Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Гетерогенность и полиморфизм ингибиторов протеиназ сои и гороха

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Гетерогенность и полиморфизм ингибиторов протеиназ сои и гороха"

На правах рукописи

КОМИССАРОВА Юлия Васильевна

ГЕТЕРОГЕННОСТЬ И ПОЛИМОРФИЗМ ИНГИБИТОРОВ ПРОТЕИНАЗ СОИ И ГОРОХА

Специальность: 03.00.04 - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт-Петербург 1998

Работа выполнена в 1994-1998 гг. в отделе биохимии и молекулярной биологии Всероссийского научно-исследовательского института растениеводства им. Н. И. Вавилова.

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор И. П. Гав-рилюк.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор В. П. Комов, доктор биологических наук, профессор М. А. Флёров.

Ведущее учреждение: Всероссийский научно-исследовательский институт биохимии им. А. Н. Баха РАН (Москва).

Защита диссертации состоится 29 мая 1998 г. в 14 часов на заседании Диссертационного совета Д 020.18.02 при Всероссийском научно-исследовательском институте растениеводства им. Н. И. Вавилова по адресу: 190000, Санкт-Петербург, ул. Большая Морская, 42.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Всероссийского научно-исследовательского института растениеводства им. Н. И. Вавилова.

Автореферат диссертации разослан 28 апреля 1998 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета, доктор биологических наук,

профессор Э. А. Гончарова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность темы. Растительные белковые ингибиторы протеолитических ферментов привлекают внимание исследователей по целому ряду причин. С одной стороны это нежелательные компоненты в пищевых продуктах и кормах, препятствующие перевариванию белка, с другой показано их участие в формировании механизмов устойчивости растений к болезням и вредителям. Кроме того в последнее время активно изучается способность этих белков подавлять развитие заболеваний, связанных с гиперпротеолизом, в частности, онкологических. Белки, ингибирующие протеиназы, имеются у многих растений, однако у бобовых они представлены в большем количестве. Наиболее изученным является соевый ингибитор трипсина Кунитца. Встречается несколько форм этого ингибитора в зависимости от происхождения сортов сои. Актуальной проблемой остаётся изучение форм ингибитора Кунитца в продуктах переработки сои. Второй тип ингибиторов протеиназ бобовых - ингибитор трипсина и химотрипсина Баумана-Бирк (ИББ). К настоящему времени получены данные о формах этого ингибитора и его изменчивости у видов и сортов. Однако до сих пор эти сведения фрагментарны и противоречивы.

Цель и задачи исследования. Цель работы - изучить гетерогенность и полиморфизм ингибиторов протеиназ двух важных сельскохозяйственных культур сои и гороха. Были поставлены следующие задачи:

- подобрать и модифицировать методы для исследования состава и изменчивости ИББ, позволяющие осуществлять скрининг генетических коллекций и анализировать исходный и селекционный материал;

- изучить сортовую и внутрисортовую изменчивость ИББ, а также зависимость их состава от года и места репродукции;

- оценить возможность отбора высоко- и низкоингибиторных сортов сои и гороха;

- изучить возможности выделения активных форм ингибитора трипсина Кунитца из соевой сыворотки, как отхода при производстве белковых изолятов.

Научная новизна работы. Метод желатиновых реплик, предложенный ранее для злаков, впервые апробирован на бобовых и показана его перспективность для скрининга коллекционного и селекционного материала на состав ИББ. Обнаружено значительное разнообразие сортов сои и гороха по составу ИББ.

Показано, что ацетоновая фракция белков семян сои, обогащенная ИББ, обладает более выраженной сортовой специфичностью, чем состав запасных белков и состав фрагментов ДНК, выявляемый методом RAPD.

Практическая значимость работы. Апробированные и модифицированные методы электрофореза, желатиновых реплик и иммуноблоттинга открывают возможность для скрининга коллекций, оценки и отбора (в том числе на индивидуальных семенах с сохранением их жизнеспособности) исходного и селекционного материала на состав и активность ИББ. Среди исследованных коллекционных образцов сои и гороха обнаружены сорта без ИББ или с одним - двумя компонентами, которые могут быть использованы в селекции на улучшение пищевых и кормовых достоинств, а также сорта с большим числом интенсивных компонентов ИББ, перспективные в качестве сырья для фармацевтической промышленности. Показана возможность выделения активных форм ингибитора Кунитца из соевой сыворотки.

Апробация работы. По результатам исследований опубликованы 3 работы. Две находятся в печати. Основные материалы диссертации были доложены на Международной научно-практической конференции «Люпин и амарант - источники новых пищевых и диетических продуктов» 28-31 октября 1996, Санкт-Петербург, конференции аспирантов и молодых учёных ВИР 24 марта 1997 г., Санкт-Петербург и 5 Международном Симпозиуме «Пищевые белки», 1-4 сентября 1997 г., Потсдам, Германия.

Объём и структура диссертации. Диссертация изложена на 110 страницах машинописного текста, состоит из введения, пяти глав, выводов, практических рекомендаций и списка литературы. В ней содержатся 14 таблиц и 26 рисунков. Библиографический указатель содержит 110 наименований, в том числе 83 на иностранных языках.

УСЛОВИЯ , МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ .

Лабораторные эксперименты проводили в отделе биохимии и молекулярной биологии ВИР. Из коллекции ВИР были отобраны две группы сортов сои различного географического происхождения. Первая включает сорта Adams, Altona, Amsoy-71, Bavender Special С, Cobb, Cutler, Disoy, Fiskeby V, Hawkeye, Lee, Roanoke, Tracy LRB-502, Tracy M, Wilkin, Williams, вторая - Beeson, Century 84,

Conrad, Edison, Elgin, Flyer, Keller, Kenwood, Pella 86, Resnik, Ripley, Vinton, Wickery и Williams 82. Для определения влияния условий выращивания на изучаемые признаки каждый сорт первой группы в исследовании был представлен семенами разных лет и мест репродукции.

Сорта гороха Amac, Amino, Colmo, Darkskin, Finette, Frisson, Maro, Mini, Terese, 447 и 449 были любезно предоставлены лабораторией биохимии и технологии белков Национального Института Сельскохозяйственных Исследований (INRA, Нант, Франция).

Соевая сыворотка, являющаяся отходом полупромышленного производства высококонцентрированных растительных белков (ВКРБ) во ВНИИ жиров, предоставлена сотрудниками этого института.

Поскольку ИББ составляет не более 3-4% белка семян сои, то для получения обогащенной им фракции использовано обнаруженное Бауманом [Bowman, 1946] свойство этого ингибитора экстрагироваться 60% этиловым спиртом. Полученный экстракт содержит небольшое число других белков, которые удаляются при осаждении ингибитора из спиртового экстракта ацетоном. Основным преимуществом этого способа является то, что 60% спиртом не извлекаются ингибитор трипсина Кунитца и основная масса запасных белков [Pusztai et al, 1991, Liu & Markakis, 1991]. Фракция белков, осаждаемых ацетоном из спиртового экстракта, значительно обогащена ИББ, и обозначена нами как ацетоновая фракция.

Для анализа состава ингибиторов протеиназ гороха проводилась кислая экстракция белков семян 0,025 M HCl pH 2,8-3,0. В этих условиях практически полностью исключена экстракция запасных глобулинов, имеющих изоэлектрические точки в близком интервале pH.

Запасные белки семян сои извлекали щелочной экстракцией в трис-глициновом буфере pH 8,3.

Для изучения компонентного и полипептидного состава ингибиторов протеиназ сои и гороха использовались методы вертикального электрофореза в 12,5% и 15% полиакриламидном геле (ЭФ в ПААГ) в диссоциирующих (в присутствии додецилсульфата Na и ß-меркаптоэтанола) и недиссоциирующих условиях в щелочной системе (Laemmli, 1970, Davis 1964).

Для определения ингибиторов трипсина и химотрипсина сои после электрофореза в ПААГ использовали метод, разработанный Ал. В. Конаревым (1986), и

модифицированный нами, включающий электроперенос белков на нитроцеллю-лозную мембрану с последующим выявлением ингибиторов при ферментативном гидролизе желатинового слоя фотоплёнки,

Определение трипсин-ингибирующей активности препаратов проводили методом Ерлангера в двух модификациях (Erlanger, 1961, Gaborit, 1991).

В качестве иммунохимических методов для определения ингибиторов про-теиназ соевой сыворотки использовались методы ракетного, слитного ракетного и перекрёстного иммуноэлектрофореза со специфической кроличьей антисывороткой на белки семян сои. Для определения ингибиторов протеиназ гороха применяли иммуноблоттинг белков, разделённых в полиакриламидном геле, на нитроцеллюлозных мембранах, используя специфическую антисыворотку к четырём очищенным формам ингибиторов протеиназ гороха.

Высокоэффективный капиллярный электрофорез (ВЭКЭ) белков сои и гороха проводили на оборудовании фирмы Beckman.

Для разделения белков соевой сыворотки и очистки ингибиторов трипсина применяли анионообменную хроматографию на ДЭАЭ-сефадексе.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

Гетерогенность и полиморфизм соевого ингибитора трипсина и химотрипсина Баумана-Бирк.

Элекгрофоретический анализ ацетоновой фракции. Для изучения состава белков ацетоновой фракции использованы различные методы вертикального ЭФ в ПААГ и метод желатиновых реплик. Нативный ЭФ в ПААГ показал спектр белков, состоящий из 5-8 основных по интенсивности и 10-15 ослабленных компонентов. Для характеристики спектров мы разделили их на три зоны: с наибольшей элекгрофоретической подвижностью - 1-я зона, со средней - 2-я зона и с наименьшей - 3-я зона. Номенклатура зон и компонентов представлена на рис.1.

Анализ белков ацетоновой фракции индивидуальных семян показал отсутствие внутрисортовога полиморфизма для сортов Altona, Amsoy-71, Bavender Special С, Cutler, Fiskeby V, Hawkeye, Roanoke, Tracy LRB-502, Tracy M, Wilkin, Williams. Внутрисортовой полиморфизм белков этой фракции обнаружен только у сортов Disoy и Conrad. Незначительные различия проявились в первой и третьей зонах. Анализ зависимости состава белков ацетоновой фракции у пере-

б

I II__III

12345 12345 1234

Hill Mill ИII

+ 4- _

Рис.1. Зоны и компоненты электрофоретического спектра нативных белков ацетоновой фракции.

численных сортов от года и места репродукции семян показал отсутствие этой зависимости у всех сортов, за исключением сорта Cobb, у которого пять компонентов спектра значительно различались по интенсивности у семян 1983 и 1990 лет репродукции.

Определение ингибиторов протеиназ группы Баумана-Бирк в ацетоновой фракции. Методом желатиновых реплик в спектрах нативных белков ацетоновой фракции белков сои выявлено восемь белковых компонентов, проявляющих ингибирующую активность по отношению к трипсину. Они обозначены от I до VIII в порядке уменьшения электрофоретической подвижности. Значения их Rf представлены в таблице 1. Учитывая склонность молекул ингибитора Баумана-Бирк к агрегации, можно предположить, что наименее подвижный компонент VIII с ингибирующей активностью представляет собой агрегат низкомолекулярных форм ингибиторов. Он проявляется в спектрах сортов Adams и Amsoy 71 нестабильно и в дальнейшем в анализе не учитывался.

Таблица 1. Значения электрофоретической подвижности (1^) ингибиторов трипсина в ацетоновой фракции белков сои.

Компонент-ингибитор I II III IV V VI VII VIII

Rf 0,85 0,80 0,74 0,68 0,63 0,59 0,52 0,25

На примере сортов Trasy LRB 502, Wilkin и Williams изучено влияние условий репродукции семян на состав ИББ . Установлено, что семена Trasy LRB 502 1984 и 1989 лет репродукции, Wilkin (1989 и 1993) и Williams (1986 и 1992) не различаются по составу ИББ. Таким образом, компонентный состав ИББ можно считать сортовой характеристикой.

В таблице 2 приведены сведения о представленности ингибиторов трипсина из ацетоновой фракции у разных сортов сои. Интенсивность их проявления обозначена от 1 до 4 в порядке увеличения. Для некоторых компонентов их усиление или ослабление обозначено + или - соответственно.

Таблица 2. Состав и интенсивность проявления ингибиторов трипсина группы Баумана-Бирк у сортов сои.

Сорт Формы ингибиторов трипсина

I II III IV V VI VII

Altona 2

Beeson сл? 2

Century 84 сл? 2

Keller 3

Ripley 3

Fiskeby V 1 2

Hawkeye 2 3

Lee сл 1

Vinton сл 3

Wilkin 1 2

Williams 2- 2

Kenwood 3 4 1

Cutler 4- 4 2

Disoy 4- 4 3

Elgin 3 4 1

Flyer 3 4 СЛ

Resnik 3 4 2

Trasy LRB 502 4 4 3

Wickery 4 4 3

Amsoy 71 4 4 4 2

Adams 4 4+ 4 2 2

Conrad 4+ 4+ 3- 3-

Edison 4+ 4+ 3 3

Pella 4 4+ 3- 3

Bavender Special С 4 4 4 4 4 3 2

Tracy M 4 4 4 4 4 3 3

Основными по интенсивности являются компоненты I и II. Компонент II присутствует в семенах всех сортов. У сортов Altona, Beeson, Keller, Century и Ripley это единственный проявляющийся в наших условиях ингибитор. По-видимому,

компонент II представляет собой основной (классический) ингибитор Баумана-Бирк, обозначенный Е у Тэн-Вильсон [Tan-Wilson et al, 1985]. Компонент I с большей электрофоретической подвижностью, по-видимому, соответствует ингибитору Е', протеолитическому производному основной формы.

По количеству выявленных ингибиторов сорта сои можно разделить на группы. К группе сортов с двумя компонентами - ИББ (I и II) относятся сорта Fiskeby V, Hawkeye, Lee, Vinton, Wilkin и Williams. У сорта Kenwood кроме этих двух компонентов присутствует ингибитор IV. По интенсивности проявления ингибиторов с одной стороны выделяется сорт Lee, у которого интенсивность их проявления наименьшая, а с другой - сорт Kenwood, у которого компоненты I и II получили максимальные 3 и 4 балла по шкале интенсивности.

Семена сои сортов Cutler, Disoy, Elgin, Flyer, Resnik, Trasy LRB 502, Wickery содержат по три компонента - ингибитора трипсина -1, II и III. Судя по электрофоретической подвижности компонента III, можно предположить, что это ингибитор D, описанный Тэн-Вильсон и др. У сорта Amsoy 71 к перечисленным трём ингибиторам добавляется форма VII, у сорта Adams - V и VI. Эти два сорта, а также сорта Trasy LRB 502 и Wickery отличаются повышенной интенсивностью проявления ингибиторов I, II и III (3-4 балла).

Четыре белковых компонента, проявляющих ингибирующую активность по отношению к трипсину (I, II, III, IV), были обнаружены у сортов Conrad и Edison. Интенсивность первых двух форм получила оценку в 4 балла, форм III и IV - 3 балла с небольшими различиями между сортами.

У сортов Bavender Special С и Tracy M зарегистрировано максимальное количество форм ингибиторов трипсина (I, II, III, IV, V, VI и VII). Из них первые пять отличаются максимальной интенсивностью проявления (4 балла) и ингибируют также и а-химотрипсин.

Анализ внутрисортовой изменчивости ингибиторов трипсина показал её отсутствие у всех сортов, кроме сорта Roanoke. При анализе белков ацетоновой фракции десяти семян этого сорта оказалось, что ингибирующую активность проявляют четыре компонента спектра I, II, III и IV (Rf 0.68, 0.74, 0.80 и 0.85), причем не во всех семенах одинаково. Поскольку внутрисортового полиморфизма белков ацетоновой фракции у этого сорта нет, и все компоненты с одинаковой интенсивностью проявляются в элекгрофоретическом спектре при окраши-

вании Кумасси, то можно предположить, что это явление связано как с наложением ингибиторов на какие-либо неактивные белки, так и с дезактивацией некоторых ингибиторов в отдельных семенах на каком-то этапе. Таким образом, из коллекционного образца сои Roanoke могут быть отобраны семена без ИББ для формирования генетических коллекций и источников для селекции.

В результате проведённых исследований во фракции белков, осаждаемой ацетоном из спиртового экстракта, у разных сортов сои методом желатиновых реплик выявлены от одного до восьми электрофоретических компонентов, обладающих ингибирующей активностью по отношению к трипсину. Степень проявления этих компонентов у разных сортов значительно различается.

Сортовые различия состава компонентов ацетоновой фракции

белков сои.

Электрофорез белков ацетоновой фракции в ПААГ. Известно, что соя отличается чрезвычайно стабильным спектром суммарных белков семян, и было принято считать невозможным использование электрофореза этих белков для её сортовой идентификации [Мол.-биол. аспекты прикл. бот., ген. и селекции, 1993]. Однако при анализе белков ацетоновой фракции методом ЭФ в ПААГ нами были замечены сортовые различия полипептидного состава этой фракции.

Для определения возможности использования электрофореза белков ацетоновой фракции для различения сортов сои были проанализированы 14 сортов сои различного происхождения (Beeson, Century 84, Conrad, Edison, Elgin, Flyer, Keller, Kenwood, Pella 86, Resnik, Ripley, Vinton, Wickery, Williams 82). У этих же сортов методом ЭФ в ПААГ в присутствии ДДС-Na мы проанализировали состав запасных белков семян. Полученные данные сравнивали с данными Янхуа и сотр. [Jianhua et al, 1996], которые исследовали эти же сорта методом RAPD по фрагментам ДНК,

Электрофорез запасных белков семян в присутствии ДДС-Na показал отсутствие различий между исследованными сортами, что согласуется с выводами, сделанными ранее. Различия были обнаружены методом электрофореза натив-ных белков ацетоновой фракции. В таблице 3 приведён состав электрофоретических компонентов ацетоновой фракции у исследованных сортов. В ней использована номенклатура зон и компонентов, представленная на рис. 1. Интенсив-

ность проявления компонентов обозначена от 4 до 1 в порядке уменьшения. Усиление или ослабление некоторых компонентов обозначено + или - соответственно.

Таблица 3. Состав элекгрофоретических компонентов ацетоновой фракции у

разных сортов сои.

Зоны и компоненты

№ CopT 1 2 3

1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 1 2 3 4

1 Flyer 2 4 1 1 1 3 2 1 1 1 1 + 2+ 2

2 Kenwood 3 4 2 1 2 3 2+ 1 1 1 1 + 2+ 1

3 Resnik 1 4- сл? сл? 1 3 2+ 1 1 1 1 + 2+ 1

4 Ripley 1 4 1 1 1 3 2 1 1 1 1 2+ 4

5 Wickery 3 4 2 2 1 2 1 1 1 1 1- 2

6 Beeson 2 4 1 1 1 2 2 2 1 1 1 1 2+

7 Keller 3 4 1 1 2 3 2 1 1 1 1 1 2+

8 Pella 86 3 4- 2 1 2 2 2 1 1 1 1 2+ 1

9 Century 84 3 4- 2 1 1 2 2 2 1 1 1 2+ 1

10 Conrad 2 4 1 1 1 3 2 2 1 1 2 2+ 1

11 Edison 2 4 1 1 1 3 2 2 1 1 1 2+ 1

12 Elgin 1 4- 1 1 1 2 2 2 1 1 1 + 2+ 1

13 Vinton 1 4- 1 1 1 3 2+ 1 1 1 1 + 2+ 1

14 Williams 82 2- 4- 1 1 1 2 1 1 1 1 1 2

При сравнении электрофореграмм обнаружена вариабельность белков I и III зон. Уникальные спектры ацетоновой фракции имеют сорта Flyer, Kenwood, Resnik, Ripley, Wickery. Остальные сорта разделились на группы с близкими типами спектров. В одну группу вошли сорта Beeson и Keller, характеризующиеся отсутствием компонента 2 при усилении компонента 4 третьей зоны. Другую группу составили сорта Pella и Century 84. У них компонент 1 первой зоны усилен (3 балла), а компонент 2 ослаблен по сравнению с другими сортами (4-). Сорта Conrad и Edison имеют спектры, похожие на спектр сорта Flyer, но компонент 4 третьей зоны у них проявляется слабее. Их можно объединить в третью группу. Четвёртую группу составили сорта Elgin, Vinton и Williams 82. Как и сорт Resnik, они отличаются несколько большим ослаблением компонентов 1 и 2 первой зоны.

При разделении восстановленных ß-меркаптоэтанолом белков ацетоновой фракции методом электрофореза в диссоциирующих условиях уникальные спек-

тры дали сорта Pella и Conrad. Таким образом, в результате использования двух вариантов ЭФ в ПААГ нам удалось отличить семь сортов: Flyer, Kenwood, Resnik, Ripley, Wickery, Pella и Conrad. Эти результаты являются сравнимыми с результатами Янхуа и сотр., которым из тех же сортов удалось отличить семь (Edison, Elgin, Flyer, Keller, Resnik, Vinton и Williams) с использованием RAPD-маркёров. Причём пригодными для этого оказались только два праймера из испробованных тридцати.

Кроме ЭФ в ПААГ для различения сортов сои можно использовать и состав ингибиторов протеиназ ацетоновой фракции белков. Как было показано выше, он также обладает сортовой специфичностью. Однако наиболее быстрым и доступным всё же является ЭФ в ПААГ ацетоновой фракции белков.

Таким образом, впервые удалось получить отчетливые различия между сортами сои по белкам семян. Полученные результаты позволяют утверждать, что состав электрофоретических компонентов ацетоновой фракции и ингибиторов протеиназ Баумана-Бирк обладает более выраженной сортовой специфичностью, чем состав запасных белков и состав фрагментов ДНК, выявляемых методом RAPD.

Высокоэффективный капиллярный электрофорез белков ацетоновой фракции. Для анализа белков ацетоновой фракции методом ВЭКЭ были взяты семена тех же 14 сортов сои (Beeson, Century 84, Conrad, Edison, Elgin, Flyer, Keller, Kenwood, Pella 86, Resnik, Ripley, Vinton, Wickery, Williams 82), что и для ЭФ в ПААГ. Предварительно была показана воспроизводимость спектров при одинаковом времени и остальных условиях экстрагирования.

Большинство электрофореграмм характеризуются наличием шести основных пиков в интервале времён миграции от 8 до 11 минут. Мы пронумеровали их от I до VI. Уникальный вид имеют элекгрофореграммы сортов Wickery и Ripley. У Wickery пики I-III имеют наибольшую высоту, a Ripley отличается максимально высоким пиком со временем миграции 11,5 минут. Среди остальных сортов можно выделить группу Conrad, Elgin, Keller, Vinton и Williams 82, у которых вместо группы пиков IV - VI представлен только один (IV') со временем миграции 9,9 минут (рис. 2). При этом Vinton отличается минимальной высотой этого пика, остальные сорта можно различить по высоте пиков I - III.

Также в отдельную группу можно выделить сорта Flyer, Edison и Resnik. Все они отличаются высоким пиком II, но у Flyer пик IV отсутствует, у Edison он имеет малую высоту, а у Resnik он сравним по высоте с пиками V и VI. Сорт Pella похож на Resnik по высоте всех пиков, кроме II - го, а сорта Beeson и Century отличаются самой малой интенсивностью всех пиков и различаются по высоте пика VI.

Conrad

Время, мин.

Время, мин.

Рис. 2. Разделение белков ацетоновой фракции двух сортов сои (Conrad и Edison) методом ВЭКЭ

Таким образом, наши данные показывают, что ВЭКЭ, как чрезвычайно чувствительный метод анализа, позволяет проводить сортовую идентификацию сои и различать сорта по спектрам ацетоновой фракции, причём более эффективно, чем обычный ЭФ в ПААГ. Методом ЭФ в ПААГ мы отличили семь сортов сои: Flyer, Kenwood, Resnik, Ripley, Wickery, Pella и Conrad. ВЭКЭ позволяет различить все четырнадцать сортов.

Гетерогенность и полиморфизм ингибиторов протеиназ Баумана-

Бирк гороха.

Активность ингибиторов протеиназ Баумана-Бирк у различных сортов гороха. В таблице 4 представлены данные по активности ингибиторов трипсина у изученных нами озимых и яровых сортов гороха. Они подтверждают сведения о более высокой активности ингибиторов трипсина у озимых сортов гороха по сравнению с яровыми [Tome & Gaborit, 1989].

Гетерогенность ингибиторов протеиназ Баумана-Бирк гороха. Разделение белков кислого экстракта семян гороха проводили методом нативного ЭФ в ПААГ в щелочной среде. Поскольку сорта гороха различались по активности ингибиторов трипсина, то для анализа состава ингибиторов в каждую ячейку наносили экстракт с активностью ингибиторов трипсина примерно 4 TUL Это соответствовало разному соотношению мука : кислота при экстракции.

Таблица 4. Активность ингибиторов трипсина у сортов гороха.

Яровые сорта TUI/мг

1 Amino 2,22

2 Colmo 2,01

3 Darkskin 2,59

4 Finette 1,34

5 Mini 1,16

6 Terese 1,89

7 447 5,47

Озимые сорта TUI/мг

1 Amac 7,16

2 Frisson 8,72

3 Maro 8,67

4 449 8,09

Методом иммуноблоттинга с использованием кроличьих специфических антител к четырём формам ингибиторов протеиназ гороха, выделенным и очищенным в лаборатории биохимии и технологии белков Национального Института Сельскохозяйственных Исследований (МКА, Нант, Франция), у изученных 11 сортов гороха обнаружено 17 ингибиторов, проявляющихся у разных сортов в разном сочетании. Для их регистрации нами составлен суммарный спектр ингибиторов со всеми встречающимися изоформами (рис. 3). Данные по представленности их у разных сортов приведены в таблице 5. Для обозначения интенсивности нами принята трехбалльная система: слабому компоненту присваивается балл 1, среднему - 2 и интенсивному - балл 3.

12: 4 5 6 789. 10 11 12 13 14 15 16

í I I I i iiiii; ni ff I i i

+

Рис. 3. Суммарный спектр ИББ гороха.

Меньше всего ингибиторов оказалось у озимых сортов Amac, Frisson и 449. В них проявились восемь ингибиторов протеиназ. У сорта Maro добавился ещё один компонент с большей электрофоретической подвижностью - компонент 3.

Яровые сорта отличаются большим количеством ингибиторов. В них представлены от десяти до четырнадцати ингибиторов протеиназ. По их составу яровые сорта можно разделить на две группы: Amino, Colmo, Darkskin и Terese - в них с наибольшей интенсивностью проявляются компоненты 1, 4, 7, 9 и 15, а также Finette, Mini и 447, в которых наибольшую интенсивность имеют компоненты 7, 9,12 и 14.

Таблица 5. Представленность форм ингибиторов протеиназ у сортов гороха.

Формы ингибиторов протеиназ гороха

Сорт 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17

Атас 2 3 2 1 1 1 1 3

Frisson 2 3 2 1 1 1 3

449 2 3 3 1 1 1 1 3

Maro 2 2 3 2 1 1 1 3

Amino 2 2 1 1 3 3 2 2 2 1 3 1

Colmo 2 2 1 1 3 3 2 2 2 1 3 1

Darkskin 2 2 1 3 3 2 2 2 1 3 1

Terese 2 2 1 3 3 1 1 1 1 2

Finette 1 1 1 1 2 1 3 1 1 3 ? 3 1 1 2

Mini 1 1 1 2 1 3 1 1 3 ? 3 1 1 2

447 1 1 2 1 1 1 1 3 1 3 1 1 1

Определение ингибиторов протеиназ Баумана-Бирк в кислом экстракте методом высокоэффективного капиллярного электрофореза. Как известно, методы электрофореза позволяют идентифицировать отдельные компоненты смеси соединений по увеличению интенсивности того или иного компонента при добавлении его в смесь перед разделением. Этот принцип был использован для идентификации некоторых ингибиторов протеиназ в суммарном экстракте семян гороха методом ВЭКЭ.

При добавлении ингибиторов II, III, IVa и IVb гороха, выделенных и предоставленных нам лабораторией биохимии и технологии белков Национального Ин-

ститута Сельскохозяйственных Исследований (^ИА, Нант, Франция), к кислому экстракту того же сорта ЯгЛепе увеличивалась высота пиков со временами миграции 7.55, 7.54, 7.62 и 7.78 соответственно (рис. 4). Оказалось, что в экстракте компоненты с этими временами миграции являются минорными, и для идентификации ингибиторов необходимо обогащение экстракта этими веществами.

Проанализирована также возможность использования трипсина для идентификации его ингибиторов в смеси белков методом капиллярного электрофореза. Поскольку ингибиторы образуют достаточно стабильные комплексы с трипсином, то предполагалось, что по уменьшению высоты пиков, соответствующих ингибиторам трипсина, можно идентифицировать их в смеси. Попытки добавления трипсина в суммарный кислый экстракт белков гороха (сорт РгПепе) привели к изменению профиля электрофореграммы, связанному с протеолизом. Происходило значительное уменьшение высоты пика основного альбумина смеси и появление нескольких новых пиков, соответствующих продуктам протеолиза. Таким образом, для получения положительных результатов необходимо исключить протеолитическое действие трипсина, сохранив его способность образовывать стабильные комплексы со своими ингибиторами. Это возможно при использовании ангидротрипсина.

Время, мин, j

_____|

Рис. 4. Наложение электрофореграмм смесей экстрактов сорта Frilene с индивидуальными ингибиторами протеиназ гороха II, III, IVa и IVb.

Выделение и очистка двух форм ингибитора трипсина Кунитца из соевой сыворотки.

Как известно, в процессе производства изолятов и концентратов соевого белка осаждение глобулинов из водного экстракта соевого шрота происходит в кислой среде при рН ~4,3 с последующим центрифугированием и удалением на-досадочной жидкости, которую принято называть соевой сывороткой [Красильников, 1985]. При этом на один килограмм изолята приходится 16-17 л сыворотки, переработка которой является проблемой данного производства, так как обычно она направляется в сточные воды. В то же время появлялись сообщения [Rackis, 1959], что соевая сыворотка содержит ингибитор трипсина. В связи с этим нами были предприняты попытки проанализировать возможность переработки соевой сыворотки с целью получения активных препаратов ингибиторов трипсина.

Состав белков соевой сыворотки. Методом электрофореза в ПААГ в диссоциирующей системе после восстановления дисульфидных связей установлено, что в сыворотке отсутствует большинство компонентов запасных белков. Доминируют по интенсивности два компонента, совпадающие по подвижности с двумя компонентами очищенного коммерческого ингибитора трипсина Кунитца (Reanal). Кроме этих белков достаточно интенсивны лишь два высокомолекулярных компонента, природа которых не ясна. Исходя из этих данных был сделан вывод об обогащении соевой сыворотки ингибитором трипсина.

Методами слитного ракетного и перекрестного иммуноэлектрофореза в сыворотке выявлены пять белковых компонентов. Преципитаты компонентов 1 и 3 сливаются с линиями преципитации коммерческого ингибитора трипсина, что говорит об их идентичности. Они обозначены нами А и В. В перекрёстном иммуно-электрофорезе коммерческого препарата ингибитора трипсина проявилась большая электрофоретическая подвижность компонента В по сравнению с компонентом А. Нашей задачей явились выделение и очистка обнаруженных белков А и В.

Выделение и очистка А и В форм ингибитора трипсина Кунитца из соевой сыворотки. Сывороточные белки разделяли методом ионообменной хроматографии на ДЭАЭ-сефадексе А-50. При линейном градиенте концентрации NaCI от 0,1М до 0,35М наблюдали образование 6 пиков (рис.5). Наиболее раз-

решенными оказались пики V и VI. После промывания колонки буфером с 0,5 М NaCI наблюдали образование седьмого, самого высокого пика. Для анализа методом слитного ракетного ИЭФ каждый пик был разделен на три участка, за исключением самых плохо разрешенных пиков II и IV. В соответствии с этим были получены 17 фракций, которые диализовали и лиофилизировали.

Методом слитного ракетного иммуноэлектрофореза установлено распределение пяти белковых компонентов сыворотки по пикам. Ингибитор трипсина А элюировался в VI пике. В виде примесей в этой фракции присутствовали компоненты 2 и 5. Ингибитором В был значительно обогащён пик VII. В качестве примесей в нём присутствовали компонент 4 и ингибитор А.

Наличие примесей во фракциях белков А и В привело к необходимости их дополнительной очистки. После рехроматографии, проведённой также на ДЭАЭ-сефадексе А-50 при выпуклом градиенте концентрации NaCI от 0.15 до 0.35 М были отобраны фракции, проверка чистоты которых методом слитного ракетного и перекрёстного ИЭФ показала практическое отсутствие примесей.

D280 0.4 0.3 0.2 0.1 0.0

"I-1-I-1-Г

100 200 300 400 500 V элюата, мл

600

CNaci, м 0.5

0.3

0.1

Рис. 5. Диаграмма градиентной элюции сывороточных белков при ионообменной хроматографии. 1 -17 - номера фракций

Данные по содержанию активного ингибитора трипсина в препаратах на стадиях очистки представлены в табл. 6. Поскольку активность ингибитора В в очищенном препарате составляет почти 100%, то, по-видимому, ингибитор А обладает вдвое меньшей активностью, чем ингибитор В, либо его активность снижалась в два раза больше в процессе очистки.

Методом ЭФ в ПААГ в присутствии ДДС-Ыа определены примерные молекулярные массы ингибиторов трипсина А и В. Они составили 21000 и 20000 соответственно. Аминокислотный состав ингибитора В близок аминокислотному составу соевого ингибитора трипсина Кунитца. Количества второго выделенного ингибитора - ингибитора А - было недостаточно для проведения аминокислотного анализа. Но, судя по его молекулярной массе, можно предположить, что он также относится к группе ингибиторов трипсина Кунитца.

Таблица 6. Активность препаратов ингибиторов А и В на стадиях очистки.

Препарат Ингибитор А Ингибитор В

% активного ингибитора в препарате выход, % % активного ингибитора в препарате выход, %

Сывороточные белки 100 100

Препарат после хроматографии 40 17 77 56

Препарат после рехроматографии 47 14 99 28

Таким образом, с помощью методов иммунохимии было установлено наличие пяти белковых компонентов в препарате сыворотки. Два из них, обозначенные нами А и В, выделены в чистом виде и представляют собой ингибиторы трипсина, принадлежащие к группе ингибитора трипсина Кунитца.

Выводы

1. Методами электрофореза и желатиновых реплик во фракции белков семян сои, осаждаемых ацетоном из спиртового экстракта, выявляются белки, обладающие трипсин- и химотрипсин-ингибирующей активностью, которые могут быть идентифицированы как ингибиторы протеиназ Баумана-Бирк.

2.У исследованных сортов сои обнаружено восемь форм ингибитора про-теиназ Баумана-Бирк, различающихся по электрофоретической подвижности, представленности и интенсивности проявления у разных сортов.

3.Состав электрофоретических компонентов ацетоновой фракции и ингибиторов протеиназ Баумана-Бирк обладает более выраженной сортовой специфичностью, чем состав запасных белков и состав фрагментов ДНК, выявляемых методом RAPD.

4.Капиллярный электрофорез позволяет выявлять сортовые различия во фракции белков сои, обогащённой ингибиторами протеиназ Баумана-Бирк. Элек-трофореграммы этой фракции у сортов сои характеризуются сочетанием нескольких пиков с одинаковой подвижностью, но разной высотой.

5.У сортов гороха с различной активностью ингибиторов трипсина методом капиллярного электрофореза с использованием очищенных препаратов ингибиторов идентифицировано несколько форм ингибиторов протеиназ Баумана-Бирк.

6. Методом иммуноблоттинга у разных сортов гороха выявляются от восьми до четырнадцати ингибиторов протеиназ Баумана-Бирк. Наибольшие различия по их составу наблюдаются между группами озимых и яровых сортов, меньшие - между сортами ярового гороха. Сорта озимого гороха близки между собой по составу ингибиторов Баумана-Бирк.

7.Ингибитор трипсина Кунитца в соевой сыворотке, являющейся отходом при производстве белковых изолятов, представлен двумя иммунохимически неидентичными формами с близкими молекулярными массами, и различной инги-бирующей активностью.

Практические рекомендации

1.Для скрининга коллекции, а также для оценки исходного и селекционного материала бобовых на наличие и состав ингибиторов протеиназ рекомендуется применять методы желатиновых реплик и иммуноблоттинга.

2.По результатам изучения гетерогенности и полиморфизма ингибиторов протеиназ Баумана-Бирк у 30 сортов сои различного происхождения выявлены 9 низкоингибиторных сортов (Roanoke, Altona, Beeson, Century 84, Keller, Ripley, Vinton, Lee, Wilkin), которые могут быть рекомендованы как источники для селекции на улучшение питательной ценности, тогда как высокоингибиторные сорта

Conrad, Edison, Pella, Bavender Special С и Trasy M перспективны в качестве сырья для фармацевтической промышленности.

3.Электрофорез белков ацетоновой фракции может быть рекомендован для разработки метода сортовой идентификации сои.

4.Соевая сыворотка, являющаяся отходом при производстве белковых изолятов, может быть использована для выделения двух форм ингибитора трипсина Кунитца. Для контроля степени очистки препаратов рекомендуется использовать количественные иммунохимические методы.

б.Сорта озимого гороха, характеризующиеся более высокой трипсин-ингибирующей активностью, чем яровые, перспективны в качестве источников для промышленного выделения препаратов ингибиторов протеиназ.

По материалам диссертации опубликованы следующие работы:

Ч.Доморощенкова М. Л., Редько Ю. В., Красильников В. Н. Получение препаратов ингибитора трипсина из семян сои // Тезисы докладов научно-практической конференции с международным участием «Пути решения проблемы пищевого белка в Украине на 1994-1995 годы и до 2000 года», Киев, 1994.

2. Редько Ю. В. Полипептидный состав ингибиторов протеаз сои // Тезисы Международной научно-практической конференции «Люпин и амарант - источники новых пищевых и диетических продуктов» 28-31 октября 1996, Санкт-Петербург, с. 60 - 62.

3.Редько Ю. В. Полипептидный состав ингибиторов протеаз Баумана-Бирк сои // Материалы конференции аспирантов и молодых учёных ВИР 24 марта 1997 г., Санкт-Петербург (в печати).

4.Komissarova Ju. V., Isolation of Kunitz trypsin inhibitors from soy whey. Abstracts of the 5th International Symposium on Food Proteins, September, 1-4, 1997, Potsdam, Germany, p. 25.

5.Комиссарова Ю. В. Выделение двух форм ингибитора трипсина Кунитца из соевой сыворотки // Прикладная биохимия и микробиология (в печати).