Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему

Технологические и селекционные аспекты гаплоидии

ВАК РФ 06.01.05, Селекция и семеноводство

Автореферат диссертации по теме "Технологические и селекционные аспекты гаплоидии"

На правах рукописи

ДЬЯЧУК ТАИСИЯ ИВАНОВНА

ТЕХНОЛОГИЧЕСКИЕ И СЕЛЕКЦИОННЫЕ АСПЕКТЫ ГАПЛОИДИИ (на примере пшеницы и ячменя)

06.01.05 - селекция и семеноводство

АВТОРЕФЕРАТ диссертации ва соискание ученой степени ' доктора биологических наук

I

Саратов - 2003

Работа выполнена в Научно-исследовательском институте сельского хозяйства Юго-Востока РАСХН

Оффициальные оппоненты: доггор биологических наук Эльконин Л. А.

доктор биологических наук Еналеева Н.Х. доктор сельскохозяйственных наук Орлова Н. С..

Ведущее учреждение: ФГНУ Поволжский научно-исследовательский и проектно-технологический институт сорго и кукурузы

Защита состоится "/5 « М^Л*^- 2003 г. в 10 часов на заседании диссертационного совета Д 006.050.01 при Научно-исследовательском институте сельского хозяйства Юго-Востока по адресу: 410010, г. Саратов, ул. Тулайкова,7, зал заседаний.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке НИИСХ Юго-Востока.

Автореферат разослан Л_" _2003 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

О.А. Евдокимова

2.ооЗ-А

fur

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Три последних десятилетия исследований по культуре клеток и тканей растений in vitro позволили существенно повысить эффективность методов и сделать их доступными для практического использования. В официальных каталогах зарегистрированы сорта не только двудольных растений, которые долгое время были модельными объектами в культуре тканей, но и зерновых злаков. В экспериментальных работах и практической селекции широко используют гаплоиды - спорофиты с гаметическим числом хромосом.

Основное селекционное преимущество использования гаплоидов -одноэтапное получение гомозигот, что позволяет быстро фиксировать морфофизиологические параметры адаптивности и сокращать сроки создания сортов, отвечающих всем потребностям современного рынка.

У гаплоидов каждый ген представлен единственным аллелем, и эффект рецессивных аллелей проявляется наряду с эффектом доминантных. Генетическое расщепление при использовании гаплоидов менее сложно (не превышает числа классов гамет), и для выделения определенной комбинации генов нужна меньшая выборка растений.

Как известно, отбор в традиционной селекции проводится по одному колосу или одному растению, а на проявление признака в сложной гибридной популяции оказывают влияние как внутрипопуляционные взаимоотношения между растениями, так и различные эффекты взаимодействия генов, что делает такой отбор малоэффективным. Потомство удвоенных гаплоидов, представляющее линию и состоящее из нескольких растений, легче оценивать и отбирать.

Для массового получения гаплоидов пшеницы и ячменя широко используются два метода: культуры пыльников и селективной элиминации хромосом чужеродного вида-опылителя. Эффективное применение этих методов сдерживается рядом причин, главные из которых - недостаточная воспроизводимость полученных результатов в различные сезоны и для различных генотипов.

В Поволжье проблема прямого использования DH-линий (потомств диплоидизированных гаплоидов) в качестве элитных для создания сортов пшеницы и ячменя является новой. Известно, что возделываемые сорта саратовской селекции гетерогенны - у пшеницы выявлен огромный внутрисортовой полиморфизм по компонентному составу глиадинов (Метаковский и др., 1987). Гомогенность сортов гаплоидного происхождения затрагивает проблему их адаптивности в этом уникальном регионе, в первую очередь, засухоустойчивости.

Цель и задачи исследований. Целью данного исследования является изучение возможностей использования гаплоидии в селекции засухоустойчивых сортов пшеницы и ячменя в условиях Поволжья.

Для выполнения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

- усовершенствовать биотехнологии получения гаплоидов в культуре зародышей и пыльников ячменя и пшеницы на основе оптимизации существующих методик и собственных разработок;

- для каждого этапа разработанных биотехнологий изучить факторы, влияющие на гапло продукцию;

- изучить сравнительную эффективность различных методов получения гаплоидов у пшеницы и ячменя;

- изучить влияние Rht-генов на авдрогенез в культуре пыльников и зародышей пшеницы in vitro;

- оценить селекционную ценность линий и сортов, созданных методами гаплоидии.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Теоретическое и экспериментальное обоснование принципов оптимизации биотехнологий получения гаплоидов пшеницы и ячменя.

2. Значение Rht-генов в культуре тканей in vitro пшеницы.

3. Возможность создания сортов пшеницы и ячменя с использованием гаплоидных биотехнологий для засушливых условий Поволжья.

Научная новизна Впервые изучено влияние Rht-генов на эффективность культивирования пыльников и незрелых зародышей мягкой и твердой пшеницы. Показан существенный положительный эффект гена Rht-Blc как на гаплоидном, так на и диплоидном уровнях. Линии, содержащие этот ген, характеризуются длительной морфогенетической активностью каллусов из незрелых зародышей при пассировании, а также более высокими значениями основных показателей, определяющих эффективность гаплопродукции в культуре пыльников, по сравнению с контрольной изолинией.

Впервые показана возможность использования пролиферативного антигена инициалей в качестве маркера морфогенетической активности каллусов пшеницы, что позволяет отбирать генотипы с высокой регенерационной способностью в культуре тканей in vitro.

Проведено комплексное изучение факторов, влияющих на эффективность гаплопродукции пшеницы и ячменя в куьтуре пыльников и зародышей, что послужило основой для разраработки технологий массового получения гаплоидных растений и последующего использования DH-линий в селекционном процессе. Экспериментально

доказано, что традиционное воздействие на колосья и пыльники донорных растений пониженными положительными температурами не является триггером спорофитного развития микроспор - оно происходит и в пыльниках не хранившихся на холоде колосьев.

Установлено, что высокая частота альбинизма регенерантов характерна для различных культуральных систем (культуры пыльников и культуры гаплоидных зародышей). Отсутствие альбиносов при прямой регенерации и появление их в значительном количестве из каллусов гаплоидных незрелых зародышей, свидетельствует о том, что определяющей предпосылкой этого феномена является гаплоидный статус культивируемых клеток, прошедших стадию неорганизованного роста, а не генезис каллусных культур (микроспора или зародыш).

Впервые показано, что в суровых агроклиматических условиях Поволжья гомогенные сорта, созданные с использованием гаплоидии, характеризуются высокой засухоурожайн остью - основным показателем их адаптивности в этом регионе. По коэффициентам пластичности и стабильности сорта ярового ячменя Нутанс 240 и яровой мягкой пшеницы Саратовская 64 не уступают лучшим саратовским сортам-стандартам. Они сохраняют константность и однородность как по своей морфологии, так и электрофоретическим характеристикам запасных белков при длительном самоопылении.

Практическая ценность, работы. Усовершенствованы гаплоидные биотехнологии в культуре пыльников и незрелых зародышей пшеницы и ячменя. Результаты разработок опубликованы в "Методических рекомендациях по получению гаплоидных растений мягкой пшеницы в культуре пыльников" (Дьячук Т.И., Дьячук П.А., 1989).

В результате использования гаплоидных биотехнологий получено 14495 DH-линий, в том числе, яровой мягкой пшеницы - 8297, озимой мягкой - 428 и ярового ячменя - 5770. В содружестве с лабораторией селекции яровой мягкой пшеницы НИИСХ Юго-Востока методом культуры пыльников создан сорт яровой мягкой пшеницы Саратовская 64, допущенный к использованию в 8 регионе РФ (A.c. № 30538 от 01.06.1999 г.) и защищенный патентом РФ (№ 0344 от 05.11.1996 г.). В содружестве с отделом селекции ячменя Краснокутской СОС подготовлен для передачи на Государственные испытания сорт ярового ячменя пивоваренного направления Нутанс 240.

Полученные DH-линии используются как доноры важнейших селекционных признаков в рекомбинационной селекции, что явилось основой для создания новых засухоустойчивых сортов' ячменя Нутанс 287. Нутанс 288 и Нутанс 279 и перспективной линии яровой мягкой пшеницы С-2127.

Апробация работы. Результаты исследований и основные положения диссертации докладывались на Всесоюзных конференциях по биотехнологии злаковых культур (Алма-Аты, 1988, 1989), Международных рабочих совещаниях по программе 5.1.1.1. КПНТП СЭВ (Алма-Ата. 1988; Одесса, 1989; Москва, 1990), Международных конференциях "Биология культивируемых клеток и биотехнология" (Новосибирск. 1989; Москва, 1989; Алма-Аты, 1993). 1-м Всесоюзном симпозиуме "Новые методы биотехнологии растений" (Пущино. 1991), 5-м съезде ВОГиС им. Н.И. Вавилова (Москва, 1987 ), 1-м сьезде Вавиловского общества генетиков и селекционеров (Саратов, 1994), 5-й международной конференции по пшенице (Анкара, 1996), Международной научной конференции "Развитие научного наследия академика Н.И. Вавилова" (Саратов, 1997), Международном совещании "Проблемы селекции полевых культур на адаптивность и качество в засушливых условиях", посвященном 115-летию со дня рождения А.П. Шехурдина (Саратов, 2001), Научной генетической конференции, посвященной 100-летию со дня рождения А.Р. Жебрака и 70-летию образования кафедры генетики в Московской сельскохозяйственной академии им. К.А. Тимирязева (Москва, 2002), Всероссийской научной конференции "Селекция, семеноводство и технологии возделывания сельскохозяйственных культур сухо-степного Заволжья" (Пенза, 2002), 6-й Всероссийской научно-практической конференции "Селекция и семеноводство полевых культур" (Пенза, 2002), Научно-практической конференции профессорско-преподавательского состава Саратовского ГАУ им. Н.И. Вавилова (Саратов, 2003).

Личный вклад соискателя. Результаты исследований, представленные в диссертации, получены при непосредственном личном участии диссертанта или под его руководством. Роль Rht-генов в культуре органов и тканей пшеницы in vitro изучалась совместно с сотрудниками кафедры биотехнологии, селекции и генетики Саратовского ГАУ им. Н.И. Вавилова д.с.х.н. Лобачевым Ю.В. и к.с.х.н. Ткаченко О.В., специфика образования и накопления молекулярного маркера морфогенеза - пролиферативного антигена инициалей (ПАИ) -со старшим научным сотрудником института бйо'химии и физиологии растений и микроорганизмов РАН (г. Саратов) к.б.н. Евсеевой Н.В. Участие автора было определяющим при оформлении научных публикаций. Доля соискателя в создании сорта яровой мягкой пшеницы Саратовская 64 составляет 15%.

Связь работы с крупными научными программами. Данная работа выполнялась с 1984 по 2002 г.г. в соответствии с международной программой КП НТП СЭВ по пятому приоритетному направлению "Ускоренное развитие биотехнологии", программой ВРО ВАСХНИЛ и

РАСХН "Биологические основы интенсификации селекционного процесса культурных растений и животных".

Публикации. Основные положения диссертации изложены в 49 печатных работах, опубликованных в отечественных и зарубежных изданиях, включая два авторских свидетельства и два патента.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 280 страницах машинописного текста. Состоит из введения, 6 глав, выводов, практических рекомендаций и списка использованной литературы, включающего 336 наименований, в том числе 246 - на иностранных языках. Таблиц - 79, рисунков - 24.

Выражаю глубокую благодарность коллективу лаборатории клеточной селекции НИИСХ Юго-Востока, возглавляемому д.б.н Тучиным C.B. - за участие в проведении экспериментов и обсуждении результатов, д.б.н., профессору, заслуженному деятелю науки РФ Крупнову В. А. и д.б.н.. профессору, Тырнову B.C. - за ценные советы при оформлении работы.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ ГЛАВА 1. Аналитический обзор литературы

В обзоре дана краткая история гапловдии у злаков. Обобщены факторы, влияющие на гаплопродукцию. Приведены данные по практическому использованию в селекции методов культуры пыльников и культуры зародышей за рубежом и в России. ГЛАВА 2. Материал и методика

Исследования проводились в лаборатории клеточной селекции НИИСХ Юго-Востока в течение 1984-2002 гг.

2.1. Изучаемый материал. В исследование были взяты из гексаплоидов (2п=42) - Triticum aestivum L. (сортообразцы и гибриды -всего около 400 гибридных комбинаций), из тетраплоидов (2п=28): Triticum durum Desf. (сортообразцы и гибриды), Triticum dicoccum Schuebl. (k-9228), Triticum persicum Vav. (k-40576, k-13385), Triticum aethiopicum Jakubz. (k-43757), Triticum timopheevii Zhuk.(k-31684), Hordeum vulgare L. (сортообразцы и гибриды Краснокутской СОС). Для получения гаплоидов ячменя методом селективной элиминации хромосом в качестве опылителя служил дикий луковичный ячмень Hordeum bulbosum L., для получения полигаплоидов пшеницы - два вида Zea mays L. ( сорт Seneca 60) и Pennisetum americanum L. (образец неизвестного происхождения). Клоны луковичного ячменя были предоставлены С.Ф. Лукьянюк (бывший ВСГИ.).

Для получения гаплоидов ячменя в культуре пыльников использовали как сорта (Донецкий 8, Медикум 46, Нутанс 642, Нутанс 108), так и межсортовые гибриды Краснокутской СОС.

Для изучения влияния генов Rht на процессы культивирования in vitro использовался набор почти изогенных по генам Rht-Blb, Rht-Blc и Rhtl4 линий сорта яровой мягкой пшеницы Саратовская 29 и по генам Rht-Blb и Rhtl4 линий сорта яровой твердой пшеницы Харьковская 46. В качестве стандартов служили соответствующие высокорослые сибсы и сорта Саратовская 29 и Харьковская 46. Изогенные линии не отличались по фенотипу от своих реккуренгных родителей, за исключением высоты растений (табл. 1). Эффекты генов вычисляли в процентах по отношению к соответствующему показателю у контрольной изолинии.

Таблица 1

Характеристика изучаемых линий с генами низкорослости

Линия Происхождение Ген Фенотип

JIRht-BlbC C29xl0/k-45785 Rht-Blb короткостебельный

JIlRht-BlaC C29xl0/k-45785 Rht-Bla высокорослый

JIRht-BlcC C29x7/k-56967 Rht-Blc короткостебельный

JI2Rht-BlaC C29x7/k-56967 Rht-Bla высокорослый

JIRht-14C C29x7/k-52999 Rhtl4 короткостебельный

JIrht-14C C29x7/k-52999 rht 14 высокорослый

JIRht-BlbX X46xl0/k-48310 Rht-Blb короткостебельный

JIRht-BlaX X46xl0/k-48310 Rht-Bla высокорослый

JIRht-14X X46x7/k-52999 Rhtl4 короткостебельный

JIrht-14X X46x7/k-52999 rht 14 высокорослый

2.2. Методика исследований. Отбор донорных растений для последующего культивирования пыльников проводили на стадии вакуолюированной микроспоры, которую наряду с цитологическим контролем определяли по комплексу морфологических признаков -степени плотности цветочных и колосковых чешуй, размеру и цвету пыльников. Пыльники (с холодовой предобработкой и без нее) культивировали на твердых и жидких питательных средах Blades, N6, Potato-2. Для обеспечения вязкости жидких питательных сред был применен Фиколл-400 в концентрации 100 г/л. Регуляторы роста в составе индукционных питательных сред включали 2,4-Д (1 мг/л в агаровых и 5-8 мг/л в жидких) и кинетин (0,5-1мг/л).

Источниками углеводов служили сахароза и мальтоза (в концентрации 6%). Среды для регенерации растений содержали ИУК (1мг/л), сахарозу (2%).

Наблюдения за культурой изолированных микроспор проводили на живом материале на микроскопе IM35 фирмы "Opton".

Для получения гаплоидов методом селективной элиминации хромосом накануне опьшения рыльца обрабатывали раствором пролина,

после опыления - раствором гиббереллина (75 мг/л). Зародыши вычленяли из завязей на 16-18 день после опыления и культивировали на питательной среде Р-8 (Луюьянюк, 1986). Для определения уровня плоидности регенерантов корни обрабатывали насыщенньш раствором монобромнафталина в воде в течение 3-4 часов, фиксировали в растворе Карнуа (3:1) с последующим окрашиванием в реактиве Шиффа (Паушева, 1988). Удвоение хромосомного набора регенерантов проводили путем обработки кончиков корней раствором колхицина (0,3%).

Процедура удвоения набора хромосом состояла из нескольких этапов.

1. Подготовка растений к колхицинированию. Это один из наиболее ответственных этапов, определяющих выживаемость регенерантов и успешность удвоения хромосом. Особое внимание уделяли состоянию корневой системы растений, в связи с чем использовали комплекс процедур для укоренения регенерантов: а) пониженные температуры культивирования (12-15°С), б) дополнительные жидкие питательные среды (Kruse, 1974) с мостиками из фильтровальной бумаги и в) выдерживание регенерантов в воде в течение 10-12 дней.

2. Для синхронизации клеточных делений в меристемах регенераты выдерживали в холодильнике в течение 2-х суток.

3. Процесс колхицинирования проводился потружением корней в раствор колхицина 0,2% с добавлением 0,03% папаина (экспозиция 5 часов при комнатной температуре).

После колхицинирования растения высаживали в вазоны и помещали в условия щадяшего режима, который обеспечивался защитой от попадания прямых солнечных лучей и температурой на уровне 15-17°С. В таких условиях растения находились до возобновления роста листа, ингибированного действием колхицина, с последующим их выращиванием в стандартных условиях.

Регенераты, полученные из донорных растений с озимым типом развития, яровизировали в условиях in vitro в течение двух месяцев, после чего они подвергались колхицинированию по аналогичной с яровыми процедуре.

Для изучения влияния Rht-генов на процессы морфогенеза в культуре незрелых зародышей пшеницы последние вычленяли из колосьев на 14-18 сутки после опыления, что соответствует оптимальной стадии развития для получения каллусных культур in vitro (Не et al.. 1986). В пробирку на поверхность питательной среды помещали по одному зародышу щитком вверх для получения щиткового каллуса, отличающегося от эпибластового более высокой эмбриогенной способностью (Не et al., 1986). В каждом варианте закладывали по 120

зародышей, по одному на пробирку. Культивирование осуществляли в темноте при температуре 25-28 °С.

Полученный каллус анализировали на 30 сутки культивирования. Оценивали следующие показатели: выход общего количества образовавшихся каллусов от числа инокулированных эксплантов (%), выход морфогенных каллусов от общего числа полученных каллусов и от числа эксплантов (%), выход морфогенных каллусов с начавшимся процессом регенерации побегов на исходной питательной среде от числа эксплантов, от общего числа полученных каллусов и от числа морфогенных каллусов.

Морфогенные каллусы субкультивировали на свежей среде того же состава в течение ряда пассажей продолжительностью по 30 суток каждый для определения влияния Ши-генов на процесс затухания морфогенной способности каллусов при длительном культивировании. После каждого пассажа каллусы анализировали по тем же показателям, что и после 0-пассажа. с той лишь разницей, что выход морфогенных каллусов и каллусов с начавшейся регенерацией побегов вычисляли по отношению к количеству морфогенных каллусов, полученных в предыдущем пассаже.

Для оптимизации состава индукционной питательной среды были изучены вещества "1385", "1386" и "1387", предоставленные профессором кафедры химии Саратовского ГАУ им. Н.И. Вавилова Норициной М.В. Для этой цели в качестве модельной использовали линию с геном 1Ш-В1с из-за повышенной способности к соматическому эмбриогенезу, выявленной в процессе скрининга.

Контрольной для культивирования являлась среда ЛС с содержанием 2 мг/л 2,4-Д. Изучалось 6 вариантов сред: к контрольной среде ЛС добавлялись вещества "1385", "1386" и "1387" в концентрации 1 и 10 мг/л. Дополнительно, для исключения дедифференцирующей способности исследуемых веществ было изучено их влияние без 2,4-Д. Культивировали по 80 эксплантов в каждом варианте.

Отбор проб на ПАИ проводился в момент закладки зародышей (О суток), на 8. 15, 22, 30 сутки (среда с 2,4-Д) и на 32, 35 и 39 сутки (среда без 2.4-Д). Каждая проба отбиралась в трех повторностях. Анализ содержания ПАИ определялся по стандартной методике (Володарский и др.. 1979).

Стабильность характеристик потомств диплоидизиро ванных гаплоидов определялась как по морфологическим признакам растений, так и электрофоретическим характеристикам запасных белков. Глиадины исследовали в отдельных зерновках (по 3 зерновки из колоса), предварительно экстрагируя их из эндосперма 70% этанолом. Электрофорез глиадинов проводили в 8% ПААГ в однородной буферной системе: лактат алюминия-молочная кислота (рН 3,1) (ВияЬик, гШтапп,

10

1978). После электрофореза белки в геле выявляли методом окрашивания Кумаси С-250 в 10% трихлоруксусной кислоте с последующим вымачиванием гелевых пластин в 7% уксусной кислоте.

Первоначальное изучение потомств удвоенных гаплоидов проходило на полях экспериментального севооборота лаборатории клеточной селекции, последующие - в соответствующих селекционных лабораториях НИИСХ Юго-Востока по общепринятым методикам селекционного процесса (Ильина, 1970; Ильин, 2000).

Полученные данные обрабатывались методами биологической статистики с приложением комплекса программ для ЮМ.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ ГЛАВА 3. ПОЛУЧЕНИЕ ГАПЛОИДОВ МЕТОДОМ КУЛЬТУРЫ

ПЫЛЬНИКОВ

3.1. Факторы, влияющие на гаплопродукцию

Получение гаплоидов в культуре пыльников состоит из ряда взаимосвязанных этапов - выращивания донорных растений, отбора пыльников на определенной стадии развития, их культивирования на индукционных питательных средах и регенерации растений из полученных новообразований. Из всех звеньев этой цепи невоспроизводимым является одно - условия выращивания донорных растений.

Изучено влияние условий выращивания доноров на эффективность гаплопродукции пшеницы и ячменя. Анализ показателя "частота индукции андрогенеза" показал, что в засушливые годы его величина в среднем в 2-2.5 раза превышает таковую в относительно благоприятные годы.

Изучение влияния двух стандартных сроков посева доноров в теплице (август и январь) и поле на частоту формирования эмбриогенных пыльников показало, что при посеве донорных растений в первый срок в теплице (август-сентябрь) частота спорофитного развития микроспор у всех изученных сортообразцов и гибридов была низкой, а среди полученных новообразований преобладали неморфогенные каллусы, что резко снижало частоту регенерации растений. Пыльники вегетирующих в поле растений формировали андрогенетические структуры с частотой 1,09,2%. Пыльники тех же гибридов, отобранные из донорных растений второго срока сева в теплице (январь-февраль), имели сходную с полевыми условиями частоту индукции андрогенеза, тогда как отзывчивость пыльников тепличных растений первого срока (их отбор проводился в осенне-зимний период), составляла всего 0,4-1,1%.

Существенно, что условия выращивания доноров влияют и на путь морфогенеза в культуре пыльников. В условиях теплицы спорофитное развитие микроспор в большей степени смещено в сторону образования неэмбриогенного каллуса. Доля каллусов в культуре пыльников пяти

11 '

гибридных комбинаций, вегетирующих в поле, составила в среднем 6,8% от общего числа новообразований. При выращивании гибридов в теплице их доля возросла в 3,8 раза и составила 25.5%. В зависимости от генотипа этот показатель колеблется от 0 до 9,7% при полевом выращивании доноров и от 20 до 33,3% - в условиях теплицы.

Таким образом, проведенные исследования показали, что выращивание донорных растений в теплице первого срока сева неэффективно как по причине низкой частоты индукции андрогенетических объектов, так и высокой доли неморфогенного каллуса среди общего количества новообразований.

Эффект пониженных положительных температур. Для увеличения частоты спорофитного развития микроспор используют различные воздействия на колосья и пыльники донорных растений, среди которых наибольшее распространение получила пониженная положительная температура.

По данным СМ и ЭМ, под воздействием низких положительных температур микроспоры отрываются от стенки пыльника и выпадают в полость гнезда; в таких "оторвавшихся" и "голодающих" микроспорах подавляется экспрессия гаметофитной и проявляется спорофитная программа развития (Круглова, .2000). Однако, по мнению других авторов, выпадение микроспор в полость гнезда пыльника и их голодание являются причиной полиморфизма пыльцы in vivo и рассматриваются в контексте со спорофитным развитием микроспор in vitro (Idzikowska, 1982; Dunwell, 1985).

Эффект холодового воздействия (+2°С...+5°С) был изучен нами на различных по уровню отзывчивости генотипах - низкоотзывчивых линиях твердой и мягкой пшеницы с генами низкорослости и сортообразцах яровой мягкой пшеницы саратовской селекции. Результаты опытов показали, что холод не является триггером спорофитного развития микроспор - оно происходит и в пыльниках свежеубранных колосьев (табл.2). Уровень спорофитного развития микроспор резко падает при увеличении сроков хранения, а при 2-х недельном воздействии холодом андрогенетический потенциал сортов практически затухает, он сохраняется только у высокоотзывчивой линии 35/5.

Проведенные эксперименты показали, что принципиальный эффект холода заключается скорее в поддержании жизнеспособности микроспор, возникших задолго до их культивирования in vitro, а не в переключении новых микроспор с гаметофитного на спорофитный путь развития.

В пользу этой точки зрения, на наш взгляд, служат следующие факты:

Таблица 2

Влияние продолжительности воздействия пониженной положительной температурой на частоту индукции андрогенеза у яровой мягкой пшеницы (среднее 1996-2000 гг.)

Сорт, линия Продолжительность воздействия, сутки

0 3 5 7 14 Рфакт НСР

пыль НИКОВ, шт. новообразований, шт. (%) пыль НИКОВ, шт. новообразований, пгг.(%) пыль НИКОВ, шт. новообразований, шт.(%) пыльников шт. новообразований, шт.(%) пыль НИКОВ, шт. новооб разова-ний, шт.(%)

JI503 846 64(7,6) 640 43(6,7) 684 26(3,8) 681 13(1,9) 456 0 15,2* 2,2

С58 •987 82(8,3) 619 59(8,1) 760 ' 46(6,0) 720 31(4,3) 640 7(1,2) 11,7* 2,4

А28 764 37(1,9) 704 30(4,3) 818 32(3,9) 490 15(3,1) 562 1(0,2) 6,2* 2,0

Прох. 810 48(5,9) 762 36(4,8) 768 30(4,0) 632 17(2,7) 480 1(0,2) 7,7* 2,1

Л35 876 208(23,8) 810 137(17,0) 462 47(10,3) 710 51(7,2) 512 14(2,8) 43,8* 3,6

Рфакг. - 59,2* - 27,8* - 8,2* - 7,8* - 7,7* 7,7*

НСР - 2,2 - 2,9 - 2,4 - 2,0 - 1,9 1,9

Примечания: С58 - Саратовская 58, А28 - Альбидум 28, Прох. - Прохоровка *- различия значимы на уровне 05

1. Наличие связи между частотой аномалий в развитии микроспор in vivo и анцрогенетическим потенциалом в культуре пыльников in vitro. Регенераты в культуре пыльников высокоотзывчивой линии яровой мягкой пшеницы №35/5, характеризующейся наличием различных естественных аномалий микроспор, образуются путем первичного и вторичного эмбриоидогенеза - одной из форм бесполого размножения растений (Шамров, Дьячук, Батыгина, 1988). Эта же линия характеризовалась и самой высокой частотой формирования эмбриогенных пыльников и растений (максимальный выход растений составил 18 штук на 100 культивируемых тальников).

Высокоотзывчивая в культуре пыльников линия "Фотос" характеризуется ярко выраженными естественными аномалиями микроспор по сравнению с низкоотзывчивым сортом Саратовская 29 (Мунаварова, 2000).

2. Искусственно вызванные аномалии микроспор путем обработки донорных растений гаметоцидом задолго до культивирования пыльников (на стадии мейоза) приводят к резкому увеличению частоты индукции андрогенетических структур по сравнению с контролем (Picard et al., 1987).

3. До холодового шока колосья и пыльники донорных растений подвергаются другому, в большинстве исследований не учитываемому стрессу, - удалению их с донорнош растения и как следствие - быстрому старению.

Состав индукционных питательных сред. Изучено влияние трех распространенных питательных сред для культивирования пыльников -Блейдза, N6. Potato 2. Показана высокая эффективность питательных сред с добавлением картофельного экстракта для всех генотипов. В то же время различия между генотипами продолжают сохраняться и при культивировании пыльников на картофельной среде.

Особенности гаплопродукции на жидких питательных средах отличаются тем. что этот прием культивирования пыльников включает в себя две культуральные системы: собственно культуру пыльников и культуру изолированных микроспор. Пыльники помещаются на поверхность жидкой питательной среды, содержащей Фиколл-400 в концентрации 100 г/л. Через 4-6 дней микроспоры высыпаются из лопнувшего пыльника в жидкую среду, где они подвергаются серии делений до формирования многоклеточных новообразований (рис.1). Сформировавшиеся на жидкой питательной среде эмбриоиды по своему внешнему виду являются точными копиями зиготических зародышей, их размер превышает размер пыльника (рис.2). Дифференцированные эмбриоиды начинают регенерировать растения уже через три дня после их переноса на дифференцирующие среды (рис.3). Важным преимуществом жидких питательных сред является возможность

14

культивирования целых цветков и даже колосков, что освобождает от трудоемкой процедуры вычленения пыльников (рис. 2 в).

Для 5 изученных генотипов пшеницы (4 сорта и один межвидовой гибрид) преимущество питательных сред, содержащих Фиколд. было показано на всех этапах получения гаплоидных растений.

С целью оптимизации состава индукционных питательных сред были изучены вещества "1385". "1386" и "1387" (производные фурфурола. полумаемого при гидролитическом расщеплении гемицеллюлаз).

Росторегудируюшая активность этих веществ была установлена in vivo - они стимулировали рост колеоптилей мягкой пшеницы различных генотипов. Установлено, что вещество "1386" даже в концентрации 1 мг/л существенно повышает регенерационную способность и не оказывает отрицательного влияния на выход морфогенных каллусов Получен патент РФ №2186768 на морфогенетическуто и

росторегулирующую активность этого вещества от 10.08.2002 г.

3.2. Генотип донорного рас 1еиия.

3.2.1. Гаплопродукции у сортообразцов мягкой и твердой пшеницы саратовской селекции

Начиная с 1984 года, нами было изучено 442 генотипа пшениц, основную часть которых составили гибриды и сорта яровой и озимой мягкой пшеницы, межсортовые гибриды, а также межвидовые гибриды и виды Т. durum Desf.. Т. timopheevii Zhuk., Т. aethiopicum Jaknbz.. Т. persicum Vav . Т. dicoccum Schuebl.

У всех испытанных сортов и линий мягкой пшеницы были получены эмбриоиды и зеленые растения., однако частота их формирования зависела от генотипа. Выявлен образец (№35/5). полученный от скрещивания Inia 66 х Кавказ, с очень высокой частотой формирования эмбриоидов - 41,1%. Частота регенерации растений у этого генотипа составила 18,2%. т.е. на каждые 100 культивируемых пыльников было получено 18 гаплоидных растений. У других сортов регенерация растений была на уровне 0.2-5,8%. Хорошей отзывчивостью в культуре пыльников отличались сорта Лютесценс 62 (Л62). Альбидум 43 (А43). Саратовская 46 (С46), слабой - Саратовская 38 (С38) и Саратовская 42 (С42).

Отмечены сортовые различия и по выходу хлорофиллдефекгных растений. Так, значительная часть регеиерантов. полученных на основе сортов С46. А43 и линии С-i 871 оказались нежизнеспособными альбиносами (более 70%). Такие сорта, как Саратовская 29 (С29). Л62 и Саратовская 54 (С54) формировали в культуре пыльников, главным образом, зеленые растения.

Рис 1.Основные этапы развития микроспор в изолированной культуре (а. б. в. г - первые деления, д - формирование многоклеточного новообразования, е - общий вид)

Ш >

Рис.2. Культура пыльников яровой мягкой пшеницы на жилкой шпульной среде (а - общий вВД: б -тфф^иищ^^^ртт В - культура изолированных цветков)

Рис.3. Регенерация растений яровой мягкой пшемти гаплоидным (а) и диплоцдным (б) натром хромосом *

Таким образом, несмотря на резко выраженную генотипическую мвисимость. у мягкой пшеницы регенерация растений в культуре пыльников с различной частотой возможна практически из всех генотипов.

Проанализированный нами набор различных тетраплоидных видов - T.durum Desf.. T.aetliyopicum Jakubz., T.persicum Vav., T.dicoccum Schuebl.. T.timopheevii Zhuk. - характеризовался более низким андрогенетическим потенциалом по сравнению с мягкой пшеницей Исключение составил образец T.persicum (k-13385), который на протяжении ряда лет изучения превосходил другие тетраплоидные виды по способности давать гаплоидные растения в культуре пыльников. Сорта твердой пшеницы формировали андрогенетические структуры с частотой 0.8-3,3%. Низкую частоту регенерации гаплоидных растений твердой пшеницы в культуре пыльников отмечали и другие исследователи (Picard et al.. 1998), при этом индукция андрогенетических структур у некоторых сортообразцов вида происходит примерно с такой же частотой, как и у мягкой. Однако, среди полученных новообразований преобладают неморфогенные каллусы, что. вероятно, и служит причиной ншкой частоты регенерации растений. Проблема регенерации растений у твердой пшеницы в значительной степени была решена с использованием жидких питательных сред, способствующих формированию хорошо дифференцированных эмбриоидов, однако, подавляшес большинство регенератов этого вида являются альбиносами (в среднем 80%).

3.2.2. Особенности культивирования пыльников

межвидовых гибридов пшеницы

Пол>ченные на основе комплексного использования селекционных и биотсхнологических методов (бэккроссы. эмбриокультура. микроклональнос размножение), межвидовые гибриды пшеницы были использованы в качестве донорных растений для получения гаплоидов. Гибриды F, характеризовались повышенной частотой индукции новообраюваний по сравнению с родительскими линиями, что давало возможность получать гаплоиды в тех комбинациях скрещиваний, где один или оба родителя имели низкие значения этого признака.

При возвратных скрещиваниях значение показателя "частота индукции андрогснс ¡а" приближалось к таковому у реккурентного родителя. Пол\ченные регенеранты характеризовались высокой частотой альбинизма - от 45 до 80%. Наибольшую частоту хлорофиллдефектности растений имели гибриды мягкой и твердой пшеницы с эфиопской. В общей сложности в культуре пыльников межвидовых гибридов получено 360 DH-линий, большую часть которых составляют линии с участием высокоотзывчивого сортообразца вида Т. persicum (k-13385).

3.2.3. Получение гаплоидов ячменя в культуре пыльников

При культивировании пыльников ячменя выявлено, что несмотря на высокую частоту индукции андрогенетических структур, регенерация из них растений была очень низкой и не превышала десятые доли процента.

Для изучения влияния состава индукционных питательных сред было проведено сравнительное изучение влияния сахарозы и мальтозы на различные этапы получения гаплоидных растений в культуре пыльников. У 8 из 12 изученных генотипов ячменя не удалось получить ни одного зеленого растения при культивировании пыльников на сахарозосодержащей среде, и только два генотипа не формировали зеленых регенерантов при замене сахарозы на мальтозу в индукционной питательной среде. Мальтоза оказала положительное влияние на все основные этапы получения регенерантов - на выход каллусов, регенерацию растений и особенно на выход зеленых растений. В то же время у двух генотипов и на питательной среде с мальтозой не удалось получить ни одного гаплоидного растения.

При культивировании примерно одинакового количества пыльников (8700 на среде с мальтозой и 8508 на среде с сахарозой) общий выход регенерантов составил 336 и 109, т.е. мальтоза увеличила частоту регенерации растений в 3 раза. Выход зеленых растений в опыте с мальтозой составил 45 шт. или 0,5% к обшему числу культивируемых пыльников. Этот же показатель на сахарозосодержащей индукционной питательной среде составил 11 шт. или 0,1 % к числу культивируемых пыльников. В общей сложности в этих опытах было получено 445 регенерантов, из которых лишь 52 были зелеными.

Исходя из эффективности жидких питательных сред, содержащих Фиколл-400, на эффективность гаплопродукции в культуре пыльников мягкой пшеницы, соответствующий опыт был проведен на четырех сортах ярового ячменя - Медикум 46, Нутанс 108, Нутанс 642 и Нутанс 240. Наиболее заметное влияние жидкие питательные среды оказали на регенерацию растений. У сорта Медикум 46 она увеличилась с 15,6 до 25 %, у Нутанс 108 почти в два раза (с 20,8% до 40.9%), у Нутанс 642 с 14.2 до 26.7%, а у сорта гаплоидного происхождения Нутанс 240 - с 8,5 до 25.8%.

Таким образом, с использованием жидких питательных сред в культуре пыльников ячменя в значительной степени решаются проблемы, связанные с регенерацией растений. Однако, основной недостаток метода - высокая частота альбинизма - и в этом случае остается непреодоленным. Подавляющее большинство регенерантов (от 80 до 100%) остаются альбиносами и гибнут на стадии 2-3-х листьев. Однако, этот метод получения гаплоидов имеет преимущества перед

методом "бульбозум", выражающиеся в высокой доли спонтанных диплоидов и высокой озерненности колосьев уже в поколении Но По этой причине в определенных случаях этот метод может служить не только дополнением к методу селективной элиминации хромосом, но и быть его альтернативой.

3.2.4. Регенерация растений

Регенерация растений является важным завершающим этапом технологии культивирования пыльников. Процессы дедифференциации и вторичной дифференциации в культуре in vitro сопровождаются изменением качественного и количественного соотношения белков. Для изучения морфогенетической характеристики каллусов пшеницы был использован высокомолекулярный маркер "пролиферативный антиген инициалей" (ПАИ). Показано, что ПАИ, используемый как маркер морфогенеза пшеницы in vivo ((Evseeva et al., 1998), может использоваться и в качестве маркера морфогенетической активности каллусов in vitro. Иммунохимический анализ содержания ПАИ в эмбриогенных и неэмбриогенных каллусах пшеницы показал, что, независимо от состава питательной среды, в неэмбриогенном каллусе ПАИ не содержится. В эмбриогенном каллусе ПАИ обнаружен в обоих случаях, причем на среде для регенерации растений его содержание было в 2 раза выше, чем на исходной питательной среде.

Следовательно, показатель содержания ПАИ может использоваться в качестве дополнительного теста на морфогенетическую способность каллусов линий и сортов мягкой пшеницы.

Среди физических условий важная роль принадлежит темературе культивирования полученных новообразований. Мы изучили влияние различных температур культивирования эмбриоидов -традиционные (25-27°С), чередование пониженных положительных температур (4°С) с обычными и постоянное культивирование при 12-15°С на проявление основных путей морфогенеза у линии мягкой пшеницы 35/5 - регенерацию зеленых и альбиносных растений, ризогенез, некрозы. Постоянное культивирование при 12-15 °С привело к заметному снижению некрозов - с 55,5 до 35,5%, что, очевидно с синхронизацией клеточных делений, увеличением размера эмбриоидов и их лучшей дифференциацией. Достоверно увеличился и выход зеленых растений. С другой стороны, такие температуры культивирования способствуют формированию крепких, хорошо развитых растений, которые могут быть колхицинированы непосредственно после их выведения из условий in vitro без дополнительных операций по высадке растений в почву, их доращиванию, колхицинированию и последующей высадке в грунт. При массовом получении гаплоидных растений эта операции очень

трудоемкие, и они в значительной степени повышают себестоимость получаемых линий.

Состояние корневой системы регенератов определяет как выживаемость после колхицинирования, так и успех диплоидизации. Для укоренения растений использовали комплекс приемов: обедненный состав сред для регенерации растений, дополнительные жидкие питательные среды с мостиками из фильтровальной бумаги, культивирование полученных новообразований при 12-15°С.

Регенераты с озимым типом развития яровизировали в условиях in vitro в течение 2-месяцев (для этой цели пригоден обычный бытовой холодильник). Такой прием не только значительно экономит место в климатически-контролируемом помещении - один штатив с 40 пробирочными растениями занимает площадь 20x12 см2. но и зачастую является единственной возможностью яровизации регенерантов, полученных в летнее время. Дальнейшие процедуры для укоренения регенерантов и их диплоидизации были сходны с яровыми. ГЛАВА 4. ГЕНЕТИЧЕСКИЙ КОНТРОЛЬ МОРФОГЕНЕЗА НА ГАПЛОИДНОМ И ДИПЛОИДНОМ УРОВНЯХ

В литературе имеется чрезвычайно ограниченная информация о сходстве и различиях генетических систем, контролирующих морфогенетические процессы на диплоидном и гаплоидном уровнях -культуре пыльников и культуре незрелых зародышей. Имеются сведения, что нет прямых корреляций между показателями в культуре соматических тканей (культуре зародышей) и в культуре пыльников in vitro, на основании чего сделан вывод о разном генетическом контроле этих признаков (Agashe et al., 1988).

Общий генетический контроль морфогенеза в обеих культуральных системах у мягкой пшеницы связан с негативной ролью короткого плеча 1В хромосомы. Замена его на соответствующее плечо ржаной хромосомы привела к положительному эффекту как в культуре пыльников, так и культуре зародышей (Henry and de Buyser, 1994).

Существенное влияние генов низкорослости на баланс эндогенных гормонов позволяет предположить их детерминацию на процессы, происходящие в культуре клеток и тканей.

4.1.Влияние Rht-генов на андрогенез мягкой и твердой пшеницы в культуре пыльников

Результаты проведенных экспериментов показали, что гены низкорослости оказывают неоднозначное влияние на различные этапы андрогенеза в культуре пыльников. В генофоне мягкой пшеницы ген низкорослости Rht-Blc оказал существенное положительное влияние на эффективность всех этапов культивирования. Положительные эффекты гена на показатель "выход морфогенных пыльников", "выход гаплоидных новообразований" и "регенерационная способность"

21

составили 61%, 40,7% и 200% соответственно. Ген Rhtl4 оказал достоверное отрицательное влияние на показатели "выход морфогенных пыльников" и "выход новообразований" (отрицательный эффект гена по обоим показателям составил 73,3%). Ген Rht-Blb имеет однонаправленный (положительный) с геном Rht-Blc эффект, хотя и менее ярко выраженный (рис. 4А).

В генофоне твердой пшеницы оба изученных гена (Rht-Blb и Rhtl4) показали отрицательный эффект по сравнению с соответствующим сибсом. как по выходу эмбриогенных пыльников, так и новообразований (рис.4В) Таким образом, ген Rht-Blb оказывает различное влияние на эффективность культивирования пыльников мягкой и твердой пшеницы. Изменение величины проявления признаков, обусловленных действием генов Rht, проявляется и in vivo при переносе генов из мягкой пшеницы в твердую (Lobachev, 1998). Кроме того, существуют данные и о влиянии уровня плоидности на способность к андрогенезу in vitro.

Влияние генотипа особенно наглядно демонстрируют данные по соотношению различных типов гаплоидных структур (каллусов и эмбриоидов) среди общего количества новообразований. Известно, что регенерационная способность зависит не только от количества, но и качества новообразований, степени их дифференцированное™ (Henry and Buyser, 1990). У мягкой пшеницы слабоотзывчивый сорт Саратовская 29 и высокорослые сибсы не имеют заметного превосходства структур того или иного типа. То же самое можно отметить для линии с геном Rht-Blb. У линии, несущей ген Rht-Blc, характеризующейся наибольшей отзывчивостью в культуре пыльников, количество эмбриоидов достоверно превышает количество каллусов, что и является, очевидно, причиной лучшей регенерационной способности этого генотипа. Наоборот, линия с геном Rhtl4, достоверно снижающая способность к регенерации, характеризуется и меньшим количеством эмбриоидов по сравнению с каллусами.

4. 2. Влияние Rht-генов на морфогенез в культуре незрелых зародышей мягкой и твердой пшеницы

Экспланты (в данном случае незрелые зародыши), помещенные на искусственную питательную среду, под действием ее компонентов претерпевали ряд последовательных изменений: дедифференциацию и образование каллуса, рост каллусной массы и формирование зон вторичной дифференциации. Однако, у части зародышей под влиянием эндогенных гормонов прорастают колеоптили. При этом каллус из других тканей зародыша образуется медленно, и если колеоптили не удалить, то такой каллус обычно остается неморфогенным.

75 --

>5 55

о4

^ 35

61

□ пыльники И новообразования

X

ш и

15

40,7

ч

НШ4

Ш-В1

Ши14 Ген

-18,41 -20,6 ПЫЛЬНИКИ

новообразования

В

Рис. 4. Эффекты генов низкорослости в культуре пыльников мягкой (А) и твердой (В) пшеницы (% от сибса)

Среди изучаемого набора линий мягкой пшеницы прорастание колеоптилей наблюдалось в среднем с частотой 5,1 %. При этом линии 1Ш-В1Ь и ШИ-В1 с достоверно превосходили свои высокорослые сибсы по этому показателю. Линия с геном Щц14 по этому признаку достоверно не отличалась от своего сибса.

У твердой пшеницы частота прорастания зародышей оказалась значительно выше - примерно 11%. Аналогично мягкой пшенице, линия твердой пшеницы с геном Ши-В1Ь достоверно превышала свой сибс, а линия с геном ИЫ14 не отличалась по этому показателю от соответствующего сибса.

Таким образом, уже на первом этапе культивирования действие генов ЩЦ-В1Ь и Щн-В1с отличается от гена 1Ш14. что, видимо, объясняется их различным влиянием на баланс эндогенных гормонов.

Анализ каллусных культур на 30 сутки культивирования показал, что частота образования каллуса у мягкой пшеницы составила в среднем 94%. Однако, среди образовавшихся каллусов количество морфогенных каллусов под действием гена ШИ-В1с достоверно увеличилось по сравнению с сибсом. По отношению к общему количеству инокулированных эксплантов выход морфогенного каллуса у линии с геном Юй-В1с достоверно выше, чем у высокорослого сибса. Гены ЗШ-В1Ь и №14 достоверного влияния на каллусогенез, образование морфогенного каллуса и регенерацию растений на исходной питательной среде не оказали.

У твердой пшеницы каллус из эксплантов образовывался с частотой 83% На общую каллусообразуюшую способность отрицательное влияние оказал ген Шц-В1Ь. Однако образующийся у линии с этим геном каллус отличался более высокой степенью дифференцированное™. По отношению к общему количеству эксплантов выход морфогенного каллуса существенно увеличился под действием гена №14. Регенерация на инициальной питательной среде из морфогенных каллусов была примерно на одинаковом уровне, но значительно ниже, чем у мягкой пшеницы (0,84 % у твердой пшеницы по сравнению с 17,5 % у мягкой).

Таким образом, проведенный эксперимент показал, что Шй-гены не оказывают достоверного влияния на регенерационную способность каллусов на инициальной питательной среде. Однако, на общую каллусообразующую способность и на формирование морфогенных каллусов ГШ-гены оказали различное по степени и направлению влияние.

Полученные на инициальной питательной среде морфогенные каллусы далее субкультивировались для изучения влияния Шп-генов на процесс затухания морфогенетической активности каллусов мягкой и твердой пшеницы в процессе пассирования.

У мягкой пшеницы каллусы пассировались 4 раза. Тенденция к уменьшению количества морфогенных каллусов наметилась уже после

первого пассажа, но у половины линий достоверных отличий на этом этапе не было. После второго пассажа у всех линий выход морфогенных каллусов по отношению к количеству первоначальных эксплантов уменьшился, а между вторым и третьим пассажами существенных различий не было ни у одной линии.

Гены Ши-В1с и КШ4 увеличили выход морфогенных каллусов во всех пассажах. Эффект действия генов по мере уменьшения общего количества морфогенных каллусов нарастал, но достоверный положительный эффект отмечен только у линии с геном Шй-В1с. При этом эффект гена Шц-В 1 с превосходил по величине однонаправленный с ним эффект гена 1Ш14. Линия с геном Шн-В1Ь во всех пассажах отличалась от своего сибса более низким выходом морфогенных каллусов, но достоверный отрицательный эффект этого гена зафиксирован только в первом пассаже, в остальных случаях различия между альтернативными парами не достоверны.

Эффект затухания морфогенетической активности каллусов в наибольшей степени характеризует показатель "выход морфогенных каллусов" (в % от количества каллусов в предыдущем пассаже). Только у линии с геном 1Ш-В1с морфогенетическая активность каллусов остается на одном уровне и даже увеличивается после 120 суток культивирования, а достоверное уменьшение наблюдается только после 4-х пассажей (160 суток культивирования). Это свидетельствует о высокой степени дифференцированное™ каллусов у линий с этим геном. У остальных линий затухание морфогенной способности каллусов происходит равномерно: после первого пассажа снижается практически у всех линий, а затем удерживается примерно на одном уровне и резко снижается в 4-м пассаже (рис.5).

Регенерационная способность морфогенных каллусов на инициальной питательной среде в процессе пассирования практически не изменяется у всех линий и колеблется примерно на одном уровне. Только после четвертого пассажа происходит ее снижение у половины изучаемых генотипов. Во втором пассаже среди морфогенных каллусов достоверно увеличивается доля каллусов с зелеными листовыми примордиями под влиянием генов Шц-В1с и 1Ш14. У линии с геном Ши-В1с регенерационная способность каллусов существенно увеличивается и по отношению к количеству первоначальных эксплантов. У твердой пшеницы способность морфогенных каллусов к длительному культивированию на среде аналогичного состава была значительно хуже, чем у мягкой, всего 90 суток. Линии с генами низкорослосги проявили тенденцию к увеличению морфогенетической активности каллусов. При этом, ген 1Ш-В1Ь у твердой пшеницы, в отличие от мягкой, увеличивал выход морфогенных каллусов в процессе пассирования, а у линии с геном Щи 14 существенное увеличение морфогенетически активных каллусов по

£ 300

ее

2 250 +

£200 +

•вт

ю о<

150 + 100 50 0 -50

262

176

]Ш-В1Ь

51

)

73

ИШ

4 -46

47

220

79

61

33

Ж

КМ-В1с

Rhtl4

ген

Рис.5. Эффект Ши-генов из признак "выход морфогеиного каллуса в процессе пассирования" у мягкой пшеницы

0, 1, 2, 3, 4 - номера пассажей

сравнению с сибсом отмечено лишь на инициальной питательной среде. Регенерационная способность каллусов твердой пшеницы оказалась крайне низкой и статистической обработке не подлежит.

Таким образом, сравнительный анализ влияния генов Rht на морфогенетические процессы в культуре пыльников и незрелых зародышей показывает, что наиболее ярко выраженным положительным эффектом in vitro обладает ген Rht-Blc. Этот ген существенно увеличивает выход гаплоидных новообразований в культуре пыльников и длительно поддерживает морфо генетическую активность каллусов при пассировании в культуре незрелых зародышей.

ГЛАВА 5. ПОЛУЧЕНИЕ ГАПЛОИДОВ МЕТОДОМ СЕЛЕКТИВНОЙ ЭЛИМИНАЦИИ ХРОМОСОМ

5.1. Получение гаплоидов обыкновенного ячменя при скрещивании Hordeum vulgare L. х Hordeum bulbosum L.

На успешность использования метода в селекции оказывают влияние следующие показатели: а) завязываемость зерновок, б) выход дифференцированных зародышей, в) степень элиминации хромосом Н. bulbosum. определяющая выход гаплоидных или гибридных растений, г) эффективность удвоения хромосом. Количественные и качественные параметры этих показателей зависят от условий выращивания донорных растений (региона, поле-теплица, сезона), которые определяют их физиологическое состояние, а также генотипов Н. vulgare L. и Н. bulbosum L.

Условия Поволжья являются специфичными для гаплопродукции в культуре зародышей. Степень проявления обратимых и необратимых нарушений эмбриологических процессов, проявляющихся при отдаленной гибридизации (Батыгина, 1987), в этом климатическом регионе усиливается под влиянием засухи и жары. В условиях низкой влажности воздуха и повышенных теператур, складывающихся в период опыления и формирования зародышей, которые являются обычными для условий Юго-Востока, элиминация хромосом Н. bulbosum L. является абсолютной, и за все годы исследований мы наблюдали гибридные растения лишь в едиичных случаях при выращивании донорных растений в условиях фитотрона. Все 10 клонов Hordeum bulbosum L, основным источником поступления которых был бывший ВСГИ (г. Одесса), не проявили различий по этому показателю. Отсутствие гибридов в скрещиваниях различных генотипов Н. vulgare с луковичным ячменем в условиях Юго-Востока указывает на огромную роль температурного фактора в элиминации хромосом.

Показатель, непосредственно определяющий выход гаплоидных растений-регенерантов - дифференциация зародышей, явился критическим во все годы исследований, особенно в полевые сезоны с неблагоприятными условиями. На процесс дифференциации зародышей

оказывает влияние комплекс факторов - степень генетической близости исходных форм (генотип обыкновенного ячменя и клона Н. bulbosum L.), а также климатические условия, сложившиеся в этот период. Наиболее существенные параметры - влажность воздуха и почвы. Оптимальными являются температуры 25°С±2°С и влажность воздуха 70% (Jensen, 1974).

Как правило, дифференциация зародышей в полевых условиях выращивания доноров в Саратове приходится на конец июня -начало июля, т.е. период острого напряжения метеорологических факторов с высокими температурами и низкой влажностью воздуха. По среднемноголетним данным, которые приводит Н.С. Васильчук (2001), дефицит влажности воздуха к этому периоду усиливается и достигает 20 мб (в экстремальные годы - до 30 мб), что свидетельствует о нарастании почвенной и атмосферной засух. Процесс развития зародышей протекает аномально, что резко снижает выход гаплоидных растений. Зародыши имеют сильно измененный щиток, который может быть разной величины и формы, часто у них отсутствует точка роста, что приводит к ранним некрозам и гибели. Измененный щигок чабто пролиферирует в каллус. В результате в отдельные полевые сезоны вообще не удается получить гаплоидных растений при регенерации посредством прямого эмбриогенеза.

Аномально дифференцированные зародыши, неспособные к регенерации растений путем прямого эмбриогенеза, могут служить источником гаплоидных каллусных культур. При культивировании каллусных культур на средах с 2 мг/л 2,4-Д происходит реализация различных путей морфогенеза - эмбриоидогенеза и органогенеза и последующая регенерация растений на стандартных питательных средах. Такая процедура увеличивает время для получения регенерантов на 1-1,5 месяца, но позволяет сохранять максимальное количество потенциальных генотипов. В экстремальных погодно-климатических условиях регенерация растений из каллусных культур, полученных из аномально дифференцированных зародышей, является реальной возможностью сохранения генетического потенциала любого гибрида. Получение морфогенетически активных каллусных культур из незрелых зародышей широко используется в клеточной селекции злаков (Тучин, 2000), однако в условиях Поволжья этот прием является эффективным и для получения гаплоидных регенератов в тех случаях, когда регенерация растений посредством прямого эмбриогенеза невозможна из-за различных аномалий в развитии зародышей.

При регенерации гаплоидов, полученных в каллусной культуре из незрелых зародышей, возникают альбиносные растения с частотой от 27,4 до 100% (в среднем 45,3%), в то же время при регенерации через

прямой эмбриогенез формирования бесхлорофилльных растений не наблюдалось.

Полученные данные позволяют выделить некоторые критические предпосылки появления высокой частоты альбинизма злаков в условиях in vitro: а) гаплоидный статус клеток различных культуральных систем (культура пыльников, культура зародышей), 2) наличие стадии неорганизованного роста in vitro. В качестве мутагенного фактора может выступать специфический для культуры злаков ауксин 2,4-Д.

Таблица 3

Эффективность гаплопродукции ячменя в каллусной культуре

Гибрид кол-во зароды шей Каллусов Растений в 1-ом пассаже

кол-во % кол-во % альбиносов

кол-во %

Нут. 553/ Зимран 69 50 72,4 51 102,0 14 27,4

Нут. 556/ Прикулит. 42 34 80,9 39 114,7 22 56,4

Нут. 277 / Зимран 5 4 80,0 7 175,0 7 100,0

Мед. 345/ Одесский 12 9 75,0 9 100,0 5 55,5

Нут. 553 / книисх 201 110 54,7 64 58,2 29 45,3

Роль условий выращивания доноров в эффективности гаплопродукции ячменя в Поволжье была установлена и при сравнительном выращивании одних и тех же гибридов в условиях поля и фитотрона. Эффективность гаплопродукции в условиях фитотрона была более стабильной

Расчет коэффициентов вариации по признакам "завязываемость зерновок", "выход зародышей" и "регенерация растений" показал более сильное варьирование этих признаков в полевых условиях. Величина коэффициэнта вариации в условиях теплицы и поля соответственно составляля 2,5 и 12,5% по завязываемости зерновок, 12,1 и 20,3% по выходу зародышей.

Наибольшие различия условия выращивания донорных растений обусловили по признаку "регенерация растений". Значение коэффициентов вариации для этого признака в пересчете на опыленные цветки, зерновки и сформировавшиеся зародыши составили для теплицы

и поля соответственно 13,1 и 84,9%; 11,0 и 77,2% и 22,3 и 77,7%. Дифференциация зародышей, как основной показатель, влияющий на регенерацию растений, наиболее оптимально проходит в контролируемых условиях фитотрона, и коэффищйнт вариации по признаку "выход растений" к опыленным цветкам, завязавшимся зерновкам и зародышам в полевых условиях в 3.5-6.4 раза выше, чем в тепличных.

Таблица 4

Коэффициенты вариации основных показателей гаплопродукции ячменя в различных режимах выращивания доноров, % (1985-2001 гг.)

Условия выращивания доноров Завязы-ваемость зерновок Выход зародышей, от Выход растений, от

цветков зерно вок цветков зерновок зароды шей

Теплица 2,5 12,1 13,1 13,1 11,0 22,3

Поле 12,5 20,3 20,3 84,9 77,2 77,7

При сравнении среднемноголетних данных тепличных и полевых режимов выращивания доноров установлено,что процент эксплантированных зародышей выше из полевых доноров по сравнению с тепличными (32.6 и 19,9% соответственно). Однако контролируемые условия фитотрона были более благоприятными для дифференциации зародышей, что и обеспечило повышенную регенерацию растений в этих условиях (7.1% и 8,7%). По среднемноголетним данным, выход растений от числа эксплантрованных зародышей (как основной показатель степени их дифференциации) составил 24,2 % в полевых условиях выращивания доноров и 43,5% - в тепличных. В отдельные годы этот показатель колебался от 21 до 56%, а максимальное значение составило 73%.

Таким образом, несмотря на то, что на всех этапах технологии в условиях Юго-Востока вдет жесткий отбор, способствующий выживанию наиболее жизнеспособных гамет и эмбрионов, конечный продукт метода -выход удвоенных гаплоидов - был высоким и составил в среднем за изученные годы 7.8 линий на 100 опыленных цветков в условиях фитотрона и 6,4 линии для полевых условий.

5.2. Получение полигаплоидов пшеницы методом селективной элиминации хромосом

Перспективность метода селективной элиминации хромосом была изучена для получения полигаплоидов озимой мягкой пшеницы. Процент завязывания зерновок колебался от 29,1 до 61,7%, однако, доля зерновок,

содержащих зародыши, была очень низкой (от 4,9% до 8,5%, в среднем по опыту 6.9%). Регенерация растений к числу опыленных цветков составила 2.0-6.3% (в среднем 4,9%).

Таблица 5

Эффективность получения удвоенных гаплоидов ячменя в различных режимах выращивания донорных растений (средние за 1987-1994 гг.)

Этапы технологии Поле Фитотрон

кол-во % кол-во %

Опылено цветков 8407 - 4868 -

Завязалось зерновок 4742 56,4 2970 61,0

Эксплантировано зародышей 2748 32,6 973 19,9

Получено регенерантов 600 7,1 424 8,7

Погибло растений 59 9,8 42 9,9

Получено удвоенных гаплоидов 541 6,4 382 7,8

Сравнивая эффективность метода селективной элиминации хромосом применительно к пшенице и ячменю, нельзя не заметить различий в прохождении отдельных этапов получения гаплоидных растений у этих видов. При межвидовой гибридизации ячменя частота сформированных зародышей может достигать более 70%, однако низкая степень их дифференцированности резко снижает конечный выход гаплоидных растений различных генотипов. В то же время высокий процент партенокарпических зерновок в скрещиваниях пшеница х кукуруза снижает эффективность метода уже на самых ранних этапах. Эти различия, очевидно, объясняются степенью генетических различий исходных форм при скрещивании. Межвидовая гибридизация Н. vulgare L. х Н. bulbosum L. может приводить не только к получению гаплоидных, но и гибридных растений. Высокий процент партенокарпических зерновок в скрещиваниях пшеница х кукуруза, как одна из форм проявления постгамной несовместимости, резко ограничивает возможности метода уже на самых ранних этапах. Выход гаплоидных растений озимой мягкой пшеницы составил 2.6-6.3% (в среднем 4,9 %).

Генотипы яровой твердой и мягкой пшеницы саратовской селекции существенно различались по своей способности формировать гаплоидные растения при использовании двух видов-опылителей: кукурузы и африканского проса. При этом существует очень низкая эффективность получения гаплоидов твердой пшеницы как при опылении пыльцой кукурузы, так и африканского проса. Завязываемость зерновок составила 3,1-15,3% при опылении различных генотипов твердой пшеницы пыльцой африканского проса и 3,4-7,8% - пыльцой кукурузы. Наличие

зерновок с зародышами для вида - опылителя кукурузы составило лишь 0,4-2,6% к числу опыленных цветков и 6,7-42,8 % к числу зерновок. Эти показатели для другого опылителя (африканского проса) составили 0,33,1% и 9,1-42,8% соответственно. Регенерация растений к опыленным цветкам не превышала уровня 1,7%.

У яровой мягкой пшеницы завязываемость зерновок колебалась от 1,4 до 18,3% при опылении пыльцой кукурузы и от 4,3 до 16,9% при опылении пыльцой африканского проса. В скрещиваниях с кукурузой выход зародышей составил 2,7-4,8%, в скрещиваниях с просом 1,1-7,1%. Пониженный процент регенерации гаплоидных растений у яровой мягкой пшеницы по сравнению с озимой, очевидно, связан с различиями условий выращивания донорных растений. Период дифференциации зародышей озимой мягкой пшеницы происходит в более благоприятных климатических условиях (конец мая - начало июня), тогда как для яровой пшеницы этот этап развития приходится на середину - конец июня, т.е. время, когда возрастает напряжение метеорологических факторов с более жесткими условиями повышенных температур и низкой влажности воздуха.

Обнаружен высокий коэффициэнт корреляции по выходу зародышей в скрещиваниях пшеница х кукуруза и пшеница х африканское просо (г=+0,74), что указывает на сходство генетических систем, контролирующих формирование зародышей в этих скрещиваниях, сходных с Кг-генами для мягкой пшеницы. С другой стороны, сравнивая поведение мягкой и твердой пшеницы при скрещивании с этими видами, можно предположить, что наличие генома Б является критическим для формирования зародышей в этих скрещиваниях.

ГЛАВА 6. ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ДИПЛОИДИЗИРОВАННЫХ ГАПЛОИДОВ В СЕЛЕКЦИИ

За все годы исследований было получено 14495 тысяч ОН-линий (потомств удвоенных гаплоидов) яровой и озимой мягкой пшеницы, межвидовых гибридов пшеницы и ячменя (табл.6). Полученные линии после предварительного размножения и первичной оценки в лаборатории клеточной селекции проходили дальнейшие испытания на полях экспериментального севооборота НИИСХ Юго-Востока в соответствующих селекционных лабораториях.

При селекционном изучении потомств удвоенных гаплоидов и характеристик сортов, созданных на их основе, основное внимание уделялось адаптивности к местным условиям, зерновой продуктивности в различные по влагообеспеченности годы в сочетании с другими хозяйственно-ценными признаками.

6.1. Методы гаплоидии в селекции ячменя

По различным селекционным программам ячменя было получено 5770 DH-линий, основная их часть - от скрещивания Hordeum vulgare L. х Hordeum bulbosum L. (табл. 6).

Таблица 6

Количество DH-линий, полученных на основе гаплоидии

(1985-2002 гг.)

Культура Получено DH-линий Всего

Культура пыльников Селективная элиминация хромосом

Яровая мягкая пшеница 8201 96 8297

Озимая мягкая пшеница 314 114 428

Яровой ячмень 58 5712 5770

Всего 8573 5922 14495

В 1987 году в конкурсном сортоиспытании стали испытываться первые сорта, элитные линии которых были получены методом гаплоидии, - Медикум 25/87 и Нутанс 26/87 с высокой устойчивостью к пыльной головне. Они показали урожайность 1,89 и 1,98 т/га при урожае стандарта Донецкий 8 - 2,05 т/га, что составило 92,5 и 97,0% (НСР05 = 0,15 т/га) соответственно. Медикум 25/87 показал при искусственном поражении патогеном - 0, Нутанс 26/87 - 6,5% и Донецкий 8 - 32,8%. Сорт Медикум 25/87 отличался скороспелостью (колошение и восковая спелость наступали у него на 7 дней раньше, чем у Донецкого 8). Сорта не были переданы на Государственные испытания из-за пониженной урожайности по сравнению со стандартом.

В 1989 году были получены ИН-линии №2883, №2624 и другие с генами Ш6 и .Ш8, которые также отличались устойчивостью к пыльной головне. При высокой устойчивости к патогену продуктивность этих сортов также составила лишь 98,3-96,8% к стандарту. Однако, необходимо подчеркнуть, что и в традиционном селекционном материале проявлялась та же закономерность - устойчивые к пыльной головне линии были менее продуктивны. В общей сложности по этой программе за период 1986-1990 гг. было получено 3400 гомозиготных линий, которые не дали промышленных сортов, но используются в качестве исходного материала в селекции.

В 1993 году в конкурсное сортоиспытание был переведен сорт пивоваренного направления Нутанс 365, полученный на основе сложного скрещивания с участием пивоваренных сортов Докучаевский и Галина (ГДР). Его урожайность в среднем за три--года (1293г1995 гг.) была на

I - ОС. НАЦИОНАЛЬНА«! {

| БИБЛИОТЕКА |

331 С. Петербург {

' 09 Ш акт Г

уровне пивоваренного стандарта Нутанс 642 и на 0,20 т/га выше, чем у Донецкого 8 (табл.7).

В сравнении с пивоваренным сортом Нутанс 642 новый сорт отличался пониженным содержанием белка в зерне (13,2% против 13,8% у Нутанс 642) - факт, имеющий значение для характеристики пивоваренных качеств. Однако, сорт оказался сильно восприимчивым к пыльной головне и был забракован. В настоящее время он используется в качестве исходного материала в дальнейших скрещиваниях. В различных селекционных питомниках изучается ряд перспективных линий от скрещивания Нутанс 365 с сортами Нутанс 553, Нутанс 62, ДН-линией 108/5 и некоторыми другими сортами.

Таблица 7

Урожай зерна сортов ячменя в конкурсном сортоиспытании на Краснокутской СОС, т/га

Сорт Годы

1993 1994 1995 Средний

Донецкий 8 4,76 2,90 1,33 2,99

Нутанс 642, ст. 5,04 3,00 1,58 3,20

Нутанс 365 DH 5,38 2,91 1,29 3,19

HCPos 0,29 0,18 0,10 0,12

В 1995 году в конкурсное сортоиспытание поступили две DH-линии Н108/5 и Н108/6, полученные на основе культуры пыльников из сорта Нутанс 108. Следует отметить, что обе линии не выявили превосходства не только по сравнению со стандартом, но и исходным сортом Нутанс 108. При этом линия 108/6 была забракована после 2-х летнего изучения в конкурсном сортоиспытании, а линия 108/5 уступила по продуктивности стандартному сорту Нутанс 642 в 1997 году. С другой стороны, тот факт, что линии 108/5 и 108/6 не уступают по продуктивности исходному сорту - Нутанс 108, свидетельствует, что разработанные технологии получения гаплоидных растений в культуре пыльников не вызывают негативных наследственных изменений, а их генетические характеристики можно рассматривать как стабильные.

Сорт ярового ячменя Нутанс 240. Родоначальная DH-линия этого сорта № 421/17 получена в 1992 г. от скрещивания [Нутанс 642/Донецкий4/Донецкий 8/Целинный 5/Медикум 119)] х Hordeum bulbosum. Летом этого же года она начала изучаться в СП-1 на Краснокугскрй СОС. Уже в 1997 году линия поступила в питомник конкурсного сортоиспытания.

Сорт Нутанс 240 изучался по продуктивности в контрастные по увлажнению годы Средняя зерновая продуктивность сорта в ОКИ за 5 изученных лет (1997-2002 гг.) составила 2,58 т/га при продуктивности лучшего стандарта 2.51 т/га (табл. 8). В острозасушливом 1998 году он значительно превысил по продуктивности стандарт Нутанс 642 (0.51 т/га по сравнению с 0.29 т/га).

Таблица 8

Урожай 5ерна сортов ярового ячменя, т/га

Сорт Год

1997 1998 1999 2000 2001 2002 Сред нее

Н642 4,26 0.29 2.00 3.04 2.26 3.21 2.51

Н240 4.41 0.51 2.31 3.08 2,02 3.15 2,58

НСРу, 0.25 0.06 0.15 0.23 0.15 0.20 0,16

Сорт Нутанс 240 имеет высокую продуктивность не только по сравнению со стандартом, но и лучшими перспективными номерами пивоваренного направления. Сорт отличается высокой массой 1000 зерен, крупностью зерна и экстрактивностью, а также более низким содержанием белка - показателю, определяющем)' качество зерна пивоваренных сортов. Сорт устойчив к полеганию, более устойчив по сравнению со стандартом к пыльной головне. Нутанс 240 -перспективный сорт, подготовленный для передачи на государственное сортоиспытание.

Электрофоретическое ¡«учение гордеинов сорта Нутанс 240 показало стабильность его характеристик в течение 5 лет изучения в конкурсном сортоиспытании.

Широкое использование ВИ-линин в качестве доноров различных хозяйственно-ценных признаков в рекомбинационной селекции привело к созданию новых сортов ярового ячменя Нутанс 287. Нутанс 288. Нтанс 279, которые изучаются на заключительных этапах селекционного процесса.

6.2. Гаплопдпя в селекции пшеницы

По различным селекционным программам было получено около 9 тысяч линий яровой и озимой мягкой пшеницы, главным образом, методом культуры пыльников. Практический интерес представлял анализ ЭН-линий по таким хозяйственно-ценным признакам, как скороспелость и высота растений в сочетании с продуктивностью. Исследования показали, что по продолжительности периода всходы - колошение среди линий гаплоидного происхождения наблюдается достаточно большое разнообрашс - отмечены формы от \льтраскороспелы.\ (выколашивались

более чем на 3 суток раньше скороспелого сорта Саратовская 42) до позднеспелых (выколашивались на 3 суток позднее среднеспелого сорта Саратовская 46).

Было получено 360 ИН-линий от межвидовых скрещиваний мягкой пшеницы с Т. решсшп Уа\;.. Т. 1иттор]аееуи 21шк.,Т. (1ишт Без!, Т. аеШюрюит Jakubz.it Т. сИсоссит БсЬиеЫ. Основная часть этих линий была получена из гибридов Р:. 51 линия - из гибридов 15 - из Б] и лишь одна линия из Е). Полученные в культуре пыльников линии имели повышенную продуктивность в сравнении со стандартом, были устойчивы к мучнистой росе и пыльной головне, а некоторые и частично устойчивы к бурой ржавчине.

Наибольшее количество линий получено от скрещивания мягкой пшеницы с Т. регасит (к-30385). У лучших линий наблюдалась высокая озерненность колоска (2.5 зерновки по сравнению с 2.3 для Саратовской 42 и 1.75 для Саратовской 46). Все линии от этого скрещивания были устойчивы к пыльной головне, в то время как стандарты поражались головней от 2 до 17 шт./делянку. По высоте изучаемые линии были выше Саратовской 42 в среднем на 3.7 см и выше Саратовской 46 на 2,7 см.

Однако, все линии от этого скрещивания имели очень мелкое зерно, что и послужило причиной выбраковки большинства из них. Лучшие линии вовлекаются в скрещивания для дальнейшей селекционной работы. Примером тому может служить семья 139 от скрещивания Саратовская 58/ОНР4 (Альбидум 28/Т.регасит). полученная в лаборатории селекции и семеноводства яровой пшеницы. Эта семья устойчива к пыльной головне, слабее, чем стандарты поражается мучнистой росой. По содержанию клейковины линия превосходит стандарты, она имеет высокие показатели объема и пористости хлеба.

Таким образом, полученные методами гаплоидии линии являются донорами хозяйственно-полезных признаков и широко привлекаются в рекомбинационную селекцию пшеницы. Кроме того, они могут непосредственно использоваться в качестве элитных линий при создании новых сортов, примером чему является сорт яровой мягкой пшеницы Саратовская 64.

Сорт яровой мягкой пшеницы Саратовская 64

В полевом сезоне 1987 года на питательной среде РОТАТО-2 культивировали 1462 пыльника, изолированные из 100 донорных растений Р2 гибрида Эритроспермум 1976/Саратовская 60. Из полученных 51 эмбриоида регенерировано 39 зеленых гаплоидных растений. Выход эмбриогенных пыльников составил 3,49 %, частота регенерации от полученных эмбриоидов - 76,5%. Диплоидизированные гаплоиды, полученные в результате обработки регенерантов колхицином, дали серию гомозиготных линий, которые после предварительного размножения и изучения в лаборатории клеточной селекции были

1986 г., поле

1986 г , теплица, лаб. яр пш.. авгус!, Р|

Р 1 хР2

№ скрещивания 29832

№ 31

1987 г., Рг. лаб.клет.селекции, культура пыльников

1987-1988 п., Рг, 1?3 лаб селекции яр пшеницы Гибрид забракован

1990 г, лаб селекции яровой пшеницы, Нз СП-2

1991 г. лаб селекции яровой пшеницы. И», КИ

1992 г., лаб. селекции яровой пшеницы, Н5, ПКИ

1993 г., лаб. селекции яровой пшеницы, Но. ПКИ

М1

жа

линия №2024 №321

№ 1578

№ 646

№ 112

№94

№ 13, № 12, №8

Рис 6. Схема выведения сорта яровой мягкой пшеницы Саратовская 64

переданы в селекционную лабораторию в СП 2-го года. Одна из этих линий - С-2045 - стала элитной линией сорта Саратовская 64 (рис.б).

Вторая часть этой гибридной популяции изучалась в лаборатории селекции и семеноводства яровой пшеницы в НИИСХ Юго-Востока. После 2-х летнего пересева (1987-1988 гг..) гибрид был забракован без проведения отборов. Создание сорта Саратовская 64 со всей очевидностью подчеркивает преимущества использования гаплоидной селекции. В популяции удвоенных гаплоидов отбор проводился не по индивидуальным растениям (как это имеет место в традиционной селекции), а по группе растений, составляющих ту или иную линию.

Гомо шготность линий по всем признакам повысила точность отборов и позволила выявить реальную селекционную ценность и перспективность гибридной популяции.

Сорт Саратовская 64 относится к разновидности erythrospermum. Установлена глиадиновая формула сорта - Aid. В1в, Did, A2n, В2о, D2r, сохраняющася в течение 8 лет изучения его в основном конкурсном сортоиспытании.

За все годы изучения в основном конкурсном сортоиспытании Саратовская 64 превышала по продуктивности лучший стандарт -Саратовскую 58 При изучении в различных питомниках, начиная с 1990 г., увеличение урожая зерна составило 118,9 -156,4% к Саратовской 42 и 106,5-120.9% к Саратовской 58. Наиболее высокий урожай сорт дал в ОКИ в 1990 г. - 4,0 т/га, прибавка к Саратовской 42 составила 135.5%. В остро засушливый 1995 г. сорт Саратовская 64 превысил по продуктивности лучший стандарт, Саратовскую 58, на 0,22 т/га. Исключение составил острозасушливый 1998 г.. в котором урожай зерна у Саратовской 64 был на 0,16 т/га меньше, чем у Саратовской 58.

Таким образом, обладая высокой засухоустойчивостью, сорт Саратовская 64 имеет и повышенную отзывчивость на улучшений условий агрофона. Урожай зерна сорта за 8 лет изучения в конкурсном сортоиспытании в ергшнении с лучшими сортами саратовской селекции показан в таблице 9

Повышенная продуктивность Саратовской 64 обеспечивается за счет большей продуктивной кустистости и густоте стеблестоя перед уборкой, а также за счет большей массы 1000 зерен

Высокая продуктивность сорта подтверждена и результатами экологических испытаний. По данным экологического испытания в 19951997 годах в экспериментальном хозяйстве НИИСХ Юго-Востока новый сорт превысил Саратовскую 58 в среднем на 0,36 т/га, на Ершовской ОСОЗ - на 0.21 т/га и на Краснокутской СОС - на 0,17т/га.

По коэффициентам пластичности и стабильности Саратовская 64 не только не уступает линейномл сорту Лютесценс 62. но и новым сортам Л503 и Саратовская 58 (табл.10).

Таблица 9

Урожай зерна сортов яровой мягкой пшеницы саратовской селекции, т/га

Сорт Годы

1995 1996 1997 1998 1999 2000 2001 2002 Среднее Сред нее в

в засуш ли-вые гг. благо прият ные

гг.

Л62 0,74 1,74 1,77 0,66 1,09 1,63 1,72 1,71 0,83 1,71

С29 0,85 2,31 2,23 1,00 1,35 1,80 1,92 2,20 1;07 2,09

С60 0,87 2,72 2,58 0,88 1,44 2,09 2,02 2,07 1,06 2,09

Л503 1,13 2,56 2,61 1,01 1,45 1,86 1,99 - 1,19 2,29

С58 1.05 2,35 2,39 1,24 1,63 1,85 1,95 2,18 1,31 2,14

С62 0,80 2,65 2,40 1,06 1,42 2,16 2,02 2,13 1,09 2,27

С64 1,27 2,52 2,44 1,08 1,65 2,16 2,02 2Д5 1,33 2,26

С68 1,13 2.77 2,72 1,37 1,64 2,64 2,17 2,40 1,38 2.54

С70 1,48 3.08 2,39 1,21 1,39 2,63 2,41 2,27 1,33 2,56

НСР 0,15 0.17 0,18 0,19 0,16 0,14 0,15 0,14 0,17 0,17

Таблица 10

Коэффициенты пластичности и стабильности урожая зерна сортов яровой мягкой пшеницы саратовской селекции

Сорт Пластичность Ошибка Стабильность Б 1

С64 0,998 0.087 1,255 131,094 0,026

Л62 0,859 0,076 0,956 127,537 1.853

Л503 1.197 0,097 1.539 153.752 2,040

С58 0.946 0.084 ' 1,171 126,345 0,637

Саратовская 64 в условиях Саратова созревает за 78-96 дней, что на 1-3 дня раньше Саратовской 58 и на 1-2 дня позже Саратовской 60. Сорт высокорослый - средняя высота растений 84 см, у Саратовской 58 -83 см.

Новый сорт слабее поражается вирусами злаков. Устойчивость к другим болезням, полеганию и скрыгостебелъным вредителям на уровне ранее районированных сортов яровой мягкой пшеницы (табл.11).

Таблица 11

Реакция сорта Саратовская 64 на возбудителей основных болезней и вредителей (данные лаб. селекции яровой мягкой пшеницы НИИСХ

Юго-Востока)

Сорт Степень поражения на фоне Полегание балл

искусственный естественный

бурой ржавчи ной. тип пыльной головней, % мучнистой росой, % скрыгосге-бельными вредителями, %

С64 4 11,6 0-50 4,7 4,6

С42 4 71,5 0-80 4.3 4,3

С46 3-4 44,2 0-70 7,3 4,8

С58 4 15,6 0-70 7,7 4,6

С60 4 26,3 0-60 8,3 5,0

По данным лабораторий технологической оценки зерна и массовых анализов почв и растений НИИСХ Юго-Востока, содержание белка и сырой клейковины у Саратовской 64 находится на уровне Саратовской 58 и уступает Саратовской 60. По качеству клейковины и хлеба, силе муки этот сорт равноценен Саратовской 60.

Саратовская 64 превосходит Саратовскую 58 по хлебопекарным свойствам и уступает ей по силе муки и качеству клейковины. В целом можно сказать, что технолого-хлебопекарные свойства Саратовской 64 находятся на уровне сорта сильной яровой пшеницы Саратовская 60 (табл.12).

Высокие технологические качества Саратовской 64 подтверждаются и результатами анализа качества зерна урожая 1996 в ВЦСКС (г.Москва): содержание белка - 15,8%, сырой клейковины -32,3%, сила муки - 381 е.а., объем хлеба - 1180 мл, общая хлебопекарная оценка - 4,6 балла.

Таким образом, многолетние полевые испытания сорта Саратовская 64 в экстремальных погодно-климатических условиях показали, что гомозиготность и гомогенность сорта не снизили его адаптивных свойств, которые обеспечиваются за счет способности к адаптации, заложенной в самом геноме. Биохимические исследования

запасных белков сорта подтвердили его стабильность и гомогенность при длительном самоопылении.

Таблица 12

Качество зерна сортов яровой мягкой пшеницы

Сорт Белок % Сырая клейковина Хлеб Сила муки, е.а. Вало-риметр е. п.

% Ед. идк Объем Общая оценка, балл

С64 (БН) 12,9 30,1 80 740 4,7 166 51

С58 12,8 29,9 70 702 4,6 212 55

С60 13,7 32,6 79 753 4,7 171 61

Резюмируя первый опыт использования гаплоидов в селекции пшеницы и ячменя на Юго-Востоке, можно отметить следующее. Получение гаплоидов из гибридов ранних поколений позволяет не только сократить сроки получения гомозигот, но и выявить реальную селекционную ценность скрещивания, его сортообразующие потенции. Выведение сорта яровой мягкой пшеницы Саратовская 64, элитная линия которого была получена методом культуры пыльников, наглядно демонстрирует эти преимущества гаплоидной селекции. Сорта пшеницы и ячменя, созданные на основе методов гаплоидии, характеризуются генетической стабильностью и однородностью. Это подтверждается как многолетним морфологическим анализом, так и анализом электрофоретических свойств запасных белков. Гомогенные сорта гаплоидного происхождения, характеризуются высокой засухоурожайностью в сочетании с другими хозяйственно-ценными признаками. Они конкурируют с традиционными селекционными сортами по адаптивности к засушливым условиям Юго-Востока.

ВЫВОДЫ

1. Усовершенствована гаплоидная биотехнология пшеницы и ячменя в культуре пыльников, включающая:

- посев донорных растений в поле (3-4 срока) с интервалом в две недели и 2-й срок в теплице (январь-февраль);

- культивирование пыльников как свежеубранных, так и кратковременно хранившихся на холоде колосьев донорных растений; спорофитное развитие микроспор происходит и без воздействия холодом;

- использование, наряду с агаровыми, жидких питательных сред, содержащих Фиколл-400 в комбинации с высокими концентрациями 2,4-Д (5-8 мг/л), что увеличивает общее количество новообразований. способствует формированию хорошо дифференцированных эмбриоидов - копий зиготических зародышей с высоким регенерационным потенциалом; жидкие питательные среды обеспечивают возможность культивирования целых цветков и колосков, что позволяет избегать трудоемкой процедуры вычленения пыльников;

- применение вещества "1386" в концентрации 1 и 10 мг/л в составе индукционных питательных сред, что повышает регенерационную способность каллусов пшеницы;

- комплекс приемов для укоренения растений, обеспечивающий успех их диплоидизации и выживаемость после колхицинирования -состав индукционных и регенерационных питательных сред, пониженные положительные температуры культивирования эмбриоидов (+12...+15° С), выдерживание регенерантов в воде в течение 10-12 суток; колхицинирование регенерантов для удвоения набора хромосом непосредственно после их выведения из условий in vitro;

- яровизацию гаплоидных растений с озимьм типом развития в условиях in vitro (для этой цели пригоден бытовой холодильник); этот доступный прием экономит место в помещении с контролируемыми условиями выращивания растений и обеспечивает возможность яровизации регенерантов, полученных в летнее время.

2. Гибриды Fi характеризуются повышенной частотой индукции андрогенетических структур до сравнению с родительскими линиями, что дает возможность получать гаплоидные растения в комбинациях с участием в скрещиваниях низкоотзывчивых родителей (тетраплоидных видов пшеницы). В бэккроссных поколениях значение признака "частота индукции андрогенеза" приближается к таковому у реккурентного родителя.

3. Установлено различное по степени и направлению влияние Rht-генов на этапы культивирования in vitro мягкой и твердой пшеницы. Линии, содержащие ген Rht-Blc, обладают высоким морфогенетическим потенциалом in vitro на гаплоидном и диплоидном уровнях, они характеризуются длительной морфогенетической активностью каллусов из незрелых зародышей при пассировании, а также повышенной частотой индукции андрогенетических структур и регенерации растений в культуре пыльников по сравнению с контрольной изолинией.

4. Пролиферативный антиген инициалей (ПАИ) может использоваться в качестве дополнительного маркера морфогенетической активности каллусов мягкой пшеницы, позволяющего выявлять генотипы, обладающие повышенной регенерационной способностью в культуре in vitro.

5. Потомство от скрещиваний Hordeum vulgare х Hordeum bulbosum в условиях Поволжья характеризуется отсутствием гибридов, что указывает на роль температурного фактора в элиминации хромосом опылителя Эффективность метода в среднем за все годы исследований составила 8,7 и 7,1 растений на 100 опыленных цветков в условиях теплицы и поля соответственно. Регенерация растений из каллусных культур незрелых зародышей обеспечивает дополнительную возможность увеличения гаплопродукции.

6. Установлено, что высокая частота альбинизма характерна для различных культуральных систем (культуры пыльников и каллусных культур гаплоидных зародышей). Отсутствие альбиносов при прямой регенерации и появление их в значительном количестве среди регенерантов. полученных из каллусов незрелых зародышей, свидетельствует о том, что определяющей предпосылкой этого феномена является наличие стадии неорганизованного роста in vitro в сочетании с гаплоидным статусом хромосом, а не генезис каллусных культур (микроспора или зародыш).

Частота проявления альбинизма зависит как от генотипа растения-донора, так и условий культивирования полученных новообразований. Постоянное культивирование при 12-15°С приводит к повышению частоты регенерации зеленых растений по сравнению с обычными режимами культивирования (25-27°С).

7. Основным лимитирующим фактором получения гаплоидов мягкой пшеницы в скрещиваниях с кукурузой и африканским просо является высокая частота формирования партенокарпических зерновок (до 90%). Установлена низкая эффективность получения гаплоидов твердой пшеницы в скрещиваниях с Zea mays L. и Pennisetum americanum L.

8. С применением гаплоидных биотехнологий в культуре пыльников и незрелых зародышей получено 14495 DH-линий различных видов злаков, в том числе, яровой мягкой пшеницы - 8297, озимой мягкой пшеницы - 428 и ярового ячменя - 5770. которые широко используются в рекомбинационной селекции этих культур.

9. С использованием гаплоидии созданы засухоустойчивый сорт яровой мягкой пшеницы Саратовская 64, допущенный к использованию с 2000 года в 8 регионе РФ (A.c. №30538 от 01.06.1999 г.) и защищенный патентом Российской Федерации (№0344 от 05.11.1996 г.) и ячменя

Нутанс 240, подготовленного для передачи на ГСИ. С привлечением DH-линий в новые скрещивания получены перспективные линии ячменя Нутанс 279, Нутанс 288, Нутанс 289 и яровой мягкой пшеницы С-2127.

10. Сорта пшеницы и ячменя гаплоидного происхождения сохраняют стабильность и однородность при длительном самоопылении. Это подтверждается анализом их морфологических признаков и спектром запасных белков. Экспериментально доказано, что сорта, созданные с использованием гаплоидии, характеризуются высокой засухоурожайностью - основным показателем их адаптивности в Поволжском регионе РФ.

РЕКОМЕНДАЦИИ ПО ИСПОЛЬЗОВАНИЮ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЙ

1. Дня ускорения селекционного процесса и повышения эффективности отборов использовать усовершенствованные биотехнологии получения гаплоидов пшеницы и ячменя в культуре зародышей и пыльников.

2. В биотехнологических исследованиях использовать линии пшеницы, содержащие ген Rht-Blc, способствующий увеличению выхода новообразований в культуре пыльников и длительно поддерживающий морфогенетическую активность каллусов при пассировании.

3. В качестве дополнительного маркера морфогенетической активности каллусов мягкой пшеницы использовать ПАИ (пролиферативный антиген инициалей).

4. Использовать в рекомбинационной селекции пшеницы и ячменя DH-линии, созданные в культуре пыльников и зародышей (всего около 15 тысяч) в качестве исходного материала по комплексу хозяйственно-ценных признаков.

5. Внедрять в зонах допуска к использованию высокопродуктивный, засухоустойчивый сорт яровой мягкой пшеницы Саратовская 64.

Список основных работ, опубликованных по теме диссертации

1. Дьячук П.А., Дьячук Т.И., Кудашкина C.B., Сафронова Н.Ф., Давыдов С.Д. Получение гаплоидных растений яровой мягкой пшеницы в культуре пыльников // Докл. ВАСХНИЛ. - 1986. - № 10. - С. 3-4.

2. Дьячук П.А., Дьячук Т.И., Прокофьева И.Г., Тучин C.B. Возможности и перспективы использования гаплоидов в селекции пшеницы и ячменя // Селекция и семеноводство зерновых культур. - Саратов: НИИСХ Юго-Восгока. - 1986. - С. 46-50.

3. Шамров И.И., Дьячук Т.И., Батыгина Т.Б., Дьячук ПЛ. Эмбриоидогенный тип бесполого размножения и классификация аномалий в культуре пыльников на примере пшеницы // Биология культивируемых клеток и биотехнология. - Новосибирск. - 1988. - С. 210-211.

4. Дьячук Т.И., Дьячук ПЛ., Духарев H.A. Культура пыльников как возможный метод селекции // Всес. конф. по биотехнологии злаковых культур. - Алма-Ата. -1988. - С. 92.

5. Дьячук Т.И., Дьячук ПЛ. Методические рекомендации по получению гаплоидных растений в культуре пыльников яровой мягкой пшеницы. М.,: ВАСХНИЛ. - 1989. -36с.

6. Дьячук Т.И., Дьячук П.А. Культура пыльников злаков: современное состояние, проблемы, перспективы // С.х. биология. -1989. - № 5. -С. 3-10.

7. Кузьменко А.И., Дьячук Т.И., Галкин А.Н. Об итогах изучения андрогенных линий пшеницы // Селекция и семеноводство. - 1990. -№ 4. - С. 10-12.

8. Столярова C.B., Дьячук Т.И. Метод культуры пыльников в межвидовой гибридизации пшеницы // Научная конф. по с.х. биотехнологии. -Целиноград. - 1991. - Стр. 54-55.

9. Дьячук Т.Н., Столярова C.B., Носова H.H. Культура пыльников межвидовых гибридов пшеницы и тритикале // Биолог, основы селекции. - Саратов: НИИСХ Юго-Востока. - 1991 - С.35-41.

10. Djatchouk T.I.The techniques of bread spring wheat anther culture // Trends in plant biotechnology. - Russia: M., - 1993. - P. 89.

11. Дьячук Т.И. Культура пыльников и фомообразовательный процесс у яровой мягкой пшеницы // Генетика. - 1994. - Т. 30. - С.45.

12. Дьячук ПЛ., Тучин C.B., Дьячук Т.И., Духарев H.A., Васькин Д.В. Биотехнологические исследования в НИИСХ Юго-Востока // Селекция с.х. культур. Саратов: НИИСХ Юго-Востока. - 1994. - С.256-266.

О.Столярова C.B., Дьячук Т.И. Биотехнологические способы преодоления трудной скрещиваемости T. aestivum L. и T. timopheevii Zhuk. // Итоги и перспективы селекции, семеноводства и ландшафтно-экологического земледелия. - РАСХН: - Саратов: НИИСХ Юго-Востока. - 1995. - С. 32-33.

14. Дьячук Т.И., Тучин C.B., Столярова C.B., Итальянская Ю.В., Сафронова Н.Ф. Использование методов биотехнологии в селекции пшеницы и ячменя // Селекция, семеноводство и технология возделывания зерновых культур. - РАСХН- Саратов: НИИСХ Юго-Востока. -1996. - С. 41-48.

15. Дьячук Т.И., Дьячук ПЛ., Тучин C.B. Биотехнологические проблемы в создании исходного материала для селекции пшеницы // Проблемы

селекции яровой пшеницы. - Саратов: НИИСХ Юго-Востока. - 1996. -С. 13-14.

16. Козлова А.Ю., Дьячук Т.И. Реальные и потенциальные возможности андроклинии на примере твердой пшеницы // Тез. докл. научно-практической конференции по актуальным проблемам интенсификации сельского хозяйства. - Шортанды. - 1993. - С.10-11.

17. Djatchouk T.I. Agronomic performances of doubled haploids // Annual Wheat Newsletter / Kansas State University (USA). -1995. - V. 41 .P. 182.

18.Kusmenko A.I., Djatchouk T.I. Agronomic performances of a wheat crosses using anther culture method // Annual Wheat Newsletter / Kansas State University (USA). - 1995. - V.41. - P. 165.

19. Дьячук Т.И.. Сафронова Н.Ф. Об использовании метода культуры пыльников для получения гаплоидов ячменя //С.х. биология. - 1996. -№ 5. - С. 72-76.

20. Djatchouk T.I., Stoliarova S.V. Response of different wheat species in anther culture // Annual Wheat Newsletter / Kansas State Univertsity (USA). - 1996. - V. 42. - P. 175-176.

21. Djatchouk T.I., Kusmenko A.I. Haploid breeding for dry regions of Russia // 5th Int. Wheat Conference. Iune 10-14. Turkey. Ankara. -1996. - P. 354.

22.Kusmenko A.I., Djatchouk T.I. Saratovskaya 64, a new spring wheat variety, created by combining conventional and haploid breeding // Ann. Wheat Newsletter / Kansas State University (USA). - 1997. - V. 43. - P. 199-200.

23. .Дьячук Т.И., Сафронова Н.Ф., Ермолаева O.B. Технология получения гаплоидов ячменя в культуре пыльников // Вопросы генетики, селекции и семеноводства зерновых культур в Поволжье. -Саратов: НИИСХ Юго-Востока. - 1997. - С. 72-75.

24. Дьячук Т.И., Сафронова Н.Ф., Ермолаева О.В. Оптимизация состава индукционной питательной среды для культивирования пыльников ячменя и пшеницы // Развитие научного наследия академика Н.И. Вавилова. - Саратов: СГСХА. -1997. - С.70-71.

25. Кузьменко А.И., Дьячук Т.И., Галкин А.Н., Гурьянова К.Ф., Зотова Т.Ф., Данилова В.А. Перспективы использования метода культуры пыльников в селекции пшеницы на устойчивость к вирусам // Защита растений от болезней и вредителей. Сб., посвященный 110-летшо со дня рождения Н.И. Вавилова. - Саратов. - 1997. - С. 59-63.

26. Djatchouk T.I., Tkachenko O.V., Lobachev Yu.V. The influence of Rht-genes on wheat anther culture //Annual Wheat Newsletter / Kansas State University (USA). - 1998. - V. 44. - P. 169.

27. Djatchouk Т.I., Stoliarova S.V., Nosova N.N., Nosova O.N., Saftonova N.F. Tissue culture methods for wheat breeding in ARISER //Annual Wheat Newsletter / Kansas State University (USA). - 1998. - V. 44. - P. 168-169.

28. Ткаченко O.B.. Фокина О.А., Дьячук Т.И., Лобачев Ю.В. Особенности андрогенеза у линий яровой мягкой пшеницы различающихся аллелями Rht-локусов // Проблемы и перспективы развития АПК в условиях рыночных отношений. - Мичуринск. - 1998. - С. 111.

29. Ткаченко О.В., Дьячук Т.Н., Лобачев Ю.В. Андрогенез in vitro у короткостебельных линий мягкой и твердой пшеницы, различающихся по Rht-генам // Актуальные проблемы селекции и семеноводства зерновых культур Юго-Восточного региона Российской Федерации. Сб., посвященный 90-летаю основания Краснокутской СОС. - Саратов: НИИСХ Юго-Востока. - 1999. - С. 147-148.

30. Сафронова Н.Ф., Медведева Л.П., Ильин А.В., Дьячук Т.И. Гаплоидия в селекции ячменя в НИИСХ Юго-Востока // Там же. - С. 139-140.

31. Дьячук Т.И., Кузьменко А.И. Культура пыльников в селекции яровой мягкой пшеницы // Там же. - С. 39.

32. Djatchouk T.I., Tkachenko O.V., Lobachev Yu.V. The effect of Rht-alleles on the wheat anther culture // Annual Wheat Newsletter / Kansas State University (USA). - 1999. - V. 45. - P. 123.

33. Tkachenko O.V., Djatchouk T.I., Lobachev Yu.V. Genes Rht influence on an androgenesis in vitro of spring bread wheat and durum wheat lines // The special issue of Huazhong Agricultural University, P.R. China and Saratov State Agrain University, Russia. - 2000. -V.19. - №3 -P.219-222.

34. Djatchouk T.I., Tkachenko O.V., Lobachev Yu.V. In vitro influence of Rht-genes on anther culture and somatic embiyogenesis of bread wheat and durum wheat // Annual Wheat Newsletter / Kansas State University (USA). - 2000. - V. 46.-P. 115.

35. Дьячук Т.И., Столярова C.B.. Медведева Л.П., Тучин С.В. Гаплоидия в селекции пшеницы и ячменя в НИИСХ Юго-Востока // 1-й Сьезд Вавиловского общества генетиков и селекционеров (1-5 февраля 2000 г.). Тез. докл. Т.1. - Санкт-Петербург. - 2000. - С. 145.

36. Тучин С.В., Дьячук Т.И., Столярова С.В., Итальянская Ю.В. Биотехнологические методы в селекции зерновых культур // Проблемы и пути преодоления засухи в Поволжье - Саратов: НИИСХ Юго-Востока. - 2000. - С. 306-324.

37. Дьячук Т.И., Столярова С.В., Сафронова Н.Ф., Медведева Л.П. Методы in vitro в селекции пшеницы и ячменя для засушливых условий // Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеренарии. - М.. 2000 - С. 116-117.

38. Дьячук Т.И., Тучин С.В., Столярова С.В. Медведева Л.П., Сафронова Н.Ф. Технологические и селекционные аспекты использования гаплоидов в НИИСХ Юго-Востока // Проблемы селекции полевых культур на адаптивность и качество в засушливых условиях. Сб. научных трудов, посвященный 115-летию со дня рождения А.П. Шехурдина. -Саратов: НИИСХ Юго-Востока. - 2001 - С.93-97.

39.Djatchouk T.I., Tkachenko O.V., Lobachev Yu.V. Rht genes influence androgenesis and somatic embryogenesis in vitro in spring bread wheat // Annual Wheat Newsletter / Kansas State University (USA). -2001. -V.47.-P.148.

40. Дьячук Т.И., Тучин C.B., Столярова C.B., Итальянская Ю.В., Медведева Л.П., Сафронова Н.Ф., Киреева В.В. Технологические и селекционные аспекты гаплоидии в НИИСХ Юго-Востока // Селекция и семеноводство полевых культур. - Пенза. -2002,- С. 12-14.

41. Дьячук Т.И., Тучин С.В., Столярова С.В., Сафронова Н.Ф. Спорофитное развитие микроспор - роль холодового воздействия // Материалы научной генетической конференции, посвящ. 100-летию со дня рождения А.Р. Жебрака и 70-летию образ, кафедры генетики в Московской сельскохозяйственной академии им. К.А. Тимирязева. -М.,: МСХА. - 2002. - С. 103-105.

42.Ткаченко О.В., Дьячук Т.И., Лобачев Ю.В. Особенности культуры клеток и тканей короткостебельной яровой пшеницы // Селекция, семеноводство и технологии возделывания сельскохозяйственных культур сухо-степного Заволжья (Всероссийская научная конференция). - Пенза. - 2002. - С. 80-82.

43.Evseeva N.V., Tkachenko O.V., Lobachev Yu.V., Mitrophanov A.Yu., Djatchouk T.I., Shcogolev S.Yu. Studies on the embryogenic processes in the in vitro culture of wheat somatic tissues by using a proliferative antigen of initials cells U Wheat Information Service. - 2002. - № 94. -P. 1-4.

44. Лобачев Ю.В., Вертикова E.A., Заварзин А.И., Ткаченко О.В., Дьячук Т.И. Влияние Rht-генов на комплекс признаков яровой мягкой пшеницы // Материалы научной генетической конференции, 26-27 февраля 2002 г. - М.: Изд-во МСХА. - 2002. - С.210-212.

45.Lobachev Yu.V., Tkachenko O.V., Djatchouk T.I. New chemicals for morhogenic optimization of bread wheat in vitro II Annual Wheat Newsletter / Kansas State University (USA). - 2002. - V.48. - P. 124

46.A.C. № 4938 на сорт яровой пшеницы Саратовская 57 (СССР). Панфнлкина Т.И.,* Ильина Л.Г., Галкин А.Н., Агибалова Л.Г., Украинец И.Д., Гурьянова К.Ф., Перепечина В.Д, Васильчук Н.С., Кузьменко А.И. - Зарегиспр. в Гос. реестре селекционных достижений 3.07.1989 г.

47. .A.c. № 30538 на сорт яровой мягкой пшеницы Саратовская 64 (РФ). Дьячук Т.И.. Галкин А.Н., Кузьменко А.И., Ильина Л.Г., Данилова В.А., Зотова Т.К., Давыдов С.Д., Столярова C.B., Тучин C.B. -Зарегистр. в Гос. реестре охран.селекц. достижений 01.06. 1999 г.

48.Пат.№ 0344 (РФ) Пшеница мягкая яровая Triticum aestivum L. Саратовская 64. Дьячук Т.И., Кузьменко А.И., Ильина Л.Г, Данилова В.А., Зотова Т.К., Давыдов С.Д., Столярова C.B., Тучин C.B. -Зарегистр. в Госреестре охран, селекц. достижений 05.11.1996 г.

49. Пат. № 2186768 (РФ)на изобретение. Теграгидрат (+) гидротартрата (+) цис- [2S, 5R -1,5-диметил-2-(1-окси-3-пропил)] - пирролидиния, проявляющий морфогенетическую и росторегулирующую активность (РФ). Норицина М.В., Клочкова И.Н., Суслова Т.А., Бардачева В.М.. Лобачев Ю.В., Ткаченко О.В., Дьячук Т.И., Семенова H.H., Титов В.Н. - Зарегистр. в Госреестре изобретений 10.08.2002 г.

и др.

* - Дьячук Т.И.

Подписано в печать 8.оф 2003 г. Формат 60x84 1/16. Бумага офсетная. Усл.печ.л.2,0. Тираж 100. Заказ №¿3 9

Типография ЗАО ПЦ "ИППОЛиТ-99" 401600, г. Саратов, ул. Советская, 45, тел.: 59-06-69

t

7114

.7114

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Дьячук, Таисия Ивановна

Список сокращений, условных обозначений и символов

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

ГЛАВА 1. АНАЛИТИЧЕСКИЙ ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. ПОЛУЧЕНИЕ ГАПЛОИДОВ В КУЛЬТУРЕ ПЫЛЬНИКОВ

1.1.1.Биология развития микроспор в культуре пыльников.

1.1.3. Факторы, влияющие на гаплопродукцию.

1.1.3. Генетический контроль гаплопродукции в культуре пыльников.

1.2. ПОЛУЧЕНИЕ ГАПЛОИДОВ МЕТОДОМ СЕЛЕКТИВНОЙ ЭЛИМИНАЦИИ ХРОМОСОМ

1.2.1. Получение гаплоидов обыкновенного ячменя в скрещиваниях Hordeum vulgare L. х Hordeum bulbosum L.

1.2.2.Получение полигаплоидов пшеницы при скрещивании с

Zea mays L. и Pennisetum americanum L.

1.3. Селекционное использование диплоидизированных гаплоидов.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЙ

2.1.Изучаемый материал.

2.2.Методика исследований.

ГЛАВА 3. ПОЛУЧЕНИЕ ГАПЛОИДОВ В КУЛЬТУРЕ ПЫЛЬНИКОВ

3.1. Факторы, влияющие на гаплопродукцию.

3.2. Генотип донорного растения

3.2.1.Гаплопродукция у сортообразцов мягкой и твердой пшеницы саратовской селекции.

3.2.2.Особенности культивирования пыльников межвидовых гибридов.

3.2.3. Получение гаплоидов ячменя в культуре пыльников.

3.2.4. Регенерация растений.

ГЛАВА 4. ГЕНЕТИЧЕСКИЙ КОНТРОЛЬ МОРФОГЕНЕЗА НА

ГАПЛОИДНОМ И ДИПЛОИДНОМ УРОВНЯХ

4.1. Андрогенез в культуре пыльников линий, содержащих гены низкорослости.

4.1. Влияние Rht-генов на морфогенез в культуре незрелых зародышей мягкой и твердой пшеницы.

ГЛАВА 5. ПОЛУЧЕНИЕ ГАПЛОИДОВ МЕТОДОМ СЕЛЕКТИВНОЙ ЭЛИМИНАЦИИ ХРОМОСОМ

5.1.Получение гаплоидов обыкновенного ячменя при скрещивании Hordeum vnlgare L. х Hordeum bulbosum L.

5.1.1. Удвоение хромосомного набора регенерантов.

5.2. Получение полигаплоидов пшеницы в скрещиваниях с кукурузой и африканским просо.

ГЛАВА 6. ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ДИПЛОИДИЗИРОВАННЫХ ГАПЛОИДОВ В СЕЛЕКЦИИ

6.1.Методы гаплоидии в селекции ячменя.

6.2. Гаплоидия в селекции пшеницы.

ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по сельскому хозяйству, на тему "Технологические и селекционные аспекты гаплоидии"

Актуальность проблемы. Три последних десятилетия исследований по культуре клеток и тканей растений in vitro позволили существенно повысить эффективность методов и сделать их доступными для практического использования. В официальных каталогах зарегистрированы сорта не только двудольных растений, которые долгое время были модельными объектами в культуре тканей, но и зерновых злаков. В значительной степени прикладное использование методов in vitro связано с клеточной и хромосомной инженерией. В экспериментальных работах и практической селекции широко используют гаплоиды - спорофиты с гаметическим числом хромосом.

Основное селекционное преимущество использования гаплоидов исходит из возможности одноэтапного получения гомозигот, что позволяет быстро фиксировать морфофизиологические параметры адаптивности и сокращать сроки создания приспособленных к суровым условиям Поволжья засухоустойчивых сортов, способных стабильно формировать высокие урожаи зерна и отвечающих всем потребностям современного рынка.

У гаплоидов каждый ген представлен единственным аллелем, и рецессивные аллели одних генов проявляются наряду с доминантными аллелями других.

Генетическое расщепление при использовании гаплоидов менее сложно (фактически оно не превышает числа классов гамет), и для выделения определенной комбинации генов нужна сравнительно малочисленная популяция.

Как известно, отбор в традиционной селекции проводится по одному колосу или одному растению, а на проявление признака в сложной гибридной популяции оказывают влияние как внутрипопуляционные взаимоотношения между растениями, так и различные эффекты взаимодействия генов, что делает отбор малоэффективным. Потомства диплоидизированных гаплоидов представляющие линию и состоящие из нескольких растений, легче оценивать и отбирать.

Для массового получения гаплоидов пшеницы и ячменя широко используются два метода - культуры пыльников и селективной элиминации хромосом чужеродного вида-опылителя. Несмотря на значительные успехи, достигнутые при разработке этих методов и создании на их основе ряда сортов важнейших видов зерновых культур, их эффективное применение сдерживается рядом причин, главными из которых являются воспроизводимость полученных результатов в различные сезоны и для различных генотипов в сочетании со снижением затрат на получение.

Проблема прямого использования DH-линий (потомств диплоидизированных гаплоидов) в качестве элитных для создания сортов пшеницы и ячменя в Поволжье является новой. Известно, что возделываемые сорта саратовской селекции гетерогенны - у пшеницы выявлен огромный внутрисортовой полиморфизм по компонентному составу глиадина (Метаковский и др., 1987). Гомогенность сортов гаплоидного происхождения затрагивает проблему их адаптивности в этом уникальном климатическом регионе, в первую очередь, засухоустойчивости.

Цель и задачи исследований. Целью данного исследования является изучение возможностей использования гаплоидии в селекции засухоустойчивых сортов пшеницы и ячменя в условиях Поволжья.

Для выполнения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

- усовершенствовать биотехнологии получения гаплоидов в культуре зародышей и пыльников ячменя и пшеницы на основе оптимизации существующих методик и собственных разработок;

- изучить факторы, влияющие на гаплопродукцию;

- изучить сравнительную эффективность различных методов получения гаплоидов у пшеницы и ячменя;

- изучить влияние Rht-генов на андрогенез в культуре пыльников и зародышей пшеницы in vitro;

- оценить селекционную ценность сортов, созданных методами гаплоидии.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Теоретическое и экспериментальное обоснование принципов оптимизации биотехнологий получения гаплоидов пшеницы и ячменя в культуре пыльников и зародышей.

2. Значение Rht-генов в культуре in vitro пшеницы.

3. Возможность создания сортов пшеницы и ячменя для условий Поволжья с использованием гаплоидии.

Научная новизна. Впервые изучено влияние Rht-генов в генофоне мягкой и твердой пшеницы на эффективность культивирования пыльников и незрелых зародышей. Показан существенный положительный эффект гена Rht-Blc как на гаплоидном, так и на диплоидном уровнях. Линии, содержащие ген Rht-Blc, характеризуются длительной морфогенетической активностью каллусов из незрелых зародышей при пассировании, а также более высокими значениями основных показателей, определяющих эффективность гаплопродукции в культуре пыльников, по сравнению со своим сибсом.

Впервые показана возможность использования пролиферативного антигена инициалей (ПАИ) в качестве маркера морфогенетической активности каллусов пшеницы, что позволяет отбирать генотипы с высокой регенерационной способностью в культуре тканей in vitro.

Проведено комплексное изучение факторов, влияющих на эффективность гаплопродукции ячменя и пшеницы в культуре пыльников и зародышей, что послужило основой для массового получения DH-линий этих культур и их использования в практической селекции. Экспериментально доказано, что традиционное воздействие на колосья и пыльники донорных растений пониженными положительными температурами не является триггером спорофитного развития микроспор - оно происходит и в пыльниках не хранившихся на холоде колосьев.

Установлено, что высокая частота альбинизма регенерантов характерна для различных культуральных систем (культуры пыльников и культуры гаплоидных зародышей). Отсутствие альбиносов при прямой регенерации и появление их в значительном количестве среди регенерантов, полученных из каллусов незрелых зародышей, свидетельствует о том, что определяющей предпосылкой этого феномена является гаплоидный статус культивируемых клеток, прошедших стадию неорганизованного роста, а не генезис каллусных культур (микроспора или зародыш).

Частота проявления альбинизма зависит от генотипа растения-донора, а также физических условий культивирования полученных новообразований. Наибольшей частотой альбинизма характеризуются твердая пшеница, ячмень и межвидовые гибриды пшеницы. Постоянное культивирование при 12-15°С приводит к повышению частоты регенерации зеленых растений по сравнению с обычными режимами культивирования (25-27°С).

Впервые показано, что в суровых агроклиматических условиях Поволжья гомогенные сорта, элитные линии которых получены методами гаплоидии, не снижают засухоурожайности, как основного показателя их адаптивности в этом регионе. По коэффициентам пластичности и стабильности сорта ярового ячменя Нутанс 240 и яровой мягкой пшеницы Саратовская 64 не уступают лучшим саратовским сортам-стандартам. При длительном самоопылении сорта пшеницы и ячменя гаплоидного происхождения сохраняют константность и однородность как по своей морфологии, так и электрофоретическим характеристикам запасных белков.

Практическая ценность работы. Адаптированы и усовершенствованы гаплоидные биотехнологии в культуре пыльников и незрелых зародышей пшеницы и ячменя для условий Поволжья. Результаты разработок опубликованы в "Методических рекомендациях по получению гаплоидных растений мягкой пшеницы в культуре пыльников" (Дьячук Т.И., Дьячук П.А., 1989).

В результате использования гаплоидных биотехнологий получено 14495 DH-линий, в том числе, яровой мягкой пшеницы - 8297, озимой мягкой пшеницы - 428 и ярового ячменя - 5770. В содружестве с лабораторией селекции яровой мягкой пшеницы НИИСХ Юго-Востока методом культуры пыльников создан сорт яровой мягкой пшеницы Саратовская 64, допущенный к использованию в 8 регионе РФ (А.с. № 30538 от 01.06.1999 г.) и защищенный патентом РФ (№ 0344 от 05.11.1996 г.). В содружестве с отделом селекции ячменя Краснокутской СОС подготовлен для передачи на Государственные испытания сорт ярового ячменя пивоваренного направления Нутанс 240.

Полученные DH-линии используются как доноры важнейших селекционных признаков в рекомбинационной селекции, что явилось основой для создания новых засухоустойчивых сортов ячменя Нутанс 287, Нутанс 288 и Нутанс 279 и перспективной линии яровой мягкой пшеницы С-2127.

Апробация работы. Результаты исследований и основные положения диссертации докладывались на Всесоюзной конференции по биотехнологии злаковых культур (Алма-Аты, 1988, 1989), Международных рабочих совещаниях по программе 5.1.1.1. КПНТП СЭВ (Алма-Ата, 1988; Одесса, 1989; Москва, 1990), Международной конференции "Биология культивируемых клеток и биотехнология" (Новосибирск, 1989; Москва, 1989; Алма-Аты, 1993), 1-м Всесоюзном симпозиуме "Новые методы биотехнологии растений" (Пущино, 1991), на 5-ом сьезде ВОГиС им. Н.И. Вавилова (Москва, 1987 ), 1-ом сьезде Вавиловского общества генетиков и селекционеров (Саратов, 1994), 5-ой международной конференции по пшенице (Анкара, 1996), Международной научной конференции "Развитие научного наследия академика Н.И. Вавилова" (Саратов, 1997),

11.

Международном совещании "Проблемы селекции полевых культур на адаптивность и качество в засушливых условиях", посвященной 115- летию со дня рождения А.П. Шехурдина (Саратов,2001), Научной генетической конференции, посвященной 100-летию со дня рождения А.Р. Жебрака и 70-летию образования кафедры генетики в Московской сельскохозяйственной академии им. К.А. Тимирязева (М:МСХА, 2002), Всероссийской научной конференции "Селекция, семеноводство и технологии возделывания сельскохозяйственных культур сухо-степного Заволжья" (Пенза, 2002) и 6-й Всероссийской научно-практической конференции "Селекция и семеноводство полевых культур" (Пенза, 2002).

Личный вклад соискателя. Результаты исследований, представленные в диссертации, получены при непосредственном личном участии диссертанта или под его руководством. Изучение роли генов Rht в культуре органов и тканей пшеницы in vitro было проведено совместно с сотрудниками кафедры биотехнологии, селекции и генетики Саратовского ГАУ им. Н.И. Вавилова д.с.х.н Лобачевым Ю.В. и к.с.х.н. Ткаченко О.В. Эксперименты по изучению специфики образования и накопления молекулярного маркера морфогенеза -пролиферативного антигена инициалей (ПАИ) проводились совместно со старшим научным сотрудником института биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН (г. Саратов) к.б.н. Евсеевой Н.В. Участие автора было определяющим при оформлении научных публикаций. Доля соискателя в создании сорта яровой мягкой пшеницы Саратовская 64 составляет 15%.

Связь работы с крупными научными программами. Данная работа выполнялась с 1984 по 2002 г.г. в соответствии с международной программой КП НТП СЭВ по пятому приоритетному направлению "Ускоренное развитие биотехнологии", программой ВРО ВАСХНИЛ- и РАСХН "Биологические основы интенсификации селекционного процесса культурных растений и животных".

Публикации. Основные положения диссертации изложены в 49 печатных работах, опубликованных в отечественных и зарубежных изданиях, включая два авторских свидетельства и два патента.

Структура и обьем диссертации. Диссертация изложена на 280 страницах машинописного текста. Состоит из введения, 6 глав, выводов, практических рекомендаций и списка использованной литературы, включающего 336 наименованй, в том числе 246 - на иностранных языках.

Заключение Диссертация по теме "Селекция и семеноводство", Дьячук, Таисия Ивановна

243 ВЫВОДЫ

1 .Усовершенствована гаплоидная биотехнология пшеницы и ячменя в культуре пыльников, включающая:

- посев донорных растений в поле (3-4 срока) с интервалом в две недели и 2-й срок в теплице (январь-февраль);

- культивирование пыльников как свежеубранных, так и кратковременно хранившихся на холоде колосьев донорных растений; спорофитное развитие микроспор происходит и без воздействия холодом;

- использование, наряду с агаровыми, жидких питательных средах, содержащих Фиколл-400 в комбинации с высокими концентрациями 2,4-Д (58 мг/л), что увеличивает общее количество новообразований, способствует формированию хорошо дифференцированных эмбриоидов - копий зиготических зародышей с высоким регенерационным потенциалом; жидкие питательные среды обеспечивают возможность культивирования целых цветков и колосков, что позволяет избегать трудоемкой процедуры вычленения пыльников;

- применение вещества "1386" в концентрации 1 и 10 мг/л в составе индукционных питательных сред, что повышает регенерационную способность каллусов пшеницы;

- комплекс приемов для укоренение растений, обеспечивающий успех их диплоидизации и выживаемость после колхицинирования - состав индукционных и регенерационных питательных сред, пониженные положительные температуры культивирования эмбриоидов (+12.+15° С), выдерживание регенерантов в воде в течение 10-12 суток; колхицинирование регенерантов для удвоения набора хромосом непосредственно после их выведения из условий in vitro;

- яровизацию гаплоидных растений с озимым типом развития в условиях in vitro (для этой цели пригоден бытовой холодильник); этот доступный прием экономит место в помещении с контролируемыми условиями выращивания растений и обеспечивает возможность яровизации регенерантов, полученных в летнее время.

2. Гибриды Fi характеризуются повышенной частотой индукции андрогенетических структур по сравнению с родительскими линиями, что дает возможность получать гаплоидные растения в комбинациях с участием в скрещиваниях низкоотзывчивых родителей (тетраплоидных видов пшеницы). В беккроссных поколениях значение признака "частота индукции андрогенеза" приближается к таковому у реккурентного родителя.

3. Установлено различное по степени и направлению влияние Rht-генов на этапы культивирования in vitro мягкой и твердой пшеницы. Линии, содержащие ген Rht-Blc, обладают высоким морфогенетическим потенциалом in vitro на гаплоидном и диплоидном уровнях, они характеризуются длительной морфогенетической активностью каллусов из незрелых зародышей при пассировании, а также повышенной частотой индукции андрогенетических структур и регенерации растений в культуре пыльников по сравнению с контрольной изолинией.

4. Пролиферативный антиген инициалей (ПАИ) может использоваться в качестре дополнительного маркера морфогенетической активности каллусов мягкой пшеницы, позволяющего выявлять генотипы, обладающие повышенной регенерационной способностью в культуре in vitro.

5. Потомство от скрещиваний Hordeum vulgare х Hordeum bulbosum в условиях Поволжья характеризуется отсутствием гибридов, что указывает на роль температурного фактора в элиминации хромосом опылителя. Эффективность метода в среднем за все годы исследований составила 8,7 и 7,1 растений на 100 опыленных цветков в условиях теплицы и поля соответственно. Регенерация растений из каллусных культур незрелых зародышей обеспечивает дополнительную возможность увеличения гаплопродукции.

6. Установлено, что высокая частота альбинизма характерна для различных культуральных систем (культуры пыльников и каллусных культур гаплоидных зародышей). Отсутствие альбиносов при прямой регенерации и появление их в значительном количестве среди регенерантов, полученных из каллусов незрелых зародышей, свидетельствует о том, что определяющей предпосылкой этого феномена является наличие стадии неорганизованного роста in vitro в сочетании с гаплоидным статусом хромосом, а не генезис каллусных культур (микроспора или зародыш).

Частота проявления альбинизма зависит как от генотипа растения-донора, так и условий культивирования полученных новообразований. Постоянное культивирование при 12-15°С приводит к повышению частоты регенерации зеленых растений по сравнению с обычными режимами культивирования (25-27°С).

7. Основным лимитирующим фактором получения гаплоидов мягкой пшеницы в скрещиваниях с кукурузой и африканским просо является высокая частота формирования партенокарпических зерновок (до 90%). Установлена низкая эффективность получения гаплоидов твердой пшеницы в скрещиваниях с Zea mays L. и Pennisetum americanum L.

8. С применением гаплоидных биотехнологий в культуре пыльников и незрелых зародышей получено 14495 DH-линий различных видов злаков, в том числе, яровой мягкой пшеницы - 8297, озимой мягкой пшеницы - 428 и ярового ячменя - 5770, которые широко используются в рекомбинационной селекции этих культур.

9. С использованием гаплоидии созданы засухоустойчивый сорт яровой мягкой пшеницы Саратовская 64, допущенный к использованию с 2000 года в 8 регионе РФ (А.с. №30538 от 01.06.1999 г.) и защищенный патентом Российской Федерации (№0344 от 05.11.1996 г.) и ячменя Нутанс 240, подготовленного для передачи на ГСИ. С привлечением DH-линий в новые скрещивания получены перспективные линии ячменя Нутанс 279, Нутанс 288, Нутанс 289 и яровой мягкой пшеницы С-2127.

10. Сорта пшеницы и ячменя гаплоидного происхождения сохраняют стабильность и однородность при длительном самоопылении, что подтверждается анализом их морфологических признаков и спектром запасных белков. Экспериментально доказано, что сорта, созданные с использованием гаплоидии, характеризуются высокой засухоурожайностыо -основным показателем их адаптивности в Поволжском регионе РФ.

РЕКОМЕНДАЦИИ ПО ИСПОЛЬЗОВАНИЮ РЕЗУЛЬТАТОВ

ИССЛЕДОВАНИЙ

1. Для ускорения селекционного процесса и повышения эффективности отборов использовать усовершенствованные технологии получения гаплоидов пшеницы и ячменя в культуре зародышей и пыльников.

2. В биотехнологических исследованиях использовать линии пшеницы, содержащие ген Rht-Blc, способствующий увеличению выхода новообразований в культуре пыльников и сохранению морфогенетической активности каллусов при пассировании.

3. В качестве дополнительного маркера морфогенетической активности каллусов мягкой пшеницы использовать ПАИ (пролиферативный антиген инициалей).

4. Использовать в рекомбинационной селекции пшеницы и ячменя DH-линии, созданные в культуре пыльников и зародышей (всего около 15 тысяч) в качестве исходного материала по комплексу хозяйственно-ценных признаков;

5. Внедрять в зонах допуска к использованию высокопродуктивный, засухоустойчивый сорт яровой мягкой пшеницы Саратовская 64.

248

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Резюмируя первый опыт использования гаплоидов в селекции пшеницы и ячменя на Юго-Востоке, можно отметить следующее. Получение удвоенных гаплоидов из сортов и перспективных форм ярового ячменя и яровой мягкой пшеницы, что по своей сути может быть приравнено к повторному отбору, не выявило преимуществ гаплоидии по сравнению с обычными методами селекции. В то же время зерновая продуктивность линий остается на уровне исходных сортов, что свидетельствует о том, что технологии получения гаплоидов не вызывают наследственных изменений, негативно влияющих на проявление основных хозяйственно-ценных признаков.

Урожайность зерна сортов яровой мягкой пшеницы (по Л.Г. Ильиной, 2000 г., с сокращениями)

Сорт Год допуска С реднее за 1995-1999 гг. по 7 опытам острозасушливые (1995,1998, 1999) гг. т/га % т/га %

Л62 1924 1,22 100,0 0,83 100,0

С29 1957 1,60 131,1 1,10 132,5

С58 1991 1,77 145,1 1,30 156,6

С64 2000 1,79 146,7 1,33 160,2

С68 2000 1,97 161,5 1,38 166,3

Получение гаплоидов из гибридов ранних поколений позволяет не только сократить сроки получения гомозигот, но и выявить реальную селекционную ценность скрещивания, его сортообразующие потенции. Выведение сорта яровой мягкой пшеницы Саратовская 64, элитная линия которого была получена методом культуры пыльников, наглядно демонстрирует эти преимущества гаплоидной селекции. В традиционной селекции ценность той же комбинации скрещивания не была выявлена.

Сорта пшеницы и ячменя, созданные на основе методов гаплоидии, характеризуются генетической стабильностью и однородностью. Это подтверждается как морфологическим анализом линий в самоопыленных поколениях, так и анализом электрофоретических свойств запасных белков.

Гомогенные сорта гаплоидного происхождения характеризуются высокой засухоурожайностью в сочетании с другими хозяйственно-ценными признаками. Они конкурируют с традиционными селекционными сортами по адаптивности к засушливым условиям Юго-Востока.

Библиография Диссертация по сельскому хозяйству, доктора биологических наук, Дьячук, Таисия Ивановна, Саратов

1. А.с. СССР № 1036306. Способ получения растений пшеницы в культуре пыльников. Авторы: Суханов В.М., Тырнов B.C., Салтыкова Н.Н. Заявл. 01. 04. 1981 г. Опубл. 23. 08. 1983 г. Бюл. № 31.

2. Александрова Л.Г., Лукьянюк С.Ф. Пыльниковая культура ячменя: эффективность, воспроизводимость // Материалы научной конференции по сельскохозяйственной биотехнологии. Целиноград. - 1991. - С. 63-65.

3. Анапияев Б.Б. Культура микроспор и гаплоидная биотехнология пшеницы. // Монография (Ред. Рахимбаев И.Р). Алмааты. - 2001. - 220 с.

4. Анапияев Б.Б. Экспериментальный морфогенез и биотехнология получения гаплоидов в культуре микроспор пшеницы // Автореф. дис. . докт. биол. наук. Москва,. - 2001. 50 с.

5. Батыгина Т.Б. Эмбриология пшеницы. Изд. Колос, Л., - 1974. - 206 с.

6. Батыгина Т.Б. Хлебное зерно. Атлас. Изд. Наука. Л., -1987. -108 с.

7. Батыгина Т.Б., Шамров И.И., Дьячук Т.И. Эмбриогенный тип бесполого размножения и классификация аномалий в культуре пыльников на примере пшеницы // Биология культивируемых клеток и биотехнология. -Новосибирск. 1988.-С. 210-211.

8. Бояджиев Петьр. "Мариана", нов сорт ориз, получен по метода на антерните култури // Растениевод. Науки Болг., 1990. -Т. 27. - С. 11-113.

9. Бутенко Р.Г. Культура изолированных тканей и физиология морфогенеза растений. М., - Наука. - 272 с.

10. Бутенко Р.Г. Биология клеток высших растений in vitro и биотехнологии на их основе // Уч. пособие. М,: ФБК-ПРЕСС. -1999. -160с.

11. Вавилов Н.И. Роль Центральной Азии в происхождении культурных растений // Избр. произв. в 2-х томах. Л.Б - 1967

12. Васильчук Н.С. Селекция яровой твердой пшеницы. Саратов. - 2001. -123 с.

13. Внучкова В.А., Чеботарева Т.М. Оптимизация условий получения гаплоидов пшеницы при посадке пыльников // Докл. ВАСХНИЛ. -1990. -№5.-С. 6-9.

14. Володарский А.Д., Чаянова С.С., Хебер У., Халлиер У.В., Шмитт Ю. Определение содержания ферментных белков с помощью иммунохимической тест-системы // Физиология растений. 1979. - т. 26. -С. 71-74.

15. Гааль Э., Медьеши Г., Верецкеи Л. Электрофорез в разделении биологических макромолекул. М.: Мир. - 1982. - 448 с.

16. Голубовская И.Н. Генетический контроль мейоза. Автореф. дис. . докт. биол. наук. Новосибирск. - 1983. -32 с.

17. Горбунова В.Ю. Эмбриоидогенез в культуре пыльников пшеницы -цитолого-гистологические аспекты. -Уфа. -1992. 62 с.

18. Горбунова В.Ю. Андрогенез in vitro у яровой мягкой пшеницы // Автореф. дис. . докт. биол. наук. Санкт-Петербург. -2000. - 48 с.

19. Дмитриева Н.Н. Особенности метаболизма белка и нуклеиновых кислот в процессе дедифференциации клеток сердцевинной паренхимы стебля табака//Труды 1-й Всес. конф. "Культура изолированных органов и клеток растений". М.; Наука. -1970. - С. 101-106.

20. Дунаева С.Е. Использование различных клонов Hordeum bulbosum в качестве опылителей для получения гаплоидов культурного ячменя // Научно-технический бюл. ВИР им. Н.И. Вавилова. Л., - 1990. - Вып.204. С.12-16.

21. Дьячук Т.И., Дьячук П.А., Столярова С.В. Получение гаплоидных растений яровой мягкой пшеницы саратовских сортов в культуре пыльников // Докл. ВАСХНИЛ. 1986. - № 10. - С. 2-3.

22. Дьячук Т.Н., Дьячук П.А. Культура пыльников злаков современное состояние, проблемы, перспективы // С/х биология. - 1989. - № 5 - С. 3-10.

23. Дьячук Т.И., Дьячук П.А. Методические рекомендации по получению гаплоидных растений мягкой пшеницы в культуре пыльников // Всероссийское отделение ВАСХНИЛ: НПО " Элита Поволжья". -М., -1989.-36 с.

24. Дьячук Т.И., Столярова С.В., Носова О.Н. Культура пыльников межвидовых гибридов пшеницы и тритикале // Биологические основы селекции. Саратов. - 1991. - С. 29-35.

25. Дьячук Т.И. Культура пыльников и формообразовательный процесс у яровой мягкой пшеницы // Генетика. -1994. -Т. 30. С. 45.

26. Дьячук Т.И., Сафронова Н.Ф. Об использовании метода культуры пыльников для получения гаплоидов ячменя // С/х биология. 1996. -№5- С. 72-75.

27. Ильина Л.Г. Селекция яровой пшеницы в НИИСХ Юго-Востока // Научные труды НИИСХ Юго-Востока. Саратов. - 1970. - Вып. 27. - С. 5-126.

28. Ильина Л.Г. Селекция саратовских яровых пшениц. Саратов: Изд. СГУ. -1996. -130 с.

29. Ильина Л.Г. Саратовской селекции яровой пшеницы 90 лет // Проблемы и пути преодоления засухи в Поволжье. Научные труды. Саратов. - 2000. -С. 7-13.

30. Ильин А.В., Калинин Ю.А., Степанова Т.И. Селекция ярового ячменя на продуктивность и качество зерна на Краснокутской станции // Проблемы и пути преодоления засухи в Поволжье. Саратов. - 2000. - С. 186-194.

31. Ильин А.В. Селекция ярового ячменя в Поволжье // Автореферат дис. . докт. с.х. наук. Саратов. - 2000. - 48 с.

32. Калинин Ф.Л., Сарнацкая В.В., Полищук В.Е. Методы культуры тканей в физиологии и биохимии растений. — Киев: Наукова думка. 1980. - 399 с.

33. Козловская В.Ф. Преодоление межвидовой несовместимости пшениц // Рос. вестн. с.-х. наук. 1992. - № 6. - С. 18-19.

34. Круглова Н.Н., Сельдимирова О.А. Культура изолированных пыльников злаков: точка зрения эмбриолога. 2. Характеристика эмбриолога // Клеточные культуры. 2000. - Вып. 15. - С. 9-12.

35. Круглова Н.Н. Микроспора злаков как модельная система для изучения путей морфогенеза // Автореф. дис. . докт. биол. наук. -Уфа. 2002. -48с.

36. Крупнов В.А. Сравнительная оценка биотехнологических методов в селекции злаков // Вестник с.х. науки. 1989. - № 3. -С. 23-29.

37. Кумаков В.А. Физиологическое обоснование моделей сортов пшеницы. -М., Агропромиздат. 1985. - 268 с.

38. Кучеренко J1.A. Биологические особенности риса в культуре in vitro и создание на их основе биотехнологии получения исходного селекционного материала // Автореф. дис. . докт. биол.наук. М., -1991. - 41 с.

39. Лаптев Ю.П. Гетероплоидия в селекции растений. М., Колос. - 1984. -248 с.

40. Лобачев Ю.В. Проявление генов низкорослости у яровых пшениц в нижнем Поволжье.( Ред. Крупнов В.А.). Саратов: СГАУ. - 2000. - 264 с.

41. Лукьянюк С.Ф. Разработка приемов in vitro для получения гаплоидов ячменя и тритикале // Автореф. дис. .канд. биол. наук. М., - 1983. - 18с.

42. Лукьянюк С.Ф., Игнатова С.А. Получение гаплоидов ячменя с помощью гаплопродюсера//Методические рекомендации. Одесса. - 1983. - 21 с.

43. Лукьнюк С.Ф., Игнатова С.А., Наволоцкий В.Д. Получение гаплоидов ячменя и использование гомозиготных линий в селекции // Геном ячменя и проблемы его улучшения. Одесса. - 1989. - С. 76-83.

44. Мамонтова В.Н. Выведение сортов яровой пшеницы в институте сельского хозяйства Юго-Востока // Селекция и семеноводство яровой пшеницы. Избранные труды. М., Колос. - 1980. - С. 155-162.

45. Махновская JI.А., Литвиненко Н.А. Игнатова С.А. Технология получения удвоенных гаплоидов и источников высокой андрогенетической способности у пшеницы // Цитол. и генет., 1999. - Т.ЗЗ. - № 2. - С.45-48.

46. Метаковский Е.В., Ильина Л.Г., Галкин А.Н., Коваль С.Ф., Созинов А.А. Аллельные варианты блоков компонентов глиадина у саратовских пшениц // Селекция и семеноводство. -1987. №1. - С.11-15.

47. Молканова О.И., Данилова Т.В. Выход гаплоидных растений яровой пшеницы (Triticum aestivum L.) в культуре пыльников в зависимости от состава Сахаров питательной среды // Известия ТСХА. 1984.- № 4.- С. 69-75.

48. Мукашева А.Ф, Лукьянюк С.Ф. Оптимизация условий выхода гаплоидов у ячменя // Материалы научной конф. по с.-х. биотехнологии. — Целиноград. -1991.-С. 65-66.

49. Мунаварова А.А. Аномальные споргенные клетки возможный источник образования андроклинных регенерантов пшеницы // 2-й сьезд Вавиловского общества генетиков и селекционеров. 1-5 февраля 2000 г.: Тез. докл. Санкт-Петербург. -2000. - С. 157-158.

50. Наволоцкий В.Д. Направления и перспетивы использования гаплоидии в селекции ячменя // Бюллетень ВСГИ. 1986. - С. 14-18.

51. Наумова Л.Н., Манзюк В.Т., Носовская Л.А., Юшкина Л.Л., Кучеренко Е.Н. Способ получения гаплоидов Hordeum vulgare // А.с. 1544297 СССР "МКИ", А 01 Н 1/04

52. Ницше В., Венцель Г. Гаплоиды в селекции растений. Пер.с англ., М., Колос, - 1980.- 126 с.

53. Новак Ф.И. Индукция гаплоидов в культуре таней и их значение для селекции растений // Культура клеток растений и биотехнология. М., Наука.-1986.-С. 159-167.

54. Павловская М.Е., Голышкин Л.В., Голышкина Л.В. Введение в сельскохозяйственную биотехнологию // Уч. пособие. Орел: ОГСХА. -1998.-204 с.

55. Паушева З.П. Практикум по цитологии растений. М., -1970. - 255 с.

56. Писарев В.Е., Виноградова Н.М. Гибриды между пшеницей и Elymus // Докл. АН СССР. 1944. - 45. - С. 129-132.

57. Поддубная-Арнольди В.А. Цитоэмбриология покрытосеменных растений.- М., "Наука". 1976. - 507 с.

58. Приходько Н.Н. Получение гаплоидных растений из пыльцевых зерен мягкой пшеницы Triticum aestivum // Труды по прикладной ботанике, генетике и селекции. 1980. -Т. 67. - № 3. - С. 75-79.

59. Пшеницы мира. Видовой состав, достижения селекции, современные проблемы и исходный материал. (Ред. Дорофеев В.Ф). Л., - 1987. -560 с.

60. Резникова С.А. Цитология и физиология развивающегося пыльника. М., "Наука".- 1984.-272 с.

61. Родин Е.А., Крылов П.А. Способ получения гаплоидных растений ячменя. А.с. 1520096 СССР "МКИ" с 12 №5/00№4377683/30-13

62. Сельскохозяйственная биотехнология. Учеб. (Ред. B.C. Шевелуха). М., : Высшая школа. - 1998. - 416 с.

63. Сибикеева Ю.Е. Изучение генетической изменчивости признаков в связи с андрогенезом in vitro мягкой пшеницы // Автореф. дис. .канд. биол. наук. Санкт-Петербург - 1996. - 18 с.

64. Сельдимирова О.А. Морфогенез эмбриоида in vitro и зародыша in vivo у пшеницы // Автореф. дис. .канд. биол. наук. Уфа,. - 2002. - 23 с.

65. Сидоров В.А. Биотехнолоия растений. Клеточная селекция. Киев: Наукова думка. - 1990. - 280 с.

66. Созинов А.А., Метаковский Е.В, Коваль С.Ф. Закономерности формирования генотипа при селекции пшеницы // Вестник с.х. науки. -1986. Т. 3.-С. 60-70.

67. Солнцева М.П., Дунаева С.Е. Изучение оплодотворения, развития зародыша и эндосперма в комбинации скрещивания Hordem vulgare х Hordeum bulbosum // Научно-техн. бюл. ВИР им. Н.И. Вавилова. Д., -1990.-Вып. 204,- С. 17-25.

68. Столярова С.В. Культура тканей in vitro при межвидовой гибридизации пшеницы. Дис. .канд. с. х. наук. Саратов. - 1998. - 123 с.

69. Суриков И.М., Дунаева С.Е. Элиминация хромосом при отдаленной гибридизации в семействе злаков и ее использование для получения гаплоидов //Ж. общ. биол. -1989. Т. 50. - № 2. - С. 158-170.

70. Суханов В.М. К использованию андроклинных растений в селекции пшеницы // Докл. ВАСХНИЛ. 1982. - № 11. - С. 7-8.

71. Суханов В.М. Андроклиния и ее особенности у пшеницы. Дисс. .канд. биол. наук. Саратов. - 1983. - 224 с.

72. Суханов В.М., Зайкина Т.Ф., Нестеров А.Ю. Получение андроклинных растений пшеницы и тритикале путем создания органогенных штаммов // Сб. Апомиксис и селекция. Саратов. - 1987. - С. 3-13.

73. Ткаченко О.В. Культура тканей n vitro короткостебельной мягкой и твердой пшеницы. Автореф. дис. .канд. с.х. наук. Саратов. - 2001. - 24с.

74. Тивари Ш. Морфогенез в культуре пыльников и изолированных микроспор ячменя. Автореф. дис. . канд. биол. наук. М., -1989. - 24 с.

75. Тучин С.В., Дьячук Т.И., Столярова С.В., Итальянская Ю.В. Биотехнологические методы в селекции зерновых культур // Сб. Проблемы и пути преодоления засухи в Поволжье. Саратов. - 2000. - С. 306-324.

76. Фещенко В.Р., Евсеева Н.В., Подольный В.З., Володарский А.Д. Изучение функционального состояния апикальных меристем пшениц, различающихся по отзывчивости к длине дня // Доклады РАН. 1992. — Т.327. - С. 284-288.

77. Хохлов С.С., Гришина Е.В., Зайцева М.И., Тырнов B.C., Малышева-Шишкинская Н.А. Гаплоидия у покрытосеменных растений.Ч.1. -Саратов: СГУ. 1970.

78. Чистякова В.Н. Место гаплоидии в интенсификации генетико-селекционных программ // Тезисы 2-го сьезда Вавиловского общества генетиков и селекционеров. 1-5 февраля 2000г. Санкт-Петербург. - 2000. -С. 167.

79. Шамина З.Б. Андрогенез и получение гаплоидов в культуре пыльников и микроспор // Культура клеток растений. "Наука", М., -1981. - С. 124-130.

80. Шамров И.И., Дьячук Т.И., Батыгина Т.Б. Эмбриоидогенный тип бесполого размножения и классификация аномалий на примере пшеницы // Биология культивируемых клеток и биотехнология. Новосибирск. - 1988. -С. 210-211.

81. Юркова Г.И., Левенко Б.А. Изолированная культура пыльников злаков (литературный обзор) // Экспериментальная генетика растений. Киев: Наукова думка. - 1981. - С. 46-65.

82. Agache S., Bachelier B, de Buyser J, Henry Y and Snape J. Genetic analysis of anther culture response in wheat using aneuploid, chromosome substitution and translocation lines // Theor.Appl.Genet., 1989. - V. 77. - P.7-14.

83. Andersen S.B., Due L.K and Olsen A. The response of anther culture in a genetically wide material of winter wheat (Triticum aestivum L.) // Plant Breed., 1987.-V. 99.-P. 181-186.

84. Baenzieger P.S. and Schaeffer G.W. Dihaploids via anthers cultured in vitro// Genetic engineering: application to agriculture. Beltsville Symposium 7 (ed. D. Owens). Rowman and Ahanheld: Totowa. -1985. - P. 269-284.

85. Ball E. Hydrolysis of sucrose by autoclaving media, a neglected aspect of the technique of culture of plant tissues // Bull. Torrey Bot. Club 80. 1953. - V. 4. -P. 409-411.

86. Barclay I.R., Shepherd W.E. and Sparrow D.H. Control of chromosome elimination in Hordeum vulgare H. bulbosum hybrids // Barley Genet. Newsletter. - 1972. - V.2. - P. 22-24.

87. Barclay I.R. High frequencies of haploid production in wheat (Triticum aestivum) by chromosome elimination // Nature. 1975. - № 256. - P. 410-411.

88. Barnabas B.P., Pahler P.L., Kovacs G. Direct effect of colchicine on the microspore embryogenesis to produce dihaplod plants in wheat (Triticum aestivum L.) // Theor. Appl. Genet., 1991. - V.81. - P. 675-678.

89. Beamont V.H., Rocheford T.R., Widholm J.M. Mapping the anther culture response genes in maize (Zea mays L.) // Genome. 1995. - V. 38. - P. 968975.

90. Bennet M.D., Hughes W.G. Abnormal mitosis in wheat pollen induced by etlirel // Nature. 1972. - V. 240. - P. 566-568.

91. Bennet M.D., Finch R.A., Barclay I.R. The time and mechanism of chromosome elimination in Hordeum hybrids // Chromosoma. 1976. - V. 54. -P. 175-200.

92. Bernard S. In vitro androgenesis in hexaploid triticale determination of phisical conditions increasing embryoid and green plant production // Z. Pflanzenzuchtung. - 1980. - V. 85. - P. 308-321.

93. Brian R.Orshinsky, McGregor L.J., Johnson G.I., Hucle P and Kartha K. Improved embryoid induction and green shoot regeneration from wheat anthers cultured in medium with maltose // Plant Cell Reports. 1990. - V. 9. - P. 365369.

94. Bullock P. and P.S.Baenziger. Anther culture of wheat ( Triticum aestivum L.) F-ls and their reciprocal crosses // Theor.Appl.Genet., -1982. V. 62. - P. 155159.

95. Bushuk W., Zillmann R. Wheat cultivar identification by gliadin electroforegrafns. 1. Apparatus, method and nomenclature // Can. J. Plant Sci. -1978.-V. 58.-P. 505-507.

96. Buyser J, Heniy Y and Taler G. Wheat androgenesis: cytogenetical anallysis and agronomic performance of doubled haploids // Z. Pflanzenzuchtung. 1985.- V. 95. P. 23-34.

97. Buyser J. and Henry Y. Wheat production of haploids, performance of doubled haploids and yield trials // Biotechnology in agriculture and forestry. (Ed.by Y.P.S.Bajaj) Springer Verlag: Berlin - New York- Heidelberg. - 1986. - № 2- P. 73-78.

98. Buyser J., Henry Y., Lonnet P, Hertzog R and Hespel A. "Florin, a doubled haploid wheat variety developed by anther culture method // Plant Breeding. -1987.-V. 98.-P. 53-56.

99. Campbell K.W., Brawn R.J and Ho K.M. "Rodeo" barley // Canad. J. Plant Sci., 1984. - V. 64. - P. 203-205.

100. Chaemi ML, Sarrafi A. Pollen derived plants from F1 hexaploid/tetraploid wheats // Genet, and Breed., 1994a. - V. 48. - №4. - P. 87-93.

101. Chaemi M., Sarrafi A. The effect of the "D" genome from synthetic wheat lines in anther culture responses // Plant Breed., 1994b. - V. 112. - №1. - P. 76-79.

102. Charmet G., Bernard S. Diallel analysis of androgenetic plant production in hexaploid triticale (Triticosecale Wittmack) // Theor. Appl. Genet., 1984. - V. 69.-P. 55-61.

103. Chen С .M., Chen C.C. Genetic analysis of anther-derived plants of rice // J. Hered., -1982. V. 73. - P. 49-52.

104. Chen Y. Anther and pollen culture of rice // Haploids in higher plants in vitro (ed. by Hu Han and Jang Hongyan). Springer Verlag Publishers: Berlin New York - Tokyo. - 1986. - P. 3-25.

105. Chen F.Q. and Hayes P.M. A comparison of Hordeum bulbosum mediated haploid production efficiency in barley using in vitro floret and tiller culture // Theor. Appl. Genet., - 1989. - V. 77. - P. 701-704.

106. Chen Chi- Chang, Hsin-Sheng Tsay and Chien-Rong Huang. Rice (Oryza sativa): factors affecting androgenesis // Biotechnology in agriculture and forestry, (ed. By Y.P.S.Bajaj). Springer Verlag: Berlin Heidelberg. - 1986. -V.2. - P. 123-137.

107. Choo U.H., Kasha K.J. Ethylene production and embryogenesis from anther cultures of barley (Hordeum vulgare) // Plant Cell Reports. 1989. - V. 8. - P. 415-417.

108. Choo T.M., Reinbergs E., Park S. Comparison of frequency distributions of doubled haploid and single seed descent lines in barley // Theor. Appl. Genet., -1982.-V. 61.- P. 215-218.

109. Choo T.M., Reinberg E., Kasha K.J. Use of haploids in breeding barley // Plant Breeding Rev., 1985. - V. 3. - P. 219-252

110. Chu С.С. The N6 medium and its application to anther culture of cereal crops // Proc. of symp. on plant tissue culture / Science Press: Peking. 1978. - P. 4350.

111. Chuang C.C.,Ouyang J. W. A set of Potato medium for wheat anther culture // Proc. Symp. Plant Tissue Culture. Science Press: Peking. 1978. - P. 51-56.

112. Clapham D. In vitro development of callus from the pollen of Lolium and Hordeum // Z. Pflanzenzucht., 1971. - V. 65. - P. 285-292.

113. Clapham D. Haploid Hordeum plants from anthers in vitro // Z. Pflanzenzucht. -1973,-V. 69.-P. 142-155 .

114. Collins G.M. Production and utilization of anther derived haploids in crop plants // Crop Sci., 1977. - V. 17. - P. 583-586.

115. Cowen N.M., Johnson C.D., Armstrong K., Miller M., Woosley A., Pescitelli S., Shokut M.,Belmar S., Petolino J. F. Mapping genes conditioning in vitro androgenesis in maize using RELP analysis // Theor. Appl. Genet., 1992. - V. 84. - P. 720-724.

116. Dale R.J. Pollen dimorphism and anther culture in barley // Planta. 1975. -V.27.-P. 213-220.

117. Darvey N.L . Doubled haploid technology : an interactive model for germplasm enhancement // Proc. of the 9th Int. Wheat Genet. Symp. Canada. Saskatoon. Saskatchevan. 1998. - V. 1. - P. 148-151.

118. Datta S.K. and Wenzel G. Isolated microspore deriveded plant formation via embryogenesis in Triticum aestivum L. // Plant Sci., 1987. - V. 48. - P. 49-54.

119. Datta S.K. Plant regeneration by pollen embryogenesis from cultured whole spikes of barley (Hordeum vulgare L.) // Theor. Appl. Genet., 1987. - V. 74. -P. 121-124.

120. Datta S.K. and Wenzel G. Single microspore derived embryogenesis and plant formation in barley (Hordeum vulgare L.) // Arch. Zuchtungsforsch., — 1988. -Berlin. B.18. - S. 125-131.

121. Datta S.K., Potrykus J. Artificial seeds in barley: encapsulation of microspore-derived embryos // Theor. Appl. Genet., 1989. - V. 77. - № 2. - P. 820-824.

122. Davis D.R. Male parthenogenesis in barley // Heredity. 1958. - V.12. - P. 493-498.

123. Day A., Ellis Т.Н. Chloroplast DNA deletions associated with wheat plants regenerated from pollen: possible basis for maternal inheritance // Cell. 1984. -V. 39.-P. 359-368.

124. Dixin X., W. Manli, H. Qiung. Comparison of several characters between the pollen-derived hybrid plants and the conventional F2 hybrids in rice // 3rd Int. Symp. of haploidy. 1st Int. Symp. of somatic cell genetics. Beijing (China). -1984.-P. 134.

125. Djatchouk T.I., Kusmenko A.I. Agronomic performances of a wheat crosses using anther culture method // Ann.Wheat Newsletter. KSU (USA). 1995. - V. 41.-P. 165

126. Djatchouk T.I., Stoljarova S.V. Response of differen wheat species in anther culture.// Ann.Wheat Newsletter. KSU (USA). 1996. - V„42. - P. 175-176.

127. Djatchouk T.I., Kusmenko A.I. Haploid breeding for dry regions of Russia // 5th Int.Wheat Confer., June 10-14. Ankara. Turkey. - 1996. - P. 354.

128. Dunwell J.M. Embryogenesis from pollen in vitro // Biotechnology in Plant Science. Relevance to Agriculture in the Eighties: Academic Press. 1985. - P. 49-76.

129. Dunwell J.M., Francis R.J., Powell W. Anther culture of Hordeum vulgare L.: a genetic study of microspore callus production and differentiation // Theor. Appl. Genet., 1987. - V. 74. - P. 60-64.

130. Ekiz H., Konzak C.F. Preliminary diallel analysis of anther culture response in wheat (Triticum aestivum L.) // Plant Breed., 1994. - V. 113. - № 1. - P. 4752.

131. Falk D.E., Kasha K.J. Comparison of crossability of rye (Secale cereale) and Hordeun bulbosum onto wheat (Triticum aestivum) // Canad. J. Genet. Cytol.,1981.-V. 23.-P. 81-88.

132. Falk D.E., Kasha K.E. Genetic studies of the crossability of hexaploid wheat with rye and Hordeum bulbosum // Theor. Appl. Genet., 1983. - V. 64. - P. 303-307.

133. Fedak G. Haploids from barley x rye crosses // Canad. J. Genet. Cytol., -1977.-P. 15-19.

134. Fedak G. Haploids in Triticum ventricosum via intergeneric hybridization with Hordeum bulbosum// Can. J. Genet. Cytol., 1983. - V. 25. - P. 104-106.

135. Finch R.A. Tissue-specific elimination of alternative whole parental genomes in one barley hybrid// Chromosoma. 1983. - V. 88. - P. 49-76.

136. Finnie S.J., Powell W. and Dyer A.F. The effect of carbohydrate composition and concentration on anther culture response in barley (Hordeum vulgare L.) // Plant Breed., 1989.-V.10.-P. 110-118.

137. Foroughi-Wehr В., Friedt W., Wenzel G. On the genetic improvement of androgenetic haploid formation in Hordeum vulgare L. // Theor. Appl. Genet.,1982.-V. 62.-P. 233-239.

138. Foroughi-Wehr B. and Zeller F.J. In vitro microspore reaction of different german wheat cultivars // Theor. Appl. Genet., 1990. - V. 79. - P. 77-80.

139. Friedt W., Braun J., Zuchner S., Foroughi-Wehr B. Comparative value of spring barley lines // Plant Breeding. 1986. - V. 97. - №1. - P. 56-64.

140. Genovesi A.D. and Collins G.W. In vitro production of haploid plants of corn via anther culture // Crop Sci., 1982. - V. 6. - P. 1137-1143.

141. Giura A. In vitro chromosome doubling of the wheat polyhaploids // Proc. of the 11th EWAC Conference. Novosibirsk 24-28 July 2000. EWAC Newsletter . -2001. P. 70-76.

142. Goorg H.,A. Hu and Hoang Tang. Direct generation of wheat haploids via anther culture // Crop Sci., 1987. - V. 27. - № 2. - P. 330-339.

143. Guha S.S., Maheshvari S.C. In vitro production of embryos from anthers of Datura // Nature. London. - 1964. -V. 204. - P. 497.

144. Guha S., Maheshvari S.C. Cell division and differentiation of embryos in the pollen grains of Datura in vitro // Nature. London. - 1966. - V.212 - P. 97-98.

145. Guo H.W. and J. Oujang. The effect of KNO3 concentration in callus induction medium for wheat anther culture // Plant, Cell, Tissue and Organ culture. 1988. -V.12.-P.3-12.

146. Harmants K.J, Vanes A. The influence of growth regulators GA3, ABA, kinetin and IAA on sprout and root growth and plant development using excised potato buds // Potato Res., 1979. - V. 22. - P. 319-332.

147. Hasan M., Pauk J., Jankulosky L., Mihaly R., Toth-Lokos K., Falusi J. Comparison of in vitro androgenetic response and F1 seed production in wheat (Triticum aestivum L.) // Cer. Rec. Com., 2001. V. 29. - P. 297-305.

148. Hassavi D.S., Liang G.H. Antimitotic agents: effects on doubled haploid production in wheat// Crop Sci., 1991. - V. 31. - P. 723-726.

149. He D.G. and J. Oujang. Callus and plantlet formation from cultured wheat anthers at different developmental stages // Plant Sci. Letters. 1984. - V. 33. -P. 71-79.

150. He D.G., Tanner G., Scott K.J. Somatic embryogenesis and morphogenesis in callus derived from the epiblast of immature embryos of wheat (Triticum aestivum L.) // Plant Sci., 1986. V.45. - P. 119-124.

151. He P., Shen L., Lu S., Xhu L. Analysis of qualitative trait loci wich contribute to anther culturability in rice Orysa sativa L.) // Molecular Breed., 1998. - V.4. -P. 165-172.

152. Heberle-Bors E. and Reinert J. Isolated pollen cultures and pollen dimiorphism // Naturwissenschaften. 1980. - V. 67. - P. 311- 316.

153. Heberle-Bors E. and Reinert J. Environmental control and evidence for predetermination of pollen embryogenesis in Nicotiana tabacum L. pollen // Protoplasma. 1981. - V. 109. - P. 249-255.

154. Heberle-Bors E. On the time of embryogenic pollen grain induction during sexual development of Nicotiana tabacum L. plants // Planta. 1982. - V. 156. - P. 402-406.

155. Heberle-Bors E. In vitro haploid formation: a critical review I I Theor. Appl. Genet., 1985. - V. 71. - P. 361-374.

156. Heberle-Bors E. and Odenbach W. In vitro pollen embryogenesis and cytoplasmic male sterility in Triticum aestivum L. // Z. Pflanzenzucht., 1985. -V. 95.-P. 14-22.

157. Henry Y., Vain P., de Buyser J. Genetic analysis of in vitro plant tissue culture responses and regeneration capacities // Euphytica. 1994. - V. 79. - P. 45-58.

158. Higgins P. and Mathias R. The effect of 4B chromosome of hexaploid wheat on the growth and regeneraton of callus cultures // Theor. Appl. Genet., 1987. -V. 74. - P. 439-444.

159. Ho K.M. and Jones G.E. "Mingo" barley // Canad. J. Plant. Sci., 1980. - V. 60. - P. 279-280.

160. Horner M. and Street H.E. Pollen dimorphism origin and significance in pollen plant formatin by anther culture // Ann. Bot.( London). - 1978. - V.42. -P. 763-771.

161. Horner M. And Mott R.L. The frequency of embryogenic pollen grains is not increased by in vitro anther culture in Nicotiana tabacum L. // Planta. 1979. -V. 147.-P.156-158.

162. Hu Daofen,Yuan Thendong,Tang Yunlian, Lie Tianping. "Yinghua 1" a winter wheat variety derived from pollen sporophyte // Scientica Sinica. - 1986. - V. 29,-№7.-P. 733-745.

163. Hu Han. Genetic stability and variability of pollen-derived plants // Plant Cell Cult.Crop Improv.Proc. Int.Symp: Calcutta,6-10 Dec. 1981. - P.145-157.

164. Hu Han. Use of haploids in crop improvement // Biotecnology in international agricultural research: Int. Res. Rice Inst., 1985. - P. 75-84.

165. Hu Han. Wheat:improvement through anther culture // Biotechnology in agriculture and forestry. (Ed. By Y.P.S.Bajaj). Springer-Velag: Berlin -Heidelberg. 1986. - V. 2. - P. 55-71.

166. Hu Han and Bin Huang. Application of pollen derived plants to crop improvement // International Reviev of cytology. 1987. - V. 107. - P. 293-313.

167. Hu Han. Gametic analysis and gametoclonal variation in Triticeae // Biotechnology in agriculture and forestry (Wheat). Ed. by Y.P.S. Bajaj. 1990. -V.13.-P. 539-548.

168. Huang В., Sunderland N. Temperature-stress pretreatment in barley anther culture//Ann. Bot.,- 1982. -V. 49. P. 77-88.

169. Huang В., Dunwell J.M. The relative efficiency of microspore culture and chromosome elimination as methods of haploid production in barley // Z. Pflanzenzucht., 1984. - V.92. - № 1. - P. 22-29.

170. Huang. B. Wheat anther culture : effect of temperature // Biotechnology in agriculture and forestry (Wheat) (ed.by Y.P.S. Bajaj). Springer-Verlag: Berlin -New York Tokyo - Heidelberg. - 1990. -V.13. - P. 403-415.

171. Hunter. C.P. The effect of anther orientation on the production of microspore-derived embrioids and plants of Hordeum vulgare cv. Sabarlis // Plant Cell Reports. 1985. - V. 4. - P. 267-268.

172. Immonen S. Androgenetic green plants from winter rye of diversed origin // Plant Breed., 1999. - V. 118. - № 4. - P. 319-322

173. Idzikovska K., Ponitka L., Miodzianovski F. Pollen dimorphism and androgenesis in Hordeum vulgare // Acta Soc. Bot. Polon., 1982. - V.51. -№2. - P. 153-156.

174. Inagaki. M.N. Chromosome doubling of the wheat haploids obtained from crosses with Hordeum bulbosum L. // Jpn. J. Breed., 1985. - V. 35. - P. 193195

175. Inagaki. M.N. Variation in plant height of doubled haploid lines of wheat from intergeneric crosses with Hordeum bulbosum L. // Jpn. J. Breed., 1987. - V. 37.-№3.-P. 275-282.

176. Inagaki.M.N. Wheat haploids through the bulbosum technigue // Biotechnology in agriculture and forestry. Berlin New York - Tokyo. - 1990. -V. 13.-P. 448-459.

177. Inagaki M.N. Comparison of crossabilities of tetraploid wheat with Hordeum bulbosum and maize // Cereal Res. Com., 1995. - V. 25. - №4. - P. 339-343

178. Inagaki M.N and Mujeeb-Kazi A. Polyhaploid production in hexaploid wheat crosses with stored pearl millet pollen // 5th Int. Wheat Conference, June 10-14. 1996. Ankara/Turkey. - 1996. - P. 363.

179. Inagaki M.N., Nagamine T. and A. Mujeeb-Kazi. Use of pollen storage and detached -tiller culture in wheat polyhaploid production through wide crosses // Cereal. Res.Com., 1997. - V. 25. - №1. - P. 7-13.

180. Inagaki M.N. Production of wheat haploids using wide crosses and its application to breeding programs // Proseedings of the 9th Int. Wheat Genet. Symp. Saskatoon. Saskatchevan. Canada. 1998. - V.2. - P. 225-226 .

181. Islam A.K.M.R., Shepherd K.W. Wheat-barley addition lines: their use in ~ genetic and evolutionary studies of barley // Barley Genet., 1982. -V. 4. - P.729.739.

182. Jensen C.J. Barley monoploids and doubled monoploids // Applied and fundamental aspects of plant cell, tissue and organ culture ( Eds.Reinert J., Bajaj Y.P.S.) Berlin -Heidelberg- New York: Springer-Verlag. 1977. - P. 316-343.

183. Kao K.N., Horn D.C. Induction of pollen plant formation in barley anther culture // Int. Symp. on genetic manipulation in crops. Abstracts. Beijing. China. 1984.- P. 64.

184. Kasha K.S. Kao K.N. High freuqency haploid production in barley (Hordeum vulgare L.) // Nature. -1970. V. 225. - P. 874-876.

185. Kasha K. J. and Reinbergs E. Recent development in the production and application of haploid in barley // 4th Int. Barley Genet. Symp. Edinburgh University Press. ( ed. by Asher M.J. and Ellis P.P.). 1981. - P. 655-665.

186. Kasha K.J., Ни T.C., Simion E and Oro R. Cytological development of wheat microspores in culture // Proceeding of the 9th Int. Wheat Genet Symp. Saskatoon. Saskatchevan. Canada. 1998. - P.152-155.

187. Kaul B.L., Zutshi N. Dimethyl sulfoxide as an adjuvant of colchicine in the production of poliploid in crop plants // Indian J. Exp. Bot. Biol., 1971. - V.9. -P. 522-533

188. Keller E.R.,Schmidt J. Effect of a gametocide on the induction of haploids in Triticum aestivum // Gen. Manipulat. Plant. Breed. Proc. Int. Symp. Berlin (West), Sept. 8-13. 1985. Berlin-New York. 1986. - P. 347-349.

189. Kihara H.,Tsunewaki K.Use of an alien cytoplasm as a new method of producing haploids //Jpn.J.Genet., 1962. -V.37. - P. 310-313.

190. Knudsen S., Due J.K., Andersen S.B. Components of response in barley anther culture // Plant Breed., 1989. - V.103. - P. 241-246

191. Konzak C.F., Randolph L.E. and Ensen N.E. Embryo culture of barley species hybrids, cytological studies of Hordeun sativum x Hordeum bulbosum // J. Heredity.- 1951.- V. 42. P.124-134.

192. Kruger H. Zytologische Charakterisierung androgenetischer Entwicklungsphasen bei Weizen // Arch.Zuchtungsforsch., Berlin. - 1987. -B. 5.- S. 297-307.

193. Kruger H. Ein Beitrag zum Ferlauf der Androgenese bei Weizen (Triticum aestivum L.) // Archiv Zuchtungsforsch., 1988. - B. 3. - S .133-138.

194. Kruse A. An in vitro embryo culture technique // Hereditas. 1974. - V. 77. -P. 157-161

195. Kuckuck H. Artkreuzungen by Gerste // Zuchter. Berlin. 1934. - B. 6. - S. 270-271.

196. Kuhlman U. and Forougi-Wehr B. Production of doubled haploid lines in freguences sufficient for barley breeding programs // Plant Cell Reports. 1989. -8.-P. 78-81.

197. Kusmenko A.I., Djatchouk T.I. Saratovskaya 64, a new spring wheat variety created by combining conventional and haploid breeding. // Ann. Wheat Newslet., KSU(USA) -V. 199. P.202-203.

198. Lange W. Crosses between Hordeum vulgare L. and H. bulbosum L. Elimination of chromosomes in hybrid tissues // Euphitica. 1971. - V. 20. - P. 181-194.

199. Laurie D.A., Bennet M.D. Cytological evidence for fertilization in hexaploid wheat x sorghum crosses // Plant Breed., 1988. - V. 100. - P. 73-82.

200. Laurie D.A. The production of haploid wheat plants from wheat x maize crosses // Theor. Appl. Genet., 1988. - V. 76. - №3. - P. 393-397.

201. Laurie D.A. Factors affecting fertilization frequency in crosses of Triticum aestivum c.v. Highbury x Zea mays cv. Seneca 60 // Plant Breed., 1989. - V. 103.- P.133-140.

202. Laurie D.A., Bennet M.D. The timing of chromosome elimination in hexaploid wheat x maize crosses // Genome. 1989. - V. 32. - №6. - P. 953-961.

203. Laurie D.A. The frequency of fertilization in wheat x pearl millet crosses // Genome.- 1989. V. 32. - № 6. - P. 1063-1067.

204. Lazar M.D., Baenziger P.S. and Schaeffer G.W. Combining abilities and heritability of callus formation and plantlet regeneration in wheat (Triticum aestivum) anther culture // Tlieor. Appl. Genet., 1984a. - V. 68. - P. 131-134.

205. Lazar M.D., Schaeffer G.W., Baenzieger P.S. Cultivar and cultivar x environment effects on the development of callus and polyhaploid plants from anther cultures of wheat // Theor. Appl. Genet., -1984b. V. 67. - P. 273-277.

206. Lazar M.D., Chen Т.Н., Scooles G.J., Kharta K.K. Immature embryo and anther culture of chromosome eddition lines of rye in Chinese Cpring wheat // Plant Sci., 1987. - V. 51. - P.77-81.

207. Lei Z.S., Zhou Y., He X.C., Lin Z.J., Zhang S.C.,Yang H.M., Huang B.Y., Lai Q.R. Efficient wheat haploid production by wheat x maize // 5th Int. Wheat Conference. June 10-14. 1996. Ankara. Turkey. - 1996. - P. 374.

208. Leike H. Bedeutung der haploiden fur die Pflanzenzuchtung // Akademie der landwirtschaft DDR. 1985. -№ 5. - 52 S.

209. Lettre J.J., Kelly S.L., Kasha K.J. Wheat anther culture using liguid media // Biotechnology in agriculture and forestry (ed. Bajaj Y.P.S.) (Wheat). Springer -Verlag. Berlin -New York Tokyo - Heidelberg. - 1990. -V. 13. - P. 416423.

210. Li D.W., He Z.Y., Hu O.D. The crossability of Triticum aestivum with tetraploid Hordeum bulbosum // Annu. Rep. Inst. Genet. Acad. Sinica. 1981. -1982,- P. 136-138.

211. Liang G.H., Xu H.-T. Direct generation of wheat haploids via anther culture // Crop Sci., 1987. - V. 27. - P. 336-339.

212. Loo S.W. and Xu Z.H. Rice anther culture for rice improvement in China // Biotechnology in agriculture and forestry (ed. Bajaj Y.P.S.). Springer Verlag Berlin Heidelberg. - 1986. - Crops 1. - P 139-156.

213. Lorenz I. Ergebnisse zur Induction der androgenetischer Entwicklung in Winterroggenantheren // Arch. Zuchtungforch., Berlin. - 1989. - B. 19. - 6. -S. 415-420.

214. Lorz H., Gobel E., Brown P. Advances in tissue culture and progress towards genetic transformation of cereals // Plant Breed., 1988. - V. 100. - P. 1-25.

215. Lyne R.L., Bennet R.I., Hunter C.P. Embryoid and plant production from cultured barley anthers // Plant tissue culture and its agricultural applications (ed. Alderson P.G.) Butterworth. London. - 1984. - P. 405-411.

216. Maheshvaari S. C., Tyagi A.K. and Malhotra K. Induction of haploidy from pollen grains in angiosperms the current status // Theor. Appl. Genet., - 1980. -P. 193-206.

217. Maheshvari S.C., Rashid A.K. and Tyagi A.K. Haploids from pollen grains -retrospect and prospect // Amer.J. Bot., 1982. - V. 69. - №5. - P. 865-879.

218. Marburger J.E., Sammons D.J and Schaeffer G.W. Effect of modified potato medium on anther culture of wheat // Crop. Sci., 1987. - V. 27. - № 2. - P. 351-354.

219. Marsolais A.A., Kasha K.J. Callus induction from barley microspores.The role of sucrose and auxin in a barley anther culture medium // Can. J. Bot., 1985. -V. 63.- P. 2209-2212.

220. Mathias R.J., Fikui K. The effect of specific chromosome and cytoplasmic substitutions on the tissue culture response of wheat (Triticum aestivum L.) callus // Theor. Appl. Genet., 1986. - V. 71. - P. 797-800.

221. Mathias R.J., Higgins P., Atkinson E. Genetic control of wheat (Triticum aestivum) tissue culture response // Pros. 7th Int. Wheat Genet. Symp., Cambridge, (eds. Miller T.E and Koebner R.M.D.). 1988. - P. 763-768.

222. Mathias R.J, Boyd L.A. The growth in culture of detached ovaries of wheat (Triticum aestivum L.) // Plant Breed., 1988. - V. 100. - P.143-146.

223. Mathias R.J., Atkinson E. In vitro expression of genes affecting whole plant phenotype the effect of Rht /Gai alleles on the callus culture response of wheat (Triticum aestivum L.) // Theor. Appl. Genet., - 1988. - V. 75. - P. 474-479.

224. Mcintosh R.A., Hart G.E., Devous K.M., Gale M.D., Rogers W.J. Catalogue of gene symbols for wheat // Proc. of the 9th Int. Wheat Genet. Syinp. Canada. Saskatoon, Sask., 1998. - V.5. - 236 p.

225. Miao S., Kuo C, Sun A., Ku S., Lu W., Wang Y., Chen M., Wu M. Induction of pollen plants of maize and observation of their progeny // Tissue Culture: Science Press. Peking. 1978. -P. 23-33.

226. Miao S.H. Effect on NH4 on emryoid generation from pollens of maize. // Acta Bot. Sinica, 1980. - V. 22. - № 4. - P. 356-359.

227. Moieni A. and Sarrafi S. Genetic improvement of androgenetic haploid formation in hexaploid wheat // Cereal Reserch Com., 1997. - V. 25. - P. 232234

228. Moieni A. and Sarrafi S. Haploid regeneration by anther culture and its relationship to agronomic traits in the parents and progeny pure lines of a composite cross of hexaploid wheat // Cereal Reserch Com., -1998. V. 26. -P. 127-135.

229. Moraes-Fernand M. and Picard E. Variability of haploid production by anther culture using brasilian wheat genotypes // Rev. Bras. Genet., 1983. - V.6. - № 2.-P. 261-267.

230. Mujeeb-Kazi A., S. Cano, V. Rosas, R. Delgado. Maize mediated haploid production in bread wheat: current status, constraints and modifications // Ann. Wheat Newslet., KSU (USA).- 2001. V. 47. - P. 116-117.

231. Mukai Y., Nakanishi S. Genetic mechanism of parthenogenesis in common wheat with an alien cytoplasm // Jpn. J. Genet., 1982. - V. 57. - P. 665-669.

232. Muller G, Bohme Т., Borschel H, Vahl U. and Wiberg A. Die Nutzung der Antherenkulturmethode im Zuchtprozes von Winterweizen // Plant Breed., -1990,-V. 104.-P. 272-276.

233. Murigneux A., Bentolila S., Hardy Т., Baud S., Giutton C., Juiien H., Ben Tachar S., Freyssinet G. and Beckert M. Genotypic variation of quantitative trait loci controlling in vitro androgenesis in maize // Genome. 1994. - V. 37. - P. 970-976.

234. Nitch J.P. Pollen culture a new technigue for mass production of haploid and homozygous plants // Haploids in higher plants. Advances and potential (Ed. by Kasha K.J.): The University of Guelph. - 1974. - P. 123-135.

235. Orlikowska T. Induction of androgenesis in vitro in Secale cereale and Triticale // Genet. Pol., 1977. - V. 18. - P. 51-59.

236. Orshinsky В., McGregor L., Johnson I., Hucle P., Kartha K. Improved embryoid induction and green shoot regeneration from wheat anthers cultured in medium with maltose // Plant Cell Reports. 1990. - V. 9. - P. 365-369.

237. Ouyang S., Zhou M and Jia S.E. The response of anther culture to culture temperature in Triticum aestivum.L. // Theor. Appl. Genet., 1983. - V. 66. - P. 101-109.

238. Ouyang Junwen. Induction of pollen plant in Triticum aestivum L. // Haploids in higher plants in vitro. China Academic publishers. Beiying.Springer Verlag. Berlin Heidelberg - New York - Tokyo. - 1986. - P. 26-41.

239. Ouyang J., Ни H., Chang C., Tseng S. Induction of pollen plants from anthers of Triticum aestivum cultured in vitro II Sci.Sinica,. 1973. - 16. - P. 79-95.

240. Pace G.M., Reed J.N, Ho L.C and Fahey J.W. Anther culture of maize and visualization of embryogenic microspores by fluorescent microscopy // Theor Appl. Genet., 1987. - V. 73. - P. 863-869 .

241. Pan J., Gao G.and Ban H. Initial patterns of androgenesis in wheat anther culture. // Acta Bot. Sin., 1983. - V. 25. - P. 34-39.

242. Pauk. J Breeding with half the genes : GK "Delibab" released, patented and GK "Ambitus" patented new winter wheat varieties // Ann.Wheat Newslet., KSU (USA). 1996.-V. 42.-P.159.

243. Peterka H. Die Bedeutung der Haploiden-methode flir Sommergerstenzuchtung. Nutzung biotechnologisher Methoden in der Pflanzenzuchtung // Ein Tagungsbericht Akademie der Landwirtsch.DDR. -1987. S.85-98.

244. Picard E., Hours C., Gregoire S. Significant improvement of androgenetic haploid and doubled haploid induction from wheat plants treated with a chemical hybridization agent // Theor. Appl. Genet., -1987. V. 74. - №3. - P.289-297.

245. Picard E., Touraine P., Ambroise A. and de Buyser J. Chlorophyillian, anthocyanic and albinos Triticum durum plants derived from isolated microsporeculture. Proc. of the 9th Int. Wheat Genet. Symp. Saskatoon. Saskatchevan. -1998.-V. 3.-P. 44-45.

246. Pickering R.A. The location of a gene for incompatibility in crosses between Hordeum vulgare L. and Hordeum bulbosum L. // Heredity. 1983. - V. 51. - P. 455-459.

247. Pickering R.A. The influence of genotype on doubled haploid barley * production // Euphytica. 1983. -V. 32. -№3. - P. 863-876.

248. Pickering R.A. Crossability relationships between species in Hordeae^// Barley Genet. Newslet., 1984. - V. 14. - P. 14-17.

249. Raghavan V. Role of the generative cell in androgenesis in herbane // Science. 1976. - V.191. - P. 388-389.

250. Raghavan V. Origin and development of pollen and pollen calluses in cultured anthers segments of Hyoscyamus niger (Henbane) // Amer. J. Bot., 1978. - V. 65.-№9.-P. 984-1002.

251. Raghavan V. Pollen developmemt biology in cultured anthers // Cell culture and somatic genetic of plants. Academic Press. -1986. V. 3. - P. 275-304.

252. Raghavan V. Variability through wide crosses and embryo rescue // Cell culture and somatic genetic of plants. Academic Press. -1986. V. 3. - P. 613633.

253. Rahgavan V. Developmental stages of the angiosperm pollen: a biochemical perspective // Cell Differentiation. 1987. - V. 21. - P. 213-226.

254. Raquin C. Utilization of different sugars of carbon sourses for in vitro anther culture of Petunia // Z. Pflanzenphysiol., 1983. - P. 453-457.

255. Rashid A. Pollen dimorphism in relation to pollen plant formation // Physiol. Plant., 1983. - V. 58. - P. 544-548.

256. Rashid A. Angiosperm pollen a system for cell differentiation // Curr. Sci. (India), - 1983. -V. 52. - P. 964-967.

257. Riley R., Chapman V. The inheritance in wheat of crossability with rye // Genet. Res., 1967. - V. 9. - P. 259-267.

258. Rines H.W. Oat anther culture genotype effects on callus initiation and production of a haploid plant // Crop Sci., - 1983. - V. 23. - P. 268-271.

259. Sadasivaiah R.S., Orshinsky B.R., Pecovic S.M., Beres B.L. Colchicine-induced chromosome doubling in wheat haploids // Wheat Information Service. -2001.-№93.-P. 1-4.

260. Sangwan-Norreel B.S. Male gametophyte nuclear DNA content evolution during androgenetic induction in Datura inrioxia Mill. // Z. Pflanzenphysiology, -1983.-V. 111.-P. 47-54.

261. Schooler A.B. Interspecific Hybrids in Hordeum // Barley Newslet., -1963. -V. 6. -P. 47-48.

262. Schumann G. Zytologish-histologishe Untersuchungen in Triticale antheren culture // Arch. Zuchtungsforsh., (Berlin). -1987. -V. 17. -S. 17-25.

263. Schumann G. Zur Morphologie und Entwicklung androgenetisher Makrostnikturen in Antherenkulturen von Triticale // Arch. Zuchtungforsh., (Berlin). 1987. -V. 17. - S. 245-257.

264. Schumann G. In vitro haploid production in Triticale // Biotechnology in agriculture and forestry. V. 13. Wheat (ed. Bajaj P.S.). Springer-Verlag: Berlin -Heidelberg. 1990.-P. 383-401.

265. Schumann G. Untersuchungen zum Albinismus in Antherenkulturen von Triticale // Arch. Zuchtungsforsch., Berlin. - 1988. - V. 18. - B.2. - S. 115122.

266. Sliimada T. Haploid plants regenerated from the pollen callus of wheat (Triticum aestivum L.)//Jap. J. Genet., 1981. - V. 56. - 6. - P. 581-588.

267. Sibikeeva Ju.E., Sibikeev S.N. Genetic analysis of anther culture response in wheat carrying alien translocations // Theor. Appl. Genet., 1996. - V. 92. - P. 782-785.

268. Simpson E., Snape J.W. and Finch R.A. Variation between Hordeum bulbosum genotypes in their ability to produce haploids in barley (Hordeum vulgare L.) // Z. Pflanzenzucht., 1980. - V. 85. - S. 205-211.

269. Singh N., Behl R.K., M.S. Punia. Production of double haploids via maize pollination in wheat // Cer. Res. Com., 2001. - V. 29. - P. 289-296

270. Snape J.W. A theoretical comparison of diploidized haploid and single seed descent populations // Heredity. 1976. - V. 36. - P. 275-277.

271. Snape J.W., Chapman V., Moss J., Blandchard C.E., Mitter Т.Е. The crossabilities of wheat varieties with Hordeum bulbosum // Heredity. 1979. -V. 42. - P. 292-298.

272. Sorvari S. The effect of starch gelatinized nutrient media in barley anther cultures // Annales Agr. Fenniae. 1986a. - V. 25. - P. 127-133.

273. Sorvari S. Comparison of anther cultures of barley cultivars in barley starch and agar gelatinized media // Annales Agr. Fenniae. 1986b. - V. 25. - P. 249254.

274. Sorvari S. and Schieder Q. Influence of sucrose and melibiose on barley anther cultures in starch media // Plant Breed., 1987. - V. 99. - P. 164-171.

275. Subrahmanyam N.C Haploidy from interspecific crosses. 1. Polyhaploids of H.parodii and H.procerum // Theor. Appl. Genet., 1977. - V. 49. - P. 209-217.

276. Subrahmanyam N.C. Haploidy from interspecific crosses. 2. Dihaploids of H. brachyantherum and H.depressum // Theor. Appl. Genet., 1979. - V. 55. - P. 139-144.

277. Subrahmanyam N.C. Haploidy from interspecific crosses. 3. Trihaploids of H. arisonicum and H. lechleri // Theor. Appl. Genet., 1980. - V. 56. - P. 257-263.

278. Sun C., Wang С and Chu C. Cell division and differentiation of pollen grains Triticale antheres cultured in vitro II Sci. Sin., 1974. - V. 17. - P. .47-54.

279. Sun C. Androgenesis of cereal crops // Plant Tissue Culture: Science press: -Pekng. 1978. - P. 117-123.

280. Sunderland N., Wicks F.N, Embryiod formation in pollen grains of Nicotiana tabacum //J. Exp. Bot,. 1971. - V. 22. - P. 213-226.

281. Sunderland N., Roberts M. Cold pretreatment of excised flower buds in float culture of tobacco anthers // Ann. Bot., 1979. -V. 43. - P. 405-414.

282. Sunderland N., Evans L. Multicellular pollen formation in cultured barley anthers//J. Exp. Bot., 1980. - V. 31. - P. 501-514.

283. Sunderland N.,Huang В., Hills B. Disposition of pollen in situ and its relevance to anther pollen culture // J. Exp. Bot., 1984. - V. 35. - P. 521-530.

284. Sunderland N., Huang B. Barley anther culture the switch program and albinism //Hereditas. - 1985. -№ 3. - P. 27-40.

285. Sungwan R.S., Sangwan-Norreel. Biochemical cytology of pollen embryogenesis // Int. Rev. Cytol., 1987. - V. 107. - P. 221-272.

286. Szigat G. Abtbastardierung by Gerste // Tag. Ber. Akad. Landwirtschaft DDR. Berlin,. 1984. - V. 225. - S. 201-207.

287. Szigat G., Pohler W. Hordeum bulbosum x Hordeum vulgare hybrids and their baccrosses with cultivated barley // Cereal Res.Commun., 1982. - Szeget. -V.10. -№1.-P. 73-78.

288. Thomas H.M. and Pickering R.A. The influence of parental genotype on the chromosome behaviour of Hordeum vulgare x Hordeum bulbosum diploid hybrids // Theor. Appl. Genet., 1985. - V. 71. - P. 437-442.

289. Thiebaut J., Kasha K.J., Tsay A. Influence of plant development stage, temperature and plant hormones on chromosome doubling of barley haploids using colchicine // Can. J. Bot., 1979. - V. 57. - P. 480-483

290. Torp A.M., Hansen A.L., Holm I.B. and Andersen S.B. Genetic markers for haploid formation in wheat anther culture // Proc. of the 9th Int. Wheat Genet. Symp., Saskatoon. Sask.,Canada. 1998. - V. 3. - P. 159-161.

291. Tsay S.S., Tsay H.S., Chao C.Y. Cytochemical studies of callus development from microspore in cultured antheres of rice // Plant Cell Reports. 1986. - V. 5.-№2.-P. 119-123.

292. Tsunewaki K. Genetic studies of a 6-x derivate from an 8-x Triticale // Canad. J. Cytology. 1964. - V. 6. - P. 1-11.

293. Tsunewaki K., Noda K., Fujisava T. Haploid and twin formation in a wheat strain Salmon with alien cytoplasms // Cytologia. 1968. - V. 33. - P. 526-538.

294. Tsunewaki K., Tsujimoto H. Genetic diversity of the cytoplasm in Triticum and Aegilops // Proc. of the 6th Int .Genet. Symp., Kyoto. - 1983. - P. 1139-1144.

295. Tsunewaki К and Mukai Y. Wheat haploids through Salmon method // Biotechnology in agriculture and forestry (ed. Bajaj Y.P.S.). Springer Verlag: Berlin Heidelberg. -1990. - V. 13. - P. 460-477.

296. Wan Y., Petolino J.F. and Widholm J.M. Efficient production of doubled haploid plants through colchicine treatment on anther derived callus // Theor. Appl. Genet., -1989. V. 77. - P. 889-892.

297. Wan Y., Rayburn A.L., Petolino J.F and Widholm J.M. The use of antimicriotubule herbicides for the production of doudled haploid plants from anther-derived callus // Theor. Appl. Genet., 1991. - V. 81. - P. 205-211.

298. Wang C.C., Sun S., Chu C. Effects of culture factors in vitro on the production of albino pollen-plantlets of rice // Acta Bot. Sinica, 1977. - V. 19. - P. 190-199.

299. Wang C.C., Kuang B.J. Induction of haploid plants from the female gametophyte of Hordeum vulgare L. // Acta Bot. Sinica. 1981. - V. 23. - P. 329-330.

300. Wei X.L., Cao H.L., Hu Q.D. Studies on the process of fertilization and the development of haploid embryos and endosperms of Triticum aestivum aftercrossing with tetraploid Hordeum bulbosum // Acta Genet. Sinica. 1985. - V. 12.-P. 275-280.

301. Wenzel G., Hoffmann F., Potrykus I., Thomas E. The separation of viable rye microspores from mixed populations and their development on culture // Molec. Genet., 1975. - № 138. - P. 293-297.

302. Wiliams E.G. and de Lautour G. The use of embryo culture with transplanted nurse endosperm for the production of interspecific hybrids in pasture legumes // Bot. Gaz. Chikago. 1980. -V. 141. - P. 252-257.

303. Winzeler H., Schmid J. and P.M. Fried. Field performance of androgenetic doubled haploid spring wheat lines in comparison with lines selected by the pedigree system // Plant Breeding. 1987. -V. 99. - P. 41-48.

304. Xu Jie and Snape J.W. The cytology of hybrids between Hordeum vulgare and H. bulbosum revisited // Genome. 1987. - V. 30. - P. 486-494.

305. Xu Z.H., Huang B. Anther factors(s) in barley anther culture //Acta Bot. Sinica. -1984. -V. 26. -№1. P. 1-10.

306. Xynias I.N., Zamani I.A., Goul-Vavdinoudi E., Roupakias. Effect of cold pretreatment and incubation temperatute on bread wheat (Triticum aestivum L.) anther culture // Cer. Res. Com. 2001. - V. 29. - №3 . - P. 331-338.

307. Yamomoto K., Miura H. Influence of the semidwarf genes Rhtl and Rht2 upon embryoid induction from anther culture of wheat // Wheat Inform. Serv., 1995. - V. 81.-P. 6-12.

308. Yang H., Zhou C. In vitro induction of haploid plants from unpollinated ovaries and ovules // Theor. Appl. Genet., 1982. - V. 63. - P. 97-104.

309. Zhou J. Pollen dimorphism and its relation to the formation of pollen embryos in anther culture of wheat (Triticum aestivum L.) // Acta Bot. Sin:, 1980. - V. 22.-P. 117-121.

310. Zhou С and Yang H. Anther culture and androgenesis of Hordeum vulgare L. // Acta Bot. Sin., 1980. - V. 22. - P. 211-215.4

311. Zhou C.,Yang H. Induction of haploid rice plantlets by ovary culture // Plant Sciense Letters. 1981. -V. 20.-P. 231-237.

312. Zenkteler M., Straub J. Cytoembryological studies on the process of fertilization and the development of haploid embryos of Triticum aestivum L.(2n=42) after crossing with Hordem bulbosum (2n=14) // Z. Pflanzenzucht., -1979,-V. 82.-P. 36-44.

313. Zhu Z.C., Wu H.S. Induction of haploid plants from unpollinated ovaries of Triticum aestivum cultured in vitro II Acta Genet. Sinica, 1981. - V.8. -P.386-390.

314. Zhuang J.J., Jia X. Studies the differentiation of pollen calli of wheat // Ann. Rep. Inst. Genet. Acad. Sin., 1980. - P. 70-71.