Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему

Идентификация сортов сои с использованием молекулярно-генетических методов

ВАК РФ 06.01.05, Селекция и семеноводство

Автореферат диссертации по теме "Идентификация сортов сои с использованием молекулярно-генетических методов"

На правах рукописи

003448806 РАМАЗАНОВА СВЕТЛАНА АЛЕКСЕЕВНА

ИДЕНТИФИКАЦИЯ СОРТОВ СОИ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИХ МЕТОДОВ

06 01 05 - селекция и семеноводство

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 6 О КГ 2008

Краснодар - 2008

003448806

Работа выполнена в ГНУ «Всероссийский научно-исследовательскоий институт масличных культур им. В С. Пустовойта» Россельхозакадемии в 2005-2008 г.г.

Научный руководитель, доктор биологических наук,

АНТОНОВА Татьяна Сергеевна

Официальные оппоненты, доктор биологических наук, профессор ТРОШИН Леонид Петрович

кандидат биологических наук, СУПРУН Иван Иванович

Ведущая организация: ГНУ Краснодарский научно-исследовательский институт сельского хозяйства им. П.П. Лукьяненко

Защита диссертации состоится «30» октября 2008 г в 9 ч. 00 мин на заседании диссертационного совета Д 220 038 03 при ФГОУ ВПО «Кубанский государственный аграрный университет» по адресу 350044, г Краснодар, ул Калинина, 13

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГОУ ВПО «Кубанский государственный аграрный университет», с авторефератом — на сайте http://www.kubagro.ru

Автореферат разослан и размещен на сайте « »_2008 г

Ученый секретарь диссертационного совета

Кравцов А.М.

1.0БЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Соя - это культурное растение, по последней классификации относящееся к семейству Бобовые (Leguminosae (Fabaceae)), подсемейству Мотыльковые (Papilionaceae), трибе Фасолевые (Phaseoleae), подтрибе Глициниевые (Glycininae Benth ), роду Соя (Glycine), подроду Soja, виду G max, подвиду^р) manshurica (Зеленцов, Кочегу-ра,2006)

В мировом производстве белка соя является ведущей зернобобовой культурой Среди всех сельскохозяйственных культур ей нет равных по богатству и разнообразию содержащихся в зерне полезных химических веществ.

На современном этапе в успешной реализации селекционных программ большое значение имеет идентификация генотипов, поэтому актуальной задачей является паспортизация сортов, гибридов и исходных форм в соответствии с международными нормами.

Для сои характерно большое разнообразие морфологических признаков С их помощью в настоящее время оценивают генофонд популяций, уровень изменчивости, генетическое разнообразие и др Но иногда их бывает недостаточно для того, чтобы идентифицировать селекционный материал

Наиболее удобными для описания генотипов являются молекулярно-генетические маркеры, то есть запасные белки, изоферменты и полиморфные фрагменты ДНК Они в меньшей мере подвержены фенотипической изменчивости и, в большинстве случаев, имеют кодоминантный тип наследования На их основе проводится биохимическая паспортизация сортов и гибридов многих сельскохозяйственных культур Данные биохимической паспортизации можно использовать при регистрации сортов и гибридов, а так же для защиты прав селекционеров

В настоящее время наблюдается тенденция к увеличению посевных площадей сои в Краснодарском крае Во ВНИИМК в результате успешной

селекции созданы новые сорта этой культуры, разнообразные по своим характеристикам и назначению Недалек выход на международный рынок, когда потребуется сертификация семенного материала в соответствии с международными требованиями Поэтому актуально провести исследования по подбору молекулярных маркеров для идентификации и паспортизации сортов сои селекции ВНИИМК на основе анализа полиморфизма микросател-литных локусов

Микросателлитные последовательности ДНК являются наиболее доступными, простыми, удобными и относительно недорогими маркерами, пригодными, прежде всего, для идентификации генотипов Их преимущественно кодоминантное наследование позволяет отличать гомо- и гетерозиготные растения Это имеет большое значение для раннего распознавания ложных гибридов сои, что позволяет существенно экономить время, при создании новых селекционно-значимых исходных форм

Цель работы. Целью работы являлось создание системы маркеров пригодной для идентификации и паспортизации генотипов сои на основе молекулярно-генетического полиморфизма микросателлитных локусов ДНК В связи с этим для выполнения работы были поставлены следующие задачи

1 Оптимизировать условия проведения ПЦР-анализа ДНК для образцов сои

2 Апробировать праймеры на микросателлитные последовательности ДНК сои

3 Оценить степень полиморфизма микросателлитных локусов ДНК сои и создать систему маркеров для дифференциации сортов сои селекции ВНИИМК

4 Составить на основе созданной системы микросателлитных маркеров генетические формулы сортов сои селекции ВНИИМК

5 Определить тлп наследования выявленных полиморфных локусов ДНК и выделить пригодные для идентификации гибридов сои Научная иовшна В результате проведенных исследований установлен уровень полиморфного информационного содержания 10 микросател-литных локусов Д11К у 58 генотипов сои разного происхождения Показана степень генетического родства этих генотипов на основе полиморфных локусов Выделены 9 микросателлитных локусов ДНК с уровнем полиморфизма, пригодным для молекулярно-генетической дифференциации изученной группы 1еногипов, в гом числе 24 сортов сои селекции ВНИИМК Впервые предложена система маркеров и составлены молекулярно-генетические формулы 24 сортов сои селекции ВНИИМК на основе 9 полиморфных микросателлитных локусов ДНК Установлен тип наследования 9 полиморфных микросателлитных локусов ДНК гибридов сои в Р) Выделены три микросателлитных локуса ДНК с кодоминантным наследованием, предложенные к использованию в качестве маркеров для идентификации гибридов сои селекции ВНИИМК

Практическая нгачимость работы. Предлагаемая маркерная система на основе микросателлитных локусов ДНК позволяет дифференцировать гено1ипы сои, выявлять генетическую однородность сортов Показана перспективность этой системы для идентификации, паспортизации и сертификации сортов сои Предложен способ идентификации гибридов сои Разработаны молекулярпо-генетические формулы сортов сои, которые можно использовать для их паспортизации и сертификации

Апробация работы Основные результаты исследований были представлены на международной научно-практической конференции «Современные проблемы научного обеспечения производства подсолнечника» посвященной 120-летию со дня рождения академика В С Пустовойта (ВНИИМК, Краснодар, 19-22 июля, 2006), 8-й региональной научно-практической конференции молодых ученых «Научное обеспечение агро-

промышленного комплекса» (Краснодар, 7-8 декабря, 2006), 4-й международной конференции молодых ученых и специалистов «Актуальные вопросы селекции, технологии и переработки масличных культур», посвященной 95-летию со дня основания ВНИИМК (Краснодар, 27-29 марта, 2007), 7-й молодежной конференции «Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии» (Москва, 4 апреля, 2007), VIII съезде Украинского общества генетиков и селекционеров им Н И Вавилова (Алушта, Украина, 24-28 сентября, 2007), II Вавиловской международной конференции (Санкт-Петербург, 26-30 ноября, 2007)

Публикации по теме диссертационной работы. По материалам диссертации опубликовано 10 научных работ, в том числе в реферируемых изданиях, утвержденных ВАК - одна

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, изложения и обсуждения результатов, выводов и списка литературы Работа изложена на 107 страницах, содержит 16 таблиц и 32 рисунка Список литературы включает 176 наименований, в том числе, 85 иностранных авторов

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Исследования проводились с 2005 г по 2008 г в лаборатории иммунитета и электрофореза ЦЭБ ВНИИМК

Для идентификации и создания молекулярно-генетических паспортов были изучены 61 образец, культурной и дикорастущей сои из коллекции ВНИИМК и ВИР В работе по изучению наследования микросателлитных локусов использовались 11 гибридных комбинаций F| созданные отделом селекции сои ВНИИМК

Для выделения ДНК использовали проростки семян сои, полученные путем инкубации в рулонах фильтровальной бумаги в течение 7-ми суток

при комнатой температуре или фрагменты зеленых листьев с растений, выращенных в поле или камере искусственного климата

Выделение ДНК проводили по модифицированному методу Saghai-Maioof (1984) Концентрацию выделенной ДНК в полученном препарате определят визуально по интенсивности свечения окрашенной бромистым гтндием ДНК в 1% агарозном геле (Остерман, 1981)

Для амплификации выделенной ДНК были использованы I I SSR-праймеров, отобранных из литературных источников (Morgante et al, 1995, Rongven et al, 1995, Ilossam et al, 2000) Пары праймеров были синтезированы фирмой ЗЛО«Стиол», Москва

Полимеразную ценную реакцию проводили в объеме реакционной смеси 25 мкл содержащем 67 мМ ipnc- MCI, рН8 8, 16,6 мМ сульфата аммония, 1.5-3 мМ MgC12, 0 01% Tween 20, rio 02 мМ дезоксирибонуклео-зидфосфатов, по 10 пкМ праймеров, 10 нг матричной ДНК и 1 единицу ре-комбинантпой гермосгабильной ДНК полимеразы производства Госнииге-негика (Москва) Амплификацию проводили в приборе Терцик (ДНК-технология, Россия)

Для проведения полимеразной цепной реакции применяли следующие температурные режимы начальная денатурация при 96°С в течении 2 мин, следующие 32 цикла 30 с - денатурация при 94 °С, 40 с - отжиг праймера при 45-60°С (в зависимости от праймера), I мин - элонгация при 70°С, заключительная элонгация при 70 °С в течении 2 мин.

Электрофорез продуктов амплификации проводили в агарозном геле (2% агароза, ГАЕ-буфер, с добавлением 2мкл BiEt) с использованием камеры для горизонтального электрофореза (SE I, ДНК-технология, Россия)

Документировали результаты электрофореза с помощью видеосистемы (ДНК-технология, Россия) с программным обеспечением Gel lmager-2

Размер аллелей микросателлитных локусов определяли с использованием программы Gel-Pro Analyzer 3 I Статистическую обработку резулыа-

тов и построение дендрограмм проводили с помощью кластерного анализа методом Уорда в программе STATISTICA 6 О

Глава 3. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ 3.1. Апробирование и подбор оптимальных условий для анализа микросателлитных последовательностей ДНК генотипов сои

При создании системы маркеров на основе микросателлитных локу-сов ДНК первоначальным этапом работы является проведение предварительных экспериментов по оптимизации методики ПЦР-анализа

В ходе работы выяснилось, что в качестве материала для выделения ДНК сои можно использовать зеленые листья растений любой фазы развития Но наиболее пригодный материал для выделения ДНК - это примор-диальные листья 5-7 дневных проростков, либо кончики корешков длиною 1-1,5 см, так как проростки можно вырастить в лабораторных условиях в любое время года

Для использованных, одиннадцати пар праймеров, была вычислена теоретическая температура отжига Но, как правило, она является приблизительной и требует оптимизации Экспериментально были подобраны оптимальные температуры отжига Реакции ПЦР проводились по четырем программам с разными температурами отжига 45°С, 50°С, 55°С, 60°С

Известно, что чем выше температура отжига, тем меньше вероятность неспецифичного связывания праймера с матричной ДНК, т. е снижение температуры отжига ведет к гибридизации праймера с не полностью комплементарной ему последовательностью нуклеотидов При этом могут появляться дополнительные, невоспроизводимые фракции ДНК

В таблице 1 показано сравнение теоретических и экспериментальных температур отжига для выбранных праймеров При экспериментально подобранных температурах практически со всеми праймерами количество

продуцируемых фракций равно количеству полиморфных или разница между ними минимальна

При работе с молекулярными маркерами для селекционных задач важным фактором является время, затрачиваемое на проведение анализа Поэтому для каждого праймера было подобрано свое время проведения электрофореза

Таким образом, была оптимизирована методика выделения ДНК из листьев и проростков сои Подобраны оптимальные условия амплификации ДНК и электрофоретического разделения продуктов ПЦР с одиннадцатью парами праймеров, фланкирующих микросателлитные последовательности ДНК В результате два праймера были исключены из работы (Ба143 и 138сЮ4), а остальные в дальнейшем использовались для идентификации и паспортизации сортов и гибридов сои

Таблица 1 - Оптимальные температуры отжига для праймеров, фланкирующих одиннадцать микросателлитных локусов

Локус Температура отжига (С°) Количество продуцируемых фракций Количество полиморфных фракций

теоретическая экспериментальная

БаП 1 60 60 4 4

Бай 2 63 60 2 2

Бай 5 58 55 4 4

8ай_9______ Биург 1 61 45 5 5

68 60 3 2

Бо^у 2 66 55 2 2

I 70 60 6 4

8а136 72 55 3 3

Ба143 64 55 5 2

БоуИзрПб 67 60 4 3

138сШ4 60 60 3 0

3.2. Полиморфизм сортов сои по микросателлитным локусам

Поскольку соя является самоопыляющейся культурой, предполагается, что культивируемые сорта генетически однородны. Однако бывают исключения. Для проверки предположения о генетической однородности сортов был исследован внутрисортовой полиморфизм сортов сои селекции ВНИИИМК. Для этого были выбраны два сорта Фора и Лада и проведем анализ ДНК, выделенной отдельно из 10 проростков, по девяти микросател-литным локусам.

У сорта Фора внутрисортовой полиморфизм отсутствовал по всем 9 локусам. А сорт Лада по четырем локусам оказался неоднороден, что свидетельствуете его внутрисортовом полиморфизме (рис. 2).

12 3 4 5 6 7 8 9 10 М 11

Рисунок 2 - Фореграмма продуктов амплификации ДНК сорта сои Лада по локусу Salt 5. Дорожки 1-10 ДНК отдельных растений, 11-смесь ДНК, М маркер молекулярного веса 100 bp DNA [.adder

При создании молекулярно-генетического паспорта сорта сои требуется учитывать внутрисортовой полиморфизм. Но паспортизировать сорта по выборке из 10 индивидуальных растений не представлялось возможным по техническим причинам. Поэтому в целях экономии времени, ресурсов и соответственно стоимости анализов на примере сорта Лада был проведен эксперимент по оптимизации количества необходимых ПЦР для создания паспорта сорта. В результате было установлено, что при наличии 30% и более «нетипичных» растений на фореграммах выявляются две фракции (рис.2, дорожка 11).

Таким образом, мри создании молекулярио-генетического паспорта сорта сои целесообразно анализировать смесь ДНК не менее 10 растений Если же па фореграмме обнаруживаются двойные фракции, при необходимой и следует выполнять анализ ДНК отдельно по каждому растению чтобы определить аепень внутрисортового полиморфизма

3.3. Анализ гснешчсского разнообразия коллекции генотипов сон на основе полиморфизма микросателлитиых локусов

Для кучьтурной сои высокий уровень полиморфизма удалось обнаружить только по микросателлитным локусам (Keim et al, 1989, Глазко, 2000) Этим и определяется ценность данного метода для оценки генетического разнообразия и достоверной идентификации сортов

Вся изученная коллекция генотипов была проанализирована по 9 локусам (табл2) Дискриминационные возможности этой маркерной системы были оценены отдельно для трех групп образцов сои Это - сорта селекции ВНИИМК, сорта и линии других Российских и зарубежных селекцентров и образцы полукультурной и дикорастущей сои (G gracilis) и (G soya)

Таблица 2 - Характеристика исследованных микросателлитиых локусов

Локус Повтор Последовательности фланкирующих праимеров 5'-3' Молекулярный вес (п и )

Satt 1 (ATT),, t AG 1 ЛС Л TAG A 1Л 1 1А ЛЛС) ГС 1 г ЛЛЛ rGA IGAACG 1С.ААТГЛП 141-150

Sdtt2 (AAT),« i АЛ1 ЛА1 GIGGAA ЛС ГАЛЛ 1GG г IAA Ki 1 ОС С 1Л1 СП TOI С П 140-152

Satt5 (ГАА)21 1 IАI С С I AG Л GAA GAA С1Л Л АЛ АЛ г G 1С GAI 1AGC.C 1 ICiA АЛ I Л 157-177

Satt9 Soyprl (AAT)I2 (ТАТЬ 1 Al 1 ACI AGACiAAAII AGI 1 IЛ г С П АС T AGG С. ГА 1 IA АС С С ГГ 1 (GAAGAGÛ ACG1GC С ЛА Л 1 Г г G1 1 ACiA АЛА С К ГССССЛСЛС 142-221 163-188

Soyg>2 Satl (АТ)Ч(АТТ)6 (АТ)п I АЛЛ Л I 1 GAA AG I Ci 1С АСАСССС г 1 IA АЛЛТС G А I Г АЛ1 1GGCAIGA 1 С IOGTGGAC ТАЧ fGA 1А( ОА( С г ЛЛС IGC GAAGAl ЛС [ \С С СТГС 167-175 188-235

Sat36 (AT),, г ллл g ic л i а лс т CiCiC лс i а л agi : г г СЛАСЛГЛЛСЛЛ! AAI АЛЛ ГЛ1 AGCTC 115-185

Soyhsp 176 (A-Oís 1 Г ОI GGG С С А С ЛЛ ЛЛС СЛ А 1 ло 1 CGI лее, ГТС IACJCIA С, ГС 11С 118-135

3.3.1. Анализ генетического разнообразия сортов сои селекции ВНИИМК

Результаты амплификации ДНК 24 сортов сои селекции ВНИИМК показали, что из девяти изученных 88Я-локусов восемь оказались лолиал-лельными, а один - 8оу»у2 мономорфным. Всего в этой группе генотипов было выявлено 26 аллелей. Среднее значение индекса полиморфного информационного содержания составило 0,50.

Аллели ЗБИ-локусов представлены на фореграммах фрагментами ДНК разного молекулярного веса (длины пар нуклеотидов). Нумерацию аллелей по каждому локусу проводили следующим образом: фрагмент ДНК с максимальным значением молекулярного веса обозначали цифрой I и далее по мере уменьшения молекулярного веса цифрами 2, 3, 4, 5 (рис. 3, табл. 3).

■ММ

ЩШшя

1 2 3

5 6 7

9 М

4 4 ЛЙР

М 1 2 3 4

Рисунок 3 - Фореграмма продуктов амплификации ДНК сортов сои по локусу Satt9. Дорожки 1-9 фрагменты ДНК сортов, М - маркер молекулярного веса 100 bp DNA Ladder

Рисунок 4 - Фореграмма продуктов амплификации ДНК сортов сои по локусу Satt 1. Дорожки 1-4 фрагменты ДНК сортов, М - маркер молекулярного веса 100 bp DNA Ladder

У сортов сои Вилана и Лада, по нескольким локусам было обнаружено по две фракции разного размера (рис. 4), их обозначали двумя цифрами через запятую (табл. 3).

Таблица 3 - Полиморфизм микросателлитных локусов ДНК сортов сои из разных селекцентров____

Copra* Локус :ы Soylisp 176

Sattl Sait2 Satt5 Satt9 Soyprl Satl Sat36 Soygy2

Williams 2 2 4 5 1 1 2 3 2

Hood-75 2 2 2 1 2 1 1 3 2

T-2I5 4 1 2 4 2 4 1 3 1

Т-201 1 1 4 1 ] 2 2 3 2

Stine 52 2 1 4 5 2 2 1 3 2

Stine Ol Aldana Goldor 2 3 1 2 2 2 4 1 3 5 4 5 2 2 ~ 1 1 "3 1 1 2 * 2 3 3" ~ 2 ~2 "l

Y leso 2 2 1 5 2 3 1 3 2

Petit Jaune de Hongrie -> j 2 4 1 1 3 2 3 2

Bomax 2 2 3 5 1 1 2 2 2

Е-шен-доу 4 1 2 4 2 4 2 3 Г

San 2 1 2 5 2 2 1 3 2

Sepideh 2 1 3 5 1 1 1 3 2

Sahar 3 1 1 1 2 2 1 3 2

Safi-Abad 1 "1 3 2 2 5 2 2 2 3 2

Shimabara wase 1 2 1 1 1 1 2 2 2

Orinoqua 3 2 2 4 2 1 1 3 2

Юг-30 3 2 2 5 2 3 2 3 2

Офелия Припять 2 2 1 2 ~ 1 2 1 5 2 I 2 2 2 2 3 " 2 2 - y -

Ланцетная 2 2 1 2 2 2 2 3 2

Сибниисхоз 6 1 2 3 1 2 1 2 3 2

Приморская 56 1 1 4 3,5 1 2 2 3 2

К-10641 3 2 1 4 2 3 2 3 1

Куба 2 2 3 I 2 1 2 3 2

Селекта 301 4 2 2 1 1 1 2 3 2

Кубанская 4958 4 2 3 5 1 4 2 _ 2

сграиа-мроишодшсльсоргатабл 1, 11

Для изученных сортов сои селекции ВНИИМК были получены уникальные наборы аллелей и составлены молекулярно-генетические

паспорта (табл 4) Большими буквами латинского алфавита был обозначен код локуса, а нижний индекс - аллельное состояние данного локуса

Таблица 4 - Формулы сортов сои селекции ВНИИМК

Сорт Формула*

Лань АгВзОАЕ^СзНз

Лира А^САЕ^СзИз

Фора А2В1С202Е|Р4С|Н1

Валента А^АВДР^Н.

Дельта АзВгОАЕ^СзН,

Парма А^С^Е^гН;,

Рента АзВАОгЕ^гСгНз

РВБ АзВгСзО^.РзСгНт

РВФ АзВгСгОзЕ.РгОзН,

Веста АгВ.СзВД.РАНз

Вилана А-,А4В2С201Е1Р2СгН1

Лакта А2В2С202Е,Р,С2Н,

Ника А2В2С20,Е2Р1С2Н1

Дива АЛС^Е,^^

Диана АзВ^зОгЕ^зСгНт

Памелла Л^САБ^Н,

Д-6 А^зС^зЕгР^гНг

Д-4 А,В2С,О,Е2Р2О2Н2

Альба А2В2С201Е2Р4С2Н1

Трембита А,В2С40,Е2РзС2Н2

Лиана А^С^Е^О,^

Лада А1В2С1С2О4Е2Р2О2Н2

Б-2 АгВАО^^^гН,

Дуар (ВНИИМК,Армавир) А4В2С1О|Е1Р2О2Н1

* Примечание код локуса А-За111, В-Яаи!, С-$аП5, В-Хай9, Е-$оург1,

Г-ЯаИ. С-ЯмЗб, Н-ЬсфрПб

Для всех выявленных аллелей по каждому локусу были вычислены частоты их встречаемости в изученной выборке сортов (рис. 5 и 6).

80

70

£

ж 60

ь

о

S ЬО

4!

ГО

Ф 40

р,

Ь

СЗ

га 30

о

& т 20

10

0

8,3

58,S

20,8

37.5

20,Я

12,5

12,5

A1 А2 A3 А4 B1 В2 CI С2 СЗ С4 01 D2 D3 D4 D5 Аллели

A-Sattl B-Satt2 c-satts о sans

Рисунок 5 - Частота встречаемости аллелей микросателлитных локусов БаШ, ЯаИ2, 8ай9 у сортов сои селекции ВНИИМК

'is, а

4.2 « 4,2

кт И ш»

F3 Я4 61

А/т ели

95,8

70,8

И 2

нз

E-Soyprl F-Satl G-Sat36 H-Soybspl76

Рисунок 6 - Частота встречаемости аллелей микросателлитных локусов Soyprl, Sail, Sat36, Soyhspl 76 у сортов сои селекции ВНИИМК

У четырех локусов Satt2, Satt5, Satl, Sat36, Soyhspl76 выявлялись аллели с частотой встречаемости более 50% (аллели - В2, С2, F|, G2 и H!) Эго может свидетельствовать об относительной генетической близости сортов, создаваемых во ВНИИМК, что, по-видимому, является следствием того, что сорта создавались на основе небольшого числа исходных популяций

3.2 Анализ генетического разнообразия сортов сои из разных селекцентров

Анализ 28 сортов сои из разных российских и зарубежных селекцентров по девяти микросателлитным локусам показал, что в этой группе генотипов полиморфны все локусы Всего было выявлено 27 полиморфных аллелей Локус Soygy2 в данной коллекции полиморфен, у него обнаружено 2 аллеля Среднее значение PIC, гак же как и у сортов селекции ВНИИМК составило 0,50

В этой группе генотипов не было получено идентичных наборов аллелей по 9 изученным микросателлитным локусам На основании этих данных для каждого сорта был создан индивидуальный молекулярно-генечический паспорт, по аналогии с сортами селекции ВНИИМК (табл 5)

В этой группе сортов по локусу Satt9 редкими оказались аллели D2 (Ланцетная) и D3 (Приморская 56) Это сорта российской селекции У иностранных сорзов эти аллели не выявлены А у сортов селекции ВНИИМК они имели частоту встречаемости 19,2% и 34,6% соответственно (табл 4. рис 5,6) Эти аллели, по-видимому, могут характеризовать общий тип сорта сои селекции ВНИИМК

Таблица 5 - Формулы сортов сои разных селекцентров

Сорт Формула*

Williams (США) A2B2C4DsEI F,G2HII2

Hood-75 (-//-) A2B2C2D ] E2F1G1 H-j 12

T-215 (-//-) A4B1C2D4E2F4G1H3I1

T-201 (-//-) AiBiGAE^Gzbhh

Stine 52 (-//-) AîB^DjfcFîGMb

StineOI (-//-) AZBZC^DJEÎF^IH,^

Aldana (Польша) A1B2CiD4E2F,G2H3I2

Goldor (Франция) A1B2QD5E1F1G2HH2

Yieso (-//-) A2B2C,D5E2F-,G,Hil2

Petit Jaune de Hongrie (-//-) A-,B2C4DlE,F1G2H3l2

Bomax (Канада) A2B2CjD5E,F,G2H2I2

Е-шен-доу (Китай) A4BIC2D4E2F4G2H,I,

Sari (Иран) A2B,C2D4E2F2G,H3I2

Sepidell (-//-) A2B1C3D5E1F1G1H1I2

Sahar (-//-) A-,B,CAE2F2G,H3I2

Safi-Abad 1 (-//-) A^BADsFjFzG^h

Shimabara wase (Япония) A,B2CIDIE,FIG2H2I2

Orinoqua (Бразилия) A1B2C2D4E2FIG1H3I2

Юг-30 (Украина) a1b2c2d5e2f3g2h1i2

Офелия (-//-) a2b,c,d,e2f2g2h3i2

Припять (Белоруссия) A2B2C2D5E,F2G2H2l2

Ланцетная (Россия, Орел) a2b2c1d2e2f2g2h-1i2

Сибниисхоз 6 (Россия, Омск) AtB^D^F^H^

Приморская 56 (Приморский край) A,B,C4D3D5E,F2G2H312

Селекта A4B2C2DiEiFiG2H312

К-10641 (ВИР) A1B2CiD4E2F3G2H31|

Кубанская (КОС ВИР) A4B2C1D5E|F4G2H2I2

Куба (-//-) À2B2C1D,E2FlG2H-,b

* Примечание код локуса A-Satt 1, B-SatÛ, C-Sall5, D-Satl9, E-Soyprl, F-SatI, G-Sal36, H-Soyhspl76, !-Soygy2

3.3 3. Полиморфизм микросагеллитных локусов ДНК дикорастущей сои

Дискриминационный потенциал описанной выше маркерной системы изучался в выборке дикорастущих генотипов сои В эту группу вошли три образца, принадлежащих дикорастущему виду G soya и промежуточному между дикорастущей и культурной соей подвиду G gracilis

В этой выборке генотипов всего было выявлено 25 аллелей Среднее значение PIC , было немного выше, чем в обеих группах культурных сортов О, 52

По двум локусам Soygy2 и Soyhspl76 выявлены аллели, не встречающиеся у культурных сортов Это аллель 3 в локусе Soygy2 и аллель 1 в локусе Soyhspl76 Несмотря на достаточный дискриминационный потенциал изученной маркерной системы, наборы аллелей у дикорастущих генотипов Соя-93 и Соя-133 оказались идентичны (табл 6)

Таблица 6 - Полиморфизм микросателлитных локусов ДНК дикорастущих генотипов сои_______

Генотипы Sattl Satt2 Satt5 Satl9 Локус Soyprl -Ы Satl Sat36 Soyhsp 176 Soygy2

К-4947 (С gracilis) 2,4 1 2 1 2 2 2 ! 1

К-5683 (Gracilis) 2 1 3 4 2 4 2 3 1

К-5142 (G gracilis) К-1007(G soya) Соя-93 (G soya) " 2 4 4 2 1 2 2 1 1 5 3 2 2 1 2 4 4 3 1 2 2 1 3 2 2 2 3

Соя-133 (G soya) 4 2 1 2 2 3 2 2 3

3.3.4. Анализ исходных сорит и их полиплоидных и реплоидных форм по микросателлитным локусам

При создании разнообразного исходною селекционного материала сои в селекционной практике используется такое явление, как полиплоидная рекомбинация генома

Анализ микросазеллитных локусов ДНК у исходных сортов Вилама и Фора, а также их тетраплоидных и реплоидных форм показал, что всего из девяти микросателлитных локусов в процессе полиплоидной рекомбинации генома изменения произошли в шести У трех локусов 8оу§у2, 5а136 и БоуЬврПб не произошло изменений ни у тефаплоида, ни у реплоидов (табл 7)

Таблица 7 - Полиморфизм микросателлитных локусов у исходных

11ломд_ Локус

Обра ii.ii НОС11. Ча((2 Ча«5 Ьа119 So}prl 4,1136 4(.>у1ьр 176

Вилапа 2н=40 3,4 1 2 1 1 2 2 2 3

Ви мил |Ир.ШЛОИЛ 2п=80 1 2 4 5 I 2 2 2 3

Вилли рсилоид 2п—40 2 2 2 1 2 2 1 2 3

Форс! 2п=40 2 1 2 2 1 2 2 2 3

С11-1422-1461 2п=40 2 2 2 2,4 I Г 2 4 2 3

Возможно, это связано с положением микросателлитного локуса в хромосоме Известно, что при сцеплении локуса с центромерой расщепление идет по хромосомному типу, з е гомологичные хромосомы ведут себя как случайно комбинирующиеся единицы При отсутствии

сцепления случайно комбинируются не хромосомы, а хроматиды (Инге-Вечтомов, 1989)

Полученные данные показали, что микросателлитные локусы в процессе полиплоидизации и затем реплоидизации претерпевают изменения, в частности, увеличивается или уменьшается число повторов По-видимому, это является еще одним подтверждением гипотезы о полиплоидной рекомбинации генома.

3.3.5 Анализ дискриминационного потенциала маркерной системы для коллекции генотипов сои

Дискриминационный потенциал изученной маркерной системы оказался достаточно высоким для тою, чтобы использовать ее для идентификации и паспортизации сортов культурной сои Были идентифицированы 52 сорта, для каждого из них получены уникальные наборы аллелей, на основании которых составлены их генетические формулы

По данным о частоте встречаемости аллелей и их размере была проведена оценка степени генетического родства изученных генотипов сои Для этой цели был использован кластерный анализ (метод Уорда) (рис 6) Анализ полученного иерархического дендрита позволил выделить в выборке исследованных генотипов сои два основных кластера

Как уже отмечалось выше, не удалось различить два дикорастущих генотипа Соя-93 и Соя-133, атакже сорт Ника селекции ВНИИМК и реплоидную форму, полученную из сорта Вилана. Генетическая дистанция между ними по изученным локусам близка к 0 (рис 6)

Tree Diagram for 61 Variables Ward's method Euclidean distances

35 30 25 a, 20

0

1 15 b CD

S1 10

.ьг с

-> 5 0

Рисунок б - Дендрограмма генотипов сои

3.4. Анализ типа наследования микроеателлнтных локгусов

В селекции сои при искусственной гибридизации необходимо контролировать образование гибридов. Идентификация гибридов во ВНИИМК в настоящее время проводится либо согласно разработанной Мякушко с соавторами (1979) методике, либо рулонным способом по цвету гипокотиля (Трембак, 2001). Первая подразумевает посев семян с пониженной плотностью в поле или в теплице, вторая - проращивание семян в рулонах фильтровальной бумаги в лабораторных условиях. При этом должно соблюдаться основное условие - родительские формы должны отличаться по морфологическим признакам, которые легко различимы визуально.

Микросателлитные маркеры, если они имеют кодоминантный тип наследования, позволяют легко выявить гибридность в скрещиваниях, когда родительские формы не отличаются по морфологическим признакам. Из

литературных источников известно, что SSR - локусы имеют, как правило, коломинантный тип наследования (Кожухова и др., 2004; Солоденко и др., 2004). Однако нередки исключения. Учитывая это, был проведен анализ типа наследования всех изученных микросателлитных локусов.

Для этого было отобрано 12 гибридных комбинаций родительские формы, которых отличались друг от друга размером аллелей и проведены реакции амплификации ДНК родительских форм и гибридов F,

Анализ наследования показал, что шесть изученных локусов Satt2, Salt5, Sat I, Soygy2, Sat36 и Soyhspl76 не могут использоваться для распознавания ложных гибридов, так как наследуются доминантно. К тому же, из них три локуса: Soygy2, Sat36 и Soyhspl76 показали самый низкий уровень PIC, то есть большинство использованных в скрещиваниях родительских форм имели аллели одного размера, что не позволило их различить.

Три локуса Sattl, Satt9 и Soyprl имели кодоминантпый тип наследования. У всех гибридов на фореграмме присутствовали как отцовская, так и материнская фракции ДМ К (рис.7).

1 2 3 4 5 6 7 8 9

Рисунок 9 - Электрофорегические спектры продуктов амплификации ДНК сортов и гибридов сои по локусу 8ай9. Дорожки: I - Вилана; 2 - Р, (Вилана х Валенга); 3 - Валента; 4 - Офелия; 5 - Р, (Офелия х РВБ); 6 - РВБ; 7 -Дива; 8 - Р, (Дива х РВФ); 9 - РВФ

Несмотря на то, что выявлено только три локуса с кодоминантным наследованием, с их помощью можно было оценить все двенадцать,

анализированных гибридных комбинаций Таким образом, их можно использовать для определения гибридности потомств, при создании гибридов сои Благодаря проведенным исследованиям, мы можем предложить селекционерам еще один метод идентификации гибридов

Выводы

1 Для ПЦР определены оптимальные температуры отжига 11 пар праймеров на микросателлитные последовательности ДНК сои Для праймеров Satt!, Satt2, Soyprl, Soygy2, Sat36 Soyhspl76 и 138ct04 оптимальные температуры отжига в сравнении с теоретически ожидаемыми составляют 60 °С, Для Satt5 и Satl - 55°С, для Sat43 - 50°С, для Satt9 -45 °С

2 Из одиннадцати пар праймеров, фланкирующих микросателлитные последовательности ДНК сои, 9 выявили полиморфизм у 52 изученных культурных сортов сои разного происхождения

3 Количество выявленных полиморфных аллелей в изученной группе генотипов по разным локусам варьировало от 2 до 5, Общее количество полиморфных аллелей - 29, среднее - 3,2 на локус

4 Уровень полиморфного информационного содержания (PIC) для изученной группы культурных сортов составил - 0,50, для дикорастущих - 0,52 Дискриминационный потенциал созданной маркерной системы на основе 9 полиморфных микросателлитных локусов ДНК определен как достаточный для четкой дифференциации сортов сои селекции ВНИИМК

5 По принципу наибольшего сходства при кластерном анализе изученные генотипы сои группируются в два основных кластера При этом сорта селекции ВНИИМК попадают в оба кластера, а пары генотипов Соя-93 и Соя-133, Ника и RP Вилана имеют высокий уровень сходства

6 Создана маркерная система на основе 9 полиморфных микросателлитных локусов ДНК и составлены молекулярно-генетические формулы 52 генотипов сои, в том числе, 24 сортов селекции ВНИИМК Предложено использовать эти формулы, как соответствующие паспорта для идентификации и сертификации сортов сои

7 Установлен тип наследования полиморфных фракций 9 микросателлитных локусов ДНК у гибридов сои первого поколения Шесть локусов Satt2, Satt5, Soygy2, Satl, Sat36 и Soyhspl76 имеют доминантный тип наследования, а три Satt I, Satt9 и Soyprl -кодомипантный

8 Локусы с кодоминантным наследованием, апробированные на выявление ложной гибридизации, показали эффективность в идентификации гибридов сои селекции ВНИИМК Предложен метод определения гибридности селекционного материала в Ft

9 Определен уровень внутрисортового полиморфизма у сортов сои Фора и Лада селекции ВНИИМК Показано, что Фора - неполиморфен, а сорт Лада является генетически неоднородным

Рекомендации для селекционной практики

1 Применять в селекционном процессе метод идентификации гибридов сои с использованием трех микросателлитных локусов ДНК Sattl, Satt9 и Soyprl, имеющих кодомипантный тип наследования

2 Использовать созданную маркерную систему на основе 9 полиморфных SSR-локусов ДНК для паспортизации сортов сои селекции ВНИИМК и определения их генетической однородности

3 Применять для паспортизации и сертификации сортов сои селекции ВНИИМК молекулярно-генетические формулы, созданные на основе полиморфных микросателлитных локусов ДНК

Список работ, опубликованных по материалам исследований

1 Рамазанова С Л Перспективы использования молекулярных маркеров в идентификации сортов сои // Сборник докладов 3 международной конференции молодых ученых и специалистов «Актуальные вопросы селекции, технологии и переработки масличных культур» - Краснодар, 28-30 марта2005г-С 102-106

2 Рамазанова С А, Гучетль СЗ, Челюстникова ТА, Антонова ТС Полиморфизм микросателлитных локусов ДНК сортов сои селекции ВНИИМК // Сборник докладов международной научно-практической конференции « Современные проблемы научного обеспечения производства подсолнечника» посвященной 120-летию со дня рождения академика В С Пустовойта - Краснодар, 19-22 июля 2006 -С 234-239

3 Рамазанова С А Генетическое разнообразие сорюв сои // Ма1ериалы 8-й региональной научно-практической конференции молодых ученых « Научное обеспечение агропромышленного комплекса» - Краснодар, 7-8 декабря 2006 г - С 60-61

4 Рамазанова С А, Гучетль СЗ, Челюстникова ТА Использование анализа микросателлитных последовательностей ДНК в решении проблем селекции сортов сои // Сборник материалов 4-й международной конференции молодых ученых и специалистов «Актуальные вопросы селекции, технологи и переработки масличных кульгур», посвященной 95-летию со дня основания ВНИИМК -Краснодар, 27-29 марта 2007 г - С 233-242

5 Рамазанова С А Использование микросателлитных локусов ДНК для идентификации генотипов сои // Сборник материалов 7-й молодежной конференции «Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии» - Москва, 4 апреля 2007 г - С 31 -33

6 Рамазанова С А , Антонова Т С , Гучетль С 3, Челюстникова Т А Анализ микросателлитных локусов (SSR) ДНК для идентификации генотипов сои // Збфник наукових праць «Досягнення I проблеми генетики, селекцп та бютенологп» - Кжв, 2007 -Т2-С 279-283

7 Антонова Т С , Челюстникова Т А , Гучетль С 3 , Рамазанова С А Генотипирование подсолнечника и сои селекции ВНИИМК на основе микросателлитных маркеров // Генетические ресурсы культурных растений в XXI веке II Вавиловская международная конференция -Санкт-Петербург, 26-30 ноября 2007г - С 236-237

8 Рамазанова С А , Гучетль С 3 , Антонова Т С ДНК-генотипирование на основе SSR-маркеров Апрбирование и подбор оптимальных условий для Glycine max (L) Merr // НТБ ВНИИМК Масличные культуры - Краснодар, 2007 -№2(137) - С 78-80

9 Рамазанова С А Идентификация генотипов сои разного происхождения с использованием полиморфизма девяти микросателлитных локусов ДНК // Современные проблемы селекции и технологии возделывания сои Сб статей 2-й международной конференции по сое - Краснодар, 9-10 сентября 2008г -С 129-136

10 Рамазанова С А , Гучетль С 3, Челюстникова Т А , Антонова Т С , Мошненко Е.В Идентификация гибридов F| сои с использованием микросателлитных локусов ДНК // Современные проблемы селекции и технологии возделывания сои Сб статей 2-й международной конференции по сое - Краснодар, 9-10 сентября 2008г -С 137-141

Подписано в печать 26 09 2008 Бумага офсетная

Печать офсетная Формат 60x84 1/16

Уел печ п 1 Тираж 100 Заказ №605

Типография кубанского государственного аграрного университета 350044, г Краснодар, ул Калинина, 13

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Рамазанова, Светлана Алексеевна

ВВЕДЕНИЕ.

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1 Использование молекулярно-генетических маркеров для изучения генетического разнообразия растений.

1.2 Микросателлитные маркеры.

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

Глава 3. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ.

3.1 Апробирование и подбор оптимальных условий для анализа микросателлитных последовательностей ДНК генотипов сои.

3.2 Полиморфизм сортов сои по микросателлитным локусам.

3.3 Анализ генетического разнообразия коллекции генотипов сои на основе полиморфизма микросателлитных локусов.

3.3.1. Анализ генетического разнообразия сортов сои селекции ВНИИМК.

3.3.2 Анализ генетического разнообразия сортов сои из разных селекцентров.

3.3.3. Полиморфизм микросателлитных локусов ДНК дикорастущей сои.

3.3.4. Анализ исходных сортов и их полиплоидных и реплоидных форм по микросателлитным локусам.

3.3.5 Анализ дискриминационного потенциала маркерной системы для коллекции генотипов сои.

3.4. Анализ наследования микросателлитных локусов.

ВЫВОДЫ.

РЕКОМЕНДАЦИИ ДЛЯ СЕЛЕКЦИОННОЙ ПРАКТИКИ.

Введение Диссертация по сельскому хозяйству, на тему "Идентификация сортов сои с использованием молекулярно-генетических методов"

Актуальность темы. Соя - это культурное растение, по последней классификации, относящееся к семейству Бобовые (Leguminosae (Fabaceae)), подсемейству Мотыльковые (Papilionaceae), трибе Фасолевые (Phaseoleae), подтрибе Глициниевые (Glycininae Benth.), роду Соя (Glycine), подроду Soja, виду G.max, подвиду^р.) manshurica. (Зеленцов, Кочегура,2006).

В мировом производстве белка соя является ведущей зернобобовой культурой. Среди всех сельскохозяйственных культур ей нет равных по богатству и разнообразию содержащихся в зерне полезных химических веществ. Это самая высокобелковая культура из всех зернобобовых. Содержание его в зерне достигает 45%. Причем соевый белок наиболее близок по аминокислотному составу к животному и в то же время дешевле в 10-12 раз (Баранов, 2002; Петибская и др, 2001). В нем имеются все незаменимые аминокислоты в количестве достаточном, для того, чтобы заменить значительную часть белка животного происхождения. Это особенно актуально в связи с растущим населением планеты.

Вторым ценным компонентом соевого зерна является масло, содержание которого, в среднем, составляет 21,5 %. Из всех растительных масел соевое является самым биологически активным, так как содержит около 55% линолевой, 25% олеиновой и 8% линоленовой кислоты. Кроме этого, важно не только высокое содержание полиненасыщенных жирных кислот, но и оптимальное их соотношение (Петибская и др., 2001).

Благодаря своему уникальному составу, а так же экономичности, небольшой энергоемкости производства, универсальности применения, эта культура имеет значительный вес в национальных продовольственных программах ряда стран. В Краснодарском крае распространены сорта сои селекции ВНИИМК и возделывается на больших площадях. Ежегодно регистрируются новые улучшенные сорта. На современном этапе в успешной реализации селекционных программ большое значение имеет идентификация генотипов, поэтому актуальной задачей является паспортизация сортов, гибридов и исходных форм в соответствии с международными нормами.

Для сои характерно большое разнообразие морфологических признаков. С их помощью в настоящее время оценивают генофонд популяций, уровень изменчивости, генетическое разнообразие и др. Но иногда их бывает недостаточно для того, чтобы идентифицировать селекционный материал. Проявление морфологических признаков часто существенно зависит от условий выращивания. При этом фенотипическое выражение признака уже может не соответствовать нужному генотипу, что приводит к некорректным выводам. В результате, заключение о принадлежности данной партии семян или посева к тому или иному сорту можно сделать лишь с определенной долей вероятности. К тому же это требует дополнительных затрат времени и средств. Еще одним существенным недостатком морфологических маркеров является то, что многие из них полигенны по своей природе.

Наиболее удобными для описания генотипов являются молекулярно-генетические маркеры, то есть запасные белки, изоферменты и полиморфные фрагменты ДНК. Они в меньшей мере подвержены фенотипической изменчивости и, в большинстве случаев, имеют кодоминантный тип наследования. На их основе проводится биохимическая паспортизация сортов и гибридов многих сельскохозяйственных культур. Данные биохимической паспортизации можно использовать при регистрации сортов и гибридов, а так же для защиты прав селекционеров.

Кроме этого, для селекционеров большое значение имеет информация о степени генетического родства исходного материала, того разнообразия селекционных форм различного происхождения, которые используются в селекционном процессе. Молекулярно генетические маркеры — самый современный инструмент получения информации такого рода. Они позволяют классифицировать сорта, линии и селекционные формы в зависимости от их генетических взаимоотношений.

Еще одной задачей, которая успешно решается с использованием моле-кулярно генетических маркеров — это маркирование отдельных генов, контролирующих качественные признаки, и групп генов, контролирующих количественные признаки.

Соя во многом уникальная культура. Уникальна она и в том, что из всех типов молекулярно-генетических маркеров высокий уровень полиморфизма удалось выявить только по микросателлитным локусам (Глазко и др. 1999).

Микросателлиты представляют собой простые, наиболее доступные, удобные и относительно недорогие маркеры, пригодные, прежде всего, для идентификации генотипов. Их кодоминантный тип наследования позволяет отличать гомо- и гетерозиготные растения. Это имеет большое значение для раннего распознавания ложных гибридов сои, что позволяет существенно экономить время, при создании новых селекционно-значимых форм.

Сорта сои в настоящее время проходят регистрацию только на основании морфологических данных. Такую ситуацию нельзя признать удовлетворительной, так как существуют сорта неотличимые по морфологическим признакам. Микросателлитные маркеры позволяют дифференцировать биотипы, отличающиеся от исходных сортов или линий небольшим количеством генов, что не всегда заметно фенотипически.

Поэтому целью наших исследований является изучение молекулярно-генетического полиморфизма микросателлитных локусов сои и создание на этой основе системы маркеров пригодной для идентификации и паспортизации генотипов.

В задачи исследований входило:

1. Оптимизировать условия проведения ГЩР-анализа ДНК для образцов сои.

2. Апробировать праймеры на микросателлитные последовательности ДНК сои.

3. Оценить степень полиморфизма микросателлитных локусов ДНК сои и создать систему маркеров для дифференциации сортов сои селекции ВНИИМК.

4. Составить на основе созданной системы микросателлитных маркеров генетические формулы сортов сои селекции ВНИИМК

5. Определить тип наследования выявленных полиморфных локусов ДНК и выделить пригодные для идентификации гибридов сои.

Научная новизна исследований:

- установлен уровень полиморфного информационного содержания 10 микросателлитных локусов ДНК у 58 генотипов сои разного происхождения. Показана степень генетического родства этих генотипов на основе полиморфных локусов;

- выделены 9 микросателлитных локусов ДНК с уровнем полиморфизма, пригодным для молекулярно-генетической дифференциации изученной группы генотипов, в том числе 26 сортов сои селекции ВНИИМК;

- впервые создана система маркеров и составлены молекулярно-генетические формулы 26 сортов сои селекции ВНИИМК на основе 9 полиморфных микросателлитных локусов ДНК;

- установлен тип наследования 9 полиморфных микросателлитных локусов ДНК у гибридов сои Рь

- выделены три микросателлитных локуса ДНК с кодоминантным типом наследования, пригодные в качестве маркеров для идентификации гибридов сои селекции ВНИИМК.

Основные положения выносимые на защиту:

Впервые создана система маркеров и составлены молекулярно-генетические формулы 26 сортов сои селекции ВНИИМК на основе 9 полиморфных микросателлитных локусов ДНК;

Установлен тип наследования 9 полиморфных микросателлитных локусов ДНК у гибридов сои первого поколения: шесть имеют доминантный тип, три - кодоминантный.

Предложен способ определения гибридности у гибридов сои на основе трех полиморфных микросателлитных локусов с кодоминантным типом наследования.

Практическая значимость работы. Предлагаемая маркерная система на основе микросателлитных локусов ДНК позволяет надежно дифференцировать генотипы сои, выявлять генетическую однородность сортов. Показана перспективность этой системы для идентификации, паспортизации и сертификации сортов сои. Предложен способ идентификации гибридов сои. Разработаны молекулярно-генетические формулы культурных сортов сои, которые можно использовать для их паспортизации и сертификации.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 10 научных работ, в том числе в реферируемых изданиях, утвержденных ВАК - одна.

Апробация работы. Основные результаты исследований были представлены на международной научно-практической конференции «Современные проблемы научного обеспечения производства подсолнечника» посвященной 120-летию со дня рождения академика B.C. Пустовойта (ВНИИМК, Краснодар, 19-22 июля, 2006); 8-й региональной научно-практической конференции молодых ученых «Научное обеспечение агропромышленного комплекса» (Краснодар, 7-8 декабря, 2006), 4-й международной конференции молодых ученых и специалистов «Актуальные вопросы селекции, технологии и переработки масличных культур», посвященной 95-летию со дня основания ВНИИМК (Краснодар, 27-29 марта, 2007), 7-й молодежной конференции «Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии» (Москва, 4 апреля, 2007), VIII съезде Украинского общества генетиков и селекционеров им Н.И. Вавилова (Алушта, Украина, 24-28 сентября, 2007), II Вавиловской международной конференции (Санкт-Петербург, 26-30 ноября, 2007).

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, изложения и обсуждения результатов, выводов и списка литературы. Работа изложена на 107 страницах, содержит 16 таблиц и 32 рисунка. Список литературы включает 176 наименований, в том числе, 85 иностранных авторов.

Заключение Диссертация по теме "Селекция и семеноводство", Рамазанова, Светлана Алексеевна

выводы

1. Для ПЦР определены оптимальные температуры отжига 11 пар праймеров на микросателлитные последовательности ДНК сои. Для праймеров Sattl, Satt2, Soyprl, Soygy2, Sat36 Soyhspl76 и 138ct04 оптимальные температуры отжига в сравнении с теоретически ожидаемыми составляют 60 °С, Для Satt5 и Satl - 55°С, для Sat43 - 50°С, для Satt9 - 45°С.

2. Из одиннадцати пар праймеров, фланкирующих микросателлитные последовательности ДНК сои, 9 выявили полиморфизм у 52 изученных культурных сортов сои разного происхождения.

3. Количество выявленных полиморфных аллелей в изученной группе генотипов по разным л оку сам варьировало от 2 до 5, Общее количество полиморфных аллелей — 29, среднее - 3,2 на локус.

4. Уровень полиморфного информационного содержания (PIC) для изученной группы культурных сортов составил - 0,50, для дикорастущих — 0,52. Дискриминационный потенциал созданной маркерной системы на основе 9 полиморфных микросателлитных локусов ДНК определен как достаточный для четкой дифференциации сортов сои селекции ВНИИМК.

5. По принципу наибольшего сходства при кластерном анализе изученные генотипы сои группируются в два основных кластера. При этом сорта селекции ВНИИМК попадают в оба кластера, а пары генотипов Соя-93 и Соя-133, Ника и RP Вилана имеют высокий уровень сходства.

6. Создана маркерная система на основе 9 полиморфных микросателлитных локусов ДНК и составлены молекулярно-генетические формулы 52 генотипов сои, в том числе, 24 сортов селекции ВНИИМК. Предложено использовать эти формулы, как соответствующие паспорта для идентификации и сертификации сортов сои.

7. Установлен тип наследования полиморфных фракций 9 микросателлитных локусов ДНК у гибридов сои первого поколения. Шесть локусов Satt2, Satt5, Soygy2, Satl, Sat36 и Soyhspl76 имеют доминантный тип наследования, а три Sattl, Satt9 и Soyprl — кодоминантный .

85

8. Локусы с кодоминантным наследованием, апробированные на выявление ложной гибридизации, показали эффективность в идентификации гибридов сои селекции ВНИИМК. Предложен метод определения гибридности селекционного материала в Бь

9. Определен уровень внутрисортового полиморфизма у сортов сои Фора и Лада селекции ВНИИМК. Показано, что Фора - неполиморфен, а сорт Лада является генетически неоднородным.

РЕКОМЕНДАЦИИ ДЛЯ СЕЛЕКЦИОННОЙ ПРАКТИКИ

1. Применять в селекционном процессе метод идентификации гибридов сои с использованием трех микросателлитных локусов ДНК: 8ай1, Бай9 и 8оург1, имеющих кодоминантный тип наследования.

2. Использовать созданную маркерную систему на основе 9 полиморфных ЗБЯ-локусов ДНК для паспортизации сортов сои селекции ВНИИМК и определения их генетической однородности.

3. Применять для паспортизации и сертификации сортов сои селекции ВНИИМК молекулярно-генетические формулы, созданные на основе полиморфных микросателлитных локусов ДНК

Библиография Диссертация по сельскому хозяйству, кандидата биологических наук, Рамазанова, Светлана Алексеевна, Краснодар

1. Алексеенко А.Ю. Консерватизм глицинина в семенах сои культурной и дикой уссурийской / А.Ю. Алексеенко, В.И. Сичкарь, A.A. Мусатова, Е.А. Тимохина и др. // Генетика. 1985. - Т. 21, №7. - С. 1185-1191.

2. Алексеенко А.Ю. Полиморфизм запасных белков многолетней сои подрода Glicine / А.Ю. Алексеенко, Т.С. Седова, И.В. Николаев и др. // Генетика. 1987.- №1.-С.135-142.

3. Алпатьева Н.В. Характеристика староместных сортов озимой мягкой пшеницы по электрофоретическим спектрам высокомолекулярного глютенина / Н.В. Алпатьева, Н.К. Губарева // Аграрная Россия. 2002. -№3. - С.24-28.

4. Алтухов Ю.П. Полиморфизм ДНК в популяционной генетике / Ю. П. Алтухов, Е.А. Салменкова // Генетика 2002. - Т.38, №9. - С 11731195.

5. Анисимова И.Н. Идентификация генетического и селекционного материала подсолнечника по белкам семян. // Аграрная Россия. 2002. - №3.- С. 52-59.

6. Анискина Ю.В. Технология генотипирования культурных и дикорастущих форм Brassica на основе анализа полиморфизма микросателлитов: Автореф. дис. канд. биол. наук: 03.00.23 / ВНИИ с-х биотехн. РАСХН. Москва., 2006. - 24 с.

7. Антонова О.Ю. Анализ генетической стабильности образцов картофеля,сохраняемых в условиях in vitro / О.Ю. Антонова, Э.В. Трускинов, Д.В. Фролова, Т.А.Гавриленко // Аграрная Россия 2004. -№6.-С. 25-29.

8. Антонова О.Ю. Генетическая дифференциация сортов картофеля с использованием SSR-маркеров / О.Ю. Антонова, Н.А. Швачко, Л.И. Костина и др. // Аграрная Россия 2004. - №6. - С. 19-24.

9. Бальвинская М.С. SSRP-анализ молекулярно-генетического полиморфизма сортов ярового ячменя южно-украинской селекции / М.С. Бальвинская, М. Ruder, Ю.М. Сиволап // Доклады Росс. Акад. сельхоз. Наук. -2001. -№5. С.3-7.

10. Ю.Баранов В.Ф. Добрая культура. Научно-популярный очерк о сое / В.Ф. Баранов Краснодар.: 2002. - 69 с.

11. П.Белоконь М.М. Аллозимный полиморфизм Европейской кедровой сосны {Pinus cembra L.) в горных популяциях Альп и Восточных Карпат 1 М.М. Белоконь, Ю.С. Белоконь, Д.В. Политов и др. // Генетика. 2005. - Т.41, № 11. - С. 153 8-1551.

12. Брик А. Исследование генетического разнообразия сои (Glycine max L.) с помощью ПП-ПЦР анализа / А. Брик, Ю. Сиволап, В. Сичкарь // Молекулярно-генетические маркеры растений. К.: Тезисы докл. межд. конф. - 1996. - С.12-13.

13. Булат С. А. Полимеразная цепная реакция с универсальными праймерами для изучения геномов / С.А.Булат, O.K. Кобаев, Н.В. Мироненко и др. // Генетика. 1992. - Т.28, №5. - С.19-28.

14. Вартапетян А.Б. Полимеразная цепная реакция // Мол. биол.- -1991. -Т.25, №4 С.926-936.

15. Велишаева Н.С. Технология генотипирования картофеля и его дикорастущих сородичей на основе микросателлитного анализа: Автореф. дисс. канд. биол. наук: 03.00.23 / ВНИИ с-х биотехн. РАСХН. -М., 2006.-22 с.

16. Волкова С.А. Поиск источников устойчивости к пирикуляриозу риса с помощью молекулярных маркеров с целью использования их вселекции риса: Автореф. дисс. канд. биол. наук: 06.01.05 / ВНИИриса. -Краснодар, 2007. 15 с.

17. Воробьев Н.И. Методические рекомендации по использованию граф-анализа в исследованиях биосистем. Санкт-Петербург. Пушкин. -2005.-28 с.

18. Выделение гибридных растений сои по генетическим метчикам при искусственных скрещиваниях и спонтанном опылении / Методические указания // Ю.П. Мякушко, Н.Д. Лунин, Л. М. Лыгина, A.B. Кочегура. -М., 1979.-15 с.

19. Генетика культурных растений: зернобобовые, овощные, бахчевые // Всесоюз. акад. с.-х. наук им В.И. Ленина; Под ред. Фадеевой Т.С. и Буренина В.И. Л.: Агропромиздат, 1990. - 287 с.

20. Глазко В.И. Генетически детерминированный полиморфизм ферментов у некоторых сортов сои (Glicine max) и дикой сои (Glicine soja) // Цитол. и генетика. 2000. - Т.34, №2. - С.83-90.

21. Глазко В.И., Созинов И.А. Генетика изоферментов животных и растений. Киев: Урожай, 1993. - 526 с.

22. Гостимский С.А. Изучение организации и изменчивости генома растений с помощью молекулярных маркеров / С.А. Гостимский, З.Г. Кокаева, Ф.А. Коновалов // Генетика. 2005. - Т. 41, №4. - С.480-492.

23. Гречко.В.В. Молекулярные маркеры ДНК в изучении филогении и систематики // Генетика. 2002. - Т.38, №8. - С.1013-1033.

24. Гузенко Е.В. ДНК полиморфизм современных сортов льна масличного / Е.В. Гузенко, В.А. Лемеш, Л.В. Хотылева, О.В.Муравенко и др. //

25. Досягнення i проблеми генетики, селекци та бютехнологп. Зб1рник наукових прадь. Khïb: JIroc, 2007. - Т.2. - С.256- 260.

26. Гучетль С.З. Молекулярно-генетическая характеристика инбредных линий подсолнечника по изоферментным маркерам и ДНК-профилям / С.З. Гучетль, Т.А.Челюстникова, С.А.Рамазанова и др. // Науч. техн. бюллетень ВНИИМК. 2004. - Вып. 2(131). - С. 42-46.

27. Давоян Э.Р. Селекционно-генетическое изучение линий мягкой пшеницы с генетическим материалом Triticum miguschovae zir. Aegilops speltoiges taucch: Автореф. дисс. канд. биол.наук: 06.01.05 / КНИИСХ им. Лукьяненко Краснодар, 2004. - 26 с.

28. ЗО.Зеленцов C.B. Использование полиплоидной рекомбинации генома в увеличении полиморфизма у сои / C.B. Зеленцов // Доклады РАСХН. — 2002. №3. - С.3-5.

29. Зеленцов C.B. Современное состояние систематики культурной сои Glycine max (L.) Merrill I C.B. Зеленцов, A.B. Кочегура // Науч.-техн. бюл. ВНИИМК. 2006. - Вып. 134. - С.34-48.

30. Ефименко В.Г Полиморфизм микросателлитной ДНК и изучение генетических ресурсов кукурузы / В.Г. Ефименко, Н.Э.Кожухова, Ю.М. Сиволап // Цитология и генетика. 2005. - Т.39, №2. - С. 10-15.

31. Идентификация сортов и регистрация генофонда культурных растений по белкам семян / Под ред. В.Г. Конарева СПб.: ВИР, 2000. - 178 с.

32. Инге-Вечтомов С.Г. Генетика с основами селекции. Учеб. для биол. спец. ун-тов. -М.: Высш. шк., 1989. 591 с.

33. Ильницкая Е.Т. Молекулярное маркирование в селекции риса на устойчивость к пирикуляриозу. Автореф. дисс. канд. биол. наук: 06.01.05 / ВНИИ риса. Краснодар., 2007. - 24 с.

34. Использование ПЦР-анализа в генетико-селекционных исследованиях / Научно-методическое руководство // Под. ред. Сиволапа Ю.М. -Киев: Аграрна наука, 1998.- 156с.

35. Ковеза О.В. Выявление и картирование полиморфных RAPD-маркеров генома гороха ( Pisum sativum L.) / O.B. Ковеза, З.Г.Кокаева, Ф.А.Коновалов и др. //Генетика- 2005. Т. 41, №3. - С.341-348.

36. Кожухова Н.Э. Идентификация и регистрация генотипов кукурузы при помощи молекулярных маркеров / Н.Э. Кожухова, Ю.М. Сиволап // Генетика 2004. - Т.40, №1. - С.59-66.

37. Кожухова Н.Э. Прогнозирущий потенциал ДНК-маркеров в гетерозисной селекции кукурузы / Н.Э. Кожухова, Б.Ф.Вареник, Ю.М. Сиволап // Цитология и генетика 2005. - Т.39, №1. - С. 14-20.

38. Козлов H.H. Перспективы использования молекулярных маркеров в селекции кормовых культур / H.H. Козлов, Б.П.Михайличенко, С.И.Ивашута и др. // Сельхоз. биол. 1997. - №3 - С.68-73.

39. Конарев A.B. Адаптивный характер молекулярного полиморфизма и его использования в решении проблем генетических ресурсов / A.B. Конарев // Аграрная Россия. 2002. - №3.- С. 4-11.

40. Конарев A.B. Белки семян как маркеры в решении проблем генетических ресурсов растений, селекции и семеноводства / В.Г. Конарев, Н.К. Губарева, Т.И. Пенева // Цитология и генетика. 2000.— Т.34,№2-С. 91-104.

41. Конарев В.Г. Белки пшеницы / В.Г. Конарев М.: Колос, 1980. - 350с

42. Конарев A.B. Использование молекулярных маркеров в работе с генетическими ресурсами растений / A.B. Конарев // Сельхоз. Биол. -1998.-№5.-С. 3-23.

43. Конарев A.B. Использование полиморфизма проламинов в изучении исходного материала в семеноводстве кормовых злаковых трав / A.B. Конарев, И.Н. Перчук, С. Накаяма. // Аграрная Россия. 2002. - №3. -С. 63-66.

44. Конарев В.Г. Белки растений как генетические маркеры / В.Г. Конарев -М.: Колос, 1983.-245с.

45. Конарев В.Г. Сортовая идентификация по белкам зерна / В.Г. Конарев // Сельхоз. биол. 1989. -№ 1. - С.51-59.

46. Кочиева Е.З. Использование методов на основе полимеразной цепной реакции для анализа и маркирования растительного генома / Е.З. Кочиева // Сельхоз. биол. 1999. - №3 - С.3-14.

47. Кузнецова О.И. Исследование растений-регенерантов гороха (Pisum sativum L.) с помощью молекулярных RAPD- и ISSR-макеров / О.И. Кузнецова, O.A. Аш, Г.А. Хартина, С.А. Гостимский // Генетика. -2005. Т.41, №5 - С.71 -77.

48. Левитес E.B. Генетика изоферментов растений / Е.В. Левитес — Новосибирск: Наука, 1986. — 145с.

49. Лоскутов A.B. Изоферментные системы в гибридологическом анализе подсолнечника. Автореф. дис. канд. биол. наук: 03.00.15 /ВИР. Л., 1993.- 21 с.

50. Маниатис Т., Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование / Т. Маниатис, Э. Фрич, Дж. Сэмбрук М.: Мир, 1984. -480 с.

51. Методические указания и каталог белковых формул / Под ред. В.Г. Конарева- СПб.: РАСХН, ВИР, 1998. 50 с.

52. Петибская B.C. Соя: качество, использование, производство / B.C. Петибская, В.Ф.Баранов, A.B. Кочегура, C.B. Зеленцов М.: Аграрная наука, 2001.-64 с.

53. Попереля Ф.А. Генетический контроль гелиантинина семян у подсолнечника (Helianthus annuus L.) Ф.А. Поперелля, В.П. Нецветаев // Цитология и генетика. 1994. - Т.28, № 4 - С. 59-63.

54. Попов В.Н. Исследование генетического разнообразия инбредных линий подсолнечника методами RAPD- и изоферментного анализов / В.Н. Попов, О.Ю. Урбанович, В.В. Кириченко // Генетика. 2002. -№7.-С. 937-941.

55. Сеитова A.M. Оценка генетического разнообразия дикорастущей сои (Glycine soja siebold et Zucc.) в дальневосточном регионе России / A.M. Сеитова, А.Н. Игнатов, Т.П. Супрунова, И.Л. Цветков и др. // Генетика. -2004. Т.40, №2. - С. 224-231.

56. Сиволап Ю.М. Генетический полиморфизм ячменя, детектируемый ПЦР с произвольными праймерами / Ю.М. Сиволап, Р.Н. Календарь // Генетика. 1995.-Т. 31.-№Ю.-С. 1358-1364.

57. Сиволап Ю.М. Дифференциация и идентификация сортов пшеницы и тритикале при помощи ДНК-типирования / Ю.М. Сиволап, A.B. Галаев, В.Г. Нестерец // Bích. Укр. тов-ва генетиюв i селекцюнер1в. 2004. -Т.2. - №1. - С. 3-15.

58. Сиволап Ю.М. Идентификация и паспортизация сортов мягкой пшеницы методами RAPD- и SSRP- анализа / Ю.М. Сиволап, Е.А. Топчиева, C.B. Чеботарь // Генетика. 2000. - Т.36, №1. - С.44-51.

59. Сиволап Ю.М. RAPD-анализ молекулярно-генетического полиморфизма подсолнечника (Helianthus annuus) / Ю.М. Сиволап, А.Е. Солоденко, В.В Бурлов // Генетика. 1998. - №2. - С. 37-43.

60. Сиволап Ю.А., Солоденко А.Е. Способ установления типичности и уровня гибридности генотипов подсолнечника. 2003. A.c. №2003032413.от 15.01.2004.

61. Сидорова В.В. Использование электрофоретического спектра зеина для прогнозирования гетерозиса у кукурузы /В.В. Сидорова, А.В.Конарев, Г.В. Матвеева, Г.И. Тимофеева // Аграраная Россия 2004. - 6. - С. 3441.

62. Сингер М., Берг П. Гены и геномы. М: Мир, 1998. - II тома. - 373с., 391с.

63. Скворцов Б.В. Дикая и культурная соя Восточной Азии. Китай, Харбин: Изд-во общества изучения Маньчжурского края, 1927. - 44с.

64. Созинов A.A. Полиморфизм белков и его значение в генетике и селекции.-М.: Наука, 1985. 270 с.

65. Солоденко А.Е. Идентификация генотипов подсолнечника с помощью миросателлитных маркеров / А.Е. Солоденко, A.B. Саналатий, Ю.М. Сиволап // Цитология и генетика. 2004. - №2. - С. 15-19.

66. Соя. Биология и технология возделывания ГНУ ВНИИМК имени В.С.Пустовойта Россельхозакадемии / Под. ред. Баранова В.Ф. и Лукомца В.М. Краснодар: 2005 - 433 с.

67. Способ маркирования селекционных достижений клевера лугового на основе RAPD-маркеров: а.с. RU 2244416 С2 А 01 Н 1/04 от / H.H. Козлов., Ю.Н. Малышева, Т.Ф. Прибыткова. №2002102791/13; заявл. 06.02.2002; опубл. // 20.01.2005, Бюл.№2.

68. Стрельченко П.П.,. Сравнение возможностей RAPD-, AFLP- и SSR-маркеров для различения местных сортов гексаплоидных пшениц / П.П. Стрельченко, О.П. Митрофанова, А.В Конарев // Аграрная Россия -2004-№6-С. 3-9.

69. Сулимова Г.Е. ДНК- маркеры в генетических исследованиях: типы маркеров, их свойства и области применения / Г.Е. Сулимова // 2004, Электронный ресурс. — режим доступа: http://www.labsgi.by.ru

70. Супрун И.И. Использование ДНК-маркеров в селекционно-генетических исследованиях риса: Автореф. дисс. канд. биол. наук: 06.01.05 / ВНИИ риса. Краснодар, 2005. - 24с.

71. Трембак E.H. Естественная гибридизация сои как метод создания исходного материала для селекции: Автореф. дисс. канд. биол. наук: 06.01.05. /ВНИИМК. Краснодар, 2001. - 25с.

72. Туркав С.З. Генетика изоферментов в селекции гибридного подсолнечника: Автореф. дис. канд. биол. Наук: 03.00.15 / ВИР. СПб., 1995.-16 с.

73. Туркав С.З., Оценка генетической чистоты линий и гибридов подсолнечника с помощью изоферментных маркеров /С.З. Туркав, A.B. Лоскутов, Т.П. Губенко // Науч.-техн. бюл. ВНИИ масличных культур. Краснодар, 1996. - Вып. 117. - С. 33-37.

74. Черемис A.B., Новая старая ДНК. / A.B. Черемис, В.А. Вахитов Уфа, 2002. - 80 с.

75. Чесноков Ю.В. ДНК-фингерпринтинг и анализ генетического разнообразия у растений / Чесноков Ю.В. // С-х. биол. 2005. - №1. — С. 20-40.

76. Хавкин Э.Е. ДНК-технологии в растениеводстве / Э.Е. Хавкин // С-х. биол. 2003. - №3. - С. 26-41.

77. Хлесткина Е.К., Генотипирование отечественных сортов мягкой пшеницы с использованием микросателлитных (SSR) маркеров / Е.К. Хлесткина, Е.А. Салина, В.К. Шумный // С-х. биол. 2004. - №5. -С.44-51.

78. Шилов И.А. Новые технологии детекции точечных мутаций и анализа полиморфизма повторяющихся последовательностей геномов:

79. Автореф. дис. д. биол. наук: 03.00.23. / ВНИИ сельхоз. биотехн.-М.,2006. 48с.

80. Щербаков В.Г.Биохнмия h товароведение масличного сырья. М.: Пищевая промышленность, 1979. - 336 с.

81. Урбанович О.Ю. Исследование генетического разнообразия сортов яблони с помощью SSR-анализа / О.Ю. Урбанович, З.А.Козловская // Досягнення i прблеми генетики, селекци та бютехнологи. Зб1рник наукових праць. Кшв: Лгос, 2007 - Т.2. - С.297-301.

82. Урбанович О.Ю. Определение генов устойчивости к бурой ржавчине в сортах пшеницы (Triticum aestivum L. с использованием молекулярных маркеров / О.Ю. Урбанович, C.B. Малышев, Т.В. Долматович и др. // Генетика. 2006. - Т.42. - №5. - С.675-683.

83. Юренкова С.И. Полиморфизм видов льна по изоферментным и метаболическим маркерам / С.И. Юренкова, С.В.Кубрак, В.В.Титок и др. // Генетика. 2005. - Т. 41, №3. - С. 334-340.

84. Галаев О.В. Особливост1 змш геному Triticum aestivum внаслщок пбридизацп з Aegilops cylindrica.l O.B. Галаев, Ю.М. Сиволап // Вюник Укр. тов-ва. генетиюв i селекщонер1в. 2006. - Т.4. - №1. - С.31-39.

85. Дерев'янко О.О. ПЛР-анал1з внутршньовидового пол1морф1зму Fusarium oxysporum v. orthoceras / О.О. Дерев'янко, А.П. Луцик, О.В. Бабаянц, Н.Е. Кожухова и др. // Вюник Укр. тов-ва. генетиюв i селекщонер1в. 2006. -Т.4. -№1. - С. 12-20.

86. Доменюк В.П. Ефектившсть добору за ДНК-маркерами локуав кшьюсних ознак в популящях кукурудзи / В.П. Доменюк, А.О. Бшоусов, Ю.М. Сиволап // Цитология и генетика. 2004. - Т.38. - № 1. - С. 44-48.

87. Ефименко В.Г. Молкулярно-генетична характеристика генотишв кукурудзи за складом мшросателггних локус1в / В.Г. Ефименко, Н.Е.

88. Кожухова, Ю.М. Сиволап // Вюник Укр. тов-ва. генетиюв i селекщонер1В. 2006. - Т.4. - №1. - С.21-30.

89. Кр1пка А. Анал1з пол1моф1зфу у геном1 сосни звичайноТ (Pinus sylvestris) за доподмогою ДНК-маркер1в / А.Крипка, Л.Зелена // Досягнення i проблеми генетики, селекци та бютехнолоп'ь Зб1рник наукових праць. Кшв: Лгос, 2007 - Т.2. - С.260-264.

90. Попереля Ф.О. Генетична штерпретащя електрофореграм гел1антину нас1ння Fi соняшника / Ф.О. Попереля // Цитология и генетика. 2000. - Т.34. - №2. - С.84-90.

91. Сиволап Ю.М. ДНК-технолопг в рослинництв1 УкраТни / Ю.М. Сиволап // BicHHK Укр. тов-ва. генетиюв i селекцюнер1в. 2006. - Т.4. -№1. - С.111-117.

92. Abe J., Xu D., Suzuki Y., Kanazawa A., Shimamoto Y. Soybean germplasm pools in Asia revealed by nuclear SSRs // Theor. Appl. Genet. -2003. V.106. - №3. - P.445-453.

93. Akkaya M., Bhagwat A., Cregan P. Length polymorphism of simple sequence repeat DNA in soybean. // Genetics 1992. - V.132. - P.l 131-1139.

94. Anisimova I.N. Genotypic variation and polymorphism of 2S albumin in sunflower / I.N. Anisimova, R.J. Fido, A.S. Tatham, P.R. Shewry // Euphytica. 1995.—V.83. -P. 15-23.

95. Antonova T.S Development of marker system for identification and certification of sunflower lines and hybrids on the basis of SSR-analysis /

96. T.S. Antonova, S.Z. Guthetl, T.A. Tchelustnicova., S.A. Ramazanova // Helia.-2006.-Vol. 29, № 45. P. 63-72.

97. Apuya N.R., Frarier B., Keim P. Restriction fragment length polymorphisms as genetic markers in soybean. // Theor. Appl. Genet. -1988. V.75. - №6. - P.889-901.

98. Arber W. Promotion and limitation of genetic exchange / W. Arber // Science. 1979. - V. 205. - P.361-365.

99. Botstein D. Construction of a genetic linkage map in man using restriction fragment length polymorphisms / D. Botstein, R.L. White, M. Skolnick, R.W. Davis // Am. J. Hum. Genet. -1980. V. 32 - P.314-331.

100. Brown A.H.D. Barley // Isozymes in plant genetics and breeding. Part B. -Amsterdam: Elsevier. 1983. - P.57-77.

101. Charlson D. Associating SSR-markers with soybean resistance to iron deficiency Chlorosis / D. Charlson, S.Cinzio, R. Shoemaker // Journal of Plant Nutrition. 2003. - V.26. - №10-11. - P. 2267-2276.

102. O.Chiang Y.C. Inheritance and linkage analysis of phosphoglucose isomerase isozymes in soybeans / Y.C. Chiang, M.B. Gorman, Y.T. Kiang // Biochemical Genetics. 1987. - V.25. - № 11/12. - P.893-900.

103. Chiang Y.C. Genetic analysis of mannose-6-phosphate isomerase in soybeans / Y.C. Chiang, Y.T. Kiang // Genome. -1988. V.30. - P.808-811.

104. Chiang Y.C. Inheritance and linkage relationshins of 6- phosphogluconate dehydrogenase isozymes in soybean / Y.C. Chiang, Y.T. Kiang // Genome. — 1987. V.29. - P.786-792.

105. Grodzicker T. Physical mapping of temperature-sensitive mutations of adenoviruses / T. Grodzicker, J. Williams, P. Sharp, J. Sambrook // Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 1975. - V.39. Pt.l. - P.439-446.

106. Devine T.E. Simultaneous genetic mapping of morphological and biochemical traits in the soybean / T.E. Devine, Y.T. Kiang, M.B. Gorman // The Journal of Heredity. 1984. -№75. - P.311-312.

107. Diwan N. Automated sizing of fluorescent-labeled simple sequence repeat (SSR) markers to assay genetic variation in soybean / N. Diwan, P.B. Cregan // Theor. Appl. Genet. 1997. - V.95. - №5-6. - P723-733.

108. Doong J-Y.H. Inheritance of aconitase isozymes in soybean / J- Y.H. Doong, Y.T. Kiang//Genome. -1987. V.29. -P713-717.

109. Doong J-Y.H. Inheritance study on a soybean Fluorescent Esterase / J-Y.H. Doong, Y.T. Kiang // The Journal of Heredity. -1988. №75 (5). - P.399-400.

110. Edwards K. A simple and rapid method for the preparation of plant genomic DNA for PCR analysis / K. Edwards, C. Johnstone, C. Thompson // Nucl. Acid Rres. 1991. - V. 19. - N6. - P. 1349.

111. Garvin D.F. Genetic mapping of the barley Rrsl4 scald resistance gene With RFLP, isozyme and seed storage protein markers / D.F. Garvin, A.H.D. Brown, H.Raman et.al. // Plant Breeding. 2000. - №119. - P. 193-196.

112. Goldberg R.B. Developmental regulationof cloned superabundant embrio mRNAs in soybean / R.B. Goldberg, G. Hoscck, G.S. Ditta, R.W. Breidenbach // Develop. Biol. 1981. - V. 83 - P.218-223.

113. Goodman M.M. Genetic control of malatdehydrogenase isozymes in maize / M.M. Goodman, S.W. Stuber, C.N. Lee et.al. // Genetics. 1980. - V.94. -P.153-168.

114. Graef G.L. Relation of isozyme genotypes to quantitive characters in soybean / G.L. Graef, W.R. Fehr, S.R. Cianzio // Crop. Sci. 1989. - V.29 -№3. — P. 683-688.

115. Guhetl S. Z. Development of marker system for identification and certification of sunflower lines and hybrids on the basis of SSR-analysis Guhetl S. Z., T.S. Antonova, T.A. Tchelustnicova, S.A. Ramazanova // Helia.-2006.-Vol. 29, № 45. P. 63-72

116. Hart C.E. Hexaploid wheat (Triticum aestivum L. em Thell) II Isozymes in plant genetics and breeding. Part B. Amsterdam: Elsevier. - 1983. - P.35-56.

117. Hossain K.G. Characterization and identification of (CT)n microsatellites in soybean using sheared genomic libraries / K.G. Hossain, H. Kawai, M. Hayashi, M. Hoshi et al. // DNA Research. 2000. - №7. - P. 103-110.

118. Hu J. Identification of broccoli and caui flower cultivars with RAPD markers / J. Hu, C.F. Quiros II Plant Cell Reports. 1992. - V. 10. - P. 505511.

119. Jhormann C.E. Comparison of RFLP and RAPD markers to estimating genetie relationships within and among cruciferous species / C.E. Jhormann, M.E. Ferreira, L.E.A. Camargo et al. // Theor. Appl. Genet. 1994. - V.88. -P.93 0-980.

120. Jiang R. The use of microsatellite DNA markers for soybean genotype identification / R. Jiang, M. Akkaya, A. Bhagwat, U. Lari et al. // Theor. Appl.Genet. 1995. - V.90. - P.43-48.

121. Keim P. Restriction fragment length polymorphism diversity in soybean / P. Keim, R.C. Shoemaker, R.G. Palmer // Theor. Appl.Genet. 1989. - V.77. -P. 786-792.

122. Keim P. A high-density soybean genetic map based primarily upon AFLP markers / P. Keim, J. Schupp, S. Travis et al. // Crop Science. 1997. -V.37.-P. 537-543.

123. Kuribara H. Novel reference molecules for quantitation of genetically modified maize and Soybean / H. Kuribara, Y. Shindo, T. Matsuoka, K. Takubo et al. // Journal of AOAC International. 2002.- V.85. - N5 -P.1077-1089.

124. Lacombe S. RFLP profiles in low oleic sunflower USING SDI-, astearoyl-ACP, and an oleoyl-pc desaturases с DNAs / S. Lacombe, P. Lambert, F. Cellier, F. Casse, A. Berville // Hellia. 1999. - №30 - P. 19-28.

125. Lebowitz, R. Marker-based designs for the detection of linkage between a marker locus and a linked quantitative trait locus / R. Lebowitz, M. Soller, J.S. Beckmann // Theor. Appl. Genet. 1987. - V. 72 - P.556-562.

126. Li W. Genetic diversity of Triticum turgidum L. based on microsatellite markers / W. Li, D.-F. Zhang, Y.-M. Wei et.al. // Генетика. 2006. - T.42. — №3. - C.397-402.

127. Lin J.J. Identification of molecular markers in soybean comparing RFLP, RAPD and AFLP DNA mapping techniques / J.J. Lin, J. Kuo, J. Ma et al. // Plant Mol. Biol. Rep. 1996. - V.14, N2. - P. 156-169.

128. Martin G.B. Rapid identification of markers linked to a Pseudomonas resistance gene in tomato by using random primers and near-isogenic lines / G.B. Martin, J.G. Williams, S.D. Tanksley // Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. -1991. — V.88. — P.2336-2340.

129. Maughan P. Microsatellite and amplified sequence length polymorphism in cultivated and wild soybean / P. Maughan, M. Saghai- Maroof, G. Buss // Genom. 1995.-V.38.-P.715-723.

130. MO.Maughan P. Amplified fragment length polymorphism (AFLP) in soybean: species diversity, inheritance, and near-isogenic line analysis / P. Maughan, M. Saghai Maroof, G. Buss, G. Huestis // Theor. Appl. Genet. 1996. -V.93. - 3. -P.392-401.

131. Morgante M. Genetic mapping and variability of seven soybean simpl sequence repeat loci / M. Morgante, A. Rafalski, P. Biddle // Genome. — 1994. V.37, №5. - P.763-769.

132. Paniego N. Microsatellite isolation and characterization in sunflower (Helianthus annus L.) / N. Paniego, M. Eschaide, M. Munoz et al. // Genom. 2002. - № 45. - P.34-43.

133. Pankovic D. The use of PCR- based markers in the evaluation of resistance to downy mildew in NS-breeding material / D. Pankovic, S. Jocic, N. Lacok et al. // Helia. 2004. - V.27, № 40. - P. 149-158.

134. Pejic I. Comparative analysis of genetic similarity among maize inbred lines detected by RFLPs, RAPDs, SSRs and AFLPs / I. Pejic, P. Ajmorne-Marsan, M. Morgante et al. // Theor. Appl. Genet. 1998. - V.83. - P. 194200.

135. Plaschke J. Detection of genetic diversity in closely related bread wheat using microsatellite markers / J. Plaschke, M.W. Ganal, M.S. Roder // Theor. Appl. Genet. -1995.-V.91.-P.1001-1007.

136. Plomion C. Genomic mapping in Pinus pinaster (maritime pine) using RAPD and protein markers / C.Plomion, D. Bahrman, C.E. Durel et.al. // J. Heredity. 1995. -№74. -P.661-668.

137. Powell W. The comparison of RFLP, RAPD, AFLP and SSR (microsatellite) markers for germplasm analysis / W. Powell., M. Morgante, C. Andreet et al. // Mol. Breeding. 1996. - V.2 - P. 225-238.

138. Prabhu R. Selecting soybean cultivars for dual resistance to soybean cyst nematode and sudden desth syndrome using two DNA markers / R. Prabhu, V. Njiti, J. Bell- Johnson, M. Schmidt // Crop Science. 1999. - V.39, № 4. — P.982-987.

139. Rafalski J.A. RAPD markers a new technology for genetic mapping and plant breeding / J.A. Rafalski, S.V. Tingey, J.G.K. Williams // Ag Biotech News Info. -№ 3. -P.645-648.

140. Rongwen J. The use of microsatellite DNA markers for soybean genotype identification / J. Rongwen, M.S. Akkaya, A.A. Bhagwat et al. // Theor. Appl. Genet. 1995. - V. 90. - P.43-48.

141. Saghai Maroof M.A. Ribosomal DNA spacer-length polymorphisms in barley: Mendelian inheritance, chromosomal location, and population dynamics / M.A.Saghai - Maroof, K.M. Soliman, R.A. Jorgensen, R.W. Allard // PNAS USA. - 1984. -№ 81. - P. 8014-8018.

142. Schlotterer C. Evolutionary dynamics of microsatelliteDNA / C. Schlotterer // Chromosoma. 2000. - V. 109. -P.365-371.

143. Snyder M.P. Transposable element that splits the promoter region inactivates a Drosophila cuticle / M.P. Snyder, D. Kimbrell, M. Hunkapiller et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1982. - V. 79. - P.7430-7434.

144. Soller M. Genetic polymorphism in varietal identification and genetic improvement / M. Soller, J.S. Beckmann // Theor. Appl. Genet. 1983. -V. 67-P. 25-33.

145. Soller M. Restriction fragment length polymorphisms in poultry breeding / M. Soller, J.S. Beckmann // Poultry Science. 1986. - V.65. -P.1471-1488.

146. Solodenko A. Genotyping of Helianthus based on microsatellite sequences / A. Solodenko, Yu. Sivolap // Helia. 2005. - V. 28, №. 42. - P. 19-26.

147. Sossey-Alaoui K. Molecular relationships of Helianthus based on RAPD markers / K. Sossey-Alaoui, H. Serieys, M. Tersac, P. Lambert // Helia. -1999. -№30 — P.1-18.

148. Staswick P.E. Identification of the acidic and basic subunit complexes of glycinin / P.E. Staswick, M.A. Hermodson, N.C. Nielsen // J. Biol. Chem. -1981. V.256. - P.8752-8761.

149. Tanksley S.D. Genetics subcellular localization and molecular-caracterization of 6-phosphogluconate dehydrogenase isozymes in tomato / S.D. Tanksley, G.D. Kuehn // Biochem Genet. 1985. - V.23, №516. -P.441-454.

150. Taramino G. Simple sequence repeats for germplasm analysis and mapping in maize / G.Taramino, S. Tingey // Theor.Appl. Genet. 1996. - N 95. -P.66-72.

151. Tautz D. Cryptic simplicity in DNA is a major source of genetic variation / D. Tautz, M. Trick, G.A. Dover // Nature. 1986. - V. 322, N 6080. -P.652-656.

152. Vallejos C.E. Enzyme activity staining / C.E. Vallejos // Isozymes in plant genetics and breeding.Part A. Amsterdam: Elsevier, 1983. - P.469-516.

153. Wallace R.B. DNA recombinant Technology / R.B. Wallace // Boca Raton (Fla.): CRC press. 1983. - 212 p.

154. Weeden N. F. Chromosomal locations of twelve isozyme loci in Pisum sativum / N. F. Weeden, G.A. Marx // J. Heredity. 1984. - V.75. - №5. -P.365-370.

155. Welsh J. Fingerprinting genomes using PCR with arbitrary primers / J. Welsh, M. McClelland // Nucl. Acids Res. 1990. - V. 18. - P.7213- 7218.

156. Williams J. DNA polymorphisms amplified by arbitrary praimers are useful as genetic markers / J. Williams, A. Kubelik., K. Kenneth, J. Rafalski et al. // Nucl. Acids Res. 1990. - V.18. -P. 6531-6535.

157. Xu D.N. Diversity of chloroplast DNA SSRs in wild and cultivated soybeans: evidence for multiple origins of cultivated soybean / D.N.Xu, J. Abe, Y. Shimanoto // Teor. Appl. Genet. 2002. - V. 105. - №5. - P. 645653.

158. Yu J. Towards a saturated molecular genetic linkage map for cultivated sunflower / J.Yu, S. Tang, M.B. Slabaugh, A. Husacker et.al. // Crop Science.-2002- №3.-P. 1-24.

159. Zhivotovsky L.A. The effective mutation rate at Y chromosome shot tandem pepets, with application to human population divergence time / L.A. Zhivotovzly, P.A. Underhill, C. Cinnioglu et al. // Am. J. Hum Genet. -2004.- V.74.,Nl.-P. 50-61.