Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Поиск продуцентов антибиотиков грибного происхождения, эффективных в отношении метициллинрезистентных стафилококков

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Поиск продуцентов антибиотиков грибного происхождения, эффективных в отношении метициллинрезистентных стафилококков"

На правей рукописи

Ершова Екатерина Юрьевна

Поиск продуцентов антибиотиков грибного происхождения, эффективных в отношении метициллэшрезисгентных стафилококков

03.00.23 - биотехнология 14.00.31. - химиотерапия и антибиотики

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискаине ученой степени кандидата биологических наук

Москва-2003

Работа выполнена в Государственном учреждении Научно-исследовательском институте по изысканию новых антибиотиков имени Г. ф. Гаузе Российской академии медицинских наук (Москва).

Научные руководители: Члсн-коррссноцдекг РАМН,

доктор биологических наук, профессор Ю. В. Дудник

Кандидат биологических наук О. В. Ефремснкова

Официальные оппоненты: Доктор биологических наук,

профессор Л. В. Гарибова

Доктор биологических наук, ст. н. с. М. В. Бибикова

Ведущая организация Институт микробиологии РАН, Москва.

Защита диссертации состоите! «_»_2003г в час мин

в Д иссертационной совете Д 217.008.01 при ФГУП «Государственный научный центр по антибиотикам» по адресу: 117105, Москва, ул. Наюпшскаа д. За.

С диссертацией можно ознакомится в библиотеке ФГУП «ГНЦА»

Автореферат разослан «_»_2003г.

Учвный секретарь Диссертационного совета

кандидат медицинских наук, ст. н. с.

С. М Кузнецова.

¿¿006-4 7464

з

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Д М9Я83

Актуальность темы. В свячи с широким распространением устойчивых форм микроорганизмов, снижающим эффективность применения антибиотиков, одной из наиболее актуальных проблем современной науки об антибиотиках является поиск новых препаратов, преодолевающих лекарственную устойчивость микроорганизмов. Особые опасения вызывает резко возрастающая частота инфекций, вызываемых метициллинрезистентными штаммами золотистого стафилококка (MRSA).

Одним из направлений поиска новых природных антибиотиков является изучение видов, ранее не рассматривавшихся или малоизученных как возможные продуценты антибиотиков. К числу таких организмов можно отнести базидиальные грибы.

В начале антибиотической эры базидиомицеты привлекли к себе внимание наряду с другими организмами. Флори с соавт (1949) определил различную антимикробную активность при анализе как плодовых тел, так и мицелиальных культур более чем у 2000 видов грибов Однако, в дальнейшем интерес к метаболитам грибов снизился, так как актиномицеты проявили себя как более богашй и легко культивируемый источник антибиотиков

На современном этапе базидиомицеты и другие высшие грибы стали заново исследоваться в этом отношении. Новые достижения в технологии ферментации, выделения, очистки и методологии определения структуры полученных веществ сделали возможным изучение различных организмов в качестве источников новых антибиотиков. В пастоящее время трудности, связанные с медленной скоростью роста базидиомицетов, почучением плодовых тел в искусственных условиях, низким выходом продукта компенсируются реальной возможностью выявления новых антибиотиков различной химической природы

Тот факт, что базидиомицеты до настоящего времени были недостаточно исследованы вместе с тем, что они продуцируют широкий ряд антибиотиков различной структуры [Anke, 1989; Molitoris, 1994, Феофилова, 1998; Wasser, Weis, 1999; Suay et al., 2000], позволяет предположить, что их можно рассматривать как новый источник биологически активных соединений.

Настоящая работа проводилась в ГУ НИИНА РАМН в рамках тзм РАМН 002 -«Поиск новых природных антибиотиков медицинского назначения, преодолевающих устойчивость патогенных бактерий» и 008 - «Поиск и анализ новых антибактериальных и противоопухолевых антибиотиков».

РОС. НАЦИОНАЛЬНАЯ БИБЛИОТЕКА

Цель работы. Выявление грибов-продуцентов антибиотиков, эффективных в отношении метициллинрезистентных стафилококков. Задачи исследования:

1. Выделение из природных источников штаммов грибов

2. Проведение скринингового исследования среди выделенных культур: выявление продуцентов антибиотически активных веществ и отбор наиболее перспективных продуцентов по антимикробному спектру и уровню активности

3. Разработка условий кулыивирования и подбор сред для отобранных продуцентов с целью повышения выхода антибиотиков.

4. Наработка антибиотически активпых веществ, синтезируемых наиболее перспективными продуцентами, выделение и определение химической природы.

Научная новизна. Впервые было показано, что представители рода Coprinus (Fr.) S. F. Gray образуют вещества, эффективные в отношении метициллинрезистентных стафилококков.

Всего протестировано 14 штаммов рода Coprinus, антимикробную активность проявили И штаммов. Среди них - 9 штаммов активны в отношении MRSA и 6 штаммов - в отношении грамотрицагельных тест-организмов. Таким образом, установлено, что представители рода Coprinus - перспективная группа продуцентов антибиотиков.

Три антибиотика, эффективных в отношении MRSA, выделены из штамма Coprinus radiatus (Fr.) S. F. Gray 2987 Из трёх антимикробных веществ в наибольшем количестве образуется уже известный антибиотик лагоподин В, активность которого в отношении рсзистеншых форм патогенных бактерий ранее не исследовалась. Образование лагоподина В у вида С radiatus описано впервые.

Два антибиотика, подавляющие рост MRSA, выделены из штамма С congregatus (Bull.) Fr. 2961-2. Установлено, что один из активных компонентов является уже известным антибиотиком группы микомиципов - немотином А. Синтез данного антибиотика впервые описан у шляпочного гриба, ранее также не определялась его активность в отношении мегициллинрезистентного золотистого стафилококка.

Показано образование четырёх ан гибиотических веществ штаммами вида Laetiporus sulphureus (Fr.) Bond et Sing, обладающих широким антибактериальным спектром, включая метициллинрезистентный золотистый стафилококк. Три антибиотика, активных в отношении MRSA, выделены из штамма L sulphureus 2990 Впервые описан биосинтез щавелевой кислоты у вида L sulphureus

Антибиотик группы пептаиболов, подавляющий рост метициллинрезистентного золотистого стафилококка, выделен из штамма Trichoderma viride (Pers.) Fr. 2963, отсеянного с плодового тела базидиомицета Rxidia glandulosa Fr.

Практическая значимость Создана коллекция базидиомицетов родов Coprinus и Laetiporus Mtirr , состоящая из 17 штаммов, в том числе продуцентов антибиотиков, эффективных в отношении MRSA.

Разработан и внедрен в практику лаборатории метод очистки грибной культуры от бактериальной контаминации.

В результате изучения биосинтетической деятельности штамма С radiatm 2987 разработаны условия культивирования, позволившие выделить 3 антимикробных вещества, из которых в наибольшем количестве образуется лагоподин В, ранее не описанный у данного вида, не было известно и о его активности в отношении метициллинрезистентного золотистого стафилококка.

Штамм С. congregutus 2961-2 в подобранных условиях ферментации образует 2 активных компонента Один из которых идентифицирован с антибиотиком группы микомицинов - немотином А, синтез которого у шляпочных грибов ранее не был известен, а также не определялась его активность в отношении MRSA.

В результате изучения биосинтетических свойств 4-х выделенных из природной среды и одного коллекционного гггтамма L sulphureus, показано, что образуется 4 антибиотических вещества, эффективных в отношении тест-штамма MRSA. Выделено три антибиотика из штамма L. sulphureus 2990

Показано, что наряду с антимикробными веществами всем штаммам L sulphureus свойственно образование больших количеств щавелевой кислоты, что делает возможным использование данного вида как продуцента щавелевой кислоты.

Из штамма Т viride 2963 выделено вещество группы пептаиболов, действующее на грамположительные бактерии, в том числе MRSA.

Апробация работы. Основные положения работы доложены на Международной конференции по медицинским грибам («Medicinal Mushrooms») Киев, 2001г, на 1-й и 2-й Конференциях молодых ученых в ГУ НИИНА им. Г. Ф. Гаузе в 2001 и 2002 гт; I Съезде микологов Росии, Москва, 2002г; Всероссийском конгрессе по медицинской микологии, Москва, 2003г, на заседании Учёного совета ГУ НИИ по изыскапшо новых антибиотиков 28 апреля 2003г.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 12 печашых работ

Объём работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, главы, посвященной материалам и методам исследования, одной главы собственных

исследований и выводов. Ма1ериалы диссертации изложены на страницах машинописного текста Список литературы включает 136 источников, из них 103 -зарубежные

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Объекты и методы исследования

Объекты исследования. Объектами исследования данной работы являлись 22 грибных штамма, из которых 18 ппаммов были выделены из природы: Coprinus atramentarius (Fr.) Fr. 3025; С comatus (Fr) S. F. Gray 2957; С congregatus (Bull.) Fr. 2961-2, 3003; С delicatulus Apinis ВКПМ F-248 (=3046), С digitalis (Batch) Fr. 2956; С micaceus (Fr.) Fr. BKM F-2945 (=2860), С rmcaceus BKM F-2946 (=2870); С radiatus 2965; С radiatus 2987; С plicatilis (Fr.) Fr. 3068; Coprinus. sp. 2958,2959, 2960-1, 2960-2; Coprinus. sp. 3002; Laetiporus sulphur cub (Fr.) Bond et Sing 2990; L sulphureus 2991; L sulphurous 3375; L. sulphureus 3461; L sulphureus BKM F-1456 (=3524); Trichoderma viride (Pers.) Fr. 2963.

Методы исследования

Сбор материала и выделение грибов в культуру. Для выделения грибных штаммов в культуру в качестве исходного материала использовали- свежесобранные плодовые тела; подсушенные плодовые тела; отпечатки лизировавшихся плодовых тел на бумаге Выделение грибных штаммов в культуру проводили споровым и тканевым методами. С помощью микроскопа контролировали прорастание спор и образование микроколоний.

Очистка грибных культур от бактериальной контаминации. Очистку грибных культур от сопутствующей бактериальной микрофлоры проводили следующими традиционными методами- последовательными пересевами на питательную агаровую среду, внесением в среду смеси антибактериальных антибиотиков бензилпенициллина и стрептомицина [Бухало, 1988; Stamets, 2000] Положительный результат так же был получен при использовании разработанного нами метода мицелиального моста.

Проверка грибных культур на бактериальную контаминацию. С целью провоцирования роста бактерий в пробирки с пептонно-трицтонным бульоном высевали грибную культуру, исследуемую на чистоту. После 1 -3 суток инкубирования проводили микроскопирование для оценки возможного роста бактерий.

Определение антимикробной активности. Антимикробную активность определяли методом диффузии в агар. Использовали три варианта метода: метод лунок, метод дисков и метод блоков.

После инкубирования в термостате в течение суток антимикробную активность определяли по наличию зон задержки роста тест-организмов. Антимикробную активность определяли по результатам не менее 5 опытов.

Микроекопирование. Световая микроскопия проводилась с помощью микроскопов МБИ-15, Ampleval, Микмед - 1, Olympus. Просмотр препаратов производили при увеличении в 100, 400, 900 раз При увеличении в 900 раз использовали иммерсионное масло.

Методы приготовления фиксированных мазков. Каплю культуральной жидкости равномерно распределяли по предметному стеклу, подсушивали на воздухе и затем фиксировали в растворе Карнуа. Фиксированные мазки окрашивали 0,1% водным раствором метиленовой синьки в течение 1 мин, после чего препарат промывали водой и подсушивали на воздухе.

Сканирующая электронная микроскопия (СЭМУ Культуры исследовали с помощью сканирующего электронного микроскопа AMRAY (США) при увеличении до 30000 раз.

Приготовление препаратов для СЭМ Из чапгки Петри стерильным скальпелем вырезали блок агара примерно 1 см3 вместе с целлофановой подложкой, на которую нарос мицелий (20 суток роста), и помещали в бюкс, на дне которого был 2% водный раствор 0s04 для образования паров. Фиксация парами 0s04 продолжалась в течение 96 часов. После фиксации препарат мицелия на целлофане переносили в чашку Петри на фильтровальную бумагу и сушили 72 час После этого целлофановые блоки приклеивали к предметным столикам с помощью лака, напыляли платино-палладиевой смесью и сканировали.

Методы первичного выделения антибиотиков. Для химического

изучения антибиотиков нарабатывали культуральную жидкость в объёме 1 - 5 л и передавали в Лабораторию химического изучения биологически активных соединений микробного происхождения Для анализа антимикробной активности из

упомянутой лаборатории получали элюаты и экстракты, упаренные в вакууме до сухого остатка Для биологических испытаний использовали следующие образцы: Кн -концентрат веществ, выделенных из нативного раствора при нейтральном значении pH; Кк - концентрат веществ, выделенных из нативного раствора при кислом значении рП; Мн - концентрат веществ, выделенных из мицелия при нейтральном значении pH; Мк -

концентрат веществ, выделенных из мицелия при кислом значении рН; сырцы выделенных антибиотиков.

Определение МПК в жидкой среде методом двукратных серийных разведений

Была приготовлена планшетка с лунками, содержащими одинаковый объём среды (ПТБ), инокулированной тест-ор!-анизмом (106 бактерий в 1 мл). Затем в лунки добавляли антибиотик в уменьшающихся концентрациях. Использовали ступенчатое двукратное разведение, концентрации испытуемых антибиотиков составляли от 512 до 0,062 мкг/мл. В одну пробирку антибиотик не добавляли, она являлась контрольной. Планшетки инкубировали в термостате в течение 17-24 часов, после чего рост бактерий определяли по помутнению среды. МПК соответствовало наименьшей концентрации антибиотика, при которой отсутствовал рост тест-организма.

Биоавтография. Пластинки после проведения ТСХ выделенных антибиотиков или бумагу после проведения электрофореза, полученные из Лаборатории химического изучения биологически активных соедипепий микробного происхождения, высушивали и накладывали на газон с растущим тест-штаммом (как правило, - В subtilis АТСС 6633, S aureus FDA 209Р (MSSA) или S aureus ИНА 00761 (MRSA)) и выдерживали 15 мин при комнатной температуре Затем пластинку или бумагу убирали и инкубировали чашки при 37°С в течение 17-24 час Антибиотически активные вещества обнаруживали по наличию зон задержки роста.

Результаты и обсуждение

Поскольку целью данной работы был поиск антибиотиков, эффективных в отношении метициллинрезистентных стафиллококков, для первичного скрининга проводили определение МПК некоторых антибиотиков в отношении тест-культур, используемых в качестве целевого объекта при поиске продуцентов антибиотиков с заданными свойствами (табл 1). Особое внимание было уделено тест-организмам, устойчивым к р-лактамным и гликопептидным антибиотикам в связи с широким распространением патогенных бактерий, резистентных к действию этих групп антибиотиков [Сидоренко, 1995, Дудник, 1999; Страчунский с соавт., 2002; Srinivasan et al„ 2002].

Таблица 1. Определение МПК некоторых антибиотиков в отношении тест-организмов S aureus ГОЛ 209Р (MSSA), S aureus ИНА 00761 (MRSA) и L meienieroides ВКПМВ-4177.

МПК антибиотиков

Тест-организм ч в я ж S е и 1 я я S § я в и IS 1 IS и и •е-S

о Я 1* IS о X fr о. о

б я Л £ V U Si X

S aureus ИНА 00761 (MRSA) 32 2 128 8 >128 >128 128 128

S aureus FDA 209Р (MSSA) 0,125 2 0,125 0,125 0,5 32 0,25 64

L. mesenteroides ВКПМВ-4177 64 >512 1 8 2 >128 2 64

Наибольший интерес представляли новые антибиотики узкого спектра действия - эффективные в отношении грамположительных бактерий, включая метициллинрезистентные штаммы (табл 2).

Таблица 2. МПК некоторых антибиотиков в отношении грамотрицательных тест-организмов.

МПК антибиотиков

Тест-организм Оксациллин Бензилпенициллин Ванкомицин Ампициллин Эритромицин Доксициклин Гентамицин | Хлорамфеникол

С. terrigena ВКПМ-7571 8 0,125 >128 16 32 32 32 16

Е coli АТСС 25922 32 16 >128 4 128 >128 4 >128

Р. aeruginosa АТСС 27853 >128 >128 >128 64 >128 >128 2 >128

Данная работа была начата как продолжение исследований биосинтетической деятельности Сорпгш гсиНаШ, начатых в 1985 году во ВНИИ антибиотиков [Анисова с соавт., 1987]. Поэтому в первую очередь и наиболее подробно были изучены представители рода СорИпш

Выделспие штаммов рода Coprinus в культуру

Грибы рода Coprinus выделяли из природы споровым методом путем непосредственного высева или серии пересевов на агаровую среду При использовании спорового метода под микроскопом контролировали прорастание спор и образование микрокод опий. У 8 из 12 выделенных культур была определена видовая принадлежность. Большинство культур рода Coprinus имели схожий характер роста на агаризованной среде

Однако, получение мицслиальных культур сопровождалось трудностями, связанными с очисткой штаммов от бактериальной контаминации Поэтому в ходе работы был предложен метод мицелиального моста, базирующийся па различии в характере роста бактериальных и мицелиальных грибных культур

На следующем этапе работы в искусственных условиях были получены плодовые тела у штаммов. С digitalis 2956, С delicatulus Apinis 3046 (ВКПМ 248), С radiatus 2965, С radiatus 2987.

Выявление и анализ антимикробной активности у представителей рода Coprinus

Для выявления антимикробной активности представителей рода Coprinus сначала исследовали культуральные жидкости десяти штаммов Coprinus Было показано, что культуральные жидкости восьми штаммов из десяти обладают антимикробной активностью (табл. 3). Максимальная антимикробная активность культуральной жидкости у большинства штаммов наблюдалась на 14 сутки роста Диаметр зон подавления роста варьировал в пределах 11-23 мм (диаметр лунок 9 мм). Культуральные жидкости штаммов С micaceus ВКМ F-2945 (2860) и Coprinus sp. 29602 не проявили антимикробной активности.

Таблица 3. Антимикробная активность культуральных жидкостей представителей рода Coprinus

Штаммы Coprinus Тест-организмы, в отношении которых обнаружена антимикробная активность

С micaceus 2870 ВКМ F-2946 Escherichia coli АТСС 25922

С. digitalis 2956 Bacillus subtilis АТСС 6633

С comatus 2957 Staphylococcus aureus FDA 209P (MSSA), ИНА 00761 (MRSА), В subtilis ATCC 6633, Candida albicans ИНА 00763, Saccharomyces cerevisiae RIA 259, Axpergillius niger ИНА 00760

Штаммы Coprinus Тест-организмы, в отношении которых обнаружена антимикробная активность

Coprinus sp 2958 S aureus FDA 209Р, A niger ИНА 00760

Coprinus. sp. 2959 Micrococcus luieus NCTC 8340 , Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853

Coprinus. sp. 2960-1 S. aureus FDA 209P(MSSA), В subtile ATCC 6633, M luteus NCTC 8340, S cerevisiae RIA 259

C. congregatus 2961-2 В. subtihs ATCC 6633, S aureus FDA 209P(MSSA), ИНА 00761 (MRSA)

C. radiatus 2965 S. aureus ИНА 00761(MRSA), B. subtihs ATCC 6633, M luteus NCTC 8340

Затем методом дисков анализировали концентраты выделяемых веществ. Для более полного выявления антимикробных веществ, а также для уточнения спектра их действия исследовали продуцент С radiatus 2965. Было показано, что штамм С radiatus 2965, вероятно, синтезирует не менее двух антимикробных веществ на разные сроки культивирования (табл. 4).

Анализ концентратов культуральной жидкости С. radiatus 2965 позволил обнаружить антимикробную активность в отношении более широкого спектра микроорганизмов (восьми тест-организмов из четырнадцати)

В дальнейшем было проведено выделение биологически активных соединений и получение их концентратов еще для восьми штаммов рода Coprinus: С. digitalis 2956, Coprinus sp 2959; Coprinus sp.2960-2; С congregatus 2961-2; С radiatus 2987; Coprinus sp.3002; С congregatus 3003, C. delicatulus 3046. По результатам данного эксперимента, на основании спектра антимикробной активности и уровня биосинтеза антибиотически активных веществ, действующих на MRSA, представителями рода Coprinus были отобраны штаммы С congregatus 2961-2 и С radiatus 2987 для дальнейшей работы по повышению продуктивности, а также выделению антибиотически активных веществ и определению их химической природы (табл. 5)

Было выделено 3 морфологических типа моноспоровых вариантов штамма С radiatus 2987 Для каждого морфологического типа было отсеяно по 7 моноспоровых вариантов и определена антимикробная активность их кулмуральных жидкостей. Данные этого эксперимента продемонстрировали расщепление каждого из морфологических типов моноспоровых вариантов по способности к синтезу антимикробных веществ. Для последующей работы представляют интерес следующие варианты, относящиеся ко 2 морфологическому гипу: №8, обладающий достаточно высокой избирательной активностью в отношении MSSA и MRSA, а гакже №14,

проявивший значительную антимикробную активность в отношении грамположительных бактерий.

Таблица 4. Антимикробная активность концентратов культуральной жидкости и

экстрактов мицелия С га<Ишш 2965*

Сутки роста Фракция** Тест-организмы

Грамположительные бактерии Грамотрицательные бактерии Грибы

№ •О О и я «1 В тусогЫея 537 В ритП!5 >ГСТС 8241 I тезеМегоШея ВКПМ В-4177 М Шею ИСТС 8340 5 аигем ББА 209Р (М8ЭА) Я аигеш ИНА 00761 (МЯвА) Е. со1х АТСС 25922 г» ш г^ оа 1 в с .Ьо Е а о Р аеги&пова АТСС 27853 А. и^ег ИНА 00760 5 сегеу1$1ае МА 259 С а1Ысат ИНА 00763

7 Кн - + + - + - - - + - - - -

Кк ++ ++ + - + - - - - - - - -

Мн - - + - - - - - +++ - - - -

Мк - - + - - - - + - - - - -

17 Кн +++ +++ +++ +-Н- ++ - - - - -

Кк ++ ++ +++ +++ ++ - - - - -

Мн - - - - - - - - - -

Мк - - - - - - - - - -

21 Кн

Кк

Мн

Мк

* В таблицах 4 и 5 используются следующие условные обозначения зон подавления роста тест-организмов: (-) подавления нет; (+) минимальные зоны, свидетельствующие о следовых количествах антимикробных веществ (диаметр менее 7 мм); (++) диаметр

зоны подавления 7-9 мм; (+++) диаметр зоны подавления не менее 10 мм

С. radiatus 2987 С congregatus 2961-2 Штамм

1 * Я я Я s s я 2 Ш Я я Я a Фракция

+ + t +++ t + + + t + t B subtilis AI CC 6633 | Грамположительные бактерии | Тест-организмы |

+++ +++ + t 1 "^"M B mycoides 537

1 + + +++ + + 1 + + + B. pumilis NCTC 8241

1 1 ■ + + + + + L mesenteroides BKIIM B-4177

t t + + + + + + M luteus NCTC 8340

■ 1 + + 1 ■ + i t 5. aureus FDA 209P (MSSA)

1 + 1 + 1 + + + + S aureus HHA 00761 (MRS A)

+ 1 + + + 1 S. aureus HHA 00762 (MRSA)

1 1 I + + + + E coli ATCC 25922 Грамотрицательные бактерии

' 1 l 1 i C terrigena BKilM B-7571

1 1 1 1 + + + + P. aeruginosa Atcc 27853

' ■ 1 ( 1 1 1 i A niger HHA 00760 Грибы

1 1 1 1 ' J ' ■ 5 cerevisiae RIA 259

■ ■ 1 • 1 1 1 i C albicans HHA 00763

Подбор сред для повышения выхода ашимикробных метаболитов штаммов

С. congregatus 2961-2 и С. radiatus 2987

С целью наработки биомассы отобранных штаммов С congregatus 2961-2 и С radiatus 2987 и выделения антимикробных метаболитов, было проведено сравнение двух сред: соево-глицериновой и сусло-среды. Антимикробная активность культуральной жидкости определялась в отношении В subtilis АТСС 6633, S aureus ИНА 00761 (MRSA) на 5, 7, 14, 21 и 27 сутки роста в глубинной культуре В результате было показано, что наиболее высокий уровень биосинтеза был достигнут при использовании сусло-среды с концентрацией сусла 250 мл/л.

Выделение антимикробных метаболитов штаммов С congregatus 2961-2 и С. radiatus 2987

Культуральные жидкости были наработаны и переданы в Лабораторию химического изучения биологически активных соединений микробного происхождения для выделения и идентификации веществ, проявляющих антимикробную активность.

Из культуральной жидкости штамма С congregatus 2961-2 было выделено 2 активных компонента (табл. 6). Определена МПК выделенных веществ (см. стр 20, табл. 12).

Второй активный компонент может быть отнесён к группе антибиотиков микомицинов - ненасыщенных алифатических соединений и по физико-химическим свойствам близок к антибиотику немотину А (рис. 1в). Ранее немотин А был выделен вместе с нсмотином (рис 1а) и немотиновой кислотой (рис. 16) из базидиомицетов Poria tenuis и Porta corticola. [Korzybski, 1978]

а. НС ^C - С = С - CH = С = CH - <Ьн - СН2- СН2- ¿О

Немотин

б. НС=С-С = С-СН = С-СН-СНОН-СН2-СН2-СООН

Немотиновая кислота

в.-С=С-С = С-СН = С = СН-СН-СН--^-Н2С-(С = С)з-СН = СН

Немотин Немотин А

Рисунок 1. Химическая структура немотина, немотиновой кислоты и немотина А [Korzybski, 1978].

Таблица 6. Характеристика ан гимикробных веществ штамма С congregatus 2961-2.

Активный компонент Молекулярная масса, а. е. м. Rf (ТСХ на Кизсльгеле 60 («Merck»), F254 в системе хлороформ метанол (9.1)) Длина волны поглощения

УФ-спектр Хщах, КМ (этанол) ИК-епсктр Vmax, CM"' (хлороформ)

1-2961-2 364 0,46 229, 283,298 3300,2970,2940, 1700,1570,1370, 1230,1170

И-2961-2 234 0,24 230,241,272, 288, 306, 327 2960,2190,1700, 1580, 1400,1360, 1200

Из культуральной жидкости штамма С radtatus 2987 выделено 3 компонента, обладающих антимикробными свойствами Наиболее активный из них, и синтезируемый грибом в большем количестве, представлял собой лагоподин В (табл 7, рис. 2) - относящийся к группе антибиотиков лагоподинов, продуцируемой грибами С lagopus, С. cinereus и открытой в 1965г немецким исследователем Боллингером [Lauer, Anke, 1991]. Два минорных компонента предположительно также относятся к группе лагоподинов.

Таблица 7. Характеристика антимикробного вещества штамма С radiatus 2987

Активный компонент Молекулярная масса, а е м Rf (ТСХ на Кизельгеле 60 («Merck»), F254 о системе бензол ацетон (5.1)) Длина волны поглощения

уф. спектр ^пмх) НМ (этанол) ИК-спектр Vmax» СМ (хлороформ)

Лагоподин В 262 0,9 203, 263, 415 3200,2950,1670, 1650,1635,1580, 1445,1375, 1320, 1295,1265,1230, 1180,1165,1140, 1075, 1050,990, 940, 880

Для выделенных антимикробных веществ была определена МПК в жидкой среде методом двукратных серийных разведений в отношении ряда тест-организмов Результаты эксперимента приведены в таблице 12 (см. стр 20).

СНъ СНз

Рисунок 2. Химическая структура лагоподина В

На примере антимикробных веществ, синтезируемых представителями рода Coprinus, было показано, что одно и тоже антибиотически активное вещество может синтезироваться как близкими (лагоподин В), так и несколько отдалёнными в эволюционном отношении группами ор1анизмов (немотин А). Оразование одного и того же антибиотика отдалёнными в эволюционном отношении организмами, имеющих различную среду обитания и способ питания в природе, а также искусственно культивируемых в различных условиях, говорит о существовании общих для обоих организмов древних форм, у которых «полезная» способность к синтезу антибиотика была наследственно закреплена. Образование «общего» антибиотика представителями одного рода, возможно объяснить наличием сходных метаболических путей. Эти данные ещё раз опровергают гипотезу Ваксмана о случайном характере образования антибиотиков, зависящем только от условий культивирования, которые, однако, играют важную роль при изучении возможных продуцентов в искусственных условиях.

Анализ антимикробной активности культуральной жидкости на разные сроки культивирования на примере штамма С radiatus 2965 и определение антибиотической активности моноспоровых вариантов штамма С radiatus 2987 демонстрирует различные возможности влияния на спектр антимикробной активности с целью получения антибиотиков заданного спектра действия.

Выделение в культуру штаммов Laetiporus sulphureus

Плодовые тела серно-желтого трутовика L sulphureus (Fr) Bond et Sing были собраны с дубовых стволов в различных районах Москвы и Московской области. Из различных плодовых тел было выделено тканевым методом 4 штамма, сходных по морфологическим характеристикам и лишь незначительно отличающихся по интенсивности окраски и скорости роста.

Для идентификации мицелиальной культуры, выделенпой го плодовых тел L sulphureus, использовали методы и критерии, позволяющие определить

систематическую принадлежность исследуемых культур наличие долипоровой септы; исследование выделенных мицелиальных культур и коллекционного штамма с помощью сканирующей и трансмисивной электронной микроскопии; изучение культурально-морфологических свойств культур (тип колоний, характер роста, цвет мицелия, запах, наличие экзопигмента). Результаты всех исследований были сопоставлены с данными определителей [БЫреге, 1978; Определитель грибов России, 1998].

Получение плодовых тел в искусственных условиях могло бы служить прямым доказательством того, что выделенные мицелиальные культуры относятся к виду I ¡Ыркигеиа Поэтому, следующей задачей являлось получение плодовых тел. Плодовые тела были получены на твёрдой питательной среде, основу которой составлял ржаной хлеб. Через 1,5 месяца роста в поверхностной культуре наблюдалось образование зачатков плодовых тел, которые выглядели как ярко-оранжевые уплотнения, диаметр образований достигал 2-3 см После получения плодового тела в лабораторных условиях был проведен сравнительный анализ срезов полученного в культуре и природного плодовых тел штамма Ь шХркигет 3375 с помощью сканирующей электронной микроскопии. Результаты анализа подтвердили, что выделенные мицелиальные культуры относятся к виду Ь яиЩигеш

Выявление и анализ антимикробной активности у штаммов Ь. хШркигет

Первоначально антимикробная активность штамма 2990 I эьйрЬигеиз была обнаружена методом блоков при поверхностном культивировании на соевом агаре. На следующем этапе исследовали антимикробную активность культуральной жидкости штамма 2990 методом лунок (табл 8). Спектр антимикробной активности при использовании каждого их методов был сходным

Таблица 8. Определение антимикробной активности Ь ш1ркигеи.ч (штамм 2990) методом лунок

Тест-организм* Диаметры зон подавления роста приведены в мм

Сутки роста

7 14 21 28 35

В. ¡иЫШч АТСС 6633 14 25 18 22 29

В туыМех 537 8 17 17 20 20

В. ритШя ЫСТС 8241 25 21 21 22 23

£ теяеп1его1<1ех ВКПМ В-4177 12 16 13 21 16

Тест-организм* Диаметры зон подавления роста приведепы в мм

Сутки роста

7 14 21 28 35

S. aureus ИНА 00761 (MRSA) Более 45 мм

Е. coli АТСС 25922 25 25 26 22 24

С. terrigena ВКПМ В-7571 28 23 29 26 25

Р aeruginosa АТСС 27853 19 13 14 19 17

* В отношении грибных тест-организмов активность не выявлена.

Подбор сред для повышения выхода антимикробны* метаболитов штаммов Ь. т1ркитеш

В ходе работ по подбору среды для глубинного культивирования использовали различные источники азота, углерода, добавляли твердые частицы для иммобилизации мицелия. Внесение в сусло-среду древесных опилок березовых, дубовых и деревьев хвойных пород показало, что наилучший уровень антимикробной активности наблюдается на сусло-среде, содержащей 1% дубовых опилок. Затем исследовали влияние на рост и биосинтез антибиотических веществ различных дополнительных источников питания: соевой муки, хлопковой муки, фармамедии, кукурузного экстракта Все испытанные богатые органическим азотом компоненты стимулировали проявление антимикробной активности. Рост мицелия и уровень биосинтеза антимикробных веществ значительно увеличивались, т.е. наблюдалась зависимость биосинтеза от количества мицелия. Исключение составляет среда, содержащая кукурузный экстракт. Последний задерживал рост, но стимулировал биосинтез, что, по-видимому, связано с наличием в нем низкомолекулярных веществ - возможных предшественников антибиотиков. Изучение влияния различных источников углерода (сусло, мальтоза, глюкоза, сахароза) па антимикробную активность штамма 2990 показало, что любой из Сахаров даст положительный эффект, однако мальтоза и сусло наиболее эффективны.

Далее, на фоне подобранной среды, содержащей сусло и соевую муку, культивировали 4 штамма I ¡гАркигеш. 2990, 2991, 3375 и 3461. В условиях глубинного культивирования наблюдали гомогенный рост всех четырех штаммов, однако скорость роста и накопление анIибиотических веществ варьировали. Антимикробный спектр у всех четырех штаммов был идентичным. В процессе выращивания 4-х штаммов I хи1ркигеих происходило значительное снижение рН культуральной жидкости до уровня 2,0-2,8 и появление оранжевого пигмента,

интенсивность которого коррелировала с уровнем антимикробной активности. Указанные особенности глубинной культуры позволили предположить, что в процессе ферментации происходит биосинтез органической кислоты

Выделение антибиотически активпых метаболитов L. sulphureus

Культуральная жидкость штамма L sulphureus 2990 была наработана и передана в Лабораторию химического изучения биологически активных соединений микробного происхождения для выделения и идентификации веществ, проявляющих антимикробную активность Было выделено около 4 мг относительно чистого вещества Вещество было передано для идентификации в University Tübingen (Tübingen, FRG) профессору Цеку (A Zeeck). В результате было установлено, что полученное вещество представляет собой смесь 3-х компонентов: первый компонент имеет молекулярную массу 263 - 262 а е.м и поглощение в УФ-спектре (этанол) при 254 нм, два других компонента, предположительно стереоизомеры, с одинаковым молекулярным весом -525 а.е.м. не имеют поглощения в УФ. Все компоненты обладают выражепиой активностью в отношении метициллинрезистентных стафилококков (MRSA). Из нативного раствора L sulphureus 2990 было выделено белое кристаллическое вещество, которое по электрофоретической подвижности, хроматографическому поведению и качественным реакциям, было идентифицировано со щавелевой кислотой Биосинтез этого вещества ранее не был известен у I, sulphureus. Таким образом, было установлено, что антимикробная активность штаммов L sulphureus была обусловлена преимущественно антимикробным действием щавелевой кислоты.

Возникла необходимость разделения активности веществ, синтезируемых штаммами L sulphureus и разработки метода, позволяющего раздельно контролировать образование щавелевой кислоты и интересующих нас антибиотиков. Для этих целей был применён метод анализа компонентного состава антимикробного комплекса веществ, образуемого при глубинном культивировании с использованием электрофореза на бумаге и последующей биоавтографии. Условия, при которых проводили электрофорез, приводили к нейтрализации щавелевой кислоты и подавлению ее антимикробной активности Метод продемонстрирован на примере пгтамма L sulphureus 3375 (табл. 9). Для характеристики веществ, дающих зоны задержки роста при биоавтографии в отношении MRSA, использовали Еш„ -относительную электрофоретическую подвижность.

Таблица 9. Подвижное 1ь при электрофорезе на бумаге веществ с антибиотической активностью, образуемых штаммом Ь хи!рИигеш 3375 (по результатам биоавтографии в отношении МЯБА)

№ опыта Е(ГП! активных зон Сроки биосинтеза (сут) Среда Локализация антибиотических веществ

1 0,023 (-) 7-9 сусло-соевая культуральная жидкость, мицелий

2 0,070 (-) 9-14 сусло-соевая культуральная жидкость, мицелий

3 0,174 (-) 14 сусло-соевая мицелий

4 0, 058 14 сусло-соевая культуральная жидкость, мицелий

Таким образом, было показано, что штаммы вида Ь. ягйрУшгет образуют вещества, обладающие активностью в отношении метициллинрезистентного золотистого стафилококка и предложен метод контроля образования этих веществ. В настоящее время продолжается работа со штаммами /,. хи1рИигеш, направленная на выделение антибиотических веществ и определение их химической структуры.

Выделение в культуру дейтеромицета ТгкИойегта пгШе, получение и идентификация биологически активных метаболитов

Штамм ТпсЪос{егта \iride (Регэ.) Бг. 2963 был выделен с плодового тела базидиомицета ЕхШа #1агиЫо%а при попытке выделения последнего тканевым методом в культуру Было установлено, что штамм 2963 обладает выраженным антимикробным действием при глубинном культивировании. Первоначально антимикробную активность культуральной жидкости определяли методом лунок (табл. 10).

Культуральная жидкость была наработана и передана в Лабораторию химического изучепия биологически активных соединепий микробного происхождения, где активное вещество было выделено и идентифицировано.

Смесь антибиотических веществ, продуцируемых штаммом Т. \iride 2963, была получена из культуральной жидкости. Детально был изучен наиболее активный компонент с молекулярной массой 1755 а.е.м (табл. 11).

Таблица 10 Определение антимикробной активности Т viride 2963 методом лунок

Тест-организм Антимикробная активность (диаметры зон подавления роста в мм)

Сутки роста

7 14 21 28

В subtilis АТСС 6633 29 29 13 13

В mycoides 537 - - - -

В. pumilis NCTC 8241 - - - -

1 mesenteroides ВКПМ В-4177 - - - -

М luteui NCTC 8340 17 17 - -

S aureus FDA 209P (MSSA) - - 25 13

S aureus ИНА 00761 (MRSA) 25 23 15 15

E coli АТСС 25922 - 19 - -

С. terrigena ВКПМ B-7571 - - - -

Ps aeruginosa АТСС 27853 - - - -

A mger ИНА 00760 - - - 15

S cerevisiae RIA 259 19 15 - -

С. albicans ИНА 00763 - - - -

Масс-спектр выделенного вещества, а также наличие определённых аминокислот в гидролизате препарата, позволилили предположить, что выделенный антибиотик относится к группе полипептидных антибиотиков - пептаиболам, а именно является представителем ангибиотиков группы трихотоксинов. По литературным данным антибиотик трихотоксин А-40-3, образуемый Т viride, имеет масс-спектр (m/z)-1702, 1703, 1717, 1730, 1744, 1776, то есть является смесью близкородственных антибиотиков [BNPD], У полученного вещества определена МПК в отношении тест-организмов (см.табл 12).

Таблица 11. Характерно гика антимикробного вещества штамма Т viride 2963

Активный компонент Молекулярная масса, а е м Rf (ТСХ на Кюельгеле 60 («Merck»), t234 в системе ггилацетат. метанол (1*1)) Длина волны поглощения

УФ-спектр ^max» HM (этанол) ИК-спектр Vmax, CM"' (КВт)

Вещество группы пептаиболов 1755 0, 35 200-210 3160,1650, 1530

Таблица 12. Значения МПК для полученных антибиотических веществ.

Тест-организм МПК мкг/мл Антибиотические вещества штамма

С radiatus 2987 С. congregatus 2961-2 Т viride 2963

Лагоподин В 1 компонент (I- 2961-2) 2 компонент (немотин А) Антибиотик группы пептаиболов

В. subtilis ATСС 6633 2 128 32 2

В mycoides 537 2 1

В pumilis NCTC 8241 1 0,125 128 2

L. mesenteroides 4 1 128 >128

ВКПМВ-4177

М luteus NCTC 8340 0,062 0,5

S aureus FDA 209P 0,25 0,125 128 2

(MSSA)

S aureus ИНА 00761 0,5 4 2 4

(MRSA)

S. aureus 3797 (GISA) 8

S aureus 3998 (GISA) 8

С terrigena ВКПМ B- 1 1 128 >128

7571

Enterococcus faecahs 560 16

E faecium 569 16

E coli ATCC 25922 - 16 >128 >128

P aeruginosa АГСС 27853 - >128 >128 >128

A niger ИНА 00760 - >128 >128 >128

S cerevisiae RIA 259 - >128 >128 >128

В начале исследования была поставлена задача поиска новых антибиотиков с заданными свойствами: новые вещества должны иметь узкий спектр действия, не действовать на грибные tcci -opi аничмы и быть активными в отношении золотистого стафилококка - S aureus FDA 209Р (MSSA), а также резистентных форм бактерий, а именно S aureus ИНА 00761 (MRSA), устойчивого к оксациллину (МПК оксациллина - 32 мкг/мл, бензилпенициллина - 128 мкг/мл, ванкомиципа 2 мкг/мл) и L

mesenteroides ВКПМ B-4177, обладающего высокой природной устойчивостью к гликопептидным антибиотикам (МПК ванкомицина > 512 мкг/мл).

В результате проделанной работы из представителей рода Coprinus были получены три вещества: лагоподин В из штамма С. radiatus 2987, I активный компонент штамма С congregatus 2691-2, и немотин А - Н активный компонент штамма С. congregatus 2691-2 Наиболее активным веществом является лагоподин В, активный также в отношении ванкомицинрезистентных штаммов S aureus 3797 (GISA) и S aureus 3998 (GISA) Лагоподин В избирательно действует на грамотрицательные тест-организмы (активен в отношении С. terrigena ВКПМ В-7571 и тест-организмов рода Enterococcus, устойчивых к ванкомицину), не подавляет роста грибных тест-организмов.

Для лагоподина В была также определена МПК в отношении грамотрицательных бактерий, устойчивых к гликопептидным антибиотикам: Enterococcus faecalis 560 и Е faecium 569 - МПК в отношении данных ieci штаммов 16 мкг/мл. МПК ванкомицина в отношении двух указанных тест-организмов составляет >128 мкг/мл, эремомицина - >64 мкг/мл.

Было отмечено, что активные компоненты, выделенные из штамма С congregatus 2691 -2, значительно различаются по антимикробному спектру. Первый из компонентов, активнее, чем второй компонент - немотин А и действует на практически все грамположительные тест-организмы, не активеп в отношении грибов, избирательно подавляет рост грамотрицательных бактерий Немотин А менее активен, но его важным достоинством является практически избирательное действие в отношении метициллинрезистентного стафилококка

Следует отметить, что снекгры двух компонентов штамма С congregatus 2961-2 как бы «дополняют» друг друга, первый из компонентов практически не действует на П subtilis АТСС 6633 и малоакшвен в отношении S aureus ИНА 00761 (MRSA), активность второго компонента - немотипа А повышается именно в отношении этих тест-организмов (табл 12) И наоборот МПК немотина А в отношении С terrigena ВКПМ В-7571 и L mesenteroides ВКПМ В-4177 - 128 мкг/мл, а первый из компонентов значительно более активен в отношении данных тест-организмов оба значения МПК составляют 1 мкг/мл.

Подобное явление также подтверждает неслучайный характер синтеза антибиотиков и играет важную роль в природе, где антибиотики являются одним из способов борьбы за существование: микроорганизмы-конкуренты, на которые не действует первое из антимикробных веществ, будут чувствительны ко второму

антибиотику Одним из возможных объяснений «раздельного» синтеза активных компонентов является то, что организму не выгодно синтезировать сразу несколько антибиотиков: во-первых, не обязательно, что все они могут понадобиться, во-вторых, одновременный синтез антибиотиков требует больших «метаболических» затрат. Таким образом, биосинтез антибиотиков не только не является случайным, но также тщательно «спланирован».

Выводы

1. Создана коллекция культур базидиомицетов родов Сорпгш и ЬаеНрогш, насчитывающая 17 штаммов Все выделенные из природы штаммы обладали ангамикробной активностью, кроме того, были активны 3 штамма, полученные из коллекций ВКМ и ВКПМ Всего в отношении МЯЭА проявили активность 15 штаммов.

2. Разработан и внедрён в практику лаборатории метод очистки грибной культуры от бактериальной контаминации, названный методом мицелиального моста. Метод базируется на различии в характере роста бактериальных и грибных культур.

3 При глубинном культивировании 13 из 14 исследованных штаммов рода Соргтш проявляли антимикробную активность, что характеризует данный род как перспективную группу предполагаемых продуцентов антибиотиков.

4. Разработаны условия культивирования, при которых штамм Сорппш гасИмш 2987 синтезирует 3 антибиотика, эффективных в отношении грамположитсльных бактерий Из них в наибольшем количестве образуется лагоподин В, ранее не описанный у данного вида. МПК лагоподина В в отношении М118А составляет 1 мкг/мл. Активность в отношении резистептпых форм бактерий ранее не определялась для лагоподина В

5. Из культуральной жидкости штамма С congregatus 2961-2 выделено 2 антимикробных вещества, активных в отношении грамположительных бактерий, с молекулярными массами 364 и 234 а.е.м. В юрой из активных компонентов был идентифицирован с немотипом А Биосинтез данного антибиотика ранее не был описан у шляпочных грибов МПК выделенных антимикробных веществе отношении МИБА составляют, соответственно, 4 и 2 мкг/мл.

6. Изучены 4 природных и один коллекционный штамм ¿аеНрогия яи1ркигеш, разработаны условия проведепия глубинной ферментации, а также поверхностного культивирования с образованием плодовых тел. Выделено 3

вещества, активных в отаоптении MRSA, установлены их молекулярные массы - 262-263, 525 и 525 а.е.м Впервые показало, что кислая природа плодовых тел и культуральной жидкости обусловлена биосинтезом щавелевой кислоты. Из плодового тела базидиомицета Rxidia glandulosa выделен пггамм Trichoderma viride 2963, синтезирующий антибиотик группы пептаиболов с молекулярной массой 1755 а.е.м., активный в отношении грамположительных бактерий. Величина МПК антибиотика в отношении метициллинрезистентного стафилококка составляет 16 мкг/мл.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1 Е. Ю Ершова, О В Ефременкова, В А Зенкова, И В. Толстых, Ю. В. Дудник Выявление антимикробной активности у представителей рода Coprinus// «Микология и фитопатология». 2001. Т. 35. Вып. 6, стр. 32-37.

2 Е Ю Ершова, О. В. Ефременкова, В А. Зенкова, И. В. Толстых, Ю. В. Дудник. Базидиальные грибы рода Coprinus - продуценты антибиотиков, эффективных в отношении резистептпых бактерий // «Клиническая микробиология и антимикробная терапия» 2001, т. 3, приложение 1, стр. 15. Тезисы IV международной конференции МАКМАХ. Москва, 18-21 июня 2001г.

3 Olga V. Efremenkova, Ekaterina Yu. Ershova, Irina V. Tolstych, Valentina A. Zenkova and Yuri V. Dudnik. Antimicrobial activity of Coprinus Pers isolates // International journal of medicinal mushrooms. Vol. 3, p 138. 2001. Thesis of the conference "Medicinal mushrooms" Kiev, 2001.

4 E Ю. Ершова, О В Ефременкова, В А. Зенкова, И. В. Толстых. Новые объекты для поиска антибиотиков, преодолевающих лекарственную устойчивость // IX Российский национальный конгресс «Человек и лекарство» 2002 Тезисы докладов, стр. 613

5 Ефременкова О В., Сумарукова И Г, Ершова Е. Ю., Толстых И В., Беланенко E H, Камзолкина О. В., Дудник Ю. В Спектр антимикробной активности природного изолята Sporotrix schenckii 3158 //1 Съезд микологов России Тезисы докладов М.: Изд «Национальная Академия Микологии». 2002, стр 251

6. Ершова Е. Ю., Ефременкова О В, Зенкова В. А., Толстых И. В. Антимикробная активность представителей рода Coprinus (Fr ) S F Gray //1

Съезд микологов России Тезисы докладов. М.: Изд. «Национальная Академия Микологии». 2002, стр. 252.

7. Тихонова О В., Лурье Л. М, Ершова Е Ю., Ефременкова О. В., Дудник Ю. В Изучение глубинной культуры Laetiporus sulphureus (Fr ) Bond et Sing //1 Съезд микологов России. Тезисы докладов. М.: Изд. «Национальная Академия Микологии» 2002, стр. 257

8. Olga V. Efremenkova, Ekaterina Yu Ershova, Irina V. Tolstych, Valentina A. Zenkova and Yuri V. Dudnik. Antimicrobial activity of Medicinal Mushrooms from the Genus Coprinus (Fr) S F. Gray (Agaricomycetideae) II International Journal of Medicinal Mushrooms. 2003. Vol. 5, pp. 37-41.

9 E. Ю. Ершова, О. В. Ефременкова, Ю. В. Дудник. Метод очистки 1рибных культур от бактериальной контаминации // Микология и фитопатология. 2003г Подписана в печать. Т. 37, №4.

10. Ершова Е.Ю., Ефременкова О. В., Камзолкина О. В., Тихонова О.В., Лурье Л.М., Дудник Ю В Выделение в культуру и изучение антибиотической активности представителей вида Laetiporus sulphureus if Антибиотики и химиотерапия. 2003г. Т. 48, №1, стр. 3-7.

11. Тихонова О. В., Лурье Л. М.,Ершова Е. Ю., Катруха Г. С., Куляева В. В, Сумарукова И. Г, Ефременкова О. В., Дудник Ю. В. Изучение некоторых физиологических особенностей культуры Coprinus radiatus (Bolton) Gray (1938) 2987 - продуцента лагоподипа В // Успехи медицинской микологии под ред. Акад. РАЕН Ю В Сергеева (материалы 1 Всероссийского конгресса по медицинской микологии) Тезисы доклада. 2003. Т. 1, стр. 311-312.

12. Тихонова О В , Ершова Е. Ю., Лурье Л. М., Куляева В В , Катруха Г С , Камзолкина О. В., Ефременкова О. В., Дудник Ю. В. Антимикробные свойства представителей вида Laetiporus sulphureus (Fr.) Bond et Sing // Успехи медицинской микологии под ред. Акад. РАЕН Ю. В. Сергеева (материалы 1 Всероссийского кошресса по медицинской микологии). Тезисы доклада. 2003 Т 1, стр. 313-314

Отпечатано в когавдентре «Учебная полиграфия» Москва, Воробьевы горы, МГУ, 1 Гуманитарный корпус. www.stprint ru e-mail. zakaz@stpnnt ru. тел 939-3338 Заказ № 333, тираж 100 эю. Подписано в печать 05.05.2003 г.

РНБ Русский фонд

2006-4 7164

WY

**

ч

19 МАИ 2003

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Ершова, Екатерина Юрьевна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

• ВВЕДЕНИЕ.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Проблема лекарственной устойчивости патогенных микроорганизмов.

1.2. Базидиомицеты — продуценты веществ, проявляющих антимикробную активность.

1.3. Представители рода Соргтиэ - источник антибиотиков и других биологически активных веществ.

1.4. Характеристика представителей вида ЬаеИрогиъ ъШрИигеш как продуцентов биологически активных веществ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Поиск продуцентов антибиотиков грибного происхождения, эффективных в отношении метициллинрезистентных стафилококков"

Широкое распространение устойчивых форм микроорганизмов, снижающее эффективность применения антибиотиков, является серьезной проблемой клинической практики. Особые опасения вызывает резко возрастающая частота инфекций, вызываемых метициллинрезистентными штаммами золотистого стафилококка (MRSA).

В связи с этим одной из наиболее актуальных проблем современной науки об антибиотиках является поиск новых препаратов, преодолевающих лекарственную устойчивость микроорганизмов. Одним из направлений поиска новых природных антибиотиков является изучение видов, ранее не рассматривавшихся или малоизученных как возможные продуценты антибиотиков. К числу таких организмов можно отнести базидиальные грибы.

В начале антибиотической эры базидиомицеты привлекли к себе внимание наряду с другими организмами. Флори с соавт. (1949) определил различную антимикробную активность при анализе, как плодовых тел, так и мицелиальных культур более чем у 2000 видов грибов. Один из полученных тогда грибных антибиотиков - плевромутилин, использовался в животноводстве для лечения инфекций, вызванных микоплазмами. Однако, в дальнейшем интерес к метаболитам грибов снизился, так как актиномицеты проявили себя как более богатый и легко культивируемый источник антибиотиков. На современном этапе базидиомицеты и другие высшие грибы стали заново исследоваться в этом отношении. Установлено, что базидиомицеты синтезируют огромное количество вторичных метаболитов, проявляющих антибактериальную, противогрибковую, антивирусную, цитотоксическую и галлюциногенную активность, а также обладающих свойствами иммуномодуляторов и гормонов [Anke, 1989; Molitoris, 1994; Феофилова, 1998; Wasser, Weis, 1999; Suay et al., 2000]. )то произошло во многом благодаря новым достижениям в технологии ферментации, выделения, очистки и методологии определения структуры полученных веществ, которые сделали возможным изучение различных организмов в качестве источников новых биологически активных метаболитов.

В настоящее время трудности, связанные с медленной скоростью роста базидиомицетов, получением плодовых тел в искусственных условиях, низким выходом продукта, компенсируются реальной возможностью выявления новых антибиотиков различной химической природы. Тот факт, что базидиомицеты до настоящего времени были недостаточно исследованы, вместе с тем, что они продуцируют широкий ряд антибиотиков различной структуры, позволяет предположить, что их можно рассматривать как новый источник биологически активных соединений.

Работа выполнена в порядке соискательства в рамках программ РАМН 002 «Поиск и изучение антибиотиков, эффективных в отношении бактерий, устойчивых к лекарственным препаратам» и 008 «Поиск и анализ новых антибактериальных и противоопухолевых антибиотиков».

Целью работы было выявление грибов-продуцентов антибиотиков, эффективных в отношении метициллинрезистентных стафилококкокков.

Для выполнения основной цели данной работы были поставлены следующие конкретные задачи:

1. Выделение из природных источников штаммов грибов.

2. Проведение скринингового исследования среди выделенных культур: выявление продуцентов антибиотически активных веществ и отбор наиболее перспективных продуцентов по антимикробному спектру и уровню активности.

3. Подбор среды для глубинного культивирования, обеспечивающей накопление антимикробных веществ в количествах, достаточных для их выделения и идентификации.

4. Наработка антибиотически активных веществ, синтезируемых наиболее перспективными продуцентами, выделение и определение их химической природы.

Новизна результатов. Впервые выявлено, что представители рода Coprinus (Fr.) S. F. Gray - перспективная группа продуцентов антибиотиков. Установлено, что представители рода Coprinus образуют вещества, эффективные в отношении метициллинрезистентных стафилококков.

Три антибиотика, эффективных в отношении MRSA, выделены из штамма Coprinus radiatus (Fr.) S. F. Gray 2987. Из трёх антимикробных веществ в наибольшем количестве образуется уже известный антибиотик лагоподин В, активность которого в отношении резистентных форм патогенных бактерий ранее не исследовалась. Образование лагоподина В у вида С. radiatus описано впервые.

Впервые установлено, что штамм С. congregates (Bull.) Fr. 2961-2 является продуцентом двух антибиотиков, подавляющих рост MRSA. Один из активных компонентов является уже известным антибиотиком группы микомицинов - немотином А. Синтез данного антибиотика ранее не был известен у представителя рода Coprinus, при этом впервые выявлена активность немотина А в отношении метициллинрезистентного золотистого стафилококка.

Впервые обнаружено, что вид Laetiporus sulphureus (Fr.) Bond et Sing, образует антибиотические вещества, активные в отношении MRSA. Три антибиотика, активные в отношении MRSA, выделены из штамма L. sulphureus 2990.

Были получены плодовые тела L. sulphureus, ранее образование плодовых тел в чистой культуре не было описано у данного вида.

Основное положение диссертационной работы, выносимое на . защиту, заключается в том, что представители базидиомицетов - грибы рода Coprinus и вид L. sulphureus являются перспективными продуцентами антибиотиков, эффективных в отношении метициллинрезистентных стафилококков.

Научно-практическая значимость. Создана коллекция базидиомицетов родов Coprinus и Laetiporus Murr., состоящая из 21 штамма. Из них 16 штаммов выделены из природы в ходе данной работы и 5 штаммов получены из коллекций В КМ, ВКПМ, ИНА. В коллекцию вошли 5 штаммов, относящиеся к 3 видам рода Coprinus, отсутствующие в коллекциях ВКМ и ВКПМ. В отношении MRS А проявили активность 14 штаммов коллекции.

Разработан и внедрен в практику лаборатории метод «мицелиального моста», позволяющий очистить грибную культуру от бактериальной контаминации.

Предложены условия анализа культуральной жидкости штаммов L. sulphureus, позволившие обнаружить 4 антибиотических вещества, эффективных в отношении MRSA.

Подобраны условия поверхностного культивирования мицелиальной культуры L. sulphureus, обеспечивающие получение плодовых тел.

Автор выражает глубокую признательность за предоставление темы, руководство и ценные консультации члену-корреспонденту РАМН, профессору Ю. В. Дуднику, за постоянное внимание, ценные консультации и руководство кандидату биологических наук О. В. Ефременковой, за большую техническую помощь в работе научному сотруднику И. Г. Сумаруковой, лаборантам В. Ф. Васильевой и Н. Б. Жудиной; за плодотворное сотрудничество в изучении химической природы и выделении антибиотиков профессору Г. С. Катрухе, кандидатам биологических наук В. А. Зенковой, И. В. Толстых, В. В. Куляевой; за сотрудничество в изучении физиологии продуцентов кандидатам биологических наук О. В. Тихоновой и JI. М. Лурье, за помощь в идентификации видов и проведении цитологических исследований кандидату биологических наук О. В. Камзолкиной.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ*

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Ершова, Екатерина Юрьевна

ВЫВОДЫ

1. Создана коллекция культур базидиомицетов родов Coprinus и Laetiporus, насчитывающая 21 штамм, из них 16 штаммов выделены из природы в ходе данной работы и 5 штаммов получены из коллекций ВКМ, ВКПМ, ИНА. Все выделенные из природы штаммы обладали антимикробной активностью, кроме того, были активны 3 штамма, полученные из коллекций. Всего в отношении MRSA проявили активность 14 штаммов.

2. Разработан и внедрён в практику лаборатории метод очистки грибной культуры от бактериальной контаминации, названный методом мицелиального моста. Метод базируется на различии в характере роста бактериальных и грибных культур.

3. При глубинном культивировании 15 из 16 исследованных штаммов рода Coprinus проявляли антимикробную активность, 9 штаммов были активны в отношении MRSA, что характеризует данный род как перспективную группу предполагаемых продуцентов антибиотиков.

4. Установлено, что штамм Coprinus radiatus 2987 синтезирует 3 антибиотика, эффективных в отношении грамположительных бактерий. Из них в наибольшем количестве образуется лагоподин В, ранее не описанный у данного вида. МПК лагоподина В в отношении MRSA составляет 1 мкг/мл. Активность лагоподина В в отношении резистентных форм бактерий показана впервые.

5. Из культуральной жидкости штамма С. congregatus 2961-2 выделено 2 антимикробных вещества, активных в отношении грамположительных бактерий: антибиотик группы микомицинов - немотин А, ранее не описанный у рода Соргтих и антибиотик с молекулярной массой 364 а.е.м. МПК выделенных антимикробных веществ в отношении МКБА составляют, соответственно, 2 и 4 мкг/мл.

6. Изучена антимикробная активность 4 природных и одиного коллекционного штамма ЬаеНрогш зи1ркигеш. Из штамма Ь. хи1р}шгет 2990 выделено 3 вещества, подавляющих рост МЯЗА. Подобраны условия поверхностного культивирования Ь. 8и1рЬ.игеш с образованием плодовых тел.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Приведенные данные далеко не полностью освещают биосинтетические возможности базидиомицетов и посвящены одному из наиболее интенсивно развивающихся направлений в биотехнологии базидиомицетов - их использованию в качестве продуцентов антибиотиков. Подробнее рассмотрены представители родов Соргтш и Ьаейроги.у, которые исследуются в представленной диссертационной работе. В заключение следует отметить, что базидиомицеты всё шире используются в медицинской биотехнологии. На протяжении всей истории изучения базидиомицетов отношение к ним менялось и часто доходило до крайности: шляпочным грибам приписывали божественное происхождение, они служили частью ритуальных обрядов, некоторые из их считали панацеей от всех болезней; грибы называли изобретением дьявола и связывали с «нечистой силой». Современные тенденции развития микологии дают основание полагать, что впервые за всю историю своего существования эта группа организмов будет оценена по-настоящему.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Ершова, Екатерина Юрьевна, Москва

1. Белобородова Н.В., Богданов М.В., Черненькая Т.В. Алгоритмы антибиотикотерапии // Москва. 1999. Стр. 31, 61.

2. Бухало А. С. Высшие съедобные базидиомицеты в чистой культуре // Киев: Наукова думка. 1988. Стр 42-45.

3. Бродский А. К. Введение в проблемы биоразнообразия. Иллюстрированный справочник // СПб.: Издательство ДЕАН. 2002. Стр. 12, 14-18, 72-74, 80.

4. Великанов Л. Л., Гарибова Л. В., Горбунова Н. П., Горленко М. В. Под ред. М. В. Горленко. Курс низших растений // М.: Высшая школа, 1981. Стр. 367, 388-392, 405, 419, 461-468.

5. Гарибова Л. В., Сидорова И. И. Серия «Энциклопедия природы России» Грибы // М.: ABF, 1999. Стр. 148-149, 230-232.

6. Гаузе Г.Ф. Лекции по антибиотикам // М.: Медгиз. 1959. Стр. 5-32.

7. Глобальная стратегия ВОЗ по сдерживанию устойчивости к противомикробным препаратам. 2001.

8. Даниляк Н. И. Кинетика стабильности экзоклеточных целлюлаз у Laetiporus sulphureus (В. ex. Fr.) Bond et Sing., штамм B-6 // Микробиологический журнал. 1980.T. 42, № 6. Стр. 702707.

9. Денисова Н. П. Лечебные свойства грибов. Этномикологический очерк // СПб.: Изд. СПбГМУ, 1998. Стр 17, 23-24.

10. П.Дехнич А. В. Ванкомицинрезистентный Staphylococcus aureus новая опасность. Материалы сайта Antibiotic, ru. 1998.

11. Дудка И. А., Вассер С. П. Грибы. Справочник миколога и грибника // Киев: Наукова думка. 1987г. Стр. 153,271,386.

12. Дудник Ю.В. Перспективы создания препаратов, активных в отношении устойчивых форм бактерий // Антибиотики и химиотерапия. 1999. Т. 44, № 12. Стр. 15-18.

13. Дьяков Ю. Т. Введение в альгологию и микологию. Учебное пособие // М.: Изд-во МГУ. 2000. Стр. 100-105, 180-182.

14. Егоров А. М., Сазыкин Ю. О. Антимикробные агенты в будущем. Вклад геномики в их создание // Антибиотики и химиотерапия. 1999. Т. 44, №12. Стр 5-14.

15. Егоров Н.С. Основы учения об антибиотиках // М.: Изд-во МГУ.1994. Стр. 4-11.

16. Зерова М. Я., Елин Ю. Я., Коз'яков С. М. Гриби. Киев: Урожай, 1979. Стр. 74.

17. Каталог культур микроорганизмов. Под редакцией JI. В. Калакуцкого и М. В. Фатеева // Пущино-Москва. 1992. Стр. 123.

18. Красильников Н.А. Антагонизм микробов и антибиотические вещества // М.: Советская наука. 1958. Стр. 3-12, 320-330.

19. Лазарева Д. Н., Плечев В. В., Муртазин 3. Я. Актуальные проблемы антибиотикотерапии // Уфа: Изд-во БГМУ, «Башбиомед». 1997. Стр. 6-20.

20. Ланчини Д., Паренти Ф. Антибиотики. // М.: Мир. 1985. Стр. 9, 10, 89-91.

21. Лебедева Л.А. Определитель шляпочных грибов // М.- 1949 Л. Государственное издательство сельскохозяйственной литературы. Стр. 445-456.

22. Мюллер Э., Лёффлер В. Микология// М.: Мир. 1995. Стр. 131, 140.

23. Навашин С. М., Фомина И. П. Рациональная антибиотикотерапия // М.: Медицина. 1982. Стр. 318-333.

24. Низковская О.П. Противоопухолевые свойства высших базидиомицетов // Микология и фитопатология. J 983 № 3. Стр. 243-247.

25. Опредилитель грибов России. Под ред. М. А. Бондарцевой. Вып. 2. Порядок Афиллофоровые // Санкт-Петербург: Наука. 1998. Стр. 50-53.

26. Сидоренко С. В. Метициллинрезистентные стафиллококки // Антибиотики и химиотерапия. 1995.Т. 40, № 11/12. Стр. 57-68.

27. Сидоренко С. В. Происхождение, эволюция и клиническое значение антибиотикорезистентности//Антибиотики и химиотерапия. Т.44, №12, 1999. Стр. 19-23.

28. Страчунский Л. С., Белоусов Ю. Б., Козлов С. Н. Антибактериальная терапия. Практическое руководство // М.: Фарммединфо. 2000. Стр. 1-3, 7-11.

29. Страчунский Л. С., Богданович Т. М. Практическое руководство по антиинфекционной терапии. 2002г. (По материалам сайта antibiotic, ru).

30. Феофилова Е. П. Современные направления в изучении биологически активных веществ базидиальных грибов (Обзор) // Прикладная биохимия и микробиология. 1998. Т. 34, № 6. Стр. 597-608.

31. Шиврина А. Н., Низковская О. П., Фалина Н. Н., Маттинсон Н. Л., Ефименко О. М. Биосинтетическая деятельность высших грибов. Л.: Наука, 1969. Стр. 96-100.

32. Яковлев С. В. Тикарциллин / клавулановая кислота: возможности монотерапии тяжелых госпитальных инфекций // Инфекции и антимикробная терапия. №2, 1999. Стр. 21-31.

33. Akamatsu Y., Takahashi М., Shimada М. Production of oxalic acid by wood-rotting basidiomycetes grown on low and high nitrogenculture media // Mater. Org. 1994. V. 28, p.251-264.

34. Anke Т., Kupka J., Schramm G., Steglich W. Antibiotics from basidiomycetes. X. Scorodonin, a new antibacterial and antifungal metabolite from Marasmius scorodonius (Fr.) Fr. // Journal of antibiotics (Tokyo). 1980. V. 33 (5), p. 463-467.

35. Anke Т., Casser I., Steglich W., Pommer E. H. Antibiotics from basidiomycetes. 26. Phlebiakauranol aldehyde an antifungal and cytotoxic metabolite from Punctularia atropurpurascence // Journal of antibiotics (Tokyo). 1987. V. 40 (4), p. 443-449.

36. Anke Т. Basidiomycetes: A source for new bioactive secondary metabolites // Progress in industrial microbiology. 1989, V. 27, p. 51-66.

37. Anke T. The antifungal strobilurins and their possible ecological role // Canadian journal of botany. 1995. V. 73 (suppl. 1), p. 940-945.

38. Appleton R. E., Jan J. E., Kroeger P. D. Laetiporus sulphureus causing visual hallucinations and ataxia in a child // Canadian medical association journal. 1998.V 139 (1), p. 48-49.

39. Ayer W. A., Brown L. M. Terpenoid metabolites of mushrooms and related basidiomycetes // Tetrahedron. 1981. V. 37, p. 2199-2248.

40. Banic M. Т., Burdsall H. H. Incompatibility between Laetiporus cincinnatus and L. sulphureus in culture // Mycotaxon. 1999. V 70, p. 461-469.

41. Banic M. Т., Burdsall H. H. Incompatibility groups among North American populations of Laetiporus sulphureus sensu lato // Mycologia. 2000. 92(4), p. 649-655.

42. Bandoh K., Watanabe K., Muto Y., Tanaka Y., Kato N., Ueno K. Conjugal transfer of imipenem resistance in Bacteroides fragilis II The journal of antibiotics. 1992. Vol. 45 (4), p. 542-547.

43. Bauerle J., Anke Т., Jente R., Bosold F. Antibiotics from basidiomycetes. XVI. Antimicrobial and cytotoxic polyines from Mycena viridimarginata Karst. // Archives of microbiology. 1982. V. 132 (8), p. 194-196.

44. Belova N. V. Studies of biologically active metabolites from macromycetes in the V. L. Komarov botanical institute, Russian Academy of Sciences // International journal of medicinal mushrooms. 2001. V. 3., p. 117.

45. Berdy J. Recent development of antibiotic research and classification of antibiotics according to chemical structure // Advenced applied microbiology. 1974. V. 18, p. 309-406.

46. Berdy J. The discovery of new bioactive microbial metabolites: screening and identification // Progress in industrial microbiology. 1989. V. 27, p. 3-25.

47. Berdy J. Are actinomycetes exhausted as a source of secondary metabolites? // Биотехнология. 1995 г. №7-8. Стр. 13-34.

48. Bioactive Natural Products Database (BNPD)

49. Boyce J.M., Medeiros A.A. Clinical Isolates of MRSA from U.S. with subpopulations of Cells with Reduced Susceptibility to Vancomycin // 37th ISAAC, Toronto, Ontario, Canada. Sept. 28 -Oct. 1, 1997.

50. Bulakh E. M. Medicinal mushrooms of the Russian Far East in nature // International journal of medicinal mushrooms. 2001. Vol. 3, p. 125.

51. CABI Bioscience (hllp://\Y\v\v.intlexfungoriim.org). Материалы сайта. 2002.

52. Chambers H. F. Methicillin Resistance in Staphylococci: Molecular and Biochemical Basis and Clinical Implications // Clinical Microbiology Reviews. 1997. V 10 (4), p. 781-791.

53. Chu D., Plattner J., K.atz L. New Directions in Antibacterial Research // Journal of medicinal chemistry. 1996.V. 39 (20), p. 3854-3874.

54. Community Acquired MRSA: Pediatric Deaths and illnesses reported in the United States. // APUA Newsletter. 1999. V. 17 (3), p. 5.

55. Cuchural G. J., Malamy M. H., Tally F. P. P-lactamase-mediated imipenem resistance in Bacteroides fragilis // Antimicrobial agents and chemotherapy. 1986. V. 30 (5), p. 645-648.

56. Denisova N. P. Tradition of using medicinal mushrooms among the nations of the World // International journal of medicinal mushrooms. 2001. V. 3., p. 98.

57. Dighe S., Agate A. D. Antibacterial activity of an Indian isolate of Claudopus byssisedus (Pers.: Fr.) Fr. // International journal of medicinal mushrooms. 2001. V. 3, p. 134.

58. Erkel G., Anke T., Gimenes A., Steglich W. Antibiotics from basidiomycetes. XLI. Clavicoronicacid, a novel inhibitor of reverse transcriptases from Clavicorona pyxidata (Pers. ex Fr.) Doty // Journal of antibiotics (Tokyo). 1992. V. 45 (1), p. 29-37.

59. Erkel G., Lorenzen K., Anke T., Velten R., Gimenes A., Steglich W. Kuehneromycins A and B, two new biological active compounds from a Tasmanian Kuehneromyces sp. (Strophariaceae, Basidiomycetes) IIZ. naturforsch. 1995. V. 50 (1-2), p. 1-9.

60. Fisher B., Yawalkar N., Brander K. A., Pitchier W. J., Helbing A. Coprinus comatus (shaggy cap) is a potantial source of aeroallergen that may provouke atopic dermatitis // Journal of allergology and clinical immunology. 1999. V. 104 (4), p. 836-841.

61. Gadd G. M. Fungal production of citric and oxalic acid: importance in metal speciation, physiology and biogeochemical processes // Advences in microbial physiology. 1999. V. 41, p.47-92.

62. Garcia M. A., Alonso J., Fernandes M. I. At all. Lead content in edible wild mushrooms in northwest Spain as indicator of environmental contamination // Archives of enviromental contamination and toxicology. 1998. V. 34 (4), p.330-335.

63. Gavrilova L., Fomina V. Antibiotic action of cultivated basidiomycetes // International journal of medicinal mushrooms. 2001. V. 3, p. 145.

64. Georgopopadakou N. H. Penicillin-binding protein and bacterial resistance to p- lactams // Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 1993. V. 37 (1), p. 2045-2053

65. Han B.Y., Toyomasu T., Shinozawa T. Induction of apoptosis by Coprinus disseminatus mycelial culture broth extract in human cervical carcinoma cells // Cell Structural Function. 1999. V. 24, p. 209-215.

66. Hanson K. L., Crawford R. J., Lonergan G. T. Screening for antibacterial compounds from spent mushroom substrate // International journal of medicinal mushrooms. 2001. V. 3, p. 160.

67. Hatfield G.M., Schaumberg J.P. Isolation and structural studies of coprine, the disulfiram-like constituent of Coprinus atramentarius II Lloyd. 1975. V. 38, p. 489-496.

68. Helbling A., Gayer F., Pichler W. J. Mushroom (basidiomycete) allergy: diagnosis eastablished by skin test and nasal challenge // Journal of allergy and clinical immunology. 1998. V.102 (5), p. 853-858.

69. Huff T., Kuball H. G., Anke T. 7-Chloro-4, 6-dimethoxy-l(3H)-isobenzofuranone and basidaline: antibiotic secondary metabolites from Leucoagaricus carneifolia Gillet (basidiomycetes) corrected. // Z. naturforsch. 1994. V. 49 (7-8), p. 407-410.

70. Iinuma H., Nakamura H., Naganava H., Masuda T., Takano S., Takeuchi T., Umezava H., Iitaka Y., Obayashi A. Basidalin, a new antibiotic from basidiomycetes // Journal of antibiotics (Tokyo). 1983. V. 36 (4), p. 448-450.

71. Ishikawa N. К., Fukushi Y., Yamaji К., Tahara S., Takahashi К. Antimicrobial cuparane-type sesquiterpenes, enokipodins С and D, from a mycelial culture of Flammulina velutipes // Journal of natural products. 2001. V.64 (6), p. 932-934

72. Ito H., Arakawa Y., Ohsuka S., Washarotayakun R., Kato N., Ohta M. Plasmid-mediated dissementation of the metallo-P-lactamase gene blalMP among clinically isolated strains. // Antimicrobial agents and chemotherapy. 1995. V. 39 (4), p. 824-829.

73. Jaworski A., Kirschbaum J., Brockner H. Structures of trichovirines II, peptaibol antibiotics from the mold Trichoderma viride NRRL 5243 // Journal of peptaibol science. 1999. 5 (8), p. 341-351.

74. Johansson M., Sterner O., Labishinski H., Anke T. Coprinol, a new antibiotic cuparane from a Coprinus species // Z. Naturforsh. 2001.V. 56 (1-2), p. 31-34.

75. Kirk P. M., David J. C., Stalpers J. A. Ainsworth and Bisby's dictionary of the fungi. Сайт CAB International. 2001.

76. Konska G., Guillot J., Dusser M., Damez M., Botton В. Isolation and characterization of Nacetyllactoseamine-binding lectin from the mushroom Laetiporus sulphureus // Journal of biochemistry (Tokyo). 1994. V.116 (3), p. 519-523.

77. Korzybski T., Kowszyk-Gindifer Z., Kurilowicz W. Antibiotics. Origin, nature and properties // American Society for Microbiology. Washington, DC. 1978. V. Ill, p. 2037-2079.

78. Kozak K.R., Foster L.M., Ross I.K. Cloning and characterization of a G protein Alpha-subunitencoding gene from the basidiomycete, Coprinus congregatus // Gene. 1995. V. 163 (2), p. 133137.

79. Krasnopolskaya L. M., Belitsky I., Feodorova G., Katrucha G. Screening of strains of the genus Pleurotus (Fr.) Kumm. with a broad spectrum of antimicrobial activity // International journal of medicinal mushrooms. 2001. V. 3, p. 172.

80. Kues U. Life history and developmental processes in the basidiomycete Coprinus cinereus II Microbiology and Molecular Biology Reviews. 2000. V. 64 (4), p. 316-353.

81. Kupka J., Anke T., Mizumoto K., Giannetti B. M., Steglich W. Antibiotics from basidiomycetes. XVII. The effect of marasmic acid on nucleic acid metabolism // Journal of antibiotics. 1983. V. 362., p. 155-160.

82. Lancini G., Lorenzetti R. Biotechnology of Antibiotics and Other Bioactive Microbial Metabolites //New York: Plenum press. 1993. P. 3-10, 73-76, 89-95.

83. Lauer U., Anke T. Antibiotics from basidiomycetes. XXXVIII. 2-methoxy-5-methyl-l?4-benzoquinone, a tromboxane A2 receptor antagonist from Lentinus adhaerens // The journal of antibiotics. 1991. V. 44 (1), p 59-65.

84. Lauer U., Anke T., Sheldrick W. C., Scherer A., Steglich W. Antibiotics from basidiomycetes. XXXI. Aleurodiscal: an antifungal sesterterpenoid from Aleurodiscus mirabilis (Berk. & Curt.) Hohn //Journal of antibiotics. 1989. V. 42 (2), p. 875-882.

85. Lawson J. A., Harris J. W., Ballal S. K. Application of computer analysis of electrophoreticbanding patterns of enzymes to the taxonomy of certain wood-rotting fungi // Economic botany. 1975. V.29(2), p. 117-125.

86. Lee I.K., Jeong C.Y., Cho S.M., Yun B.S., Kim Y.S., Yu S.H., Koshino H., Yoo I.D. Illudins C2 u C3, new illudin C derivatives from Coprinus atramentarius ASI 20013 // The Jornal of antibiotics. 1996. V. 49 (6), p. 821-822.

87. Lee S. J., Yeo W. H., Yun B. S., Yoo I. D. Isolation and sequence analysis of new peptaibol, boletusin, from Boletus spp. // Journal of peptaibol science. 1999. V. 5 (8), p. 374-378.

88. Lee S. J., Yun B. S., Cho D. H., Yoo I. D. Tylopeptins A and B, new antibiotic peptides from Tylopilus neofelleus //Journal of antibiotics (Tokyo). 1999. V. 52 (9), p. 998-1006.

89. Lindberg P., Bergman R., Wickberg B. Isolation and structure of coprine, a novel physiologically active cycloprponone derivative from Coprinus atramentarius and its synthesis via 1-aminocyclopropanol // J. Chem. Commun. 1975. V.34 (3), p. 946-947.

90. Livermore D. M. Carbapenemases // Journal of antimicrobial chemotherapy. 1992.V. 29 (6), p.609-616.

91. Loewus F. A. Biosinthesis and metabolisme of ascorbic acid in plants and of analogs of ascorbic acid in fungi // Phytochemistry. 1999. V. 52 (2), p. 193-210.

92. Molitoris H. P. Mushroom in medicine // Folia microbiologica. 1994.Vol.39 (2), p. 91-98.

93. Molitoris H. P. Mushrooms and man in medicine, myth, and religion // International journal of medicinal mushrooms. 2001. V. 3, p.97.

94. Mulvey M. Jonson W., Louie L, Bryce E., McGeer A., Ofner-agostini M., Paton S., Simor A. Molecular characterization of Canadian MRSA isolates: identification of four epidemic strains // 39th ICAAC September 26-29, 1999, p. 160, abstract 1231.

95. Nenoff P., Friedrich T., Schwenke H. Rare fatal simultaneous mould infection of the lung caused by Aspergillus flavus and the basidiomycete Coprinus sp. in a leukemic patient // Journal of Medicinal and Veterinary Mycology. 1997. V.35 (1), p. 65-69.

96. Nilsson S., Persson O., Mossberg B. Fungi of Northern Europe 1 // Penguin books. 1978, p. 46-47.

97. Prutseva N. V., Belova N. V. Medical mushrooms in the Komarov botanical institute basidiomycetes cultural collection BIN (Russia) // International journal of medicinal mushrooms. 2001, V. 3, p. 203-204.

98. Rasmussen B. A., Bush K. Carbapenem-hydrolyzing P-lactamases // Antimicrobial agents and * chemotherapy. 1997.V. 41 (2), p. 223-232.

99. Roberts L. M„ Crawford R. J., Lonergan G. T. Extraction of bioactive compounds from the liquid culture of an Australian Ganoderma P. Karst. species using a range of polarity solvents // International journal of medicinal mushroom. 2001. V. 3, p. 212.

100. Rogers S. O., Holdenrieder O., Sieber T. N. Intraspecific comparisons of laetiporus sulphureus isolates from broadleaf and coniferous trees in Europe. 11 1999. Mycolog Res. V. 103(10), p. 1245-1251.

101. Sack U., Ginter T. Metabolism of PAH by fungi and correlation with extracellular enzymatic activities // Journal of basic microbiology. 1993.V. 33 (4), p. 269-277.

102. Sack U., Heinze T. M., Deck J., Cernilia C. E., Martens R., Zadrasil F., Fritsche W. Comparison of phenanthrene and pyrene degradation by different wood-decaying fungi // Applied and environmental microbiology. 1997.V.63 (10), p. 3919-3925.

103. Sasec V., Musilek V. Cultivation and antibiotic activity of mycorrhizal basidiomycetes // Folia microbiologica. 1966. V.12, p. 515-523.

104. Sasec V., Musilek V. Two antibiotic compounds from mycorrhizal basidiomycetes // Folia microbiologica. 1967. V.13, p. 43-45.

105. Shimada M., Akamtsu Y., Tokimatsu T., Mii K., Hattori T. Possible biochemical roles of oxalic acid as a low molecular weight compound involved in brown-rot and white-rot wood decays // Journal of biotechnology. 1997. V. 53, p. 103-115.

106. Sieradzki K., Villari P., Tomasz A. Decreased susceptibilities to teicoplanin and vancomycin among coagulase-negative methicillin-resistant clinical isolases of Staphylococci II Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 1998. V. 42 (1), p. 100-107.

107. Smania A, Junior S., Monache F. D. et al. Antimicrobial activity of basidiomycetes // International journal of medicinal mushrooms. 2001. Vol. (2-3), p. 87.

108. Srinivasan A., Dick J. D., Perl T. M. Vancomycin resistance in staphylococci// Clinical microbiology reviews. 2002.Vol. (3), p. 430-438.

109. Stadler M., Anke T., Dasenbrock J., Steglich W. Phellodonic acid, a new biologically active hirsutane from Phellodon melaleucus (Thelephoraceae, Basidiomycetes) //Z. Naturforsch. 1993. V. 48 (7-8), p. 545-549.

110. Stalpers J. A. Identification of wood-inhabiting fungi in pure culture // Studies in mycology. 1978. № 16 (4), p. 178-183,247.

111. Stamets P. Growing gourmet and medecinal mushrooms // Berkeley, Toronto: Ten speed press. 2000, p. 42-43, 102-103.

112. Stark A., Anke T., Mocek U., Steglich W., Kirfel A., Will G. Lentinellic acid, a biologically active protoilludane from Lentinellus species (.Basidiomycetes) II Z. Naturforsch. 1988. V. 43 (3-4), p. 177-183.

113. Takazawa H., Kashino S. Incarnal. A new antibacterial sesquiterpene from Basidiomycetes // Chemical pharmaceutical bull. 1991. V. 39 (5), p. 555-557.

114. Takeuchi T., Iinuma H., Iwanaga J., Takanashi S., Takita T., Umezawa H. Coriolin, a new basidiomycetes antibiotic // The journal of antibiotics. 1969. V. 22 (5), p. 215-217.

115. Veitch N.C., Gao Y., Welinder K.J. The Asp 245--> Asn mutant of Coprinus cinereusperoxidase // Biochemistry. 1996. V. 35, p. 14370-14380.

116. Verweij P. E., van Kasteren M., Van de Nes J., de Hoog G. S., De Pauw B. E., Meis J. F. Fatal pulmonary infection caused by the basidiomycete Hormographiella aspergillata // Journal of Clinical Microbiology. 1997. V. 35 (l),p. 2675-2678.

117. Vole J., Sedmera P., Musilek V. Glucose-2-oxidase activity and accumulation of D-arabino-2-hexosulose in cultures of the basidiomycete Oudemansiella mucida // Folia microbiology (Praha). 1978. V. 23 (4), p. 292-298.

118. Wasser S., Weis A. Medicinal properties of substances occurring in higher basidiomycetes mushrooms: current perspectives (review) // International jornal of medicinal mashrooms. 1999. V. l,p. 31-62.

119. Wielders C. L., Brisse C., Milatovic D. Schmits F. J., Verhoff J., Fluit A. C. Clonal spread of meticillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) and horizontal transfer of mec A DNA // 39th ICAAC September 26-29, 1999, p.185, abstract 1233.

120. Yosikawa K., Matsumoto K., Arihara S. New lanostanoid glycosides from the fruit body of Laetiporus versisporus // Journal of natural products 1999. 62 (4), p. 543-545.

121. Yosikawa K., Matsumoto K., Mine C., Bando S., Arihara S. Five lanostane triterpenoids and free saponins from the fruit body of Laetiporus versisporus // Chemical pharmaceutical bull (Tokyo). 2000. 48 (10), p. 1418-1421.

122. Yosikawa K., Bando S., Arihara S., Matsumura E., Katayama S. A benzofuran glycoside and an acetylenic acid from the fungus Laetiporus sulphureus var miniatus. Chemical pharmaceutical bull (Tokyo). 2001. 49(3), p. 327-329.

123. Zapf S., Anke T., Sterner O. Incrustoporin, A new antibiotic from Incrustoporia carneola (Bres.) Ryv. CBasidiomycetes) // Acta Chem. Scand. 1995. V 49 (3), p. 233-234.