Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Взаимодействие соматических клеток при трансплантации и морфогенезе у растений

ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Взаимодействие соматических клеток при трансплантации и морфогенезе у растений"

На правах рукописи

СОКОЛОВА Ольга Сергеевна

ВЗАИМОДЕИСТВИЕ СОМАТИЧЕСКИХ КЛЕТОК ПРИ ТРАНСПЛАНТАЦИИ И МОРФОГЕНЕЗЕ У РАСТЕНИЙ

03.00.12 - физиология растений

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКВА 1996

Работа выполнена в Ордена Трудового Красного Знамени Институте физиологии растений им. К.А.Тимирязева РАН

Научный руководитель: кандидат биологических наук

А.Д.Володарский

Официальные оппоненты: доктор биологических наук

Л.В. Ковалева, кандидат биологических наук Н.И.Куприна

Ведущее учреждение - Московский государственный университет

им. М.В.Ломоносова, Биологический факультет

Защита состоится 15 октября 1996 года, в 10 часов 30 минут на заседании диссертационного совета К 002.45.01 при Институте физиологии растений им. К.А.Тимирязева РАН по адресу: Россия, 127276, Москва, ул. Ботаническая, 35.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института физиологии растений им. К.А.Тимирязева РАН

Автореферат разослан 14 сентября 1996 г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук,

М.И.Азаркович

Актуальность проблемы: Процесс узнавания лежит в основе организации всех уровней живых систем - от молекулярного до клеточного (Энгельгардт, 1985).

Межмолекулярное узнавание имеет место на всех этапах реализации генетической информации, вплоть до клеточного уровня. При межклеточных взаимодействиях действуют те же процессы межмолекулярного узнавания, которые осуществляются с учетом фило- и онтогенетического происхождения клеток и обеспечиваются соответствующей системой рецепторов, находящихся под генетическим контролем (Снелл и др., 1979; Петров, 1987). Это положение к настоящему времени доказано только по отношению к животным клеткам. В отношении клеток растений оно представляется гипотетическим (Гродзинский, 1983; Yeoman, 1984; Moor, 1984; Джеффри и др., 1986; Кефели, 1991; Гамалей, 1993; Иванов, 1995).

В создании современных представлений о молекулярных и клеточных основах узнавания у растений большое значение имеют исследования рецепторов при взаимодействии клеток с различными лигавдами (Выскребенцева, 1985; Kulaeva & al, 1990, 1994), с симбиотическими (Ignatov & al, 1994, 1995; Хайло-ва, 1978, 1993; Андреева, 1991; Swords & al, 1993; Hippesanvald & al, 1994; Pain & al, 1995) и паразитическими (Метлицкий и др., 1984; Day, 1984; Озерецковская, 1991; Атабеков, 1993) микроорганизмами а также исследования по взаимодействию половых клеток (Heslop-Harrison, 1975; Linskens, 1977; Knox, 1984; Ковалева и др., 1994) и соматических клеток при трансплантации (Булах, 1988; Джеффри и др., 1986; Greenwald & Rubin, 1992; Verbeke, 1992; Титов, Соколова, Володарский, 1992; Титов, 1993).

Вместе с тем, среди различных групп рецепторов, обеспечивающих функционирование соматических клеток, совершенно неизученной остается группа, которая контролирует межклеточное узнавание при реализации различных программ гистогенеза у растений.

При исследовании этой группы рецепторов нами был использован иммунохимический подход (Абелев, 1979; Володарский, 1985) в связи с тем, что он позволяет дифференцированно оценить различные уровни фило- и онтогенетической специфичности клеточных рецепторов и выявить среди них те, кото-

рые контролируют процессы узнавания при гистогенезе (так называемые "рецепторы гистосовместимости").

Цель и задачи исследования. Цель настоящей работы — выявление и изучение рецепторов, контролирующих межклеточное узнавание при трансплантациях и морфогенезе у винограда.

Исходя из цели работы были поставлены следующие задачи.

1. Создать и экспериментально обосновать модельную систему для изучения биогенеза рецепторов, контролирующих межклеточное узнавание при трансплантациях и морфогенезе.

2. Исследовать процессы пролиферации при взаимодействии изо- и аллогенных клеток.

3. Исследовать состав и тканевое распределение мембранных дифференциро-вочных антигенов в каллусе и в тканях стебля, а также выявить рецепторы межклеточного узнавания — "рецепторы гистосовместимости".

4. Установить закономерности иммуногенетических реакций соматических клеток при изо- и аллотрансплантациях и морфогенезе. Определить роль "рецепторов гистосовместимости" в этих процессах.

Научная новизна. Впервые показано, что взаимодействие дифференцированных соматических клеток растений подчиняется законам трансплантационной генетики (аллотрансплантаты отторгаются, а изотрансплантаты - нет); в тоже время при трансплантации неорганизованно растущих клеток наблюдается толерантность независимо от их таксономического положения. Впервые выявлен тканеспецифический антиген, ответственный за гистосовместимость при трансплантации у винограда. Выявлен временной интервал (2 недели), в течение которого идет биогенез этого рецептора. Прослежен процесс ультраструктурной репарации тканей и выяснена динамика пролиферативных процессов в зоне контакта трансплантатов стебля и каллуса.

Практическая значимость. Разработана концепция иммуногенетического подхода к изучению "рецепторов гистосовместимости" у растений, на основе которого можно создать критерии для оценки совместимости пар донор-реципиент при прививках у винограда и плодовых. Это может найти применение в вино-

градарстве и плодоводстве (Соколова, Володарский, 1994). Факт наличия у растений антигенов-рецепторов шстосовместимости открывает принципиально новые перспективы для решения ряда проблем биоинженерии и клеточной биотехнологии.

Апробация работы. Основные результаты работы представлены на II Российском симпозиуме "Новые методы биотехнологии растений" (Пущино, 1992), на конференции по методам комплексной оценки продуктивности и устойчивости сельскохозяйственных растений (Москва, 1994), на Всемирном конгрессе по биологии in vitro (San Francisco, 1996), на 10 Конгрессе FESPP (Florence, 1996).

Результаты работы доложены на семинарах Группы иммунохимии клеточных рецепторов ИФР РАН (Москва, 1991, 1996), на IV ежегодном симпозиуме Российского общества физиологов растений (Пенза, 1996). Публикации. По теме диссертации опубликовано 6 печатных работ. Структура работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания методов исследования, изложения полученных результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы. Диссертационная работа изложена на 120 страницах машинописного текста, содержит 54 рисунка, 4 таблицы. Список литературы включает 164 наименования, из которых 110 на иностранном языке.

ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Работу проводили на двух несовместимых при трансплантации сортах винограда (Vitis vinifera L.). привойный — Ркацители и подвойный — Солонис (V. solonis х V.riparia f.

Виноград вводили в культуру in vitro (Володарский и др., 1988). Исходные черенки (длиной около 1,5 см) брали от одного растения каждого сорта и поддерживали в культуре in vitro микроклонированием на протяжении более пяти лет, что обеспечило сингенность тканей каждого сорта. Растения выращивали в

1 Исходные растения были получены с Гянжийской опытной станции Института виноградарства и виноделия .Азербайджан.

камере фитотрона ИФР РАН в течение 4-8 недель до получения растений с 8 -10 междоузлиями, при 24° С, влажности воздуха 73 - 75 %, освещенности 6 - 7 тыс. лк и световом фотопериоде 16 ч.

Первичные каллусы указанных выше сортов винограда получали от стеблевых эксплантов винограда, культивируемых in vitro. Пассируемые каллусные ткани выращивали на модифицированной питательной среде Мурасиге и Скуга в темноте при 26° С в условиях факторостатной камеры в течение 4-6 недель (Тихомирова и др., 1991).

Трансплантация специализированных и неорганизованно растущих в культуре in vitro тканей винограда. Трансплантацию в условиях культуры in vitro специализированных тканей стебля винограда проводили с использованием техники, разработанной в нашей лаборатории (Володарский и др.,1988).

При трансплантации2 неорганизованно растущих в культуре in vitro тканей мы использовали следующую методику: каллус, размером около 1см3, в стерильных условиях разрезали на кусочки толщиной около 3 мм, которые затем использовали в качестве реципиентов. Реципиент помещали на питательную среду, подобранную для данного сорта винограда (Тихомирова и др., 1991). В качестве донора брали кусочки каллусной ткани, размером около 5 мм3. Донор-ную ткань помещали на реципиентную и слегка прижимали. Трансплантаты культивировали в течение 10 недель при тех же условиях, что и исходные каллусные ткани.

Импульсная метка тканей Н3-тимидином. Кусочки ткани весом около 100 мг инкубировали в водном растворе метил-Н3-тимидина с радиоактивностью 25

2 При описании опытов по трансплантации тканей винограда мы будем придерживаться

терминологии, принятой в трансплантологии животных тканей, в соответствии с которой донором является тот организм, от которого берут ткань для трансплантации, а реципиентом - тот организм, которому трансплантируют ткань (Bundschuh & al, 1978). При этом, аутотрансплантациями называют трансплантацию тканей внутри одного организма, изотрансплантациями - между генетически идентичными организмами, а аллотрансгшацтацией - трансплантацию тканей с различными геномами. В растениеводстве понятие "донор" соответствует понятию "привой", а "реципиент" - "подвою".

мкКи/мл в течение J час, а затем отмывали дистиллированной водой. Ткань экстрагировали в NCS3 в течение 12 час. при 50°С, солюбшшзатор отмывали толуолом, радиоактивность считали на счетчике импульсов 1219 Rackbeta (LKB, Швеция). Расчеты проводили на основании удельной радиоактивности, выраженной в импульсах в минуту и отнесенной на сырой вес ткани в граммах. Подготовка ткани для сканирующей микроскопии. Ткань фиксировали 2% глютаровым альдегидом в Na-какодилатном буфере (0,05 М, рН = 7,4) в течение 12 часов на холоду, затем отмывали тем же буфером с добавлением сахарозы (15 мг/мл) и обезвоживали в спиртах восходящей концентрации доводя до абсолютного ацетона, после чего высушивали возгонкой при критической точке, напыляли платиной, препараты просматривали в электронном сканирующем микроскопе (Yamaha, Япония).

Получение антигенов-рецепторов из мембран клеток стебля и каллуса винограда. Исходную ткань стебля или каллуса разрушали в жидком азоте и экстрагировали в трис-HCl буфере (0,05 М, рН = 7,8) с добавлением 0,02 М меркап-тоэтанола и 0,01 М PMSF4 в течение 1 часа на мешалке при +4°С. Гомогенат центрифугировали при 20000 g 30 минут. Осадок ресуспендировали в 1 % тритоне Х-100, приготовленном на исходном буфере, и оставляли при +4°С на мешалке в течение 12 часов для солюбилизации мембранных антигенов. Гомогенат центрифугировали при 20000 g 30 минут. Надосадочную жидкость использовали для исследований.

Получение противотканевьгх антисывороток. Для получения антисывороток использовали кроликов породы Шиншилла, весом 1,5 кг. Антитела получали по схеме иммунизаций в подколенные лимфатические узлы (Candle & al, 1966; Гусев и др., 1970; Володарский, 1971).

Получение антисывороток к индивипуальным антигенам-рецепторам. Антисыворотки получали путем истощения соответствующей прогивотканевой антисыворотки гетеролошчными мембранными антигенами. Полноту нейтрализации

3 Tissue solubiliser NCS (Amersham, USA)

4 Phenilmetilsulfanylfluorid (Serva, BRD)

гетерологичных антител контролировали методом преципитации в агаре (Гусев, 1988). Затем антисыворотки узкой специфичности использовали для получения преципитатов, включающих индивидуальные антигены-рецепторы. Преципитат вырезали из агаровых пластинок, гомогенизировали через шприц и иммунизировали кроликов в лимфоузлы по описанной выше методике. Определение содержания белка. Концентрацию белка в пробах определяли спектрофотометрически по методу Bradford (1976).

Статистическая обработка результатов. Результаты обрабатывали с применением электронной таблицы "Harvard graphics" (версия 2,0) и программы "Microsoft Graph" (версия 6,0). Опыты проводились в трех биологических и пяти аналитических (опыты с меткой) повторностях. На графиках представлены средние значения.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 1. Модельная система для изучения рецепторов соматических клеток растений. ответственных за совместимость тканей при трансплантации и морфогенезе.

Проблема молекулярных и клеточных основ узнавания соматических клеток тканей растений представляется достаточно сложной для экспериментального изучения ввиду того, что реализация гистогенетических программ при морфогенезе in vivo осуществляется одновременно во многих направлениях. В связи с этим, мы обратились к изучению этой проблемы на уровне процессов, происходящих при трансплантации тканей in vitro, в ходе которой можно вычленить клетки одного или нескольких гистогенетических рядов и, таким образом, смоделировать процессы реализации отдельных морфогенетических программ.

В процессе трансплантации происходит дедифференциация специализированных клеток, в результате которой они возвращаются в физиологическое состояние, аналогичное клеткам-предшественникам гистогенетических рядов. Это выражается в изменениии их дифференцировочных антигенов (Володарский, 1968; Моисеева, 1988). В ходе последующей редифференциации клеток стано-

вится возможным экспериментально проследить ход биогенеза клеточных рецепторов, в частности, той их группы, которая, как мы полагаем, отвечает за процессы межклеточного узнавания при морфогенезе.

Исходя из этого, нами была разработана трансплантационная модель, предусматривающая изучение рецепторов гистосовместимости при взаимодействии изо- и аппогенных соматических клеток тканей стебля и каллуса. Первая часть модельной системы была построена на базе шкалы генотипов винограда с различной степенью совместимости (Володарский и др.,1988) с учетом основных законов трансплантационной иммуногенетики (Снелл и др.,1979), Для экспериментальной работы были выбраны генотипы двух сортов винограда: Ркацители (донор) и Солонис (реципиент). При аллотрансплантациях эти сорта полностью несовместимы. В то же время ткани каждого из указанных сортов полностью совместимы при изотрансплантациях.

Взаимодействия изо- и аллотрансгшантатов различаются по ответном морфогенетической реакции (рис. 1). В случае изотрансплантации наблюдали развитие реципиентом корней, а почка донора давала побег с несколькими междоузлиями и молодыми листочками. В случае же аллотрансплантации

реципиент

место трансплантации

корневой морфогенез

рис. 1. Изо- и аллотрансплантации тканей стебля винограда в культуре in vitro (14 дней)

а - аллотрансплаитация (Ркацители / Солонис) б - изотрансплантации (Ркацители / Ркацители)

морфогенез не наблюдался, в месте контакта трансплантатов нарастала масса каллусных клеток.

Вторая часть этой модели включала трансплантационную систему из пассируемых каллусных клеток стеблевого происхождения. В этом случае отторжения трансплантатов не происходило как при изо-, так и при аплотрансплан-тации (рис. 2, 3).

Кроме этого, в исследование были включены межвидовые трансплантации с использованием каллусных тканей растений5, далеких по своему таксономическому положению от винограда. В этих случаях также не наблюдали значительных различий при взаимодействии аллотрансплантатов (рис. 4), что позволило нам заключить, что в случае трансплантации аллогенных тканей, неорганизованно растущих в культуре in vitro, наблюдается толерантность.

Таким образом, морфологические проявления взаимодействия трансплантатов тканей стебля винограда при изо- и аллотрансплантациях дифференцированных тканей описываются классической формой трансплантационного ответа (аллотрансплантаты отторгаются, изотрансплантаты - нет). В то же время, при взаимодействии недифференцированных тканей проявляется толерантность (Sokolova, Volodarsky, 1996а).

5 Каллусы Papaver, Alhagi, Basella, Zea mais были нам любезно предоставлены Лабораторией генетики культивируемых клеток ИФР РАН.

место трансплантации

реципиент

донор

М/Рк

К/Рк

Б/Рк

Рис. 4.Мсжвидонап трансплантация каллусов: доноры - Papaver(M), Alhagi(K), Basella(E); реципиент- Ркацителн(Рк)

Этот феномен позволил нам высказать предположение, что клетки, находящиеся в состоянии длительного неорганизованного роста в культуре in vitro, не имеют "рецепторов гистосовместимости", контролирующих процессы гистогенеза in vivo. Для того, чтобы подтвердить или опровергнуть это предположение, было необходимо изучить биогенез рецепторов гистосовместимости у соматических клеток с разной степенью дифференцировки.

Поскольку биогенез этих рецепторов идет в процессе гистогенеза, то важно было выяснить, какие основные клеточные популяции тканей стебля способны включиться в пролиферацию и при дедифференцировке образовывать каллус. Для этого с помощью дифференциального окрашивания была исследована регенеративная способность клеток изолированных эксплантов стебля винограда, культивируемых in vitro (Титов, Соколова, Володарский, 1992).

В результате было показано (рис. 5), что в стебле винограда, выращенного in vitro, наибольшей регенерационной способностью обладают ткани перидермы (в частности, камбий) и сердцевинная паренхима.

Параллельные исследования морфологии каллусных клеток в этих зонах с помощью фазово-контрасгной и сканирующей микроскопии показа™, что существуют различия в строении клеток разного возраста; молодые клетки имеют округлую форму, у них хорошо развитые пластиды, а цитоплазма имеет включения крахмальных зерен. Клетки, перешедшие в состояние неорганизованного роста, имеют сильно вытянутую форму, ядро у них находится на одном из полюсов.

Рис.5. Содержание клеток (в %), обладающих регенерационными способностями, в стебле винограда сортов Ркацители (а) и Солонис (в)

ИИ ксилема | | сердцевина | | перидерма

Таким образом, в системе трансплантатов имеются каллусные клетки не только с различным гистогенетическим происхождением, но и в разном физиологическом состоянии. В связи с этим, необходимо было исследовать клеточные основы каллусообразования при переходе различных групп тканей к пролиферации.

2. Пролиферация клеток при взаимодействии стеблевых и неорганизованно растущих в культуре in vitro тканей винограда.

Известно, что предтрансплантационный раневой стресс активизирует процессы пролиферации клеток (Volodarsky & al, 1992). Учитывая это, мы изучали пролиферативные процессы с использованием изолированных эксплантов стебля для того, чтобы определить исходный уровень регенеративных процессов и сравнивали реакцию клеток с разной степенью дифференцировки на предтрансплантационный раневой стресс. О процессах репарации клеток судили по содержанию мембранных и растворимых белков (Sokolova, Volodarsky, 1996с).

На рис. 6 показано, что каллусная ткань быстрее реагирует на поранение, чем дифференцированная (минимум содержания белка приходится уже на 4 часа после поранения). В обоих случаях исходный уровень содержания растворимых белков в тканях восстанавливался быстрее, чем мембранных.

стебель: мембранный белок (1), растворимый белок (2)

каллус: мембранный белок (3), растворимый белок(4)

ремя после поранения, час

Рис. 6. Влияние раневого стресса на содержание белка в тканях стебля н каллусиой ткани винограда сортаРкацнтели

Таким образом, через 24 часа после поранения в результате репарационных процессов, протекающих на молекулярном уровне в клетках винограда, они переходят к пролиферации, что подтверждается данными электронной сканирующей микроскопии.

При изучении пролиферации клеток, было показано, что темпы ее — разные в системах с различным гистогенезом, а также у разных сортов (рис. 7).

число каллусных клеток

число каллусных клеток

Рис.7,Динамика новообразования каллусных клеток камбиального и паренхиматозного происхождения на изолированных эксплантах стебля в культуре in vitro ( а - Солонис" б - Ркацители,)

Так, у сорта Ркацители каллусные клетки впервые появляются в области сердцевинной паренхимы, а лишь спустя некоторое время — в области камбия (УЫоёагеку, 5око1о\'а, ТШоткоуа, 1993). У сорта Солонис они сначала образуются в области камбия. При этом темпы их пролиферации ниже, а клеток парен-

химатозного происхождения — выше, чем у Ркацители. Следует отметить, что при взаимодействии изогенных клеток наблюдается образование в их стенках вторичных плазмодесм, что дает основание говорить о наличии контактов между донором и реципиентом; наличие подобных связей на уровне образования вторичных плазмодесм было показано также для каллусных клеток томата (Джунипер, 1986; Вагпе«, 1988).

При аллотрансплантации несовместимых тканей винограда сортов Ркацители и Солонис наблюдалось пониженное каллусообразование, которое в основном осуществлялось тканями реципиента (рис. 8).

В связи с этим, необходимо было выяснить, какие ткани в системе трансплантатов (донора или реципиента) обладают большей пролиферативной активностью

Для исследования этого вопроса использовали импульсное мечение зоны трансплантации тканей стебля и каллуса Н3-тимидином. Изучение суммарной пролиферативной активности клеток в месте контакта изо- и аллотрансплантатов показало, что, независимо от степени дифференцировки тканей, у изотрансплантатов вскоре после приведения их в контакт начинается активная пролиферация каллусных клеток, которая в 4-5 раз превышает фоновый уровень пролиферации клеток в контроле. В случае взаимодействия аллогенных тканей

значительного усиления пролиферации не наблюдается (рис. 9а,б) (Соколова, Володарский, 1994; 8око1оуа, УоЬскгеку, 199Ь).

Анализ кривых изменения пролиферативной активности в системе изотрансплантатов стебля показал (см. рис. 9а), что, начиная со 2 недели, процессы каллусогенеза замещаются процессами редифференцировки новообразованных каллусных клеток.

Поскольку в контакт в месте трансплантации входят новообразованные тканями донора и реципиента каллусные клетки, мы сравнивали вклад этих тканей в изменение суммарной пролиферативной активности. Было показано, что усиление пролиферативных процессов идет за счет тканей донора (рис. 9в), тогда как про-лиферативные процессы в тканях реципиента не выходят за пределы нормы реакции, свойственной данному сорту (рис. 9г).

Дальнейшее исследование пролиферативных процессов в тканях донора показало, что при аллотрансплантации пролиферативная активность клеток повышается в зависимости от продолжительности контакта (см. рис. 9в).

По-видимому, в этом случае мы столкнулись со специфическим проявлением реакции "донор против реципиента", которая различается у молодых и старых каллусных клеток. Эта реакция выражается в том, что совместимость трансплан-тов находится в зависимости от возраста взаимодействующих клеток (рис.10). Так, после 4 недель культивирования показатель несовместимости аллотрансплантатов6 падает ниже нуля, что выражается в толерантности аллогенных каллусов и в увеличении пролиферативной активности клеток в зоне контакта аллотрансплантатов (см. рис. 9,6).

Известно, что у животных клеток с изменением их возраста меняется рецеп-торный состав поверхности (Кульберг, 1994). Основываясь на этом положении и на результатах наших опытов по изучению процессов катаболизма суммарного

6 Показатель несовместимости рассчитывали как разницу между величинами, характеризующими пролиферативную активность каллусных клеток в месте контакта изотрансплантатов и аллотрансплантатов каллусных тканей винограда.

недели недели

в. Каллус—донор г. Каллус—реципиент

Рис.9. Пролиферативная активность клеток в месте контакта трансплантатов

продукта клеточных рецепторов (так называемых Р-белков)7 каллусных клеток (рис. 11), в которых было показано, что содержание Р-белков в культуральной среде изменяется с возрастом клеток в суспензионной культуре винограда (Volodarsky, Sokolova, Tihomirova, 1993), можно объяснить факт падения показателя несовместимости аллотрансплантатов, полученных из тканей, неорганизованно растущих в культуре in vitro. Мы предположили, что накапливание продуктов катаболизма рецепторов в системе трансплантатов каллусных тканей после 4 недель культивирования обусловливает понижение несовместимости аллотрансплантатов.

7 Эти работы мы проводили в сотрудничестве с Лабораторией иммунохимии Института

эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф.Гамалеи РАМН.

недели

Рис.10. Зависимость несовместимости аллотрансплаитатов каллусных тканей винограда от возраста каллусных клеток

недели

Рис. 11. Зависимость титра Р-белков и количества клеток от возраста культуры.

I I р-белки —■— клетки

Если с этих позиций рассмотреть данные графика на рис. 9а, то можно отметить, что начало этого процесса (биогенез клеточных рецепторов) проходит в каллусных клетках в течение 2 недель, после чего начинается катаболизм рецепторов. Эта фаза совпадает с началом редифференциации каллусных клеток, что следует из характера кривых, отражающих изменение пролиферативной активности (см. рис. 9а).

Таким образом, исследования по изучению катаболизма клеточных рецепторов и пролиферативной активности клеток в системе трансплантатов позволили нам определить временной интервал (2 недели), в течение которого, вероятно, начинают формироваться рецепторные системы, в том числе "рецепторы гистосо-вместимости" соматических клеток. В связи с тем, что формирование рецептор-ных систем идет в процессе редифференциации каллусных клеток, есть основания предполагать, что "рецепторы гистосовместимости" являются дифференцировоч-ными антигенами.

3. Выявление нпливииуальных аптигенон-реценторои. ответственных за гистосо-иместимость и установление их эффекторнмх свойств.

Известно, что набор дифференцнровочных антигенов и их специфичность являются стабильной характеристикой как животноп (Абелев, 1979), так и растительной (Володарский, 1968; Гаврилюк, 1977; Конарев, 1983; Моисеева, 1988; Евсеева, 1993; Pain & al, 1995) клетки.

Учитывая это, мы попытались выявить рецепторы, ответственные за гистосо-вместимость среди диффереицировочных антигенов клеточной поверхности. Для этого было необходимо выделить тканеспецифические антигены стебля и каллуса винограда (рис. 12). Сравнительный анализ тканеспецифических антигенов показал, что среди них имеются индивидуальные антигены, характеризующие мембраны клеток стебля (ATKi) и каллуса (АГП|).

а. Лунки: 1 - антиген стебля, 2-7- последовательные разведения гомологичной антисыворотки.

б. Лунки: 1- антиген каллуса, 2-7- последовательные разведения гомологичной антисыворотки

Рис. 12. Антигенная структура мембран клеток винограда сорта Ркацители с разной степенью специализации: стебель (а), каллус (б),

Против индивидуальных антигенов АГК[ и АГП] были получены антитела, с помощью которых проводились исследования распределения указанных антигенов в различных тканях винограда (рис. 13).

Было установлено, что АГК] содержится в мембранах клеток только фракции, включающей ткани перидермы, камбий, флоэму, коровую паренхиму стебля сортов Ркацители и Солонис. Это свидетельствует о его тканевой специфичности. Тканесиецифичность АГК; была также подтверждена в опытах с использованием антикроличьих антител, меченых ФИТЦ8, в результате которых АГК| был выявлен в мембранах клеток камбия.

к Антикроличья ослиная сыворотка, меченая изопюционатом флуоресцеина (Sigma)

АГП] не выявляется в дифференцированных тканях стебля. Антитела, меченые ФИТЦ, выявляли этот антиген в мембранах молодых каплусных клеток стеблевого происхождения и в молодых пролиферирующих клетках паренхимы стебля. Это дало нам основание заключить, что АГП1 является специфическим антигеном для паренхимных клеток стебля.

1

1 - стебель Ркацители:

2 - кора

3 - древесина

4 - сердцевина

5 - стебель Солонис

6 - каллус Солонис

7 - каллус Ркацители

О АГП,

Рис.13. Содержание тканеспецифнческих антигенов АГК] и АГП1 в мембранах клеток стебля и каллуса винограда

Для того, чтобы доказать, что выявленные нами тканеспецифические антигены действительно принимают участие в процессах межклеточного узнавания у винограда, мы проводили ингибиторный анализ с использованием антисывороток против антигенов АГК| и АГП) (рис. 14).

Результаты этих опытов показали, что при инкубации трансплантатов с антисыворотками против АГП) происходит снижение пролиферативной активности клеток в месте контакта изотрансплантатов через 2 недели в два раза по сравнению с интактными изотрансплантатами.

На этом основании было сделано заключение — специфические антитела, связываясь с индивидуальными антигенами новообразованных каллусных клеток, очевидно, блокируют эти рецепторы и, таким образом, нарушают нормальное течение гистогенеза.

К - контроль

И - интактная трансплантация

Н - неиммунная антисыворотка

С - антисыворотка против АГК|

Кл - антисыворотка против АГП|

Рис. 14.Инп1бирование пролиферативной активности в зоне контакта трансплантатов с помощью антител против индивидуальных антигенов

Таким образом, в результате изучения эффекторных свойств выявленных антигенов, было установлено, что АГКЬ не участвует в процессах межклеточного узнавания. В то же время, наблюдаемое снижение пролиферативной активности в зоне взаимодействия трансплантатов после блокирования АГПь дает основание предположить, что он принимает участие в контроле за процессами совместимости клеток при трансплантации. Это дало нам основание отнести АГП] к группе "рецепторов гистосовместимости".

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Иммуногенетические реакции соматических клеток при изо- и аллотрансплан-таниях и морфогенезе. Роль рецепторов гистосовместимости в процессах межклеточного узнавания.

На рис. 15 представлена схема, обобщающая результаты нашей работы по изучению взаимодействия соматических клеток растений при изо- и аллотрансплантациях и морфогенезе, а также по исследованию рецепторов, контролирующих межклеточное узнавание на уровне гистогенеза. Исследованные нами модельные системы предусматривали изучение рецепторов гистосовместимости при взаимодействии соматических клеток в трех случаях: взаимодействие

совместимых клеток (нзотрансилантация), взаимодействие несовместимых клеток (аллотрансплантация), взаимодействие совместимых и несовместимых клеток в состоянии, когда у них не сформированы рецепторные системы, контролирующие гистосовместимость (трансплантации каллусных тканей, неорганизованно растущих в культуре in vitro).

Изучение динамики процесса взаимодействия изогенных соматических клеток (кривая 1) и его фенотипического проявления показало, что по истечении 4 недель реализуются программы как стеблевого, так и корневого морфогенеза. При аллотрансплантации (кривая 2) уже на начальных этапах редифференциров-ки каллусных клеток наблюдается их отторжение и, как следствие, тканевая несовместимость. В варианте взаимодействия каллусных клеток, где донором и реципиентом служат ткани, неорганизованно растущие in vitro, как в случае изо-, так и аллотрансплантации проявляется толерантность соматических клеток. Следует отметить, что толерантность наблюдается как при внутри-, так и при межвидовых трансплантациях.

Процесс реализации морфогенетических программ при взаимодействии соматических клеток с различной совместимостью представлен на схеме в сопоставлении с процессом катаболизма клеточных рецепторов (динамика Р-белков представлена в виде диаграммы). Динамика содержания последних в сочетании с результатами ингибиторного анализа (см. рис. 14) позволила нам найти временной интервал (2 недели), в течение которого идет биогенез рецепторов, контролирующих совместимость клеток при трансплантации.

Если полученные данные по изучению иммуногенетических реакций клеток, лежащих в основе взаимодействия трансплантатов и биогенеза рецепторов гистосовместимости аппроксимировать на процессы межклеточного узнавания при морфогенезе, то процесс формирования рецепторных систем, контролирующих на клеточном уровне процессы гистогенеза у растений, может быть представлен следующей схемой (рис. 16).

В рассмотренной нами выше "трансплантационной модели" исходное положение занимает клетка первичного каллуса (клетка 2). При переходе к неорганизованному росту в культуре in vitro (клетка Г), ее можно отождествить по

пролиферативная активность, мп.мин/г

60_

: Пролиферация

LJ_I_

узнавание

узнавание

Дифференцировка _J_I.

толерантность

морфогенез

изотрансплантация ....... 1

содержание Р-белков,

1

Репарация

-100

отторжение

аллотрансплантация

2 \

.50

биогенез рецепторов разрушение рецепторов

недели

Рис. 15. Схема взаимодействия соматических клеток при трансплантации н морфогенезе

- стеблевой морфогенез

Д

Гр"

Трансплантаты каллусов

Трансплантаты специализированных тканей

Д — донор

корневой морфогенез

Р— реципиент

морфогенетическим потенциям с инициальной клеткой меристемы (клетка 1). В свою очередь, клетка первичного каллуса по своим возможностям реализации морфогенетических программ аналогична производной клетке инициальной меристемы (клетка 2'), которая дает начало клеткам-предшественникам гистогене-тических рядов дифференцировки (клетки 3,6). В соответствии с нашими данными "рецепторы глстосовместимости"(а), появляются в процессе пролиферации меристематических клеток и их дифференциации в предшественники гистогене-тических рядов. Мы предположили, что в ходе дальнейшей дифференцировки клеток функция гистосовместимости переходит к другим тканеспецифическим: рецепторам! . (б), определяющим клеточную специализацию. Дальнейшее формирование гистогентических рядов идет с их участием (клетки 4-7).

Таким образом, проведенные исследования показали, что межклеточное узнавание при трансплантации у растений осуществляется на уровне тканеспецифических рецепторов, характерных для клеток определенных гисто-генетических рядов. Нами была предложена концепция, состоящая в том, что при морфогенезе на уровне контакта поверхностей взаимодействующих клеток протекают те же процессы межклеточного узнавания, что и при трансплантации изо-и аллогенных тканей.

В отличие от аллотрансплантаций, клетки-предшественники различных пь стогенетических рядов являются изогенными в генетическом отношении, но, исходя из антигенной структуры их поверхностных мембран, могут восприниматься как изо-, так и аллогенными. Это дает основание описывать процессы, происходящие при взаимодействии клеток в ходе морфогенеза с использованием законов трансплантационной генетики.

Пролиферация

ш

Клетка-предшественник гистогенетических рядов

Инициальная клетка меристемы

Дифференциация

Г\

Каллус т укго

Неорганизованно растущая клетка

Первичный

А

Клетка в стадии терминальной дифферен-цировки

Рецепторы тканевой дифференцировки

а) 2 Рецептор гистосовместимости парепхимпой ткани

»)■ Тканеспецифические антигены, характерные для конкретного гистогенеза

I Возможный ряд гистогенеза

II Гистогенез паренхимы

каллус

Рис.16. Схема биогенеза рецепторов гистосовместимости в процессе гистогенеза в растениях

выводы

1. Установлено, что процесс узнавания на уровне соматических клеток при изо- и аллотрансплантациях у винограда идет в соответствии с законами трансплантационной генетики: аллотрансплантаты отторгаются, а изотрансплантаты — нет.

2. Показано, что на уровне недифференцированных тканей наблюдается толерантность как при внутри-, так и при межвидовой аллотрансплантации.

3. Установлено, что в системе взаимодействующих трансплантатов изменение пролиферативной активности в тканях донора и реципиента независимо от степени дифференцировки клеток подчиняется следующим закономерностям:

• изогенные клетки отвечают усилением пролиферации, в то время как алло-генные не изменяют свою пролиферативную активность.

• пролиферативные процессы идут интенсивнее за счет тканей донора.

4. Прослежен процесс ультраструктурной репарации тканей в зоне взаимодействия трансплантатов, включающий дедифференцировку клеток.

5. Показано наличие тканеспецифических антигенов в мембранах клеток стебля и каллуса винограда. Изучено распределение этих антигенов по тканям винограда.

6. Выявлен рецептор, входящий в группу тканеспецифических антигенов, принимающий участие в процессах межклеточного узнавания при трансплантации у винограда. Установлено, что биогенез этого рецептора осуществляется в клетках в интервале 7-14 дней.

7. Показано, что продукты катаболизма рецепторов ингибируют пролиферативную активность клеток растений.

8. Предложена концепция, состоящая в том, что на начальных этапах формирования гистогенетических рядов взаимодействие соматических клеток осуществляется в соответствии с законами трансплантационной генетики.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Титов Е.В., Соколова О.С., Володарский А.Д. Распределение лектинов по тканям стебля винограда. Физиология растений, 1992, т. 39, в. 1, стр. 40-47.

2. Volodarsky A.D., Sokolova O.S., Tichomirova Е.У. Catabolism products of cell receptors and compatibility of genetic material by bioengineering work. Second symposium "Trends in plant biotechnology", Pushino, 1993.

3. Соколова O.C., Володарский А.Д. Исследование пролиферативных процессов в зоне контакта привойно-подвойных компонентов у винограда с целью разработки экспресс-методов их аффинитета. Тез. докл. конф. по методам комплексной оценки продуктивности и устойчивости сельскохозяйственных растений, Москва, 1994.

4. Sokolova O.S., Volodarsky A.D. Contact stimulation of proliferation activity of grape callus tissues during graft formation. Annual symposium of the RSPP, Penza, 1996. (a)

5. Sokolova O.S. and Volodarsky A.D. Difference during Transplantation of Grape Stem and Callus Tissues In Vitro. World Congress on In Vitro Biology, San Francisco, 1996. (b)

6. Sokolova O.S., Volodarsky A.D. The response of the grape callus tissue to the wound stress . 10-th Congress of the FESPP, Florence, 1996. (c)