Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Пролиферативный антиген инициалей в исследовании морфогенетических процессов в культуре in vitro пшеницы

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Пролиферативный антиген инициалей в исследовании морфогенетических процессов в культуре in vitro пшеницы"

На правах рукописи

ФАДЕЕВА Ирина Юрьевна

ПРОЛИФЕРАТИВНЫЙ АНТИГЕН ИНИЦИАЛЕЙ В ИССЛЕДОВАНИИ МОРФОГЕНЕТИЧЕСКИХ ПРОЦЕССОВ В КУЛЬТУРЕ IN VITRO ПШЕНИЦЫ

03 00 04 - биохимия 03 00 23 - биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

2 4 Ш 2007

Саратов - 2007

003060019

Работа выполнена в Институте биохимии и физиологии растений и микроорганизмов Российской академии наук (ИБФРМ РАН)

Научные руководители: доктор химических наук,

профессор Щеголев С.Ю. кандидат биологических наук Евсеева Н.В.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук Антонюк Л.П.

доктор биологических наук Бебякин В.М.

Защита состоится «30» мая 2007 г в 13 00 на заседании диссертационного совета Д 002 146 01 при Институте биохимии и физиологии растений и микроорганизмов Российской академии наук (410049, г Саратов, просп Энтузиастов, 13).

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ИБФРМ РАН. Автореферат диссертации размещен на сайте http //www lbppm Saratov ru/obyav_dis html

Автореферат разослан апреля 2007 г

Ученый секретарь диссертационного совета

Ведущая организация: Московский государственный университет им

М В Ломоносова, г Москва

доктор биологических наук

Никитина

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы. Молекулы белков и ДНК являются важными объектами в изучении морфогенетических процессов растений на молекулярном и клеточном уровнях Результаты этих исследований представляют большой интерес не только для развития фундаментальной науки, но и для биотехнологии, создавая основу для совершенствования селекционного процесса с использованием современных клеточных технологий Исследования подобного рода на уровне целого растения затруднены интегральным характером морфогенетических процессов и зависимостью их от многих внутренних и внешних факторов (Бу-тенко, 1999, Батыгина, 1999)

Изолированные культуры органов, тканей и клеток, помещенные в контролируемые условия (минеральное питание, температура, освещенность и экзогенные гормональные добавки), являются удобными моделями для изучения морфогенетических процессов у растений В частности, принципиально важным моментом в исследованиях соматического эмбриогенеза является анализ самых ранних его этапов, когда отдельные клетки в каллусной массе или суспензии приобретают способность развиваться в эмбриоид Прежде всего, представляют интерес сигналы и индукторы этого процесса, заставляющие недифференцированную клетку in vitro переключаться на определенный путь развития (Бутенко, 1999, Лутова, 2003)

Выяснение молекулярных основ морфогенеза растений привлекает внимание довольно большого числа исследователей Особое внимание уделяется, например, генам-переключателям развития (Хавкин, 1998, Smith et al, 2004, Sablow-ski, 2007) и продуктам их экспрессии (Карабаев и Джардемалиев, 1994, Bommert et al, 2005, Cole et al, 2006), которым отводится основная роль в пространственно-временной регуляции процессов морфогенеза Несмотря на это, еще недостаточно изученными остаются гены, контролирующие наиболее общие процессы деления и последующей дифференциации клеток (Reddy and Meyerowitz, 2005, Dewitte and Murray, 2003) Именно они определяют судьбу индивидуальной клетки продолжать ли ей делиться или переходить к растяжению и дифференциации

Кроме того, закономерности морфогенеза, установленные для конкретного генотипа в полевых экспериментах т vivo, могут значительно измениться при культивировании эксплантов в культуре in vitro (Батыгина, 1999, Соболева и Логинов, 2004) Учитывая, что решение задач повышения эффективности морфогенеза имеет большое значение для развития соответствующих биотехнологий с использованием методов клеточной селекции растений, представляется актуальным сравнительный анализ особенностей протекания соответствующих процессов, происходящих in vivo и in vitro Их решению может способствовать выявление надежных биохимических и/или морфологических маркеров, отражающих общие закономерности развития растений в условиях in vivo и т vitro и позволяющих отбирать генотипы с высоким морфогенетическим потенциалом

К началу наших работ по данной теме в исследованиях, начатых в группе

иммунохимии растительных клеток ИФР РАН (г Москва) под руководством А Д Володарского и продолженных совместно в Лаборатории физической химии клеточных структур ИБФРМ РАН, был выявлен молекулярный маркер ме-ристематических клеток пшеницы, названный пролиферативным антигеном инициален (ПАИ) Разработаны теоретические и экспериментальные основы технологии создания иммунодиагностикума к ПАИ и исследовано его распределение в тканях и органах растения Установлена целесообразность использования ПАИ в качестве белкового маркера меристематических клеток пшеницы для оценки селекционного растительного материала на устойчивость к действию неблагоприятных факторов внешней среды (Володарский с соавт, 1996, Евсеева с соавт, 2004, Evseeva et al, 2004)

Целью настоящей работы было изучение субклеточной локализации ПАИ с использованием усовершенствованной иммунохимической тест-системы, анализ гомологичности антигенных детерминант ПАИ соответствующим структурам белков растений других таксономических групп и оценка его информативности в качестве молекулярного маркера меристематических клеток в исследованиях морфогенетических процессов в культуре in vitro пшеницы В ходе исследования решали следующие задачи

1 Усовершенствовать методику получения и очистки моноспецифических антител к ПАИ

2 Исследовать субклеточную локализацию ПАИ с использованием усовершенствованной иммунохимической тест-системы

3 Оценить иммунохимическую гомологию ПАИ цитоплазматическим белкам меристем растений различных таксономических групп

4 Исследовать динамику содержания ПАИ в соматических каллусах почти изогенных линий пшеницы, альтернативных по генам короткостебельно-сти Rht, в процессе каллусогенеза и вторичной дифференциации

5 Провести сравнительный анализ содержания ПАИ в меристематических зонах in vivo и каллусных клетках in vitro почти изогенных линий пшеницы, альтернативных по ряду генов короткостебельности Rht

Научная новизна работы. Впервые проведено исследование внутриклеточной локализации ПАИ Показано, что ПАИ является цитозольным белком Впервые обнаружена иммунохимическая гомология ПАИ цитоплазматическим белкам растений различных таксономических групп. Выявлена общая закономерность динамики содержания ПАИ в процессе каллусогенеза и вторичной дифференциации в культуре in vitro на генетической модели, включающей 7 генотипов яровой мягкой пшеницы На примере трех генов короткостебельности RhtBlc, Rhtl4 и RhtBlb показано их влияние на содержание ПАИ в каллусных клетках пшеницы Впервые установлено, что содержание ПАИ в меристематических клетках узлов кущения почти изогенных линий пшеницы in vivo в целом отражает морфогенетический потенциал соматических каллусов тех же линий в культуре in vitro Впервые показано, что уровень содержания ПАИ в каллусных клетках пшеницы позволяет оценить их морфогенетическую способность на более ранних этапах по сравнению с морфометрическим анализом

Научно-практическая значимость. Полученные результаты позволяют рекомендовать ПАИ для исследований морфогенетических процессов в растениях, что открывает перспективу его использования в соответствующих отраслях агробиотехнологии в качестве дополнительного критерия морфогенетической способности тестируемых линий пшеницы в селекционной работе

Кроме того, предложенная нами стратегия получения высокоспецифических поликлональных антител может быть использована в иммунохимических исследованиях белков эукариотических и прокариотических клеток

Результаты работы используются в учебном процессе при подготовке курсовых и дипломных работ студентов в Саратовском государственном университете им Н Г Чернышевского и в Саратовском государственном аграрном университете им Н И Вавилова

Апробация работы. Материалы исследований, изложенные в диссертации, были представлены на 9-й Международной Путинской школе-конференции молодых ученых «Биология - наука 21 века» (Пущино, Россия, 2005), на 4-й Всероссийской конференции молодых ученых «Современные проблемы теоретической и экспериментальной химии» (Саратов, Россия, 2003), на Всероссийской конференции «Молекулярные механизмы взаимодействия микроорганизмов и растений фундаментальные и прикладные аспекты» (Саратов, Россия, 2005), на Всероссийской конференции «Стрессовые белки растений» (Иркутск, Россия, 2004), на международной конференции «Физиология растений - основа фитобиотехнологии» (Пенза, Россия, 2003), на межрегиональной конференции молодых ученых и специалистов системы АПК Приволжского федерального округа «Вавиловские чтения - 2003» (Саратов, Россия, 2003), на Всероссийских конференциях «Вавиловские чтения - 2004, - 2005, - 2006» (Саратов, Россия, 2004 - 2006)

Диссертация обсуждена и одобрена на расширенном заседании лаборатории физической химии клеточных структур ИБФРМ РАН

Публикации. По теме диссертации опубликовано 14 работ, в том числе 2 статьи в отечественных рецензируемых научных изданиях

Основные положения диссертации, выносимые на защиту.

1 ПАИ выявляется только в цитозоле меристематических клеток пшеницы и не обнаружен в ядрах, хлоропластах, митохондриях, плазмалемме и мембранных фракциях ряда клеточных органелл

2 Цитоплазматические белки ржи, сорго, подсолнечника и вольфии содержат антигенные детерминанты, гомологичные детерминантам ПАИ

3 Гены короткостебельности RhtBlc, Rhtl4 и RhtBlb оказывают влияние на динамику содержания ПАИ в процессе каллусогенеза и вторичной дифференциации соматических каллусов почти изогенных линий пшеницы, альтернативных по этим генам

4 Содержание ПАИ в меристематических клетках узлов кущения почти изогенных линий пшеницы в полевых экспериментах in vivo в целом отражает морфогенетическую способность каллусной ткани тех же линий в культуре ш vitro

5 Определение содержания ПАИ в соматических каллусах пшеницы позволяет оценить их морфогенетическую способность на более ранних этапах по сравнению с морфометрическим анализом, что открывает перспективу его использования в агробиотехнологии в качестве дополнительного критерия в селекционной работе

Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, изложения полученных результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы, содержащего 292 источника, в том числе - 219 зарубежных Работа изложена на 119 страницах машинописного текста, содержит 30 рисунков

Работа выполнена в лаборатории физической химии клеточных структур ИБФРМ РАН в соответствии с плановой темой НИР «Разработка эффективных тест-систем к антигенным структурам клеток микроорганизмов и растений» (№ гос регистрации 01890017743) Научный руководитель - зав лаб , дхн, профессор С Ю Щеголев

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ Материалы и методы исследования

Для исследования морфогенетических процессов в культуре in vitro был использован сорт мягкой яровой пшеницы Саратовская 29 ([Triticum aestivum L ) и набор его почти изогенных линий, альтернативных по генам короткостебельно-сти RhtBlc, Rhtl4, RhíBlb Изогенные линии были получены Ю В Лобачевым методом возвратных скрещиваний (Лобачев, 2000) Сестринские почти изогенные линии были на 99 2 % идентичны сорту-реципиенту Саратовская 29

Для исследования иммунохимической гомологии цитоплазматических белков были использованы растения пшеницы (Triticum aestivum L, сорта Саратовская 29), озимой ржи (Seeale cereale L , сорта Саратовская 7), сорго (Sorghum bicolor L , сорта Желтозерное 10), подсолнечника (Helianthus annuus L, сорта Скороспелый 87) и водной культуры вольфии бескорневой ( Wolffia arrhiza (L ) Hork ex Wimmer) из семейства рясковых (Lemnaceae)

Выделение суммарной водорастворимой фракции меристематических белков растений. Водорастворимые фракции цитоплазматических белков экстрагировали из этиолированных пятисуточных проростков пшеницы, ржи, сорго, подсолнечника и водной культуры вольфии в буфере следующего состава 0,05 M трис-HCl, pH 7 8; 0 02 M ß-меркаптоэтанол, 0 001 M PMSF (Phenilmetil-sulfanylfluond) Соотношение навески растительного материала (г) и объема среды выделения (мл) составляло 1 5 Гомогенат центрифугировали при 20000 g 30 мин Супернатант обрабатывали насыщенным раствором сульфата аммония до конечной концентрации 80 % Осадок использовали для исследований

Экстрагирование белков из узлов кущения и из каллусной ткани пшеницы проводили в том же буфере Соотношение навески растительного материала (г) и объема среды выделения (мл) составляло 1 3

Антитела (AT) к ПАИ получали иммунизацией кроликов препаратом, элюированным из полосы полиакриламидного геля, содержащей ПАИ (Муравлев с соавт, 1999) Количественное получение антигена проводили методом препаративного электрофореза в нативных условиях

Очистка антител. Фракции IgG из антисыворотки выделяли фракционированием каприловой кислотой (конечная концентрация 3 %) в комбинации с ка-тионообменной хроматографией (носитель SP-Toyopearl HW 650М)

Электрофорез (ЭФ) в полиакриламидном геле (ПААГ) в нативных условиях проводили по методике, предложенной в работе (Davis, 1964)

Электрофорез в ПААГ в денатурирующих условиях выполняли по методу Леммли (Laemmli, 1970) Визуализацию белков осуществляли окрашиванием гелей красителями на основе азотнокислого серебра или Кумасси R-250

Двойную иммунодиффузию в агарозном геле препаратов растительных белков с антителами к ПАИ проводили по стандартной методике (Ouchterlony and Nilsson, 1979)

Иммунодот-анализ был выполнен по методике, описанной в работе (Hawkes et al, 1982) Иммуноблот-анализ проводили по методу (Towbm et al, 1979)

Иммуноферментный анализ (ИФА) проводили в полистироловых 96-ти луночных планшетах В качестве ферментной метки использовали пероксидазу хрена, конъюгированную с козлиными анти-кроличьими антителами В качестве субстрата использовали орто-фенилендиамин с перекисью водорода Измерения оптической плотности исследуемых проб проводили на иммуноферментном анализаторе АИФ-Ц-01С при 490 нм с последующей обработкой результатов с помощью программы ЛабАРМ (ЗАО ИЛИП, г Санкт-Петербург)

Условия культивирования незрелых зародышей пшеницы в культуре in vitro и морфометрический анализ. Работа проводилась по классическому варианту клеточных превращений в культуре т vitro незрелых (14-суточных) зародышей пшеницы путем непрямого соматического эмбриогенеза, когда реге-нерант возникает из каллуса Для этого донорные растения исследуемых генотипов выращивали в полевых условиях (2004-2005 гг) и затем незрелые зародыши помещали в культуру Зародыши пшеницы культивировали в на среде Линсмайера-Скуга для каллусогенеза (с 2 мг/л 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты) Регенерация полученных морфогенных каллусов проводилась на среде Блейдза (с 0 5 мг/л индолилуксусной кислоты и 0 5 мг/л кинетина) На питательную среду для каллусогенеза сажали по 40 зародышей каждого варианта (по 1 зародышу в пробирку) В течение 30 суток каллусы культивировали на среде для каллусогенеза, а затем только морфогенные каллусы пересаживали на среду для регенерации Подсчет количества морфогенных каллусов у изучаемых генотипов проводили методом визуального контроля (Nabors, 1982) Статистическую обработку результатов проводили однофакторным дисперсионным анализом с определением среднего квадратичного отклонения и наименьшей существенной разницы (HCP0s) (Максимов, 1980)

Выделение субклеточных фракций меристематических клеток пшеницы проводили с использованием дифференциального центрифугирования по методике Дрейпера и Скотта (Генная инженерия растений, 1991) Очистку хлоро-

пластов проводили в ступенчатом градиенте плотности перколла, приготовленном на среде, содержащей 0 01 М трис-НС1 (рН 7 6), 30 мг/мл ПЭГ (6000), 5 мг/мл БСА, 5 мг/мл фиколла (400) Градиент состоял из 40 и 70 % (объем/объем) перколла (Селиванкина с соавт, 1997) Очистку митохондрий проводили в ступенчатом градиенте плотности перколла, приготовленного на среде, содержащей 0 01 М трис-НС1 (рН 7 6), 0 3 М сахарозы и 0 1 % БСА Градиент состоял из 18, 23 и 35 % перколла (Войников с соавт , 1991) Мембранную и ци-тозольную фракции выделяли на ультрацентрифуге "Веекшап Ь-7" (Германия) при 100000 § 1 час Осадок ресуспендировали в 1 % тритоне Х-100, приготовленном на трис-НС1 буфере (0 05 М, рН 7 8) с добавлением 0 001 М РМБР, и оставляли при +4 °С на мешалке в течение 12 часов Гомогенат центрифугировали при 20000 g 30 мин Очистку ядер проводили в ступенчатом градиенте плотности перколла, приготовленного на среде, содержащей 0 01 М трис-НС1 (рН 7 6), 0 3 М сахарозы, 0 1 % БСА Градиент состоял из 35 и 80 % перколла Целостность наружных мембран органоидов клетки контролировалась микроскопически Суспензию митохондрий при этом окрашивали специфической для этих органоидов краской янус зеленый (Гудвин и Мерсер, 1986) Ядра окрашивали акридиновым оранжевым Хлоропласты и митохондрии разрушали замораживанием-оттаиванием (-196°С/+30 °С) Для замораживания органелл использовали жидкий азот Ядра разрушали в ультразвуковом дезинтеграторе Ш-20 (Польша)

Результаты исследований и их обсуждение

1. Усовершенствование методики получения моноспенифических антител

к ПАИ

В предыдущих исследованиях для идентификации ПАИ был использован системный иммунохимический подход, разработанный Г И Абелевым на животных клетках (Абелев, 1979) и впоследствии использованный А Д Володарским (Володарский, 1985) в применении к растительным объектам На первом этапе была получена противотканевая антисыворотка к антигенам апикальных стеблевых меристем пшеницы Затем из этой сыворотки были удалены антитела, дающие реакции с антигенами клеток дифференцированных тканей листа, стебля и корня В результате была получена антисыворотка узкой специфичности к ПАИ Для дополнительного повышения специфичности антител была получена антисыворотка на преципитат, образованный ПАИ и антителами узкой специфичности к нему

В связи с тем, что процедура получения АТ к ПАИ была трудоемка и длительна, мы усовершенствовали методику их получения Моноспецифические АТ к ПАИ были получены согласно методике, предложенной Муравлевым с соавторами, с некоторыми модификациями (Муравлев с соавт, 1999) Для иммунизации мы использовали хроматографически очищенный препарат ПАИ С целью удаления различных минорных примесей, которые могут визуально не на-

блюдаться в нативном одномерном ЭФ, для иммунизации мы использовали препарат, элюируемый из полосы полиакриламидного геля, содержащей ПАИ,

В результате была получена моноспецифическая антисыворотка к ПАИ, Методом двойной радиальной иммунодиффузии было установлено, что АТ, полученные «а препарат, элюируемый из полосы ПААГ, содержащей ПАИ, и АТ, полученные на преципитат, выявляют один и тот же белок (рис. 1). В сравниваемых системах наблюдалось полное слияние полос преципитации. Из этого следует, что АТ, полученные усовершенствованным методом, гомологичны АТ, полученным ранее на преципитат.

2. Очистка антител к ПАИ с использованием каприловой кислоты в комбинации с катионообменной хроматографией

Известно, что сыворотка крови млекопитающих содержит кроме иммуноглобулинов различных классов более 60 % других белков, в частности, сывороточный альбумин, которые могут давать неспецифические реакции, отличные от взаимодействия антиген-антитело (Михайлов и Симирский, 1991).

Полученная нами антисыворотка к ПАИ была очищена с использованием каприловой кислоты с последующей катионообменной хроматографией. Эта работа проводилась совместно с с.н.с. лаборатории биохимии ИБФРМ РАН Н. Ю. Селивановым.

Была подобрана оптимальная концентрация каприловой кислоты, необходимая для осаждения балластных белков сыворотки. В образцы сыворотки добавляли каприловую кислоту до конечной концентрации 2, 2.5, 3, 3.5 и 4 %. После осаждения супернатанты анализировали элекгрофоретически. Наибольшая степень очистки АТ без потери их активности достигалась при конечной концентрации каприловой кислоты в сыворотке 3 %.

Чтобы быстро освободиться от каприловой кислоты и других низкомолекулярных примесей, сыворотку подвергали гель-фильтрации (носитель Sephadex G-25M), После этого была проведена катионообменная хроматография на носителе SP-Toyopearl HW 650М в градиенте NaCI от 0 до 0.5 М. Элюируемые фрак-

1

Рис. I. Результаты сравнительного и м мунодаффузионного анализа:

1 - моноспецифическне АТ к ПАИ, полученные на преципитат (развед. 1/2);

2 - моноспецифическне АТ к ПАИ, полученные на препарат, элюируемый из полосы ПААГ (развед. 1/4); 3 - фосфатно-солевой буфер; 4 - суммарная фракция мери стемати чески х белков 5-суточных проростков пшеницы.

ции анализировались в ЭФ в денатурирующих условиях (рис. 2). Активность антисыворотки на каждом этапе очистки контролировалась в иммунодиффузи-онном анализе.

В результате очистки была получена обогащенная фракция АТ, при этом основная масса белков сыворотки, в частности сывороточный альбумин, была удалена. Очищенные таким образом АТ не давали иеспецифического окрашивания в нммунодот-анализе. В иммуноблот-анализе полученные АТ в общем спектре белков меристематических клеток пшеницы выявляли 2 субъединицы 83-84 кДа, соответствующие ПАИ (рис. 3).

кДа

78 66

42

30 16 12

I 2 3

Рис. 3. Результаты имму-ноблот-анализа: I - общий спектр белков меристемы пшеницы в электрофорезе в ПААГ с ДСП. 2 - суммарная фракция белков меристемы, проявленная моноспецифическими АТ к 11ДИ, 3 - маркерные белки

3. Исследование субклеточной локализации ПАИ

В предыдущих работах была исследована локализация ПАИ в тканях и органах пшеницы (Евсеева, 1992: 5 и татка а а\., 2000). С использованием иммуно-дот-анализа было установлено, что ПАИ содержится в апексе стебля, кончике корня, узлах стебля и зародыше семени пшеницы. В то же время, ПАИ не был обнаружен в дифференцированных тканях пшеницы: корне, стебле, листе, а также в эндосперме. Тем самым было доказано, что ПАИ является специфическим белком меристематических клеток независимо от места их локализации.

кДа

41 66,2

45

21,5 14,4

■I

I —

1 2 3 4 5

Рис. 2. Результаты ЭФ в ПААГ с ДСП белков сыворотки: маркерные белки (I), исходная сыворотка (2), супернатант после осаждения сыворотки 3 %-ной каприловой кислотой (3), фракция после обессоливший на РО-Ю (4) и после катионо-обменной хроматографии (5).

Рис 4 Схема получения субклеточных фракций меристематических клеток пшеницы

Для дальнейшего исследования функциональной роли изучаемого белка, необходимо выяснение его субклеточной локализации

1 2 3

4 5

Рис 5 Результаты иммуно-дот-анализа субклеточных фракций меристематических клеток пшеницы с использованием моноспецифических антител к ПАИ 1 — ядро, 2 - цитозоль, 3 -хлоропласты, 4 - митохондрии, 5 - мембранная фракция

С использованием дифференциального центрифугирования было выделено 5 субклеточных фракций ядра, хлоропласты, митохондрии, мембранная фракция и цитозоль (рис 4) Все органоиды были получены по классической методике Дрейпера и Скотта (Генная инженерия растений, 1991) С использованием иммунодот-анализа ПАИ не был обнаружен в ядрах, хлоропластах, митохондриях и мембраной фракции и выявлялся только в цитозоле меристематических клеток пшеницы (рис 5)

На основании литературных данных (Холл с со-авт, 2002, Кулаева и Кузнецов, 2004, Тарчевский, 2002), можно предположить, что ПАИ, являясь ци-

тозольным белком, участвует в передаче сигнала от рецептора, расположенного на мембране, к другим системам клетки {т.е. в геном - ядерный, митохондри-апьный и т.д.), что приводит к включению/выключению генетических программ развития. Это предположение согласуется с предыдущими исследованиями (Фещенко с соавт., 1992), где установлена связь ПАИ с функциональной активностью стеблевых апексов пшеницы, а также с результатами экспериментов по исследованию морфогенетических процессов в культуре in vitro пшеницы.

4. Исследование иммунохимической гомологии цитоплазматических белков меристем растений различных таксономических групп

Известно, что белки, связанные с клеточным делением, достаточно консервативны. 11римером могут служить циклин-зависимые киназы, контролирующие прохождение клеточного цикла у всех эукариот (Doemer. 1994, Dewitte and Murray, 2003). В частности, ключевым белком клеточного цикла является про-теинкиназа P34C,J,:" , которая универсальна для всех эукариот и контролирует вступление клеток в митоз (Evans et at., 1983, John et al., 1989).

Также многие белки, участвующие в сигнальных системах и обнаруженные впервые у модельного растения Arabidopsis, найдены впоследствии и у других растений. По крайней мере, участки молекулы белка, ответственные за выполнение им основных функций, связанных с трансдукцией сигнала, аналогичны у растений различных видов, о чем свидетельствуют данные анализа строения уже выделенных белков и результаты анализа генома растении (Гречкин и Тар-чевский, 2000).

В нашей работе был проведен сравнительный иммунохимический анализ цитоплазматических белков меристем растений, принадлежащих к различным таксономическим группам. Были исследованы экстракты пятисуточных проростков пшеницы, ржи, сорго, подсолнечника и культуры водного растения воль-фии с использованием моноспецифических антител к ПАИ. Иммунодот-анализ показал, что в цитоплазме всех исследуемых растений содержатся белки, имеющие гомологичные антигенные детерминанты, характерные для ПЛИ (рис. 6),

Для дальнейшего исследования иммунохимической гомологии белков растений, принадлежащих к различным таксономическим группам, был проведен твердофазный иммуно-ферментиый анализ. Данные ИФА также демонстрируют наличие у

9 С ■ кЯ

а б в г д

Рис 6. Результаты сравнительного имму-нодот-анадиза цитоплазматических белков меристем растений: а - пшеница, б-рожь, r - copra, г - подсолнечник, д - вольфия.

= S и S X

с В 0.4

ill

С гш&ща рань cspro подсопн. вапьфя

Рис. 7. Результаты сравнительного иммуно-ферментного анализа цитоплазматических белков меристем растений.

всех исследуемых растений белков, имеющих антигенные детерминанты, гомологичные детерминантам ПАИ (рис. 7); причем максимальное содержание ПАИ наблюдалось у пшеницы.

Электрофоретический анализ ци-тогагазматических белков пшеницы, ржи, сорго, подсолнечника и воль-

|фии демонстрирует наличие полос, 45 соответствующих по молекулярной

массе ПАИ, у всех исследуемых рас" 31 тений. А иммуноблот-анализ выявляет именно эти белковые полосы у пшеницы и ржи (рис, 8). В то же 215 время белковые полосы, соответствующие по молекулярной массе ПЛИ не выявляются у других исследуемых культур. По-видимому, не хватает чувствительности полученных нами АТ к ПАИ в связи с более низким удельным содержанием его в этих культурах, о чем свидетельствуют и результаты ИФА.

Таким образом, было установлено, что ПАИ из меристематических клеток пшеницы имеет гомологичные антигенные детерминанты с цитоплазматическими белками меристем растений ржи, сорго, подсолнечника и водной культуры вольфии.

кДа 97 66.2

45

21.5 N.J

I

2

4 5 6

I 2 3 4 5

Рис.

Результаты ЭФ в ПААГ с ДСП (А) и иммуноблот-анализа (Б) цитоплаз-матических белков меристем пшеницы (1). ржи (2). сорго (3). подсолнечника (4) и вольфии (5); 6 - маркерные белки.

5. Исследование динамики содержания ПЛИ в соматических каллусах почти изогенных линий пшенииы, альтернативных по генам короткосте-бельности fill!, в процессе каллусогенеза н вторичной дифференциации

Способность клеток и тканей растений к культивированию in vitro зависит не только от эпигенетических характеристик экспланта и условий культивирования, но и от генотипа растения-донора (Бутенко, 1999; Ежова, 2003).

Несмотря на большое количество исследований по эмбриогенезу растений in vitro, многие вопросы этого уникального пути развития остаются нерешенными. В частности, малочисленны сведения о влиянии индивидуальных генов на проявление тотипотентности клеток in vitro на объектах со слабой регенерацией, к которым относятся злаки.

В связи с этим актуальной задачей является выявление роли конкретных генетических систем и генов, влияющих на способность растительных эксплан-тов к культивированию, а также идентификация новых белковых маркеров, отражающих морфогенетический потенциал каллусных клеток в культуре in vitro растений.

В предыдущих исследованиях на генетической модели, включающей высокорослый сорт мягкой яровой пшеницы Саратовская 29 и его почти изогенные линии, альтернативные по гену короткостебельности ШВ1с, была выявлена связь между морфогенетическим потенциалом каллусных клеток и содержанием в них ПАИ (Еувееуа г/ а1, 2002) Это позволило предположить, что ПАИ, вероятно, связан с системой Л/г^-генов, а также с образованием меристематиче-ских очагов в каллусной ткани Для того, чтобы доказать наше предположение, необходимо было включить в исследуемую генетическую модель изогенные линии, альтернативные по другим генам ЯЫ

В настоящей работе исследуемая генетическая модель включала сорт высокорослой яровой пшеницы (ТгШсит ае.Фхит Ь ) Саратовская 29 и набор его почти изогенных линий, включающий короткостебельные линии, несущие аллели ЯЫВ1с, ЯЫ14, ЛЫВ1Ъ, а также их соответствующие высокорослые сибы, несущие аллели Л2КЫВ1а, гЫ14, Л1 Ми В 1а Таким образом, было исследовано 7 генотипов Работа проводилась совместно с сотрудниками кафедры биотехнологии, селекции и генетики СГАУ им. Н И. Вавилова (д с -х н , проф Ю В Лобачев и к с -х н , доц О В Ткаченко)

Каллуссы пшеницы в процессе каллусогенеза и вторичной дифференциации анализировали на содержание ПАИ (иммуноферментный анализ) и морфогене-тическую способность (морфометрический анализ)

Сравнительный иммунохимический анализ содержания ПАИ в зародышах и каллусной ткани пшеницы в процессе каллусогенеза (30 суток) и последующей регенерации (9 суток) показал, что в зародышах (до начала культивирования) всех 7-и изучаемых генотипов содержание ПАИ было одинаковым (рис 9 (1)А, 9 (2)А, 9 (3)А) В процессе каллусогенеза проводили сравнительный анализ содержания ПАИ на 7-е, 14-е, 24-е и 30-е сутки культивирования На 7-е сутки каллусогенеза отмечалось снижение содержания ПАИ у всех исследуемых генотипов Начиная с 14 суток культивирования, отмечалось увеличение содержания ПАИ в каллусах всех изучаемых генотипов Причем, достоверное различие в увеличении содержания ПАИ по сравнению с высокорослым сибом наблюдалось только у короткостебельной линии с аллелем КЫВ1с (рис 9 (1)А) На 24-е и 30-е сутки каллусогенеза происходило дальнейшее увеличение содержания ПАИ, и достоверное различие между короткостебельными линиями и высокорослыми сибами наблюдалось у всех исследуемых генотипов (рис 9 (1) А, 9 (2)А, 9 (3)А) Морфометрический анализ, который был проведен на 30-е сутки культивирования, показал, что количество морфогенных каллусов у короткостебельной линии с аллелем ЛЫВ1с было на 18,3% больше (при НСР05=8 12), чем в сестринской высокорослой линии (рис 9 (1)Б) В тоже время не было отмечено достоверных различий по этому показателю у двух других исследуемых линий (рис 9(2)Б, 9 (3)Б)

А о.»

О 7 N 24 31) 32 39

Врчгчя культа внрояаннн,с}1

3 Саратовская 29 |Л Rhl-Blc ]JI2Rht-Bla

14 2J 30 32 Время культивировании сут

] Саратовская 29 1Л Rht-Blb ЭЛ IRht-Bla

1 К И ТО 31 У) Время ........ipOEOlW* С. Т

I I Саратовская 29 МЛ RIU14 ¡ZZ3JI rhtl4

-Линия гренда

Рис. 9. Динамика содержания ПАИ (А) и иыход морфогенных каллусов (Б) в процессе кал-лусогенеза и вторичной дифференциации у сорта пшеницы Саратовская 29, короткоетебель-IIой линии данного сорта с геном RhtBíc (.IRhtBlc) и ее высокорослого сиба Rhtfíla (JI2RhtB]а) (1). короткостебельной линии с геном Rlntílb (JlRtitBlb) и сс высокорослого си-оя RhtBla (il i RhtBl а) (2), короткоетебе льной линии с геном Rht¡4 U1RHM4) ее высокорослого сиба rhtl4 (Jlrhtl4) (3). HCPoí = 0.053 (А) и 8,12 (Б).

После переноса морфогенных каллусов на среду для регенерации содержание ПАИ продолжало увеличиваться у всех генотипов Но у короткостебельной линии с аллелем RhtBlc содержание ПАИ на 30-е и 32-е сутки достигало больших значений, чем у остальных исследуемых линий На 9-е сутки регенерации разница между генотипами несколько сглаживалась, что соответствовало, по-видимому, переходу к регенерации целых растений (рис 9 (1)А, 9 (2)А, 9 (3)А)

Нами установлена общая закономерность динамики содержания ПАИ в соматических каллусах пшеницы, заключающаяся в снижении уровня его содержания в процессе каллусогенеза и повышении уровня его содержания при вторичной дифференциации клеток до определенного максимального уровня в процессе регенерации растений (рис 9 (1)А, 9 (2)А, 9 (3)А)

Таким образом, созданная нами генетическая модель с использованием набора почти изогенных по Rht-тепш линий пшеницы представляет генотипы с различным морфогенетическим потенциалом Нами установлено влияние генов короткостебельности RhtBlc, RhtBlb и Rhtl4 на содержание ПАИ в каллусных клетках пшеницы Иммунохимический анализ показал, что короткостебельные линии на определенных этапах каллусогенеза и регенерации имеют более высокий показатель содержания ПАИ, чем их высокорослые сибы и исходный сорт пшеницы Саратовская 29 Причем, короткостебельная линия пшеницы с аллелем RhtBlc, обладающая по данным морфометрического анализа более высоким морфогенетическим потенциалом, имеет и более высокий показатель содержания ПАИ на ранних этапах (14 сутки) каллусогенеза по сравнению с другими короткостебельными линиями, несущими аллели RhtBlb и Rhtl4

6. Сравнительный анализ содержания ПАИ в меристематических зонах in vivo и в каллусных клетках in vitro пшеницы

Соматический эмбриогенез in vitro - наиболее общий путь развития, при котором соматические клетки высших растений под влиянием ряда сигналов превращаются в способные к развитию эмбриональные структуры Сравнительный анализ половых и соматических зародышей, развивающихся в естественных условиях и в культуре in vitro, позволяет говорить о параллелизме в их развитии, который проявляется в основных закономерностях морфогенеза В то же время, закономерности морфогенеза, установленные для конкретного генотипа в полевых экспериментах in vivo, могут в какой-то мере измениться при культивировании эксплантов в культуре in vitro (Батыгина, 1987, 1999)

Принимая во внимание результаты исследований морфогенетических процессов в культуре т vitro, мы решили проверить, возможно ли использование показателя содержания ПАИ в меристематических зонах in vivo для определения морфогенетического потенциала каллусов пшеницы в культуре in vitro Для этого был проведен сравнительный анализ содержания ПАИ в меристематических зонах in vivo и в каллусных клетках в культуре in vitro Исследование проводили на той же самой генетической модели Были исследованы растения пшеницы на двух этапах онтогенеза 5-суточные проростки и 22-суточные растения пшеницы

Сравнительный иммунохимический анализ содержания ПАИ в апексах стеблей 5-ти суточных проростков пшеницы не выявил достоверных различий между исследуемыми генотипами (рис. 10 А). В то же время высокорослые сибы и сорт Саратовская 29 значительно превосходили свои короткостебельные линии подлине колеоптиля (рис. 10 Б).

1.8 |.б 1,4

1.2 1

' <>.« 0,6 0,4 0,2 0

1

т -в

и 1 N н и уУ N II N i i — 1

Саратовская nRhlBIb Л1 Rh(B1a ílRhlBIc n2RtiiB)a ЛИМ14 29

Саратовская ЛЯ«В1Ь ЛШМВ1Э flRMEtc Л2 RhIBIa Í1RHI14

29

I - Саратовская 29; - короткостебельные линии: высокорослые сибы.

Рис 10. Содержание ПАИ в апексах пятисуточных проростков (А) и длина колеоптиля пятисуточных проростков (Б) яровой мягкой пшеницы сорта Саратовская 29 и набора его почти изогенных сестринских линий, альтернативных по генам Rhl. А. 1-1СРк = 0,428; Б. НСРИ = 0.360

В связи с тем, что в условиях in vitro различия в содержании ПАИ у исследуемых генотипов были выявлены только при формировании меристематиче-ских очагов в каллуеной ткани (рис. 9 (ПА, 9 (2)А, 9 (3)А), мы предположили, что соответствующие различия в условиях in vivo могут проявиться на более поздних этапах онтогенеза пшеницы, а именно на стадии образования узлов кущения. Сравнительный анализ содержания ПАИ в меристемагических клетках узлов кущения исследуемых генотипов показал, что короткостебельные линии с генами RhtBIc и Rhl 14 имели более высокий уровень содержания ПАИ по сравнению со своими высокорослыми сибами и исходным сортом Саратовская 29 (рис. i 1). На 30-е сутки культивирования каллусов был выявлен более высокий уровень содержания ПАИ у этих же генотипов пшеницы (рис. 9 (1)А, 9

(3)А). В то же время не было выявлено достоверной разницы в уровне содержания ПАИ в меристематических клетках узлов кушення у короткостебельной линии с геном RhiBlb по сравнению с ее высокорослым сибом и исходным сортом Саратовская 29 (рис. 11). Важно отметить, что на 30-ые сутки культивирования в культуре in vitro были выявлены достоверные различия по содержанию ПАИ в каллусах этих генотипов (рис. 9 (2)А).

Несоответствие между содержанием ПАИ in vivo и in vitro у короткостебельной линии с геном Rhtfílb подтверждает высказанное выше предположение о том, что морфогенетические процессы, протекающие in vivo, не всегда однозначно совпадают с аналогичными процессами, протекающими в культуре in vitro.

Сарэтоеаэя JlRhiBIc niRhlBia Л№114 nrtit14 JlRhtBIb JKRniBIa

28

E chotkii

]- Саратовская 29; ^H — короткостебельные линии; высокорослые сибы.

Рис. (i. Содержание ПАИ в меристематических клетках узлов кущений пшеницы сорта Саратовская 29, его короткостебельных линий и их высокорослых сибов. альтернативных по Д/г/-генам; HCP0j = 0,183.

Проведенными ранее исследованиями установлено, что общая кустистость донорного растения коррелирует с множественной регенерацией растений из каллусов (Соболева и Логинов, 2004). Также установлено, что коротко стебельные сорта пшеницы, несущие аллели генов Rht имеют более высокую степень кустистости (Лобачев, 2000), т.е. в узлах кущения у них закладывается больше боковых побегов, формирующихся из меристематических зон in vivo. По-видимому, этим и объясняется более высокий уровень содержания ПАИ в меристематических клетках узлов кущения in vivo у короткостебельных форм по сравнению с высокорослыми сибами и исходным сортом Саратовская 29, а также в каллусных клетках в культуре in vitro. В то же время у линии с геном Rhtfílb не во все годы наблюдается достоверно высокая общая кустистость (Лобачев, 2000). Это. вероятно, и является основной причиной недостаточно

высокого уровня содержания ПАИ в меристематических клетках узлов кущения у этого генотипа (рис 11)

Таким образом, в результате проведенных исследований определен этап онтогенеза пшеницы, позволяющий дифференцировать изучаемые генотипы по содержанию ПАИ в меристематических зонах in vivo Установлено, что содержание ПАИ в меристематических клетках узлов кущения изогенных линий пшеницы in vivo в целом отражает интенсивность закладки меристематических очагов в каллусной ткани тех же линий в культуре in vitro

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Основной задачей при культивировании растительных объектов, используемом для решения широкого круга фундаментальных и биотехнологических задач, является обеспечение сохранения клетками их морфогенетического потенциала Эксперименты с клетками in vitro показывают, что не только состав питательных сред, режимы культивирования, тип ткани экспланта, но и учет гено-типических особенностей растений являются условиями, необходимыми для получения культур, способных к морфогенезу (Бутенко, 1999, Kwon el al, 2001, Ежова, 2003)

В настоящей работе на генетической модели, включающей сорт пшеницы Саратовская 29 и набор его почти изогенных линий, альтернативных по генам короткостебельности Rht, была установлена связь между процессами, контролирующими развитие растений на молекулярном, тканевом и организменном уровнях В частности, выявлена связь между закладкой боковых побегов в зоне кущения различных генотипов пшеницы in vivo, а также процессами их регенерации в культуре in vitro — с одной стороны, и сравнительным уровнем содержания ПАИ у этих генотипов - с другой стороны Установление подобных связей считается одной из главных задач в исследовании морфогенетических процессов в растениях

Выявленная нами субклеточная локализация ПАИ, гомологичность антигенных детерминант ПАИ и цитоплазматических белков растений других таксономических групп, а также связь ПАИ с морфогенетическими процессами, позволяют предположить, что данный белок может являться одним из компонентов сигнал-трансдукторной системы меристематических клеток растений, передающей вне- и внутриклеточные сигналы в геном клеток при переключении на различные программы развития Можно также допустить, что синтез этого белка связан с экспрессией генов, контролирующих запуск морфогенетической программы развития у недифференцированных клеток in vitro

На основании полученных данных мы можем констатировать, что ПАИ может быть использован в селекционных программах в качестве дополнительного критерия морфогенетической способности тестируемых линий пшеницы не только в дорогостоящих экспериментах в культуре гп vitro, но и в полевых или вегетационных опытах in vivo

ВЫВОДЫ

1 С использованием усовершенствованной иммунохимической тест-системы исследована субклеточная локализация ПАИ и установлено, что он является цитозольным белком

2 Обнаружено, что ПАИ из меристематических клеток пшеницы имеет гомологичные антигенные детерминанты с соответствующими структурами цитоплазматических белков меристем ржи, сорго, подсолнечника и воль-фии

3 Показано, что изменение процедуры иммунизации животных с использованием препарата, элюированного из полосы полиакриламидного геля, соответствующей ПАИ в нативном электрофорезе, позволяет упростить методику и получить моноспецифические AT к ПАИ с более высоким титром

4 Установлено влияние генов короткостебельности RhtBlc, Rhtl4 и RhtBlb на содержание ПАИ в каллусных клетках пшеницы, выявлена общая закономерность динамики содержания ПАИ в процессе каллусогенеза и вторичной дифференциации соматических каллусов почти изогенных линий пшеницы, альтернативных по указанным генам

5 Установлено, что содержание ПАИ в меристематических клетках узлов кущения почти изогенных линий пшеницы in vivo в целом отражает мор-фогенетическую способность соматических каллусов тех же линий в культуре in vitro

6 Показано, что содержание ПАИ в соматических каллусах пшеницы позволяет оценить их морфогенетическую способность на более ранних этапах по сравнению с морфометрическим анализом, что открывает перспективу его использования в агробиотехнологии в качестве дополнительного критерия в селекционной работе

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1 Евсеева Н В, Ткаченко О В , Лобачев Ю В , Фадеева И Ю , Щеголев С Ю Биохимическая оценка морфогенетического потенциала каллусных клеток в культуре ш vitro пшеницы // Физиология растений - 2007 - N 2 - С 306-311

2 Ткаченко О В , Лобачев Ю В , Евсеева Н В , Фадеева И Ю , Щеголев С Ю Сравнительный анализ содержания пролиферативного антигена инициальных клеток в культуре in vivo и in vitro пшеницы // Вестник СГАУ - 2007 — N 1 -С 27-31

3 Евсеева Н В , Ткаченко О В , Лобачев Ю В , Фадеева И Ю , Щеголев С Ю Молекулярные маркеры морфогенеза в исследовании устойчивости растений к экстремальным факторам внешней среды // Стрессовые белки растений Материалы Всероссийской научной конференции Иркутск, 6-10 сентября 2004 -Иркутск Изд-во Института географии СО РАН, 2004 - С 44-47

4 Evseeva N V , Tkachenko О V Lobachev Yu V , Fadeeva I Yu , and Shchyogo-

lev S.Yu A novel molecular marker for morphogenesis in an in vitro culture of wheat // Annual Wheat Newsletter / Kansas State University (USA) - 2004 - V 50 -P 122-123

5 Évseeva N V , Tkachenko О V Lobachev Yu V, Fadeeva I Yu , and Shchyogo-lev S Yu Study of embryogenic processes in the wheat somatic callus with the use of genetic models // Annual Wheat Newsletter / Kansas State University (USA) -2005 -V 51 -P 116

6 Евсеева H В , Фадеева И Ю , Коробейников С В , Прянишников А И, Ще-голев С Ю Исследование функциональной активности стеблевых апексов озимой пшеницы при адаптации их к низкой температуре // Тезисы докладов V съезда общества физиологов растений России Пенза, 15-21 сентября 2003 -Пенза, 2003 - С 272

7 Фадеева И Ю , Евсеева Н В , Щеголев С Ю Субклеточная локализация пролиферативного антигена инициальных клеток в стеблевых апексах пшеницы // Современные проблемы теоретической и экспериментальной химии Тезисы докладов IV Всероссийской конференции молодых ученых Саратов, 2325 июня 2003 -Саратов Изд-во СГУ, 2003 -С 119

8 Фадеева И Ю, Евсеева Н В Иммунохимическое исследование пролиферативного антигена инициальных клеток апикальных меристем пшеницы // Вави-ловские чтения - 2003 Тезисы докладов межрегиональной научной конференции молодых ученых и специалистов системы АПК Приволжского федерального округа Саратов, 25-26 ноября 2003 - Саратов Изд-во СГАУ, 2003 -С 24-26

9 Евсеева Н В , Фадеева И Ю , Ткаченко О В , Лобачев Ю В , Щеголев С Ю Исследование постстрессовых восстановительных процессов в клетках стеблевых апексов различных по засухоустойчивости генотипов пшеницы // Вавилов-ские чтения - 2004: Сборник материалов Всероссийской научно-практической конференции Саратов, 24-26 ноября 2004 - Саратов Изд-во СГАУ, 2004 - С 17-20

10 Евсеева Н В , Фадеева И Ю, Ткаченко О В., Лобачев Ю В , Щеголев СЮ Сравнительный анализ содержания пролиферативного антигена инициальных клеток в меристемах изогенных линий пшеницы на разных этапах онтогенеза // Вавиловские чтения - 2005 Сборник материалов Всероссийской научно-практической конференции Саратов, 23-25 ноября 2005. - Саратов Изд-во СГАУ, 2005.-С 19-20

11 Фадеева И Ю , Евсеева Н В , Ткаченко О В , Лобачев Ю В , Щеголев С Ю Белковые маркеры в исследовании эмбриогенных процессов в культуре in vitro пшеницы // Биология - наука XXI века Сборник тезисов 9-ой международной школы - конференции молодых ученых Пущино, 18-22 апреля 2005 -Пущино, 2005 -С 99

12 Евсеева HB, Фадеева ИЮ, Лобачев ЮВ, Ткаченко О.В , Щеголев С Ю Пролиферативный антиген инициальных клеток в сравнительном исследовании морфогенетических процессов in vivo и пшеницы // Молекулярные механизмы взаимодействия микроорганизмов и растений фундаментальные и прикладные аспекты Материалы всероссийской конференции Саратов, 15-17

июня 2005 - Саратов Изд-во "Научная книга", 2005 - С 43-44

13 Фадеева И Ю , Неробеева Е В , Илюхова О В , Галицкая А А , Селиванов Н Ю, Евсеева Н В , Щеголев С Ю Исследование иммунохимической гомологии цитоплазматических белков меристем однодольных растений // Там же -С 51-52

14 Евсеева НВ, Фадеева ИЮ, Ткаченко ОВ, Лобачев ЮВ, Щеголев С Ю Пролиферативный антиген инициальных клеток в исследовании морфо-генетических процессов в культуре in vitro пшеницы // Вавиловские чтения -2006 Сборник материалов Всероссийской научно-практической конференции Саратов, 5-7 декабря 2006 -Саратов Изд-во СГАУ, 2006 - С 59-61

Подписано в печать 25 04 2007 Формат 60><84 1/16 Гарнитура Times Бумага типовая Объём 1 печ л Тираж 100 экз Отпечатано с готового оригинал-макета в ИБФРМ РАН 410049, Саратов, пр Энтузиастов, 13

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Фадеева, Ирина Юрьевна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Клеточные антигены как фенотипические маркеры морфогенетических процессов и функционального состояния растительных клеток

1.2 Регуляция клеточного цикла в живых организмах

1.3 Роль белков в восприятии и передаче сигналов в геном растительной клетки

1.4 Молекулярные маркеры растений, связанные с морфогенезом в культуре in vitro

1.5 Пролиферативный антиген ипициалей как молекулярный маркер меристематических клеток пшеницы

2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1 Выделение суммарной водорастворимой фракции меристематических белков растений различных таксономических групп

2.2 Получение мопоспецифических антител к ПАИ

2.3 Очистка антител

2.3.1 Фракционирование сыворотки каприловой кислотой

2.3.2 Ионообменная хроматография

2.4 Электрофорез в полиакриламидпом геле

2.5 Двойная иммуподиффузия в агарозиом геле

2.6 Иммунодот/блот-анализ

2.7 Твердофазный иммуноферментный анализ

2.8 Условия культивирования незрелых зародышей пшеницы в культуре in vitro и морфометрический анализ

2.9 Выделение субклеточных фракций пшеницы с использованием дифференциального центрифугирования

2.9.1 Выделение хлоропластов

2.9.2 Выделение митохондрий

2.9.3 Выделение мембранной и цитозолыюй фракций

2.9.4 Выделение ядер 60 3 РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

3.1 Усовершенствование методики получения моноспецифических антител к ПАИ

3.2 Очистка антител к ПАИ с использованием каприловой кислоты в комбинации с ионообменной хроматографией

3.3 Исследование субклеточной локализации ПАИ

3.4 Исследование иммунохимической гомологии цитоплазматических белков меристем растений различных таксономических групп

3.5 Исследование динамики содержания ПАИ в соматических каллусах изогенных линий пшеницы, альтернативных по Rht-генам, в процессе каллусогенеза и вторичной дифференциации

3.6 Сравнительный анализ содержания ПАИ в культуре in vitro и in vivo пшеницы

Введение Диссертация по биологии, на тему "Пролиферативный антиген инициалей в исследовании морфогенетических процессов в культуре in vitro пшеницы"

Актуальность темы. Молекулы белков и ДНК являются важными объектами в изучении морфогенетических процессов растений на молекулярном и клеточном уровнях. Результаты этих исследований представляют большой интерес не только для развития фундаментальной пауки, но и для биотехнологии, создавая основу для совершенствования селекционного процесса с использованием современных клеточных технологий. Исследования подобного рода на уровне целого растения затруднены интегральным характером морфогенетических процессов и зависимостью их от многих внутренних и внешних факторов (Бутенко, 1999; Батыгина, 1999).

Изолированные культуры органов, тканей и клеток, помещенные в контролируемые условия (минеральное питание, температура, освещенность и экзогенные гормональные добавки), являются удобными моделями для изучения морфогенетических процессов у растений. В частности, принципиально важным моментом в исследованиях соматического эмбриогенеза является анализ самых ранних его этапов, когда отдельные клетки в каллусной массе или суспензии приобретают способность развиваться в эмбриоид. Прежде всего, представляют интерес сигналы и индукторы этого процесса, заставляющие недифференцированную клетку in vitro переключаться на определенный путь развития (Бутенко, 1999; Лутова, 2003).

Выяснение молекулярных основ морфогенеза растений привлекает внимание довольно большого числа исследователей. Особое внимание уделяется, например, генам-переключателям развития (Хавкин, 1998; Smith et al, 2004; Sablowski, 2007) и продуктам их экспрессии (Карабаев и Джардемалиев, 1994; Bommert et al, 2005; Cole et al, 2006), которым отводится основная роль в пространственно-временной регуляции процессов морфогенеза. Несмотря на это, еще недостаточно изученными остаются гены, контролирующие наиболее общие процессы деления и последующей дифференциации клеток (Devvitte and Murray, 2003; Reddy and Meyerovvitz, 2005). Именно они определяют судьбу индивидуальной клетки: продолжать ли ей делиться или переходить к растяжению и дифференциации.

Кроме того, закономерности морфогенеза, установленные для конкретного генотипа в полевых экспериментах in vivo, могут значительно измениться при культивировании эксплантов в культуре in vitro (Батыгина, 1999; Соболева и Логинов, 2004). Учитывая, что решение задач повышения эффективности морфогенеза имеет большое значение для развития соответствующих биотехнологий с использованием методов клеточной селекции растений, представляется актуальным сравнительный анализ особенностей протекания соответствующих процессов, происходящих in vivo и in vitro. Их решению может способствовать выявление надежных биохимических и/или морфологических маркеров, отражающих общие закономерности развития растений в условиях in vivo и in vitro и позволяющих отбирать генотипы с высоким морфогенетическим потенциалом.

К началу наших работ по данной теме в исследованиях, начатых в группе иммунохимии растительных клеток ИФР РАН (г. Москва) под руководством А.Д. Володарского и продолженных совместно в Лаборатории физической химии клеточных структур ИБФРМ РАН, был выявлен молекулярный маркер меристематических клеток пшеницы, названный пролиферативпым антигеном инициалей (ПАИ). Разработаны теоретические и экспериментальные основы технологии создания иммунодиагностикума к ПАИ и исследовано его распределение в тканях и органах растения. Установлена целесообразность использования ПАИ в качестве белкового маркера меристематических клеток пшеницы для оценки селекционного растительного материала на устойчивость к действию неблагоприятных факторов внешней среды (Володарский с соавт., 1996; Евсеева с соавт., 2004; Evseeva et al., 2004).

Целью настоящей работы было изучение субклеточной локализации ПАИ с использованием усовершенствованной иммунохимической тест-системы, анализ гомологичности антигенных детерминант ПАИ соответствующим структурам белков растений других таксономических групп и оценка его информативности в качестве молекулярного маркера меристематических клеток в исследованиях морфогенетических процессов в культуре in vitro пшеницы.

В ходе исследования решали следующие задачи:

1. Усовершенствовать методику получения и очистки моноспецифических антител к ПАИ.

2. Исследовать субклеточную локализацию ПАИ с использованием усовершенствованной иммунохимической тест-системы.

3. Оценить иммунохимическую гомологию ПАИ цитоплазматическим белкам меристем растений различных таксономических групп.

4. Исследовать динамику содержания ПАИ в соматических каллусах почти изогенных линий пшеницы, альтернативных по генам короткостебельности Rht, в процессе каллусогенеза и вторичной дифференциации.

5. Провести сравнительный анализ содержания ПАИ в меристематических зонах in vivo и каллусных клетках in vitro почти изогеппых линий пшеницы, альтернативных по ряду генов короткостебельности Rht.

Научная новизна работы. Впервые проведено исследование внутриклеточной локализации ПАИ. Показано, что ПАИ является цитозольным белком. Впервые обнаружена иммунохимическая гомология ПАИ цитоплазматическим белкам растений различных таксономических групп. Выявлена общая закономерность динамики содержания ПАИ в процессе каллусогенеза и вторичной дифференциации в культуре in vitro на генетической модели, включающей 7 генотипов яровой мягкой пшеницы. На примере трёх генов короткостебельности RhtBlc, Rhtl4 и RhtBlb показано их влияние на содержание ПАИ в каллусных клетках пшеницы. Впервые установлено, что содержание ПАИ в меристематических клетках узлов кущения почти изогенных линий пшеницы in vivo в целом отражает морфогенетический потенциал соматических каллусов тех же линий в культуре in vitro. Впервые показано, что уровень содержания ПАИ в каллусных клетках пшеницы позволяет оценить их морфогенетическую способность на более ранних этапах по сравнению с морфометрическим анализом.

Научно-практическая значимость. Полученные результаты позволяют рекомендовать ПАИ для исследований морфогепетических процессов в растениях, что открывает перспективу его использования в соответствующих отраслях агробиотехнологии в качестве дополнительного критерия морфогепетической способности тестируемых линий пшеницы в селекционной работе.

Кроме того, предложенная нами стратегия получения высокоспецифических поликлональпых антител может быть использована в иммупохимических исследованиях белков эукариотических и прокариотических клеток.

Результаты работы используются в учебном процессе при подготовке курсовых и дипломных работ студентов в Саратовском государственном университете им. Н.Г.Чернышевского и в Саратовском государственном аграрном университете им. Н.И.Вавилова.

Апробация работы. Материалы исследований, изложенные в диссертации, были представлены на 9-й Международной Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология - наука 21 века» (Пущино, Россия, 2005), на 4-й Всероссийской конференции молодых ученых «Современные проблемы теоретической и экспериментальной химии» (Саратов, Россия, 2003), на Всероссийской конференции «Молекулярные механизмы взаимодействия микроорганизмов и растений: фундаментальные и прикладные аспекты» (Саратов, Россия, 2005), на Всероссийской конференции «Стрессовые белки растений» (Иркутск, Россия, 2004), на международной конференции «Физиология растений -основа фитобиотехнологии» (Пенза, Россия, 2003), на межрегиональной конференции молодых ученых и специалистов системы АПК Приволжского федерального округа «Вавиловские чтения - 2003» (Саратов, Россия, 2003), на Всероссийских конференциях «Вавиловские чтения - 2004, - 2005, - 2006» (Саратов, Россия, 2004 - 2006).

Диссертация обсуждена и одобрена на расширенном заседании лаборатории физической химии клеточных структур ИБФРМ РАН.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 14 работ, в том числе 2 статьи в отечественных рецензируемых научных изданиях.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту.

1. ПАИ выявляется только в цитозоле меристематических клеток пшеницы и не обнаружен в ядрах, хлоропластах, митохондриях, плазмалемме и мембранных фракциях ряда клеточных органелл.

2. Цитоплазматические белки ржи, сорго, подсолнечника и вольфии содержат антигенные детерминанты, гомологичные детерминантам ПАИ.

3. Гены короткостебелыюсти ЯЫВ1с, Шй4 и Я.ШВ1Ь оказывают влияние иа динамику содержания ПАИ в процессе каллусогенеза и вторичной дифференциации соматических каллусов почти изогенных линий пшеницы, альтернативных по этим генам.

4. Содержание ПАИ в меристематических клетках узлов кущения почти изогенных линий пшеницы в полевых экспериментах in vivo в целом отражает морфогенетическую способность каллусной ткани тех же линий в культуре in vitro.

5. Определение содержания ПАИ в соматических каллусах пшеницы позволяет оценить их морфогенетическую способность на более ранних этапах по сравнению с морфометрическим анализом, что открывает перспективу его использования в агробиотехнологии в качестве дополнительного критерия в селекционной работе.

Объем и струюура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, изложения полученных результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы, содержащего 292 источника, в том числе - 219 зарубежных. Работа изложена на 119 страницах машинописного текста, содержит 30 рисунков.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Фадеева, Ирина Юрьевна

ВЫВОДЫ

1. С использованием усовершенствованной иммунохимической тест-системы исследована субклеточная локализация ПАИ и установлено, что он является цитозольным белком.

2. Обнаружено, что ПАИ из меристематических клеток пшеницы имеет гомологичные антигенные детерминанты с соответствующими структурами цитоплазматических белков меристем ржи, сорго, подсолнечника и вольфии.

3. Показано, что изменение процедуры иммунизации животных с использованием препарата, элюированного из полосы полиакриламидного геля, соответствующей ПАИ в нативном электрофорезе, позволяет упростить методику и получить моноспецифические AT к ПАИ с более высоким титром.

4. Установлено влияние генов короткостебельности RhtBlc, Rhtl4 и RhtBlb на содержание ПАИ в каллусных клетках пшеницы; выявлена общая закономерность динамики содержания ПАИ в процессе каллусогенеза и вторичной дифференциации соматических каллусов почти изогеппых линий пшеницы, альтернативных по указанным генам.

5. Установлено, что содержание ПАИ в меристематических клетках узлов кущения почти изогеппых линий пшеницы in vivo в целом отражает морфогенетическую способность соматических каллусов тех же линий в культуре in vitro.

6. Показано, что содержание ПАИ в соматических каллусах пшенйЦЫ позволяет оценить их морфогенетическую способность на более ранних этапах по сравнению с морфометрическим анализом, что открывает перспективу его использования в агробиотехнологии в качестве дополнительного критерия в селекционной работе.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Основной задачей при культивировании растительных объектов, используемых для решения широкого круга фундаментальных и биотехнологических задач, является обеспечение сохранения клетками их морфогенетического потенциала. Эксперименты с клетками in vitro показывают, что не только состав питательных сред, режимы культивирования, тип ткани экспланта, но и учет генотипических особенностей растений являются условиями, необходимыми для получения культур, способных к морфогенезу (Бутенко, 1999; Kwon et al., 2001; Ежова, 2003).

В настоящей работе на генетической модели, включающей сорт пшеницы Саратовская 29 и набор его почти изогенных линий, альтернативных по генам короткостебельности Rht, была установлена связь между процессами, контролирующими развитие растений на молекулярном, тканевом и организменном уровнях. В частности, выявлена связь между закладкой боковых побегов в зоне кущения различных генотипов пшеницы in vivo, а также процессами их регенерации в культуре in vitro - с одной стороны, и сравнительным уровнем содержания ПАИ у этих генотипов - с другой стороны. Установление подобных связей считается одной из главных задач в исследовании морфогенетических процессов в растениях.

Выявленная нами субклеточная локализация ПАИ, гомологичность антигенных детерминант ПАИ и цитоплазматических белков растений других таксономических групп, а также связь ПАИ с морфогенетичеекими процессами, позволяют предположить, что данный белок может являться одним из компонентов сигнал-трансдукторной системы меристематических клеток растений, передающей вне- и внутриклеточные сигналы в геном клеток при переключении на различные программы развития. Можно также допустить, что синтез этого белка связан с экспрессией генов, контролирующих запуск морфогенетической программы развития у недифференцированных клеток in vitro.

На основании полученных данных мы можем констатировать, что ПАИ может быть использован в селекционных программах в качестве дополнительного критерия морфогенетической способности тестируемых линий пшеницы не только в дорогостоящих экспериментах в культуре in vitro, но и в полевых или вегетационных опытах in vivo.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Фадеева, Ирина Юрьевна, Саратов

1. Абелев Г.И. Эмбриональные антигены в опухолях. Анализ системы альфа-фетопротеина. // Опухолевый рост как поблема биологии развития / Под ред. Гелыптейн В.И. М.: Наука, 1979. - С. 148-173.

2. Авакян А.Э., Ткачук В.А. Структурная и функциональная организация систем передачи сигнала через рецепторы, сопряженные с G-белками // Рос. физиол. журн. им. И.М. Сеченова. -2003. -Т.89, N. 2. С. 219-239.

3. Альберте Б., Брей Д., Льюис Дж., Рэфф М., Роберте К., Уотсон Дж. Молекулярная биология клетки. М.: Мир, 1994. Т. 2. - 539 с.

4. Антитела. Методы. / Под ред. Кэтти Д. М.: Мир, 1991. - Т. 1. 287 с.

5. Батыгина Т.Б. Хлебное зерно. Л.: Наука, 1987. - 102 с.

6. Батыгина Т.Б. Эмбриогенез и морфогенез половых и соматических зародышей // Физиология растений. 1999. - Т. 46. - С. 884-898.

7. Батыгина Т.Б. Эмбриоидогения новая категория способов размножения цветковых растений // Тр. Ботан. ин-та им. ВЛ.Комарова. - 1993. - В. 8. - С. 15-25.

8. Бузовкина И.С., Лутова Л.А., Кнешке И. Генетический анализ признака "чувствительность к цитокинину" у редиса in vitro II Генетика. 1993. - Т. 29, N6.-С. 995-1001.

9. Бутенко Р.Г. Биология клеток высших растений in vitro и биотехнологии на их основе. Учебное пособие. М.: ФБК-ПРЕСС, 1999. - 160 с.

10. Бутенко Р.Г., Володарский А.Д. Специфика антигенов в цикле клеточных превращений в культуре ткани табака // Физиология растений. 1967. - Т. 14. -С. 965-971.

11. Войников В.К., Константинов Ю.М., Негрук В.И. Генетические функции митохогдрий растений. Новосибирск: Наука. Сиб. Отд-ние, 1991. - 183 с.

12. Володарский А.Д. Иммунохимический анализ в решении теоретических и прикладных проблем физиологии растений // Новые направления в физиологии растений. М.: Наука, 1985. - С. 47-61.

13. Володарский А.Д., Курушина Н.В., Романовская О.И. Антигенный состав клеток апикальной меристемы клеток ржи при торможении у нее ростовыхпроцессов эфетоном // Физиология растений. 1986. - Т. 33, N. 1. - С. 116121.

14. Гамбург К.З., Рекославская Н.И., Швецов С.Г. Ауксины в культурах тканей и клеток растений. Новосибирск: Наука. 1990. - 243 с.

15. Генная инженерия растений / Пер. с англ.; Под редакцией Дж. Дрейпера-М.: Мир, 1991. -408 с.

16. Гречкин А.Н., Тарчевский А.И. Сигнальные системы клеток и геном // Биоорганическая химия. 2000. - Т. 26, N. 10. - С. 779-781.

17. Гудвин Т., Мерсер Э. Введение в биохимию растений /Под ред. Кретовича В.А.: Пер. с англ. -М.: Мир, 1986. 468 с.

18. Долгих Ю.И., Китлаев Г.Б., Бутенко Р.Г. Физиологическое действие электрического тока на культуру клеток кукурузы in vitro // Докл. РАН. -1994. Т. 335.-N 3. - С. 393-395.

19. Евсеева Н.В. Иммунохимическое исследование пролиферативного антигена инициалей апикальной меристемы побега у пшениц с различной устойчмвостью к экстремальным факторам внешней среды: Автореф. дис. . канд. биол. наук / ИФР РАН. М., 1993. - 116 с.

20. Ежова Т.А. Генетический контроль тотипотентности растительных клеток в культуре in vitro // Онтогенез. 2003. - Т. 34, N 4. - С. 245-252.

21. Заграничная Т.К., Бровко Ф.А., Шепеляковская А.О., Бозиев Х.М., Липкин В.М. Моноклональные антитела к цитокипиисвязывающему белку 70 кДа из этиолированных проростков кукурузы // Физиология растений. 1997. - Т. 44.-С. 5-10.

22. Карабаев М.К., Джардемалиев Ж.К. Культивируемые клетки пшеницы и кукурузы. Морфогенез и толерантность // Физиология растений. 1994. - Т. 41.-С. 807-814.

23. Кириллова H.B. Изменение активности супероксиддисмутазы в каллусной культуре Rauwolffia serpentine Benth., выращенной в стандартных условиях и при температурном шоке // Прикладная биохимия и микробиология. 2004. -Т. 40, N. 1.-С. 89-93.

24. Ковалева JI.B., Комарова Э.Н., Выскребенцева Э.И. Сопрофитно-гаметофитные взаимодействия в системе пыльца-пестик. 1. Лектины клеточных стенок // Физиология растений. 1999. - Т. 46, N 1. - С. 98-101.

25. Ковалева Л.В., Копеина Е.В. Антигенная специфичность репродуктивных элементов лука Allium nutans II Докл. АН СССР. 1991. - Т. 321. - С. 227230.

26. Коваленко О.В. Генетические аспекты морфогенеза растений // Успехи современной биологии, 1993.-Т.113, Вып. З.-С. 269-285.

27. Конарев В.Г. Белки растений как генетические маркеры. М.: Колос, 1983. -320 с.

28. Копертех Л.Г., Бутенко Р.Г. Нативные фитогормоны экспланта и морфогенез пшеницы in vitro II Физиология растений. 1995. - Т. 42. - С. 555-558.

29. Копертех Л.Г., Стрибная Л.А. Регенерация растений из листовых эксплантов пшеницы // Физиология растений. -2003. Т. 50, N. 3. - С. 410-414.

30. Круглова H.H., Горбунова В.Ю., Батыгина Т.Б. Эмбриоидогенез как путь морфогенеза в культуре изолированных пыльников злаков // Успехи современной биологии. 1995. - Т. 115., Вып. 6. - С. 692-705.

31. Кулаева О.Н., Кузнецов В.В. Новейшие достижения и перспективы в области изучения цитокининов. // Физиология растений. 2002. - Т. 49, N. 4. - С. 626-640.

32. Кулаева О.Н., Кузнецов В.В. Новейшие достижения и перспективы изучения механизма действия фитогормонов и их участия в сигнальных системах целого растения // Вестник РФФИ. 2004. - Т. 36, N. 2. - С. 12-36.

33. Кулинский В.И., Колесниченко Л.С. Актуальные и дискуссионные аспекты гормонологии//Биохимия. 1997.-Т. 62.-Вып. 10.-С. 1369-1372.

34. Кулинский В.И., Колесниченко Л.С. Молекулярные механизмы действия гормонов I. Рецепторы. Нейромедиаторы. Системы со вторыми посредниками // Биохимия. 2005. - Т. 70, Вып. 1. - С. 33-50.

35. Кучеренко Jl. Условия получения растений-регенерантов в культуре тканей риса // С/х биология. 1983. - N 4. - С. 70-72.

36. Лобакова Е.С., Плелошкина О.Ю., Бутенко Р.Г. Морфология распределения актина в клетках морфогенного каллуса пшениц // Докл. РАН. 1997. - Т. 352.-С. 284-286.

37. Лобачев Ю.В. Проявление генов низкорослости у яровых пшениц в Нижнем Поволжье. Саратов: Сарат. гос. агр. ун-т, 2000. - 264 с.

38. Лутова Л.А. Биотехнология высших растений. СПб.: Изд-во Санкт-Петербургск. ун-та, 2003. - 227 с.

39. Максимов В.Н. Многофакторный эксперимент в биологии. М.: Изд-во МГУ, 1980.-279 с.

40. Марченко А.О. Реализация морфогенетического потенциала растительных организмов // Успехи современной биологии. 1996. - Т.116, В. 3. - С. 306319.

41. Михайлов А.Т., Симирский В.Н. Методы иммунохимического анализа в биологии развития. М.: Наука, 1991. - 228 с.

42. Моисеева H.A., Джаникашвили М.И., Смит М.В., Бутенко Р.Г. Модельная система для изучения закономерностей развития соматических эмбриоидов в культуре тканей растений // Цитология. 1987. - Т. 29. - С. 1093.

43. Моисеева H.A. Молекулярные и клеточные механизмы морфогенеза в культуре клеток растений // Биология культивируемых клеток и биотехнология растений / Под ред. Р.Г. Бутенко, М.: Наука, 1991. С. 166186.

44. Муравлев А.И., Чикаев H.A., Никонова A.A., Шелковникова H.H., Мертвецов Н.П. Иммунохимическая идентификация белковых продуктов трех новых генов из области р13-14 хромосомы 11 человека. // Молекулярная биология. 1999. - Т.З, N. 2. - С. 163-168.

45. Носов A.B. Тимидинкиназа высших растений. 1. Функциональная топография тимидинкиназы в клеточном цикле // Физиология растений-1995.-Т. 42, N 4.-С. 539-546.

46. Носов A.B. Тимидинкиназа высших растений. 2. Выделение и очистка фермента из проростков кормовых бобов // Физиология растений.-1995 Т. 42, N 5.-С. 734-745.

47. Носов A.B. Тимидинкиназа высших растений. 3. Свойства фермента из проростков кормовых бобов // Физиология растений. 1995. - Т. 42, N 5 - С. 746-753.

48. Патент Российской Федерации N 2062562, МКИ Cl, 6А01Н 1/04. Способ оценки селекционного материала на устойчивость к стрессовым факторам / Володарский А.Д., Евсеева Н.В., Кумаков В.А. Бюлл. Изобр. N 18, 1996.

49. Романов Г.А. Гормонсвязывающие белки растений и проблема рецепции фитогормонов//Физиология растений. 1989.-Т.36.-Вып. 1.-С. 166-171.

50. Романов Г.А. Рецепторы фитогормонов // Физиология растений. 2002. -Т49, N 4. - С. 615-625.

51. Романов Г.А., Медведев С.С. Ауксины и цитокинины в развитии растений. Последние достижения в исследовании фитогормонов. Второй международный симпозиум (Прага, Чехия, 7-12 июля 2005 г.) // Физиология растений. 2006. - Т. 53, N. 2. - С. 309-319.

52. Романов Г.А., Обручева Н.В., Новикова Г.В., Мошков И.Е. 17-ая Международная конференция по ростовым веществам растений (хроника) // Физиология растений. 2002. - Т. 49. - С. 330-336.

53. Румянцева Н.И. Арабиногалактановые белки: участие в росте и морфогенезе растений//Биохимия.-2005.-Т. 70, N. 10.-С. 1301-1317.

54. Румянцева Н.И., Валиева А.И., Самохвалова H.A. Особенности лигнификации клеточных стенок каллусов гречихи, различающихся по способности к морфогенезу // Цитология. 1998. - Т.40, N. 10. - С. 835-843.

55. Саламатова Т.С. Физиология растительной клетки Л.: Изд-во Ленингр. унта, 1983. -232 с.

56. Самуилов В.Д., Олескин A.B., Лагунова Е.М. Программируемая клеточная смерть. Обзор // Биохимия. 2000. - Т. 65, N. 8. - С. 1029-1046.

57. Селивапкина С.Ю., Каравайко H.H., Черепнева Г.Г., Прищепова А.Е., Кузнецов В.В., Кулаева О.Н. Биологически активный зеатин-связывающий белок из хлоропластов листьев ячменя // Доклады академии наук. 1997. - Т. 365, N. 6.-С. 830-832.

58. Сидоров В.А. Биотехнология растений. Клеточная селекция. Киев: Наукова думка, 1990.-280 с.

59. Соболева М.И., Логинов И.В Статистические характеристики, маркирующие морфогенез в каллусных культурах яровой мягкой пшеницы // Физиология растений. 2004. - Т. 51, N. 2. - С. 287-296.

60. Соколова О.С. Взаимодействие соматических клеток при трансплантации и морфогенезе у растений: Автореф. дис. канд. биол. наук / ИФР РАН. -М., 1996.-24 с.

61. Стендифер Д.К. Иммуноферментный анализ гаптенов и антигенов с разделением компонентов (гетерогенный анализ). / В кн. Иммуноферментный анализ: Пер. с англ. / Под редакций Т. Нго и Г. Ленхоффа. М.: Мир. 1988.-С. 172-192.

62. Тарчевский И.А. Метаболизм растений при стрессе (избранные труды). -Казань: Фэн, 2001.-448с.

63. Тарчевский И.А. Сигнальные системы клеток растений. / Под ред. А.Н. Гречкина. М.:Наука, 2002. 294с.

64. Тарчевский И.А. Элиситор-индуцируемые сигнальные системы и их взаимодействие // Физиология растений. 2000. - Т. 47, N. 2. - С. 321-331.

65. Туркина М.В., Куликова A.JL, Коппель J1.A., Акатова J1.3., Бутенко Р.Г. Актин и термостабильные актинсвязывающие белки в культуре клеток пшеницы // Физиология растений. 1995. - Т. 42. - С. 348-355

66. Узбеков Р.Э. Анализ клеточного цикла и методика исследования динамики уровня экспрессии белков на его различных фазах с использованием синхронизированных клеток // Биохимия. 2004. - Т. 69, N. 5. - С. 597-611.

67. Фещенко В.В., Евсеева Н.В., Подольный В.З., Володарский А.Д. Исследование функционального состояния апикальных меристем у пшениц, различающихся по реакции на длинный и короткий световой день // Докл. РАН. 1992. - Т. 327, N 2. - С. 284-288.

68. Хавкин Э.Е. Генетическая регуляция морфогенеза растений // Физиология растений. 1998. - Т.45, N. 5. - С. 763-777.

69. Холл М.А., Новикова Г.В., Мошков И.Е., Мур Л.А.Дж., Смит А.Р. // Физиология растений. 2002. - Т. 49, N 1. - С. 121-135.

70. Albani D., Mariconti L., Ricagno S., Pitto L., Moroni C. DcE2F, a functional plant E2F-like transcriptional activator from Daucus carota II J. Biol. Chem. 2000. -V. 275.-P. 19258-19267.

71. Amon A. Controlling cell cycle and cell fate: Common atrategies in procariotes and eucariotes // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1998. - V. 95. - P. 85-86.

72. Arellano M., Moreno S. Regulation of cdk/cyclin complexes during the cell-cycle // Cell Biol. 1997. - V. 29. - P. 559-573.

73. Barbier-Brygoo H., Ephritikhine G., Klambt D., Ghislain M., Guern J. Functional evidence for an auxin receptor at the plasmalemma of tobacco mesophyll protoplasts // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1989. - V. 86. - P. 891-895.

74. Beaumont V.H., Rocheford T.R., Widholm J.M. Mapping the anther culture response genes in maize (Zea mays L.) // Genome. 1995. - V. 38. -P. 968-975.

75. Beeckman Т., Burssens S., Inze D. The peri-cell-cycle in Arabidopsis. // J. Exp. Bot. 2001 - V. 52. - P. 403-411.

76. Benkirane H., Sabounji K., Chlyan A., Chlyan H. Somatic embryogenesis and plant regeneration from fragments of immature inflorescenses and coleoptiles of durum wheat // Plant Cell, Tissue Organ Cult. 2000. - V. 61. - P. 107-113.

77. Bischoff F., Molendijk A., Rajendrakumar C.S., Palme K. GTP-binding proteins in plants // Cell Mol. Life Sci. 1999. - V. 55. N. 2. - P. 233-256.

78. Bishop-Harley S.L., Gardner R.C., Walter C. Isolation and molecular characterization of genes expressed during somatic embryo development in Pinns radiata //Plant cell, tissue and organ culture. 2003. - V. 74. - P. 267-281.

79. Blagosklonny M.V. and Pardee A.B. The restriction point of the cell cycle // Cell Cycle.-2002.-V. 1,N.2.-P. 103-110.

80. Bleecker A.B. Ethylene perception and signalling: an evolutionary perspective // Trends Plant Sci. 1999. - V. 4. - P. 269-274.

81. Bleecker A.B., Kende H. Ethylene: a gaseous signal molecule in plant // Annu. Rev.Cell Dev. Biol.-2000.-V. 16.-P. 1-18.

82. Blow J.J., Laskey R.A. A role for the nuclear envelope in controling DNA replication within the cell cycle // Nature. 1988. - V. 332. - P. 546-548.

83. Braudshaw H.D. Molecular cloning and cell cycle-specific regulation of a functional human thymidine kinase gene // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1983. -V. 80,N. 18.-P. 5588-5591.

84. Caliskan M., Turet M., Cuming A. Formation of wheat (Triticum aestivum L) embryogenic callus involves peroxide-generating germin-like oxalate oxidase // Planta. 2004. - V. 219. - P. 132-140.

85. Castillo A.M., Egana B., Sanz J.M., Cistue L. Somatic embriogenesis and plant regeneration from barley cultivars grow in Spain // Plant Cell Rep. 1998. - V. 17. - P. 902-906.

86. Chang C., Kwok S., Bleecker A., Meyerowitz E. Arabidopsis ethylene-response gene ETR1: similarity of product to two-component regulators // Science. 1993. -V. 262.-P. 539-544.

87. Chang Z.-F., Huang D.-Y., Hsue N.-C. Differential phosphorylation of human thymidine kinase in proliferating and M phase-arresten human cells // J. Biol. Chem. 1994. - V. 269, N. 33. - P. 21249-21254.

88. Chaubet-Gigot N. Plant A-type cyclins // Plant Mol. Biol. 2000. - V. 43. - P. 659-675.

89. Chen J.G., Ullah H., Young J.C., Sussman M.R., Jones A.M. ABP1 is required for organized cell elongation and division in Arabidopsis embriogenesis // Genes. Dev.-2001.-V. 15.-P. 902-911.

90. Chen J.J., Janssen B.-J., Williams A., Sinha N.A. Gene Fusion at a homeobox locus: alterations in leaf shape and implications for morphological evolution // Plant Cell. 1997. - V. 9. - P. 1289-1304.

91. Chen Y.-F., Etheride N., Schaller G.E. Ethylene Signal Transduction // Annals of Botany. 2005. -V. 95, N. 6. - P.901-915.

92. Cohn N.S., Mithell J.P. Immunocytochemical localization of proteins in differentiating tissues of Pisum sativum // Histochemistry. 1986. - V. 84. - P. 432-438.

93. Coppock D.L., Pardee A.B. Control of thymidine kinase mRNA during the cell cycle // Mol. Cell. Biol. 1987. - V. 7, N 8. - P. 2925-2932.

94. Davies B., Egea-Cortines M. de Andreade S.E., Saedler H., Sommer H. Multiple interactions amongst floral homeotic MADS box Proteins // EMBO J. 1996. - V. 15.-P. 4330-4343.

95. Davis B.J. Disc electrophoresis. Methods and application to human serum proteins //Ann. N.-Y. Acad. Sci. 1964. - V. 121, N 2. - P. 404-427.

96. Day I.S., Reddy A.S.N. Isolation and characterization of two cyclin-like cDNAs from Arabidopsis // Plant Mol. Biol. 1998. - V.36. - P. 451-461.

97. De Jager S.M., Murray J.A. Retinoblastoma proteins in plants // Plant Mol. Biol. -1999.-V. 41.-P.295-299.

98. De Jager SM, Menges M, Bauer UM, Murray JAH. Arabidopsis E2F1 binds a sequence present in the promoter of S-phase-regulated gene AtCDC6 and is a member of a multigene family with differential activities // Plant Mol. Biol. -2001.-V. 47. -P.555-568.

99. De Veylder L., Beeckman T., Beemster G.T., de Almeida Engler J., Ormenese S. Control of proliferation, endoreduplication and differentiation by the Arabidopsis E2Fa-Dpa transcription factor. // EMBO J. 2002. - V.21. - P.1360-1368.

100. De Veylder L., Beeckman T., Beemster G.T., Krols L., Terras F. Functional analysis of cyclin-dependent kinase ingibitors of Arabidopsis // Plant Cell. 2001. -V. 13.-P. 1653-1668.

101. De Veylder L., Segers G., Glab N., Casteels P., Van Montagu M., Inze D. The Arabidopsis CkslAt protein binds the cyclin-dependent kinases Cdc2aAt and Cdc2bAt // FEBS Lett. 1997. - V. 412. - P.446-452.

102. Dewitte W., Murray J. The plant cell cycle // Annu. Rev. Plant. Biol. 2003. - V. 54. - P. 235-264.

103. Dharmasiri N., Dharmasiri S., Estelle M. The F-Box protein TIR1 is an auxin receptor // Nature. 2005. - V. 435. - P. 441-445.

104. Doerner P.W. Cell cycle regulation in plants // Plant Physiol. 1994. - V. 106. -P. 823-827.

105. Dudits D., Bogre L., Georgyey J. Molecular and cellular approaches to the analysis of plant embryo development from somatic cells in vitro II J. Cell Sci. 1991. - V. 99.-P. 475-484.

106. Ecker J.R. The ethylene signal transduction pathway in plants // Science. 1995. -V. 268.-P. 1463-1478.

107. Evans T., Rosental E.T., Youngblom J. Cyclin: a protein specified by maternal mRNA in sea urchin eggs that is destroyed at each cleavage division // Cell. -1983. -V. 33, N. 2.-P. 389-396.

108. Fabian-Marwedel T., Umeda M., Sauter M. The rice cyclin-dependent kinase-aktivating kinase R2 regulates S-phase progression // Plant Cell. 2002. - V. 14. -P. 197-210.

109. Flanagan C.A., Hu Y., Ma H. Specific expression of the AGL1 MADS-box gene suggests a regulatory functions in Arabidopsis ginoecium and ovule development // Plant J. 1996. - V. 10. - P. 343-353.

110. Fobert P.R., Gaudin V., Lunness P., Coen E.S., Doonan J.H. Distinct classes of cdc2-related genes are differentially expressed during the cell division cycle in plants // Plant Cell. 1996. - V. 8. - P. 1465-1476.

111. Follette P. J. and O'Farrel P. H. Connecting Cell Behavior to Patterning: Lessons from the Cell Cycle // Cell. 1997. - V. 88. - P. 309-314.

112. Fowler M.R., Eyre S., Scott N.W., Slater A., Elliott M.C. The plant cell cycle in context //Mol. Biotechnol. 1998.- N 10.-P.123-153.

113. Francis D., Dudits D., Inze D. Plant cell division. London: Portland Press, 1998. -P. 21-45.

114. Georgieva E.I., Lopez-Rodas G., Hittmair A., Feichtinger H., Brosch G., Loidl P. Maize embryo germination. I. Cell cycle analysis // Planta. 1994. - V. 192. N 1. -P. 118-124.

115. Giroux W.R., Pauls K.R. Characterisation of embriogenesis-related protein in alfal fa(Medicago saliva) II Physiol. Plant. 1996. - V. 94 - N.4. - P. 585-592.

116. Glotzer M., Murray A.W., Kirschner M.W. Cyclin is degraded by the ubiquitin pathway//Nature. 1991.-V. 349.-P. 132-138.

117. Guertin D.A., Trautmann S., and McCollum D Cytokinesis in eukaryotes // Microbiol Mol. Biol. Rev. -2002. V. 66. - P. 155-178.

118. Harbour J.W., Dean D.C. The Rb/E2F pathway: Expanding roles and emerging paradigms // Genes Dev. 2000. - V. 14. P. 2393-2409.

119. Hartwell L.H., Cullotti J., Pringle J.R., Reid B.J. Genetic control of the cell division cycle on yeast // Science. 1974. - V. 183. - P. 46-51.

120. Hartwell L.H., Cullotti J., Reid B. Genetic control of the cell-division cycle in yeast. I. Detection of mutants // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1970. - V. 66, N. 2. -P. 352-359.

121. Hartwell L.H., Weinert T. Checkpoints: Controls that ensure the order of cell cycle events // Science. 1989. - V. 246. - P.629-634.

122. Haughn G.W., Schultz E.A., Martinez-Zapater J.M. The regulation of flowering in Arabidopsis thaliana: meristems, morphogenesis, and mutants // Can. J. Bot. -1995.-V. 73.-P. 959-981.

123. Hawkes R., Niday E., Gordon J. A dot-immunobinding assay for monoclonal and other antibodies// Anal. Biochem.- 1982.- V. 119.-P. 142-147.

124. Helleboid S., Hendriks T., Bauw G. Three major somatic embriogenesis related proteins in Cichorium identified as PR proteins // J. Exp. Bot. 2000. - V. 51, N. 348.-P. 1189-1200.

125. Hengel A.J., Tadesse Z., Immerzell P., Schols H., Kämmen A. N-Acetylglucosamine and glucosamine-containing aravinogalactan proteins control somatic proteins. // Plant Physiol. 2001. - V. 125. - P. 1880-1890.

126. Henry Y., Vain P., De Buyser J. Genetic analysis of in vitro plant tissue culture responses and regeneration capacities //Euphytica. 1994a. - V. 79. - P. 45-58.

127. Henry Y., Marcotte J.-L., De Buyser J. Chromosomal location of genecontrolling short-term and long-term somatic embryo-genesis in wheat revealed by immuature embryo culture of aneuploid lines // Theor. Appl. Genet. 1994b. - V. 89. - P. 344-350.

128. Herbert R.J., Vilhar B., Evett C., Orchard C.B., Rogers H.J. Ethylene induces cell death at particular phases of the cell cycle in the tobacco TBY-2 cell line // J. Exp. Bot.-2001.-V. 52.-P. 1615-1623.

129. Hertel R., Thomson K.-St., Russo V.E.A. In vitro auxin binding to particulate cell fraction from corn coleoptiles // Planta. 1972. - V. 107. - P. 325-340.

130. Hetherington A.M. Guard cell signaling // Cell. 2001. - V. 107. - P. 711-714.

131. Howard A. and Pelc S.R. Synthesis of DNA in normal and irradiated cells and its relation to chromosome breakage // Heredity (suppl.). 1953. - V. 6. - P. 261273.

132. Hsieh W.L., Wolniak S.M. Isolation and characterization of a functional A-type cyclin from maize//Plant Mol. Biol. 1998. -V. 37. - P. 121-129.

133. Hua J., Meyerowitz E.M. Ethylene responses are negatively regulated by a receptor gene family in Arabidopsis thaliana II Cell. 1998. - V. 94. - P. 261271.

134. Huntley R.P., Murray J.A.H. The plant cell cycle // Current Opinion in Plant Biology. 1999. - N 2. - P.440-446.

135. Hush J., Wu L., John C.L., Hepler L.H., Hepler P.K. Plant mitosis promoting factor dissembles the microtubule preprophase band and accelerates prophase progression in tradescantia // Cell Biol. Int. 1996. - V. 20. - P. 275-287.

136. Hwang I., Sheen J. Two-componrnt circuitry in Arabidopsis cytokinin signal transduction // Nature. -2001. V. 413. - P. 383-389.

137. Inoue T., Higuchi M., Hashimoto Y., Seki M., Kobayashi M., Kato T., Tabata S., Shinozaki K., Kakimoto T. Identification of CRE1 as a cytokinin receptor from Arabidopsis // Nature. 2001. - V. 409. - P. 1060-1063.

138. Ishizaki T., Megumi C., Komai F. Accumulation of a 31-kDa glicoprotein in assotiation with the expression of embriogenic potential by spinach callus in culture//Physiol Plant.-2002.-V. 114.-P. 109-115.

139. Jacobs T. Control of the Cell Cycle //Dev. Biol.- 1992. -V. 153.-P. 1-15.

140. Jacqmard A., De Veylder L., Segers G., de Almeida Engler J., Bernier G. Expression of CKSlAt in Arabidopsis thaliana indicates a role for the protein in both the mitotic and the endoreduplication cycle. // Planta. 1999. - V. 207. - P. 496-504.

141. Jenik P.D., Jurkuta R.E.J., Barton M.K. Interactions between the cell cycle and embryonic patterning in Arabidopsis uncovered by a mutation in DNA polymerase // Plant Cell. 2005. - V. 17. - P. 3362-3377.

142. Jofuku K.D., Omidyar P.K., Gee Z., Okamuro J.K. Control of seed mass and seed yield by the floral homeotic gene APETALA2 // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. -2005.-V. 102,-N. 8.-P. 3117-3122.

143. John P.C.L., Sek F.J., Hayles J. Association of the plant p34cdc2 like protein with pl3suc2 implication for control of cell division cycles in plants // Protoplasma. - 1991. - V. 161. - P. 70-74.

144. John P.C.L., Sek F.J., Lee M.G. A homolog of the cell control protein p34cdc2 participates in the division cycle of Chlamydomonas, and a similar protein isdetectable in higher plants and remote taxa // Plant Cell. 1989. - V. 1. - P. 11851193.

145. Jonak C, Okresz L, Bogre L, Hirt H Complexity, cross talk and integration of plant MAP kinase signaling // Current Opinion in Plant Biology. 2002. - V. 5. - P 415^124.

146. Jonak C., Kiegerl S., Ligterink W., Barker P.J., Huskisson N.S., Hirt H. Stress signaling in plants: a mitogen-activatedprotein-kinase pathway is activated by cold and drought // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1996 - V.93. - P. 11274-11279.

147. Jones A.M., Im K.H., Savka M.A., Wu M.J., De Witt N.G. Auxin-dependent cell expansion mediated by overexpressed Auxin-Binding Protein 1 // Science. 1998. -V. 282.-P. 1114-1117.

148. Joubes J., Chevalter C., Dudits D., Heberle-Bors E., Inze D., Umeda M., Renaudl J. P. CDK-related protein kinases in plants // Plant Mol. Biol. 2000. - V. 43. - P. 607-620.

149. Kamatsuda T., Annaka T., Oka S. Genetic mapping of a quantitative trait locus (QTL) that enchances the shoot differentiation rate in Hordeum vulgare L. // Theor. Appl. Genet. 1993. -V. 86. - P. 713-720.

150. Kepinski S. Leyser O. The Arabidopsis F-Box protein TIR1 is an auxin receptor // Nature. 2005. - V.435 - P. 446-451.

151. Kerstetter R.A., Hake S. Shoot meristem formation in vegetative development // Plant Cell. 1997. - V. 9. - P. 1001-1010.

152. Kim H.J., Ryu H., Hong S.H., Woo H.R., Lim P.O., Lee I.C., Sheen J., Nam H.G., Hwang I. Cytokinin-mediated control of leaf longevity by AHK3 through phosphorylation of ARR2 in Arabidopsis IIPNAS. 2006. - V. 103. - P. 814-819.

153. Kim S., Soltis P.S., Wall K., Soltis D.E. Phylogeny and domain evolution in the APETALA2-like gene family // Molecular Biology and Evolution. 2006. - V. 23, N. l.-P. 107-120.

154. King R.W., Deshaies R.J., Peters J.M., Kirschner M.W. How proteolysis drives the cell cycle // Science. 1996. - V. 274. - P. 1652-1659.

155. Knetsch M.L.W., Wang M., Snaar-Jadalska B.E., Heimovaara-Dijkastra S. Abscisic acid induces mitogen-activated protein kinase activation by barley aleurone protoplasts //Plant Cell. 1996. - V. 8. -P. 1061-1067.

156. Kornberg A., Kornberg S.R., Simms E.S. Metaphosphate synthesis by an enzyme from Escherichia coli // Biochim. Biophys. Acta. 1956. - V. 20. - N. 1. - P. 215227.

157. Kovtun Y., Chiu W.-L., Tena G., Sheen J. Functional analysis of oxidative stress-activated mitogen-activated protein kinase cascade in plants // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2000. - V. 318. - P. 729-747.

158. Kozaki A., Hake S., Colasanti J. The maize ID1 flowering time regulator is a zinc finger protein with novel DNA binding properties // Nucleic Acids Research. -2004. V. 32 N. 5. - P. 1710-1720.

159. Kulaeva O.N., Karavaiko N.N., Selivankina C.Yu., Zemlyachenko Ya.V., Shipilova S.V. Receptor of trans-Zeatin involved in transcription activation by cytokinin // FEBS Letters. 1995. - V. 366. - P. 26-28.

160. Kulaeva O.N., Zagranichnaya T.K., Brovko F.A., Karavaiko N.N., Selivankina C.Yu., Zemlyachenko Ya.V., Hall M.A., Lipkin V.M., Boziev Kh.M. A newfamily of cytokinin receptor from cereales // FEBS Letters. 1998. - V. 423. - P. 239-242.

161. Kwoh T.J., Zipser D., Wigler M. Mutational analysis of the cloned chicken thymidine kinase gene // J. Mol. Appl. Genet. 1983. - V. 2. - N 2. - P. 191-200.

162. Kwon Y.S., Kim K.M., Eun M.Y., Sohn J.K. Quantitative trait loci mapping associated with plant regeneration ability from seed derived calli in rice (Oryza sativa L.) // Mol. Cells. 2001. - V. 28, N. 11. - P. 64-67.

163. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 // Nature. 1970. - V. 277. - P. 680-685.

164. Laquel P., Litvak S., Castroviejo M. Mammalian proliferating-cell nuclear antigen stimulates the processivity of two wheat embryo DNA polymerases // Plant Physiol.- 1993.-V. 102.N l.-P. 107-114.

165. Lembi C.A., Morre D.J., Thomson K.-St., Hertel R. N-l-Naphtylphtalamic-acid-binding activity of a plasma membrane-rich fraction from maize coleoptiles // Planta. 1971. - V. 99. - P. 37-45.

166. Lessard P., Bouly J.P., Jouannic S., Kreis M., Thomas M. Identification of cdc2cAt: a new cyclin-dependent kinase expressed in Arabidopsis thaliana flowers // Biochim. Biophys. Acta. 1999. - V. 1445. - P. 351-358.

167. Li H., Kurata K. Static suspension culture of carrot somatic embryos // J Biosci Bioeng. 2005. - V. 99, N.3. - P. 300-302.

168. Li H., Lin Y., Heath R., Zhu M., Yang Z. Control of pollentube tip growth by a rop GTPase-dependent pathway that leads to the tip-localized calcium influx //Plant Cell. -1999. -V. 11. -P. 1731-1742.

169. Li H., Wu G., Ware D., Davis K.R., Yang Z. Arabidopsis rho-related GTPases: differential geneexpression in pollen and Polar Localization in fission yeast // Plant Phisiol. -1998. V. 118. -P. 407-417.

170. Lobler M., Klambt D. Auxin-binding protein from coleoptile membranes of corn (Zea mays L.). Purfication by immunological methods and characterization // J. Biol. Chem. 1985. - V. 260. - P. 9848-9853.

171. Macdonald H. Auxin perception and signal transduction // Phisiol. Plant. 1997. -V. 100.-P.423-430.

172. Machii H., Mizuno H., Hirabayashi T., Li H., Hagio T. Screening wheat genotipes for high callus induction and regeneration capability from anther and immature embryo cultures // Plant Cell, Tissue Organ Cult. 1998. - V. 53. - P. 67-74.

173. Maggioni L., Lusardi M.C., Lupotto E. Effects of cultural conditions on callus induction and plant regeneration from mature and immature embryos of rice varietes (Oryza sativa) // J. Genet Breed. 1989. - V. 43. - P. 99-106.

174. Mahonen A.P., Bonke M., Kauppinen L., Riikonen M., Benfey P.N., Helariutta Y. A novel two-component molecule regulates vascular morphogenesis of the Arabidopsis root // Genes Devel. 2000. - V. 14. - P. 2938-2943.

175. Mano Y., Takahashi H., Sato K., Takeda K. Mapping genes for callus growth and shoot regeneration in barley (Hordeum vulgare L.) // Breed. Sci. 1996. - V. 46. -P. 137-142.

176. Mathias R.J., Atkinson E. In vitro Expression of genes affecting whole plant phenotype the effect of Rht/Gai alleles on the callus culture response of wheet (Triticum aestivum L. em. Thell) // Theor. Appl. Genet. - 1988. - V. 75. - P. 474479.

177. Mayer K.F., Schoof H., Haecker A. Role of WUSHEL in regulating stem cell fate in the Arabidopsis shoot meristem // Cell. 1998. - V. 95. - N. 6. - P. 805-815.

178. McWilliam A.A., Smith S.M., Street H.E. The origin and development of em-brioids in suspension cultures of carrot (Daucus carota L.) // Ann. Bot. 1974. -V. 38. - P. 243-250.

179. Meijer M., Murray J.A.H. The role and regulation of D-type cyclins in the plant cell cycle // Plant Mol. Biol. 2000. - V. 43. - P. 621-633.

180. Menges M., Henning L., Gruissem W., Murray J. Cell cycle-regulated gene expression in Arabidopsis // J. Biol. Chem. 2002. - V. 277. - P. 41987-42002.

181. Menges M., Murray J.A.H. Synchronous Arabidopsis suspension cultures for analysis of cell-cycle gene activity // Plant J. 2002. - V.30. - P. 203-212.

182. Mikolajczyk M., Awotunde O.S., Muszynska G., Klessig D., Dobrowolska G. Osmotic stress induces rapid activation of a salicylic acid-induced protein kinase and a homolog of protein kinase ASK1 in tobacco cells //Plant Cell. 2000. - V. 12. -P.165-178.

183. Mironov V., De Veylder L., Van Montagu M., Inze D. Cyclin-dependent kinases and cell division in plants the nexus // Plant Cell. 1999. - V. 11. - P. 509-522.

184. Moon J., Parry G., Estelle M. The ubiquitin-proteasome pathway and plant development // Plant Cell. 2004. - V. 16. - P. 3181-3195.

185. Murashige T., Skooge F. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures. Physiol. Plantarum. 1962. - V. 15. - P. 473-497.

186. Napier R.M. Towards an anderstanding of ABP1 // J. Exp. 1995. - V. 46. - P. 1787-1795.

187. Napier R.M., Venis M. A. From auxin-binding protein to plant hormone receptor //Trend Biochem. Sci. 1991. - V. 16. - N.2. - P. 72-75.

188. Neill S.J., Desikan R., Clarke A., Hancock J.T. Nitric oxide is a novel component of abscisic acid signaling in stomatal guard cells // Plant Physiol. 2002. - V. 128. -P. 13-16.

189. Nigg E.A. Cyclin-dependent protein kinases: Key regulators of the eucariotic cell cycle //Bioassays. 1995. - V. 17. - P. 471-480.

190. Nomura K., Komamine A. Identification and isolation of single cells that produce somatic embrious at a high frequency in carrot suspension culture // Plant Physiol. 1985. -V. 79.-P. 988-991.

191. Nurse P. Universal control mechanism regulating onset of M-phase // Nature. -1990.-V. 344.-P. 503-508.

192. Okamuro J.K., Caster B., Villaroel R., Montagu M.V., Jofuku K.D. The AP2 domain of APETALA2 defines a large new family of DNA binding proteins in Arabidopsis II Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1997. - V. 94. - P. 7076-7081.

193. Omelianchuk N.A., Dobrovolskaya O.B., Koval S.F., Shumny V.K. Plant regeneration from immature embrio-derved calli of wheat isogenic lines // Hereditas. 1992. - V. 116. - P.311-314.

194. Osuga K., H Masuda H., Komamine A. Synchronization of somatic embryogenesis at high frequency using carrot suspension cultures: model systems and application in plant development // Methods Cell Sci. 1999. - V. 21(2-3). - P. 129-140.

195. Ouchterlony 0., Nilsson L.-A. // Handbook Experimental Immunology / Ed. Weiz D.M. Oxford: Alden Press, 1979. V. 1. - P. 19 - 33.

196. Paulovich A. G., Toczyski D. P. and Hartwell L. H. When Checpoints Fail // Cell. 1997. -V. 88.-P. 315-321.

197. Pines J., Hunt T. Molecular cloning and characterization of the mRNA for cyclin form sea urchin eggs // EMBO J. 1987. - N. 6. - P. 2987-2995.

198. Poething R.S. Leaf morphogenesis in flovering plants // Plant Cell. 1997. - V. 9. -P. 1077-1087.

199. Ramirez-Parra E, Xie Q, Boniotti MB, Gutierrez C. The cloning of plant E2F, a retinoblastoma-binding protein, reveals unique and conserved features with animal Gl/S regulators //Nucleic Acids Res. 1999. - V. 27. - P. 3527-3533.

200. Raweerith R., Ratanabanangkoon K. Fractionation of equine antivenom using caprylic acid precipitation in combination with cationic ion-exchange chromatography // Journal of Immunological Methods. 2003. - V. 282. - P. 6372.

201. Razem F.A., El-Kereamy A., Abrams S.R., Hill R.D. The RNA-binding protein FCA is an abscisic acid receptor // Nature. 2006. - V. 439. - P. 290-294.

202. Reddy G.V, Meyerowitz E.M. Stem-cell homeostasis and growth dynamics can be uncoupled in the Arabidopsis shoot apex // Science. 2005. - V. 310. - P. 663667.

203. Reichheld J.P., Chaubet N., Shen W.H., Renaudin J.P., Gigot C. Multiple Atype cyclins express sequentially during the cell cycle in Nicotiana tabacum BY2 cells //Proc. Natl. Acad. Sci USA 1996,-V. 93. - P. 13819-13824.

204. Renaudin J.P., Doonan J.H., Freeman D., Hashimoto J., Hirt H. Plant cyclins: a unified nomenclature for plant A-, B- and D-type cyclins based on sequence organization //Plant Mol. Biol. 1996. - V. 32. - P. 1003-1018.

205. Riou-Khamlichi C., Menges M., Healy J.M., Murray J.A.H. Sugar control of the plant cell cycle: differential regulation of Arabidopsis D-type cyclin gene expression. // Mol. Cell. Biol. 2000. - V. 20. - P.4513-4521.

206. Rodrigues L.R., Terra T. de F., Bered F., Bodanese-Zanettini M.H. Origin of embrio-like structures in soubean anther culture investigated using SSR marker // Plant cell, tissue and organ culture. 2004. - V. 77. - P. 287-289.

207. Rodriguez P.L., Esch J.J., Hall A.E., Binder B.M., Schaller G.E., Bleeker A.B. A copper cofactor for the ethylene receptor ETR1 from Arabidopsis // Science. -1999.-V. 283.-P. 996-998.

208. Rojas, G., Jimenez, J.M., Gutierrez, J.M. // Toxicon. V. 32, N. 3. - P. 351- 363.

209. Romanov G.A., Lomin S.N., and Schmiilling T. Biochemical characteristics and ligand-binding properties of Arabidopsis cytokinin receptor AHK3 compared to CRE1/AHK4 as revealed by a direct binding assay // J. Exp. Bot. 2006. - V. 57. -P. 4051 - 4058.

210. Russel P., Nurse P. Negative regulation of mitosis by weel+ a gene encoding a protein kinase homolog // Cell. 1987. - V. 49. - P. 559-567.

211. Sablowski R. Flowering and determinacy in Arabidopsis II J. Exp. Bot. 2007. -V. 58.-P. 899-907.

212. Saton S., Fudjii T. Purification of G57 and auxin-regulated exstracellular glycoprotein of carrots and its immunochemical localization in dermal tissues // Planta. 1988.-V. 175.-P. 364-373.

213. Schmulling T. CREam of cytokinin signaling: receptor identified // Trends Plant Sci.-2001.-V. 6.-P. 281-284.

214. Schultz C., Gilson P., Oxley D., Youl J., Bacic A. GPI-anchors on arabinogalactan-proteins: implications for signalling in plants. // Trends Plant Sci. -1998.-V.3.-P. 426-431.

215. Schuppler U., He P.-H., John C.L., Munns R. Effect of water stress on cell division and cdc2-like cell cycle kinase activity in wheat leaves // Plant Physiol. 1998. -V. 117.-P. 667-678.

216. Sherley J.L., Kelly T.J. Regulation of human thymidine kinase during the cell cycle // J. Biol. Chem. 1988. - V. 263, N 17. - P. 8350-8358.

217. Shooge F., Miller C., Saltza M., Strong F. Kinetin a cell division factor from desoxyribonuclei acid. // J. Amer. Chem. Soc. 1955. - V. 77. - P. 1392.

218. Simanis V., and Nurse P. The cell cycle control gene cdc2+ of fission yeast encodes a protein kinase potentially regulated by phosporylation. // Cell. 1986. -V.45.-P. 261-268.

219. Smith H.M., Campbell B.C., Hake S. Competence to respond to floral inductive signals requires the homeobox genes PENNYWISE and POUND-FOOLISH // Curr. Biol. 2004. -V. 14(9). - 812-817.

220. Smith J.A., Krauss M.R., Borkird C., Sung R. Nuclear protein associated with cell divisions in plants // Planta. 1988. - V. 174. - P. 462-472.

221. Smith L.G., Hake S. Molecular genetic approaches to leaf development: knotted and beyond // Can. J. Bot. 1994. - V. 72. - P.617-625.

222. Smith L.G., Jackson D., Hake S. Expression of knottedl marks shoot meristem formation during maize embriogenesis // Dev. Genet. 1995. - V. 16. - P. 344348.

223. Smith M., Ito M., Miyawaki M., Sato S., Yoshika Y., Wada S., Maki H„ Nakagava H., Komamine A. Plant 21D7 protein, a nuclear antigen associated with cell divission, is a component of the 26S proteasome // Plant Physiol. 1997. - V. 113.-P.281-291.

224. Sorrell D.A., Combettes B., Chaubet-Gigot N., Gigot C., Murray J.A.H. Distinct cyclin D genes show mitotic accumulation or constantlevels of transcripts in tobacco Bright Yellow-2 cells // Plant Physiol. 1999 - V. 119. - P. 343-351.

225. Sorrell D.A., Marchbank A., McMahon K., Dickinson J.R., Rogers H.J., Francis D. A WEE1 homologue from Arabidopsis thaliana // Planta. 2002. - V. 215. - P. 518-522.

226. Steinborn K., Maulbetsch C., Priester B., Trautmann S., Pacher T. The Arabidopsis PILZ group genes encode tubulin-folding cofactor orthologs required for cell division but not cell growth // Genes Dev. 2002. - V. 16. - P. 959-971.

227. Stillman B. Smart machines at the DNA replication fork // Cell. 1994. - V. 78. N.5.-P. 725-728.

228. Strangt Ph. G. Mechanisms of inverse agonism: memory therapy and enchancement. //Trends Pharmacol. Sci. 2002. - V. 23. - P.85-95.

229. Sun Y., Dilkes B.P., Zhang C., Dante R.A., Carneiro N.P. Characterization of maize (Zea mays L.)Weel and its activity in developing endosperm // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1999. - V. 96. - P. 4180-4185.

230. Suzuki S., Miwa K., Ishikawa K., Yamada H., Aiba H., Mizuno T. The Arabidopsis sensor His-kinase, AHK4, can respond to cytokinins // Plant Cell Physiol.-2001.-V. 42.-P. 107-113.

231. Swedlund B., Locy R.D. Somatic embryogenesis and plant regeneration in two year old cultures of Zea diloperenni // Plant Cell Rep. 1988. - V. 7. - P. 144147.

232. Swiatek A., Lenjou M.,Van Bockstaele D., Inze D.,Van Onckelen H. Differential effect of jasmonic acid and abscisic acid on cell cycle progression in tobaccoBY-2 cells // Plant Physiol. 2002. - V. 128. - P. 201-211.

233. Tan S., Kamada H. Initial identification of phosphoprotein that appears to be involved in the induction of somatic embriogenesis in carrot // Plant Cell Rep. -2000. V. 19. N 8. - P. 739-747.

234. Terryn N., Arias M.B., Engler G., Tire C., Villarroel R., Van Montagu M., Inze D. rhal, a gene encoding a small GPT binding protein from Arabidopsis, is expressed primarily in developing guard cells //Plant Cell. 1993. -V. 5. - P. 1761-1769.

235. Tian M., Gu Q., Zhu M. The involvement of hydrogen peroxide and antioxidant enzymes in the process of shoot organogenesis of strawberry callus // Plant Science. 2003. - V. 165. - P. 701-707.

236. Tiwari S.B., Hagen G., Guilfoyle T.J. Aux/IAA Proteins Contain a Potent Transcriptional Repression Domain // Plant Cell. 2004. - V. 16. N. 2. - P. 533543.

237. Towbin H., Staehelin T., Gordon J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrilamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1979. - V. 76.- P. 4350-4354.

238. Trehin C., Ahn I.O., Perennes C., Couteau F., Lalanne E., Bergounioux C. Cloning of upstream sequences responsible for cell cycle regulation of the Nicotianasylvestris CycBl;l gene // Plant Mol. Biol. 1997. - V. 35. - P. 667672.

239. Treisman R. Regulation of transcription by MAP kinase cascades // Curr. Opin. Cell. Biol. 1996. -V. 8. - P. 205-215.

240. Umeda M., Bhalerao R.P., Schell J., Uchimiya H., Koncz C. A distinct cyclin-dependent kinase-activating kinase of Arabidopsis thaliana // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1998. - V. 95. - P. 5021-5026.

241. Vandepoele K., Raes J., De Veylder L., Rouze P., Rombauts S., Inze D. Genome-wide analysis of core cell cycle genes in Arabidopsis // Plant Cell. 2002. - V. 14. -P. 903-916.

242. Venis M.A., Napier R.M. Auxin receptors and auxin binding proteins // Critical Rewiews Plant Sci. 1995. - V. 14. - N. 1. - P. 27-47.

243. Venis M.A., Napier R.M. Auxin receptors: recent developments. // Plant Growth Regul. 1991. - V. 10. - P. 329-340.

244. Volodarsky A.D., Evseeva N.V. Proliferation antigen of initials the phenotype marker of the meristematik cells // 8th Congress of the FESP, Antwerpren. - 1992. -P.134.

245. Wang H., Zhou Y., Gilmer S., Whitwill S., Fowke L.C. Expression of the plant cyclin-dependent kinase inhibitor ICK1 affects cell division, plant growth and morphology // Plant J. 2000. - V. 24. - P. 613-623.

246. Warwicker J. Modelling of auxin-binding protein 1 suggests that its C-terminal and auxin could compete for a binding site that incorporates a metal ion and tryptophan residue 44 // Planta. 2001. - V. 212. - P. 343-347.

247. Wellmer F., Alves-Ferreira M., Dubois A., Riechmann J.L., Meyerowitz E.M. Genome-wide analysis of gene expression during early Arabidopsis flower development //PLoS Genet. 2006 - V.2(7) - P. 1012-1024.

248. Wong S.K.-F. G Protein selectivity is regulated by multiple intracellular regions of GPCRs // Neurosignals. 2003. - V.12. - P. 1-12.

249. Woo E.J., Bauly J., Chen J.G., Marshall J., Macdonald H. Crystallization and preliminary X-ray analysis of the auxin receptor ABP1 // Acta Crystallogr. 2000. -V. 56.-P. 1476-1478.

250. Wurschum T., GroB-Hardt R. and Laux T. APETALA2 regulates the stem cell niche in the Arabidopsis shoot meristem // The Plant Cell 2006 - V. 18. - P. 295307.

251. Yamaguchi M., Fabian T., Sauter M., Bhalerao R.P., Schrader J., Sandberg G., Umeda M., Uchimiya H. Activation of CDK-activating kinase is dependent on interaction with H-type cyclins in plants // Plant. 2000. - V. 24. - P. 11-20.

252. Zetterberg A., Larsson O. Cell cycle progression and cell growth in mammalian cells: kinetic aspects of transition events. In: Hutchison C., Glover D.M. (eds.) // Cell Cycle Control. New York: Oxford University Press 1995 - P. 206-227.

253. Zhang D.P., Wu Z.Y., Li X.Y., Zhao Z.X. Purfication and identification of 42-kilodalton abscisic acid-specific-binding protein from epidermis of broad bean leaves // Plant Physiol. 2002. - V. 128. - P. 714-725.

254. Zhong R., Kays S.J., Schroeder B.P., Ye Z. H. Mutation of a chitinase-like gene causesectopic deposition of lignin, aberrant cell shapes, and overproduction of ethylene//Plant Cell.-2002.-V. 14. N l.-P. 165-179.

255. Zhou Y., Wang H, Gilmer S., Whitwill S., Keller W., Fowke L.C. Control of petal and pollen development by the plant cyclin-dependent kinase inhibitor ICK1 in transgenic Brassica plants // Planta. 2002. - V. 215. - P. 248-257.

256. Автор выражает глубокую признательность и благодарностьколлегам из лаборатории биохимии к.б.н., с.н.с. Н. Ю. Селиванову, н.с.