидина достигала стабильного уровня в это же время, то для упрощения вычислений использовали значения, равные половине 3-мин поглощения. Для кинетики включения [3Н]дТ в ДНК, в связи с линейным характером процесса, скорости определяли для первых 10 мин инкубации и соотносили их с полной концентрацией тимидин-фосфатов в клетках. Кажущиеся кинетические константы для фосфорилирования тимидина in vivo и его включения в ДНК представлены в Таблице 7.

Анализируя кривую зависимости отношений прироста фосфорилиро-ванного тимидина к поглощенному от его внеклеточной концентрации (Рис.18-1) можно отметить точку (100 мкМ), в которой ход кривой резко изменяется. В дополнение к этому график зависимости скорости фосфорилирования тимидина от его концентрации, построенный в координатах Лайнуивера и Бэрка, показывает, что процесс подчиняется другой зависимости при концентрации тимидина свыше 100 мкМ (Рис.18-2). Если оценивать величины Кн, используя различные участки аппроксимированных линейных зависимостей: все использованные концентрации, отрезок 5 - 100 мкМ и 5 - 200 мкМ, но без точки 100 мкМ, то можно получить следующие константы - 53, 27 и 292 мкМ, соответственно (Рис.18-2).

Данные указывают на возможность существования in vivo двух кинетически различающихся механизмов вовлечения тимидина в метаболизм клетки. При относительно низких концентрациях (до 100 мкМ) нуклеозидная Кн фосфорилирования тимидина сходна с вычисленной нами для тимидинкиназы из проростков кормовых бобов - сравните 27 и 34 мкМ. При концентрации тимидина выше 100 мкМ его фосфорилирова-ние в клетках ускоряется и fCM процесса резко возрастает (возможно выше 292 мкМ), что предполагает подключение другого механизма, наиболее вероятно - НФТ.

Таблица 7. Кинетические константы® для поглощения тимидина. фос-форилирования и его включения в ДНК суспензионной культурой клеток сахарной свеклы.

Процесс Кажущиеся кинетические константы6

Км- мкМ у пмоль/мг сырой'массы мин

Поглощение тимидина (20 °С): пятидневные клетки восьмидневные клетки девятидневные клетки 28.82 ±0.7 24.84 ± 0.52 28.0 ±2.2 16.81 ± 0.02 11.55 ± 0.64 12.47 ± 0.85

Поглощение тимидина (2 °С): восьмидневные клетки 32.96 ± 1.91 1.93 ± 0.02

Фосфорилирование тимидина (20 °С): восьмидневные клетки 53.17 ± 1.72 3.55 ± 0.57

Включение тимидина в ДНК (20 °С): восьмидневные клетки 2.76 ± 0.13 0.18 ± 0.04

Примечания: а Константы рассчитаны по результатам различных экспериментов. в которых тимидин и его метаболиты экстрагировали кипящей ТХУ, либо холодными растворителями с последующим фракционированием. 6 Даны средние значения ± стандартные ошибки.

Раздвоение значений К„ (16 мкМ и 133 мкМ) в зависимости от концентрации нуклеозида было выявлено Fink (1980) при анализе кинетики фосфорилирования тимидина в экстрактах Tetrcúiymena. piriformis. Большая из указанных констант, по мнению автора, относится к НФТ. Аналогичным образом выглядит кинетика образования ТТФ из экзогенного тимидина в клетках гепатомы N1S1 (Jackson 1978).

Конкурентное влияние нуклеозидов на процессы поглощения и метаболизма тимидина in vivo. На Рис. 19 показано влияние уридина, аденозина и аналога тимидина - (5'Ш2)дТ на суммарное поглощение и метаболизм тимидина в клетках. При 5 мкМ тимидина и равной концентрации других нуклеозидов в среде (Рис. 19-1) воздействие на все определявшиеся параметры оказывал только уридин. Для данного варианта провели оценку ожидаемого количества тимидина, которое должно быть обнаружено во фракциях фосфорилированных продуктов и ДНК. В расчетах использовали значения Ки и Vmax для фосфорилирования тимидина и включения в ДНК (Табл. 7) и наблюдаемое в опыте значение

поглощения тимидина. Ожидаемые величины, выраженные в процентах от контроля, были даже меньше, чем экспериментальные, но различия были недостоверны (Р < 0.05). Следовательно, влияние уридина на метаболизм является вторичным и вызвано лишь ограничением в поглощении тимидина в этих условиях. Отметим, что уровень растворимых фосфатов тимидина в вариантах с 5 мкМ аденозина и (5'Ш2)дТ возрос по сравнению с контролем (Рис.19-1).

При ЮО-мкМ концентрациях тимидина и конкурирующих нуклеози-дов в среде наблюдали ощутимое падение поглощения тимидина в вариантах с добавкой уридина или аденозина (Рис.19-2). Однако сопутствующие процессы превращения тимидина в нуклеозид-фосфаты и включение его в ДНК снижались значительно слабее. Ожидаемые величины метаболизма тимидина, оцененные с помощью кинетических констант и измеренных значений его поглощения, показывают, что ограничение в транспорте тимидина^вызванное уридином и аденозином,полностью определяют кажущееся негативное влияние этих нуклеозидов на метаболизм тимидина.

Следует отметить, что аналог .тимидина - (5'Щ>)дТ - слабо влиял на поглощение (Рис.19). Мы предполагаем, что аминогруппа сильно изменяет заряд молекулы тимидина и тем самым делает необходимым использование другого транспортного пути для (5'NH2)дТ. Другие аналоги тимидина. получаемые замещением метальной группы у пятого атома углерода пиримидинового гетероцикла, как правило используют общую с пиримидиновыми нуклеозидами транспортную систему (KamboJ. Jackson 1985; Sugiyama. Komamine 1994; Wu, King 1994).

Чтобы исключить влияние изменений в транспорте на результаты, показывающие воздействие нуклеозидов на метаболизм тимидина, данные были представлены, как процент от суммарного поглощения (Рис.20). Эффективность такого подхода видна на Рис.20-2. Можно отметить стабильный относительный уровень фосфорилирования тимидина и его включения в ДНК в клетках контрольного варианта и при +2 °С, в последнем случае скорость транспорта в шесть раз меньше (см. таблицу 7).

Из Рис. 20 видно, что уридин. аденозин и (5'Шг)дТ при концентрациях 5 мкМ и 100 мкМ и равных концентрациях тимидина не ин-гибируют фосфорилирование тимидина и его включение в ДНК. Напротив, все нуклеозидные добавки, за исключением ЮО-мкМ (5'Ш2)дТ, увеличивали на 3-4% содержание растворимых фосфатов тимидина в культивируемых клетках. Коль скоро уридин и аденозин не являются конкурентами в процессе фосфорилирования тимидина и все эти нукле-

1 ) 1 1 Суммарно« поглошете

r\\J Ргс1*орниие *ос«аш гимнами«

Контроль Урилип (5*жртимиди>1 Аленозин

Контроль Ури дин (S*W|) тими дин Аденозин

РИС. 19.

Q Растворимые «ос«втм тимидина

J) ■ ДНК

Контроль Ури дин ($?*утимивин Аденозин

+2*С Контроль Ури дин is)*v™UMAMH Аавнозин

РИС. 20.

1.5-

1.0-

» 0.5

Г771 2 мин КЗ в мин

Контроль Гилоясия АленоЗин

РИС. 21.

160-

Контроль Гипоксия Аденозин Гипохс.+Аден.

Рис..22.

Рис. 19. Влияние уридина. аденозина и (S'NH2)-тимидина на поглощение и метаболизм тимидина в суспензионной культуре клеток сахарной свеклы. Клетки инкубировали с 5 мкМ® [3Н1 -тимидина (33 кБк/мл) или 100 мкМ© (690 кБк/мл) и равными концентрациями других нуклеозидов в течение 10 мин.

Рис. 20. Влияние уридина. аденозина. (5*NH2)-тимидина и низкой температуры на метаболизм тимидина в суспензионной культуре клеток сахарной свеклы. Ланные представлены как процент от суммарного поглощения тимидина в каждом варианте. Экспериментальная процедура дана под Рис. 20. Ш- 5 мкМ концентрации тимидина и нуклеозидов в среде.(2) - 100 мкМ концентрации.

Рис. 21. Изменение внутриклеточного количества АТФ в суспензионной культуре сахарной свеклы в условиях гипоксии и под влиянием аденозина и тимидина. Количество АТФ определяли в ТХУ экстрактах люциферин-люциферазным методом. Измерения проводили: после 20-мин гипоксии, спустя 2 и 8 мин после добавки нуклеозидов (200 мкМ).

Рис. 22. Число зерен серебра над ядрами в автографах клеток суспензионной культуры сахарной свеклы после кратковременной инкубации с [3Н]-тимидином. Клетки инкубировали с меченым тимидином (0.078 мкМ. 185 кБк/мл) в течение 10 мин в аэробных условиях или при гипоксии с добавкой 200 мкМ немеченого аденозина или без добавки.

озиды являются субстратами для НФТ. то это указывает на малую функциональную значимость названного фермента. По крайней мере это справедливо при концентрациях тимидина в среде до 100 мкМ.

Увеличение доли растворимых фосфатов тимидина относительно суммарного его поглощения в присутствии любых концентраций уридина или аденозина (Рис.20) можно объяснить за счет частичного ингиби-рования деградации тимидина. В частности, такой эффект был отмечен для аденозина (Zilbersteln et al. 1973) и 5-фтор-2'-дезоксиуридина (Howland and Yette 1975). Следует отметить, что (5'Ш2)дТ при 5-мкМ и 100-мкМ концентрациях оказывал противоположное влияние на фосфорилирование тимидина в клетках (Рис. 19 и 20). Рассматриваемый аналог имеет специфические взаимоотношения с тимидинкиназой, снимая ингибирующий эффект конечного продукта всей цепи киназных реакций - ТТФ на тимидинкиназу, в частности, в клетках опухоли мочевого пузыря человека (Fischer et al. 1986; 1988; Vazquez Padua et al. 1989). Известно влияние (5'Ш2)дТ на очищенный препарат ти-мидинкиназы из Escherichia соЫ - при малых концентрациях аналога наблюдается аллостерическая активация, при высоких концентрациях проявляется ингибирующий эффект (Rohde, Lezlus 1971). Показано также отрицательное действие высоких концентраций (5'Щ>)дТ на репликацию ДНК эмбрионов морских ежей, при этом предполагают, что влияние происходит на стадии фосфорилирования дезоксинуклеозидов (Терентьев и др. 1985). Такой "инструмент", как (5'Ш2)дТ дает дополнительное подтверждение, что в суспензионных клетках сахарной свеклы функционирует специфичный для тимидина механизм его фосфорилирования, а именно - тимидинкиназа.

Изменение внутриклеточного содержание АТФ под влиянием нукле-озидных добавок - критерий выбора между функциональной тимидинкиназой и НФТ. В отличие от тимидинкиназы, фосфорилирование тимидина при помощи НФТ в качестве второго продукта реакции может давать аденозин, если донор фосфата - АМФ. Аденозин, в свою очередь фос-форилируясь в цепи аденозинкиназной (или/и НФТ), аденилаткиназной и любой из АДФ-фосфорилирующих реакций (на субстратном уровне или за счет окислительного фосфорилирования), будет регенерировать АТФ.

Следовательно, снабжая клетки аденозином, увеличение количества АТФ можно ожидать в любом случае - будь-то активна адено-зинкиназа или НФТ. Однако добавка тимидина в питательную среду будет повышать внутриклеточное содержание АТФ лишь при функционировании НФТ.

Ранее было показано, что аденозин, добавленный в концентрации 470 мкМ к экстракту культивируемых клеток Catharanthus roseus. в основном фосфорилировался аденозинкиназой, хотя 3-6% полученного в реакции аденилата обеспечивала НФТ (Hirose. Ashlhara 1984). Принимая во внимание последний факт и то обстоятельство, что в предыдущих экспериментах был сделан вывод о возможной активности НФТ при концентрации тимидина в среде, превышающей 100 мкМ. были выбраны 200-мкМ концентрации нуклеозидов.

Как видно из Рис.21, количество АТФ в клетках довольно заметно возрастает уже через 2 мин инкубации с 200 мкМ аденозина. Следовательно, аденозин быстро проникает в клетку и вовлекается в метаболизм, производя в конечном итоге АТФ через серию киназных реакций. Отметим, что количество АТФ в клетках контрольного варианта находится в ряду опубликованных ранее величин (Nygaard 1972; Shl-mazakl et al. 1982; Meyer, Wagner 1985). При инкубации клеток с 200 мкМ тимидина увеличение АТФ в клетках было весьма незначительным и отсроченным во времени, а в условиях гипоксии уровень внутриклеточной АТФ снижался почти на 50% через 20 мин (Рис.21).

Для того чтобы выявить вклад НФТ и тимидинкиназы в фосфорили-рование тимидина вычисляли отношение приращения внутриклеточного АТФ под влиянием тимидина к приращению АТФ под влиянием аденозина и сравнивали данный параметр с теоретически ожидаемым (Табл. 8).

Если оставить в стороне вопрос о достоверности различий количества АТФ в клетках контрольного варианта и обработанных тимиди-ном (достоверно только при Р ) 0.3, Рис.21), то в этом случае экспериментальный параметр составляет 38% от теоретического, что означает - при 200-мкМ концентрации тимидина в среде его фосфорили-рование на 60% обеспечивается тимидинкиназой (Табл. 8).

Можно привести возражения относительно принятой доли АМФ от общего пула рибонуклеозидмонофосфатов. поскольку это определяет коэффициенты в суммарных уравнениях (Табл. 8). Но даже если для расчетов использовать крайнее из имеющихся в литературе соотношение АМФ к УМФ, равное 1:6 (Meyer, Wagner 1985), тимидинкиназа будет определять 33% от общей тимидин-фосфорилирующей активности при данной нагрузке клеток субстратом.

Малая достоверность различий количества АТФ в клетках контрольного варианта и обработанных тимидином безусловно указывает на то, что НФТ дает меньший вклад в фосфорилирование тимидина, чем показали расчеты.

Таблица 8. Отношение приращения внутриклеточного количества АТФ под влиянием тимидина к приращению АТФ под влиянием аденозина для суспензии клеток сахарной свеклы.

Ожидаемые значения®, если предположить активность: Эксперимент

НФТ для тимидина и аденозинкиназа® НФТ для всех нуклеозидов8 тимидинкиназа1-

0.25 0.25 0 0.097+0.01

Примечания: а Аденозин образуется из АМФ в НФТ-азной реакции, затем через серию киназных реакций дает АТФ. Донорами фосфата преимущественно служат рибонуклеозидмонофосфаты, превалируя в клетке над дезоксирибонуклеозидмонофосфатами (Nygaard 1972; Castrovlejo et al. 1979). Ниже приведены результирующие реакции без промежуточных этапов, в предположении что в клетках соотношение АМФ к УМФ равно 1:3. Использованы сокращения: НФТ - нуклеозидфосфот-рансфераза, Адо - аденозин, Урд - уридин, дТ - тимидин. Pi - донор фосфата для фосфорилирования АДФ, ТМФ - тимидинмонофосфат. 6 4 дТ + АМФ + 3 УМФ + 3 Р1 = 4 ТМФ + 3 Урд + АТФ И Адо + 3 Р1 = АТФ (1 тимидин дает 0.25 АТФ и 1 аденозин дает 1 АТР). 8 3 дТ + АМФ + 3 УМФ + 2 Р1 = 3 ТМФ + 3 Урд + АТФ и 3 Адо + АМФ + 3 УМФ + 8 Pi = 4 АТФ + 3 Урд (1 тимидин дает 0.333 АТФ и 1 аденозин дает 1.333 АТФ). г дТ + Р1 = ТМФ (тимидин не дает АТФ).

РадиоавтограФический анализ эффективности включения тимидина в ДНК в условиях разбавления [S-H]flT не мечеными нуклеозидами. В данном эксперименте рассматривалась ситуация, когда концентрация экзогенного тимидина была сравнима с внутриклеточной либо ниже ее. При этом концентрации нуклеозидов-конкурентов были в 2564 раз больше, чем [3Н]дТ. Суспензия клеток сахарной свеклы находилась в аэробных условиях либо при гипоксии.

На Рис.22 показано, что гипоксия вызывает 33% снижение числа зерен серебра над ядрами. Этот результат коррелирует с данными об изменении в этих условиях уровня внутриклеточного АТФ (см. Рис.21). Вероятнее всего, уменьшение включения [3Н]дТ в ядра клеток связано с нарушением синтеза ДНК, поскольку этот процесс требует больших затрат АТФ, что несравнимо с расходами на фосфорили-рование следовых количеств тимидина (0.078 мкМ). Добавка не меченого тимидина в концентрации 200 мкМ приводила к полному отсутствию зерен при любых условиях снабжения клеток кислородом.

При разбавлении [3Н]дТ не меченым аденозином в концентрации 200 мкМ зерна серебра над ядрами присутствовали, хотя число их значительно уменьшалось (Рис.22). Из данных литературы известно, что эффективность нуклеозидов в качестве акцепторов фосфата в реакции, катализируемой НФТ, в среднем можно принять равной 1 и 0.33

для тимидина и аденозина (Grivell, Jackson 1976; Brunngraber 1978). Расчеты показали, что смесь - 1:2564 - [3Н]дТ:аденозин -приведет к образованию 0.001169 единиц меченого продукта в НФТ-ка-тализируемой реакции. Для оценки ожидаемого числа зёрен серебра над ядрами применяли модель, описывающую кинетику включения тимидина в ДНК (Cleaver, Holford 1965). Модель определяет, что в случае следовых количеств [3Н]дТ, "метка", включающаяся в ДНК, пропорциональна квадратному корню концентрации тимидина в среде. В нашем случае (из-за низкой концентрации тимидина, быстроты его транспорта и фосфорилирования) концентрации тимидин-фосфатов в клетке и тимидина снаружи можно считать равными. Инкубация клеток в среде, содержащей смесь [3Н]дТ и аденозина в пропорции 1:2564 . должна давать 6.5 зерен серебра над ядрами, что в десять раз меньше. чем было обнаружено в опыте (66.6).

Результаты указывают, что либо специфичность НФТ к тимидину в 100 раз выше, чем описано в литературе (в таком случае это уже другой фермент), либо активность фермента составляет меньше 1% от общей тимидин-фосфорилирующей активности.

Снижение включения С3 Н]дТ легко объясняется ингибированием поглощения тимидина большими концентрациями аденозина. В условиях гипоксии добавка аденозина вызывала аддитивный эффект (Рис.22). Очевидно окислительное фосфорилирование принимает активное участие в процессе регенерации АТФ из аденозина.

Таким образом, по крайней мере в активно-делящихся клетках суспензионной культуры, главный путь реутилизации тимидина вовлекает субстрат-специфичный механизм - тимидинкиназу. При высоких концентрациях нуклеозидов включается НФТ, при этом не используя в качестве субстратов одновременно присутствующие- в низкой концентрации нуклеозиды.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.

Клетки, в том числе высших растений, способны поглощать нуклеозиды из внешней среды. Это обстоятельство и тот факт, что тими-дин представляет собой единственный из четырех нуклеозидов. характерный только для полидезоксирибонуклеотидов. привело к широкому использованию меченных радиоактивными изотопами производных тимидина в исследованиях синтеза ДНК (Епифанова. Терских 1969).

Вовлечение тимидина в метаболизм клетки предполагает его фосфорилирование. Первой была обнаружена (Brawerman, Chargaff 1955), широко распространенная в тканях животных и растений нуклеозидфос-

фотрансфераза (НФТ). Этот фермент использует в качестве донора фосфата различные его органические эфиры - инозиновую кислоту, адениловую кислоту, фенилфосфат и др., а в качестве акцепторов -любые рибо- и дезоксирибонуклеозиды. Немного позже, в 1956 г., было открыто зависимое от Mg2* и АТФ фосфорилирование тимидина у Escherichia coli (см. Корнберг I960). Затем аналогичную активность выявили в клетках растений (Hotta, Stern 1963; 1965) и связали ей с репликацией ДНК. В 70-е годы активно обсуждался вопрос о существовании тимидинкиназы у некоторых бактерий, простейших и растений (Arlma et al. 1971; Shlosaka et al. 1971; Deng, Ives 1972; Delseny et al. 1976; Bols, Zimmerman 1977; Mullln, Fîtes 1978). Специфика объектов исследования и особенности методов сыграли немаловажную роль в утверждении мнения, что тимидин у этих организмов фосфори-лируется с помощью НФТ. И для высших растений дискуссия закончилась не в пользу тимидинкиназы (Deng, Ives 1972; Hofman, Schwarz 1978). За сорок лет исследования фермента накоплено множество фактов о функционировании тимидинкиназы в пролиферирующих клетках, о еб роли при неопластическом росте и значении в регуляции митоти-ческого цикла. К сожалению, все эти вопросы практически не рассматривались в физиологии и биохимии растений.

Существует ли у высших растений тимидинкиназа ? С какими процессами в клетке связана активность фермента ?

Проведенные нами исследования показали, что в клетках высших растений вероятно существует несколько тимидин-фосфорилирующих систем - по числу ДНК-синтезирующих компартментов клетки. Функционирование этих систем может быть независимым (раздел 1). Пока еще рано говорить о наличии тимидинкиназ, обслуживающих митохондрии и хлоропласта. Однако активность фермента обнаруживается в препаратах этих органелл. выделенных из листьев и проростков кормовых бобов. Голашевский и др. (Golaszewskl et al. 1975) показали присутствие функциональной тимидинкиназы в цитозоле и хлоропластах проростков Secale cereaLe. Следует отметить, что для клеток млекопитающих давно установлено существование митохондриальной тимидинкиназы (Berk. Clayton 1973). Основная активность в экстрактах, возможно отчасти загрязняющая препараты органелл, выявляется в пост-мигохондриальном супернатанте. Белки, определяющие эту активность, являются "щелочными" (Рис.2).

Использование NaF в качестве ингибитора НФТ позволяет разделить тимидин-фосфорилирующие активности. Например, в гомогенате проростков кормовых бобов реакция фосфорилирования тимидина опре-

деляется на 74% НФТ и на 26% тимидинкиназой. Уровень активности последней можно повысить по крайней мере в два раза (Табл.1), применяя предобработку проростков низкими концентрациями тимидина. Вероятно за этим стоит синтез ферментного белка. Например, на микроспорах лилии и зародышах пшеницы было установлено, что этот процесс требует новых мРНК (Hoöta, Stern 1965). Отметим, что субстратная индукция, возможно осуществляемая по классической схеме ß-галактозидазы Е. coli, требует низких концентраций тимидина. какими очевидно оперируют интактные клетки растений.

В целом активность фермента хорошо коррелирует с пролиферацией клеток и наблюдается приуроченность функциональной тимидинкиназы к S-периоду и ее стабилизация в G2-периоде митотического цикла. Причем повышение ферментной активности в эти фазы клеточного цикла наблюдается не только в цитоплазме (постмитохондриальном суперна-танте), но также в ядрах и хроматине (раздел 3). Это дает основание связывать функциональную тимидинкиназу с процессом репликации ДНК. Возможно, как и для клеток млекопитающих, фермент участвует в комплексе "реплитаза" (Reddy. Pardee 1980; Pardee 1989), который, как предполагают, собирается в участках репликации. Во всяком случае после критического рассмотрения "реплитазной" модели (Reichard 1988), тимидинкиназа осталась среди претендентов на участие в мультиферментном комплексе (Xu, Plunkett 1993). Функциональная топография фермента, выявленная нами, дает аргументы в пользу этой модели для клеток растений.

На сегодняшний день совокупность опубликованных работ (как для клеток животных, так и растений) дает основания связывать активность тимидинкиназы с репликацией ДНК. Нельзя, тем не менее, исключить участие фермента в репарации. Например, в прорастающих зерновках кукурузы наблюдали ранний дорепликативный синтез ДНК и коррелирующую с ним активность тимидинкиназы и предположили связь этих процессов с репарацией ДНК (Georgieva et al. 1994). Кроме того, есть данные, указывающие на зависимость "созревания" хромосомной ДНК, то есть сшивки отдельных репликонов, от концентрации тимидина и возможное участие в этом процессе тимидинкиназы (Schvart-zman et al. 1984; Van't Hof 1985). Созревание ДНК происходит (с участием ДНК-лигазы) в позднем S й начале С2-периодов, когда уровень тимидинкиназы. как уже отмечалось, высок.

Что же объединяет тимидинкиназу с указанными процессами ? На сегодняшний день можно лишь сделать предположение о ее партнерах по взаимодействию во время синтеза, репарации и лигирования ДНК.

Среди таких партнеров явно можно выделить PCNA (Proliferating Cell Nuclear Antigen) - вероятного участника всех трех вышеназванных процессов (Stlllman 1994).

Первую и единственную попытку выделить тимидинкиназу из клеток высших растений предприняли в 1970 г. (Schwarz, Fites 1970). В результате применения "ацетонового порошка" (к столь лабильному ферменту), фракционирования сульфатом аммония и хроматографии на Sephadex G-100 удалось в 20 раз очистить тимидин-фосфорилирующую активность из проростков земляного ореха. Дальнейшая очистка тимидинкиназы была неуспешной. Авторы отмечали возможное присутствие более чем одной тимидин-фосфорилирующей активности. Однако впоследствии все свелось к НФГ (Mullin. Fites 1978). .

Как обсуждалось выше, суммарная тимидин-фосфорилирующая активность in vitro определяется тимидинкиназой и НФТ. Условия первичного экстракта как правило благоприятствуют преобладанию НФТ активности, поскольку экстракты, в отличие от ситуации in situ. обычно богаты фосфатазами и АТФ фосфогидролазами, которые снабжают НФТ субстратом реакции. "

Тем не менее, был получен очищенный препарат тимидинкиназы, свободный от НФТ активности (раздел 4). По-видимому это первое успешное выделнние фермента из высших растений.

Выявленные свойства позволяют рассматривать тимидинкиназу из проростков кормовых бобов, как нового представителя единого семейства. Например, ферменты некоторых вирусов, бактерий и клеток млекопитающих, аналогично тимидинкиназе из проростков кормовых бобов, существуют в форме тетрамера. Отметим наличие характерных полипептидных дублетов и одинаковую молекулярную массу мономеров для препарата, полученного нами, и фермента из Т. thermophila (Табл. 6). Кинетические константы тимидинкиназы из растений также сближают ее с аналогичными ферментами из других организмов, нежели с НФТ. Ряд других свойств могут служить признаками, отличающими тимидинкиназу от НФТ. Относительная устойчивость НФТ в кислой среде, при длительном хранении и при прогревании возможно имеет физиологическое значение. Активность этого фермента сохраняется в зрелых частях растений (Grivell. Jackson 1976), подверженных экстремальным воздействиям окружающей среды.' В противоположность НФТ, тими-динкиназа активна в делящихся клетках, которые морфологически хорошо защищены от неблагоприятных факторов.

Соотношение тимидин-фосфорилирующих активностей в растительных экстрактах и в интактных клетках резко отличается. Главный

путь реутилизации тимидина in vivo вовлекает субстрат-специфичный механизм - тимидинкиназу (раздел 6) - в пределах достаточно больших экстраклеточных концентраций нуклеозида. по крайней мере до 100 мкМ. В частности, для культуры клеток сахарной свеклы при такой нагрузке концентрация тимидина внутри составляла 25 - 30 мкМ. Следует отметить, что в этой области концентраций совпадают значения "нуклеозидной" Км для процесса фосфорилирования тимидина in vivo и тимидинкиназной реакции in vitro. Несомненно важным фактором. определяющим преимущественное функционирование тимидинкиназы, является низкая концентрация тимидина и тиминовых нуклеотидов в клетках растений (Nygaard 1972; Castrovlejo et al. 1979; Meyer, Wagner 1985). При высоких концентрациях нуклеозидов включается НФТ, при этом не используя в качестве субстратов одновременно присутствующие в низкой концентрации нуклеозиды.

Вреия О

Ну1леозм1»ос*отранс»(ра)*

Рис. 23. Гипотетическая схема функционирования тимидинкиназы и НФТ в клетках растений.

Нухлеоэивфос^отране^ераэа

Тишиинкмм«)* . гсхЛПП

Деэохсирибокукдео)маы Рибоиуклеозиаы

СИ- Тиимдин

Обобщая собственные экспериментальные результаты и данные, имеющиеся в литературе, предлагаем гипотетическую схему о разделении функций тимидинкиназы и НФТ в клетках растений (Рис.23).

Тимидинкиназа активна в пролиферирующих клетках. Участвует,

Тииияинкннаэа

Вреия Т

предположительно, в составе комплекса ферментов, в процессах репликации и созревания репликонов (возможно и в репарации ДНК). При этом малые количества тимидина эффективно используются клеткой.

Нуклеозидфосфотрансфераза выполняет выравнивающую функцию, перераспределяя фосфат между нуклеозидами и препятствуя непропорциональному возрастанию концентрации какого-либо одного нуклеотида в ситуациях, когда концентрации каких-либо нуклеозидов и нуклео-зидмонофосфатов значительно возрастают. В целом эти события более характерны для процессов роста. Такие ситуации могут наблюдаться в разные периоды онтогенеза: при прорастании зародыша, когда происходит мобилизация запасных веществ, в том числе нуклеиновых кислот (Хавкин 1977: 1982),и пул свободных нуклеотидов резко увеличивается (Kombrlnk, Beevers 1983); при формировании тканей эндосперма (Shannon et al. 1996); при отложении запасных веществ (Павлинова, Холодова 1935) и т.д.

Перекрывание функций этих ферментов in vivo может наблюдаться в случае возрастания внутриклеточных концентраций тимидина.

ВЫВОДЫ.

1. Тимидинкиназа существует в высших растениях. Вновь выделенный из растений и аналогичные ферменты из других организмов имеют ряд общих свойств, что позволяет рассматривать их как представителей единого семейства.

2. Функциональная тимидинкиназа коррелирует с пролиферацией клеток и наблюдается приуроченность ее активности к S-периоду и стабилизация в Gz-периоде митотического цикла.

3. Активность фермента обнаруживается в различных компартмен-тах клетки. Существует перераспределение активности в клеточном цикле - в начале S периода она возрастает в цитозоле. позже в хроматине. где сохраняется до конца G2 фазы.

4. Делящиеся клетки способны быстро поглощать тимидин и вовлекать его в метаболизм за счет фосфорилирования с помощью тимидинкиназы. При высокой концентрации нуклеозидов начинает работать неспецифическая нуклеозидфосфотрансфераза:' Пороговая концентрация тимидина, превышение которой включает неспецифический механизм, значительно выше, чем его внутриклеточные концентрации.

5. Тимидинкиназа и нуклеозидфосфотрансфераза в клетках растений не являются конкурентами, их функции сопряжены с разными физиологическими процессами - тимидинкиназа с пролиферацией, нуклеозидфосфотрансфераза с ростом в целом.

По материалам диссертации опубликовны следующие работы:

1. Nosov А.V.. Smolenskaya I.N. Radloautographlc research of DNA and RNA synthesis In the cultured mesophyll protoplasts of V.faba and N. tabacum.' - Plant Metabolism Regulation. - Proceed. II Int. Youth Symp.. Eds.. Karanov E.. Babalakova N.. Demlrevska-Kepova Kl. - Sofia. 1982. p. 426-433.

2. Носов А.В.. Смоленская И.H. Изменение комплекса ДНК-фуксин в клеточном цикле культивируемых протопластов мезофилла высших растений. - Клеточный цикл растений. - Киев, Наукова думка. 1983, с. 119-126.

3. Nosov А.V.. Smolenskaya I.N., Nosova A.L. Cytophotometrie study of DNA-fuchsln complex in cultured mesophyll protoplasts of Nicotiana tabacum and Vicia faba. - Blologla Plantarum. 1983. V 25 (3). p. 173-179.

4. Смоленская И. H.. Носов А. В., Ралдугина Г.Н. Сравнительный анализ разных приемов синхронизации культуры клеток сахарной свеклы. - IV Всесоюзная конференция "Культура клеток растений и биотехнология". Тезисы докл.. Кишинев. Штиинца, 1983, с. 21-22.

5. Smolenskaya I.N.. Nosov А.V. The events sequence during tobacco haplold mesophyll protoplast cell cycle reactivation. - Joint Congress of the European Tissue Culture Society (ETCS) and the European reticuloendothelial Society (EURES). Abstr.. Budapest. 1983. p. 63.

6. Nosov A.V., Smolenskaya I.N. The comparison of thymidine kinase activity during cell cycle of tficotiana tabacrn and Vicia faba protoplasts. - Int. Symp. Plant Tissue and Cell Culture Applied to Crop Improvement. Abstr., Olomouc. 1984. p. 137.

7. Смоленская И.H.. Носов А.В.. Ралдугина Г.Н. Суспензионная культура клеток кормовых бобов. - Физиология растений. 1988, Т 35. вып. 6, с. 1229-1237.

8. Носов А. В. Тимидинкиназа и пролиферация клеток растений. -Клеточный цикл растений в онтогенезе. - Киев, Наукова думка. 1988. с. 183-194.

9. Смоленская И.Н.. Носов А.В. Методы получения и культивирования протопластов. - Методы культивирования клеток. Под ред. Пинае-ва Г.П. - Л.: Наука. 1988. с. 164-175.

10. Smolenskaya I.N.. Zorlnyants S.E.. Nosov A.V. Resumption of suspension cell culture of Triticum timopheevit from protoplasts and obtaining of synchronous cell populations. - VII Int. Congress Plant Tissue and Cell Culture. Amsterdam, 1990. p. 37.

11. Jasik J.. Smolenskaya I.N.. Zorlnyants S.E.. Nosov A.V.. Ba-ullna 0.I.. Kristin J. Cytologlcal study on wheat (Triticum ttmop-heevii Zhuk.) protoplasts. Biologla plantarum. 1992. V 34 (3-4). p. 193-201.

12. Зоринянц С.Э.. Смоленская И.Н.. Носов А. В. Быстрорастущая суспензионная культура клеток и протопласты пшеницы Тимофеева. -Ризиология растений. 1993, Т 40. N 2. с. 300-306.

13. Носов А.В. Тимидинкиназа клеток высших растений. - II Между-1ародная конференция "Биология культивируемых клеток растений и Зиотехнология". Тезисы докл., Алматы, 1993, с. 22.

14. Носов А.В. Маркерный фермент клеточного цикла - тимидинкиназа - предмет для генетики соматических клеток высших растеий. -(онференция "Генетика соматических клеток в культуре". Тезисы юкл., Черноголовка, 1993. с. 32.

15. Nosov А.V., Novlkova G. V.. Smolenskaya I. N. Absclslc acid effect on proliferation of suspension-cultured sugar beet cells: :ytoklnln modulates absclslc acid effect. - Int. .Symposium. Physiology of absclslc acid, Abst., Pushchlno, 1993, p. 43-44.

16. Nosov A.V. Thymidine kinase from broad bean seedlings: purification and properties. - IV Int. Congress of Plant Molecular Biology. Abst.. Amsterdam. 1994, 881.

17. Zorlnyants S.E., Nosov A. V., Badaeva E.D., Smolenskaya I.N., iadaev N. S. Cytogenetic analysis of a long-term Triticum ttmophee->xi (Zhuk.) Zhuk. cell suspension culture. - Plant Breeding, 1995, I 114, N 5, p. 219-225.

18. Носов А. В. Тимидинкиназа в клетках высших растений. 1. Функциональная топография тимидинкиназы в клеточном цикле. - Физиология растений. 1995, Т 42. N 4, с. 539-546.

19. Носов А. В. Тимидинкиназа в клетках высших растений. 2. Выделение и очистка фермента из проростков кормовых бобов. - Физиология растений. 1995, Т 42, N 5. с. 734-745.

20. Носов А.В. Тимидинкиназа в клетках высших растений. 3. Свойства фермента из проростков кормовых бобов. - Физиология растений. 1995, Т 42, N 5, С. 746-753.

21. Nosov А.V.. Smolenskaya I.N. Evidence for specificity of thymidine phosphorylation in Beta vulgaris suspension cell cultures. - Представлено в журнал Planta (рукопись 28 е.).

Информация о работе

Носов, Александр Владимирович
доктора биологических наук
Москва, 1996
ВАК 03.00.12

Автореферат

Похожие работы

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему Тимидинкиназа высших растений ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Тимидинкиназа высших растений"

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Тимидинкиназа высших растений
ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений