Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Технология генотипирования картофеля и его дикорастущих сородичей на основе микросателлитного анализа

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Технология генотипирования картофеля и его дикорастущих сородичей на основе микросателлитного анализа"

На правах рукописи

ВЕЛИШАЕВА Назифе Серверовна

ТЕХНОЛОГИЯ ГЕНОТИПИРОВАНИЯ КАРТОФЕЛЯ И ЕГО ДИКОРАСТУЩИХ СОРОДИЧЕЙ НА ОСНОВЕ МИКРОСАТЕЛЛИТНОГО АНАЛИЗА

Специальность 03.00.23 — Биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 2006

Работа выполнена во Всероссийском научно-исследовательском институте сельскохозяйственной биотехнологии РАСХН (г. Москва).

Научный руководитель: ведущий научный сотрудник

кандидат химических наук тхт „ .

J Шилов Илья Александрович

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Морозов Сергей Юрьевич

доктор химических наук, профессор Костров Сергей Викторович

Ведущая организация:

Всероссийский НИИ картофельного хозяйства им. А.Г. Лорха

Защита состоится 5 декабря 2006 г. в 11.00 на заседании диссертационного совета Д 006.027.01 при Всероссийском научно-исследовательском институте сельскохозяйственной биотехнологии по адресу: 127550, г. Москва, ул. Тимирязевская, д. 42; тел.: (495) 976-65-44; факс: (495) 977-09-47; e-mail: iab@iab.ac.ru

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Всероссийского научно-исследовательского института сельскохозяйственной биотехнологии РАСХН.

Автореферат разослан « О!» 1 рЛ 2006 г.

Ученый секретарь диссертационного совета Д 006.027.01 кандидат биологических наук

Мёликова С.А.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Картофель является одной из важнейших сельскохозяйственных овощных культур, возделываемых практически во всех регионах РФ. Разнообразие зон возделывания и направлений использования культуры привело к необходимости создания сортов картофеля с различными хозяйственными и биологическими особенностями, такими, как устойчивость к болезням и вредителям, устойчивость к экстремальным условиям природной среды, высокие хозяйственные показатели и др. Современная селекция имеет существенные практические результаты, однако, требования, предъявляемые к современным сортам, постоянно возрастают в связи с периодическими вспышками болезней, постоянными экологическими' изменениями в регионах, усиливающейся конкуренцией на рынке и т.п. В настоящее время в мировом сортименте картофеля насчитывается свыше 3 тыс. сортов. Практически ежегодно в России в Государственный Реестр селекционных достижений вносятся новые сорта. Для регистрации нового сорта по ряду основных сортоотличительных морфологических признаков, отражающих степень выраженности признаков отличимости, однородности и стабильности (Distinctness, Uniformity and Stability (DUS)) сортов, требуются длительные полевые испытания. В настоящее время представляется перспективным применение ДНК-технологий, с помощью которых станет возможным решение различных задач современной селекции, таких как подбор родительских форм для скрещивания, контроль интрогрессии генетического материала, паспортизация и сертификация сортов, создание «генетического паспорта» сельскохозяйственных растений, представляющего собой основу защиты интеллектуальной собственности селекционеров.

В настоящее время одним из главных методологических подходов в изучении генетического полиморфизма растений является применение молекулярных маркеров. Эти маркеры позволяют различать виды и подвиды растений, а также давать количественную характеристику их генетического и аллельного разнообразия. С введением молекулярных маркеров в практику биологических исследований появились новые возможности детального изучения структуры и организации генома растений, и количественной оценки степени сходства/различия на меж- и внутривидовом уровне. Для селекции растений особое значение имеет использование молекулярных маркеров для различения и идентификации сортов культурных растений, а также контроля за переносом генетического материала дикорастущих сородичей при отдаленных скрещиваниях.

Особый интерес представляют маркеры, получаемые с помощью полимеразной цеппой реакции (ПЦР). Среди ПЦР-методов наиболее широко используют метод анализа полиморфизма микросателлитных последовательностей.

Гипсрвариабельность микросателлитных последовательностей, высокая плотность и равномерность их распределения по геному, кодоминантное наследование и простота их обнаружения в автоматическом режиме делает микросателлиты незаменимыми маркерами для исследования меж- и внутривидового разнообразия, генотипирования и популяционного анализа растений, а также для построения подробных генетических карт.

К преимуществу метода микросателлитного анализа можно отнести возможность создания на его основе эффективной универсальной технологии, пригодной для контроля интрогрессии генетического материала при отдаленных скрещиваниях, для различения и идентификации источников, доноров, гибридов и сортов сельскохозяйственных растений. На момент начала наших исследований было известно достаточное количество микросателлитных локусов растений рода Solanum, однако, их применимость для решения задач по различению и идентификации картофеля была мало изучена.

Таким образом, для решения сложных задач, таких как различение и идентификация растений на генетическом уровне, представляется актуальным разработка удобной в эксплуатации, относительно быстрой, высокопроизводительной и надежной технологии для генотипирования картофеля на основе анализа полиморфизма микросателлитов.

Цель работы. Разработка технологии для генотипирования картофеля и его дикорастущих сородичей на основе микросателлитного анализа.

Для выполнения работы были поставлены следующие ЗАДАЧИ:

1. Исследовать возможность применения метода микросателлитного анализа для генотипирования представителей рода Solanum. Создать эффективную универсальную технологию для генотипирования картофеля на основе анализа полиморфизма микросателлитов. Отобрать оптимальный набор праймеров к полиморфным микросателлитным локусам, являющихся перспективными для различения и идентификации растений рода Solanum.

2. Применить технологию микросателлитного анализа для генотипирования растений рода Solanum как на внутри- и межвидовом уровне, так и для генотипирования сортов картофеля отечественной и зарубежной селекции.

3. Применить технологию микросателлитного анализа для осуществления контроля интрогрессии генетического материала в гибриды/сорта при скрещивании родительских форм.

Научная новизна. В результате проведенных исследований нами были отобраны 20 пар праймеров к микросателлитным локусам картофеля, являющихся перспективными для проведения работ по различению и идентификации видов и сортов картофеля. С применением технологии микросателлитного анализа были составлены генетические профили 85 образцов растений рода Solanum, 44 из которых являются сортами картофеля отечественной и зарубежной селекции. На основе анализа первичных структур микросателлитных локусов STM1105 (растения: вид S. bulbocastanum, сорт.Ласунак и гибрид L 4-11; повторяющийся микросателлитный мотив (АСТС)„), STM 2005 (растения: вид S. bulbocastanum, сорт Ласунак и гибрид L 4-11; повторяющийся микросателлитный мотив (CTGTTG)„) и STM 1057 (растения: вид S. demissum, сорта Early Rose, Anoka, Скороплодный и гибрид 128-6; повторяющийся микросателлитный мотив (АААТ)„) была впервые продемонстрирована природа полиморфизма микросателлитных последовательностей растений рода Solanum, а также показана возможность контроля интрогрессии генетического материала в гибриды/сорта при скрещивании родительских форм.

Практическая значимость работы. Показана перспективность применения техники микросателлитного анализа для исследования генетического разнообразия сельскохозяйственных культур, а также их идентификации, паспортизации и сертификации селекционного материала. Предлагаемая технология ДНК-анализа позволяет различать растительные геномы, осуществлять контроль интрогрессии генетического материала родительских форм в гибриды, а также осуществлять контроль сортовой чистоты растений. Продемонстрировано различение близкородственных сортов картофеля Альтаир и Аксамит, в селекции которых участвовали одни и те же родительские формы; различение сортов отечественной и зарубежной селекции (сорт Скороплодный и Wauseon); различение близкородственных генотипов — сортов Голубизна и Скороплодный, являющихся полусестринскими сортами картофеля. На примере сорта Голубизна показано, что предлагаемая технология микросателлитного анализа позволяет отслеживать и подтверждать сортовую подлинность экспертных образцов, сохраняемых и поддерживаемых в различных опытно-производственных хозяйствах.

Публикации по теме диссертационной работы. По материалам диссертации опубликовано 8 печатных работ. Основные результаты исследований были представлены на научной конференции «Постгеномная эра в биологии и проблемы биотехнологии» (Казань, 17-18 июня, 2004), III Международной научной конференции «Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии» (Москва, 19 октября, 2004), III Московском международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 14-18 марта, 2005), а также на Всероссийской научно-практической конференции

молодых ученых и специалистов «Окружающая среда и здоровье» (Суздаль, 19 - 22 мая, 2005).

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 152 страницах печатного текста, содержит 17 таблиц и 37 рисунков. Список литературы включает 142 источника.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. Материалы и методы исследования,

В работе использовали олигонуклеотиды, синтезированные в ЗАО «Синтол» (Россия); дНТФ фирмы «Медиген» (Россия); Tag ДНК-полимеразу ThermoStar, обеспечивающую «горячий старт» при проведении ПЦР, производства ВНИИ СБ (лаб. Молекулярной диагностики и генно-инженерных конструкций, зав. лаб. Лунин В.Г.), термосеквеназу фирмы Amersham Biosciences (США), эндонуклеазы рестрикции Msp I, Eco RI, Т4 ДНК-лигазу и соответствующие буферные растворы фирмы MBI Fermentas (Литва).

Формы растений были предоставлены из Института картофелеводства НАН (Беларусь), Российского аграрного университета (ТСХА, Россия), Всероссийского ШШ картофельного хозяйства (Россия), Всероссийского НИИ растениеводства им. И.И. Вавилова (Россия), ARS Potato Introduction Project, USDA (США), Center for Genetic Resources (CGR, Голландия), IPK Genbank Aussenstelle Nord (CLK.S, Германия) и International Potato Center (CIP, Перу).

Выделение геномной ДНК из растительного материала проводили по методике Т.С. Osborn, предполагающей лизис материала с помощью детергентов и органических агентов, а также с помощью метода выделения ДНК на силикагелевом сорбенте [Boom R. et aL 1990].

Для получения препаратов геномной ДНК в качестве растительного материала использовали световые ростки и молодые листья растений.

Полимеразную цепную реакцию проводили с помощью праймеров, представленных в Табл. 1. Реакции проводили в ЗОмкл реакционной смеси, содержащей 50- 100 нг ДНК, по 10 пмоль каждого из используемых локус-специфичных праймеров (один из праймеров был помечен флуоресцентным красителем Су 5), буфер для Taq ДНК-полимеразы ThermoStar, содержащий ЮОмМ трис-HCl (рН 8,3), 25 мМ MgCl2, 500 мМ КС1, 400 мкМ каждого дезоксинуклеозидтрифосфата и 1 ед. термостабильной ДНК-полимеразы. Активация термостабильной ДНК-полимеразы происходила в результате нагревания реакционной смеси перед проведением ПЦР до 95°С и экспозиции при данной температуре в течение 10-12 мин.

Полимеразную цепную реакцию проводили при следующих температурных условиях: 1 цикл: 95°-10 мин; 30 циклов: 94°С - 30 сек, То™-30сек, 72°С-30сек; 1 цикл: 72°С-5 мин. Температура отжига праймеров (ТОТж) указана в Табл. 1. Для амплификации использовали термоциклер «Mastercycler gradient» фирмы «Eppendorf» (Германия) и GcncAmp PCR System 2400 фирмы «Perkin Elmer» (США).

Анализ флуоресцентно-меченых ПЦР-фрагментов проводился методом электрофореза в денатурирующих условиях с помощью автоматического секвенатора ALFexpress II фирмы Amersham Biosciences (США). Полученные данные анализировали с помощью пакета прикладных программ ALFwin Software Fragment Analysis.

Клонирование амплифицированных фрагментов ДНК проводили в состав pGEM-T Easy вектора (Promega, США).

Секвенирование ДНК-матриц проводили по методу Сэнгера с использованием автоматического секвенатора ALFexpress II фирмы Amersham Biosciences (США).

Для множественного выравнивания нуклеотидных последовательностей использовали программы Clustal W и GenDoc, для построения дендрограмм использовали пакет прикладных программ TREECON [Van de Peer Y. et. al., 1994].

2. Исследование межвидовой и внутривидовой вариабельности представителей рода Solanum методом микросателлитного анализа.

В основе предлагаемого способа генотипирования картофеля лежит метод микросателлитного анализа, неотъемлемой частью которого является полимеразная цепная реакция (ПЦР). При выборе праймеров для исследования полиморфизма микросателлитных локусов растений Solanum учитывались следующие критерии:

- длина получаемых ПЦР-фрагментов;

— количество выявляемых аллелей.

Различие длин аллелей микросателлитного локуса определяется числом повторяющихся единиц, представляющих собой ди-, три-, тетра-, пента- и гексануклеотиды. С помощью высокоразрешающего электрофореза в полиакриламидном геле ПЦР-фрагменты, отличающиеся всего на несколько нуклеотидов, различаются надежнее, если они имеют не очень большую длину (не более 300 п.н.). Это обстоятельство учитывалось при первичном выборе и анализе праймеров.

Важным критерием при выборе праймеров являлось выявляемое ими количество аллелей микросателлитного локуса. На основании литературных данных [Milbourne D. et al., 1998, Ashkenazi V. et a!., 2001, McGregor C.E. et al., 2000] было проанализировано около

200 пар праймеров к микросателлитным локусам, после чего для генотипирования представителей рода Solarium нами были первоначально выбраны 30 пар праймеров.

С помощью метода микросателлитного анализа в работе было проанализировано 6 клубненосных видов Solanum (S. kurtzianum, S. stolonifertim, S. chacoense, S. bulbocastanum, S. demisstim и S. tuberosum) и один бссклубневый вид (S. lycopersicoides). На рис. 1 представлены электрофореграммы разделения продуктов ПЦР в 8 %-ном полиакриламидном геле, полученных с четырех пар праймеров (РОТ 47-48, STIIKA, STS 1-2 и STM0031), выявляющих в сумме от 6 до 12 аллельных вариантов для исследуемых микросателлитных локусов картофеля.

123446TS А -

iSO u — 15ППЯ. --

НЮ пл. 250 ил. ¿Мал. 150 ил.

1*Ппл. llWn.il 50 пл.

Рис. 1. Электрофореграммы разделения продуктов ПЦР в 8 % -ном полиакриламидном геле, полученных с праймеров РОТ 47-48 (A), STIIKA (Б), STS 1-2 (В) и STM 0031 (Г). В качестве матриц для ПЦР использовали образцы ДНК растений S. lycopersicoides (2), S. kurtziamim PI 472923 (3), S. chacoense PI 133713 (4), S. stoloniferum PI 255532 (5), S. demissum PI 498012 (6), S. bulbocastanum Sbk (7), 5. tuberosum 78563-76 (8). (Соответствующие дорожки электрофореграммы указаны в скобках). Дорожка 1 - маркер молекулярной массы.

Анализ представленных на рис. 1 данных показывает, что с помощью ряда праймеров к микросателлитным локусам картофеля можно получать уникальные для каждого образца ДНК-профили. В целом, совокупный генетический профиль, полученный в результате анализа нескольких локусов, позволяет нам надежно различать клубненосные и неклубненосные формы Solanum.

Далее мы исследовали уровень генетического полиморфизма внутри видов Solanum. Для проведения анализа в нашем распоряжении были два североамериканских вида:

S. stoloniferum, S. demissum, и один южноамериканский вид S. chacoense. На рис. 2 представлены генетические профили 5-6 представителей каждого вида, полученные с пар праймеров РОТ 81-82 и STM0019. Как видно из представленных на рис.2 электрофореграмм, внутри каждого локуса все три вида Solanum имеют свои уникальные микросателлитные профили, однако, отдельные растения каждого вида обладают низким уровнем полиморфизма, что может свидетельствовать о том, что внутри того или иного локуса разные виды Solanum проявляют различный уровень генетического разнообразия. Так, например, внутри локуса РОТ 81 -82 (рис. 2, А) все 6 растений S. stoloniferum имеют идентичный микросателлитный профиль; среди 5 растений S. demissum только S. demissum CGN 17805 (рис. 2, А, дорожка 17) имеет отличный от остальных растений ДНК-профиль; наибольший полиморфизм проявляют растения южноамериканского вида S. chacoense, среди которых 5 из 6 анализируемых генотипов имеют уникальные ДНК-профили; неразличимы только генотипы S. chacoense PI 189219 и chacoense PI 133713 (рис.2, А, дорожки 8 и 9). Внутри локуса STM0019 (рис.2, Б) формы S. stoloniferum проявляют больший (по сравнению с локусом РОТ 81-82) полиморфизм.

А

Л ¡¡¿'!.чп/.'гнЛ i/i i nifrit. г S.dariissam

>---1 \--1 I-1

10» <U.

5« -л.

Б

Рис. 2. Электрофореграммы разделения продуктов ПЦР в 8 % -ном полиакриламидном геле, полученных с праймеров РОТ 81-82 (А) и STM 0019 (Б). В качестве матриц для ПЦР использовали образцы ДНК растений S. stoloniferum PI 230490 (2), S. stoloniferum PI 255532 (3), 5. stoloniferum CGN 18348 (4), S. stoloniferum CGN 23072 (5), S. stoloniferum 513 (6), S. stoloniferum 590 (7), S. chacoense PI 189219 (8), S. chacoense PI 133713 (9), S. chacoense PI 472828 (10), S. chacoense PI 472810 (11), S. chacoense CGN 20583 (12), S. chacoense 135 (13), S. demissum PI 161715 (14), S. demissum PI 205514 (15), S. demissum PI 498012 (16), S. demissum CGN 17805 (17), S. demissum 253 (18). (Соответствующие дорожки электрофореграммы указаны в скобках). Дорожка 1 - маркер молекулярной массы.

В результате проведенного микросателлитного анализа мы получили уникальный для каждого вида набор дескрипторов, на основе которого может быть составлен индивидуальный «генетический паспорт».

Таблица 1. Список рекомендуемых праймеров для анализа микросателлитов картофеля.

Л п/п Название праймера Последовательности праймеров 5' —3' Те«, •с Диапазон длин ПЦР-фрагмеитов, п.н. Мотив Количество наблюдаемых аллелей

1 вТПКА Ь'-ТТССТТССТТЛССТЛСТЛ К-СССААСАТТАССАСАТТС 45 100-250 Ш4 12

2 БТЭ 1-2 Г-ТСТСТТСАСАССГСТСАСТСАААС Р-ТСАСССАТТЛСЛСТАСССЛЛСАС-А 50 200-270 9

3 ТОМ 8-9 Г-С-САТТОАТТОААСТТСАТТСТССТ Н-АТГГТТСТССАСЛССААСТЛАССС 56 120-170 (311). 8

4 РОТ 47-18 Г-АЛСАТТАСАЛСАСАТТАССА а-ААСТТЛ?СТСАЛЛСТС7ССТ 45 150-270 ИвМзн)» 6

5 РОТ 83-84 Г-С-ССАСАТСАСАетСТ К-ССТССТССТАТТССТС 42 100-200 (18). 6

6 5Т 15-16 Е-АЛТТСЛТСгТТС-СССТАССТС Й-АТССАСАААОАТСТСААААТТСА 52 200-300 (ааё). 5

7 РОТ 53-54 Г-ССААААТАСАСССТССАТЛО И-ТТСТСААСААСТТСССАТСС 55 150-250 (сЩМ)„ 4

8 РОТ 57-58 Г-ТТСССГС-ААССАССССТААА Й-ССССАСТЛАСТЛААЛСАТТС 55 100-200 «8>ь 6

9 РОТ 81-82 Р-АТАААССССАТСАСААСС К-АТСССАТАСАТТТСГТАС 48 50-170 (¡«ЩО-Н), 8

10 5Т 5-6 Г-СТСССААСТТСГТАСТАССССС К-АААТССТ7ТСТСАССТСССС 55 100-200 (<с).(И). 4

11 ЭТМ 0031 Г-САТАСССАСССЛССТЛСЛС К-ТТСААССТАТСАТТТТСТСАСГ'СС 54 50-200 (ас>,...(асиэсас)...(ас)р(есас\ 8

12 5ТМ 1005 Г-АТСССТСТТАССААТААСТССб ¡*-СЛССТААС0ТСС-Т7СС-СС 55 150-200 (ЁИ). 3

13 вТМ 1016 Г-ТТСТСАТТТСАТССАТСТТТСС К-АТССТТСССАТСГСАТСТСТ 55 200-300 (И). 9

14 5ТМ1019 Г-ТАСАТТТТАТТАТТСССЛАСААОСА Р-СААСТАССТТСТССССАСАТАС 55 200-250 <а1с). 4

15 ЗТМОО|9 Г-ЛЛТАСаТСТАСТСЛСТСТСЛЛТО ?-ТТСААСТААЛАСТССТЛСТАТС7С 46 70-150 (а1М81Ма1иОДвсМр)к 9

16 БТМ 1057 Е-ТТАТСТТ?ССС:?АААА?СТА Я-АААТТАААТССААСЛСААСС 47 100-150 (аащ). 5

17 ЯТМ 1097 Р-ТСАТТТАСТТССТТСТТТС З-ССТТТССАТССТААТАСАСС 47 100-200 (да). 4

18 ЭТМ 20115 Е-ТТТААСТТСТСАСТТСТССАССС й-СТСАТЛАССТТГЛССЛТТССТССС 55 150-200 3

19 5ТМ2013 Р-ТТСССААТТАСССТСЮСС З-АААААААСААСССССАСС 55 150-200 (Ив). 4

20 ЭТМ 1105 Г-АААССТС-СТАСЛЛЛТАЛСОС З-САСАААТААТТССАССАСАТС 52 70-150 (аск). 9

Подобный «паспорт» можно представить как в графической форме в виде набора аллелей по всем локусам, представляющих своеобразный «штрих-код», так и в математической форме в виде матрицы. Для составления совокупного математического профиля («паспорта») генотипа каждый фрагмент ДНК с известной молекулярной массой принимают за дескриптор. Далее составляют матрицу, содержащую сведения о присутствии (1) или отсутствии (0) этих дескрипторов у всех исследованных генотипов для всех сочетаний праймеров. В конечном итоге получают общую таблицу, в которой показаны все дескрипторы, выявленные с помощью разных пар праймеров и расположенные в порядке убывания их молекулярной массы. В результате проведенных нами экспериментальных исследований были отобраны 20 пар праймеров (Табл. 1), являющихся перспективными для идентификации растений рода Solanum.

В данной работе с использованием этих 20 пар праймеров было выявлено 126 дескрипторов генетического разнообразия растений рода Solanum, на основе которых были созданы матрицы межвидового, внутривидового и сортового разнообразия. Эти матрицы в дальнейшем использовали для определения генетических расстояний (GD) между генотипами по Nei и Li (1979), и впоследствии проводили кластерный анализ методом UPGMA (Unweighted Pair-Group Method with an Arithmetic Average) [Sneath P.H.A. et. ai, 1973], результатом которого являлись дендрограммы (пример одной из них приведен на рис. 3), отражающие филогенетические взаимоотношения анализируемых форм растений. Эти расчеты проводили с помощью пакета прикладных программ TREECON [Van de Peer Y. et. at., 1994].

Рис. 3. Дендрограмма генетического разнообразия представителей трех видов рода

Таким образом, используя метод анализа микросателлитных последовательностей, можно определять уровень биоразнообразия внутри вида, в частности внутри видов Solanum. На основании проведенного анализа представителей трех видов Solanum: S. stoloniferum, S. demissum и S. chacoense, можно говорить о том, что наибольшее генетическое

S. demissum PI 498012 S. demissum PI 161715 S. demissum PI 205S14 S. demissum CGN 17805 ' 5". demissum 253

S. chacoense PI 472810 S. chacoense CGN 20583 S. chacoense PI 189219 S. chacoense PI 133713 S. chacoense PI 472828 " S. chacoense 135

j. sioioni/егит t * ■ S. stoloniferum 513

SOLANUM.

разнообразие проявляют растения 5. chacoense, наименьшее — растения 5. demissum; также можно различать североамериканские (5. stoloniferwn, S. demissum) и южноамериканские (S. chacoense) виды Solanum (рис. 3).

3. Исследование полиморфизма генома картофеля методом микросателлитного анализа.

В настоящее время картофель является одной из основных овощных сельскохозяйственных культур. Современная селекция картофеля основывается на применении межсортовой и межвидовой гибридизации. Эти методы позволили сочетать и комбинировать в новых сортах наиболее важные свойства родительских форм, планировать и прогнозировать заданные параметры. Современные сорта сочетают около 40 - 50 признаков (далее перечислены наиболее важные и значимые признаки), как то морфологические особенности гнезда и клубня (окраска кожуры, мякоти, глазков; число клубней в гнезде и масса клубня; длина столонов); урожайность (число и масса клубней в гнезде); качество (содержание крахмала, белка, витамина С, редуцирующих Сахаров, соланина, вкус, консистенция, развариваемость, пригодность к переработке); группа спелости (ранние, среднеранние, среднеспелые, среднепоздние, поздние); устойчивость к грибным и бактериальным болезням (рак, фитоальтернариоз, парша, чСрная ножка, кольцевая гниль и др.); устойчивость к вирусным болезням (скручивание листьев, крапчатость и др.); устойчивость к вредителям (картофельная и стеблевая нематоды, колорадский жук, картофельная моль и др.); устойчивость к жаре, засухе, переувлажнению, заморозкам; период покоя клубней (в зависимости от целей возделывания); сохранность (лёжкость) в период хранения; пригодность к механизированному уходу и уборке.

Для современного сельского хозяйства решающую роль играет выбор сорта. Благодаря правильно подобранным сортам для возделывания в той или иной местности возможно увеличение сбора продукции до 30 - 50 %. Правильно подобранный сортимент позволяет увеличить не только урожай, но и улучшить качество продукции, растянуть сроки ее поступления, повысить выход готового продукта.

В нашей работе для исследования полиморфизма нетранслируемых последовательностей генома картофеля мы использовали сорта отечественной и зарубежной селекции. Технология анализа микросателлитных последовательностей генома картофеля позволяет различать сорта по ряду микросателлитных локусов, причем перечень этих локусов не универсален и варьирует в зависимости от характера и количества

Рис. 4. Электрофореграммы разделения продуктов ПЦР в 8 % -ном полиакриламидном геле, полученных с пары праймеров STM 2005. В качестве матриц для ПЦР использовали образцы ДНК растений Скороплодный (2), Брянский ранний (3), Эффект (4), Голубизна (5), Ресурс (6), Никулинский (7), Белоснежка (S), Жуковский ранний (9), Atlantic (10), Ильинский (11), Луговской (12), Удача (13), Синецвет (14), Лукъяновский (15), Петербургский (16), Невский (17), Kameraz (18), Смена-20 (19), Saturna (20), Desiree (21), Romano (22), Katahdin (23), Russet Burbank (24), Kennebec (25), Wauseon (26), Lady Rosetta (27), Maris Piper (28), Альтаир (29), Аксамит (30). (Соответствующие дорожки электрофореграммы указаны в скобках). Дорожка 1 - маркер молекулярной массы.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 И 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 2S

250 пл.

200 пл.

150 пл.

Рис. 5. Электрофореграммы разделения продуктов ПЦР в 8 % -ном полиакриламидном геле, полученных с пары праймеров ТОТ 47-48. В качестве матриц для ПЦР использовали образцы ДНК растений Olev (2), Агрономический (3), Aquila (4), Jubel (5), Приекульсхий ранний (6), Смена - 20 (7), Kameraz (8), Голубизна (9), Осень (10), 128-6 (11), Эффект (12), Раменский (13), Скороплодный (14), Anoka (15), Удача (16), Брянский ранний (17), Березка (18), Atlantic (19), Wauseon (20), Katahdin (21), Kennebec (22), Superior (23), Альтаир (24), Аксамит (25). (Соответствующие дорожки электрофореграммы указаны в скобках). Дорожка 1 - маркер молекулярной массы.

анализируемых генотипов. Внутри одного и того же локуса для определенной выборки генотипов можно получить микросателлитные профили, позволяющие различать либо всю панель исследуемых генотипов, либо часть представленных образцов растений.

Таким образом, можно говорить о том, что выбор информативного локуса для генотипирования образцов методом микросателлитного анализа во многом зависит от характера и представительности выборки генотипов для проведения подобного эксперимента. На рис. 4 представлены микросателлитные профили сортов картофеля, обнаруженные для локуса STM 2005. Как видно, внутри локуса STM 2005 (рис. 4) можно наблюдать наличие 7 различных генетических профилей анализируемых сортов, среди которых 2 являются уникальными: сорт Никулинский и Kennebec (дорожки 7 и 25).

Специального внимания заслуживает задача генотипирования близкородственных сортов картофеля методом анализа микросателлитных последовательностей. В качестве примера на рис. 5 приведен анализ генетических профилей ряда близкородственных сортов по локусу РОТ 47-48. Как видно из рис. 5, практически все представленные генетические профили имеют сложный и схожий набор аллелей. Среди анализируемых образцов ДНК имеются 2 пары генотипов: сорт Голубизна (Гатчинский х 128-6) и Осень (Granóla * 128-6) (дорожки 9 и 10); сорт Скороплодный (128-6 х Anoka) и Удача (Vilnia * Anoka) (дорожки 14 и 16), в селекции которых участвовали родительские формы, среди которых одна была общая (генотипы выделены жирным шрифтом). Как видно из электрофореграмм генотипы сортов можно различать между собой внутри каждой полусестринской пары.

Общность происхождения сортов можно также наблюдать между сортами отечественной и зарубежной селекции (рис. 6). Проведенный анализ микросателлитных профилей сортов Скороплодный (Россия) и Wauseon (Нидерланды), полученных с пары праймеров STM 1057 (рис. 6, А), показывает, что сорт Скороплодный (дорожка 11) сочетает все аллели родительских форм Anoka (дорожка 9) и 128-6 (дорожка 10) (рис. 6, А, аллели обозначены стрелками 1, 2, 3 и 4), а различие в генетических профилях сортов Скороплодный и Wauseon (дорожки 11 и 12, соответственно) обеспечивается присутствием/отсутствием единственного аллеля (обозначен стрелкой 2), который является генетическим материалом S. demissum (дорожка 7). Для определения характера происхождения аллелей необходимо в каждом конкретном случае устанавливать их первичную структуру; аллели 3 и 4 размером 103 п.н. и 107 п.н., соответственно (рис. 6, А) характерны для двух родоначальников: S. demissum и Early Rose, участвовавших в селекции сортов Wauseon (рис. 6, А, дорожка 12) и Скороплодный (рис. 6, А, дорожка 11).

1 2 .1 4 5 6 7 Я 9 10 11 12 И

--Г

Sdmissum X Shiberosum USDA 43055 X Iri&h Cobbler :

|USL'A3S95-13 X Eatliне L----1 | .---1

T

jUSDAXOA.jJ XUSDAXS2817Q

B402-1 X; CTicrokee! USPA41!iS6x! Cherokee

\ ,......

X 1376-6

................>.....,

R514^-S| X Kai.ihdin

Рис. 6. Пример сопоставления генетического профиля образцов ДНК растений отечественной селекции, полученного на основе анализа микросателлитных последовательностей, с их селекционной историей. Электрофореграмма разделения продуктов ПЦР в 8 % -ном полиакриламидном геле, полученная с пары праймеров STM 1057 (А). В качестве матриц для ПЦР использовали образцы ДНК растений 5. demissum CGN17805 (2), S. demissum 375 (3), S. demissum 253 (4), 5. demissum PI 161715 (5), S. demissum PI 205514 (6), 5. demissum PI 498012 (7), Early Rose (8), Anoka (9), гибрид 128-6 (10), Скороплодный (11), Wauseon (12), Katahdin (13). Селекционная история (схема) сортов картофеля (Б) составлена на основании их родословных. (Соответствующие дорожки электрофореграммы указаны в скобках). Дорожка 1 - маркер молекулярной массы.

Полученные данные о первичной структуре микросателлитного локуса STM 1057, локализованного на VIII хромосоме [Milbourne D. el. al., 1998], представлены на рис.7 и рис. 8; аллель размером 111 п.н. является генетическим материалом S. demissum; аллель размером 115 п.н. - Early Rose (рис. 8). Полученные данные о первичных структурах аллелей родительских форм (гибрид 128-6 и сорт Anoka) и их гибрида (сорт Скороплодный) (рис. 7), свидетельствуют о кодоминантном наследовании генетического материала родительских форм при скрещивании. Различия в молекулярной массе аллелей обеспечивается наличием разного количества повторяющихся единиц (АААТ)„ (рис. 7).

Еще более сложной, но крайне необходимой и важной задачей в селекции растении является различение и идентификация растений, полученных в результате скрещивания одних и тех же родительских форм, получивших статус сорта.

TTATGTTTCGGTTAAAATGTATCAGCTGGATAGCTGATTACTAGCCTTGCCAGTTGTTAAT 61 TTATGTTTCGGTTAAAATGTATCAGCTGGATAGCTGATTACTAGCCTTGCCAGTTGTTAAT б1 TTATGTTTCGGTTAAAATGTATCAGCTGGATAGCTGATTACTAGCCTTGCCAGTTGTTAAT б1 TTATGTTTCGGTTAAAATGTATCAGCTGGATAGCTGATTACTAGCCTTGCCAGTTGTTAAT б1 TTATGTTTCGGTTAAAATGTATCAGCTGGATAGCTGATTACTAGCCTTGCCAGTTGTTAAT б1 TTATGTTTCGGTTAAAATGTATCAGCTGGATAGCTGATTACTAGCCTTGCCAGTTGTTAAT б1 TTATGTTTCGGTTAAAATGTATCAGCTGGATAGCTGATTACTAGCCTTGCCAGTTGTTAAT 61 TTATGTTTCGGTTAAAATGTATCA GC TGGATAGC TGAT TAC TAGCC T TGC CAG T T GTTAAT 61 TTATGTTTCGGTTAAAATGTATCAG С T GGATAGCTGAT TAC TAGCC T TGC CAG T TG TTAAT б1 TTATGTTTCGGTTAAAATGTATCAGCTGGATAGCTGATTACTAGCCTTGCCAGTTGTTAAT 61 TTATGTTTCGGTTAAAATGTATCAGC TGGATAGCTGAT TAC TAGCC T TGC CAG T TG T T AAT 61

GCTATGTATGAAATAAATAAAT------------GGTTGTCTTCCATTTAATTT 103

GCTATGTATGAAATAAATAAATAAAT--------GGTTGTCTTCCATTTAATTT 107

GCTATGTATGAAATAAATAAATAAATAAATAAATGGTTGTCTTCCATTTAATTT 115

GCTATGTATGAAATAAATAAAT------------GGTTGTCTTCCATTTAATTT 103

GCTATGTATGAAATAAATAAATAAAT--------GGTTGTCTTCCATTTAATTT 107

GCTATGTATGAAATAAATAAATAAATAAAT—--GGTTGTCTTCCATTTAATTT 111 GCTATGTATGAAATAAATAAATAAATAAATAAATGGTTGTCTTCCATTTAATTT 115

GCTATGTATGAAATAAATAAAT------------GGTTGTCTTCCATTTAATTT 103

GCTATGTATGAAATAAATAAATAAAT--------GGTTGTCTTCCATTTAATTT 107

GCTATGTATGAAATAAATAAATAAATAAAT----GGTTGTCTTCCATTTAATTT 111

GCTATGTATGAAATAAATAAATAAATAAATAAATGGTTGTCTTCCATTTAATTT 115

Рис. 7. Первичная структура аллелей локуса STM 1057» интрогрессируемых из родительских форм Anoka и гибрида 128-6 в сорт Скороплодный (Scor) - гибрид 128-6 х Anoka. 103, 107, 111 и 115 - размер соответствующего аллеля, п.н. Повторяющийся мотив (АААТ)„ подчеркнут. Последовательности праймеров отмечены жирным шрифтом.

S.dem(103): TTATGTTTCGGTTAAAATGTATCAGCTGGATAGCTGATTACTAGCCTTGCCAGTTGTTAAT 61

S.dem(107) : TTATGTTTCGGTTAAAATGTATCAGCTGGATAGCTGATTACTAGCCTTGCCAGTTGTT AAT 61

S.dem(111): TTATGTTTCGGTTAAAATGTATCAGCTGGATAGCTGATTACTAGCCTTGCCAGTTGTTAAT 61

Scor(103) : TTATGTTTCGGTTAAAATGTATCAGCTGGATAGCTGATTACTAGCCTTGCCAGTTGTTAAT 61

Scor(107) : TTATGTTTCGGTTAAAATGTATCAGCTGGATAGCTGATTACTAGCCTTGCCAGTTGTTAAT 61

Scor(111) : TTATGTTTCGGTTAAAATGTATCAGCTGGATAGCTGATTACTAGCCTTGCCAGTTGTTAAT 61

Scor(115) : TTATGTTTCGGTTAAAATGTATCAGCTGGATAGCTGATTACTAGCCTTGCCAGTTGTTAAT 61

E.R.(107) : TTATGTTTCGGTTAAAATGTATCAGCTGGATAGCTGATTACTAGCCTTGCCAGTTGTTAAT 61

E.R.(115) : TTATGTTTCGGTTAAAATGTATCAGCTGGATAGCTGATTACTAGCCTTGCCAGTTGTTAAT 61

S.dem(103) : GCTATGTATGAAATAAATAAAT------------GGTTGTCTTCCATTTAATTT 103

s.dem(107): GCTATGTATGAAATAAATAAATAAAT--------GGTTGTCTTCCATTTAATTT 107

S.dem(lll): GCTATGTATGAAATAAATAAATAAATAAAT----GGTTGTCTTCCATTTAATTT 115

Scor (103) : GCTATGTATGAAATAAATAAAT------------GGTTGTCTTCCATTTAATTT 103

Scor (107) : GCTATGTATGAAATAAATAAATAAAT--------GGTTGTCTTCCATTTAATTT 107

Scor(111) : GCTATGTATGAAATAAATAAATAAATAAAT----GGTTGTCTTCCATTTAATTT 111

Scor(115) : GCTATGTATGAAATAAATAAATAAATAAATAAATGGTTGTCTTCCATTTAATTT 115

E.R. (107) : GCTATGTATGAAATAAATAAATAAAT--------GGTTGTCTTCCATTTAATTT 107

E.R.(115) : GCTATGTATGAAATAAATAAATAAATAAATAAATGGTTGTCTTCCATTTAATTT 115

Рис. 8. Первичная структура аллелей локуса STM 1057. Дикий вид S.demissum PI 498012 (S. dem); сорт-родоначальник Early Rose (E.R.); сорт Скороплодный (Scor). 103, 107, И! и 115 — размер соответствующего аллеля, п.н. Повторяющийся мотив (АААТ)„ подчеркнут. Последовательности праймеров отмечены жирным шрифтом.

Среди анализируемых нами растений имеются два сорта картофеля белорусской селекции, являющихся сестринскими линиями: сорт Аксамит (Добро * 77540-57) и Альтаир

(Добро х 77540-57). Проведенные исследования показали, что генотипы сортов Аксамит и Альтаир по ряду локусов (Табл. 1) имеют различный набор аллелей, что позволяет различать два растения.

Таким образом, система генотипирования растений рода Solanum на основании использования 20 пар праймеров (Табл. 1), позволяет проводить различение известных генотипов между собой (включая близкородственные сорта). Было выявлено 126 дескрипторов генетического разнообразия представителей рода Solanum, на основе которых созданы так называемые «генетические паспорта» исследуемых генотипов картофеля. В рамках проведенной работы на основе «генетических паспортов» построены дендрограммы (пример одной из них приведен на рис. 9), характеризующие генетические расстояния между сортами картофеля и дикорастущими сородичами.

т

г!-С

— Aquila -JuWl

— OU'v —»Wauseon

Katahdin ""* Superior "" Скороплодный ~ Приекульский ранний "" Голубизна

— 2Я-6

"" Брянский ранний *** Раменский Anoka

— Kennebec ~~ Осень

— Эффект Агрономический

— Alfuntic " Kameraz " Удача

— Березка Белоснежка

— !,adv Rosetta

— Ресурс

Лульяновский Никулинский " Синёцвет "Saturna " Петербургский " Russet Burbank

Луговской " Невский

— Смена-20 Жуковский ранний

— Maris Piper ~1 Ильинский ™ Desiree

~ Romano ~~ S. vhacoense "" Л tuberosum

— S. demissum

— & bulbocastanum "* 51 stoloniferum

Рис. 9. Дендрограмма генетического разнообразия представителей рода Solanum, построенная по результатам анализа полиморфизма микросателлнтных последовательностей.

Представленная дендрограмма (рис. 9), выявляет связи между сортами, которые достаточно хорошо соотносятся с их селекционными историями (родословными).

Дальнейшая работа по совершенствованию метода анализа полиморфизма микросателлнтных последовательностей позволит создать «генетические паспорта».

идентифицирующие генотипы. Прежде необходимо провести популяционное исследование, основанное на ДНК-анализе значительного количества образцов растений определенной группы, как по количеству ДНК-образцов, так и по их разнообразию. Таким образом, для каждого микросателлитного локуса на основе всех выявленных аллельных вариантов, будет составлена так называемая «аллельная лестница», отражающая весь набор аллельных вариантов для конкретного локуса с известной первичной структурой. Дальнейшая работа подразумевает проверку стабильности аллельных вариантов, содержащих микросателлитные последовательности для того или иного растения, после чего исследуемому образцу растения будет присвоен свой уникальный набор аллелей («генетический паспорт») по строго определенному списку микросателлитных локусов. Результатом столь масштабной работы станет возможность паспортизации новых сортов, сертификации семян и разнообразной продукции растениеводства.

4. Контроль интрогрессии генетического материала родительских форм в гибриды.

В настоящее время одним из основных методов селекции картофеля является межвидовая гибридизация, в частности, гибридизация с дикими видами картофеля. Однако передача полезных признаков от диких видов путем их непосредственного скрещивания с S. tuberusum осложняется по ряду причин, одной из которых является филогенетическая отдаленность видов. В целях преодоления межвидовой несовместимости, вызывающей отклонения от нормального процесса формирования гибридных семян, прибегают к использованию метода сомаклональной гибридизации. Для оценки эффективности передачи генетического материала при межвидовой гибридизации картофеля мы изучали растительный материал, любезно предоставленный Г. А. Яковлевой (Институт картофелеводства IIAH, Беларусь), представляющий собой соматические гибриды и их семенное поколение, полученные при скрещивании S. bulbocastanum и S. tuberosum. Для установления природы интрогрессируемых фрагментов ДНК от родительских форм в гибриды в работе использовали образцы ДНК растений S. bulbocastanum, S. tuberosum (сорт Ласунак) и гибрида L 4-11 (рис. 10).

Соответствующие аллели размером 96, 104, 114 п.н. (рис. 10, А) и аллели размером 154, 166 п.н. (рис. 10, Б) клонировали в состав вектора pGEM-T Easy фирмы Promega (США).

Полученные данные о первичной структуре микросателлитного локуса STM 1105, локализованного на VIII хромосоме, представлены на рис. 11 и в целом согласуются с результатами работы [MilbourneD. et. al., 1998], в которой была определена первичная структура фрагмента ДНК размером 114 п.н. у S. tuberosum, содержащего мотив (АСТС)б.

Рис. 10. Электрофореграммы разделения продуктов ПЦР в 8 % -ном полиакриламидном геле, полученных с праймеров STM 1105 (А) и STM 2005 (Б). В качестве матриц для ПЦР использовали образцы ДНК растений S. bulbocastamim (Sbk; дорожка 2), L 4-11 (Sbk х Ласунак; дорожка 3), tuberosum (сорт Ласунак; дорожка 4). (Соответствующие родительские пары и/или дорожки электрофореграммы указаны в скобках). Дорожка 1 - маркер молекулярной массы. 96, 104, 114, 154, 166 - размер аллелей соответствующего локуса, п.н.

Las.114 AAACCTGCTACAAATAAGGCAGGCACCTCCTCATTCTTACACTCACTCACTCACTCACTCACTC : 64

L4-11.114 AAACCTGCTACAAATAAGGCAGGCACCTCCTCATTCTTACACTCACTCACTCACTCACTCACTC : 64

L4-11.104 AAACCTGCTACAAATAAGGCAGGCACCTCCTCATTCT—С--------ACTCACTCACTCACTC : 54

Las . 104 AAACCTGCTACAAATAAGGCAGGCACCTCCTCATTCT—С--------ACTCACTCACTCACTC : 54

Sbk. 96 AAACCTGCTACAAATAAGGC----ACCTCCTCATTCT—CAC—ACTC--------------------------------: 40

L4-11.96 AAACCTGCTACAAATAAGGC----ACCTCCTCATTCT—CAC—ACTC--------------------------------: 4 0

Las.114 ACACAGCTCAAC-------AAGTGGTAACTTTTACTCATCTCCTCCAATTATTTCTG : 114

L4-11.114 ACACAGCTCAAC-------AAGTGGTAACTTTTACTCATCTCCTCCAATTATTTCTG : 114

L4-11.104 ACACAGCTCAAC-------AAGTGGTAACTTTTACTCATCTCCTCCAATTATTTCTG : 104

Las. 104 ACACAGCTCAAC-------AAGTGGTAACTTTTACTCATCTCCTCCAATTATTTCTG : 104

Sbk. 96 ACACAGCTCAACACTCAACAAGTGGTAACTTTTAC-CATCTCCTCCAATTATTTCTG : 96

L4-11.96 ACACAGCTCAACACTCAACAAGTGGTAACTTTTAC-CATCTCCTCCAATTATTTCTG : 96

Рис. 11. Первичная структура аллелей локуса STM 1105 интрогрсссируемых из родительских форм 5. bulbocastamtm (Sbk) и S. tuberosum (сорт Ласунак, Las) в соматический гибрид Sbk х Ласунак (L4-11). 96, 104, 114 - размер соответствующего аллсля, п.н. Повторяющийся мотив (АСТС)П подчеркнут. Последовательности лраймеров отмечены жирным шрифтом.

Проведенный анализ первичных структур аллелей локуса STM1105 позволяет говорить о полиморфизме микросателлитных последовательностей, основанном не только на различии в количестве тандемных повторов, но и на вариабельности областей, прилегающих к микросателлитным повторам.

Сведения о первичной структуре микросателлитного локуса STM 2005, локализованного на XI хромосоме, представлены на рис. 12 и согласуются с результатами работы [Milboume D. ct. al., 1998] с той только разницей, что в определенной нами первичной структуре фрагмента ДНК размером 166 п.н. у S. tuberosum содержится мотив

(СТОТТО)5 вместо опубликованных авторами данных о наличии во фрагменте ДНК размером 166 п.н. мотива (СТСТТС)}.

40

Las.l£6 TTTAAGTTCTCAGTTCTGCAGGGAAGTACTTCATATAACATATATTTCTGTGTAAACGACGAAATA : 66 L4-11.166 TTTAAGTTCTCAGTTCTGCAGGGAAGTACTTCATATAACATATATTTCTGTGTAAACGACGAAATA: 66 БЫс .154 TTTAAGTTCTCAGTTCTGCAGGGAAGTACTTCATATAACTTATATTTCTGTGTAGACGACGAAATA : 66 L4-11.154 TTTAAGTTCTCAGTTCTGCAGGGAAGTACTTCATATAACTrATATTTCTGTGTAGACGACGAAATA:66

107

Las.166 AACAATGCTGCTGTTGCTGTTGCTGGTGCTGTTGCTGGTGCTGCTAAGAGGGGACTATCGTGCCAA:132 L4-11.166 AACAATGCTGCTGTTGCTGTTGCTGGTGCTGTTGCTGGTGCTGCTAAGAGGGGACTATCGTGCCAA:132

Sbk.154 AACAATGCTGCTGTTGCTGTTGCTGGTG------------TTGCTAAGAGGGGACTATCGTGCCAA: 120

L4-11.154 AACAATGCTGCTGTTGCTGTTGCTGGTG------------TTGCTAAGAGGGGACTATCGTGCCAA: 120

Las.166 TGTAGCCGAACCCAGCAATGGTAAAGGTTATGAC: 166

L4-11.166 TGTAGCCGAACCCAGCAATGGTAAAGGTTATGAC : 166

Sbk.154 TGTAGCCGAACCCAGCAATGGTAAAGGTTATGAC: 154

L4-11.154 TGTAGCCGAACCCAGCAATGGTAAAGGTTATGAC : 154

Рис. 12. Первичная структура аллелей локуеа STM 2005 интрогрсссирусмых из родительских форм 5. bulbocastanum (Sbk) и S. tuberosum (сорт Ласунак, Las) в соматический гибрид Sbk х Ласунак (L4-11). 154, 166 — размер соответствующего аллеля, п.н. Повторяющийся мотив (CTGTTG)n подчеркнут. Последовательности праймеров и нуклеотиды в позициях 40, 107 отмечены жирным шрифтом.

Анализ первичных структур микросателлитных повторов локуса STM 2005 позволяет объяснять полиморфизм длин аллелей только лишь различием в количестве повторяющихся гексануклеотидных единиц (CTGTTG). Интересно отметить, что по этим двум микросателлитным локусам обе родительские формы относительно друг друга имеют уникальные первичные структуры: нуклеотидные последовательности AGGC...TA...T (S. tuberosum) и АСТСААС (S. bulbocastanum), образующие соответствующие инсерции/делеции в первичных структурах аллелей гибрида L 4-11 (рис. 11) или точечные нуклеотидные замены в позициях 40 и 107 (рис. 12), которые отчетливо наследуются гибридом L 4-11.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Проведенные нами экспериментальные исследования позволили создать эффективную универсальную технологию для генотипирования картофеля и его дикорастущих сородичей. Применение техники микросателлитного анализа: оптимизированный способ выделения растительной ДНК; применение современных подходов к проведению ПЦР (использование термостабильных ферментов, обеспечивающих проведение «горячего старта» ПЦР); применение метода высокоразрешающего электрофореза в денатурирующих условиях, исключающего возникновения артефактов в

ПЦР, позволяет различать растительные геномы, включая близкородственные, а также осуществлять контроль интрогрессии генетического материала от родительских форм в гибриды/сорта; сравнение генетических «отпечатков пальцев» контрольных образцов с генетическими «отпечатками пальцев» экспертных образцов позволяет отслеживать и подтверждать сортовую подлинность последних. Предлагаемая в нашей работе технология анализа микросателлитов позволит в будущем приблизиться к внедрению методов контроля продуктов растениеводства; к введению в действие автоматизированной информационной системы, обеспечивающей быстрый сбор, обработку, хранение и использование данных о генетических ресурсах («генетический паспорт» растения).

По материалам работы составлены и опубликованы методические рекомендации для специалистов-биотехнологов, сельскохозяйственных биотехнологических и селекционных центров, научно-исследовательских институтов.

ВЫВОДЫ

1. Разработана эффективная универсальная технология генотипирования представителей рода Solanum. По результатам исследования 85 генотипов картофеля и его дикорастущих сородичей предложен оптимальный набор праймеров (20 пар праймеров), с помощью которого возможно различать и идентифицировать растения рода Solanum.

2. С помощью разработанной технологии проведено межвидовое и внутривидовое различение растений рода Solanum. Проведено генотипирование 44 сортов картофеля отечественной и зарубежной селекции. На основе анализа генотипов показана возможность различия близкородственных сортов картофеля Альтаир и Аксамит, в селекции которых участвовали одни и те же родительские формы.

3. Впервые показапо, что предлагаемая технология микросателлитного анализа позволяет осуществлять контроль интрогрессии генетического материала родительских форм в гибриды/сорта. На основе экспериментального анализа первичных структур ряда микросателлитных локусов показана возможность контроля интрогрессии генетического материала дикого вида S. bulbocastanum и сорта Ласунак в гибрид L4-11, а также интрогрессии генетического материала родительских форм, участвовавших в селекции сорта Скороплодный.

4. С помощью разработанной технологии микросателлитного анализа проведено подтверждение сортовой подлинности экспертных образцов картофеля сорта Голубизна, полученных из различных опытно-производственных хозяйств.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Бирюкова В.А., Велишаева Н.С.. Зайцев B.C., ХавкинЭ.Е., Хромова Л.М., Шилов И.А. ДНК — даксилоскопия картофеля и его дикорастущих сородичей. // Вопросы картофелеводства. Материалы «Школы молодых ученых». Всерос. НИИ картофельного хозяйства. - М., 2004. С. 114-123.

2. Анискина Ю.В., Бирюкова В.А., Велишаева Н.С.. Мартынов В.В., Панкин A.A., Прибылова Т.А., Хавкин Э.Е., Шилов И.А. ДНК - генотипирование растений Brassica и Solanum. // III Международная научная конференция «Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии». Тезисы докладов. Москва. 19 октября 2004 г. С. 119-120.

3. Анискина Ю.В., Бирюкова В.А., Велишаева Н.С.. Панкин A.A., Прибылова Т.А., Хавкин Э.Е., Шилов И.А. ДНК - генотипирование растений родов Brassica и Solanum. // Сельскохозяйственная биология. 2005 г. №1. С. 110-119.

4. Анискина Ю.В., Велишаева Н.С.. Шилов И.А., Хавкин Э.Е. Генотипирование пасленовых и крестоцветных растений методом микросателлитного анализа. // Методические рекомендации, ВНИИСБ. Москва. 2005 г. 21 С.

5. Бекетова М.П., Бирюкова В.А., Велишаева Н.С.. Дробязина П.Е., Зайцев B.C., Хавкин Э.Е., Шилов И.А., Яковлева Г.А. ДНК маркеры интрогрессии устойчивости к фитофторозу картофеля. // III Московский международный конгресс. Биотехнология: состояние и перспективы развития. Москва. 14-18 марта 2005 г. С. 227.

6. Велишаева Н.С.. Бирюкова В.А., Яковлева Г.А., Хавкин Э.Е. Применение метода микросателлитного анализа для ДНК-генотипирования картофеля и его дикорастущих сородичей. // Материалы Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых и специалистов «Окружающая среда и здоровье». Суздаль. 19 - 22 мая 2005 г. С. 333.

7. Велишаева Н.С.. Шилов И.А., Хавкин Э.Е. Использование технологии микросателлитного анализа для различения сортов картофеля и его дикорастущих сородичей. // Вопросы картофелеводства. Актуальные проблемы науки и техники. Научные труды. Всерос. НИИ картофельного хозяйства. - М., 2006. С. 228 — 235.

8. Велишаева Н.С.. Хавкин Э.Е., Шилов И.А. Генотипирование картофеля и его дикорастущих сородичей методом полиморфизма микросателлитов. // Доклады РАСХН. 2006 г. № 5. С. 3 - 5.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Велишаева, Назифе Серверовна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Ишродукция картофеля в Европу и Россию.^

1.1.1. Ишродукция картофеля в Европу.

1.1.2. Ишродукция картофеля в Россию.

1.2. Систематика картофеля.

1.3. Основные заболевания картофеля.

1.3.1. Рак картофеля.

1.3.2. Вирус скручивания листьев (вирус РЬИУ).

1.3.3. Фитофтороз картофеля.

1.3.3.1. Симптомы болезни и биология возбудителя.

1.3.3.2. Распространение и вредоносность фитофтороза.

1.4. Метод контроля качества. Сортовая идентификация.

1.5. Молекулярные маркеры в генетическом анализе растений.

1.5.1. Полиморфизм длины рестриктазных фрагментов (ИРЬР-маркеры).

1.5.2. Произвольно амплифицированная полиморфная ДНК (ЯАРО-маркеры).

1.5.3. Полиморфизм длины амплифицированных фрагментов (AFLP-маркеры).

1.5.4. Микросателлитные маркеры.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Реактивы и материалы.

2.2. Приборы и методы.

2.3. Общие методики.

2.3.1. Выращивание растительных образцов.

2.3.2. Выделение геномной растительной ДНК на силикагелевом сорбенте.

2.3.3. Выделение геномной растительной ДНК.

2.3.4. Выделение плазмидной ДНК.

2.3.5. Полимеразная цепная реакция.

2.3.6. Электрофорез в агарозном геле.

2.3.7. Электрофорез в полиакриламидном геле.

2.3.8. Визуализация ДНК в полиакриламидном геле с помощью нитрата серебра.

2.3.9. Секвенирование ДНК-матриц по Сэнгеру.

2.3.10. Приготовление стандартов длины.

2.3.11. Проведение ферментативных реакций.

2.3.12. Клонирование амплифицированных фрагментов ДНК.

2.3.13. Трансформация клеток Е coli.

2.3.14. Анализ клонов с помощью ПЦР-амплификации.

2.3.15. Анализ флуоресцентно-меченных ПЦР-фрагментов.

2.3.16. Выравнивание нуклеотидных последовательностей.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1. Исследование межвидовой вариабельности представителей рода Solanum методом микросателлитного анализа.

3.1.1. Выбор праймеров для анализа полиморфизма микросателлитных локусов картофеля и его дикорастущих сородичей.

3.1.2. Исследование выбранных микросателлитных локусов на представителях рода Solanum

3.1.3. Оценка генетического полиморфизма видов Solanum

3.2. Исследование внутривидовой вариабельности представителей рода Solanum методом микросателлитного анализа.

3.3. Исследование полиморфизма генома картофеля методом микросателлитного анализа.

3.4. Контроль интрогрессии генетического материала от родительских форм в гибриды.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Технология генотипирования картофеля и его дикорастущих сородичей на основе микросателлитного анализа"

Семейство Solanaceae является одним и i самых представительных семейств двудольных рааепий, ставших незаменимыми объектами в жизнедеятельности человека [Knapp S. et al, 2004]. Многие растения этого семейства являются основными овощными сельскохозяйственными культурами - картофель (Solanum tuberozum L.), томат (Solanum lycopersicum L.), баклажан (Solanum melongena L), перец {Capsicum annuum).

В настоящее время картофель является одной из важнейших сельскохозяйственных овощных культур, возделываемых практически во всех peí ионах Российской Федерации. Разнообразие зон возделывания и направлений использования кулыуры привело к необходимости создания сортов карюфеля с различными хозяйственными и биологическими особенностями, такими, как устойчивость к болезням и вредителям, устойчивость к экстремальным условиям природной среды, высокие хозяйственные показатели и др. Современная селекция имеет существенные практические результаты, однако, требования, предъявляемые к современным сортам, постоянно возрастают в связи с периодическими вспышками болезней, посюянными эколо1ическими изменениями в регионах, усиливающейся конкуренцией на рынке и т.п. Для решения этих сложных задач необходимо применять современные методы селекции, основанные па достижениях генетики и дру1их смежных наук, и использовать разнообразный хорошо изученный на ¡епетическом уровне исходный материал для селекции.

В настоящее время в мировом сортименте карюфеля насчитывается свыше Зтыс. сортов. Практически ежегодно в России в Государственный Реестр селекционных достижений вносятся новые сорта. Для ре1истрации новою сорта по ряду основных сортоотличительных морфологических признаков, отражающих степень выраженности при Жаков отличимости, однородности и стабильное i и (Distinctness, Uniformity and Stability (DUS)) сорюв, требуются длительные полевые испытания. В настоящее время представляется перспективным применение ДПК-техноло1ий, с помощью которых станет возможным решение различных задач современной селекции, таких как подбор родительских форм для скрещивания, контроль интрогрессии генетическою материала, паспортизация и сертификация сортов, создание «генетическою паспорта» сельскохозяйственных растений, представляющею собой основу защиты ин1еллектуальпой собственности селекционеров.

Наибольшее распространение в изучении генетическою разнообразия рааений получил подход, основанный на применении молекулярных маркеров. Использование таких молекулярных ДНК-маркеров открывает большие перспективы для де1алыюго картирования хромосом, идентификации юнов, ответственных за хозяйственно-ценные признаки культуры, а также позволяет осуществлять контроль интрогрессии генетического материала родительских форм в гибриды при скрещивании. Широкое применение находят методы анализа растений, основанные па амплификации произвольных или заранее выбранных последовательностей ДНК с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР), проведение которой требует сравнительно небольших затрат времени. Метод ПЦР-анализа позволяет специфично копировать in vitro определенные фрагменты генома, увеличивая их количество в юометрической прогрессии, используя небольшие (hi) количества геномной ДНК. Среди ПЦР-методов наиболее широко используют метод анализа полиморфизма микросатсллитных последовательносте й.

Гипервариабельность микросателлитных последовательностей, высокая плотность и равномерность их распределения по геному, кодомипантное наследование и простота их обнаружения в автоматическом режиме делает микросателлиты незаменимыми маркерами для исследования меж- и внутривидовою разнообразия, генотипирования и популянионного анализа растений, а также для построения подробных юнетических карг.

К преимуществу метода микросателлитного анализа можно огпести возможность создания на его основе эффективной универсальной технологии, пригодной для контроля интрогрессии генетического материала при отдаленных скрещиваниях, для различения и идентификации источников, доноров, гибридов и сортов сельскохозяйственных растений. IIa момент начала наших исследований было известно достаточное количество микросателлитных локусов растений рода Solanum, однако, их применимость для решения задач по различению и идентификации картофеля была мало изучена.

Таким образом, представляется актуальным разработка удобной в эксплуатации, относительно быстрой, высокопроизводительной и надежной технологии для генотипирования растений на основе анализа полиморфизма микросателлитов.

Целью данной работы явилась разработка технологии для генотипирования картофеля и ею дикорастущих сородичей на основе микросателлитного анализа.

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Велишаева, Назифе Серверовна

выводы

1. Разработана эффективная универсальная технология генотипирования представителей рода Solanum По результатам исследования 85 генотипов картофеля и его дикорастущих сородичей предложен оптимальный набор праймеров (20 пар праймеров), с помощью которого возможно различать и идентифицировать растения рода Solanum.

2. С помощью разработанной технологии проведено межвидовое и внутривидовое различение растений рода Solanum. Проведено генотипирование 44 сортов картофеля отечественной и зарубежной селекции. На основе анализа генотипов показана возможность различия близкородственных сортов картофеля Альтаир и Аксамит, в селекции которых участвовали одни и те же родительские формы.

3. Впервые показано, что предлагаемая технология микросателлитного анализа позволяет осуществлять контроль интрогрессии генетического материала родительских форм в гибриды/сорта. На основе экспериментального анализа первичных структур ряда микросателлитных локусов показана возможность контроля интрогрессии генетического материала дикого вида S bulbocastanum и сорта Ласунак в гибрид L 4-11, а также интрогрессии генетического материала родительских форм, участвовавших в селекции сорта Скороплодный.

4. С помощью разработанной технологии микросателлитного анализа проведено подтверждение сортовой подлинности экспертных образцов картофеля сорта Голубизна, полученных из различных опытно-производственных хозяйств.

Благодарности

Автор искренне признателен проф., д.б.н. Хавкину Э.Е., д.б.н. Карягиной A.C., к.б.н. Лунину В.Г., к.б.н. Ворониной O.JI., к.х.н. Сергиенко О.В., к.б.н. Хромовой JI.M. (Всероссийский НИИ картофельного хозяйства, Россия), Яковлевой Г.А. (Институт картофелеводства HAH, Беларусь) и всем коллегам из группы анализа геномов, лаборатории молекулярной диагностики и генно-инженерных конструкций и лаборатории ДНК маркеров Всероссийского научно-исследовательского института сельскохозяйственной биотехнологии РАСХН за оказанную помощь во время выполнения этой работы.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Проведенные нами экспериментальные исследования позволили создать эффективную универсальную технологию для генотипирования картофеля и его дикорастущих сородичей. Применение техники микросателлитного анализа: оптимизированный способ выделения растительной ДНК; применение современных подходов к проведению ПЦР (использование термостабильных ферментов, обеспечивающих проведение «горячего старта» ПЦР); применение метода высокоразрешающего электрофореза в денатурирующих условиях, исключающего возникновения артефактов в ПЦР, позволяет различать растительные геномы, включая близкородственные, а также осуществлять контроль интрогрессии генетического материала родительских форм в гибриды/сорта; сравнение генетических «отпечатков пальцев» контрольных образцов с генетическими «отпечатками пальцев» экспертных образцов позволяет отслеживать и подтверждать сортовую подлинность последних. Предлагаемая в нашей работе технология анализа микросателлитов позволит в будущем приблизиться к внедрению методов контроля продуктов растениеводства: к введению в действие автоматизированной информационной системы, обеспечивающей быстрый сбор, обработку, хранение и использование данных о генетических ресурсах («генетический паспорт» растения).

По материалам работы составлены и опубликованы методические рекомендации для специалистов-биотехнологов с которыми можно ознакомится в библиотеке Всероссийского научно-исследовательского института сельскохозяйственной биотехнологии РАСХН.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Велишаева, Назифе Серверовна, Москва

1. Будин К.З. Генетические основы картофеля. //JI.: Агропромиздат., 1986. 192 С.

2. Букасов С.М., Камераз А.Я. Основы селекции картофеля. // М. Л.: Сельхозиздат., 1959.-528 С.

3. Букасов С.М. Принципы систематики картофеля. // Труды по прикладной ботанике, генетике и селекции. Ленинград, 1978. Т. 62. Выпуск 1. С. 3-34.

4. Генетика культурных растений (лен, картофель, морковь, зеленые культуры, гладиолус, яблоня, люцерна). // Под ред. д.б.н. В.А. Драгавцева, д.б.н. Т.С. Фадеевой. СПб.: ВИР, 1998.- 193 С.

5. Жуковский М.П. Культурные растения и их сородичи. //Л. Колос, 1972. С. 220-256.

6. Зайцева Н.Д. Методические указания по определению районированных сортов картофеля. // М.: Россельхозиздат., 1972. 102 С.

7. Камераз А.Я. Межвидовая и внутривидовая гибридизация картофеля. // Генетика картофеля. М.: Наука, 1973. С. 104-121.

8. Картель H.A., Просняк М.И., Корзун В.Н. Полиморфизм длины рестрикционных фрагментов ДНК и его использование в генетике и селекции растений. // Сельскохозяйственная биология. 1991. № 5. С. 41-48.

9. Корзун В.Н., Плашке И., Бернер А., Картель H.A. ПДРФ-картирование гена карликовости et 1 в геноме ржи Seeale cereale L. II Генетика. 1995. Т. 31. № 9. С. 12821286.

10. Картофель России. // Под ред. Чл.-корр. РАСХН A.B. Коршунова. М.: 2003. Том 1. Селекция, семеноводство, сертификация. 411 С.

11. Костина Л.И. Родословная отечественных сортов картофеля. // Труды по прикладной ботанике, генетике и селекции. 1971. Т. 46. № 1. С. 45-62.

12. Кустарев А.И. Происхождение, эволюция, экология и селекция картофеля. // Монография. Брянск. 2001. 248 С.

13. Оганисян А.С., Кочиева Е.З., Рысков А.П. Маркирование видов и сортов картофеля с помощью метода RAPD-PCR. // Генетика. 1996. Т. 32. № 3. С. 448-451.

14. Попкова К.В. Фитофтора картофеля. // Москва: Колос, 1972. 175 С.

15. Росс X. Селекция картофеля. Проблемы и перспективы. // Пер. с англ. Лебедева В.А.; Под ред. Яшиной И.М. М.: Агропромиздат., 1989. - 183 С.

16. Чумаков А.Е., Захарова Т.И. Вредоносность болезней сельскохозяйственных культур. // Москва: Агропромиздат, 1990. 126 С.

17. Шмальц X. Селекция растений. М.: 1973. С. 109-110.

18. AgakiH., Yokozeki Y., InagakiA., NakamuraA., FujimuraT. A codominant DNA marker closely linker to rise nuclear restorer gene, Rf-1, identified with inter-SSR fingerprinting. // Genome. 1996. V. 96. P. 1205-1209.

19. Albani M.C., Wilkinson M.J. Inter simple sequence repeat polymerase chain reaction for the detection of somaclonal variation. // Plant. Breed. 1998. V. 117. P. 573-575.

20. Apuya N.R., Frazier B.L., Keim P., Roth E.J., Lark K.G. Restriction fragment length polymorphisms as genetic markers in soybean. // Theor. Appl. Genet. 1988. V. 75. P. 889901.

21. AsakuraN., NakamuraC., OhtsukaJ. RAPD markers linked to the nuclear gene from Triticum timopheevii that confers compatibility with Aegilops squarrosa cytoplasm on alloplasmic durum wheat. //Genome. 1997. V. 40. P. 201-210.

22. Ashkenazi V., Chani E., Lavi U., Levy D., Hillel J., Veilleux R.E. Development of microsatellite markers in potato and their use in phylogenetic and fingerprinting analyses. // Genome. 2001. V. 44. P. 50-62.

23. Barua U.M., Chalmers K.J., Hackett C.A. Identification of RAPD markers linked to a Rhynchosporium secalis resistance locus in barley using near-isogenic lines and bulked segregant analysis. // Heredity. 1993. V. 71. P. 177-184.

24. Beavis W.D., Grant D., Albertsen M., Fincher R. Quantitative trait loci for plant height in four maize populations and their associations with qualitative genetic loci // Theor. Appl. Genet. 1991. V. 83. P. 141-145.

25. Becker J., HeunM. Barley microsatellites: Allele variation and mapping. // Plant Mol. Boil. 1995. V. 27. P. 835-845.

26. Becker J., Vos P., Kuiper M., Salamini F., Heun M. Combined mapping of AFLP and RFLP markers in barley. //Mol. Gen. Genet. 1995. V. 249. P. 65-73.

27. Beckmann J.S., Weber J.L. Survey of human and rat microsatellites. // Genomics. 1992. V. 12. P. 627-631.

28. Bell C.J., EckerJ.R. Assignment of 30 microsatellite loci to the linkage map of Arabidopsis //Genomics. 1994. V. 19. P. 137-144.

29. Black W. A general basis for the classification of strains of phytophthora infestans. // Proc. Roy. Soc. Edinburgh, B. 1952-1953.V. 65. № 1. P. 36.

30. Blair M.W., Panaud 0., McCouch S.R. Inter-simple sequence repeat (ISSR) amplification for analysis of microsatellite motif frequency and fingerprinting in rise (Oryza saliva L.). // Theor. Appl. Genet. 1999. V. 98. P. 780-792.

31. BolibokH., Rakoczy-Trojanowska M. Evaluating the efficiency of SAMPL marker system in assessing genetic diversity in winter rye (Secale cereale L.). 7th Internat. Congress of Plant Mol. Boil. 2003. Barcelona. June 23-28.

32. Bonierbale M.W., Plasted R.L., Tanksley S.D. RFLP maps based on a common set of clones reveal modes of chromosomal evolution in potato and tomato. // Genetics. 1988. V. 120. P. 1095-11-3.

33. Boom R., Sol C.J.A., Salimans M.M.M. et al. Rapid and simple method for purification of nucleic acides. // J. Clin. Microbiol. 1990. - V. 28 (3). - P. 495-503.

34. Bornet B., Goraguer F., Joly G., Branchard M. Genetic diversity in Europian and

35. Argentiniam cultivated (Solanum tuberosum subsp. tuberosum) detected by inter-simplesequence repeats (ISSRs). II Genome. 2002. V. 45. P. 481-484.

36. Botstein D., Write R.L., Skolnik M., Davis R.W. Construction of a genetic linkage map inman using restriction fragment length polymorphisms. // Am. J. Hum. Genet. 1980. V. 32.1. P. 314-331.

37. Broun P., Tanskley S.D. Characterization and molecular genetic mapping of simple repeat sequences in tomato genome. // Mol. Gen. Genet. 1996. V. 250. P. 39-49.

38. Cardie L., Ramsay L., Milbourne D., Macaulay M., Marshall D., Waugh R. Computation and experimental characterization of physically clustered simple sequence repeats in plants. // Genetics. 2000. V 156. P. 874-854.

39. Chambers G.K., MacAvoyE.S. Microsatellites: consensus and controversy. // Comp. Biochem. Physiol. 2000. V. 126. P. 455-476.

40. Chang C., Bowman J.L., DejohnA.W., Lander E.S., Meyerowitz E.M. Restriction fragment length polymorphism linkage map for Arabidopsis thaliana. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1988. V. 85. P. 6856-6860.

41. Cockerham G. General studies on resistance to potato viruses X and Y. // Heredity. 1970. V. 25. P. 309.

42. McCouch S.R., KochertG., YuZ.H., WangZ.Y., KhushG.S., Coffman W.R., Tankersly S.D. Molecular mapping of rice chromosomes. // Theor. Appl. Genet. 1988. V. 76. P. 815-829.

43. Demeke T., Lynch D.R., Kawchuk L.M., Kozub G.C., Armstrong J.D. Genetic diversity of potato determined by random amplified polymorphic DNA analysis. // Plant Cell Reports. 1996. V. 15. P. 662-667.

44. Devos K.M., Gale M.D. The use of random amplified polymorphic DNA markers in wheat. // Theor. Appl. Genet. 1992. V. 84. P. 567-572.

45. Dickinson M.J., Jones D.A., Jones J.D. Close linkage between the Cf-2/Cf-5 and Mi resistance loci in tomato. // Mol. Plant-Microbe Interactions. 1993. V. 6. P. 341-347.

46. DunnetJ. Inheritance of resistance to the Duddingston strain in the breeding line stemming from Solarium miltidissectum. II Rept. Scot. Plant Breed. Stat. 1961. V. 39.

47. Ellenby C. Resistance to the potato root eelworm. // Nature. 1948. V. 162. P. 704.

48. Fang D.Q., Roose M.L. Identification of closely related citrus cultivars with inter-simple sequence repeat markers. // Theor. Appl. Genet. 1997. V. 95. P. 408-417.

49. Gebhardt C., Mugniery D., Ritter E., Salamini F., Bonnel E. Identification of RFLP markers closely linked to the HI gene conferring resistance to Globodera rostochiensis in potato. // Theor. Appl. Genet. 1993. V. 85. P. 541-544.

50. Gebhardt C., Ritter E., Debener T., Schachtschabel U., Walkemeier B., Uhring H., Salamini F. RFLP analysis and linkage mapping in Solarium tuberosum U Theor. Appl. Genet. 1989. V. 78. P. 65-75.

51. Goodfellow P.N., Seflon L., Farr C.J. Genetic Maps. // Philos. Trans. R. Soc. Lond. Boil. Sci. 1993. V. 339. P. 139-146.

52. Gootlieb M., Chavko M. Silver staining of native and denatured eukaryotic DNA in agarose gels. // Analitical Biochemistry. 1987. V. 165. P. 33-37.

53. McGregor C.E., Lambert C.A., Greyling M.M., Louw J.H., Warnich L. A comparative assessment of DNA fingerprinting techniques (RAPD, ISSR, AFLP and SSR) in tetraploid potato (Solanum tuberosum L). // Euphytica. 2000. V. 113. P. 135-144.

54. Gupta M., Chyi Y.S., Romero-Severson J., Owen J.L. Amplification of DNA markers from evolutionarily diverse genomes using single primers of simple sequence repeats. // Theor. Appl. Genet. 1994. V. 89. P. 998-1006.

55. Gur-ArieR., CobenC.J., Eitan Y., Shelf I., Hallerman E.M., Kashi Y. Simple sequence repeat in Escherichia coli: abundance, distributions, composition, and polymorphism. // Genome Res. 2000. V. 10. P. 62-71.

56. Hancock J.M. The contribution of slippage-like processes to genome evolution. // J. Mol. Evol. 1995. V. 41. P. 1038-1047.

57. Hartl L., Weiss H., Zeller F.J., Jahoor A. Use of RFLP markers for the identification of alles of the Pm 3 locus conferring powdery mildew resistance in wheat (Triticum aestivum L). //Theor. Appl. Genet. 1993. V. 86. P. 959-963.

58. He C., Poysa V., Yu K. Development and characterization of simple sequence repeat (SSR) markers and their use in determining relationships among Lycopersicon esculentum cultivars. //Theor. Appl. Genet. 2003. V. 106. P. 363-373.

59. Helentjaris T. A genetic linkage map for maize based on RFLPs. // Trends Genet. 1987. V.3. P. 217-221.

60. Helentjaris T. A genetic lineage map for maize based on RFLP. // Trends in Genetics. 1992. V.3. P. 215-219.

61. Heun M. Mapping quantitative powdery mildew resistance of barley using a restrictionfragment lengh polymorphism map. // Genome. 1992. V. 35. P. 1019-1025.

62. Hinze K., Thompson R.D., Ritter E., Salamini F., Schulze-Lefert P. Restriction fragment lengh polymorphism-mediated targeting of ml-o resistance locus in barley (Hordeum vulgare). II Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1991. V. 88. P. 3691-3695.

63. Hosaka K., Hanneman R.E. Random amplified polymorphic DNA markers detected in a segregating hybrids population of Solanum chacoense X S phureja. II Japan. J. Genet. 1994. V. 69. P. 53-66.

64. HuJ., QuirosC.F. Identification of broccoli and cauliflower cultivars with RAPD markers. // Plant Cell Rep. 1991. V. 10. P. 505-511.

65. Humans R.J., Spooner D.M. Geographic distribution of wild potato species. // American Journal of Botany. 2001. V. 88. № 11. P. 2101-2112.

66. Jain A., ApparandaC., BhallaP.L. Evaluation of genetic diversity and genome fingerprinting of Pandorea (Bignoniaceae) by RAPD and inter-SSR PCR. // Genome. 1999. V. 42. P. 714-719.

67. Joshi C.P., Nguyen H.T. Application of random amplified polymorphic DNA technique for the detection of polymorphism among wild and cultivated tetraploid wheats. // Genome. 1993. V. 36. P. 602-609.

68. KantetyR.V., ZengX.P., Bennetzen J.L., ZehrB.E. Assesment of genetic diversity in Dent and Popcorn (Zea mays L.) inbred lines using inter-simple sequence repeat (ISSR) amplification. // Mol. Breed. 1995. V. 1. P. 365-373.

69. Karihaloo J., Brauner S., Gottlieb L.D. Random amplified polymorphic DNA variation in the eggplant, Solanum melongena L. (Solanaceae). // Theor. Appl. Genet. 1995. V. 90. P. 767-770.

70. Kawchuk L.M., Lynch D.R., Thomas J., Penner B., Sillito D., Kulcsar F. Characterization of Solanum tuberosum simple repeats and application to potato cultivar identification. // American Potato Journal. 1996. V. 73. P. 325-333.

71. Kidd K. K., Ruano G. Optimizing PCR. In: PCR 2. A practical approach. Edited by McPherson M. J., Harnes B. D., Taylor G. R. // Irl Press 1995. P. 6-28.

72. Kidwell K.K. and Osborn T.C. In: J. Beckman & T.C. Osborn (eds). Plant Genomes: Methods for Genetic and Physical Mapping. Kluever Academic Publishers Group. A.H. Dordrecht, The Netherlands. 2001. P. 1-13.

73. Kleinhofs A., Kilian A., Saghai MarorofM., BiashevR. A molecular, isozyme and morphological map of the barley (Hordeum vulgare) genome. // Theor. Appl. Genet. 1993. V. 86. P.705-712.

74. Klein-Lankhorst R., Rietveld P., Machiels B., Verkerk R., Wiede R., Gebhardt C., Koornneef M., Zabel P. RFLP markers linked to the root knot nematode resistance gene Mi in tomato///Theor. Appl. Genet. 1991. V. 81. P. 661-667.

75. Klein-Lankhorst R.M., Vermunt A., Weide R. Isolation of molecular markers for tomato (Lycopersicon esculentum) using random amplified polymorphic DNA (RAPD). // Theor. Appl. Genet. 1991. V. 83. P. 108-114.

76. Knapp S., Bohs L., Nee M., Spooner D.M. Solanaceae a model for linking genomics with biodiversity. // Comparative and Functional Genomics. 2004. V. 5. P. 285-291.

77. Koller B., Lehmann A., McDermott J.M., Gessler C. Identification of apple cultivars using RAPD markers. // Theor. Appl. Genet. 1993. V. 85. P. 901-904.

78. Konieczny A., Ansubel F.M. A procedure for mapping Arabiclopsis mutations using co-dominant ecotype-specific PCR-based markers. // Plant J. 1993. V. 4(2). P. 403-410.

79. Krantz F.A., Eide C.J. Resistanceof common scab of potatoes in parental clones and thear hybrid progenies. // Am. Potato J. 1948. V. 25. P. 294-300.

80. Ma Z.Q., Sorrells M.E., Tanksley S.D. RFLP markers linked to powdery mildew resistance genes Pm 1, Pm 2, Pm 3 and Pm 4 in wheat. // Genome. 1994. V. 37. P. 871-875.

81. Mace E.S., Lester R.N., Gebhardt C.G. AFLP analysis of genetic relationships among the cultivated eggplant, Solarium melongena L., and wild relatives (Solanaceae). // Theor. Appl. Genet. 1999. V. 99. P. 626-633.

82. Marczewski W., Hennig J., Gebhardt C. The Potato virus S resistance gene Ns maps to potato chromosome VIII. //Theor. Appl. Genet. 2002. V. 105. P. 564-567.

83. Martin G.B., Williams J.G.K., Tanskley S.D. Rapid identification of markers linked to Pseudomonas resistance in tomato by using random primers and near-isogenic lines. // Proc. Natl. Acad. USA. 1991. V. 88. P. 2336-2340.

84. Milbourne D., Meyer R.C., Collins A.J., Ramsay L.D., Gebhardt C., Waugh R. Isolation, characterization and mapping of simple sequence repeat loci in potato. // Mol. Gen. Genet. 1998. V. 259. P. 233-245.

85. Morgante M., Hanafer M., Powell W. Microsatellites are preferentially associated with nonrepetetive DNA in plant genomes. // Nat. Genet. 2002. V. 30. P. 194-200.

86. Morgante M., Olivieri A.M. PCR-amplified microsatellites as markers in plant genetics. // Plant J. 1993. V.3.P. 175-182.

87. Multani D.S., Lyon B.R. Genetic fingerprinting of Australian cotton cultivars with RAPD markers. // Genome. 1995. V. 35. P. 1005-1008.

88. Nei M., Li W.H. Mathematical model for studying genetic variation in terms of rectriction endonucleases. // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1979. V. 76. P. 5269-5273.

89. Nunome T., Ishiguro K., Yoshida T., Hirai M. Mapping of fruit shape and color development traits in eggplant (Solarium melongena L.) based on RAPD and AFLP markers. //Breed. Sci. 2001. V. 51. P. 19-26.

90. Nunome T., Suwabe K., Iketani H., Hirai M. Identification and characterization of microsatellites in eggplant. //Plant Breeding. 2003. V. 122. P. 256-262.

91. Panaud 0., Chen X., McCouch S.R. Frequency of microsatellite sequence in rice (Oryza saliva L.). // Genome. 1995. V. 38. P. 1170-1176.

92. Paran I., Aftergoot E., Shifriss C. Variation in Capsicum annum revealed by RAPD and AFLP markers. // Euphytica. 1998. V. 99. P. 167-173.

93. Van de Peer Y., De Wacheter R. TREECON for Windows: A software package for the construction and drawing of evolutionary trees for the Microsoft Windows enviroment. // Comp. Appl. Biosci. 1994. V. 10. P. 569-570.

94. Powell W., Morgante M., McDevitt R., Vendramin G.G.,Rafalski J. Polymorphic simple sequence repeat regions in chloroplast genomes: applications to the population genetics of pine. // Proc. Natl. Acad. USA. 1995. V. 92. P. 7759-7763.

95. Powell W., Machray G.C., Provan J. Polymorphism by simple sequence repeats. // Trends in plant science. 1996. V. 1. № 7. P. 215-222.

96. Prince J.P., Lackney V.K., Angeles C., Blauth J.R., Kyle M.M. A survey of DNA polymorphism within the genus Capsicum and the fingerprinting of peper cultivar. // Genome. 1995. V. 36. P. 404-417.

97. ReiterR.S., Williams J.G.K., FeldmanK.A. Global and local genome mapping in Arabidopsis thaliana by using recombinant inbred lines and random amplified polymorphic DNAs. // Proc. Natl. Acad. USA. 1992. V. 89. P. 1477-1481.

98. Roder M.S., Korzun V., Wendehake K., Plaschke J., Tixier M.-H., Leroy P., Ganal M.W. A microsatellite map of wheat. // Genetics. 1998. V. 149. P. 2007-2023.

99. Rodriguez J.M., Berke T., Engle L., Nienhuis J. Variation among and within Capsicum species revealed by RAPD markers. // Theor. Appl. Genet. 1999. V. 99. P. 147-156.

100. Ross H. Inheritance of exstreme resistance to virus Y in S.stoloniferum and its hybrids with S.tuberosum. // Proc. 3rd Conf. Potato Virus Diseases, Lisse-Wageningen. 1958. P. 204.

101. Rostiana 0., Niwa M., Marubashi W. Efficiency of inter-simple sequence repeats PCR for detecting somaclonal variation among leaf-culture-regenerated plants of horseradish. // Breed. Sci. 1999. V. 49. P. 245-250.

102. Roy J.K., Balyan H.S., Prasad M., Gupta P.K. Use of SAMPL for a study of DNA polymorphism, genetic diversity and possible gene tagging in bread wheat. // Theor. Appl. Genet. 2002. V. 104. P. 465-472.

103. Saal B., Wricke G. Development of simple sequence repeats markers in rye (Secale cereale L). // Genome. 1999. V. 42. P. 964-972.

104. Sanger F., Nicklen S., Coulson A.R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1977. V. 74. P. 5463-5467.

105. SambrookJ., FritschE.F. ManiatisT. Molecular Cloning: A Laboratory Manual // Cold Spring Harbor, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press. 1989.

106. Sanwen H., Baoxi Z., Milbourne D., Cardie L., Guimei Y., Janzhen G. Development of pepper SSR markers from sequence databases. // Euphytica. 2000. V. 117. P. 163-167.

107. Schachermayr G., Siedler H., Gale M.D., Winzeler H., Winzeler M., Keller B. Identification and localization of molecular markers linked to the Lr 9 leaf rust resistance gene of wheat. // Theor. Appl. Genet. 1994. V. 88. P. 110-115.

108. Sneath P.H.A., Sokal R.P. Numerical taxonomy. The principles and practice of numerical classification. // San Francisco: W.H. Freedman and Co. 1973.

109. Southern E.M. Detection of specific sequences among DNA fragments separated by gel electrophoresis. // J. Mol. Biol. 1975. V. 98. P. 503-517.

110. Stevenson F., Schultz E., Clark C. Inheritance of immunity from virus X in the potato. // Phytopathology. 1939. V 29. P. 362.

111. Tang S., Yu J.K., Slabaugh M.B., Shintani D.K., Knapp S.J. Simple sequence repeat map of the sunflower genome. // Theor. Appl. Genet. 2002. V. 105. P. 1124-1136.

112. Taramino G., Tingey S. Simple sequence repeats for germplasm analysis and mapping in maize. // Genome. 1996. V. 39. P. 277-287.

113. Tautz D. Hypervariability of simple sequences as a general source for polymorphic DNA markers.//Nucleic Acid Res. 1989. V. 17(16). P. 6463-6471.

114. Tautz D., Schlotterer C. Simple sequences. // Curr. Opin. Genet. Dev. 1994. V. 4. P. 832837.

115. Toth G., Gaspari Z., Jurka J. Microsatellites in different eucariotic genomes: survey and analysis. // Genome Research. 2000. V. 10. P. 967-981.

116. Trognitz B., Ghislain M., Crissman G. Breeding potatoes with durable resistance to late blight using novee sources of resistance and noncon ventional methods of selection. // Circular. 1996. V. 22. № l.P. 6-9.

117. Vivek B.S., Simon P.W. Linkage relationships among molecular markers and storage root traits of carrot (Daucus carota L. ssp. sativus). // Theor. Appl. Genet. 1999. V. 99. P. 58-64.

118. Vos P., Hogers R., Bleeker M., Reijans M., van de Lee T., Homes M., Frijters A., Pot J., Peleman J., Kuiper M., Zabeau M. ALFP: a new technique for DNA fingerprinting. // Nucleic Acid Res. 1995. V. 23. P. 4407-4414.

119. Vosman B., Arens P., Molecular characterization of GATA/GACA microsatallite repeats in tomato. // Genome. 1997. V. 40. P. 25-33.

120. WangZ., Weber J.L., ZhongG., TanksleyS.D. Survey of plant short tandem DNA repeats.//Theor. Appl. Genet. 1994. V. 88. P. 1-6.

121. Weeden N.F., Timmermann G.M., Hemmat M. Inheritance and reliability of RAPD markers. // Proc. Conf. Appl. RAPD Tech. Plant Breed. 1992. P. 12-17.

122. Welsh J., McClelland M. Fingerprinting genomes using PCR with arbitrary primers. // Nucleic Acid Res. 1990. V. 18. P. 7213-7218.

123. Williams K.J., Fisher J.M., Langridge P. Identification of RFLP markers linked to the cereal cyst nematode resistance gene (Cre) in wheat. // Theor. Appl. Genet. 1994. V. 89. P. 927-930.

124. Williams J.G.K., Kubelic A.R., Livak K.J. DNA polymorphisms amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers. // Nucleic Acid Res. 1990. V. 18. P. 6531-6535.

125. Wolfe A.D., Xiang Q-Y., Kephard S.R. Assessing hybridization in natural populations of Penstemon (Scrophulariaceae) using hypervariable inter-simple sequence repeat markers. // Mol. Ecol. 1998. V.71.P. 1107-1125.

126. Wu K.S., Tanksley S.D. Abundance, polymorphism and genetic mapping of microsatellites in rice. // Mol. Gen. Genet. 1993. V. 241. P. 225-235.

127. Yu Y.G., et al. RFLP and microsatellite mapping of a gene for soybean mosaic virus resistance. // Phytopathology. 1994. V. 84. P. 60-64.

128. Zietkiewicz E.A., Rafalski A., Labuda D. Genome fingerprinting by simple sequence repeat (SSR)-anchored polymerase chain amplification. // Genomics. 1994. V. 20. P. 176183.