Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение штаммов Laetiporus sulphureus (Bull.) Murrill., ксилотрофов древостоев хвойных, и оценка перспектив их использования в биотехнологии

ВАК РФ 03.01.06, Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Автореферат диссертации по теме "Изучение штаммов Laetiporus sulphureus (Bull.) Murrill., ксилотрофов древостоев хвойных, и оценка перспектив их использования в биотехнологии"

На правах рукописи

ИВАНОВА Ирина Евгеньевна

изучение штаммов 1аепр(жп5яслрнипЕия (виьь.) МШШЬЬ,

КСИЛОТРОФОВ ДРЕВОСТОЕВ ХВОЙНЫХ, ЙОЦЕНКА ПЕРСПЕКТИВ ИХ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ В БИОТЕХНОЛОГИИ

Специальность 03.01.06 - Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

14 НАР Ш

Москва 2013

005050582

005050582

Работа выполнена в ФГБОУ ВПО «Московский государственный университет пищевых производств» на кафедре «Химия пищи и пищевая биотехнология»

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор

Громовых Татьяна Ильинична

Официальные оппоненты: Шнырева Алла Викторовна

доктор биологических наук, профессор Кафедра микологии и альгологии биологического факультета Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова

Бирюков Валентин Васильевич доктор технических наук, профессор Заведующий кафедры экологической и промышленной биотехнологии

Университет машиностроения (МАМИ)

Ведущая организация:

Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Мордовский государственный

университет им. Н.П. Огарёва»

Защита диссертации состоится 09 апреля 2013 г. В 15.30 на заседании диссертационного совета Д 501.001.21 при Московском государственном университете им. Ломоносова по адресу: 119234, Москва, Ленинские горы, д.1, стр. 12, биологический факультет МГУ, ауд. М-1. Тел. 8(495)939-54-83, эл. почта: npiskunkova@rambler.ru

С диссертацией можно ознакомится в библиотеке Биологического факультета Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова.

Автореферат разослан ¿^"марта 2013 года.

Ученый секретарь Диссертационного со веча

\fbnp к.б.н. ГТискункова Нина Федоровна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. В настоящее время в России наблюдается повышенное внимание к базиднальным грибам, которые имеют большое значение е биотехнологии пищевых продуктов и фармацевтических производств. Объектами большинства таких разработок являются базидиомицеты, широко исследуемые в различных странах мира из родов Grifóla, Coprinus, Ganoderma, Leminula. Laetiporus, Partus, Pleurotus, Trametes. Возможность использования рассматриваемых грибов для создания профилактических и лечебных средств стала реальной после многолетних фундаментальных исследований процессов жизнедеятельности макромицетов, в том числе особенностей их роста и развития, характера и механизма метаболической и ферментативной активности (Белова Н.В.,2001, Гвоздкова Т.С.,2007). В последние десятилетия привлекают внимание в качестве ведущих объектов биотехнологии, полезных продуктов и препаратов грибы рода Laetiporus.

Широко известен вид Laetiporus sulphweus (Bull.) Murrill, поражающий лиственные породы древостоев. Он обладает хорошими вкусовыми, питательными и лекарственными свойствами. Кроме того, следует отметать и способность этого вида гриба к синтезу полиеновых пигментов каротиноидной природы (ксантофиллы). В последние десятилетня лекарственные препараты, содержащие каротиноиды, используют для профилактической антираковой терапии (Прокопенко Н.Г., 2ООО; Феофилова Е.П. 2001, 2006; Woodall А.А.,1997).

Существует информация об антимикробных, антивирусных свойствах соединений, как плодовых тел, так п мицелия Laetiporus sulphweus (Ефременкова О.В., 2006; Квачева З.Б., 2005). Растущая популярность вида Laetiporus sulphureus делает актуальной разработку вариантов технологии его выращивания с использованием сырьевой базы и отходов растениеводства.

Несмотря на то, что общин объем публикаций, посвященный базидиомицету Laetiporus sulphureus чрезвычайно велик, отсутствуют сведения о биохимическом составе и бактерицидных свойствах плодовых тел и мицелия штаммов рода Laetiporus, развивающихся на хвойных породах деревьев. В настоящее время таких представителей рода Laetiporus, обнаруженных в Северной Америке, стали относить к виду Laetiporus conifericola (Burds and Banik, 2001). На территории России сведения о штаммах, выделенных с древостоев хвойных, отсутствуют. В связи с этим, поиск штаммов рода Laetiporus, выделенных из плодовых тел пораженных древостоев хвойных, и исследование их видовой принадлежности открывает перспективы пополнения коллекций и дает возможность использования в биотехнологии.

Цель работы - изучение штаммов-ксилотрофов рода Laetiporus, выделенных с древостоев хвойных, и оценка возможности их использования в биотехнологии.

Для достижения поставленной цели решали следующие задачи:

• изучить морфолого-культуральные, генетические и физиологические особенности и идентифицировать видовую принадлежность штаммов Laetiporus sp;

* изучить химический состав биомассы мицелия Laetiporus sulphureus (содержание белка и его переваримость, количество аминокислот, липидов, жирных кислот, каротиноидов, углеводов);

■изучить влияние физических факторов на показатели роста штаммов Laetiporus sulphureus в условиях твердофазного и погруженного культивирования;

■ оптимизировать состав технологической среды для получения биомассы мицелия и биосинтеза каротиноидов;

■ изучить антиоксидантную, антимикробиую, противоопухолевую активность и токсичность штаммов Laetiporus sulphureus;

" изучить влияние соли селена на рост штаммов Laetiporus sulphureus и разработать способ получения селенсодержащего мицелия;

■ изучить влияние штаммов Laetiporus sulphureus на пробиотическую культуру Lactobacillus acidophilus;

■ отобрать наиболее перспективные штаммы в качестве продуцентов биологически активных веществ.

Научная повизпа работы

Впервые выделены штаммы с хвойных древостоев Larix sibirica L. рода Laetiporus на территории России. На основании исследований культуральных, физиологических свойств и молекулярно-гснетической идентификации штаммов рода Laetiporus установлена их принадлежность к виду Laetiporus sulphureus.

Мицелий штаммов-ксилотрофов хвойных Laetiporus sulphureus может быть использован для получения белка, незаменимых аминокислот, ненасыщенных жирных кислот и каротиноидоподобных соединений. Максимальное накопление каротиноидов установлено у штамма Laetiporus sidphureus MZ-22.

На культурах клеток простейших доказана безопасность мицелия штаммов Laetiporus sulphureus.

Показана, переваримость белка биомассы мицелия штаммов Laetiporus sulphureus.

Установлено, что в условиях максимального выхода биомассы отмечен более низкий уровень накопления каротиноидов для всех исследуемых штаммов.

Установлено влияние соли селена на показатели роста мицелия штаммов Laetiporus sulphureus; определена оптимальная концентрация селена в среде для получения селенсодержащего мицелия штаммов Laetiporus sulphureus.

Выявлена антимикробная активность спиртовых экстрактов мицелия штаммов Laetiporus sulphureus в отношении условно-патогенных бактерий и цитотоксичность в отношении линии опухолевых клеток Сасо-2.

Показано отсутствие ингибирукмцего влияния препарата мицелия штамма Laetiporus sulphureus на ростовые показатели пробиотической культуры Lactobacillus acidophilus АСТ-44 (ВКПМ В-9647) и обоснована целесообразность

применения препарата мицелия штамма для повышения антиоксидантной активности молочных продуктов.

Практическая значимость работы

-Отобраны штаммы-продуценты каротнноидов и белка, которые депонированы в коллекциях: L sulphureus Ls I-06 (ВКПМ F-982) и L sulphureus (ВКМ F-4276D).

-разработана оптимальная технологическая среда и условия для жидкофазного погруженного культивирования мицелия штаммов Laetiporus sulphureus;

-показана возможность использования растительных отходов предприятий АПК для бноконверсни штаммом L. sulphureus Ls C-Q;

-в результате исследований противоопухолевой активности экстрактов мицелия на линии опухолевых клеток даны рекомендации для использования штамма Laetiporus sulphweits MZ-22 как продуцента противоопухолевых соединений;

-разработан способ получения селенсодержащего мицелия на основе штамма Laetiporus sulphureus MZ-22, обладающего способностью к связыванию селена в биомассе и биосинтезу каротиноидоподобных соединений в количестве 17,8 мг/г.

Апробация работы

Основные положения работы и результаты исследований представлены на конкурсах и конференциях: Международной научной конференции студентов и молодых ученых «Экологические безопасные ресурсосберегающие технологии и средства переработки сельскохозяйственного сырья и производства продуктов питания» (Москва, 2009); 10-ой юбилейной Всероссийской выставке научно-технического творчества молодежи НТТМ (Москва, 2010); V фестивале науки (Москва, 2010); конкурсе молодых ученых VI Московского международного конгресса «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 2011); V Международной научно-технической конференции, посвященной 80-летию университета «Низкотемпературные и пищевые технологии в XXI веке» (Санкт-Петербург, 2011); симпозиуме в МГУ им. М.В. Ломоносова «Биологически активные вещества микроорганизмов: прошлое, настоящее, будущее» (Москва, 2011); III Съезде микологов России (Москва, 2012); X Международной научно-практической конференции с международным участием «Живые системы и биологическая безопасность населения» (Москва, 2012).

Работа выполнялась при финансовой поддержке грантов: аналитической ведомственной целевой программы «Развитие научного потенциала высшей школы (2009-2010 годы)», проектов № 4209 и № 9353 «Коллекция культур бактерий, бактериофагов, дрожжевых и мицелнальных грибов как база для научно-образовательного процесса, сохранения биоразнообразия и развития современной биотехнологии»; по госконтракту П175 в рамках федеральной целевой программы «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 гг; гранта Президента РФ по поддержке ведущих научных школ; тема № 16.120.11.3245.-НШ «Разработка новых пищевых

технологий с участием живых систем на основе нетрадиционных подходов к управлению их жизнедеятельностью и обеспечению качественных показателей готовой продукции».

Структура и объем работы

Диссертация состоит из введения, 9 глав, заключения, выводов, списка литературы и приложений. Обший объем диссертации 186 страниц (основной текст - 167 стр.; приложения 19 стр.). Диссертация включает 43 рисунка и 28 таблиц. Список цитируемой литературы содержит 166 источников, из которых 69 на иностранных языках.

Публикации

Материалы диссертации изложены в 15 публикациях (из них 3 статьи в журналах, рекомендованных ВАК, и 1 патенте).

Благодарности

Автор выражает благодарность заведующему кафедры «Химия пищи и пищевая биотехнология» академику РАЕН, д.т.н. А.И. Жаринову, зав. каф. «Технология молока и молочных продуктов» проф., д.т.н. В.И. Ганиной, доц. каф. «Биохимия» Е.Г. Черемных за помощь, оказанную при работе ^над диссертацией; руководителю лаборатории молекулярных основ биотрансформаций Института биохимии им. А.Н. Баха д.б.н. О.В. Королевой за предоставление базы лаборатории для проведения экспериментальных исследований; к.б.н. И.В. Николаеву, аспиранту A.A. Торковой за помощь в проведении исследований.

Отдельная благодарность научному руководителю проф., д.б.н. Т.Н. Громовых за неоценимую помощь, понимание и поддержку на всех этапах работы над диссертацией.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во введении обоснована актуштьность проблемы, сформулированы цели и задачи исследований, показана научная новизна и практическая значимость результатов работы

В первой главе представлены сведения о характеристике рода Laetiporus, его систематическом положении, приведено описание вида Laetiporus sulphureus: его составе, свойствах, морфолого-культуральных особенностях. Показаны аспекты использования плодовых тел и мицелия Laetiporus sulphureus для получения биологически активных соединений. Приводятся сведения о современных источниках каротиноидов и биологически активных добавках на их основе. Проанализированы сведения по использованию макромицетов для получения селенсодержащего мицелия.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

При выполнении работы объектами исследований служили 12 штаммов, выделенные из плодовых тел пораженных древостоев лиственницы сибирской

Larix sibirica L. в период 1996-2006 гг. в республике Тыва. После проведения скрининга по скорости роста и пигментообразованию были отобраны три штамма: Ls-06 (ВКПМ F-982), MZ-22 (ВКМ F-4276D), Ls C-Q коллекции культур Московского государственного университета пищевых производств.

Культуралыю-морфологические признаки исследуемых штаммов изучали на различных агаризованных питательных средах (сабуро, крахмало-аммиачная, сусловая, капустная (с добавлением соевой муки, лиственничных опилок и молочной сыворотки)и дрожжевая). Учет результатов проводили в течение всего срока наблюдения по следующим показателям: диаметр разрастания колоний, текстура и форма колоний, пигментация мицелия, плотность и высота воздушного мицелия, среднесуточная скорость роста, ростовой коэффициент. Отбор продуктивных штаммов проводили по показателям ростового коэффициента на исследуемых питательных средах.

Изучение микроморфологических признаков штаммов проводили в камерах Ван-Тигема с использованием световой микроскопии при помоши светового микроскопа марки LW Scientific (США). Микроморфологию ядер изучали с использованием люминисцентной микроскопии, для чего 7, 14 и 21-суточный мицелий фиксировали на покровном стекле в модифицированном растворе Карнуа с последующим окрашиванием реактивом ДАПИ (4',6-диамидино-2-фенилипдол, SIGMA) в концентрации 500 нг/мл (Ota et al., 1998); в работе использовали микроскоп Axioskop 40 FL, фильтр 02 (Zeiss). Для изучения микроморфологии бластокоиидий использовали сканирующую электронную микроскопию. Агаровые блоки с наросшим 7, 14 и 21-суточным мицелием фиксировали в парах осмия. После высушивания образцы закрепляли, напыляли смесь платины и палладия (ÍB-3 Ion Coater) и просматривали с помощью сканирующего электронного микроскопа «Hitachi» S-405A лаборатории электронной микроскопии МГУ им. М.В. Ломоносова.

Для подтверждения видовой принадлежности проводили генетическую идентификацию. Исследовали участок ядерной рДН1С, содержащий транскрибируемый спейсерный участок ITS. Для анализа хроматограмм, полученных после секвенирования, использовали программу Chromas Pro Sequence Scanner; для поиска гомологичных последовательностей в Генбаике -программу BLAST (wwv.ncbi.nih.gov). Исследования проводили на базе кафедры микологии и альгологии МГУ им. М.В. Ломоносова.

Рост мицелия штаммов Laetiporus sulphureits изучали при различных значениях температуры (16, 20, 24, 28 и 32 °С), показателях рН (от 3,5 до 7,5) и при условиях освещенности (500 люкс, фотонериод 12:12) и определяли оптимальные параметры для каждого штамма.

Изучение динамики накопления биомассы штаммами Laetiporus sulphureits проводили путем статического жидкофазного культивирования на капустной среде при 28±1 "С. Продуктивность биомассы оценивали весовым методом на 7,10,15,20,25, 30, 35 сутки культивирования.

Изучение химического состава мицелия Laetiporus sulphureits проводили классическими методами. Содержания белка в мицелии штаммов Laetiporus sulphureus определяли по методу Кьельдаля (ГОСТ 26889—86,1986);

качественный состав аминокислот - на аминокислотном аначизаторе Хитачи (Япония); отдельно содержание триптофана - спектрофотометрическим методом (Fletrous D.J., 1993); общее содержание липидов - по методу Блайя и Дайера, предварительно перетерев сырой мицелий с песком в жидком азоте (Бриттон Г., 1986); определение жирнокислотного состава - с помощью газожидкостной хромотографии (ГОСТ Р 51483-99,2001); количество простых и легкогидролизуемых углеводов - методом Бертрана (ГОСТ 26176-91,1999), трудногидролизуемых углеводов - методом Кюршнера и Ганака (Ермаков А.И., 1972). Анализ содержания каротиноидов в мицелии штаммов Laetiporus siilphweus проводили методом экстракции (Капич А. Н., 1996). Содержание каротиноидов определяли в пересчете (5-каротин в экстракте спектрофотометрическим методом на спектрофотометре Сагу 100 Bio (Varian Inc., США). Исследования проводили на базе Института биохимии им. А.Н. Баха.

Культивирование штаммов проводили в течение 20 сут погруженным способом в круглодонных конических стеклянных колбах объемом 750 см на качалках при скорости вращения 150 об/мин и температуре 28±1 "С. Штаммы Laetiporus sulphureits культивировали на модифицированной питательной глюкозо-пептонной среде (Hwang Н. S., 2008), в которой пептон заменяли на молочную сыворотку: глюкоза - 10г/л, молочная сыворотка - 21 г/л, КН2Р04 -0,6 г/л, К2НР04 - 0,4 г/л, ZnS04x7H20 - 1 мг/л, FeS04x7H20 - 0,5 мг/л, MnS04x5H20 - 50 мг/л, MgS04x7H20 - 0,48г/л, СаСЬ - 0,5 г/л. Для подбора оптимальпого состава питательной среды использовали метод полного факторного эксперимента (N = 2x103). Подбор оптимального состава среды проводили по изменению концентраций (факторы варьирования) г/л: MnS04x5H:0 (верхний уровень - 0,15, нижний - 0,05), глюкоза (верхний уровень - 15, нижний - 5), молочная сыворотка (верхний уровень - 27, нижний 115).

Твердофазное культивирование проводили на растительных субстратах: подсолнечной лузге, лиственничных опилках и смеси злаковых культур: пшеница, просо, овес. Оценивали рост изучаемых штаммов по показателям среднесуточной скорости роста и характеру формирования воздушного мицелия.

Антимикробную активность культурапьных жидкостей штаммов, содержащих продукты метаболизма, и спиртовых экстрактов из мицелия базидиомицетов изучали методом дисков (Егоров Н.С., 1994). В качестве тест-культур использовали штаммы грампопожительных и грамотрицательных условно-патогенных микроорганизмов коллекции Аналитического испытательного центра «БИОТЕСТ» МГУПБ: Staphylococcus aureus 6538-Р, Escherichia coli М17, Salmonella typhimurium 79, Listeria monocytogenes 766.

Противоопухолевую активность экстрактов мицелия штаммов проверяли на линии опухолевых клеток Сасо-2 по показателю жизнеспособности клеток, оценивая цитотоксичность действия мицелия.

Антиоксидантную емкость экстрактов мицелия штаммов определяли по методу пероксильного радикала (Prior R.L., 2003).

Изучение токсичности штамма Laetiporus sulphureus проводили путем биотестирования с использованием простейших - инфузориях Paramecium caudatum и Tetrachymenapyrlformis коллекции простейших МГУПБ (Чсремных Е.Г., 2004). Влияние препарата мицелия штамма Laetiporus sulphureus на пробиотическую культуру Lactobacillus acidophilus- АСТ-44 (ВКПМ В-9647) изучали путем культивирования закваски методом НВЧ (Меркулова Н.Г., 2009).

Действие соли селенита натрия на рост штаммов Laetiporus sulphureus оценивали культивированием на агаризованных и жидких питательных средах. Получение селенсодержащего мицелия штаммов Laetiporus sulphureus проводили путем жидкофазного культивирования на капустной селенсодержащей среде. Концентрацию селена в высушенном мицелии штаммов измеряли методом атомно-абсорбционной спектрометрии (МУК 4.1.991-00, 2000).

При проведении научно-исследовательской работы получали не менее трех-пяти параллельных вариантов результатов экспериментов. Полученные данные обрабатывали статистически с использованием пакета программ Statistica 6.0.

МОРФОЛОГИЧЕСКИЕ И КУЛЬТУРАЛЬНЫЕ СВОЙСТВА ШТАММОВ LAETIPORUS SULPHUREUS

С начала 21 столетия американскими учеными было показано, что представители рода Laetiporus, поражающие древостой хвойных, принадлежат к виду Laetiporus conifericola (Burds and Banik, 2001). В наших исследованиях были использованы 12 штаммов, выделенные из плодовых тел пораженных древостоев Larix sihirica L., произрастающих в Республике Тыва. Все исследуемые изоляты на агаризованных средах образуют колонии с ватообразньгм воздушным высоким мицелием от бледно-кремового до ярко розовато-оранжевого. Цвет обратной стороны колоний бледно-желтого цвета.

Для дальнейшей работы были отобраны 3 штамма, различающиеся способностью к образованию пигмента (воздушный мицелий штамма Ls 1-06 розовато-оранжевого, Ls C-Q бледно-розового оттенка, MZ-22 - ярко-оранжевого цвета) и имеющие наиболее высокие показатели роста.

Изучение микроморфологии мицелия штаммов (рисунок 1) показало, что он состоит из длинных гиф с простым ветвлением, без пряжек, отмечалось образование овальных, шарообразных и грушевидных структур, расположенных на гифах терминально или интеркалярно (рисунок I А). При изучении микроморфологнн базидиоспор в режиме световой микроскопии было установлено, что штаммы принадлежат к роду Laetiporus. Мицелий исследуемых изолятов дикариофитный, ядра расположены тесно друг к другу (рисунок 1 Г).

Рисунок 1 - Микроморфология мицелия штаммов Laetiporus sp; А -шарообразные структуры на гифах (РЭМ-микроскопия); Б - утолщение клетки мицелия при образовании хламидоспор; В - вздутия в районе септ; Г-дикариофити ый м ице л и й

На основании микроморфологических и культуральных признаков штаммов на агаризованных средах установлено их сходство с видом Laetiporus sulphureits. Изучение их генетической принадлежности секвенированием вариабельных участках ITS рДНК подтвердило сходство с видом Laetiporus sulphureus на 99 % (в качестве типового вида использован L. sulphureus LAE 09-LS03). Таким образом, установлено, что выделенные штаммы из плодовых тел, растущих на хвойных породах деревьев на территории Республики Тыва, принадлежат к виду Laetiporus sulphureus, в связи с чем, утверждение авторов Ж. Бурдсала и М. Баника о том, что на древостоях хвойных паразитирует только вид Laetiporus conifericola неправомочно, так как полученные нами данные этому противоречат.

Изучение культуральных особенностей штаммов Laetiporus sulphureus на агаризованных питательных средах показало, что максимальный прирост мицелия отмечен на капустном агаре на 12 сутки у штамма Ls 1-06; на 10-е сутки у штамма Ls C-Q и на 8-е у штамма MZ-22. Наибольшая скорость роста приходится на 4 - 6 сутки культивирования. Учитывая ростовые коэффициенты, штаммы Laetiporus sulphureus MZ-22 и Ls C-Q можно отнести к быстро растущим, а штамм Ls 1-06 - к виду, растущему со средней скоростью. Наиболее оптимальной средой для культивирования штаммов по показателям роста является капустный агар, что подтверждают исследования по среднесуточной скорости роста и динамики прироста колоний.

Для повышения ростовых показателей штаммов ЬаеНрогиэ 5и1р1тгеш проводили модификацию капустной среды путем добавления различных составляющих: лиственничные опилки, соевая мука «сопролец» и молочная сыворотка. Высокий ростовой коэффициент у всех штаммов наблюдается на среде, содержащей молочную сыворотку (от 182 до 281). Формирующийся мицелий штаммов характеризуется средней плотностью и высотой мицелия. Добавление лиственничных опилок в питательную среду увеличивает скорость роста, однако, из-за рыхлости мицелия ростовые показатели ниже.

Исследования роста всех штаммов показали, что оптимум температуры составляет 24-28 °С. При культивировании изменяется морфология штаммов: при температуре 30-32 СС штаммы формируют более рыхлый мицелий с ярко выраженными концентрическими кругами, тогда как при температуре 16-20 °С - более плотный.

Все исследуемые штаммы ЬаеНрогш $и1р1гигеш растут при большом интервале рН среды; однако более высокие показатели роста наблюдались при значении рН - 3,5, тогда как самые низкие - при рН 7,5.

Исследования показали, что при культивировании штаммов Ьаефогш т1рИигеи8 в условиях освещенности 500 люкс с фотопериодом 12:12 часов на агаризованных средах достоверных изменений ростовых показателей не отмечено. Однако в мицелии штаммов в с условиях освещенности накапливалось больше пигмента.

ЖИДКОФАЗНОЕ КУЛЬТИВИРОВАНИЕ ШТАММОВ ЫЕПРОЯиБ хиичитЕт

Динамика накопления биомассы штаммами Ъаейрогт яи/р/шгеиз

Интенсивность развития Ьасйрогт хи1р1тгсш можно оценить по накоплению биомассы мицелия при выращивании штаммов на жидких питательных средах. Исследования показали, что при статическом жидкофазном культивировании на капустной среде наибольшее накопление биомассы (в стационарной фазе роста) отмечается на 30-е сутки культивирования для штамма Ьэ 1 -06 и составляет 3,6 г/л на абсолютно сухую биомассу (АСБ), а для штамма Ья С-<3 -1,9 г/л. Штамм \fZ-22 быстрее достигает максимальной величины накопления биомассы - на 20-е сут, которая составляет 2,1 г/л АСБ, чем подтверждается и его высокая скорость роста на агаризованных средах (рисунок 2).

Культивирование штаммов ¿асИрогш 5и1р1тгеи$ на среде с дополнительными источниками азота и углерода позволило повысить продуктивность биомассы мицелия, выход которой на среде с молочной сывороткой увеличился до 3,8 г/л для штамма Ьэ С-С>; 4,86 г/л для штамма 106; 5,1 г/л для штамма \lZ-22.

1 2 3 Л

Питательная среда „ и 1-06

1- Капустная среда (КЛ)

2-КА+опилии ШМг-22

3-КА+соевая мука ш1.ьС-0

4-КА+м«эло11ная сыворотка

Рисунок 2 - Выход биомассы мицелия штаммов ¿ае^роги.^ $и1р1шгеш при статическом жидкофазном культивировании на капустной среде

БИОХИМИЧЕСКИЙ СОСТАВ МИЦЕЛИЯ ШТАММОВ ЬАЕПРОШ75

Биологическая ценность биомассы базидиомицетов определяется не только количеством белка, липидов, углеводов, но и качественным содержанием аминокислот в белке, жирнокислотным составом липидов. Для представителей ЬаеНрогия ,1и1р1тгеш также важно количество каротиноидоподобных соединений, которые синтезируют штаммы этого вида, выделенные из лиственных пород.

Согласно полученным данным, в биомассе мицелия исследуемых штаммов количество белка составляет от 15,03 до 16,8 %, в котором обнаружено большое количество незаменимых аминокислот (более 30 %). Это не превышает показатели для штаммов, указанных авторами Т.С. Г'воздковой, Т.В. Чернооком и другими. Однако следует отметить высокое содержание аминокислоты триптофана (1,66-2,22 г/100 г белка) в изучаемых нами штаммах, что ранее не было установлено выше перечисленными авторами у исследуемых продуцентов. Отмечалось в основном превалирование в биомассе лейцина и валина.

Лимитирующая аминокислота в биомассе мицелия - метионин, скор которой составляет 30,3 %. Результаты по исследованию переваримости белка изучаемых штаммов показали, что она составляет 54,2 % для штамма М2-22 и 61,4 % для штамма Ьэ С-0, что характерно для многих других грибов в связи с присутствием в тканях грибной клетчатки и хитина.

Количественное исследование липидов показало наличие их от 20,07 до 29,35 % в мицелии исследуемых штаммов. Максимальное содержание липидов отмечено в мицелии штамма Ья С-<3 (29,35 %), тогда как в мицелии 1-06 только 20,07 и М2-22 ~ 21,33 %. Ненасыщенные жирные кислоты составляют более 50 % от общего количества липидов с преобладанием олеиновой кислоты (таблица 1).

Таблица 1 — Состав жирных кислот липидных фракций штаммов Laetiporus sulphureus_

Жирная кислота Содержание в %

Ls 1-06 LsC-Q MZ-22

С| |1 ЬзСОО! 1(лаурнновая кислота) - - 0,4

С|31127СООН(тетрадекаповая кислота) 2,17 2,23 1,4

СнНвдСООП (пентадекановая кислота) 0,49 0,25 0,6

С|5Н29СООН(пальмитолешювая кислота) 0,83 0,38 1,14

С|5Нз|СООН (пальмитиновая кислота) 23,18 36,09 32,07

С|6НззСООН (маргариновая кислота) 0,91 0,19 0,64

С17Н31С0011(л и нолевая кислота) 22,60 15,28 23,72

С|71ЬзСООН(олеиновая кислота) 26,10 34,86 26,39

С17Н35СООН (стеариновая кислота) 19,02 8,94 9,88

С19Нз9СООН(эйкозановая) 0,73 0,64 0,75

С2| Н^СООЩдокозаповая кислота) 0,67 0,21 0,48 ■

С29Н59СООН(трикозаповая кислота) 0,58 0,12 0,60

С23Н47СООН (лигноцериновая кислота) 0,48 0,21 1,68

С^Ь^СООН (11-эйкозеновая кислота) 0,56 0,22 -

С17П33СООН (элаидиновая кислота) 0,82 - -

В мицелии всех штаммов Laetiporus sulphureus присутствует ненасыщенная линолевая кислота, содержание которой составляет от 15,28 до 23,72 % от общего числа жирных кислот. Для мицелия штамма MZ-22 ее количество максимальное. Из насыщенных жирных кислот содержание пальмитиновой кислоты наибольшее (от 23,18 до36,09 %). Следует отметить, что при исследовании плодовых тел L. sulphureus C.B. Агафоновой и мицелия Lsulplntreus Т.С. Гвоздковой, В.В. Щербой и А.Н. Капичем установлено преобладание незаменимой линолевой кислоты от 50 до 70 %, в отличие от количества в мицелии изучаемых нами штаммов.

Биологическую активность грибов связывают с наличием в них углеводов. Исследования углеводного состава штаммов Laetiporus sulphureus показали, что наибольшее их количество отмечено в мицелии штамма MZ-22 (28,7 %) (таблица 2).

Из таблицы видно, что количество легкогидролизуемых полисахаридов значительно выше, чем трудногидролизуемых.

Таблица 2 - Доля углеводов в мицелии изучаемых штаммов Laetiporus

sutpnureus Штаммы Laetiporus sulphureus Водорастворимые углеводы Лсгкогидролизуемые полисахариды Трудногидролизуемые полисахариды

Ls 1-06 2,1±0,18 19,8 ±0,9 6,0±0,14

Ls C-Q 2,2±0.05 19,3±1,1 5.03±0,12

MZ -22 1,5±0,04 20,4±0,8 6,8±0,21

Наиболее важный признак - способность к биосинтезу каротиноидов -является основным показателем для отбора штаммов-продуцентов L.sulphureus. Известно, что каротиноиды синтезируют и другие организмы: грибы Phycomyces blakesleeanus, Rhodotorula glutinis, Mucor roiixii, Blakeslea trispora, бактерии Rhodomicrobium vamielii, Rhododmicrobium acidophils Chloroflexis spp., водоросли рода Danaliella, растения Lycopersicon spp. Получение каротиноидов из перечисленных продуцентов имеет ряд недостатков: низкий выход действующего вещества, большие потери при очистке, либо применение токсичных стимуляторов синтеза каротиноидов, или токсичность самой получаемой каротиноидной биомассы. Следует также отметить, что химическое строение каротиноидов растений, грибов и бактерий различное, что отличает и степень их биологической активности. Важным преимуществом штаммов-продуцентов L.sulphureus является наличие в его составе редкого соединения кислого каротиноида - летипоровой кислоты, которое было исследовано рядом зарубежных авторов (Weber R.W.S, Davoli P., 2004, 2006 гг.), и определяет высокие иммуномодули руютис, антиоксидантные и про'тиоопухолевые свойства этого вида макромицета. Наряду с этим, L.sulphureus - съедобный гриб, не патогенен, не вызывают аллергии и нетоксичен. В наших исследованиях методом пересчета на р-каротин установлено, что содержание каротиноидов в биомассе мицелия штаммов от 2,12 до 3,58 мг % и максимально в мицелии штамма L.sulphureus MZ-22.

ОЦЕНКА БЕЗОПАСНОСТИ ЭКСТРАКТОВ ШТАММОВ LAETIPORUS SULPHUREUS

Перспективным и доступным методом определения безопасности пищевых продуктов и источников биологически активных веществ считают метод биотестирования с использованием простейших - инфузорий Tetrahymena pyriformis, Paramecium caudatum и др.

На первом этапе определяли степень токсичности водных и спиртовых экстрактов мицелия штаммов Laetiporus sulphureus на Paramecium caitdatum. Результаты показали, что водные экстракты мицелия штаммов (мицелий : вода - 1:30) нетоксичны при соотношении экстракт:вода - 1:5 для штаммов Ls 1-06 и Ls C-Q, тогда как для штамма MZ-22 - только 1:10. Спиртовые экстракты мицелия всех штаммов Laetiporus sulphureus (1 % спирт) нетоксичны при

содержании сухих веществ 0,02 % в экстракте (коэффициент прироста клеток Parameciwn caudatum составил от 3,07 до 3,15).

На втором этапе исследований на инфузориях Tetrahymena pyrifonnis использовали разведение водных и спиртовых экстрактов мицелия в соотношении, которые являлись нетоксичными для Paramecium caudatum.

Биологически активные вещества, влияющие на жизнеспособность инфузорий, содержатся у всех штаммов Laetiporus sulphureus в достаточно большом количестве (коэффициент прироста клеток составил от 13 до 18 для водных экстрактов и от 10 до 13 для спиртовых экстрактов). В связи с этим, по результатам биотестирования все штаммы можно считать нетоксичными.

ОПТИМ ИЗАЦИЯ ПИТАТЕЛЬНОЙ СРЕДЫ ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАШШЯ ШТАММОВ LAETIPORUS SULPHUREUS В ПОГРУЖЕННОЙ КУЛЬТУРЕ

По результатам исследований можно сделать заключение, что все исследуемые штаммы Laetiporus sulphureus имеют довольно высокую скорость роста, нетоксичны и содержат в своем составе биологические активные вещества. В связи с этим, их можно рассматривать как перспективные объесты для создания биологически активных добавок. Оптимизация питательной среды для культивирования - важная часть для биотехнологии продуцентов биологически активных соединений Laetipoms sulphureus, которую проводили в два этапа: методом полного факторного эксперимента.

При оптимизации за основу использовали глюкозо-пептонную среду, в которой пептон в среде заменяли на молочную сыворотку, следующего состава: глюкоза - Юг/л, молочная сыворотка - 21 г/л, КН2Р04 - 0,6 г/л, К2НР04 - 0,4 г/л, ZnS04x7H20 - 1 мг/л, FeS04x7H20 - 0,5 мг/л, MnS04x5M20 - 50 мг/л, MgS04x7H20 - 0,48г/л, СаСЬ - 0,5 г/л. В качестве варьирующих факторов в среде брали глюкозу, молочную сыворотку и MnS04x5H20.

В результате проведенной оптимизации было установлено, что зависимость выхода биомассы у штаммов Laetiporus sulphureus при различном уровне содержания питательных веществ в среде неодинакова. Так, для штаммов Ls 1-06 и MZ-22 наибольший выход биомассы (5,85 г/л и 5,6 г/л соответственно) наблюдается при максимальном уровне содержания питательных веществ в среде, для штамма Ls C-Q - при максимальном уровне содержания глюкозы и молочной сыворотки и минимальном - соли марганца (12,96 г/л). Установлено, что наиболее продуктивный штамм - Ls C-Q, выход биомассы которого повысился от 2,75 до 12,96 г/л на АСБ. Такие данные свидетельствую о сильной зависимости штамма роста биомассы от уровня содержания питательных веществ в среде.

При подборе оптимальной среды, для культивирования L sulphureus важно было учесть и уровень каротиноидов в биомассе мицелия, т.к Laetiporus sulphureus, как отмечалось выше, единственный на сегодняшний день

съедобный базидиомицет, синтезирующий каротиноид редкого строения -летипоровую кислоту. Анализ показал, что наибольший выход каротиноидов в пересчете на АСБ отмечен на средах с минимальным уровнем молочный сыворотки в питательной среде для штаммов Ьб 1- 06, LsMZ- 22 и максимальном ее уровне для штамма Ьэ С-С). Наибольшее накопление каротиноидов наблюдается у штамма М2-22 (от 6,06 мг % до 45,71мг %), минимальное - у штамма Ьб С-С? (1,57-5,88 мг %).

Как известно, для извлечения каротиноидов используют полярные растворители (Кретович В Л., 1986). Для выбора наиболее подходящего растворителя исследования проводили с экстрагентами: ацетон, 96 % этанол, смесь хлороформ:этанол:вода (1:2:0,8 по объему). В результате исследований было установлено, что лучший экстрагент - этанол 96 %. При экстракции 96%-м этанолом количество экстрагируемых каротиноидов максимально и выше в 1,5-1,7 раз чем при экстракции ацетоном. Так, для штамма MZ-22 экстракция каротиноидов увеличилась с 45, 71 мг % до 74,5 мг %.

Влияние освещения на рост биомассы и биосинтез каротиноидов у штаммов ЬаеИрогии ьи/р/шгеиь

Рядом авторов (Бэккер З.Э., 2003; Гвоздкова Т.С., 2003) установлено, что свет стимулирует образование пигментов в мицелии грибов. В наших исследованиях определено, что при погруженном жйдкофазном культивировании количество каротиноидов в мицелии всех штаммов в условиях освещения увеличивается в 14-24 раза в сравнении с контролем (рисунки За и 36). Наибольшая разница в накоплении каротиноидов была отмечена у штамма М2-22 и составила 1787,8 мг %.

g 18® 21600 £ 1400 ¡ Ш0 ' 1.1000 5 800 г б« ■ 5 ад

I ш

бноскщгш

« СОСВПШШ.Ч

127,111,23

Ж 1

М2Ш5 над,

со. 1-ое Штаммы Lastiponts sulphmete

268,212.63

r / сосвгшгакем 6ei осзе иеная

9..................... 9 •--------------------------------

7 -

6 • 5,6í0j¡3

: В 5 - 4.95:031

шссшщвимем

: i 4 3,57-0,25

| 3.WI.02 ;;6гзк5идгн«я

§ 3.....

i 'Л 2 J

MZ-22 UC-Q U1-Q5

Шгзмлы/атрлтипфЛигйи

а б

Рисунок 3 - Влияние освещенности на биосинтез каротиноидов (а) и прирост биомассы (б) штаммами ЬаеНрогт 5и1р1гигеш

Кроме того, в условиях освещения увеличился выход биомассы у всех штаммов ЬаеНрогш зи1рИигеи$ в 1,2-2,3 раз. Следует указать, что достоверного положительного влияния при культивировании на агаровых средах отмечено не было.

Биомасса, полученная в условиях погруженного культивирования с освещением продуцента, отличалась яркой красно-оранжевой окраской по сравнению с биомассой, полученной при культивировании без света, цвет мицелия которого был светло-оранжевым.

БИОЛОГИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ МИЦЕЛИЯ И КУЛЬТУРАЛЬНЫХ ФИЛЬТРАТОВ ШТАММОВ ЬАЕТ1Р(Жи8 8т.РН1ЖЕиБ

Оценка биологической активности (антимикробной, противоопухолевой) и токсичности позволяет дать объективную оценку возможности их использования в биотехнологии биомассы мицелия и биологически активных веществ. Кроме того, такие показатели позволяют сравнить выделенные штаммы с древостоев хвойных со штаммами £.ягф/шгам, выделенными с лиственных пород и уже рекомендованными для получения биологически активных добавок, таких как, например, «Летипорин» в Белоруссии.

Антиоксндантная емкость

Антиоксидантная емкость является важным показателем биологической активности и позволяет рекомендовать полученную биомассу мицелия для использования в различных областях: для получения пищевых и кормовых добавок, биологически активных веществ.

В наших исследованиях установлено, что при культивировании в условиях освещения и в темноте количество каротиноидов в экстрактах мицелия неодинаково. В связи с чем, оценивали антиоксидантную емкость в экстрактах различных партий мицелия, полученного при погруженном культивировании на оптимизированной по выходу каротиноидов среде с освещением и без освещения.

Наибольшей антиоксидантной емкостью обладает гидрофильная фракция. В условиях освещения антиоксидантная активность штаммов увеличивается в среднем в 2 раза для гидрофильной фракции и 3-5 раз для липофильной. Максимальная активность образцов мицелия отмечена у штамма MZ-22, минимальная - у С-С>. Однако следует отметить, что липофильная фракция этого штамма обладает большей активностью по сравнению с другим (таблица 3).

Таблица 3 - Антиоксидантная ёмкость мицелия штаммов Laetiponis sulphureus

Штамм Laetiporus sulphureus Антиоксидантная емкость, мкмоль ТЭ (эквивалента тролокса)/г.

Экстракт мицелия, полученного без освещения Экстракт мицелия, полученного с освещением

Гидрофильная фракция Липофильная фракция Гидрофильная фракция Липофильная фракция

MZ-22 41,30±2.11 7,63±0,31 78,64±2,25 24Д7±2.72

Общая АЕ/г 48,93±2,42 Общая АЕ/г 102,91±4,97

L.s. C-Q 22,0б±1,02 6,3711 ± 0.2931 37,37±1,83 32,60±2,14

Общая АЕ/г 28,43±1,31 Общая АЕ/г 69,97±3,97

L.s. 1-06 32,95±1,0732 5,0370 ± 1,2351 50,12±2,01 2035±1,36

Общая АЕ/г37,98±2,3 Общая АЕ/г 70,47±3Г37

Таким образом, при культивировании в условиях освещения увеличивается биосинтез каротиноидов, что доказывает зависимость значений антиоксидантной емкости от количества пигмента в биомассе мицелия штаммов.

Антимикробная активность штаммов Laetiporns sulphureus

Изучение культуральных жидкостей, содержащих продукты метаболизма штаммов гриба Laetiporus sulphureus, и спиртовые экстракты мицелия (в 30% спирте) оценивали на тест-культурах грамотрицательных бактерий Escherichia coli М 17 и Salmonella typhimurium 79 и грамположительных бактерий Staphylococcus aureus 6538-Р и Listeria monocytogenes 766. Исследования показали, что все используемые тест-культуры с разной степенью чувствительны к метаболитам штаммов Laetiporus sulphureus. Наибольшая антимикробная активность культуральных фильтратов и спиртовых экстрактов отмечена для штамма - Ls 1-06. Зоны подавления роста тест-культур составляют от 9 до 16 мм. Лучше всего штаммы подавляют рост грамположительных бактерий Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes. Культурачьные фильтраты в основном проявляют бактериостатическое действие, тогда как спиртовые экстракты - бактерицидное.

В связи с тем, что штамм Ls 1-06 Laetiporus sulphureus обладает высокими антимикробными и антиоксидантными свойствами, представляло интерес изучить возможность использования его мицелия для повышения антиоксидантной емкости молочного продукта. Проведенные исследования по влиянию добавки мицелия Laetiporus sulphureus показали значительное

увеличение антиоксидантной активности ЗЦМ по сравнению с контролем [Ким И. А., 2011].

Учитывая, что штамм Ls 1-06 проявляет перечисленные свойства, целесообразно предложить его для обогащения кисломолочных продуктов в сочетании с пробиотическими культурами, оказывающими положительное влияние на микрофлору человека и проявляющими антагонистическую активность против условно-патогенных микроорганизмов. Для этого исследовали влияние штамма Ls 1-06 Laetiporus sulphureus на пробиотическуто культуру Lactobacillus acidophilus АСТ-44, часто применяемую при производстве кисломолочных продуктов и обладающие высокой антимикробной активностью.

Исследованиями установлено, что при добавлении к закваске биомассы штамма Ls 1-06 Laetiporus sulphureus в сочетании с пробиотической культурой Lactobacillus acidophilus АСТ-44 значение кислотности изменяется более интенсивно по сравнению с контрольным образцом, где в качестве закваски была только монокультура Lactobacillus acidophilus АСТ-44. Численность клеток (КОЕ/г) в закваске, в состав которой вносили биомассу гриба Laetiporus sulphureus, через 4 часа с момента заквашивания была больше, чем в контрольном образце. Отмечено, что штамм Ls 1-06 Laetiporus sulphureus в сочетании с пробиотической культурой АСТ-44 влияет на скорость сквашивания молока, что приводит к увеличению кислотности до рН=4,35. Присутствие в молоке добавки мицелия штамма Ls 1-06 Laetiporus sulphureus незначительно влияет на рост и развитие пробиотической культуры Lactobacillus acidophilus АСТ-44.

Таким образом, можно утверждать, что введение биомассы мицелия штамма Ls 1-06 Laetiporus sulphureus не ингнбирует рост пробиотической культуры Lactobacillus acidophilus АСТ-44, что позволяет рекомендовать его для обогащения молочных продуктов ценными аминокислотами и биологически активными веществами, обладающими антиоксидантной и антимикробной активностью.

Противоопухолевая активность штамма Laetiporus sulphureus

Учитывая, что наибольшей антиоксидантной активностью среди изучаемых штаммов Laetiporus sulphureus обладает штамм MZ-22, исследовали противоопухолевую активность спиртовых экстрактов биомассы мицелия, содержащей 17,9 мг/г каротиноидов, на линии клеток Сасо-2.

Результаты показали, что штамм MZ-22 обладает противоопухолевым действием на линию опухолевых клеток Сасо-2 при концентрации сухого вещества в экстракте (25 % спиртовой) 0,1 %. При этом цитотоксический эффект составляет 79 %. Такой высокий показатель активности при низкой концентрации сухого вещества открывает возможности для дальнейшего изучения штамма в качестве источника противоопухолевых соединений. Основным компонентом, обеспечивающим биологическую активность экстрактов, вероятно, следует считать каротиноиды в мицелии штамма MZ-22.

ПЕРСПЕКТИВЫ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ ШТАММОВ ЫЕПРОЕиЗ ЯЬТРНиЯЕШ

Влияние соли селена на рост мицелия штаммов Ьаейрогю зи1р1шгею

Широкое использование базидиомицетов обусловлено их способностью сорбировать микроэлементы, в частности селен. Проблема недостаточности селена в питании привлекает в настоящее время повышенное внимание, поэтому разработка селенсодержащих биологических добавок становится все более актуальной (Савченко М.Ф., 2001). Искусственное снабжение организма селеном при его пищевом дефиците может осуществляться: в форме неорганического селена (селенита или селената натрия); в форме органических соединений селена микробиального, либо дрожжевого происхождения. Одной из основных форм существования органического селена в грибных тканях является селенметионин.

На основании всего выше указанного целью исследования было получение биомассы мицелия штаммов Ьаеиротз зи1рИигеиз с повышенным содержанием органического селена. На первом этапе исследовали рост штаммов ЬаеПропя $и1р1тгет при различных концентрациях соли селена на агаризованной капустной среде (15 мг/л, 20 мг/л, 25 мг/л селена). Результаты исследований показали, что с повышением концентрации соли селена в среде замедляется рост колоний продуцентов. Концентрация селена 15 мг/л в меньшей степени снижает ростовые показатели штаммов. Ростовой коэффициент у штаммов составлял от 24 до 51 и среднесуточная скорость роста 3,67 - 6,2 мм/сут. Следует отметить, что лучше всего на среде с селеном (15 мг/л) растет штамм \4Z-22.

При статическом культивировании штаммов ЬаеИрогия ви\рЪшгеив на жидкой питательной среде при концентрации селена 15, 20 и 25 мг/л биомасса мицелия на 30-е сутки культивирования снижается у штаммов Ьэ 1-06 и М2-22. Полностью ингибируется рост для штамма Ьб С-(} при концентрациях селена в среде 20 и 25 мг/л.

Наиболее устойчив к соли селена в питательной среде штамм Мг-22, поэтому его использовали для разработки способа получения мицелия, содержащего селен. Как показали исследования (таблица 4), больше всего селена содержится в мицелии, культивируемом на среде с концентрацией 25 мг/л и составляет 4,50 мкг/г АСБ, однако разница накапливаемого селена мала между его количеством, полученным после культивирования на среде с 25 мг/л и с 15 мг/л селена. Учитывая, что показатели накопления биомассы выше на среде с 15 мг/л селена, такую концентрацию целесообразнее использовать для получения селенсодержащего мицелия. Разработанный способ позволяет обогатить биодоступным селеном мицелий штамма.

Таблица 4 - Количество селена в мицелии штамма MZ-22 Laetiporm sulphureus______

№ Количество селена в Количество селена в мицелии

п /п питательной среде, мг/л после культивирования, мкг\г

1 0 0,01±0

3 15 4,25±0,12

4 20 4,38±0,26

5 25 4,50±0,14

Исследования токсичности на простейших Paramecium caudatum н Tetrahymena piriformis водного и спиртового экстрактов селенсодержащего мицелия штамма MZ-22 показали, что они безопасны в тех же концентрациях, что и экстракты мицелия, не обогащенного селеном. Способ получения мицелия, обогащенного селеном защищен патентом (№ 2473679).

Твердофазное культивирование штаммов Laetiporus sulphureus

Перспективным способом получения мицелия грибов - источников биологически активных соединений - может быть твердофазная ферментация растительных материалов. Обогащение растительных субстратов путем биоконверсии базидиомицетами, обладающими ценными свойствами и биохимическим составом, может представлять интерес для кормопроизводства. Для твердофазного культивирования штаммов Laetiporus sulphureus использовали отходы сельского хозяйства, такие как подсолнечная лузга, опилки хвойных пород деревьев, а также смесь злаковых (пшеница, просо, овес), которые используют для приготовления комбикормов.

Рост штаммов Laetiporus sulphureus был отмечен на всех растительных субстратах, однако с различными показателями. Наиболее быстро колонизировали мицелием штаммы подсолнечную лузгу. Оценка динамики роста мицелия на указанном растительном субстрате показала, что максимальный диаметр колоний штаммов на нем достигается на 10 сутки культивирования для штамма MZ-22; на 11 - для штамма Ls C-Q и 13 - Ls 1-06. Однако мицелий формировался очень слабый, неплотный, в отличие от мицелия, выращенного на смеси злаковых культур. Именно на нем наблюдается самый высокий ростовой коэффициент (48,0-215).

Таким образом, наилучшим растительным субстратом из исследуемых может считаться смесь злаковых культур. Учитывая, что такой растительный субстрат используется в качестве кормов в птицеводстве, целесообразно определить содержание в нем белка и липидов, после культивирования штаммов Laetiporus sulphureus. По данным биохимического анализа получены результаты, приведенные в таблице 5.

Таблица 5 - Общее содержание белков и липидов в препарате, полученном после биоконверсии штаммами Ьаеиротэ яи/р/тгеиз

Штамм Laetiporus sulphureus Ls C-Q Ls 1-06 MZ-22 Контроль (субстрат)

белок, % 33,95±I,2 29,78±1,6 18.53±0,8 10,77±0,5

липиды, % 19,24±0,8 15,29±1,2 10,43±0,6 6,51±0,6

Штамм Ls C-Q в большей мере обогащает растительный субстрат белками и липидами (33,95 % и 19,24 % соответственно), поэтому он может быть рекомендован в качестве продуцента для биологической трансформации смеси злаковых культур.

ВЫВОДЫ

1. В результате исследования культур&пьно-морфологических, микроморфологоческих и генетических свойств штаммов, выделенных из плодовых тел пораженных хвойных древостоев Larix sibirica L., установлена их принадлежность к виду Laetiporus sulphureus (Bull.) Murrill.

2. Исследования биохимического состава показали, что мицелий штаммов Laetiporus suIpJrureus Ls-06, MZ-22 и Ls C-Q можёт быть источником белка, в составе которого, наибольшее количество незаменимых аминокислот приходится на триптофан, треонин, лизин и валин, и ненасыщенных жирных кислот (линолевая и оленновая).

3. Штаммы L. sulphureus, выделенные с древостоев хвойных, синтезируют соединения каротиноидной природы, количество которых в мицелии зависит от условий культивирования и от биологических особенностей продуцента. В условиях максимального роста биомассы отмечен более низкий уровень накопления каротиноидов для всех исследуемых штаммов. Наибольший выход каротиноидов достигается при культивировании в условиях освещения 500 люкс у штамма MZ-22 и составляет 17,9 мг/г.

4. Антиоксидантная активность гидрофильной' и липофильной фракций мицелия штаммов зависит от количества каротиноидов в биомассе мицелия штаммов и максимально составляег 102,91 мкмоль ТЭ/г.

5. Для максимального накопления каротиноидов в мицелии штамма MZ-22 разработан состав питательной среды, содержащей г/л: глюкозу - 15; молочную сыворотку - 15; MnS04x5H20 - 0,05. Для получения биомассы штамма L. sulphuretisLs C-Q разработана питательная среда состава, г/л: глюкоза - 15; молочная сыворотка - 27; MnSO-ixSlLO - 0,05.

6. Спиртовые экстракты и культуральные фильтраты штаммов-ксилотрофов хвойных L. sulphureus являются источником биологически активных соединений, обладающих антимикробной активностью в отношении условно-патогенных и патогенных бактерий. Экстракты мицелия штамма MZ-22 L. sulphureus оказывают цитотоксическое воздействие на опухолевые клетки Сасо-2.

7. Установлено влияние различной концентрации соли селена на показатели роста мицелия штаммов L. sulphurous на твердых питательных средах и продуктивность биомассы при статическом жидкофазном культивировании. Показана возможность получения селенсодержащего препарата на основе мицелия штамма Laetiporus sitlphureus MZ-22 на среде, содержащей 15 мг/л селена. Связанный в биомассе селен не влияет на токсичность мицелия, что позволяет получать селенсодержащий препарат как биологически активную добавку.

8. Показана возможность твердофазного культивирования штаммов на различных растительных субстратах, оптимальный состав представляет смесь злаковых культур (овес, пшеница, просо). Штамм Ls C-Q рекомендован в качестве продуцента для биологической трансформации смеси злаковых культур и получения кормовой добавки.

9. На культурах клеток простейших доказана нетоксичность мицелия штаммов. Обоснована целесообразность применения препарата мицелия штамма Laeti/югш sulphtireus Ls 1-06 для повышения антиоксидантной активности молочных продуктов. Показано, что введение препарата мицелия штамма Laetiporiis sulphureiis Ls 1-06 не влияет на активность и численность пробиотической культуры Lactobacillus acidophilus АСТ-44 при культивировании в молочном продукте.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Иванова И.Е. Изучение продуктивности и биологической активности нового штамма Ls 1-06 Laetiporiis sulphureus (Bull, fr) Bond. et. Sing // Иммунология, Аллергология, Инфектология.-Москва- 2010.- №1,- c.251.

2. Иванова И.Е. Влияние штамма Ls 1- 06 Laetiporus sulphureus на пробиотическую культуру Lactobacillus acidophilus АТ-44 //Молочная промышленность.- Москва.-2011.- №12, с.54.

3. Громовых Т.И, Иванова И.Е., Торкова А.А. Культивирование мицелия штаммов Laetiporus sulphureus для получения кормовой добавки для птиц // Вестник РАСХН-Москва, 2012.№ 6.С-53-55.

4. Патент на изобретение № 2011115880. Способ получения селенсодержащего препарата биомассы Laetiporus sulphureus М2-22. Авторы: Громовых Т.И. Салохина О.Э., Иванова И.Е., Жаринов А.И., Сидаков Т.А. Заявка № 211115880/10(023650).27.01. 2013. Бюлл. №3.

5. Иванова И.Е. Изучение продуктивности и биологической активности нового штамма гриба Ls 1-06 Laetiporus sulphureus (Bull, fr) Bond, et. Sing // Материалы VII Международной конференции «Экологические безопасные ресурсосберегающие технологии и средства переработки сельскохозяйственного сырья и производства продуктов питания» -Москва.-2009.-С. 16-18.

6. Иванова И.Е., Громовых Т.И. Изучение продуктивности штаммов Laetiporus sulphureus (Buli.fr) Bond.et.Sing // Материалы 9-ой международной

научной конференции студентов и молодых ученых «Живые системы и биологическая безопасность населения», 2010,- С.150-151.

7. Иванова И.Е., Громовых Т.Н. Антимикробные и антиоксидантные свойства нового штамма гриба Laetiporus sulphureus // Биологически активные вещества микроорганизмов: прошлое, настоящее, будущее». Москва, 2011.-С.35.

8. Иванова И.Е., Громовых Т.И. Изучение свойств и биохимического состава штамма MZ-22 Laetiporus sulphuretts // Материалы V международной научно-технической конференции «Низкотемпературные и пищевые технологии в ХХ1веке». Санкт-Петербург, 2011,- С.375-377.

9. Иванова И.Е. Биологически активные вещества мицелия штамма Z-22 Laetiporus sulphureus/ZMartpmrnA IX Международной научно-практической конференции «Технологии и продукты здорового питания. Функциональные продукты питания». Москва, 2011 С.184-187.

10. Иванова И.Е., Громовых Т.И. Оптимизация питательной среды для культивирования штаммов Laetiporus sulphuretts // Материалы 10-й международной научной конференции студентов и молодых ученых «Живые системы и биологическая безопасность населения». Москва, 2011.- С.75-77

11. Иванова И.Е., Громовых Т.И., Федосенко A.C. Твердофазное культивирование штаммов Laetiporus sulphureus // Материалы конф. «Достижения и перспективы развития биотехнологии». Саранск, 2012.С.63-64.

12. Иванова И.Е., Громовых Т.И., Черемных Е.Г. Биологическая активность штамма гриба Ls C-Q Laetiporus sulphureus (Bull) Murrill // Современная микология России . Москва, 2012.-Т.З.- С.376-377.

13. Иванова И.Е., Громовых Т.И. Влияние внешних факторов на рост и морфологию штаммов Laetiporus conifericola II Материалы VIII международной научно-практической конференции «Наука и инновации-2012». Польша, 2012. - С.6-9.

14. Иванова И.Е., Громовых Т.И Влияние света на биосинтез каротинондов и антиоксидантные свойства штаммов Laetiporus conifericola (Burds and Banik) // Материалы 11-ой международной научной конференции студентов и молодых ученых «Живые системы и биологическая безопасность населения». М, 2012.- С.-6-8.

15. Садыкова B.C., Свирщевская Е.В., Громовых Т.И., Иванова И.Е., Попова Е.С., Катруха Г.С., Федорова Г.Б. Противоопухолевая активность метаболитов штаммов Trichoderma harzianum, Т. asperellum и Laetiporus sulphureus // Постгеномные методы анализа в биологии, лабораторной и клинической медицине III международная научно-практическая конференция. Казань, 2012.-С.379-380.

Отпечатано в типографии ООО "Франтера" Подписано к печати 01.03.2013г. Формат 60x84/16. Бумага "Офсетная №1" 80г/м2. Печать трафаретная. Усл.печ.л. 1,50. Тираж 120. Заказ 569.

WWW.FRANTERA.COM

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Иванова, Ирина Евгеньевна, Москва

Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования

Московский государственный университет пищевых производств

На правах рукописи 04201354915 I

Иванова Ирина Евгеньевна

ИЗУЧЕНИЕ ШТАММОВ LAETIPORUS SULPHUREUS (BULL.) MURRILL, КСИЛОТРОФОВ ДРЕВОСТОЕВ ХВОЙНЫХ, И ОЦЕНКА ПЕРСПЕКТИВ ИХ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ В БИОТЕХНОЛОГИИ

Специальность 03.01.06 - Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: д.б.н, проф. Громовых Т.И.

Москва - 2013

СОДЕРЖАНИЕ

ВВЕДЕНИЕ..............................................................................................................5

1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ......................................................................................11

1.1 Характеристика базидиомицетов рода Laetiporus....................................11

1.2 Характеристика вида Laetiporus conifericola.............................................12

1.3 Характеристика базидиомицета Laetiporus sulphureus............................12

1.4 Морфолого - культуральные особенности Laetiporus sulphureus...........15

1.5 Глубинное культивирование Laetiporus sulphureus..................................18

1.6 Химический состав плодовых тел и мицелия Laetiporus sulphureus ....20

1.7 Аспекты использования Laetiporus sulphureus - источника комплекса биологически активных веществ......................................................................27

1.8 Антимикробные, противовирусные, антиоксидантные и радиопротекторные свойства Laetiporus sulphureus.......................................29

1.9 Каротиноиды - природные антиоксиданты...............................................33

1.10 Селен в грибах: использование макромицетов для получения селенсодержащего мицелия..............................................................................36

ЗАКЛЮЧЕНИЕ К ОБЗОРУ ЛИТЕРАТУРЫ......................................................39

2 ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ..................................................41

2.1 Характеристика объектов исследований...................................................41

2.2 Методы исследования..................................................................................42

2.2.1 Определение видовой принадлежности..............................................42

2.2.2 Изучение микроморфологических особенностей штаммов..............43

2.2.3 Изучение морфолого-культуральных особенностей штаммов.........43

2.2.4 Оценка влияния физических факторов на ростовые показатели штаммов...........................................................................................................45

2.2.5 Твердофазное культивирование штаммов...........................................46

2.2.6 Изучение продуктивности биомассы штаммов..................................47

2.2.7 Исследование биохимического состава мицелия штаммов..............47

2.2.8 Определение антиоксидантной емкости по отношению к пероксильному радикалу [148]......................................................................58

2.2.9 Определение массовой доли влаги в полученной биомассе.............60

2.2.10 Определение токсичности штаммов на инфузориях видов Paramecium caudatum и Tetrahymena pyriformis..........................................60

2.2.11 Определение антимикробной активности штаммов.......................65

2.2.12 Определение влияния штаммов Laetiporus sulphureus на молочно-килую культуру Lactobacillus acidophilus.....................................................65

2.2.13 Оценка противоопухолевой активности экстрактов штаммов.......66

2.2.14 Определение степени переваримости белка [69]..............................67

2.2.15 Получение селенсодержащего мицелия............................................69

2.2.16 Оптимизация питательной среды для культивирования мицелия штаммов...........................................................................................................71

2.2.17 Статистическая обработка полученных результатов.......................74

3 МОРФОЛОГИЧЕСКИЕ И КУЛЬТУРАЛЬНЫЕ СВОЙСТВА ШТАММОВ LAETIPORUS SULPHUREUS................................................................................75

3.1 Морфологические особенности штаммов Laetiporus sulphureus............75

3.2 Культуральные особенности штаммов Laetiporus sulphureus.................79

3.3 Отношение к температуре штаммов Laetiporus sulphureus.....................86

3.4 Влияние рН среды на рост штаммов Laetiporus sulphureus.....................87

3.5 Влияние света на рост и развитие штаммов Laetiporus sulphureus.........89

4 ЖИДКОФАЗНОЕ КУЛЬТИВИРОВАНИЕ ШТАММОВ LAETIPORUS

SULPHUREUS........................................................................................................92

4.1 Динамика накопления биомассы штаммами Laetiporus sulphureus..........92

5 БИОХИМИЧЕСКИЙ СОСТАВ МИЦЕЛИЯ ШТАММОВ LAETIPORUS SULPHUREUS..........................................................................................................95

5.1 Определение качественного и количественного содержания белка.Переваримость белка мицелия...............................................................95

5.2 Определение общего содержания липидов и каротиноидов. Жирнокислотный состав липидов....................................................................97

5.3 Определение количества углеводов..........................................................99

6 ОЦЕНКА БЕЗОПАСНОСТИ ЭКСТРАКТОВ ШТАММОВ LAETIPORUS SULPHUREUS......................................................................................................100

6.1 Биотестирование штаммов на Paramecium caudatum.............................100

6.2 Биотестирование штаммов на Tetrahymenapyriformis...........................101

7 ОПТИМИЗАЦИЯ ПИТАТЕЛЬНОЙ СРЕДЫ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ БИОМАССЫ МИЦЕЛИЯ LAETIPORUS SULPHUREUS В ПОГРУЖЕННОЙ КУЛЬТУРЕ...........................................................................................................103

7.1 Метод полного факторного эксперимента.............................................104

7.2 Оптимизация по метод крутого восхождения Бокса-Уилсона...........110

7.3 Экстракция каротиноидных пигментов органическими растворителями... 114

7.4 Влияние света на выход биомассы и каротиноидов у штаммов Laetiporus sulphureus........................................................................................116

8 БИОЛОГИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ ЭКСТРАКТОВ И КУЛЬТУР АЛЬНЫХ ФИЛЬТРАТОВ МИЦЕЛИЯ ШТАММОВ LAETIPORUS SULPHUREUS............120

8.1 Антиоксидантная емкость штаммов Laetiporus sulphureus..................120

8.2 Антимикробная активность штаммов Laetiporus sulphureus...............122

8.3 Влияние штамма Ls 1-06 Laetiporus sulphureus на пробиотическую культуру Lactobacillus acidophilus АСТ-44...................................................124

8.4 Противоопухолевая активность штамма Laetiporus sulphureus............127

9 ПЕРСПЕКТИВЫ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ ШТАММОВ LAETIPORUS SULPHUREUS......................................................................................................129

9.1 Получение селенсодержащего мицелия штаммов Laetiporus sulphureus.... 129

9.2 Твердофазное культивирование штаммов Laetiporus sulphureus на растительных субстратах.................................................................................135

ЗАКЛЮЧЕНИЕ....................................................................................................139

ВЫВОДЫ.............................................................................................................147

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ...................................................................................149

ПРИЛОЖЕНИЯ...................................................................................................168

ВВЕДЕНИЕ

В последние годы и в России наблюдается повышенное внимания к созданию на основе высших грибов и продуктов их метаболизма пищевых, кормовых добавок и лекарственных препаратов, биологически активных соединений. В различных странах мира объектами многих таких разработок являются базидиомицеты, из родов Ganoderma, Grifóla, Coprinus, Lentinula, Fomytopsis, Laetiporus, Panus, Pleurotus, Trametes, большинство которых -съедобные грибы. Возможность использования рассматриваемых базидиомицетов для создания лечебных и профилактических средств стала реальной после многолетних фундаментальных исследований процессов жизнедеятельности макромицетов, в том числе особенностей их развития, роста и механизма ферментативной и метаболической активности [8,22].

В мицелии базидиальных грибов присутствует комплекс физиологически активных соединений белковой, углеводной, липидной природы, витаминов и др. соединений, которые определяют как питательную, так и биологическую ценность, связанную с антибиотическими иммуномодулирующими, антиоксидантными и др. свойствами компонентов, входящих в их состав [20]. Одно из развивающихся направлений использования базидиомицетов - это получение лекарственных препаратов, богатых каротиноидами и флавоноидами, которые в последнее время стали применятся для профилактики и лечения раковых заболеваний [82,84, 158,163].

В последние десятилетия в качестве ведущих объектов биотехнологии полезных продуктов и препаратов привлекают внимание грибы рода Laetiporus. Виды рода Laetiporus имеют ареал естественного местообитания - страны Юго-Восточной Азии, Европы, Северной и Южной Америки [136]. Широко известен вид Laetiporus sulphureus (Bull.) Murrill, поражающий различные породы древостоев. Он обладает хорошими вкусовыми,

питательными и лекарственными свойствами. Белок плодовых тел и мицелия ЬаеНрогт зи1ркигет обладает высокой биологической ценностью.

Кроме указанных свойств следует отметить и способность этого вида гриба к синтезу полиеновых пигментов каротиноидной природы (ксантофиллы), участвующие в окислительном обмене и депонировании кислорода в клетках при старении организма, которые занимают особое место среди физиологически активных соединений, присутствующих в мицелии базидиальных грибов.

По сравнению с каротинообразующими дрожжами и микромицетами базидиальный ксилотроф Ь. 8и1ркигет обладает определенными преимуществами. Известно, что штаммы Ь. БШркигет являются продуцентами ряда биологически активных веществ: ферментов, разрушающих древесину, галлюциногенов, иммуностимуляторов, цитотоксинов. Есть сведения об антимикробных, антивирусных свойствах соединений как плодовых тел, так и мицелия Ь. зи1ркигет [82]. Растущая популярность вида ЬаеНрогт яШркигеш делает актуальной разработку вариантов технологии его выращивания с использованием сырьевой базы и отходов растениеводства.

Несмотря на то, что общий объем публикаций, посвященный

базидиомицету ЬаеНрогт зи1ркигет, чрезвычайно велик, сведения о

химическом составе и бактерицидных свойствах плодовых тел и мицелия,

изолятов рода ЬаеНрогт относятся к штаммам, паразитирующих на

лиственных породах деревьев. Подобная информация о ксилотрофах,

поражающих древостой хвойных, практически отсутствует. Известно лишь,

что они распространены в основном в Северной Америке, некоторых странах

Европы и обладают токсичными свойствами. В настоящее время

североамериканские штаммы стали относить к новому виду ЬаеНрогт

сот/епсо1а [107]. Все ранее проводившиеся исследования в России, кроме

того, что были посвящены изучению штаммов, выделенных с лиственных

пород деревьев, касались в основном изучения плодовых тел, в том числе

6

их экологических особенностей, либо были посвящены морфолого-культуральным свойствам мицелия штаммов данного вида. Генетика принадлежности к виду изучаемых штаммов в России не проводилась.

Таким образом, поиск и исследования новых штаммов рода Laetiporus, выделенных из плодовых тел пораженных древостоев хвойных открывает перспективы пополнения коллекций и дает возможность их использования в биотехнологии.

Цель работы - изучение штаммов-ксилотрофов рода Laetiporus, выделенных с древостоев хвойных, и оценка возможности их использования в биотехнологии.

Для достижения поставленной цели решали следующие задачи: ■ изучить морфолого-культуральные, генетические и физиологические особенности и идентифицировать видовую принадлежность штаммов Laetiporus sp;

■изучить химический состав биомассы мицелия Laetiporus sulphureus (содержание белка и его переваримость, количество аминокислот, липидов, жирных кислот, каротиноидов, углеводов);

■изучить влияние физических факторов на показатели роста штаммов Laetiporus sulphureus в условиях твердофазного и погруженного культивирования;

■оптимизировать состав технологической среды для получения биомассы мицелия и биосинтеза каротиноидов;

■изучить антиоксидантную, антимикробную, противоопухолевую активность и токсичность штаммов Laetiporus sulphureus;

■изучить влияние соли селена на рост штаммов Laetiporus sulphureus и разработать способ получения селенсодержащего мицелия;

■изучить влияние штаммов Laetiporus sulphureus на пробиотическую культуру Lactobacillus acidophilus',

■отобрать наиболее перспективные штаммы в качестве продуцентов биологически активных веществ.

Научная новизна работы

Впервые выделены штаммы с хвойных древостоев Larix sibirica L. рода Laetiporus на территории России. На основании исследований культуральных, физиологических свойств и молекулярно-генетической идентификации штаммов рода Laetiporus установлена их принадлежность к виду Laetiporus sulphureus.

Мицелий штаммов-ксилотрофов хвойных Laetiporus sulphureus может быть использован для получения белка, незаменимых аминокислот, ненасыщенных жирных кислот и каротиноидоподобных соединений. Максимальное накопление каротиноидов установлено у штамма Laetiporus sulphureus MZ-22.

На культурах клеток простейших доказана безопасность мицелия штаммов Laetiporus sulphureus.

Показана переваримость белка биомассы мицелия штаммов Laetiporus sulphureus.

Установлено, что в условиях максимального выхода биомассы отмечен более низкий уровень накопления каротиноидов для всех исследуемых штаммов.

Установлено влияние соли селена на показатели роста мицелия штаммов Laetiporus sulphureus; определена оптимальная концентрация селена в среде для получения селенсодержащего мицелия штаммов Laetiporus sulphureus.

Выявлена антимикробная активность спиртовых экстрактов мицелия штаммов Laetiporus sulphureus в отношении условно-патогенных бактерий и цитотоксичность в отношении линии опухолевых клеток Сасо-2.

Показано отсутствие ингибирующего влияния препарата мицелия штамма Laetiporus sulphureus на ростовые показатели пробиотической культуры Lactobacillus acidophilus АСТ-44 (ВКПМ В-9647) и обоснована целесообразность применения препарата мицелия штамма для повышения антиоксидантной активности молочных продуктов.

Практическая значимость работы

- Отобраны штаммы-продуценты каротнноидов и белка, которые депонированы в коллекциях: L. sulphureus Ls 1- 06 (ВКПМ F-982) и L. sulphureus (ВКМ F-4276D).

- разработана оптимальная технологическая среда и условия для жидкофазного погруженного культивирования мицелия штаммов Laetiporus sulphureus;

показана возможность использования растительных отходов предприятий АПК для биоконверсии штаммом L. sulphureus Ls C-Q;

- в результате исследований противоопухолевой активности экстрактов мицелия на линии опухолевых клеток даны рекомендации для использования штамма Laetiporus sulphureus MZ-22 как продуцента противоопухолевых соединений;

- разработан способ получения селенсодержащего мицелия на основе штамма Laetiporus sulphureus MZ-22, обладающего способностью к связыванию селена в биомассе и биосинтезу каротиноидоподобных соединений в количестве 17,8 мг/г.

Апробация работы Основные положения работы и результаты исследований представлены на конкурсах и конференциях: Международной научной конференции студентов и молодых ученых «Экологические безопасные ресурсосберегающие технологии и средства переработки сельскохозяйственного сырья и производства продуктов питания» (Москва,

2009); 10-ой юбилейной Всероссийской выставке научно-технического творчества молодежи НТТМ (Москва, 2010); V фестивале науки (Москва,

2010); конкурсе молодых ученых VI Московского международного конгресса «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва,

2011); V Международной научно-технической конференции, посвященной

80-летию университета «Низкотемпературные и пищевые технологии в XXI

веке» (Санкт-Петербург, 2011); симпозиуме в МГУ им. М.В. Ломоносова

9

«Биологически активные вещества микроорганизмов: прошлое, настоящее, будущее» (Москва, 2011); III Съезде микологов России (Москва, 2012); X Международной научно-практической конференции с международным участием «Живые системы и биологическая безопасность населения» (Москва, 2012).

Работа выполнялась при финансовой поддержке грантов: аналитической ведомственной целевой программы «Развитие научного потенциала высшей школы (2009-2010 годы)», проектов № 4209 и № 9353 «Коллекция культур бактерий, бактериофагов, дрожжевых и мицелиальных грибов как база для научно-образовательного процесса, сохранения биоразнообразия и развития современной биотехнологии»; по госконтракту П175 в рамках федеральной целевой программы «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 гг; гранта Президента РФ по поддержке ведущих научных школ; тема № 16.120.11.3245.-НШ «Разработка новых пищевых технологий с участием живых систем на основе нетрадиционных подходов к управлению их жизнедеятельностью и обеспечению качественных показателей готовой продукции».

1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Характеристика базидиомицетов рода Laetiporus

Род Laetiporus, который относят к семейству полипоровых (лат. Polyporaceae), был подробно описан в 1904 году Уильямом Мюррилом.

По классификации данный род относят к царству Fungi; отделу Basidiomycota, классу Agaricomycetes, порядку Polyporales, семейству Fomitopsidaceae. Ранее считалось, что род Laetiporus содержал 2 вида L. sulphureus (Bull.) Murrill и L.persicinus (Berk and M.A. Curtis) [117]. Позже было выявлено, что данный род содержит как минимум 6 видов, при этом Laetiporus persicinus не может быть отнесен к роду Laetiporus в связи с темной пигментацией плодовых тел, в отличие от других видов этого рода, имеющих окраску от бледно желтого до ярко-оранжевого цвета [107]. По результатам исследований, проведенным Дэниэлом Линдером, Марком Баником и др. авторами при изучении различных североамериканских, азиатских и европейских изолятов в настоящее время род Laetiporus может быть представлен следующими видами: Laetiporus cincinnatus, Laetiporus conifericola, Laetiporus cremeiporus, Laetiporus gilbertsonii, Laetiporus huroniensis, Laetiporus montanus, Laetiporus sulphureus, Laetiporus versisporus [102,146]

Грибы данного рода паразитируют на различных деревьях (преимущественно лиственных), имеют бесцветные тонкостенные базиди