Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

ТЕХНОЛОГИЯ ГЕНОТИПИРОВАНИЯ КАРТОФЕЛЯ И ЕГО ДИКОРАСТУЩИХ СОРОДИЧЕЙ НА ОСНОВЕ МИКРОСАТЕЛЛИТНОГО АНАЛИЗА

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "ТЕХНОЛОГИЯ ГЕНОТИПИРОВАНИЯ КАРТОФЕЛЯ И ЕГО ДИКОРАСТУЩИХ СОРОДИЧЕЙ НА ОСНОВЕ МИКРОСАТЕЛЛИТНОГО АНАЛИЗА"

На правах рукописи

ВЕЛИШАЕВА Назифе Серверовна

ТЕХНОЛОГИЯ ГЁНОТИПИРОВАНИЯ КАРТОФЕЛЯ И ЕГО ДИКОРАСТУЩИХ СОРОДИЧЕЙ НА ОСНОВЕ МИКРОСАТЕЛЛИТНОГО АНАЛИЗА

Специальность 03.00.23 — Биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 2006

Работа выполнена во Всероссийском научно-исследовательском институте сельскохозяйственной биотехнологии РАСХН (г. Москва).

Научный руководитель: ведущий научный сотрудник

кандидат химически* наук Шилов Илья Александрович

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Морозов Сергей Юрьевич

доктор химических наук, профессор Костров Сергей Викторович

Ведущая организация:

Всероссийский НИИ картофельного хозяйства им. А.Г. Лорха

Защита состоится 5 декабря 2006 г. в 11.00 на заседании диссертационного совета Д 006,027,01 при Всероссийском научно-исследовательском институте сельскохозяйственной биотехнологии по адресу: 127550, г. Москва, ул. Тимирязевская, д. 42; тел.: (495)976-65-44; факс: (495)977-09-47; e-mail: iab@iab,ac,ru

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Всероссийского научно-исследовательского института сельскохозяйственной биотехнологии РАСХН.

Автореферат разослан « w WcOJ^p 2006 г.

Ученый секретарь диссертационного совета Д 006.027.01 кандидат биологических наук

Меликова С. А.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность нрпЯлемм. Картофель является одной из важнейших сельскохозяйственных овощных культур, возделываемых практически во всех регионах РФ. Разнообразие зон возделывания к направлений использования культуры привело к необходимости создания сортов картофеля с различными хозяйственными и биологическими особенностями, такими, как устойчивость к болезням и вредителям, устойчивость к экстремальным условиям природной среды, высокие хозяйственные показатели н др. Современная селекция имеет существенные практические результаты, однако, требования, предъявляемые к современным сортам, постоянно возрастают в связи с периодическими вспышками болезней, постоянными экологическими изменениями в регионах, усиливающейся конкуренцией на рынке н т.п. В настоящее время в мировом сортименте картофеля насчитывается свыше S тыс. сортов. Практически ежегодно в России в Государственный Реестр селекционных достижений вносятся новые сорта. Для регистрации нового сорта по ряду основных сортоотличительных морфологических признаков, отражающих степень выраженности признаков отличимости, однородности и стабильности (Distinctness, Uniformity and Stability (DUS)) сортов, требуются длительные полевые испытания. В настоящее время представляется перспективным применение ДНК-технологий, с помощью которых станет возможным решение различных задач современной селекции, таких как подбор родительских форм для скрещивания, контроль интрогрессии генетического материала, паспортизация и сертификация сортов, создание «генетического паспорта» сельскохозяйственных растений, представляющего собой основу зашиты интеллектуальной собственности селекционеров.

В настоящее время одним нз главных методологических подходов в изучении генетического полиморфизма растений является применение молекулярных маркеров. Эти маркеры позволяют различать виды и подвиды растений, а также давать количественную характеристику их генетического и аллельного разнообразия. С введением молекулярных маркеров в практику биологических исследований появились новые возможности детального изучения структуры и организации генома растений, и количественной оценки степени сходства/различия на меж- и внутривидовом уровне. Для селекции растений особое значение имеет использование молекулярных маркеров для различения и идентификации сортов культурных растений, а также контроля за переносом генетического материала дикорастущих сородичей при отдаленных скрещиваниях.

Особый интерес представляют маркеры, получаемые с помощью полнмеразиой цепной реакции (ПЦР). Среди ПЦР-методов наиболее широко испольэутот метод анализа полиморфизма микросателлитных последовательностей.

Гнпервариабельность микроеател лнтн ы х последовательностей, высокая плотность и равномерность и* распределения по геному, кодоминантное наследование и простота и* обнаружения в автоматическом режиме делает микросател литы незаменимыми маркерами для исследования меж- н внутривидового разнообразия, генотип и рования и поиуляцио иного анализа растений, а также для построения подробных генетических карт,

К преимуществу метода микросателлитного анализа можно отнести возможность создания на его основе эффективной универсальной технологии, пригодной для контроля интрогрессии генетического материала при отдаленных скрещиваниях, для различения и идентификации источников, доноров, гибридов и сортов сельскохозяйственных растений. На момент начала наших исследований было известно достаточное количество микросателлитных локусов растений рода 5Ыапит, однако, их применимость для решения задач по различению и идентификации картофеля была мало изучена.

Таким образом, для решения сложных задач, таких как различение н идентификация растений на генетическом уровне, представляется актуальным разработка удобной в эксплуатации, относительно быстрой, высокопроизводительной и надежной технологии для генотипнрования картофеля на основе анализа полиморфизма мнкросателлитов.

Цель раВотм, Разработка технологии для генотипнрования картофеля и его дикорастущих сородичей на основе микросателлнтного анализа.

Для выполнения работы были поставлены следующие ЗАДАЧИ:

1. Исследовать возможность применения метода микросателлитного анализа для генотипнрования представителей рода БЫитап. Создать эффективную универсальную технологию для генотипнрования картофеля на основе анализа полиморфизма микросателлитов. Отобрать оптимальный набор праймеров к полиморфным микросателлитным л оку сам, являющихся перспективными для различения н идентификации растений рола 5о!апит,

2. Применить технологию микросателлитного анализа для генотипирования растений рода ВЫапит как на внутри- и межвидовом уровне, так и для генотипирования сортов картофеля отечественной н зарубежной селекции,

3. Применить технологию микросателлитного анализа для осуществления контроля интрогрессии генетического материала в гибриды/сорта при скрещивании родительских форм.

Научная новизна. В результате проведенных исследований нами были отобраны 20 пар праймеров к микросэтел-чктным локусам картофеля, являющихся перспективными для проведения работ по различению н идентификации видов и сортов картофеля. С применением технологии микросателлитного анализа были составлены генетические профили 85 образцов растений рода Solanum, 44 из которых являются сортами картофеля отечественной и зарубежкой селекции. 11а основе анализа первичных структур микросателлнтных локусов STM 1105 (растения: вид S. buibocastanum, сорт Ласунак и гибрид L 4-11; повторяющийся микросателлктиый мотне <АСТС)п), STM 2005 (растения: вид S. bulbocaslanum, сорт Ласунак и гибрид L4-II; повторяющийся микросателлитный мотив (CTGTTO)o) и STM 1057 (растения; вид tkmissum, сорта Early Rose. Arvoka, Скороплодный и гибрид 128-6; повторяющийся микросателлитный мотив (АДАТ),) была впервые продемонстрирована природа полиморфизма мнкросателлитных последовательностей растений рода Solanum, а также показана возможность контроля ингрогрессии генетического материала в гибрндыЛсорта при скрещивании родительских форм.

Практическая значимость работы. Показана перспективность применения техники микросателлитного анализа для исследования генетического разнообразия сельскохозяйственных культур, а также их идентификации, паспортизации и сертификации селекционного материала. Предлагаемая технология ДНК-анализа позволяет различать растительные геномы, осуществлять контроль интрогрессин генетического материала родительских форм в гибриды, а также осуществлять контроль сортовой чистоты растений. Продемонстрировано различение близкородственных сортов картофеля Альтаир и Аксамит, в селекции которых участвовали одни и те же родительские формы; различение сортов отечественной и зарубежной селекции (сорт Скороплодный и Wauseon); различение близкородственных генотипов - сортов Голубизна и Скороплодный, являющихся полусестринскимн сортами картофеля. На примере сорта Голубизна показано, что предлагаемая технология микросателлнткого анализа позволяет отслеживать и подтверждать сортовую подлинность экспертных образцов, сохраняемых и поддерживаемых в различных опытно-производственных хозяйствах.

Публикация по теме диссертационной работы. По материалам диссертации опубликовано 8 печатных работ. Основные результаты исследований были представлены на научной конференции «Постгеномная эра в биологии и проблемы биотехнологии» (Казань, 17-18 июня, 2004), III Международной научной конференции «биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии» (Москва, 19 октября. 2004), (II Московском международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 14-18 марта, 2005), а также на Всероссийской научно-практической конференции

молодых ученых и специалистов «Окружающая среда и здоровье» (Суздаль, 19 - 22 мая, 2005).

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы. Работа итожена на 152 страницах печатного текста, содержит 17 таблиц и 37 рисунков. Список литературы включает 142 источника,

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

t. Материалы и метопы исследования.

В работе использовали олигонуклеотиды, синтезированные в ЗАО «Синтол» (Россия); дНТФ фирмы «Медиген» (Россия); Tag ДНК-пол и меразу ThermoSlar, обеспечивающую «горячий старт» при проведении ПЦР, производства ВНИИ СБ (лаб. Молекулярной диагностики н генно-инженерных конструкций, зав. лаб, Лунин В.Г.), термосеквеназу фирмы Amersliam Biosciences (США), эндонуклеазы рестрикции Msp [, Eco RI Т4 ДНК-лигазу и соответствующие буферные растворы фирмы МБ! Fermentas (Литва).

Формы растений были предоставлены из Института картофелеводства HAH (Беларусь), Российского аграрного университета (ТСХА, Россия), Всероссийского НИИ картофельного хозяйства (Россия), Всероссийского НИН растениеводства им. H.H. Вавилова (Россия), ARS Potato Introduction Project, USDA (США), Center for Genetic Resources (CGR, Голландия). IPK Genbank Aussensteile Nord (CLKS. Германия) и International Potato Center (C1P, Перу).

Выделение геномной ДНК из растительного материала проводили по методике Т.С. Osborn, предполагающей лизис материала с помощью детергентов и органических агентов, а также с помощью метода выделения ДНК на силикагелевом сорбенте [Boom R, et al., 1990].

Для получения препаратов геномной ДНК в качестве растительного материала использовали световые ростки и молодые листья растений.

Полимеразную цепную реакцию проводили с помощью праймеров, представленных в Табл. 1. Реакции проводили в 30 мкл реакционной смеси, содержащей 50 - 100 нг ДНК, по 10 пмоль каждого из используемых локус-специфичных праймеров (один из праймеров был помечен флуоресцентным красителем Су 5), буфер для Га?ДНК-полнмеразы ThermoStar, содержащий 100мМ трис-HCI (pH 8,3), 25 мМ MgClj. 500 мМ KCl, 400мкМ каждого дезоксинуклеозидтрнфосфата и ) ел. термостабнльной ДНК-полимеразы. Активация термостабильной ДНК-поли меразы происходила в результате нагревания реакционной смеси перед проведением ПЦР до 95"С и экспозиции при данной температуре в течение 10-12 мин.

Полнмеразную цепную реакцию проводили при следующих температурных условиях; I цикл: 95°- 10 мин; 30 ш<«слов: 94°С-30сек, Т„„-30сек, 72"С - 30 сек; 1 цикл; 72°С-S мин. Температура отжига праймеров (Тощ) указана в Табл. I. Для амплификации использовали термоциклер «Mastercycler gradient» фирмы «Eppendorf» (Германия) и GeneAmp PCR System 2400 фирмы «Perkin Elmer» (США).

Анализ флуоресцентно-меченых ПЦР-фрагментов проводился методом электрофореза в денатурирующих условиях с помощью автоматического секвенатора ALFexpress It фирмы Amersham Biosciences (США). Полученные данные анализировали с помощью пакета прикладных программ ALFwin Software Fragment Analysis.

Клонирование »модифицированных фрагментов ДНК проводили в состав pGEM-T Easy вектора (Pronvega, США).

Секвенироваиие ДНК-матриц проводили по методу Сэнгера с использованием автоматического секвенатора ALFexpress II фирмы Amersham Biosciences (США).

Дтя множественного выравнивания нуклеотидных последовательностей использовали программы Clusta] W и GenDoc, для построения дендрограмм использовали пакет прикладных программ TREECON [Van tie Peer Y. et. at, 1994].

2. Исследование межвидовой н внутривидовой вариабельности представителей рола Solatium методом микросятеллнтного анализа.

В основе предлагаемого способа геиотнпнрования картофеля лежит метод микросателлитного анализа, неотъемлемой частью которого является полимеразная цепная реакция (ПЦР). При выборе праймеров для исследования полиморфизма микросателлитных локусов растений Soltmum учитывались следующие критерии:

— длина получаемых ПЦР-фрзгментов;

- количество выявляемых аллелей.

Различие длин аллелей микросателлитного локуса определяется числом повторяющихся единиц, представляющих собой ди-, три-, тетра-, пента- и гексануклеотиды, С помощью высокоразрешающего электрофореза в пол иакрилам идиом геле ПЦР-фрагменты, отличающиеся всего на несколько нуклеотидов, различаются надежнее, если они имеют не очень большую длину (не более 300 п.н.). Это обстоятельство учитывалось при первичном выборе и анализе праймеров.

Важным критерием при выборе праймеров являлось выявляемое ими количество аллелей микросателлитного локуса. На основании литературных данных [Milboume D. et al., 1998, AshkenaziV. et о/., 2001, McGregorC.E. et ai.t 2000] было проанализировано около

200 пар праймеров к микросателлитным локусам, после чего для генотипирова ния представителей рода Solatium нами были первоначально выбраны 30 пар праймеров,

С помощью метода микросателлитного анализа в работе было проанализировано 6 клубненосных видов Solatium (S. kitrfcianvm, S. slotoniferum, S. chacoense, S, bulbocastanum, S. demrssum и S. tuberosum) и один бесклубне вый вид (£. lycopersicoiJes). На рис, I представлены электрофореграммы разделения продуктов ГГЦР в 8 %-ном палиакркламндном геле, полученных с четырех пар праймеров (РОТ 47-48, STIIKA, STS 1-2 и STM 0031). выявляющих в сумме от 6 до 12 аллельных вариантов для исследуемых микросателлнтньтх локусов картофеля.

Рис, I. Электрофореграммы разделения продуктов ЛИР в в % -ном пол накрил л МИЛНОМ геле, полученных с праймеров РОТ 47-48 (А), 5Т11КА СБХ ЭТ5 1-2 (В> и БТМ 0031 (Г). В качестве матриц для ПЦР исполиовллн образиы ДНК растений 5.1у<-0[>ег^п-ой1<'5 (2), 5, китшпит Р1 472923 (3), X сЬасоеже Р1 133713 (4), 5. ьЫоШ/егит Р1 255532 (5), 5. Лет^ит Р[ 498012 (в), 5. ЫЬоеаттит 5Ък (7), 5, ГиЬега!ит 78363-76 (8). (Соответствующие дорожки электрофореграммы указаны в скобках). Дорожка I - маркер молекулярной массы.

Анализ представленных на рис. 1 данных показывает, что с помощью ряда праймеров к микросателлитным локусам картофеля можно получать уникальные для каждого образца ДНК-профили. В мелом, совокупный генетический профиль, полученный в результате анализа нескольких локусов, позволяет нам надежно различать клубненосные и неклубненосные формы ЗЫапит.

Далее мы исследовали уровень генетического полиморфизма внутри видов Бо!атт>. Для проведения анализа в нашем распоряжении были два североамериканских вида:

5. stotoniferum, S. Jamissum, и один южноамериканский вид S. chiicoense. На рис. 2 представлены генетические профили S - б представителей каждого вида, подученные с пар праймеров РОТ 81-82 и STM 0019. Как видно из представленных на рис. 2 электрофореграмм, внутри каждого локуса все три вида Solanum имеют свои уникальные микросателлитные профили, однако, отдельные растения каждого вида облазают низким уровнем полиморфизма, что может свидетельствовать о том, что внутри того или иного локуса разные виды Solanum проявляют различный уровень генетического разнообразия. Так, например, внутри локуса РОТ 81-82 (рис.2, А) все б растений S. stobnifemm имеют идентичный микросателлитный профиль; среди 5 растений S. dentissuni только S. ilemissiwt CGN 17805 (рис. 2, А, дорожка 17) имеет отличный от остальных растений ДНК-профиль; наибольший полиморфизм проявляют растения южноамериканского вида S. chacoense, среди которых 5 из 6 анализируемых генотипов имеют уникальные ДНК-профили; неразличимы только генотипы £ chacoense PI 189219 и 5. chacoense PI 133713 (рис.2. А, дорожки 8 и 9), Внутри локуса STMOOI9 (рис, 2, Б) формы S. slolonißrum проявляют больший (по сравнению с локусом РОТ 81-82) полиморфизм.

-fi я/ггм rtf SrtAiHMthd SiAmivwiii

Рис. 1, Элгктрофореграммы разделения продуктов ПЦР в 8 % -ком полнакрнламидном геле, полученных е праймеров РОТ 81-82 (А) и STM 0019 (Б). В качестве матриц для ПЦР использовали образцы ДНК растений S. siohníftnim PI 230490 (2), S. siolani/erum Pl 2J5Í32 (Э), £ stoloniferum CGN 18348 (4), S. sioloniferum CON 2J072 (5), 5, sloianifemm 513 (6), S. stoloni/erum 590 (7), S. cAacuerne Pl 189219 (8), S. chacoeme Pl 133713 (9), S. cbacoense Pt 472828 (10), S. chacoense Pl 472810 (111, S. i-huevease CGN 20583 (I2>, S. chacoense 135 (13). S.tkmissum Pl 161715 (14), 5L Jemissvm Pl 205514 (15), £ demissum Pl 498012 (161, S. Jemissum CGN 17805 (17), S. demisswm 253 (18K (Соответствующие дорожки электрофореграммы указаны в скобках). Дорожка 1 - маркер молекулярной массы.

В результате проведенного мнкросателлитного анализа мы получили уникальный для каждого вида набор дескрипторов, на основе которого может быть составлен индивидуальный «генетический паспорт».

Таблиц« t. Список рекомендуемых ираймеров для анализа микросателлнтов картофеля.

M Htm Циник flpiiMCp* ТТаслеммтельмкти лрЦнср«« s-r т№ •с Даша до длин ПЦР-фрягнент«*, 1LH. MOTH* Кмичепм 1.UK.RU

1 STUKA vT":^""'"..^,: ::A S- ГГСМСПТТЛССИСА'ГС 45 IOO.JJO IMW 12

î STSi-2 Г-^;7СТТСЛСЛССТС?СЛСГСДАЛС p-tcftccc ' ftctm^císaclwza » Wo-270 ÍIJKli »

J TOM 8-9 Г-ССЛТТСЛТТЬАЛСТТСАГГС-.'СС Р"^"'-'-ЛС" 56 Uli-IT« latit. s

4 POT4TJ* F-ЛАСЛТТЛСАЛСЛСЛ^ТЛССА В-АЛСТТЛТСГГЛАЛГГСТСС? 4! I5M7» (ISkläfl. ь

í РОТ «344 f-.o, :л:т Л'*'::,: « ItW-ÎOO dsL 6

á ET 1S-16 г-ЛАттсАтстттнгсе'глсстС S -ATCCÍ CAMGÍ ТСТпИАйАТГСЛ к 21ИЬ300 ("il. s

1 POTÍJ-J4 f-gcmucmíccctccatac л л г » л г ; с и IW.2JO 4

S POTJÍ-JS F-ГГСССТСЛАССАОССОТЛЛА r'intcfr^ttftäctwm: "~~с я юо-кп Hfl.

í roTsiJt; F-ATAAACCGCATUIICAACC 4S SO-IT« (BSWilWifl. s

10 Р-СГГССААСТТСТТАСТАССССС ?-Л^Т^ГГТТСТьЛССГССГС я lun.;w IttMul.

11 STM0UJ1 f-catacccacmaçctacac í -ттсллсггдтгйг^с1?« gtco » йьй» (KV. Ix У цех). ■

11 ЭТМ10И г-тасстстглссмтллстссс АССТЛАСОТССГГСГ-СС Sí líe-Sk) fïtab 3

I) STM10I6 Р-Т^СГСЛГГГСЛТОГЙТСГТГСС Э-л Г г-.-л S3 ÎMHW

14 STM IUI« F-TACATT^TATTA^TCCCMlCAAMA Й-СААСТАСС^ТТТССССАСЛГЛС: M 3IW-2SO t'Kl. 4

Ii STM0HI4 г-лл7асс^гассйастс?сллтс 7(W» »

It STH (■-тглтстггсссттыллтстл А- ААЛТГЛААТСГЛАГпЛСЛЛСС 4/ 100.150 («wtfc s

17 STMIIW7 S -ССТГГ СЛ7ССТАА?Л?ЛСС 41 1OU-20U (cgtnl t

1! етмиин f-tttaagt^ctctóttctccaggg Jí 130-200 <с!(0(». 3

lí S TM 201Î Г-тгсссааттлссс^стссс ft -mwaawicmrccfr.vc í} ISO-200 (IVUk 4

20 STM!!« г-аллсст^СТЛСЛЛАТЛАССС 12. NM» (■Kick »

Подобный «паспорт» можно представить как в графической форме в виде набора аллелей по всем локусам, представляющих своеобразный «штрих-код», так и в математической форме в виде матрицы. Для составления совокупного математического профиля («паспорта») генотипа каждый фрагмент ДНК с известной молекулярной массой принимают за дескриптор. Далее составляют матрицу, содержащую сведения о присутствии (1) или отсутствии (0) этих дескрипторов у всех исследованных генотипов для всех сочетаний праймеров. В конечном итоге получают общую таблицу, а которой показаны все дескрипторы, выявленные с помощью разных пар праймеров и расположенные в порядке убывания их молекулярной массы, В результате проведенных нами экспериментальных исследований были отобраны 20 пар праймеров (Табл. )), являющихся перспективными для идентификации растений рода Solanum.

В данной работе с использованием этих 20 пар праймеров было выявлено 126 дескрипторов генетического разнообразия растений рода Solanum, на основе которых были созданы матрицы межвидового, внутривидового и сортового разнообразия. Эти матрицы в дальнейшем использовали для определения генетических расстояний {GD) между генотипами по Nei и Li (1979), и впоследствии проводили кластерный анализ методом UPGMA (Unweighted Pair-Croup Method with an Arithmetic Average) [Sneath P.HA, et. at,, 1973], результатом которого являлись декдрограммы (пример одной из них приведен на рис. 3), отражающие филогенетические взаимоотношении анализируемых форм растений. Эти расчеты проводили с помощью пакета прикладных программ TREECON [Van de Реет Y. «(.ei., 1994].

Рис. 3. Дендрограмма генетического разнообразия представителей трех видов рола SOUNUM.

Таким образом, используя метод анализа микросателлитных последовательностей, можно определять уровень биоразнообразия внутри вида, в частности внутри видов Solanum. На основании проведенного анализа представителей трех видов Solanum: S, stoioniferum, Jemissum и S. chacoense, можно говорить о том, что наибольшее генетическое

разнообразие проявляют растения 5. сЬасоете, наименьшее — растения (¡етатт; также можно различать североамериканские (5. Ио1оп1/епт1, 5, <1ет~азит) и южноамериканские ($. сЬасоете) виды 5о!апит (рис. 3).

3. Исследование полиморфизма генома картофеля методом микросателлитного аналны.

В настоящее время картофель является одной из основных овощных сельскохозяйственных культур. Современная селекция картофеля основывается на применении межсортовой и межвидовой гибридизации. Эти методы позволили сочетать и комбинировать в новых сортах наиболее важные свойства родительских форм, планировать и прогнозировать заданные параметры. Современные сорта сочетают около 40 - 50 признаков (далее перечислены наиболее важные и значимые признаки), как то морфологические особенности гнезда и клубня (окраска кожуры, мякоти, глазков; число клубней е гнезде н масса клубня; длина столонов); урожайность (число и масса клубней в гнезде); качество (содержание крахмала, белка, витамина С, редуцирующих Сахаров, соланина, вкус, консистенция, развариваемость, пригодность к переработке); группа спелости (ранние, среднеранние. среднеспелые, среянепоздние, поздние); устойчивость к грибным и бактериальным болезням (рак, фитоальтернариоз. парша, чёрная ножка, кольцевая гниль и др.); устойчивость к вирусным болезням (скручивание листьев, крапчатость и др.); устойчивость к вредителям (картофельная и стеблевая нематоды, колорадский жук, картофельная моль и др.); устойчивость к жаре, засухе, переувлажнению, заморозкам; период покоя клубней (в зависимости от целей возделывания); сохранность (лёжкость) в период хранения; пригодность к механизированному уходу и уборке.

Для современного сельского хозяйства решающую роль играет выбор сорта. Благодаря правильно подобранным сортам для возделывания в той или иной местности возможно увеличение сбора продукции до 30-50%. Правильно подобранный сортимент позволяет увеличить не только урожай, но и улучшить качество продукция, растянуть сроки ее поступления, повысить выход готового продукта.

В нашей работе для исследования полиморфизма нетранслируемых последовательностей генома картофеля мы использовали сорта отечественной и зарубежной селекции. Технология анализа микросателлитных последовательностей генома картофеля позволяет различать сорта по ряду микросателлитных локусов, причем перечень этих локусов не универсален и варьирует в зависимости от характера и количества

*

Z J 4 5 í 7 I » II II II 13 Н 15 Ii 17 1« 19 I« II И В И 15 1« 17 2t » И

1*0 ах Я ■А ■ :' —j ■ ,

II В^М. ■ II II

1» пл.

100 ыи М

Рнс, 4. Электрофореграммы рямелсшм продуктов ПЦР е 8 % -ной полна крнламштом геле, полученных с пары праймеров STM 2005, В качестве матриц для ПЦР использовали обратды Д51К растений Скороплодный (2), Брянский ранний (3). Эффект (4), Голубизна (5), Ресурс (6), Никулинский (7), Белоснежка (8), Жуковский {щннкй (9), Atlantic ¡10), Ильинский (¡1), Луговской (12), Удача (13), Сннешет (14), ЛукшкшскийОЗ), Петербургский (16), Невский (17), Kamcraz (18), Смена-20 (19), Satuma (20), Desires (21), Romano (22). Katahdin (23). Russet Burbank (24), Kennebec (2Я Wauscon (26), Lady Rosetia (27), Maris Piper (28). Альтаир (29), Аксамит (30). (Соответствующие дорожки злектрофореграммы указаны в скобках). Дорожка 1 - маркер молекулярной массы.

1 1 3

» к Ii Ii 13 14 и и п и » lo м а м и я

1SÍU.

Рис.!. Электрофорс граммы разделения продуктов ПЦР в 8% -ном полнакриламкдном геле, полученных с пари принтеров РОТ 47-48. В качестве матриц для ПЦР использовали образцы ДНК растений Olev (2), Агрономический (3), Aquila(4), Jubel (J), Приекульскин ранний (6), Смема - 20 (7), Kameraz (8), Голубизна (9), Осень (10), 128-6 (II), Эффект (12), РаменскиЙ (13), Скороплодный (14), Anoka (15), Удача (16), Брянский ранний (17), Березка (18), Atlantic (19), Wauseon (20), Katahdin (21), Kennebec (22), Superior (13). Альтаир (24), Аксамит (25). (Соответствующие дорожки злектрофореграммы указаны в скобках). Дорожка 1 - маркер модакулярной пассы.

анализируемых генотипов. Внутри одного и того же локуса для определенной выборки генотипов можно получить мнкросателдитные профили, позволяющие различать либо всю панель исследуемых генотипоа, либо часть представленных образцов растений.

Таким образом, можно говорить о том, что выбор информативного локуса для генотнпирования образцов методом микросателлитного анализа во многом зависит от характера и представительности выборки генотипов для проведения подобного эксперимента. На рис. 4 представлены микросателлитные профили сортов картофеля, обнаруженные для локуса STM 2005. Как видно, внутри локуса STM 2005 (рис.4) можно наблюдать наличие 7 различных генетических профилей анализируемых сортов, среди которых 2 являются уникальными: сорт Никулинский и Kennebec (дорожки 7 и 25).

Специального внимания заслуживает задача генотипирования близкородственных ч

сортов картофеля методом анализа микросателлитных последовательностей. В качестве примера на рис. 5 приведен анализ генетических профилей ряда близкородственных сортов по до кусу ЮТ 47-48. Как видно из рис.5, практически все представленные генетические профили имеют сложный н схожий набор аллелей. Среди анализируемых образцов ДНК имеются 2 пары генотипов: сорт Голубизна (Гатчинский * 128-Й) и Осень (Granóla к 128-Й) (дорожки 9 и 10); сорт Скороплодный (J 28-6 х Anoka) и Удача (Vilnia * Anoka) (дорожки 14 и 16), в селекции которых участвовали родительские формы, среди которых одна была общая (генотипы выделены жирным шрифтом). Как видно из электрофореграмм генотипы сортов можно различать между собой внутри каждой полу сестринской пары.

Общность происхождения сортов можно также наблюдать между сортами отечественной и зарубежной селекции (рис. 6). Проведенный анализ микросателлитных профилей сортов Скороплодный (Россия) и Wauseon (Нидерланды), полученных с пары пранмеров STM 1057 (рис. 6, А), показывает, что сорт Скороплодный (дорожка 11) сочетает все аллели родительских форм Anoka (дорожка 9) и 128-6 (дорожка 10) (рис. 6, Л, аллели обозначены стрелками 1, 2, 3 и 4), а различие в генетических профилях сортов Скороплодный и Wauseon (дорожки II и 12, соответственно) обеспечивается присутствием'отсутствмем единственного аллеля (обозначен стрелкой 2), который является генетическим материалом S. demhsum (дорожка 7), Для определения характера происхождения аллелей необходимо в каждом конкретном случае устанавливать их первичную структуру; аллели 3 и 4 размером 103 п.и. и 107 п.н., соответственно (рис, 6, А) характерны для двух родоначальников: S. demissum и Early Rose, участвовавших в селекции сортов Wauseon (рис, 6, А, дорожка 12) и Скороплодный (рис. 6, Л, дорожка 11),

--з—;

—• Н--а

j

AiHnthim XSliSnuiaiv Иф.НУЯХ CnShJcr .

_ - A'-

JLSP.O^Mjj Л IhIHKJ _

EH«M X От*;? UtfUJJ^X Оил*ФГ'

3

Рис. S. Пример сопоставления генетического профиля образцов ДИК растений отечественной селекция, полученного на основе анализа микросателлитных последовательностей, с нх селекционной историей. Элехтрофрреграмма разделения продуктов ПЦР в В % -ном пол на крклами дном геле, полученная с пары праймеров STM 1057 (А). В качестве матриц для ПЦР использовали образцы ДНК растений $. Jemissum CON] 7Й05 (2), S. demhsum 375 (3), S. demtesum 253 (4), 5. demlsiiim PI 161715 (5), S. Jemissum PI 205514 (6), S. Jemissvm PI 49Я012 (7), Early Rose (8), Anoka (9), гибрпа 128-6(10), Скороплодный (II), Wauseon (12), Katahdin (13). Селекционная история (схема) сортов картофеля (Б) составлена на основании их родословных. (Соответствующие дорожки электрофореграммы указаны в скобках). Дорожка I - маркер молекулярной массы.

Полученные донные о первичной структуре микросателлитного локуса STM 1057, локализованного на VIII хромосоме [Milboume D. et. al, 1998), представлены на рис.7 и рис. 8; аллель размером 111 п.п. является генетическим материалом S, demi$stim\ аллель размером 115 п.н. - Early Rose (рис. 8). Полученные данные о первичных структурах аллелей родительских форм (гибрид 128-6 и сорт Anoka) и их гибрида (сорт Скороплодный) (рис. 7), свидетельствуют о кодомннантаом наследовании генетического материала родительских форм при скрещивании. Различия в молекулярной массе аллелей обеспечивается наличием разного количества повторяющихся единиц {АААТ)„ (рис. 7).

Еще более сложной, но крайне необходимой и важной задачей в селекции растений является различение н идентификация растений, полученных в результате скрещивания одних и тех же родительских форм, получивших статус сорта.

ллок»(103) : ttätatttcesttixaatstiltcacciggatftüctgattaciftgccttgccagtlctiaat ы

АПвк»(107) : TTATeTTTCW^aamliiratcaactccatagctgaiiactagccttoccagt-fgttwil 61

Anokk(llS) : ttat'wtcggttikaattrpatcagctcgatagctc-a'tlactagccttgccaottgitiai 61

$»tU«3) t matotttowttaaaatstatcagctgcatagctgattactaocgttgccagttgttaat il

scer(lot) ! ttktstitcggttaaaatctatcagctggatagctgattactagccttsccagttcttaai 61

soor (iii) : rr»tatrrce©rr*ajült«tjl'reac.ctsgatag;gtgattactagccttgccait*retiait 61

see* (us) : ttatirrrtcoartaaaatstatcagctggatagctüattac'ragccttgccagttcit'rmt 61

129-6 (103) ; ttltirrttoisrtaaajltetatcagctggatagctcattactagccttoccaittcittaai 61

12в-е<107): ttatortlosettaajlatsiatcagctggatagctgattagtagccttgccasttgrraat 41

128-6(111): ttatitttcggtmaaatatatcagctggatagctgattagtagcgtt&ccagttgrtmt il

12b-6 (iis) : ttaigtttcggwaaaatafatcaktggatagctgattactagccttgccagtrgttaai $1

Anok»(103)i gcta.tgratgaaataaataaat------------GGTTGTCTTCCATTTAATTT 103

Anok*(107); cctatgtatgmaтйаатааатааат--------GGTTGTCTTCCATTTAATTT 107

Anoka (iis) ; gctatgtatguaataaataaatajiataaat AAATttCTTSTgTTCCArTTAATTT 115

Snor(103) : gctatgtatgaaataaataaat------------ОСТКЛСТТССАТТТААТТГ 103

Scor(107) : gc tatgtatgaaatfta ataaataaat--------OOTTGTCITCCATTTAATTT 107

Scor(lll) ; gctatgtatgaj-ataa uta aatfj.ataaat----SSTTCTCTTOCATTTAATTT 111

scor|lls> : gctatgtatgaaataaataaataaataaataaat60ttstcttcc»ttttjlttt 115

lib-s(loi): gc tatgtatgaaataa ataaat------------оотнгтсггссаттталттт 103

li»-i(107); octatctatc адлтааатд алтааат--------OSTTGTCTTCCATTTAAITT 107

IIS-((111); gc tatgtatgaaataaataaataafttaaat----QJTTGTCTTCCATTTAArTT 111

Ppc, 7. Первичная структура аллелей ли«у-н STM 1057, лнтрогресснруемых из ролнтсльсгих форм Апока н гибрида ) 28-й в сорт скоронжижый (Scor) * гкАрид 128-4 * Anok» 103, 107, П1 н 115 - размер соответствующего аллсля, п м Повторяющийся мотив (АААТ»., подмокнут. Последовательности прайме ров отмечены жирным шрифтом.

s.deaf103) I rtatgtttc6ettaa»xkitatcaactggatftcctgattactagcettgccagttgttaat il

S.dan(107) : ttatiitttcggttjuurttotatcagctggatagctgättactagcc'rrgccagttgttaat 61

1.<1авц11) : rr*TUXrrOGerPAJUUlteTATCAGCTGGATAGCTGArTACTAGCCTT3CCAGTTGTTAAt 61

scor {103} ; ttai<5ttkgottil»*atgtatcagctbgatagctgattactagccttgccagrrgttaat 61

scox(loi) ; ttatctttomttjolaatglatcag'rrggatagctgattactagccttgccagrigttaat il

soot(111) : ttatstttcsgmaaaatgtatcagctüüatagctgattactagccttgccagttgttaat 61

soor (hi) ; ttatgtttcogttaaaatotatcagctggaiagctgattactagccttgccagttgttaat 61

e.r.(107) : ttatstwcostiaaaatctatcagctggatagctgattactflgccttgccagttgttaat 61

e.h. (iis) : ttatstttossttabaatgta'rcagctiggatagctgf.ttactagcc'rrgccagttgitaat 61

s.dh(l03): gc tatgtatgaaataaataaa.t------------ssttgtcttccatttaatttt 103

s.daK(1071 : gctfltgtatgaaataaataaataaftt--------g6t7gtcttccatttaattt 107

s.lw»(lll)i gctatgtmgaaataawaaataj.ataaat----свттетсттссатттаат*» 115

seor(103) : gctatgtatgaaataaataaat------------cottgtcttccatttaattt 103

seer (107) : gctatgtatgaaataaataaataaat--------sottgtcttccatttaattt 107

seer(lll) : gctatgtatc-aaataaataaataaataaat----(иттстсттссатттаатм 111

e.r. (107) : gctatgtatsaaataaataaataaat--------gcttgtcttccatttaattt 107

e,r. (115) ; gctatglatgaaataaataaataaataaataajitggtxstcttccatrmrrt hi

Рис, 8, Первичная структура аллелей локуеа STM 1057. Дикнй вил S, Jemiswm PI 498012 (S. dem); сорт-роаонвчапьиик Early Kose (E.R-); сорт Скороплодный (Seor). 103, 107, III н И5 - размер соответствующего адлеля, п.и. Повторяющийся мотив (АЛ.АТ), подчеркнут. Псследовагельиостц праймерав отмечены жнрным шрифтом.

Среди анализируемых нами растений имеются два сорта картофеля белорусской селекции, являющихся сестринскими линиями; сорт Аксамит (Добро * 77540-57) и Алътаир

(Добро * 77540-57)» Проведенные исследования показали, что генотипы сортов Аксамит и Альтаир по ряду локусов (Табл. 1) имеют различный набор аллелей» что позволяет различать два растения.

Таким образом* система генотипирования растений рода Solanum на осно&анни использования 20 пар праймеров (Табл. I), позволяет проводить различение известных генотипов между собой (включая близкородственные сорта). Было выявлено 126 дескрипторов генетического разнообразия представителей рода Solanum, на основе которых созданы так называемые «генетические паспорта» исследуемых генотипов картофеля. В рамках проведенной работы на основе «генетических паспортов» построены дендрограммы (пример одной из них приведен на рис* 9), характеризующие генетические расстояния между сортами картофеля н дикорастущими сородичами,

kutfthrfm Super tor fkrlH Л40ДИЫЙ '-»uwyjMriciiffr ранний twciuii*

КрямскиЯ ранний

PiMtHCKMH

ЛАокй

ДПШМ11ЧК1»1 й

Д<БШ4|С

«IvrOKKOi HfUMiA

Тукмсмчй рянйий ЙГН Piper _ ,.1ЬИНС|СИЙ

^•mao» „ tiieceewxt tubtw**r _ demLtmm

t&nlvmfervm üttrhteHUM

Рнс» 9* Де »программа генетического разнообразия представителей рода 5октит% построенная по результатам анализа полиморфизма микросателлитиых последовательностей.

Представленная дендрограмма (рис.9), выявляет связи между сортами, которые достаточно хорошо соотносятся с их селекционными историями (родословными).

Дальнейшая работа по совершенствованию метода анализа полиморфизма микросателлитных последовательностей позволит создать «генетические паспорта».

идентифицирующие генотипы. Прежде необходимо провести популяционное исследование, основанное иа ДНК-анализе значительного количества образцов растений определенной группы, как по количеству ДНК-образцов, так и по их разнообразию. Таким образом, для каждого микросатедлитного локуса на основе всех выявленных аллельных вариантов, будет составлена так называемая «алдельная лестница», отражающая весь набор аллельных вариантов для конкретного локуса с известной первичной структурой. Дальнейшая работа подразумевает проверку стабильности аллельных вариантов, содержащих микросателлитные последовательности для того или иного растения, после чего исследуемому образцу растения будет присвоен свой уникальный набор аллелей («генетический паспорта) по строго определенному списку микросателлитных локусов. Результатом столь масштабной работы станет возможность паспортизации новых сортов, сертификации семян и разнообразной продукции растениеводства.

4. Контроль ннтрогрессии генетического материала родительских форм в гнбрнды.

В настоящее время одним из основных методов селекции картофеля является межвидовая гибридизация, в частности, гибридизация с дикими видами картофеля. Однако передача полезных признаков от диких видов путем их непосредственного скрещивания с S. tuberusum осложняется по ряду причин, одной из которых является филогенетическая отдаленность видов, В целях преодоления межвидовой несовместимости, вызывающей отклонения от* нормального процесса формирования гибридных семян, прибегают к использованию метода сомаооиальной гибридизации. Дзя оценки эффективности передачи генетического материала при межвидовой гибридизации картофеля мы изучали растительный материал, любезно предоставленный Г. А, Яковлевой (Институт картофелеводства HAH, Беларусь), представляющий собой соматические гибриды и их семенное поколение, полученные при скрещивании S. bulboeastenum и S. tuberosum. Для установления природы иитрогрессируемых фрагментов ДИК от родительских форм в гибриды в работе использовали образцы ДНК растений 5. bulbocastanum, S. tuberosum (сорт Ласунак)и гибрида L4-11 (рис. 10).

Соответствующие аллели размером 96, 104, 114 п.н. (рис. 10, А) и аллели размером 154, 166 п.н. (рис.10. Б) клонировали в состав вектора pGEM-T Easy фирмы Promega (США).

Полученные данные о первичной структуре микросатедлитного локуса STM 1105, локализованного на VIII хромосоме, представлены на рис. 11 и в целом согласуются с результатами работы [Milboume D. et. ai., 1998), в которой бьша определена первичная структура фрагмента ДНК размером 114 п.н. у S. tuberosum, содержащего мотив (АСТС)ц.

Рис. 10. Элепрофореграммы разделения продуктов ПЦР в 8 % -ном полиакриламидиом геле, полученных с пранмеров ¿ТМ 1105 (А) и БТМ 2005 (Б). В качестве матриц для ПЦР использовали образцы ДНК растений £ ЬЫЬоса&Шпит (5Ы:; дорожка 2), Ь 4-11 (5Ьк х Ласунак; дорожка 3), 5. гиЬегааит (сорт Ласунак; дорожка 4). (Соответствующие родительские пары н/кли дорожки злектрофореграммы указаны в скобках). Дорожка 1 - маркер молекулярной массы. 96, 104, 114, 154. 166 - размер аллелей соответствующего локуса, п.н.

l»*.ll« AAACCTGCTACAAATAASaCAmCACCTCt тс attcttacactcacttactcactcactcactc : 64

l4-11.u4 >*acctgctacajult*asscaggcacctcctg>,ttcttacactcactcitctcactcactc>,ctc i h

l4-11.104 ааасстсстасаааталтесасссасстсстсаттст—с--------actcactcac tcactc t 54

lic.104 aa»octoctäc»**tluieociqgcacctcctcattct—с--------actc actctctcactc ; 54

sbk.si aaacctgctacjuuwaaogc----acctcctcattct—cac" actc----------------: 40

l4-11.96 aaacctgctacaaataaoqc----acctcctcattct--cac—actc---------------- : 40

li*.114 acacagctcaac-------aagtggtafct t tttac tcat ctcctccaattat tt ctg : 114

l4-11.114 acacagctcaac-------aagtggtaacttttactcatctcctccaattatttctc : 114

L4-11.104 acacagctcaac-------aastsotaactittactcatctcctccaattaittctg : 104

las.104 acacacctcaac-------aagtggtaacttttactcatctcctccjattatttcte : 104

sblt.m acacagctcaac actcaacaagtggtaacttttac-catctcctccaattatttctg : 96

w-11.s6 асасайстсаасастсалсаазтсстаасттттас-сатстсстссааттагттсто : 9«

II, Первичная структура шыслей локуса STM 1105 и(5трофессируечых нз ролнтсльскик форм S, huthocesiamtm (Sbk) ч & tuberosum (сорт Ласунак, L*s) в соматический гибрид Sbk * Ласунак (L4-1 !>. 96, 104, 114 - размер соответствующего аллела, п.и. Повторяющийся мотив (ЛСТС'К, поэчеркнут. Последовательности лраймеров отмечены жирным и>р»фтом.

Проведенный анализ первичных структур аллелей локуса STM 1105 позволяет говорить о полиморфизме микросателлитных последовательностей, основанном не только на различии в количестве тандемных повторов, но и на вариабельности областей, прилегающих к микросателлитным повторам.

Сведения о первичной структуре микросателлитного локуса STM 2005, локализованного на XI хромосоме, представлены на рнс, 12 и согласуются с результатами работы (Müboume D. ei. а!., 1998] с той только разницей, что в определенной нами первичной структуре фрагмента ДНК размером 166 п.н. у S. tuberosum содержится мотив

(CTGTTG)j вместо опубликованных авторами данных о наличии во фрагменте ДНК размером 166 л.н. мотива (CTGTTG)j.

40

TTI**(iTraC*liTTCTQCA«^XCTXCTK:ftTAtiAC»TflTftTTTCTGTOTAAACOACGWTR : 6« tttjulgttctcagttctecagea^gtacttcatataacatatatttctgtgtaaacgacgaaata : 66 tttaagractcjwittctocagggaagtacrtcatataactratatttctgtgtagacgacgfcftata : 66 tttaaottctcaottctocagggaagtacttcatataacttatatttctgtgtagacgacgaaata f 66

107

aacm tgc гссгсггзстзттсстсотос tgrroctggtgctgctaaaagsgsactatcgtgccaa ; 132 aacaatgctgctcttoctg ttgc tootgctgttgcrggtgctgctaagagoggactatcg'toccaa : 132

aacaatgc tgctc ttoc tgttgct3gt3------------ttgctaagaggfjgactatcgtoccaa: 120

aacaatcctgctgttgctcttgctggtg------------ttoctaasaggggactatcgtgccaa; 120

lU.KS l4-11.x« Sbk.151 n-il.lSi

lu.l« M-U.IM &bk.ls4 u-u.1s)

1**, ki tgtagccgaaocc*gca*twta*asettaiem;: us

ы-ll.iet tgtagccgaacccagcjulto«taaaggtt»tg*c: iee

sbk.lh tgtagccoaacccascaatggtaaasgttatgac: 151

4-11,1s< tqtaqccgaacccaoclultgotaaaggtiateac; 1m

Рис. II, Первична« структура ».мелей покуда STM 2005 интротресгирусмы* из ролитсльских фчрн bu/bocaslunum (Sbk> и X тЬетхит (сорт Дасунак, L«) в соматический тибрил Sbk * Дасунак (l4-11) 154, 166 - размер соответствующего аллелл, л.н. Повторяющийся мотив tCTGTTG), подчеркнут. Последовательности праймеров н нуклеотады в позициях 4JX 107 отмечены жн[>нмм шрифтом.

Анализ первичных структур микросателлитных повторов локуса STM 2005 позволяет объяснять полиморфизм длин аллелей только лишь различием в количестве повторяющихся гексануклеотидных единиц (CTGTTG). Интересно отметить, что по этим двум микросателлитным локусам обе родительские формы относительно друг друга имеют уникальные первичные структуры: нуклеотндные последовательности AGGC...TA...T (S. tuberosum) и АСТСЛАС (S, bulboi-ustanum), образующие соответствующие инсерции/делецин в первичных структурах аллелей гибрида L 4-11 (рис. 11) или точечные нуклеотндные замены в позициях 40 н 107 (рис. 12), которые отчетливо наследуются гибридом L4-11.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Проведенные нами экспериментальные исследования позволили создать эффективную универсальную технологию для генотип и рования картофеля и его дикорастущих сородичей. Применение техники микросатеалитного анализа: оптимизированный способ выделения растительной ДНК; применение современных подходов к проведению ПЦР (использование термостабильных ферментов, обеспечивающих проведение «горячего старта» ПЦР); применение метода высокоразрешающего электрофореза в денатурирующих условиях, исключающего возникновения артефактов в

ПНР, позволяет различать растительные геномы, включая близкородственные, а также осуществлять контроль интрогрессии генетического материала от родительских форм в гибриды/сорта; сравнение генетических «отпечатков пальцев» контрольных образцов с генетическими «отпечатками пальцев» экспертных образцов позволяет отслеживать и подтверждать сортовую подлинность последних. Предлагаемая в нашей работе технология анализа микросателлитов позволит в будущем приблизиться к внедрению методов контроля продуктов растениеводства; к введению в действие автоматизированной информационной системы, обеспечивающей быстрый сбор, обработку, хранение и использование данных о генетических ресурсах («генетический паспорт» растения).

По материалам работы составлены и опубликованы методические рекомендации для специалистов-биотехнологов, сельскохозяйственных биотехнологических и селекционных центров, научно-исследовательских институтов.

ВЫВОДЫ

1, Разработана эффективная универсальная технология генотипирования представителен рода Solanum. По результатам исследования 85 генотипов картофеля и его дикорастущих сородичей предложен о!ггимальный набор праймеров (20 пар праймеров), с помощью которого возможно различать и идентифицировать растения рода Solanum,

2, С помощью разработанной технологии проведено межвидовое и внутривидовое различение растений рода Solanum, Проведено генотипирование 44 сортов картофеля отечественной н зарубежной селекции. На основе анализа генотипов показана возможность различия близкородственных сортов картофеля Альтаир и Аксамит, в селекции которых участвовали одни и те же родительские формы.

3, Впервые показано, что предлагаемая технология микросателдитного анализа позволяет осуществлять контроль интрогрессии генетического материала родительских форм в гибриды/сорта. На основе экспериментального анализа первичных структур ряда микросателлитных локусов показана возможность контроля интрогрессии генетического материала дикого вида 5. bulbocastanum и сорта Ласунак в гибрид L 4-11, а также интрогрессии генетического материала родительских форм, участвовавших в селекции сорта Скороплодный.

4, С помощью разработанной технологии микросателлнтного анализа проведено подтверждение сортовой подлинности экспертных образцов картофеля сорта Голубизна, полученных из различных опытно-производственных хозяйств.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Бирюкова В.А., релишаева Н.С.. Зайцев B.C., Хавкин Э.Е., Хромова JI.M., Шилов H.A. ДНК - дакснлоскопия картофеля и его дикорастущих сородичей. // Вопросы картофелеводства. Материалы «Школы молодых ученых». Всерос, НИИ картофельного хозяйства. - М., 2004, С, 114-123.

2, Анискина Ю.В., Бирюкова В.А., Велишаера U.C.. Мартынов В В., Панкин A.A., Прибылова Т.А., Хавкнн Э.Е., Шилов H.A. ДНК - генотипирование растений Brassica и Solanum. И III Международная научная конференция «Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии». Тезисы докладов, Москва. 19 октября 2004 г. С. 119-120.

У. Анискина Ю.В., Бирюкова В.А., Велишаева Н.С.. Панкин A.A., Прибылова Т.Д., Хавкин Э.Е,, Шилов H.A. ДНК - тенотипирование растений родов Brassica н Solanum, //Сельскохозяйственная биология. 2005 г. №1. С. 110-119.

4. Анискина Ю.В., Велишаева hf.Çv Шилов H.A., Хавкин Э.Е. Тенотипирование пасленовых и крестоцветных растений методом мнкросагтеллитного анализа, // Методические рекомендации, ВН11ИСБ. Москва. 2005 г. 21 С.

5. Бекетова М.П., Бирюкова В .А., Велишаева U.C.. Дробязина П.Е,, Зайцев B.C., Хавкин Э.Е., Шилов H.A., Яковлева Г.А. ДНК маркеры интрогресснн устойчивости к фнтофторозу картофгля. // III Московский международный конгресс. Биотехнология: состояние и перспективы развития, Москва. 14-1S марта 2005 г. С. 227,

6. Велишаева Н С,. Бирюкова В.А., Яковлева Г.А., Хавкин Э.Е. Применение метода микросателлнтного анализа для ДНК-генотипирования картофеля и его дикорастущих сородичей. И Материалы Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых и специалистов «Окружающая среда и здоровье». Суздаль. 19 - 22 мая 2005 г. С, 333.

7. Велишаева Н.С.. Шилов H.A., Хавкнн Э.Е. Использование технологии микросатедлитного анализа для различения сортов картофеля и его дикорастущих сородичей. // Вопросы картофелеводства. Актуальные проблемы науки и техники. Научные труды. Всерос. НИН картофельного хозяйства. • М., 2006. С. 22S-235.

8. Велишаева Н.С.. Хавкин Э.Е., Шилов Н А. Генотипирование картофеля н его дикорастущих сородичей методом полиморфизма микросателлитов. // Доклады РАСХН. 2006 г. № 5. С. 3 - 5.