Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

ПРОЛИФЕРАТИВНЫЙ АНТИГЕН ИНИЦИАЛЕЙ В ИССЛЕДОВАНИИ МОРФОГЕНЕТИЧЕСКИХ ПРОЦЕССОВ В КУЛЬТУРЕ IN VITRO ПШЕНИЦЫ

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "ПРОЛИФЕРАТИВНЫЙ АНТИГЕН ИНИЦИАЛЕЙ В ИССЛЕДОВАНИИ МОРФОГЕНЕТИЧЕСКИХ ПРОЦЕССОВ В КУЛЬТУРЕ IN VITRO ПШЕНИЦЫ"



На правах рукописи yaf

ФАДЕЕВА Ирина Юрьевна

ПРОЛИФЕРАТИВНЫЙ АНТИГЕН ИНИЦИАЛЕЙ В ИССЛЕДОВАНИИ МОРФОГЕНЕТИЧЕСКИХ ПРОЦЕССОВ В КУЛЬТУРЕ IN VITRO ПШЕНИЦЫ

03.00.04 - биохимия 03.00.23 - биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Саратов - 2007

Работа выполнена в Институт« биохимии н физиологии растений и микроорганизмов Российской академии наук (ИБФРМ РАН)

Научные руководители: доктор химических наук,

профессор Щёголев С.Ю, кандидат биологических наук Евсеева Н.В.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук Антонюк JJ.il.

доктор биологических наук Бебякин В.М.

Защита состоится «30» мая 2007 г. в 13.00 на заседании диссертационного совета Д 002.146.01 при Институте биохимии и физиологии растений и микроорганизме» Российской академии наук <410049, г. Саратов, просп. Энтузиастов, 13).

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ИБФРМ РАН. Автореферат диссертации размещен на сайте http ://www. ibppm .saratov.ru/obyav_dis .html

Автореферат разослан апреля 2007 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

Ведущая организация: Московский государственный университет им.

М.В. Ломоносова, г. Москва

доктор биологических наук

ВВЕДЕНИЕ

РГАУ-МСХА имени К. А. Тимирязева ЦНБ км?нн H.H. Железнова Фонд научный литературы

Актуальность темы. Молекулы белков и /щ! ми в изучении морфо генетических процессов растений из молекулярном и клеточном уровнях. Результаты этих исследований представляют большой интерес не только для развития фундаментальной науки, ко и для биотехнологии, создавая основу для совершенствования селекционного процесса с использованием современных клеточных технологий. Исследования подобного рода на уровне целого растения затруднены интегральным характером морфогенегтических процессов и зависимостью их от многих внутренних и внешних факторов (Бу-тенко, J 999; Батыгнна, 1999).

Изолированные культуры органов, тканей и клеток, помещенные в контролируемые условия (минеральное питание, температура, освещенность и экзогенные гормональные добавки), являются удобными моделями для изучения морфоге нети чес ки х процессов у растений. В частности, принципиально важным моментом в исследованиях соматического эмбриогенеза является анализ самых ранних его этапов, когда отдельные клетки в каллусной массе или суспензии приобретают способность развиваться в эмбриоид. Прежде всего, представляют интерес сигналы и индукторы этого процесса, заставляющие недифференцированную клетку in vitro переключаться на определенный путь развития (Бутенко, 1999; Лутова, 2003).

Выяснение молекулярных основ морфогенеза растений привлекает внимание довольно большого числа исследователей. Особое внимание уделяется, например, генам-переключателям развития (Хавкии, 1998; Smith et al., 2004; Sablow-ski, 2007) и продуктам их экспрессии (Карабаев и Джардемалиев, 1994; Bommert et al., 2005; Cole et al., 2006), которым отводится основная роль в пространственно-временной регуляции процессов морфогенеза. Несмотря на это, еще недостаточно изученными остаются гены, контролирующие наиболее общие процессы деления и последующей дифференциации клеток (Reddy and Meyerowitz, 2005; Dewitte and Murray, 2003). Именно они определяют судьбу индивидуальной клетки: продолжать ли ей делиться или переходить к растяжению и дифференциации.

Кроме того, закономерности морфогенеза, установленные для конкретного генотипа в полевых экспериментах in vivo, могут значительно измениться при культивировании эксплантов в культуре in vitro (Батыгина, 1999; Соболева и Логинов, 2004). Учитывая, что решение задач повышения эффективности морфогенеза имеет большое значение для развития соответствующих биотехнологий с использованием методов клеточной селекции растений, представляется актуальным сравнительный анализ особенностей протекания соответствующих процессов, происходящих in vivo и in vitro. Их решению может способствовать выявление надежных биохимических и/или морфологических маркеров, оора-жающих общие закономерности развития растений в условиях in vivo и in vitro и позволяющих отбирать генотипы с высоким морфогенетическим потенциалом.

К началу наших работ по данной теме в исследованиях, начатых в группе

иммунохимии растительных клеток ИФР РАН (г. Москва) под руководством А.Д. Володарского и продолженных совместно в Лаборатории физической химии клеточных структур ИБФРМ РАН, был выявлен молекулярный маркер меристем этических клеток пшеницы, названный пролиферативным антигеном инициалей (ПАИ). Разработаны теоретические и экспериментальные основы технологии создания иммунодиагностикума к ПАИ и исследовано его распределение в тканях и органах растения. Установлена целесообразность использования ПАИ в качестве белкового маркера меристематических клеток пшеницы для оценки селекционного растительного материала на устойчивость к действию неблагоприятных факторов внешней среды (Володарский с соавт., 1996; Евсеева с соавт., 2004; Evseeva et ai, 2004).

Целью настоящей работы было изучение субклеточной локализации ПАИ с использованием усовершенствованной иммунохимической тест-системы, анализ гомологичности антигенных детерминант ПАИ соответствующим структурам белков растений других таксономических групп и оценка его информативности в качестве молекулярного маркера меристематических клеток в исследованиях морфогенетических процессов в культуре in vitro пшеницы.

В ходе исследования решали следующие задачи: ]. Усовершенствовать методику получения и очистки моноспецифических антител к ПАИ.

2. Исследовать субклеточную локализацию ПАИ с использованием усовершенствованной иммунохимической тест-системы,

3. Оценить нммунохимнческую гомологию ПАИ цитоплазматическим белкам меристем растений различных таксономических групп.

4. Исследовать динамику содержания ПАИ в соматических каллусах почти изогенных линий пшеницы, альтернативных по генам короткостебельио-сти Rht, в процессе каллусогенеза и вторичной дифференциации.

5. Провести сравнительный анализ содержания ПАИ в меристематических зонах in vivo и каллусных клетках in vilro почти изогенных линий пшеницы, альтернативных по ряду генов короткостебельности Rht.

Научная новизна работы. Впервые проведено исследование внутриклеточной локализации ПАИ. Показано, что ПАИ является цитозольным белком. Впервые обнаружена иммунохимическая гомология ПАИ цитоплазмати чески м белкам растений различных таксономических групп. Выявлена общая закономерность динамики содержания ПАИ в процессе каллусогенеза и вторичной дифференциации в культуре in vitro на генетической модели, включающей 7 генотипов яровой мягкой пшеницы. На примере трёх генов короткостебел ьности RhtBlc, Rht¡4 и RhtBíb показано их влияние на содержание ПАИ в каллусных клетках пшеницы. Впервые установлено, что содержание ПАИ в меристематических клетках узлов кущения почти изогенных линий пшеницы in vivo в целом отражает морфогенетический потенциал соматических каллусов тех же линий в культуре in vitro. Впервые показано, что уровень содержания ПАИ в каллусных клетках пшеницы позволяет оценить их морфогенетическую способность на более ранних этапах по сравнению с морфометрическнм анализом.

Научно-практическая значимость. Полученные результаты позволяют рекомендовать ПАИ для исследований морфогенетических процессов в растениях, что открывает перспективу его использования в соответствующих отраслях агробиотехнологии в качестве дополнительного критерия морфогенети ческой способности тестируемых линий пшеницы в селекционной работе.

Кроме того, предложенная нами стратегия получения высокоспецифических поликлональных антител может быть использована в иммунохимических исследованиях белков эукариотических и п рокариотических клеток.

Результаты работы используются в учебном процессе при подготовке курсовых и дипломных работ студентов в Саратовском государственном университете им. Н.Г.Чернышевского и в Саратовском государственном аграрном университете им. Н Л .Вавилова.

Апробация работы. Материалы исследований, изложенные в диссертации, были представлены на 9-й Международной ПущинскоЙ школе-конференции молодых ученых «Биология — наука 21 века» (Пушино, Россия, 2005), на 4-Й Всероссийской конференции молодых ученых «Современные проблемы теоретической и экспериментальной химии» (Саратов, Россия, 2003), на Всероссийской конференции «Молекулярные механизмы взаимодействия микроорганизмов и растений: фундаментальные и прикладные аспекты» (Саратов, Россия, 2005), на Всероссийской конференции «Стрессовые белки растений» (Иркутск, Россия, 2004), на международной конференции «Физиология растений - основа фитобиотехнологии» (Пенза, Россия, 2003), на межрегиональной конференции молодых ученых и специалистов системы АПК Приволжского федерального округа «Вавиловские чтения — 2003» (Саратов, Россия, 2003), на Всероссийских конференциях «Вавиловские чтения - 2004, - 2005, - 2006» (Саратов, Россия, 2004 - 2006).

Диссертация обсуждена и одобрена на расширенном заседании лаборатории физической химии клеточных структур ИБФРМ РАН.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 14 работ, в том числе 2 статьи в отечественных рецензируемых научных изданиях.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту.

1. ПАИ выявляется только в цитозоле меристемагических клеток пшеницы и не обнаружен в ядрах, хлоро пластах, митохондриях, плазмалемме и мембранных фракциях ряда клеточных органелл.

2. Цнтоплазматические белки ржи, сорго, подсолнечника и вольфни содержат антигенные детерминанты, гомологичные детерминантам ПАИ.

3. Гены короткостебельности RhtBlc, RhtI4 и RhtBlb оказывают влияние на динамику содержания ПАИ в процессе каллусогенеза и вторичной дифференциации соматических каллусов почти изогенных линий пшеницы, альтернативных по этим генам.

4. Содержание ПАИ в меристематических клетках узлов кущения почти изогенных линий пшеницы в палевых экспериментах in vivo в целом отражает морфогенетическую способность каллусной ткани тех же линий в культуре in vitro.

5. Определение содержания ПЛИ в соматических каллусах пшеницы позволяет оценить их морфоге нети чес кую способность на более ранних этапах по сравнению с морфометрнческнм анализом, что открывает перспективу его использования в агробиотехиологии в качестве дополнительного критерия в селекционной работе.

Объем м структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, изложения полученных результатов и их обсуждения, заключения, выводов к списка цитируемой литературы, содержащего 292 источника, в том числе —219 зарубежных. Работа изложена на 119 страницах машинописного текста, содержит 30 рисунков.

Работа выполнена в лаборатории физической химии клеточных структур ИБФРМ РАН в соответствии с плановой темой НИР «Разработка эффективных тест-систем к антигенным структурам клеток микроорганизмов и растений» {№ гос. регистрации 01890017743). Научный руководитель — зав. лаб., д.х.н., про* фессор С.Ю. Щеголе в.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ Материалы н методы исследования

Для исследования морфогенетичсских процессов в культуре in vitro был использован сорт мягкой яровой пшеницы Саратовская 29 < Triticum aestivum L.) и набор его почти изогенных линий, альтернативных по генам короткостебельно-сти RhlBlc, RhlN, RktBíb. Изогенные линии были получены Ю.В. Лобачевым методом возвратных скрещиваний (Лобачев, 2000). Сестринские почти изогенные линии были на 99.2 % идентичны сорту-реципиенту Саратовская 29.

Для исследования иммунохимиической гомолога и цито плазматических белков были использованы растения пшеницы {Triticum aestivum L., сорта Саратовская 29), озимой ржи (Seeale cereale L-, сорта Саратовская 7), сорго {Sorghum bicolor L., сорта Желтозерное 10), подсолнечника {Helianthus annuus L., сорта Скороспелый 87) и водной культуры вольфии бескорневой {ÍVolffia arrhiza (L.) Hork. ex Wimmer) из семейства рясковых (Lemnaceae).

Выделение суммарной водорастворимой фракции мернстематических белков растений. Водорастворимые фракции цитоплазматических белков экстрагировали из этиолированных пятисуточных проростков пшеницы, ржи, сорго, подсолнечника и водной культуры вольфии в буфере следующего состава: 0,05 М трис-HCI, pH 7.8; 0.02 М ß-меркаптготанол; 0.001 М PMSF (Phemlmetil-sulfanylfluorid). Соотношение навески растительного материала (г) и объема среды выделения (мл) составляло 1:5. Гомогенат центрифугировали при 20000 g 30 мин. Супернатант обрабатывали насыщенным раствором сульфата аммония до конечной концентрации 80 %. Осанок использовали для исследований.

Экстрагирование белков из узлов кущения и из каллусной ткани пшеницы проводили в том же буфере. Соотношение навески растительного материала (г) и объема среды выделения (мл) составляло 1:3.

Антитела (AT) к ПАИ получали иммунизацией кроликов препаратом, элюированным из полосы полиакриламидного геля, содержащей ПАИ (Муравлев с соавт., 1999). Количественное получение антигена проводили методом препаративного электрофореза в нативных условиях.

Очистка антител. Фракции IgG из антисыворотки выделяли фракционированием каприловой кислотой (конечная концентрация 3 %) в комбинации с ка-тионообменной хроматографией (носитель SP-Toyopearl HW 650М).

Электрофорез (ЭФ) в полна крилями дном геле (ПААГ) в нативных условиях проводили по методике, предложенной в работе (Davis, 1964).

Электрофорез в ПААГ в денатурирующих условиях выполняли по методу Леммли (Laetnmli, 1970), Визуализацию белков осуществляли окрашиванием гелей красителями на основе азотнокислого серебра или Кумасси R-2S0.

Двойную нммунодиффузню в агарозиом геле препаратов растительных белков с антителами к ПАИ проводили по стандартной методике (Ouchterlony and Nilsson, 1979).

Иммунодат-анализ был выполнен по методике, описанной в работе (Hawkes étal, 1982), Иммуноблог-анализ проводили по методу (Towbin et ai, 1979).

ИммуноферментныЙ анализ (ИФА) проводили в полистироловых 96-ти луночных планшетах. В качестве ферментной метки использовали пероксидазу хрена, конъюгиро ванную с козлиными анти-кроличьими антителами. В качестве субстрата использовали орто-феннпендиамин с перекисью водорода. Измерения оптической плотности исследуемых проб проводили на иммуноферментном анализаторе АИФ-Ц-01С при 490 нм с последующей обработкой результатов с помощью программы ЛабАРМ (ЗАО ИЛИП, г. Санкт-Петербург).

Условия культивирования незрелых зародышей пшеницы в культуре in vitro и морфометрический анализ. Работа проводилась по классическому варианту клеточных превращений в культуре in vitro незрелых (14-суточных) зародышей пшеницы путем непрямого соматического эмбриогенеза, когда реге-нерант возникает из каллуса. Для этого донорные растения исследуемых генотипов выращивали в полевых условиях (2004-2005 гг.) и затем незрелые зародыши помещали в культуру. Зародыши пшеницы культивировали в на среде Лннсмайера-Скуга для каллусогенеза (с 2 мг/л 2,4-дихлорфенокснуксусиой кислоты). Регенерация полученных морфогенных каллусов проводилась на среде Блейдза (с 0,5 мг/л индол ил уксус ной кислоты и 0.5 мг/л кинетина). На питательную среду для каллусогенеза сажали по 40 зародышей каждого варианта (по 1 зародышу в пробирку). В течение 30 суток каллусы культивировали на среде для каллусогенеза, а затем только морфогенные каллусы пересаживали на среду для регенерации. Подсчет количества морфогенных каллусов у изучаемых генотипов проводили методом визуального контроля (Nabors, 1982). Статистическую обработку результатов проводили однофакторным дисперсионным анализом с определением среднего квадратичного отклонения и наименьшей существенной разницы (НСР05) (Максимов, 1980).

Выделение субклеточных фракций меристематических клеток пшеницы проводили с использованием дифференциального центрифугирования по методике Дрейпера и Скотта (Генная инженерия растений, 1991). Очистку хлоро-

пластов проводили в ступенчатом градиенте плотности перколла, приготовленном на среде, содержащей 0.01 М трис-НС1 (рН 7.6), 30 мг/мл ПЭГ (6000), 5 мг/мл БСА, 5 мг/мл фикшла (400). Градиент состоял из 40 и 70 % (объем/объем) перколла (Селиванкина с соавт., 1997). Очистку митохондрий проводили в ступенчатом градиенте плотности перколла, приготовленного на среде, содержащей 0,01 М трис-НС1 (рН 7.6), 03 М сахарозы и 0.1 % БСА. Градиент состоял из 18,23 и 35 % перколла (Войников с соавт,, 1991). Мембранную и ци-тозольную фракции выделяли на ультрацентрифуге "Веектап Ь-7" (Германия) при 100000 g 1 час. Осадок ресуспендировали в 1 % тритоне Х-100, приготовленном на трис-НС1 буфере (0.05 М, рН 7.8) с добавлением 0.001 М РМЭР, н оставляли при +4 °С на мешалке в течение 12 часов. Гомогенат центрифугировали при 20000 g 30 мни. Очистку ядер проводили в ступенчатом градиенте плотности перколла, приготовленного на среде, содержащей 0.01 М трис-НС1 (рН 7.6), 0.3 М сахарозы, 0.1 % БСА. Градиент состоял из 35 и 80 % перколла. Целостность наружных мембран органоидов клетки контролировалась микроскопически. Суспензию митохондрий при этом окрашивали специфической дня этих органоидов краской янус зеленый (Гудвин и Мерсер, 1986). Ядра окрашивали акридиновым оранжевым. Хлоро пласты и митохондрии разрушали замораживая ием-оттаиван нем [96°С/+30 °С). Для замораживания органелл использовали жидкий азот. Ядра разрушали в ультразвуковом дезинтеграторе 1Ю-20 (Польша).

Результаты исследований и их обсуждение

1. Усовершенствование методики получения моноспецифических антител

КЛАН

В предыдущих исследованиях для идентификации ПАИ был использован системный иммунохимический подход, разработанный Г. И. Абеле вы м на животных клетках (Абелев, 1979) и впоследствии использованный А. Д Володарским (Володарский, 1985) в применении к растительным объектам. На первом этапе была получена противотканевая антисыворотка к антигенам апикальных стеблевых меристем пшеницы. Затем из этой сыворотки были удалены антитела, дающие реакции с антигенами клеток дифференцированных тканей листа, стебля и корня. В результате была получена антисыворотка узкой специфичности к ПАИ. Для дополнительного повышения специфичности антител была получена антнсыворотка на преципитат, образованный ПАИ и антителами узкой специфичности к нему.

В связи с тем, что процедура получения АТ к ПАИ была трудоемка и длительна, мы усовершенствовали методику их получения. Моноспецифические АТ к ПАИ были получены согласно методике, предложенной Муравлевым с соавторами, с некоторыми модификациями (Муравлев с соавт., 1999). Для иммунизации мы использовали хроматографически очищенный препарат ПАИ. С целью удаления различных минорных примесей, которые могут визуально не на-

блюдаться в нативном одномерном ЭФ, для иммунизации мы использовали препарат, элюируемый из полосы пол иакрнлам идного геля, содержащей ПАИ.

В результате была получена моноспецифическая антисыворотка к ПАИ. Методом двойной радиальной иммунодиффузии было установлено, что АТ, полученные на препарат, элюируемый из полосы ПААГ, содержащей ПАИ, и АТ, полученные на преципитат, выявляют один и тот же белок (рис. 1). В сравниваемых системах наблюдалось полное слияние полос преципитации. Из этого следует, что АТ, полученные усовершенствованным методом, гомологичны АТ, полученным ранее на преципитат.

2. Очистка антител к ПАИ с использованием капрнловой кислоты в комбинации с катнонообменной хроматографией

Известно, что сыворотка крови млекопитающих содержит кроме иммуноглобулинов различных классов более 60 % других белков, в частности, сывороточный альбумин, которые могут давать неспецифические реакции, отличные от взаимодействия антиген-антитело (Михайлов и Симирский, 1991).

Полученная нами антисыворотка к ПАИ была очищена с использованием ка-приловой кислоты с последующей катнонообменной хроматографией. Эта работа проводилась совместно с с.н.с. лаборатории биохимии ИБФРМ РАН Н. Ю. Селивановым.

Была подобрана оптимальная концентрация капрнловой кислоты, необходимая для осаждения балластных белков сыворотки. В образцы сыворотки добавляли капрнловую кислоту до конечной концентрации 2, 2.5, 3,3.5 и 4%. После осаждения супернатанты анализировали электрофоретически. Наибольшая степень очистки АТ без потери их активности достигалась при конечной концентрации капрнловой кислоты в сыворотке 3 %.

Чтобы быстро освободиться от капрнловой кислоты и других низкомолекулярных примесей, сыворотку подвергали гель-фильтрации (носитель 8ер11а<1ех 0-25 М). После этого была проведена катионообменная хроматография на носителе БР-Тоуореаг! НУ/ 650М в градиенте №С1 от 0 до 0.5 М. Элюируемые фрак-

Рис. 1. Результаты сравнительного и ммуноднфф уз ионного анализа:

1 - моноспеиифнческие АТ к ПАИ, полученные на преципитат (развед. 1/2);

2 - моноспсцнфические АТ к ПАН, полученные на препарат, элюируемый ш поло-си ПААГ (развел 1/4), 3 - фосфатно-солевой буфер; 4—суммарная фракция ме-ристематических белков 5-суточных проростков пшеницы.

ции анализировались в ЭФ в денатурирующих условиях {рис. 2). Активность антисыворотки на каждом этапе очистки контролировалась в иммунодиффузи-онном анализе,

В результате очистки была получена обогащенная фракция АТ, при этом основная масса белков сыворотки, в частности сывороточный альбумин, была удалена. Очищенные таким образом АТ не давали неспецифического окрашивания в иммунодот-анализе. В иммуноблот-анализе полученные АТ в обшем спектре белков меристематическнх клеток пшеницы выявляли 2 субъедин и иы 83-84 кДа, соответствующие ПАИ (рис. 3).

В предыдущих работах была исследована локализация ПАИ в тканях и органах пшеницы (Евсеева, 1992; 5итагока е! а/., 2000). С использованием иммуно-дот-анапиэа было установлено, что ПАИ содержится в апексе стебля, кончике корня, узлах стебля и зародыше семени пшеницы. В то же время, ПАИ не был обнаружен в дифференцированных тканях пшеницы: корне, стебле, листе, а также в эндосперме. Тем самым было доказано, что ПАИ является специфическим белком меристематическнх клеток независимо от места их локализации.

1 2 3 4 5

I 2 3

Рис. 2. Результаты Эф а ПААГ с ДСН белков сыворотки: маркерные белки (I), исходная сыворотка (2), сулернягант после осазкдени» сыворотки 3 %-ной калриловой кислотой (3), фракция после обессоливания на Р1Ы0 (4) н после катноно-обменной хроматографии (3).

Рис. 3. Результаты нмму-ноблот-анализа: I - общий спектр белков меристемы пшеницы в электрофорезе в ПААГ с ДСН, 2 - суммарная фракция белков меристемы, проявленная моноспецнфн-ческнмн АТ к ПАИ, 3 - маркерные белки.

3. Исследование субклеточной локализации ПАИ

Рис, 4. Схема получения субклеточных фракций мернстематических клеток ггшеннцы

Для дальнейшего исследования функциональной роли изучаемого белка, необходимо выяснение его субклеточной локализации.

1 2 3

4 5

Рис, 5. Результаты иммуно-дот-анализа субклеточных фракций мернстематических клеток пшеницы с использованием моноспецифических антител к ПАИ: I — ядро, 2 — шггозоль, 3 -хлоропласта, 4 — митохондрии, 5 - мембранная фракция.

С использованием дифференциального центрифугирования было выделено 5 субклеточных фракций: ядра, хлоропласты, митохондрии, мембранная фракция и цитгаоль (рис. 4). Все органоиды были получены по классической методике ДреЙпера и Скотта (Генная инженерия растений, 1991). С использованием иммунодот-анализа ПАИ не был обнаружен в ядрах, хлоропласта*, митохондриях и мембраной фракции и выявлялся только в цитозоле мернстематических клеток пшеницы (рис. 5).

На основании литературных данных (Холл с со-авт., 2002; Кулаева и Кузнецов, 2004; Тарчевский, 2002), можно предположить, что ПАИ, являясь ци-

ттаольным белком, участвует в передаче сигнала от рецептора, расположенного на мембране, к другим системам клетки (т.е. в геном - ядерный, митохондриал ьны В и т.д.), что приводит к включению/выключению генетических программ развития. Это предположение согласуется с предыдущими исследованиями (Фещенко с соавт., 1992), где установлена связь ПАИ с функциональной активностью стеблевых апексов пшеницы, а также с результатами экспериментов по исследованию морфоге нети чес ких процессов в культуре in vitro пшеницы.

4, Исследование иммунохиммческой гомологии цнтоплазматических белков меристем растений различных таксономических групп

Известно, что белки, связанные с клеточным делением, достаточно консервативны. Примером могут служить циклин-зависимые кнназы, контролирующие прохождение клеточного цикла у всех эукарист (Doerner, 1994, Dewitte and Murray, 2003). В частности, ключевым белком клеточного цикла является про-теинкиназа РЗД"152 , которая универсальна для всех эукариот и контролирует вступление клеток в митоз (Evans et о/„ 1983, John et at., 1989).

Также многие белки, участвующие в сигнальных системах и обнаруженные впервые у модельного растения Arabtdopsis, найдены впоследствии и у других растений. По крайней мере, участки молекулы белка, ответственные за выполнение им основных функций, связанных с транедукцней сигнала, аналогичны у растений различных видов, о чем свидетельствуют данные анализа строения уже выделенных белков и результаты анализа генома растений (Гречкин и Тар-чевский, 2000),

В нашей работе был проведен сравнительный нммунохимический анализ ци-топлазматических белков меристем растений, принадлежащих к различным таксономическим группам. Были исследованы экстракты пятисуточных проростков пшеницы, ржи, сорго, подсолнечника и культуры водного растения воль-фии с использованием моноспецифических антител к ПАИ. Иммунодот-анализ показал, что в цитоплазме всех исследуемых растений содержатся белки, имеющие гомологичные антигенные детерминанты, характерные для ПАИ (рис. б).

Дпя дальнейшего исследования нммунохи ми ческой гомологи» белков растений, принадлежащих к различным таксономическим группам, был проведен твердофазный иммуно-ферментный анализ. Данные ИФА также демонстрируют наличие у

а б в г д

Рис. б. Результаты сравнительного имму-нодот-авалим шггоплазматических белков меристем растений: а—пшеница.б—рожь, s - сорго, г - подсолнечник, д—вольфия.

I 9 м

§

f 03

рсиь <ярп ПМООЖ BOIMtxn Рис. 7, Результаты сравнительного иммуно-ферментного анализа цнтоплаэматических белков меристем растений.

всех исследуемых растений белков, имеющих антигенные детерминанты, гомологичные детерминантам ПАИ (рис. 7); причем максимальное содержание ПАИ наблюдалось у пшеницы.

Элекгрофорети чески й анализ ии-топлазматических белков пшеницы, ржи, сорго, подсолнечника и воль-фии демонстрирует наличие полос, соответствующих по молекулярной массе ПАИ, у всех исследуемых растений. А нммуноблог-аналнз выявляет именно эти белковые полосы у пшеницы и ржи (рис. S). В то же время белковые полосы, соответствующие по молекулярной массе ПАИ не выявляются у других исследуемых культур. По-видимому, не хватает чувствительности полученных нами AT к ПАИ в связи с более низким удельным содержанием его в этих культурах, о чем свидетельствуют и результаты ИФА.

Таким образом, было установлено, что ПАИ из меристемагических клеток пшеницы имеет гомологичные антигенные детерминанты с цитоплазматическими белками меристем растений ржи, сорго, подсолнечника и водкой культуры вольфии.

5. Исследование динамики содержания ПАН в соматических каллусах почти нзогенных линий пшеницы, альтернативных по геиам короткосте-бельности Rht, в процессе кяллусогенеза н вторичной дифференциации

Способность клеток и тканей растений к культивированию in vitro зависит не только от эпигенетических характеристик экспланта и условий культивирования, но и от генотипа растения-донора (Бутенко, 1999; Ежова, 2003).

Несмотря на большое количество исследований по эмбриогенезу растений in vitro, многие вопросы этого уникального пути развития остаются нерешенными. В частности, малочисленны сведения о влиянии индивидуальных генов на проявление тотипотентности клеток in vitro на объектах со слабой регенерацией, к которым относятся злаки,

В связи с этим актуальной задачей является выявление роли конкретных генетических систем и генов, влияющих на способность растительных эксплан-тов к культивированию, а также идентификация новых белковых маркеров, отражающих морфогенетический потенциал каллускых клеток в культуре in vitro растений.

«Г? И 21.5

1

4 5

г з

Б

Рис. 8. Результаты ЭФ » ПААГ с ДСН (А) и иммуноблот-анализа (Б) цитотгла> магических белков меристем пшеницы (IX ржи (2), сорго (3), подсолнечника (4) и вольфии (5); 6 - маркерные белки.

В предыдущих исследованиях на генетической модели, включающей высокорослый сорт мягкой яровой пшеницы Саратовская 29 и его почти изогенные линии, альтернативные по гену короткостебельности /?АВ/с, была выявлена связь между морфогенети чески м потенциалом каллусных клеток и содержанием в них ПАИ (Е¥$ееУа е1 а!., 2002). Это позволило предположить, что ПАИ, вероятно, связан с системой Л/М-генов, а также с образованием меристем этических очагов в каллусной ткани. Для того, чтобы доказать наше предположение, необходимо было включить в исследуемую генетическую модель изогенные линии, альтернативные подругам генам ИЫ.

В настоящей работе исследуемая генетическая модель включала сорт высокорослой яровой пшеницы {ТгШсит аевИъит Ь.) Саратовская 29 и набор его почти нзогенных линий, включающий короткостебельные линии, несущие аллели НЫВ 1с, /{А//-/, НЫВ1Ь, а также их соответствующие высокорослые сибы, несущие аллели Л2МйВ1а> гЫ14> Л1КЫВ}а. Таким образом, было исследовано 7 генотипов. Работа проводилась совместно с сотрудниками кафедры биотехнологии, селекции и генетики СГАУ им. Н. И. Вавилова (д.с.-х.н., проф. ГО. В. Лобачёв и к.с.-х.и., доц. О. В. Ткаченко).

Каллуссы пшеницы в процессе калпусогенеза и вторичной дифференциации анализировали на содержание ПАИ (иммуноферментный анализ) и морфогене-тическую способность (морфометрический анализ).

Сравнительный иммунохимический анализ содержания ПАИ в зародышах и каллусной ткани пшеницы в процессе каллусогенеза (30 суток) и последующей регенерации (9 суток) показал, что в зародышах (до начала культивирования) всех 7-и изучаемых генотипов содержание ПАИ было одинаковым (рис. 9 (1)А, 9 (2)А, 9 (3)А). В процессе каллусогенеза проводили сравнительный анализ содержания ПАИ на 7-е, 14-е, 24-е и 30-е сутки культивирования. На 7-е сутки каллусогенеза отмечалось снижение содержания ПАИ у всех исследуемых генотипов. Начиная с 14 суток культивирования, отмечалось увеличение содержания ПАИ в каллусах всех изучаемых генотипов. Причем, достоверное различие в увеличении содержания ПАИ по сравнению с высокорослым снбом наблюдалось только у короткостебельной линии с аллелем КЫЫс (рис. 9 (1)А). На 24-е н 30-е сутки каллусогенеза происходило дальнейшее увеличение содержания ПАИ, и достоверное различие между короткостебельными линиями и высокорослыми сибами наблюдалось у всех исследуемых генотипов (рис. 9 (1) А, 9 (2)А, 9 (3)А). Морфометрический анализ, который был проведен на 30-е сутки культивирования, показал, что количество морфогенных каллусов у короткостебельной линии с аллелем ЯЫВ1с было на 18,3% больше (при НСРо5=8.12), чем в сестринской высокорослой линии (рис. 9 (1)Б). В тоже время не было отмечено достоверных различий по этому показателю у двух других исследуемых линий (рис. 9(2)Б, 9 (3)Б).

' ' Саратовская 29

ПЛШ-В1с

СЗЛ2Ш-В1а

7 Н М Я)

Вро/1 куль1ннро*(Ш>шут.

Саратовская 29 «ЛКМ-В1Ь Е=2ЛШЫ-В1а

М М

Время кудьп*нр0в«шнлут.

] Саратовская 29 ПЛ1Ш14 СШЛ тМ14

-Линия тренда

Рис. 9, Динамика содержания ПАИ (А) и выход морфогенных каллусоа (Б) в процессе кал-лусогснеза и вторичной дифференциации у сорта пшеницы Саратовская 29, коропсостебель-ноЛ линии данного сорта с геном Ю>Ш1с (ЛЮиШс) и ее высокорослого сиба ЫпВ1а (Л2ЗДсВ1а) (1), короткостебельной линии с геномЛ/мВ1Ь (ШИлВ\Ъ) нее высокорослого сиба КЫВ1а (Л 1ЮнВ)а) (2), короткостебельной линии с геном ЯЬ114 (Л КМ 14) ее высокорослого сиба гИП4 (ЛгЫ14) (3). НСРо! - 0,013 (А> и «,12 (Б).

После перекоса морфогенных каллусов на среду для регенерации содержание ПАИ продолжало увеличиваться у всех генотипов. Но у короткостебельной линии с аллелем RhtBic содержание ПАИ на 30-е и 32-е сутки достигало больших значений, чем у остальных исследуемых линий. На 9-е сутки регенерации разница между генотипами несколько сглаживалась, что соответствовало, по-видимому, переходу к регенерации целых растений (рис.9 (1)А,9(2)А, 9(3)А).

Нами установлена общая закономерность динамики содержания ПАИ в соматических каллусах пшеницы, заключающаяся в снижении уровня его содержания в процессе каллусогенеза и повышении уровня его содержания при вторичной дифференциации клеток до определенного максимального уровня в процессе регенерации растений (рис, 9 (1)А, 9 (2)А, 9 (3)А).

Таким образом, созданная нами генетическая модель с использованием набора почти нзогенных по /ÍAí-генам линий пшеницы представляет генотипы с различным морфогенетнческим потенциалом. Нами установлено влияние генов короткостебельиости RhtBlc> RhíBlb и Rhtl4 на содержание ПАИ в каллусных клетках пшеницы. Иммунохимический анализ показал, что короткостебельные линии на определенных этапах каллусогенеза и регенерации имеют более высокий показатель содержания ПАИ, чем их высокорослые сибы и исходный сорт пшеницы Саратовская 29. Причем, короткостебельная линия пшеницы с аллелем RhtBic, обладающая по данным морфометрического анализа более высоким морфогенетическим потенциалом, имеет и более высокий показатель содержания ПАИ на ранних этапах (14 сутки) каллусогенеза по сравнению с другими короткостебельны ми линиями, несущими аллели RhtBlb и RhtI4.

6. Сравнительный анализ содержания ПАИ в мернстематнческнх зонах in vivo н а каллусных клетках in vitro пшеницы

Соматический эмбриогенез in vitro — наиболее общий путь развития, при котором соматические клетки высших растений под влиянием ряда сигналов превращаются в способные к развитию эмбриональные структуры. Сравнительный анализ половых и соматических зародышей, развивающихся в естественных условиях и в культуре in vitro, позволяет говорить о параллелизме в их развитии, который проявляется в основных закономерностях морфогенеза. В то же время, закономерности морфогенеза, установленные для конкретного генотипа в полевых экспериментах in v/vo, могут в какой-то мере измениться при культивировании эксплантов в культуре in viíro (Батыгина, 1987; 1999),

Принимая во внимание результаты исследований морфогенети чески х процессов в культуре in vitro, мы решили проверить, возможно ли использование показателя содержания ПАИ в меристематических зонах in v/vo для определения морфсгенетического потенциала каллусов пшеницы в культуре in vitro. Для этого был проведен сравнительный анализ содержания ПАИ в меристематиче-ских зонах in vivo и в каллусных клетках в культуре in vitro. Исследование проводили на той же самой генетической модели. Были исследованы растения пшеницы на двух этапах онтогенеза: 5-сугочные проростки и 22-суточные растения пшеницы.

Сравнительный иммунохимический анализ содержания ПЛИ в апексах стеблей 5-ти суточных проростков пшеницы не выявил достоверных различий между исследуемыми генотипами (рис.10 А). В то же время высокорослые сибы и сорт Саратовская 29 значительно превосходили свои короткостебельные линии по длине колеоптиля (рис.10 Б).

Е 1.»

9

Я

ь и

\ 1 3 о.»

1 «А

в ад

1 «

6 «

т 1 Т .

— Щ, т ííS ¡®íí N — ¿ * ■i*' '■■ íS- Í! 1 « —i — r ;lí S T í— 1'.. и —

itRhteib

fllRMStl

— - Й Sr»' ш ж as - ¡ i Ш —

— - - i» Щ — ú íñ Щ i —

3

I,

JIlMM

) I - Саратовская 29; E3 - короткостебельные линии; 223" высокорослые сибы.

Рис. 10, Содержание ПАИ в апексах пятисуточных проростков (А) и длина колеоптиля пятисуточкых проростков (Б) яровой мягкой пшеницы сорта Саратовская 29 и набора его почти изо генных сестринских линий, альтернативных по генам Rht, А. НСР« - 0,428; Б. НСР« - 0,360

В связи с тем, что в условиях in vitro различия в содержании ПАИ у исследуемых генотипов были выявлены только при формировании меристемагических очагов в каллусной ткани (рис. 9 (1)А, 9 (2)А, 9 (3)А), мы предположили, что соответствующие различия в условиях in vivo могут проявиться на более поздних этапах онтогенеза пшеницы, а именно на стадии образования узлов кущения. Сравнительный анализ содержания ПАИ в меристематических клетках узлов кущения исследуемых генотипов показал, что короткостебельные линии с генами RhtBJc и Юл14 имели более высокий уровень содержания ПАИ по сравнению со своими высокорослыми сибами и исходным сортом Саратовская 29 (рис. 11). На 30-е сутки культивирования каллусов был выявлен более высокий уровень содержания ПАИ у этих же генотипов пшеницы (рис. 9 (1)А, 9

(3)А). В то же время не было выявлено достоверной разницы в уровне содержания ПАИ в меристе магических клетках узлов кущения у короткостебельиой линии с геном RhtBIb по сравнению с ее высокорослым снбом и исходным сортом Саратовская 29 (рис. 11). Важно отметить, что на 30-ые сутки культивирования в культуре in vitro были выявлены достоверные различия по содержанию ПАИ в каллусах этих генотипов (рис. 9 (2)А).

Несоответствие между содержанием ПАИ in vivo и in vitro у короткостебельной линии с геном RhtBIb подтверждает высказанное выше предположение о том, что морфогенетические процессы, протекающие in vivo, не всегда однозначно совпадают с аналогичными процессами, протекающими в культуре in vitro.

-,-,-!

t=l А.-™ 1 1 Ш I-i ---г-1

F¡ Щ 1 m É d i

— ш m i.4«: -^- i

Сарвтоесмя HRhlBtc Jl1Rhffi1a ЛИНИ ЛгМИ JlRrt61t> D2ftntB1a

м

ТЬнтт

| ¡ - Саратовская 29; » I - короткостебельные линии; высокорослые сибы.

Рис. 11. Содержание ПАИ в меристематнческих клетках узлов кущений пшеницы сорта Саратовская 29, его короткостебельных линий и их высокорослых сибов. альтернативных по /Ш-генам; HCPos ** 0,183.

Проведенными ранее исследованиями установлено, что общая кустистость донорного растения коррелирует с множественной регенерацией растений из каллусов (Соболева и Логинов, 2004). Также установлено, что короткостебель-ные сорта пшеницы, несущие аллели генов Rhí имеют более высокую степень кустистости (Лобачев, 2000), т.е. в узлах кущения у них закладывается больше боковых побегов, формирующихся из меристематнческих зон in vivo. По-вндимому, этим и объясняется более высокий уровень содержания ПАИ в меристематнческих клетках узлов кущения in vivo у короткостебельных форм по сравнению с высокорослыми сибами и исходным сортом Саратовская 29, а также в каллусных клетках в культуре in vitro. В то же время у линии с геном RhtBIb не во все годы наблюдается достоверно высокая общая кустистость (Лобачев, 2000). Это, вероятно, и является основной причиной недостаточно

высокого уровня содержания ПЛИ в меристематических клетках узлов кущения у этого генотипа (рис. 11 ).

Таким образом, в результате проведенных исследований определен этап онтогенеза пшеницы, позволяющий дифференцировать изучаемые генотипы по содержанию ПАИ в меристематических зонах in vivo. Установлено, что содержание ПАИ в меристематических клетках узлов кущения изогенных линий пшеницы in vivo в целом отражает интенсивность закладки меристематических очагов в каллусной ткани тех же линий в культуре in vitro.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Основной задачей при культивировании растительных объектов, используемом для решения широкого круга фундаментальных и биотехнологических задач, является обеспечение сохранения клетками их морфогенетического потенциала. Эксперименты с клетками in vitro показывают, что не только состав питательных сред, режимы культивирования, тип ткани экспланта, но и учет генотип ическнх особенностей растений являются условиями, необходимыми для получения культур, способных к морфогенезу (Бутенко, 1999; Kwon et al., 200]; Ежова, 2003).

В настоящей работе на генетической модели, включающей сорт пшеницы Саратовская 29 и набор его почти изогенных линий, альтернативных по генам короткостебельности Rht, была установлена связь между процессами, контролирующими развитие растений на молекулярном, тканевом и организменном уровнях. В частности, выявлена связь между закладкой боковых побегов в зоне кущения различных генотипов пшеницы in vivo, а также процессами их регенерации в культуре in vitro - с одной стороны, и сравнительным уровнем содержания ПАИ у этих генотипов — с другой стороны. Установление подобных связей считается одной из главных задач в исследовании морфогенетических процессов в растениях.

Выявленная нами субклеточная локализация ПАИ, гомологичностъ антигенных детерминант ПАИ и цитоллазматических белков растений других таксономических групп, а также связь ПАИ с морфогенети чески ми процессами, позволяют предположить, что данный белок может являться одним из компонентов сигнал-трансдукторной системы меристематических клеток растений, передающей вне- и внутриклеточные сигналы в геном клеток при переключении на различные программы развития. Можно также допустить, что синтез этого белка связан с экспрессией генов, контролирующих запуск морфоге нети чес кой программы развития у недифференцированных клеток in vitra

На основании полученных данных мы можем констатировать, что ПАИ может быть использован в селекционных программах в качестве дополнительного критерия морфогенетической способности тестируемых линий пшеницы не только в дорогостоящих экспериментах в культуре in vitro, но и в полевых или вегетационных опытах in vivo.

18

ВЫВОДЫ

1. С использован не м усовершенствованной иммунохимической тест-системы исследована субклеточная локализация ПЛИ и установлено, что он является цитозольным белком,

2. Обнаружено, что ПАИ из меристематических клеток пшеницы имеет гомологичные антигенные детерминанты с соответствующими структурами цнтоплазматических белков меристем ржи, сорго, подсолнечника и воль-фии.

3. Показано, что изменение процедуры иммунизации животных с использованием препарата, элюированного из поносы полиакриламидного геля, соответствующей ПАИ в нативном электрофорезе, позволяет упростить методику и получить моноспецифические AT к ПАИ с более высоким титром.

4. Установлено влияние генов короткостебельности RhtBlc, Rht!4 и RhtBlb на содержание ПАИ в каллусных клетках пшеницы; выявлена общая закономерность динамики содержания ПЛИ в процессе каллусогенеза и вторичной дифференциации соматических каллусов почти изогенных линий пшеницы, альтернативных по указанным генам.

5. Установлено, что содержание ПАИ в меристематических клетках узлов кущения почти изогенных линий пшеницы /п vivo в целом отражает мор-фогенетическую способность соматических каллусов тех же линий в культуре in vitro.

6. Показано, что содержание ПАИ в соматических каллусах пшеницы позволяет оценить их морфогенетическую способность на более ранних этапах по сравнению с морфометрическим анализом, что открывает перспективу его использования в агробнотехнологии в качестве дополнительного критерия в селекционной работе.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Евсеева Н.В, Ткаченко О.В„ Лобачев Ю.В., Фадеева И.Ю., Щеголев С.Ю, Биохимическая оценка морфогенети чес кого потенциала каллусных клеток в культуре in vitro пшеницы К Физиология растений. -2007. -N, 2. - С. 306-311.

2. Ткаченко О.В., Лобачев Ю.В., Евсеева H Б., Фадеева HJO., Щеголев С.Ю. Сравнительный анализ содержания пролнферативного антигена инициальных клеток в культуре in vivo и in vitro пшеницы // Вестник СГАУ. — 2007. — N. I. — С. 27-31.

3. Евсеева Н.В., Ткаченко О.В., Лобачев Ю.В., Фадеева И.Ю., Щеголев С.Ю. Молекулярные маркеры морфогенеза в исследовании устойчивости растений к экстремальным факторам внешней среды // Стрессовые белки растений: Материалы Всероссийской научной конференции. Иркутск, 6-10 сентября 2004. — Иркутск. Изд-во Института географии СО РАН, 2004,-С. 44-47.

4. Evseeva N.V., Tkachenko O.V. Lobachev Yu.V., Fadeeva I.Yu., and Shchyogo-

lev S.Yu. A novel molecular marker for morphogenesis ¡n an in vitro culture of wheat // Annual Wheat Newsletter / Kansas State University (USA). - 2004. - V. 50. -P. 122-123.

5. EvseevaN.V.,Tkachenko O.V. Lobachev Yu.V., Fadeeva I.Yu., and Shchyogo-lev S.Yu. Study of embryogenic processes in the wheat somatic callus with the use of genetic models // Annual Wheat Newsletter / Kansas State University (USA). -2005.-V.51.-P.116.

6. Евсеева H3., Фадеева И.Ю., Коробейников C.B., Прянишников А.И„ Ще-голев С.Ю. Исследование функциональной активности стеблевых апексов озимой пшеницы при адаптации их к низкой температуре // Тезисы докладов V съезда общества физиологов растений России. Пенза, 15-21 сентября 2003. -Пенза, 2003. -С. 272.

7. Фадеева И.Ю., Евсеева Н.В., Щеголев С.Ю. Субклеточная локализация пролнферативного антигена инициальных клеток в стеблевых апексах пшеницы // Современные проблемы теоретической и экспериментальной химии: Тезисы докладов IV Всероссийской конференции молодых ученых. Саратов, 2325 июня 2003. - Саратов, Иэд-во СГУ, 2003. - С 119.

8. Фадеева И.Ю., Евсеева Н.В. Иммунохимическое исследование пролнферативного антигена инициальных клеток апикальных меристем пшеницы // Вавилове кие чтения - 2003: Тезисы докладов межрегиональной научной конференции молодых ученых и специалистов системы АПК Приволжского федерального округа. Саратов, 25-26 ноября 2003. - Саратов. Изд-во СГАУ, 2003. -С.24-26.

9. Евсеева Н.В., Фадеева И.Ю., Ткаченко О.В., Лобачев Ю.В., Щеголев С.Ю. Исследование постсгрессовых восстановительных процессов в клетках стеблевых апексов различных по засухоустойчивости генотипов пшеницы // Вавилов-ские чтения - 2004: Сборник материалов Всероссийской научно-практической конференции. Саратов, 24-26 ноября 2004. - Саратов. Изд-во СГАУ, 2004. - С. 17-20.

10. Евсеева Н.В., Фадеева И.Ю., Ткаченко О.В., Лобачев Ю.В., Щеголев СЮ. Сравнительный анализ содержания пролнферативного антигена инициальных клеток в меристемах изогенных линий пшеницы на разных этапах онтогенеза // Вавиловские чтения — 2005: Сборник материалов Всероссийской научи о-п рактичесхой конференции. Саратов, 23-25 ноября 2005. - Саратов. Изд-во СГАУ, 2005.-С. 19-20.

1J. Фадеева ИХ),, Евсеева Н.В., Ткаченко О.В., Лобачев Ю.В., Щегсшев С.Ю. Белковые маркеры в исследовании эмбриогенных процессов в культуре in vitro пшеницы // Биология — наука XXI века: Сборник тезисов 9-ой международной школы — конференции молодых ученых. Пущи но, 18-22 апреля 2005. -Пущино, 2005. - С. 99.

12. Евсеева Н.В., Фадеева И.Ю., Лобачев Ю.В., Ткаченко О.В., Щеголев С.Ю. Пролнферативный антиген инициальных клеток в сравнительном исследовании морфогенетических процессов in vivo и пшеницы // Молекулярные механизмы взаимодействия микроорганизмов и растений: фундаментальные и прикладные аспекты; Материалы всероссийской конференции. Саратов, 15-17

июня 2005. - Саратов: Изд-во "Научная книга", 2005, - С. 43-44.

13. Фадеева И.Ю., Неробеева Е.В., Илюхова О.В., Галнцкая A.A., Селиванов Н.Ю., Евсеева Н.В., Щеголе в С.Ю. Исследование иммунохимнческой гомологии цитоплазм атических белков меристем однодольных растений // Там же. -С. 51-52.

14. Евсеева Н.В., Фадеева И.Ю., Ткач ен ко О.В., Лобачев Ю.В., Щеголсв CJO. Пролиферативный антиген инициальных клеток в исследовании морфо-генетических процессов в культуре in vitro пшеницы // Вавнловские чтения — 2006: Сборник материалов Всероссийской научно-практической конференции. Саратов, 5-7 декабря 2006. - Саратов. Изд-во СГАУ, 2006. - С. 59-61.

Подписано в печать 25.04.2007. Формат 60*84 1/16. Гарнитура Times,

_Бумага типовая Объем I печ.л. Тираж 100 экэ._

Отпечатано с готового оригинал-макета в ИБФРМ РАН 410049, Саратов, пр. Энтузиастов, 13