Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Технология выращивания биомассы мицелия серно-желтого трутовика Laetiporus sulphureus в условиях глубинного культивирования с целью получения белковых пищевых добавок

ВАК РФ 03.01.06, Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Автореферат диссертации по теме "Технология выращивания биомассы мицелия серно-желтого трутовика Laetiporus sulphureus в условиях глубинного культивирования с целью получения белковых пищевых добавок"

На правах рукописи

Киселева Ольга Владимировна

Технология выращивания биомассы мицелия серно-желтого трутовика Ьаефогш ви1рНигеш в условиях глубинного культивирования с целью получения белковых пищевых добавок

03.01.06 - Биотехнология (в том числе бионанотехнология)

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата технических наук

5 ДЕК 2013

Красноярск - 2013

005542588

005542588

Работа выполнена в ФГБОУ ВПО «Сибирский государственный технологический университет» (СибГТУ) на кафедре химической технологии древесины и биотехнологии, г. Красноярск

Научный руководитель:

Миронов Петр Викторович, доктор химических наук, профессор Официальные оппоненты:

Войнов Николай Александрович, доктор технических наук, профессор, ФГБОУ ВПО «Сибирский государственный технологический университет», кафедра «Машины и аппараты промышленных технологий», профессор.

Хижняк Сергей Витальевич, доктор биологических наук, профессор, ФГБОУ ВПО «Красноярский государственный аграрный университет», кафедра «Ботаники, физиологии и защиты растений», профессор.

Ведущая организация: Институт леса им. В.Н. Сукачева СО РАН

Защита состоится «27» декабря 2013 г. в 13:00 ч на заседании диссертационного совета Д 212.253.01 Сибирского государственного технологического университета по адресу: 660049, г. Красноярск, проспект Мира, 82, ауд. Ц-110, E-mail: dissovetsibgta01@mail.ru

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Сибирского государственного технологического университета.

Отзывы (в двух экземплярах) с заверенными подписями просим направлять ученому секретарю диссертационного совета по адресу: 660049, г. Красноярск, проспект Мира, 82.

Автореферат разослан 2 биглЪрЯ 2013 г.

Ученый секретарь диссертационного совета: доктор технических наук, /р р

профессор Исаева Елена Владимировна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования. В настоящее время традиционное сельскохозяйственное производство высококачественного белка в виде продукции животноводства и птицеводства практически достишо предела своих возможностей. В связи с этим, в условиях быстрого роста численности населения планеты проблема дефицита и качества белковых продуктов не только все еще далека от решения, но и обостряется. На сегодняшний день население многих стран мира в разной степени испытывает «белковое голодание». Известно, что дефицит белка в питании является одним из главных факторов снижения средней продолжительности жизни.

В этих условиях одним из перспективных путей увеличения производства белка и других биологически ценных веществ может стать крупнотоннажное биотехнологачесюэе производство мицелия базидиальных грибов способом глубинного культивирования с использованием различных растительных субстратов, включая отходы сельского хозяйства и пищевой промышленности.

Получение грибной биомассы в условиях глубинного культивирования при оптимальных условиях выращивания и составах питательных сред может стать экономически целесообразным и доступным способом получения высококачественного экологически чистого белка пищевого и кормового назначения. Грибной белок, как правило, характеризуется относительно сбалансированным аминокислотным составом и высоким содержанием незаменимых аминокислот. Перспективным является также использование глубинного мицелия в качестве посевного материала для выращивания плодовых тел некоторых видов грибов. При этом следует отметить, что выращивание биомассы глубинным способом по скорости процесса более чем на порядок выше, чем традиционное получение плодовых тел.

Существующие исследования по искусственному выращиванию грибов направлены на увеличение выхода целевых продуктов (биомассы, белка, аминокислот) (Дворнина, 1990), создание грибного аромата, разработку новых относительно дешевых и простых питательных сред. Вариантами этих направлений могут быть также поиск или создание новых промышленных штаммов грибов (Стахеев, 1991), оптимизация качественного и количественного состава питательных сред, совершенствование конструкций биореакгоров для глубинного культивирования мицелия базидиальных грибов. Решение данных задач будет также способствовать решению другой важной проблемы — утилизации существующих отходов сельского хозяйства и пищевой промышленности, в первую очередь - крахмалсодержащего сырья.

Таким образом, разработка биотехнологий глубинного культивирования базидиальных грибов, в т.ч. технологий выращивания грибной биомассы с целью получения белковых пищевых и кормовых продуктов, а также биологически активных веществ, является актуальной проблемой. Одним из перспективных видов базидиальных грибов, пригодных для выращивания биомассы

мицелия способом глубинного культивирования, является ЬаеИрогиз ви\ркигеш - серно-желтый трутовик (СЖТ).

Цель работы: исследование закономерностей глубинного культивирования мицелия I. sv.lphv.reus на крахмалсодержащих питательных средах, разработка технологических режимов выращивания биомассы и оценка возможностей ее использования для получения белковых пищевых и кормовых продуктов.

Для достижения поставленной цели необходимо решить следующие задачи:

- изучить физиологические и морфологические особенности мицелия штамма Ь. згйркигеш при выращивании в поверхностных и глубинных условиях на крахмалсодержащих питательных средах;

- определить кинетические и продукционные показатели накопления биомассы мицелия в условиях глубинного периодического культивирования;

- изучить и отработать режимы периодического и непрерывного хемостат-ного культивирования в лабораторном биореакторе, пригодные для реализации технологического процесса получения биомассы мицелия;

- изучил, химический состав и провести оценку безвредности биомассы мицелия;

- исследовать аминокислотный состав белков мицелия, определить их биологическую ценность и возможность использования биомассы мицелия в качестве белковых пищевых добавок;

- разработать технологию опытного производства биомассы мицелия серно-желтого трутовика и дать оценку ее основных технико-экономических показателей.

Объект исследований: штамм чистой культуры мицелия кеилотрофного бази-диомицега Ьаейрогш яйркипш и процессы выращивания его биомассы в режимах глубинного культивирования.

Предмет исследований: условия и закономерности накопления биомассы мицелия Ь. т1рЫгеш при глубинном культивировании, технологические режимы и технология опытного производства по выращиванию биомассы на крахмалсодержащих средах с целью получения белковых пищевых и кормовых продуктов.

Научная новизна: впервые установлены закономерности выращивания биомассы мицелия исследуемого штамма-продуцента Ьаефогш su.lphv.reus в глубинной культуре в периодических условиях и в режиме непрерывного культивирования при максимальной продуктивности по биомассе; определены основные кинетические и продукционные характеристики роста мицелия на средах с высокими концентрациями крахмала (до 30 г/л); изучены и описаны кулыурально-морфологические особенности поверхностного и глубинного мицелия, необходимые для идентификации и технологического контроля процессов культивирования.

Исследован химический состав биомассы глубинного мицелия. Показано, что белки и липиды мицелия характеризуются высотой биологической ценностью: в белках содержатся все незаменимые аминокислоты, а их доля в суммарном содержании всех аминокислот почти на 30 % выше, чем в эталонном белке по ФАО ВОЗ; в липидах преобладают ненасыщенные жирные кислоты - не менее 75 %. Это по-

звсшяет рекомендовать биомассу Laetiporus sulphureus для использования в качестве пищевых добавок.

Практическая ценность работы: на основании проведенных исследований разработаны технологические режимы выращивания биомассы штамма-продуцента Laetiporus sulphureus в глубинных периодических условиях отьемно-доливным способом и режим непрерывного хемостатного культивирования при максимальной продуктивности по биомассе. Разработана технология опытного производства биомассы мицелия с высоким содержанием белка. Установлена безвредность биомассы и возможность ее использования в качестве белковых пищевых добавок для обогащения высококачественным белком пищевых продуктов, а также в качестве посевного материала для биоконверсии растительных субстратов с получением кормовых продуктов, обогащенных белком.

Положения, выносимые на защиту: в рамках специальности 03.01.06 -Биотехнология (в том числе бионанотехнологии) по п. 3. «Изучение и разработка технологических режимов выращивания микроорганизмов - продуцентов, культур тканей и клеток растений и животных для получения биомассы, ее компонентов, продуктов метаболизма, направленного биосинтеза биологически активных соединений и других продуктов, изучение их состава и методов анализа, технико-экономических критериев оценки, создание эффективных композиций биопрепаратов и разработка способов их применения» на защиту выносятся:

- экспериментально установленные закономерности и количественные характеристики выращивания штамма-продуцента L. sulphureus в глубинной культуре на крахмалсодержащих средах (максимальная удельная скорость роста (0,062 ± 0,005) ч"1, субстратная константа Ks=(4,3 ± 0,3) г/л, экономический коэффициенту^ 0,41 ±0,03;

- характеристики купьтуральных и морфологических особенностей глубинного мицелия штамма L. sulphureus, выращенного в режиме периодического культивирования;

- результаты изучения химического состава глубинного мицелия, доказывающие высокую биологическую ценность биомассы и возможность её использования для обогащения белком различных пищевых продуктов;

- технологические режимы выращивания биомассы мицелия в периодических условиях отьемно-доливным способом и режим непрерывного хемеклагаого культивирования, технические условия на продую; исходные данные для проектирования и основные технико-экономические показатели технологии опьпного производства.

Апробация работы: основные положения диссертационной работы и результаты исследований представлены на конференциях: Всероссийской научно-практической конференции «Проблемы химико-лесного комплекса: проблемы и решения» (г. Красноярск 2006, 2010, 2011 гг.); Международной школе-конференции студентов и молодых ученых «Экология Южной Сибири и сопредельных территорий» (г. Абакан 2005 г.); IV съезде Общества биотехнологов России имени Ю.А. Овчинникова (г. Пущино 2006 г.); Международной научно-

. практической конференции «Биотехнология: вода и пищевые продукты» (г. Москва, 2008 г.); Всероссийской на научно-практической конференции «Молодые ученые в решении актуальных проблем науки» (Красноярск, 2012 г.); Всероссийском молодежном образовательном форуме «Селигер-2010», (Зворыкинский проект: Инновации и техническое творчество).

Работа также выполнялась при финансовой поддержке фантов: Красноярского краевого фовда науки «Индивидуальные гранты для молодых ученых» (17 в) №170158 в 2007 году, (18 в) № 180177 в 2008 г.

Вклад автора: Планирование и проведение экспериментов по исследованию кинетических и продукционных характеристик культуры; обработка и анализ результатов; разработка технологии опытного производства, подготовка публикаций.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 16 печатных работ, в том числе 3 статьи в изданиях перечня ВАК.

Объем и структура работы. Диссертационная работа состоит из введения, 4-х глав, выводов и приложений. Библиографический список включает 165 источников. Материал изложен на 125 страницах, содержит 25 рисунков и 18 таблиц.

Основное содержание работы

Во введении показана проблема дефицита пищевого и кормового белка, а также необходимость и возможность решения этой проблемы путем создания биотехнологий получения биомассы глубинного мицелия базидиальных грибов. Обоснована аюуальность темы диссертационной работы.

В первой главе - аналитическом обзоре - проведен анализ отечественной и зарубежной литературы по проблеме шубинного культивирования биомассы базидиомицетов, а также по изучению химического состава биомассы грибов как перспективного источника для получения большого количества ценных продуктов. Показано, что в последние годы возрастает интерес к исследованиям Ь. БиХрЬигвш как продуцента в биотехнологии для получения белка, аминокислот, биологически активных соединений. В литературе приводится информация о морфологических и культуральных особенностях, химическом составе и свойствах как плодовых тел, так и мицелия гриба Ь. БгйрИигеш. Исследователями изучается антимикробная, противоопухолевая, антиоксидантная активность соединений, синтезируемых различными штаммами Ь. ¡Ыркигеиз (Агафонова, 2007; Иванова, 2013).

На основании анализа литературы сделан вывод о перспективности создания технологии выращивания биомассы мицелия Ь. зи1ркигет способом глубинного периодического культивирования с целью её использования для обогащения различных пищевых и кормовых продуктов белком, а также для получения биологически активных веществ (БАВ) из кулыуральной жидкости и биомассы.

Во второй главе дана характеристика объекта и методов исследования. Объектом исследования являлся штамм Ьаейрогш $гйркигеш, выделенный в виде

чистой культуры из плодовых тел, собранных с хвойных деревьев Leave sibirica L (лиственница сибирская) в лиственных и смешанных лесах Республики Тува Штамм хранится в коллекции кафедры химической технологии древесины и биотехнологии и в Центре микологии и биотехнологии СибГТУ С 2008 г ппамм пед названием Laetiporus sulphwvus Ls-06 передан также на национальное патентное депонирование во «Всероссийскую Коллекцию Промышленных Микроорганизмов» (ВПКМ), ФГУП ГосНИИгенетика. Коллекционный номер ВПКМ F-982. Область применения: биотехнология, пищевая промышленность.

Полученный в поверхностных условиях на сусло-агаре мицелий переносили в колбы со стерильной средой и культивировали в условиях интенсивного перемешивания на качалках. Полученную глубинную культуру использовали в качестве инокулята для культивирования в лабораторном биореакгоре «CECA» (Англия) объемом 6 л при рН = 4,2 и температуре (28±1) °С. Аэрация осуществлялась путем барботажа воздухом при расходе 100 л/ч на 1 л среды с дополнительным механическим перемешиванием ~500 об/мин мешалкой специальной конструкции (ротор геликоидального типа), обеспечивающей пракпиески нетравмаггическое воздействие на мицелий. Газосодержание купьтуральной жидкости составляло около 20 %. Биореакгор оснащен перистальтическими насосами для обеспечения режимов непрерывного культивирования с заданными скоростями разбавлений, а также датчиками измерения рН, температуры среды и юнцешрации растворенного кислорода в купьтуральной жидкости.

Глубинное культивирование проводили на среде с содержанием крахмала 3 % с добавками питательных солей и квасного сусла. Перед стерилизацией крахмальный клейстер обрабатывали при 60 °С промышленным ферментным препаратом - термостабильной а-амилазой (термоамил 120 L, Германия) для снижения вязкости среды.

Концентрацию биомассы в глубинной культуре определяли по величине оптической плотности среды по калибровочной кривой, а также путем прямого определения сухой массы мицелия, отделяемого из отбираемых через определенные промежутки времени образцов купьтуральной жидкости.

Микроморфслошческие особенности глубинной культуры серно-желтого трутовика изучали в препаратах «отпечаток» и «раздавленная капля» в микрокамере, используя световые микроскопы «Olimpus СХ41» и «Olimpus SZX 12» с получением компьютерных изображений с помощью цифровой камеры Nikon Е 4500, а также с использованием электронно-растровой микроскопии (РЭМ-100 У, Украина; ТМ-1000, Япония).

Химический анализ биомассы мицелия проводили, используя стандартные химические и физико-химические методы анализа. Содержание белка в мицелии определяли по методу Кьельдаля и с красителем амидо-черным 10В (Бузун и др., 1982); аминокислотный состав белков - методом ионообменной хроматографии с использованием автоматического анализатора аминокислот ААА-339 M (MIKROTECHNA, Чехия).

СибГТУ: «OKmpusCX41» -—40 СибГТУ: «Ofimpus СХ41» —40

мкм

мкм

а б

Рисунок 1 - Оптические микрофотографии мицелия штамма серно-желтого трутовика в поверхностной (а) и в глубинной культуре (б)

Жирные кислоты анализировались в ввде их метиловых эфиров на газожидЕоостном хроматографе «Agilent Technologies» с масс-селективным детектором, работающим в режиме электронного удара и регистрации разделенных компонентов по полному ионному току.

Содержание утлеводов определяли по методу Бертрана; нуклеиновых кислот -спекгрофоиметрическим методом (Ермаков и др., 1987). Элементный состав (содержание и состав тяжелых металлов) изучали методом ренттено-флуоресцентной спектроскопии на приборе «Спекгроскан» (НПО «СПЕЮРОН», С.-Пб).

Построение графиков, статистическую обработку результатов измерений проводали с использованием программ Table CurveTM и Excel.

В третьей паве изложены результаты экспериментальных исследований.

Морфологические особенности штамма Ь ьфкигеш при выращивании в поверхностной и глубинной периодической культуре. Проведенные исследования морфологических признаков штамма Ь. ¡ЫрЬиггш показали, что для культуры на твердых питательных средах характерно образование колоний с вагообразным воздушным мицелием, отдельные гафы которою беспорядочно переплетаются. Высот мицелия в среднем составляла 3-5 мм, в некоторых случаях формировались гифаль-ные пучки, приподнимающиеся над поверхностью субстратного мицелия, из-за чего колония выглядела хлопьевидной. Мицелий в процессе роста приобретал характерную желто-оранжевую окраску, которая является дополнительным идентификационным признаком; характерный грибной запах и экссудат отсутствовали. С возрастом воздушный мицелий оседал на поверхность среды, вследствие чего колония приобретала войлочный вид.

Микроскопические исследования показали, что мицелий в поверхностной и глубинной культуре состоит из длинных сепгарованных гиф с простыми ветвлениями без образования мицелиальных пряжек, характерных для большинства базидиомице-

Отличительной чертой исследуемого штамма являлось образование овальных, шарообразных и грушевидных структур, расположенных на гифах терминально или интеркалярно. Анализ экспериментальных и литературных данных позволяет предположить, что шарообразные структуры воздушного мицелия являются бластоконидиями, а грушевидные структуры мицелия -хламидоспорами. Оба указанных типа бесполого спороношения у данного вида описаны отечественными и зарубежными исследователями.

Исследование морфологических особенностей штамма серно-желтого трутовика в аэрируемой глубинной культуре при отсутствии механического перемешивания показало, что при этом вырастали достаточно крупные, отдельно расположенные глобулы с плотным центром и бахромчатым краем, сформированным за счет периферических мицелиальных образований (рисунок 2, а,б).

а - образование плобуи при культивировании без механического перемешивания; б - биомасса глубинного мицелия после отделения отработанной культуральной жидкости.

Рисунок 2 - Биомасса мицелия серно-желтого трутовика в глубинной культуре (а) и отфильтрованная биомасса мицелия (б)

В условиях дополнительного механического перемешивания в биореакторе мицелий серно-желтого трутовика фрагментировался на относительно небольшие сегменты, которые не утрачивали способности к росту и накоплению биомассы. Кроме того, на рисунке 3 на микрофотографиях (растровый электронный микроскоп - РЭМ), видно, что в культуре через трое суток выращивания накапливается значительное количество спорового материала.

Проведенные исследования и анализ литературных данных позволяют считать основными морфологическими признаками, которые могут использоваться для оценки чистоты и экспресс-контроля глубинной культуры следующие: отсутствие характерных пряжек на гифах и ярко выраженного грибного запаха; образование в культуре грушевидных и шаровидных бластошнидий и хламидос-пор; фрагментация мицелия при глубинном культивировании и образование

Рисунок 3 - РЭМ-микрофотографии глубинного мицелия серно-желтого трутовика с грушевидными и шаровидными бластоконидиями и хламидоспорами при различном увеличении (культивирование в условиях дополнительного механического перемешивания)

в кулыуральной жидкости при механическом перемешивании различных морфологических структур с наличием относительно небольших фрагментов и их агрегатов.

Таким образом, было установлено, что и в глубинной культуре мицелий способен образовывать толстостенные хламидоспоры. В культуральной жидкости в зависимости от условий культивирования могут присутствовать различные морфологические структуры - колонии (глобулы) с плотным центром и периферическим бахромчатым мицелием, глобулы неправильной формы, шаровидные и грушевидные образования, нитевидные фрагменты мицелия. Все они способны к дальнейшему росту и могут служить в качестве посевного материала.

Влияние условий культивирования на рост штамма Ь. зШркигеия.

Для подбора оптимальных условий культивирования мицелия Ь. ягЛркигеив изучали влияние на рост и накопление биомассы температуры и рН среды. При этом также определяли значения показателей ростовых коэффициентов (РК) и скорости роста (СР) в условиях поверхностного культивирования на агаризованной среде. Установлено, что максимальные значения скоростей роста достигались в диапазоне температур (28±1) °С и в диапазоне значений рН 4,2±0,5 (глубинная культура). При температуре 28 °С значения показателей РК составили 101±5 и СР (0,7±0,1) мм/сут. Значение РК = 101±5 позволяет отнести штамм к быстрорастущим; этот результат соответствует также известным данным, согласно которым чистые культуры Ь. 8и1рИигет имеют РК = 100-120.

Кинетика роста мицелия Ь. ш1р1шге№ в глубинных периодических условиях. Значения кинетических параметров роста определяли по результатам культивирования на питательных средах с различными концентрациями углеродсодержащего лимитирующего субстрата - крахмала. По-

казано, что рост культуры удовлетворительно описывается в рамках модели Моно. Параметры уравнения Моно составили: цм - (0,062 ± 0,005) ч"1 и Ks = (4,3 ± 0,3) г/л. На рисунке 4 приведены кривые роста биомассы мицелия серно- желтого трутовика в глубинных периодических условиях в биореакторе CECA при различных начальных концентрациях биомассы и при оптимальных значениях температуры и рН.

16 г

О 10 20 30 40 50 60 70 SO 90

Продолжительность культивирования, ч

1 - 0,6; 2 - 1,0; 3 - 1,9; 4 - 4,0; 5 - 5,0 г/л абсолютно сухой массы (а.с.м.)

Рисунок 4 — Кривые роста глубинной культуры мицелия серно-желтого трутовика при различных концентрациях посевного материала

Расход воздуха при аэрации (барботаж) составлял ~100 л/ч на 1 л среды при дополнительном механическом перемешивании; газосодержание составляло до 20 %. По величине убыли концентрации крахмала и прироста биомассы за весь период культивирования рассчитывали экономический коэффициент Ys= 0,41 ± 0,03, т.е. выход биомассы по крахмалу составил около 41 %.

Показано, что начальный период роста удовлетворительно описывается в рамках модели Моно. В частности, экспериментальные данные для данного случая хорошо согласуются с расчетными в рамках интегральной формы уравнения роста (Варфоломеев, 1984 г). Например, для кривых 1-3 накопление биомассы соответствует расчетным д анным по уравнению роста в интегральной форме при продолжительности культивирования приблизительно до 30 - 36 ч. При дальнейшем накоплении биомассы значения концентрации биомассы становились меньше расчетных. При более высоких концентрациях посевного материала (кривые 4 и 5) рост концентрации биомассы начинал отставать от расчетных при несколько меньшей продолжительности культивирования. Основным фактором замедления скорости роста в этих условиях является, по-видимому, снижение концентрации кислорода в культуральной жидкости и скорости его поступления в клетки при высоких концентрациях биомассы.

I

Г

Дня оценки возможностей масштабирования процесса и его реализации в промышленных биореакторах большого объема (порядка м3 и десятков м3) в кулыу-ральной жидкости определяли концентрацию растворенного кислорода при аэрации как в условиях барботажа без механического перемешивания, так и с дополнительным механическим перемешиванием. На рисунке 5 приведены результаты определения концентрации кислорода при коэффициентах массопередачи К^-50 ч"1 (барботаж воздухом) и-250 ч"1 (барботаж и механическое перемешивание).

■

е \

V в ■

\ « я

к?

1

Концентрация биомассы, г/л

1 - Къа ~ 50 (барботаж); 2 - Кьа ~ 250 ч"1 (барботаж и механическое перемешивание) Рисунок 5 - Зависимость концентрации растворенного кислорода в питательной среде от концентрации биомассы при различных коэффициентах массопередачи К^а

При барботажебез дополнительного механического перемешивания концентрация растворенного кислорода в среде с ростом биомассы убывает значительно быстрее и при концентрации 10-12 г/л становится близкой к критическому уровню, при котором рост резко замедляется.

Исследование химического состава биомассы глубинного мицелия Ь ЗШрИигеи^ Исследован состав и содержание основных групп соединений: белков, углеводов, липидов, нуклеиновых кислот. Определены также зольность и элементный состав золы («тяжелые металлы»). Результаты приведены в таблице 1.

Таблица 1 - Химический состав биомассы глубинного мицелия Ь. Би1ркиге1к

Основные группы соединений Содержание, % от (а.с.м.)

Общий белок 39,8± 4,1

Липиды 14,4 ±0.7

Углеводный комплекс, в т.ч.: - моносахариды - олигосахариды и легкогидролизуемые (в т.ч. водорастворимые) полисахариды - трудногидролизуемые полисахариды 31,9 ±2,2 3,8 ± 0,2 22,7 ± 1,2 5,5 ± 0,3

Нуклеиновые кислоты 0,7 ± 0,3

Минеральные вещества (зольность) 3,7 ± 0,3

В сухой биомассе мицелия моно- и олигосахариды и легкогидроли-зуемые полисахариды составляют до 26,5 %, в то время как трудногидро-лизуемые полисахариды - почти в пять раз меньше - около 5,5 % По содержанию и соотношению ЛГП/ТГП можно предполагать относительно высокую перевариваемость биомассы мицелия. В то же время наличие труц-норастворимых полисахаридов, которые могут выполнять роль пищевых волокон, также будет являться немаловажным фактором при использовании биомассы в качестве пищевых добавок.

Биологическая ценность биомассы серно-желгою трутовика определялась, в первую очередь, по содержанию в ней незаменимых аминокислот. Современным стандартом качества пищевых белюв является показатель скора - скорректированного аминокислотного коэффициента усвояемости белков, рекомендованный для применения при оценке качества белков Объединенным экспертным советом ФАО/ВОЗ (1989).

При исследовании аминокислотою состава белка обнаружено 8 незаменимых аминокислот (таблица 2).

Таблица 2 - Аминокислотный состав белков биомассы глубинного мицелия L. Sulphureus_

Аминокислоты Содержание в белке, %

Эталонный белок (казеин) Скор, % Мицелий СЖТ Скор, % Плодовые тела СЖТ* Скор, %

Изолейцин Лейцин Лизин Метионин + Цистин Треонин Валин Фенил аланин+ тирозин Триптофан 4,0 7,0 5,5 3,5 4,0 5,0 6,0 1,0 100 100 100 100 100 100 100 100 4,8 7,4 7,4 2,8 4,8 7,4 11,3 0,8 120 105 148 81 121 148 188 80 6,04 2,07 5,77 11,63 2,89 3,34 9,41 3,61 151 29,57 104,91 332,29 72,25 66,80 104,17

Аспарагиновая Аргинин Серии Глютаминовая Пролин Глицин Алании Гистидин 6,9 7,1 4,8 9.0 0,3 10,0 12,0 3.1 5,77 3,44 1,81 6,85 7,39 3,41 2,4 3.7

1 ариОова Л.Б., 2(JUb;Агафонова С.В., 2007

Из приведенных данных следует, что как по относительно высокому содержанию белка (до 40 %), так и по его благоприятному аминокислотному составу, биомасса мицелия серно-желтого трутовика может использоваться для обогащения высококачественным белком различных пищевых продуктов. Несмотря на то, что содержание таких аминокислот, как метионин и триптофан в биомассе мицелия меньше, чем в эталонном белке,

по содержанию других высокоценных незаменимых аминокислот - белок мицелия превосходит эталон. Следует также отметить, что общее содержание незаменимых аминокислот в белке мицелия почти на 30 % превышает этот показатель в эталонном белке.

Общее содержание липидов в биомассе глубинного мицелия относительно невелико - около 14-15 % (таблица 1). При этом жирнокислотный состав липидов является достаточно благоприятным по содержанию ненасыщенных и полиненасыщенных жирных кислот с точки зрения использования биомассы в качестве пищевых добавок и продуктов (таблица 3).

Таблица 3 - Состав жирных кислот липидных фракций

мицелия Ь. 8и1ркигеш

Наименование кислоты Содержание жирных кислот в липидах, %

Нейтральные липиды Полярные липиды

Лауриновая 0,09±0,01 0,30±0,02

Миристиновая 0,05±0,01 0,92±0,02

Пентодекановая 0,08±0,01 0,24±0,02

Пальмитиновая 2,05±0,05 13,64±0,05

Маргариновая 0,92±0,02 0,34±0,02

Стеариновая 2,03±0,05 2,51±0,02

Олеиновая 17,51±0,05 15,3±0,05

Линолевая 19,21±0,05 23,46±1,5

Лигноцериновая 0,29±0,02 0,34±0,02

Как видно из таблицы, в обеих фракциях липидов - нейтральной и полярной - преобладают ненасыщенные жирные кислоты. Общее содержание двух ненасыщенных жирных кислот - олеиновой и линолевой - достигает 75,48 %. На долю двух насыщенных жирных кислот - пальмитиновой и стеариновой - приходится 20,3 %. В наибольшем количестве в обеих фракциях находится линолевая кислота.

Характеристика элементного состава биомассы мицелия Ьльйркигет. Как известно, плодовые тела грибов в процессе роста могут аккумулировать в своих клетках значительное количество тяжелых металлов из почвы и воды. СанПиН устанавливают допустимые нормы содержания в плодовых телах некоторых наиболее токсичных элементов. Содержание обнаруженных в мицелии элементов сравнивали с нормами по СанПиН и данными по плодовым телам грибов. Результаты исследования приведены в таблице 4. Установлено, что содержание токсичных элементов в биомассе мицелия сер-но-желтого трутовика не превышает предельно допустимых уровней по нормативным требованиям безопасности пищевых продуктов. Как видно го таблицы, в образцах биомассы мицелия СЖГ были обнаружены кадмий, свинец, медь и цинк, но

Таблица 4 - Элементный состав (металлы) биомассы мицелия

L. Sulphureus

Элемент Допустимые уров- Содержание эле- Содержание эле-

ни по СанПиН ментов в глубинной ментов в плодо-

2.3.2.1078-01, не культуре мицелия, вых телах, мг/кг*

более мг/кг мг/кг

Кадмий 0,1 0,0005 ± 0,0001 0,01 -0,1

Свинец 0,5 0,0005 ± 0,0001 0,08 - 0,3

Мышьяк 0,5 не определено 0,01 - 0,1

Ртуть 0,03 не определено 0,001 - 0,01

Медь 10 2,9 ±0,13 не определено

Цинк 20 6,16 ±0,15 не определено

Фосфор не установлены 7,12± 0,15

Калий не установлены 4,3 3± 0,1

Магний не установлены 0,77±0,01 -

Железо 50 3,14±0,1

Медь не установлены 0,29±0,01 _

Марганец не установлены 0,15±0,01

Молибден не установлены 1,62±0,01 -

Никель 1,9 0,32±0,01 -

Хром 0,6 0,42±0,01

Кобальт не установлены 0,0005±0,0001 -

*- В.И. Бакайтис, 2006; Е.В. Мартене, 2007.

их содержание было значительно меньшим по сравнению с дикорастущими грибами и допустимыми нормами по СанПиН. В биомассе мицелия отсутствовали ртуть и мышьяк, являющиеся особо токсичными элементами. Следует отметить, что использование питательных сред известного состава позволяет контролировать состав и содержание тяжелых металлов в биомассе, а при необходимости обогащать биомассу дефицитными компонентами - мшфо- и макроэлементами.

В главе 4 приведены основные технико-экономические показатели технологии опытного производства биомассы Ь. зи1ркигеш.

Для масштабирования процесса и проектирования опытного производства была выбрана производительность 30 т в год товарной биомассы. На основе результатов экспериментального исследования процессов культивирования были определены количественные параметры роста, продукционные и массообменные характеристики, необходимые для технологических расчетов. Рассчитаны два варианта технологических процессов: периодическое культивирование охъемно-доливным способом и непрерывное культивирование.

На рисунке 6 приведена блок-схема технологического процесса культивирования биомассы мицелия (технологическая схема приводится в диссертации).

На предсЬепменттаюнной стадии осуществляется подготовка и стерилизация питательной среды. Для приготовления среды используется крахмал, который предварительно подвергается клейстеризации при 60 °Си обработке в течение 20 мин ферментом

Рисунок 6 - Блок схема технологического процесса культивирования биомассы мицелия серно-желтого трутовика

- термостабильной ct-амилаэой (термоамил 120 L) для частичного гидролиза и снижения вязкости; растворы питательных солей готовятся и стерилизуются оадельно.

На стадии получения посевного материала инокулят предварительно выращивается в поверхностных условиях в чашках Петри на сусло-агаре. Поверхностная культура используется для дальнейшего выращивания и накопления биомассы в глубинной культуре в колбах на качалках. Далее кулыуральная жидкость вместе с биомассой из колб передается в посевной биореактор-инокулятор первой стадии объемом 10 л, ще выращивание ведется при непрерывном перемешивании и аэрации в течение 72 ч при температуре 26-28 °С. Концентрация биомассы посевного мицелия на этапе приготовления инокуттята должна составлять 1-2 г/л, накопление биомассы - до 10-12 г/л.

Выращенный инокулят по стерильному трубопроводу самотеком последовательно поступает в посевной биореактор-инокулятор второй стадии объемом 100 л, затем выращенная до концентрации биомассы 10-12 г/л культура поступает в большой посевной биореактор третьей стадии накопления посевного материала объемом 1 м3. Из посевного биореакгора кулыуральная жидкость перекачивается по стерильному трубопроводу в биореакторы основного производства объемом 10 м\

Стадия основного производства Первый вариант технологического процесса предусматривает периодическое культивирование отъемно-доливным методом в реакторах объемом 10 м3 с коэффициентом заполнения 0,5. В данном случае при достижении конечной концентрации биомассы 14 г/л (в расчете на абсолютно сухое вещество) часть культуральной жидкости из биореактора сливается (до остаточного объема -1.8 м3) и передается на переработку. Биореактор заполняется питательной средой до конечного объема 5 м с исходными концентрациями субстрата S0 = 30 г/л и биомассы - 5 г/л. При этом полный цикл процесса от составит около 30 ч с учетом времени на слив культуральной жидкости и заполнение биореактора свежей питательной средой. Урожай абсолютно сухой биомассы за один цикл культивирования составит около 45 кг, или товарной продукции влажностью ~10 % около 50 кг.

Второй вариант технологического процесса предусматривает непрерывное культивирование также в реакторах объемом 10 м3 с коэффициентом заполнения 0,5 при скорости разбавления (протока) D^ = 0,04 ч"1 и производительности по биомассе !!„*„= Donr'XCT= 0,39 г/л-ч (при скорости разбавления Ц^ 0,04 ч"1 стационарная мэнцешрация биомассы Х„ = 9,8 г/л).

Далеё кулыуральная жидкость с выращенной биомассой из биореакторов подается на пресс-фильтр, где биомасса отделяется от отработанной культуральной жидкости. Влажная биомасса подается в аппарат для сушки во взвешенном слое и далее на упаковку. Отработанная кулыуральная жидкость передается либо на биологическую очистку, либо на вторую стадию культивирования для получения посевного материала и для

последующего засева в блоки растительного субстрата с целью получения кормовых продуктов, обогащенных белком.

По каждому из двух вариантов процесса потребуется два биореакшра объемом 10 м3 (и один резервный), которые могут обеспечил, заданную производительность опытного цеха около 30 т/г.

Сухой продукт имеет вид светло-коричневого порошка со свежим запахом, содержит не менее 40 % белка, витамины, липиды, минеральные вещества и может быть использован в пищу как белковая добавка, источник незаменимых аминокислот, ненасыщенных и полиненасыщенных жирных кислот, а также пищевых волокон.

Предварительные токсикологические исследования биомассы мицелия установили ее безвредность. Опыты проводились в «Красноярской краевой ветеринарной лаборатории» в 2008 г, где было получено положительное заключение «О возможности использования биомассы в пищевых целях». На основании этого заключения был получен паспорт на депонирование (№ Б- 982, апрель 2008 г)

штамма 1-06 Ь. ¡пйрЫгею для использования в биотехнологических целях, в

том числе с целью получения белковых пищевых продуктов.

Технико-экономические показатели процесса. В таблице 5 приведены результаты расчета основных технико-экономических показателей опытного производства биомассы мицелия белка по выпуску 30 т/г товарной продукции влажностью 10%.

Таблица 5 - Основные технико-экономические показатели производства

Показатель Величина

Объем производства в натуральных единицах, кг 30000

Выручка от реализации, тыс. руб. 16500

Число работающих, чел. 10

- основных 7

- руководителей и специалистов 3

Себестоимость единицы продукции, руб/ кг 190

Прибыль от реализации, тыс. руб. 7138

Рентабельность при цене реализации 550 руб./кг, % 46

Срок окупаемости, лет 5,74

ВЫВОДЫ

1. Изучены культуральные и морфологические особенности мицелия штамма Laetiporus sulphumis (серно-желтого трутовика), которые могут использоваться для оценки чистоты культуры и технологического контроля выращивания биомассы; установлено, что в шубинной культуре образуются грушевидные и шаровидные бластоконидии и хламидоспоры; обнаружена возможность фрагментации мицелия при глубинном культивировании.

2. Определены кинетические и продукционные показатели выращивания биомассы мицелия серно-желтого трутовика в условиях глубинною периодического культивирования, при котором максимальная удельная скорость роста составила://,, = 0,062 ± 0,005 ч'1, субстратная константа Ks = 4,3 ± 0,3 г/л, экономический коэффициент по крахмалу Ys= 0,41 ± 0,03 (т.е. выход биомассы около 41 %).

3. Изучены и отработаны режимы культивирования в лабораторном биореакторе, пригодные для масштабирования процессов выращивания биомассы огь-емно-дсшивньш и непрерывным способами в промышленных биореакгорах.

4. Установлен химический состав биомассы глубинного мицелия (определено содержание и состав белков, углеводов, липидов, нуклеиновых кислот, минеральных веществ). Исследован аминокислотный состав белков, установлена безвредность биомассы глубинного мицелия и ее высокая пищевая ценность.

5. На основе полученных исходных данных разработаны технологические режимы и технология опытного производства биомассы мицелия серно-желтого трутовика. Дана оценка ее основных технико-экономических показателей. Предлагаемая технология опытного производства позволит обеспечить продуктивность процесса по биомассе до 0,4 кг/мЧ и получение 30 т биомассы в год.

Основные материалы диссертации изложены в следующих работах:

Статьи в изданиях, входящих в перечень ВАК:

1. Уфимцева, О. В. Получение биомассы мицелия грибов вешенки обыкновенной Р1еитШ5 (¡¡Ь-еаШя и серно-желтого трутовика ЬаеНрогиз зи1ркигеш в глубинных условиях /О. В.Уфимцева, П. В.Миронов, Т. И. Громовых// Хвойные бореальной зоны. - 2009. - №2. - С. 294-296, автора - 0,09 пл.

2. Глубинное культивирование серно-желтого трутовика с целью получения белковой биомассы. / О.В. Киселева [и др.] // Химия растительного сырья. -2011№4. - С. 337-338, автора - 0,062 пл.

3. Киселева, О.В. Особенности морфологии мицелия базидиального гриба Ьаейрогш зи1ркигет в поверхностной и глубинной культуре /О. В. Киселева, П. В. Миронов, Ю. А. Литовка // Вестник КрасГАУ. - 2012. -№1. - С 91-95, -0,17 пл.

Публикации в прочих изданиях:

4. Уфимцева, О. В. Технология получения белкового препарата из мицелия грибов РЫгоШб озЯшШ и Ьаейрогиз ЫрЬигеш / О.В. Уфимцева // Лесной и химический комплексы - проблемы и решения: материалы всерос. науч.-практ. юнф. - Красноярск, 2006. - С. 60-63, автора - 0,09 пл.

5. Уфимцева, О. В. Особенности культивирования грибов Р1еигоЫь озШХш и Ьаейропя т1рЬигеиз поверхностным и глубинным способом / О.В. Уфимцева / Экология южной Сибири и сопредельных территорий: материалы всерос. науч.-пракг. юнф. - Абакан, 2005. - Т. 2. -№ 9. - С. 102, автора - 0,03 пл.

6. Уфимцева, О. В. Характеристика аминокислотного состава глубинной культуры грибов вешенки обыкновенной и серно-желтого трутовика / ОБ. Уфимцева // Материалы четвертого съезда общества биотехнологов России им. Ю.А. Овчинникова. - М.: МАКС Пресс, 2006. - С.268-270, автора- 0,09 пл.

7. Уфимцева, О. В. О возможности использования биомассы глубинного мицелия серно-желтого трутовика {ЬаеПротз тЬрЫпгет) в целях получения белковых пищевой добавки. Биотехнология: вода и пищевые продукты / ОБ. Уфимцева, П. В. Миронов, Т. И. Громовых // Пищевая биотехнология: матер, меяедун. юнф. - М., 2008 - С.88-89, автора - 0,06 пл.

8. Киселева, О. В. Биологическая ценность белка мицелия серно-желтого трутовика (ЬаеПропя 8и1р}шгеш), полученного глубинным способом /О. В. Киселева, П. В.Миронов // Пищевая промышленность и агропромышленный комплекс: достижения, проблемы, перспективы: матер, междун. конф. - Пенза: Приволжский Дом знаний, 2010. - С. 96-98, автора - 0,09 пл.

9. Изучение морфологии глубинного мицелия грибов вешенки обыкновенной (РкигойБ озйтаШэ) и серно-желтого трутовика (Ьаейрогш БифЬигеш) / О. В. Киселева [ и др.] / Молодые ученые в решении актуальных проблем науки: сб. ст. всерос. ня/ч.-пракг. юнф. - Красноярск, 2010. - С. 11-13, автора -0,09 пл.

10. Пищевая ценность биомассы глубинного мицелия базидиальных грибов ве-

шенки обыкновенной и серно-желтош трутовика / О. В. Киселева [ и др.] / Лесной и химический комплексы - проблемы и решения: сб. ст. всерос. науч.-практ. конф. -Красноярск,СибГТУ.-2006.-С. 60-63,автора- 0,09пл.

11. Киселева, О. В. Безопасность биомассы мицелия при использовании в пищевых целях / О.В. Киселева, С.Ю. Воронина, C.B. Терентий // Молодые ученые в решении актуальных проблем науки: сб. ст. всерос. науч.-практ. конф. -Красноярск, 2012 - С. 252-255, автора- 0,125 пл.

12. Киселева, О. В. Показатели безопасности биомассы мицелия базвдиальных грибов Plewvtus ostreatus и Laetiporus sulphwvus, предназначенного для пищевых целей / О. В. Киселева, С. Ю. Воронина, П. В. Миронов // Новини на научния прогресс: матер, междун. конф. - София, 2012. - С.61 -63, автора- 0,09 пл.

13. Аминокислотный состав белков глубинного мицелия гриба Laetiporus sulphureus / О. В. Киселева [и др.] // Молодые ученые в решении актуальных проблем науки: сб. ст всерос. науч,-пракг: нэнф. - Красноярск, 2013. - Т2. - С.46-49, автора -0,125 пл.

14. Выращивание глубинного мицелия серно-желтото трутовика обьемнодаливным методом / О. В. Киселева [и др.] // Лесной и химический комплексы- проблемы и решения: сб. ст. всерос. науч.-практич. юнф. - Красноярск, 2013. - Т2 - С12-13, автора-0,06 пл.

15. Морфологические особенности мицелия серно-желтого трутовика и возможность его использования в качестве источника пищевого белка / О. В. Киселева [и др.] // Лесной и химический комплексы- проблемы и решения: сб. ст. всерос. науч.-практ. конф,- Красноярск: 2013,- Т.2. - С.9-12, автора- 0,125 пл.

Подписано в печать 22.11.2013. Формат 60x84 1/16. Усл. печ. л. 1,0. Изд. № 3/25. Заказ № 1915. Тираж 100 экз. Редакционно-издательский центр СибГТУ 660049, г. Красноярск, пр. Мира, 82 факс (391) 211-97-25, тел. (391) 227-69-90