Связывание рибосомных белков S5 и S16 человека с участком 1203-1236/1521-1698 3`-концевого домена 18S pРНК

Яньшина, Дарья Дмитриевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Связывание рибосомных белков S5 и S16 человека с участком 1203-1236/1521-1698 3`-концевого домена 18S pРНК
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Связывание рибосомных белков S5 и S16 человека с участком 1203-1236/1521-1698 3`-концевого домена 18S pРНК"

1 la правах p\ копнен

ЯНЬШИНЛ ДАРЬЯ ДМИТРИЕВНА

СВЯЗЫВАНИЕ РИБОСОМНЫХ БЕНКОВ S5 II S16 ЧЕЛОВЕКА С УЧАСТКОМ 1203-1236/1521-1698 З'-КОНЦЕВОГО ДОМЕНА 18S рРНК

03 00 04 - биохимия

Авюреферат диссертации lu соискание ученой степени кандидата биологических наук

□03170982

Новосибирск - 2008

003170982

Работа выполнена в Институте химической биологии н фундаментальной медицины СО РАН

Научные руководители

д х н, профессор Карпова 1 алчна Георшсвна к \ н Малыгин Алексей Аркадьевич

Официальные оппоненты

д б н, доцент Бунева Валентина Николаевна д б н, профессор Загребельный Станислав Николаевич

Ведущая организация Научно-исследовательский институт

фи шко-хнмической биологии им А Н Бслозерскою, МГУ им М В Ломоносова

Защита состоится « 19 » июни 2008 г в 9'"' часов на заседании диссертационного совета Д 003 045 01

при Инсгитуте химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН по адресу 630090,1{овосибирск, нр ак Лаврентьева, 8

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института химической биологин и фундаментальной медицины СО РАН С авторефератом можно очнакомшься на сайге www niboch ii.se iu

Автореферат разослан « » 2008 г

УчСный секретарь диссертационного совета

к х н, доцент ' у Коваль В В

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РЛЬО! Ы

Akiv.i'ibiiocir> проблемы Рибосома - это миоюктиюисчпия дгакромолекулярная к 1стич1ыя машипа, осущсств тяющая процесс биоиппеза бетка в клетке Изучение структурно-функциональной топографии рибосом важно не только дтя понимания молскутярных механизмов биоиппеза бежа, но п для разработкгг подходов к регуляции этот процесса К настоящему времени пространственная структура рибосом прокариот детально щучена с помощью рентгеноструктурного анализа (см , например, (Biodeisen et al, 2002, Selmei et al, 2006)), в го же время структура рибосом зукарнот, особенно высших, остается намного менее нее 1едованной По-видимому, но связано с тем, что многие m методов, успешно применяемых для изучения бактериальных рибосом, пока что не могут быть пепотыовапы для исстедования структуры рибосом эукарног Это касается прежде всего метода рештенострукгурного анализа (РСА), носкотьку крнсгатлы зукарношческнч рибосом, пршодные для РСА, пока не получены, а также методов, основанных на реконструкции рибосомных субчаешц из белков и рРНК, так как до eux пор не найдено подходов к сборке функционально-активных субчаешц рибосом эукарног из рРНК и беiKOBin vino

Один hí наиболее доступных на сегодняшний день подходов к изучению РНК-белковых взаимодействий в рибосомных субчастпцах эукарног основан на использовании рекомбипаптных рибосомных белков п фрагментов РНК, отвечающих за ли взаимодействия [акие фрагменты \ioryi быть получены в системе транскрипции ш \itio Аналогичный подход был успешно использован ранее для изучения взанмодепсiвия разтичных прокарнотичсскнх рибосомных белков с РНК-транекриптами, соответствующими фрагментам 16S рРНК, содержащим участки связывания этих белков (см , наирпмер, (Diagon and Biakici-Gingias, 1993, Giegoiy et al, 1988, Рассохин и еоавт , 2001))

IXe.ni и задачи исследования. Целью настоящей работы являлось изучение диссоциации 40S еубчастнц рибосом человека в градиенте концентрации моновалентных катионов дтя выявления так наливаемых сердцевинных рибосомных 6ejiKOB, которые наиболее прочно удерживаются на 18S рРНК, и исследование связывания некоторых из них, в частности белков S5 и S16 с í8S рРНК с помощью вышеуказанною подхода. Рибосомпыи белок (ip от ашл iibosomal piotein) S- roMOTOi rpS7 прокариот, a rpSló -юмолог ipS9 (Wool et al , 1996), участки связывания rpS7 и ipS9 на 16S рРНК известны В качестве модельной РНК выбран фрагмент главного З'-концсвого домена I8S рРНК чеговекл (нуктсошды 1203-1236/1521-1698) (фрагмент 3Dm), гомологичный району 16S рРНК, содержащему участки связывания ipS7 и ipS9

Основными задачами являлись

— определение ггорядка диссоциации рибосомных белков из 40S субчастиц при увеличении копцешрацни LiCl (0 3-1 5 M) в присутствии 4 мМ MgCh н 05 M КС1 и идентификация белков, наиболее сильно удерживающихся на 18S рРШС,

— xapjMернзация связывания rpS5 u ipS16 человека с фрагментом 3Dm и определение тгуклеогндных остатков этого фрагмента, изменяющих свою доступность зондам в нрисутст вин зт их белков,

— определение взаимного влияния ipS 16 и ipS5 на связывание каждого гн них с фрагментом 3D'ít

— сопоставление полученных резулыатов по связыванию ipS5 и rpS16 с фрагментом 3Dm с рентгенострук1урнычн данными о контактах rpS7 н rpS9 с I6S рРНК в 30S субчастпце

Научная повита и практическая ценность. В настоящей работе впервые установлен порядок диссоциации белков из малои субчастпцы рибосомы человека при по ¡расгаюгдсй концензрации моновалентных катионов и изучено связывание двух сердцевинных рнбосомных белков - S5 и SI6 с фрат ментом 18S рРНК, соответствующим району 16S рРНК, содержащему участки связывания гомотошчных рнбосомных белков бакгерий - S7 и S9 соответственно Выявлены отличия в порядке диссоциации рнбосомных белков и) 30S и 40S субчастиц под действием моновалет ны\ катионов, и в характере связывания белков S5 и SI6 и их прокарнотических гомологов с соответствующей рРНК С помощью футпршггинга впервые получено представление об участках связывания рибосочных белков S5 и S16 человека на I8S рРНК Полученная в настоящей работе информация пмеет важное значение для понимания молекулярных основ РНК-белковых взаимодействий в малых субчастицах рибосом млекопитающих, а накопление такого рода информации служит первым шагом в их реконструкции in vilto

Апробация работы. Результаты работы были представлены на международном рабочем совещании "Biosphere Origin and Evolution" (Новосибирск, 2005), международной конференции "Физико-химическая биология", посвященной 80-лсшю академика Д Г Кнорре (Новосибирск, 2006), XVUI Менделеевском съезде по общей и прикладной химии (Москва, 2007), HI российском симпозиуме "Белки и нет иди" (Пущино, 2007) и II международном молодежном медицинском конгрессе «Санкт-Г1етсрбур1 екпе научные чштя-2007» (Санкт-Петербург, 2007)

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 4 печатные работы Структура работы Диссертация изложена на 133 страницах машинописного текста, состоиг из введения, грех глав, выводов, списка литературы и содержит 5 таблиц и 45 рисунков

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ 1 Диссоциация белков из 40S субчастиц рибосом человека в градиенте концентрации хлористого лития

В настоящей работе для диссоциации 40S субчастиц рибосом человека использовали подход, основанный на выщеплешш белков из субчастиц в градиенте концентрации LiCl Для отделения этих белков от недиссоциировавшего рибонуклеопротеида центрифугирование 40S субчастиц проводили в линейном градиенте плотности сахарозы, для приготовления которого использовали 10%-ную сахарозу, содержащую 0 3 M LiCl и 30%-ную сахарозу, содержащую 1 5 M LiCl Таким образом, выщепление рибосомиых белков из субчастиц осуществлялось постепенно по мере их продвижения из области градиента с меньшей концентрацией LiCl (0 3 M) в область с большей концентрацией (1 5 М) Выщепляющиеся белки оставались практически в тех же областях градиента, где происходила их диссоциация из субчастиц, благодаря их небольшому коэффициенту седиментации и слабой диффузии Условия центрифугирования были подобраны так, чтобы 18S рРНК немного не достигала дна пробирки, а пологость градиента LiCl позволяла бы получить максимальное разрешение (рис 1) Следует отметить, что на всем протяжении градиент содержал 0 5 M КС1, который также оказывал влияние на диссоциацию белков Поэтому далее при анализе мы рассматриваем суммарную концентрацию моновалентных катионов (LiCl + КС1)

А2К4 |[UCI+KCI]M

Рис. 1 Профиль седиментации 40S субчастнц в градиенте плотности сахарозы (10-30%) и концентрации LiCl (0 3-15 M) Непрерывная линия

А2в), пунктирная линия концентрация LiCl Внизу указаны номера фракций градиента

После центрифугирования

содержимое пробирок

фракционировали через проточную кювету микроспектрофотометра "Милихром", регистрируя оптическую плотность при длине волны 260 нм Содержание рибосомиых белков в каждой фракции анализировали с помощью одномерного (Ш) и двумерного (20) гель-электрофореза В первом случае каждую фракцию градиента сначала инкубировали со смолой "5&а1аС1еап", затем связавшиеся с ней белки элюировали буфером, содержащим 2%-ный додецилсульфат натрия (БОБ), после чего разделяли их электрофорезом в 14%-ном полиакриламидном геле (ПААГ) в присутствии 8С)5 Окрашенный после разделения белков гель представлен на рис 2 Видно, что диссоциация рибосомиых белков при центрифугировании 40Б субчастиц в вышеуказанных условиях происходила в интервале концентраций моновалентных катионов (1лС1 + КС1) от 0 8 до 1 55 М Хотя указанный диапазон концентраций включает 11 фракций градиента (рис 2, фракции 6-16), даже те белковые полосы, которые соответствуют индивидуальным белкам, присутствуют, как правило, на пяти-шести дорожках Таким образом, область концентраций моновалентных катионов, в которой происходит диссоциация того или

1 5-

1 0-

0 5"

-1 5 -1 0 -05

M I I I I I I I I I I I I I I I 0

1 3 5 7 9 11 13 15 Номер фракции

дно

верх

WS 16 16 14 13 12 11 10

Ht1

'SIIIM-

111=

SIS-

si7. sis, sga. ——

,„ sussa sis—

s,! SI9.S26-

S 20 — I

S! 7 S2I S27a

S30 —

}

иного белка, довольно широка, при этом области диссоциации отдельных белков сильно перекрываются. Тем не менее, обращает на себя внимание тот факт, что большая часть белков 40S субчастицы, за исключением rpS5, rpS20, rpS21, rpS27, rpS27a. rpS28 и rpS29, начинает диссоциировать практически одновременно при концентрации соли 0.8 М,

Позже, при концентрации моноваяентных катионов 1.03 М, начинается диссоциация rpS5. rpS28 и двух белков из группы (ipS21, rpS27, rpS27a и rpS29), при концентрации 1.1 M - rpS20, а при концентрации 1.18 M - двух оставшихся белков из группы (rpS21, rpS27, rpS27a и rpS29) (рис. 2). Таким образом, при концентрации 1.18 M (рис 2, фракция 11) происходила диссоциация всех рибосомных белков 40S субчастицы. Далее, с увеличением концентрации моновалентных катионов можно наблюдать постепенное исчезновение некоторых белков из фракций градиента (рис 2, фракции 10-6). При концентрации моновалентных

катионов 1.48 M (фракция 7) с 18S рРНК остаётся связанной только часть белков. удерживаемых наиболее прочно: rpS3, rpS5, rpS7, rpSIO, rpS15, rpS 16, rpS 17/rpS 18/rpS25, rpS 19, rpS20 и rpS28. Во фракции 6 можно наблюдать те же белки, что и во фракции 7, однако наиболее интенсивно окрашенными из них являются rpS7, rpSIO, rpS 16 и rpS 19. И, наконец, в случае фракций 5-3 (концентрация соли 1.63-1.78 М) никаких белковых полос в геле не наблюдали.

С помощью 1D гель-электрофореза невозможно добиться полного разрешения всех белков 40S субчастицы - некоторые полосы содержат несколько белков, обладающих одинаковой электрофоретической подвижностью, поэтому белковое содержание каждой фракции дополнительно анализировали 2D гель-электрофорезом. Для этого белки в каждой фракции градиента сначала осаждали 10%-ной ТХУ, осадок промывали ацетоном, затем разделяли их с помощью 2D гель-электрофореза (рН 8.3 в первом направлении и рН 4.0 во втором), с последующим окрашиванием кумасси. На рис. 3 в качестве примера приведены результаты разделения белков, выделенных из фракций 12, 9, 8 и 6. Сравнивая 2D электрофореграммы между собой (рис. 3 б-д) и с картиной разделения белков 40S субчастиц рибосом человека в этих же условиях (рис. За), можно видеть ослабление или исчезновение отдельных пятен белков с увеличением концентрации соли. Следует отметить, что при идентификации белковых пятен на 2D электрофореграммах принимали

1.25 1.9 Î 1.33 I

Рис. 2. Анализ содержания белков во фракциях градиента электрофорезом в 14%-ном ПААГ в присутствии 808. Гель окрашен кумасси. Номера дорожек соответствуют номерам фракций на рис. 1. Слева указаны положения индивидуальных рибосомных белков (точные положения белков 512, 821, 521, 521л и 529 неизвестны). Внизу под дорожками указана концентрация моновалентных катионов (ЫС1+КС1) в данной фракции градиента

во внимание результаты анализа соответствующей фракции Ю электрофорезом (рис. 2). Видно, что на электрофореграмме белков, содержащихся во фракции 12, соответствующей концентрации моновалентных катионов 1.1 М (рис. 36), присутствуют пятна практически всех белков (как и можно было ожидать из результатов анализа этой фракции 10 гель-электрофорезом).

Первое направление, pH 8.3

»«•Д sra s„

S5.S7 Г > »•'.SB

S^ S2J/S»S2i

Рис. 3. Анализ содержания рибосомных белков во фракциях граднента с помощью 2D гель-электрофореза (Madjar et al., 1979).

а - Типичная 2D электрофореграмма белков 40S субчастицы рибосомы человека, окраска кумасси. 6-д - Разделение белков, выделенных из фракций градиента 12. 9, 8 и 6 соответственно: обозначены наиболее яркие пятна белков.

На электрофореграмме белков, выделенных из 8 фракции 9, в которой

концентрация соли составляла 1.33 М (рис. Зв), помимо отчётливо наблюдаемых пятен S14/S15, S16/S18, S17, S19 и S20, видны слабоокрашенные пятна некоторых других рибосомных белков (S2, S3/S3a, S4, S5/S7, S8, S10, S23/S24/S25 nS28). На электрофореграмме белков из фракции 8 (рис. Зг), где концентрация моновалентных катионов была 1.4 М,

видны только белки S3, S5/S7, S10, S15, S16. S17, S19, S20 и S28. Те же самые белки наиболее сильно окрашены на соответствующей дорожке геля после 1D электрофореза (рис. 2, фракция 8). Поскольку на 2D гель-электрофореграмме отсутствовали пятна, соответствующие белкам S18, S23 и S24 (рис. Зг), то, следовательно, полосе, отнесённой к белкам rpS17/rpS18/rpS23/rpS24 на 1D гель-электрофореграмме (рис. 2, фракция 8) соответствует rpS17. На электрофореграмме белков из фракции 6 (рис. Зд) присутствовали слабоокрашенные пятна rpSlO, rpS19, rpS20 и следы rpS15, rpS 16 и rpS17. С другой стороны, анализ этой же фракции одномерным гель-электрофорезом (см. выше) дал более широкий набор белков, причём rpS7, rpSlO, rS 16 и ipS 19 были основными в этом наборе (рис. 2, фракция 6). Эти различт могли быть связаны как со слабым переходом белков rpS7, rpSlO и rpS 16 из геля первого направления в гель второго направления, так и с

разной эффективностью окрашивания рибоеомных белков после их разделения 2D гель-электрофорезом Все это не позволяло делать количественные оценки на основании интенсивности окрашивания белков на 2D гель-электрофореграмме В то же время, из данных 1D гель-электрофореза (рис 2, фракция 6) можно заключить, что rpS7, rpSIO, rpS 16 и rpS 19 оставались связанными с 18S рРНК до концентрации моновалентных катионов 1 55 M

Условия разделения белков в первом направлении 2D гель-электрофореза (рН 8 3) не позволяли получить информацию о кислых белках (rpS12, rpS21) Кроме того, низкомолекулярные белки, особенно rpS27, rpS27a и rpS29, из-за слабого окрашивания могли быть незамечены на 2D гель-электрофореграммах Однако из данных 1D гель-электрофореза (рис 2) видно, что вышеперечисленные белки не входят в набор белков, наиболее прочно удерживаемых на 18S рРНК Кроме того, дополнительный анализ белкового содержания некоторых фракций градиента в другой системе 2D гель-элекгрофореза (рН 5 5 в первом направлении и рН 4 0 во втором), показал, что rpS12 и rpS21 полностью диссоциируют из 40S субчастицы уже при концентращш соли 1 3 M (соответствующие 2D электрофореграммы не приведены)

Чтобы убедтъся, что 18S рРНК после центрифугирования в указанном градиенте не содержит следовых количеств белков, оставшихся связанными с ней, фракции градиента, содержащие рРНК (рис 2, фракции 2-5), объединяли, осаждали спиртом, осадок растворяли в буфере, содержащем 2%-ный SDS, и анализировали 1D гель-электрофорезом Гель окрашивали геля кумасси и серебром, при этом никаких белковых полос в геле не обнаружено (соответствующие электрофореграммы не приведены)

Таким образом, суммируя полученные результаты можно заключить, что 40S субчастица рибосомы человека полностью диссоциирует на белки и 18S рРНК в интервале концентраций моновалентных катионов 0 8-1 55 M Белки S3, S5, S7, S10, S15, S16, S17, S19, S20 и S28 способны удерживаться на 18S рРНК наиболее сильно и поэтому могут быть отнесены к сердцевинным или коровым белкам 40S субчастнцы При 1 55 M концентрации соли происходит практически полное отщепление этих белков от 18S рРНК, хотя следовые количества rpS7, rpSIO, rpS 16 и rpS 19 остаются связанными с ней до 1 63 M концентращш

2. Связывание rpS5 и rpS16 человека с фрагментом 1203-1236/1521-1698 18S рРНК

Из четырех белков 40S субчастицы рибосомы человека, наиболее сильно удерживающихся на 18S рРНК, три белка - rpS7, rpSIO и rpS19 эукариотспецифичны, а прокариотический гомолог rpS 16 - rpS9 относится ко второй группе белков согласно порядку его присоединения к 16S рРНК при сборке 30S субчастицы Известно, что для связывания rpS9 с 16S рРНК необходимо предварительное связывание сердцевинного rpS7, который инициирует сборку ее З'-главного домена (Held et al, 1974, Novotny and Nierhaus, 1988) Гомологом rpS7 является rpS5 человека (Wool et al, 1996), который также отнесен нами к коровым белкам, но его диссоциация из 40S субчастицы под действием моновалентных катионов происходит быстрее, чем диссоциация rpS16 В связи с этим, в качестве первого шага к сборке малой субчастнцы рибосомы человека m vitro, представляло интерес изучить взаимодействие сердцевинного белка rpS16 с 18S рРНК и

определить каким образом влияет это взаимодействие на связывание другого сердцевинного белка - rpS5

Один из доступных на сегодняшний день подходов к изучению РНК-белковых взаимодействий в субчастицах рибосом эукариот основан на использовании рекомбинантных рибосомных белков и РНК-транскриптов, моделирующих различные структурные домены рРНК Поскольку данных о молекулярных контактах rpS 16 в 40S субчастице рибосомы эукариот пока нет, то при выборе наиболее подходящего для связывания с rpS16 фрагмента 18S рРНК мы исходили из данных о пространственной организации rpS9, прокариотического гомолога rpS 16, в 30S субчастице Т thermophiliis, полученных с помощью РСА (Brodersen et al, 2002, Wimberly et al, 2000) Согласно этим данным rpS9 одной стороной контактирует с участком З'-концевого домена, образованным спиралями Н38-Н40, а противоположной стороной - с другим участком этого же домена, состоящим из спиралей Н28-Н30 и Н41-43 и обеспечивающим большую часть контактов rpS9 с 16S рРНК Этот район рРНК (спирали Н28-Н30 и шпильки Н41-Н43) обладает высокой филогенетической консервативностью в про- и эукариотах (Cannone et al, 2002) и содержит также полный участок связывания rpS7 Поэтому для изучения связывания rpS 16 и rpS5 человека с 18S рРНК мы выбрали ее фрагмент 12031236/1521-1698 (фрагмент 3Dm), содержащий спирали Н28-Н30 и шпильки Н41-Н43 ДНК-матрицу для синтеза этого фрагмента 18S рРНК получали с помощью ПЦР, фрагмент 30т-Т7-транскрнпцией m мпо

3. Комплексообразование белков и 816 с фрагментом ЗОш

Связывание гр516 или гр55 с фрагментом ЗОга проводили при 0°С в буфере, содержащем 250 мМ КС1 Комплексообразование изучали методом фильтрования на нитроцеллюлозных фильтрах Для этого проводили титрование меченого фрагмента ЗОгп гр816 (или гр55) в условиях, когда концентрация белка значительно превышает концентрацию РНК В контрольных опытах использовали рекомбинантные rp.SK) и гр826

человека Изотермы адсорбции представлены на рис 4 За кажущуюся константу диссоциации (А",,) комплекса принимали значение концентрации белка, при которой до 50% РНК, способной связываться с белком, находится в комплексе Можно видеть, что оба белка способны связываться с фрагментом ЗБщ, образуя стабильные комплексы со значениями Ка порядка 109 М (рис 4), сопоставимыми со значением К,> комплекса грБ7 с 16Б рРНК (Рассохин с соавт, 2001) О специфичности связывания свидетельствует тот факт, что сродство других рибосомных белков, в частности грЗЮ и гр526, к этому фрагменту, на порядок ниже, чем у белков 516 и 85 (см рис 4) Оказалось, что гр816

10"° [Белек] M

Рис.

Изотермы связывания рекомбинантных гр85, грв16, грЯЮ и гр826 человека с меченым фрагментом ЗОт при 20° С в присутствии 4 мМ

Mg2+ и 250 мМ К+ Относительная ошибка измерений составляла не более 10%

способен самостоятельно связываться с фрагментом 3Dm в отличие от своего прокариотического гомолога rpS9, который связывается с 16S рРНК только в присутствии rpS7 (Mizushima and Nomura, 1970), что, по-видимому, отражает принципиально различные пути сборки малых рибосомных субчастпц в клетках про- и эукариот

4. Химический и/илп ферментативный футпринтинг фрагмента 3Dm в комплексе с

rpS16 или rpS5

Для исследования связывания 18S рРНК с rpS16 и rpS5 использовали метод футпринтинга, который в силу своих ограничений хотя и не дает информации о непосредственных контактах между белком и РНК, но позволяет получить представление о том, какие участки РНК могут быть вовлечены в связывание с белком

Футпринтинг меченного [Р12] по 3'- или по 5'-концу фрагмента 3Dm в присутствии rpS16 и/или rpS5 проводили в условиях, когда практически вся РНК находилась в комплексе с белком Продукты ограниченного гидролиза этого фрагмента каждым из молекулярных зондов анализировали электрофорезом в 12%-ном денатурирующем ПААГ Для установления положения нуклеотидов РНК, изменяющих свою доступность действию зондов в присутствии rpS16 и/или rpS5, одновременно на соседние дорожки ПААГ наносили щелочной и ферментативный гидролизаты фрагмента 3Dm, в последнем случае для гидролиза использовали РНКазы Т1 и PhyM При анализе результатов футпринтинга учитывали, что наблюдаемые на радиоавтографе полосы означают расщепление фосфодиэфирных связей с 3'-стороны от нуклеотидных остатков, соответствующих этим полосам

41. Ферментативный и химический футпринтинг фрагмента 3Dm в комплексе с

rpS16

Для футпринтинга фрагмента 3Dm в присутствии rpS16 в качестве зондов применяли РНКазы Т1, Т2 и VI, а также ENU и систему Fe2+/EDTA/H202 Результаты футпринтинга представлены на рис 5 В присутствии rpS16 наблюдали выраженное повышение степени расщеплегаи фрагмента 3Dm ENU и РНКазами Т2 и VI по нуклеотиду С1544 (участок I) (рис 5а), расположенному во внутренней петле шпильки Н41 (рис 6) Кроме того, происходило изменение степени расщепления химическими и ферментативными зондами по нуклеотидам С1628-А1634 (участок II) и С1618-А1623 (участок III) (рис 56), расположенным в базальной и апикальной частях шпильки Н42 соответственно (рис 6) В присутствии rpS16 наблюдали также защиту нуклеотидов С1670-А1675 (участок IV) и A1647-G1652 (участок V) (рис 56) фрагмента 3Dm от гидролиза РНКазой Т2 Наконец, увеличивалась степень расщепления этого фрагмента химическими зондами по нуклеотидиым остаткам С1645, С1646 и G1648 (рис 56) основания шпильки Н43 (рис 6) и по нуклеотидам С1521-С1523, U1530 и С1532 (рис 5а) в спирали Н30 (рис 6) Результаты по футпринтингу фрагмента 3Dm в присутстыга rpS16 в целом согласуются с данными о взаимодействии rpS9 с 16S рРНК в 30S субчастице Т thermophilm (Yusupov et al, 2001, Brodersen et al, 2002), за исключением результатов, касающихся изменения доступности нуклеотидов к действию зондов в участках II и III

Рис. 5 Футпринтннг фрагмента 3Dm в комплексе с rpSlfi Радиоавтографы гелей после элекггрофоретнческого разделения продуктов расщепления 3Dm 5'-[32Р]-меченого (панель я), либо 3'-[ г]-меченого (панель б) Дорожки Tl, Т2 и VI - гидролиз фрагмента 3Dm свободного (-) и в комплексе с rpS16 (+) РНКазами Tl, Т2 и VI соответственно Дорожки ENU и Fe -модификация 3Dm свободного (-) и в комплексе с rpSl 6 (+) ENU и гидроксильными радикалами, генерируемыми в системе Fe27EDTA/H202 Дорожки G, A+U и ОН - определение последовательности нуклеотидов меченого 3Dm с помощью РНКаз Т1 и PhyM и ограниченного щелочного гидролиза соответственно Дорожки К и КВ - меченый 3Dm до и после инкубирования с rpS16 в условиях связывания соответственно Цифры справа от панелей а и 6 - номера нуклеотидов Цифры внизу панелей а и б - номера дорожек Стрелками отмечены участки наблюдаемого изменения доступности нуклеотидных остатков 3Dm зондам при комплексообразовании с rpSlö

Нуклеотид С1544, степень расщепления по которому РНКазой Т2 (рис 5а) повышалась в присутствии rpS16, соответствует нуклеотиду С1230 в 16S рРНК Т thermophüus (Cannone et al, 2002), образующему в 30S рибосомной субчастице вместе с А1231 пять водородных связей с остатками G67, G68, Q73 и Е12 белка S9 (Brodersen et al, 2002) Филогенетический сравнительный анализ первичных структур rpS9 Т thermophihn и гомологичных белков у других прокариот, архей и эукариот (рис 7) показал, что остаткам G67, G68 и Q73 в rpS9 соответствуют те же самые аминокислотные остатки в гомологичных белках эукариот, а остатку Е12 - серии (у дрожжей) и треонин (у человека), которые также способны быть акцептором протона Моделирование пространственной структуры rpSlö человека с помощью программы ESyPred3D (Lambert et al, 2002) показало, что структуры rpSlö человека и rpS9 Т thennophilus похожи (рис 8) Поэтому можно предположить, что характер взаимодействия rpS9 с 16S рРНК Т thennoplulin в области динуклеотида i2ioCpAi23i эволюционно консервативен и обнаруженное нами уменьшение степени расщепления фрагмента 3Dm в присутсшш rpS 16 по нуклеотиду С] ш отражает взаимодействие этого белка с динуклеотидом 1544CPA1545

УЧАСТОК

Н28

1210

Н29 1220 д0'

gacgaagggca ac u v I I I I I И I I I I II

ACUGUUJCCCGU US

1560-(J

1550-Q AU GCG Л- A-1580

1690

s0<£wm I'iic. 6. Вторнчная i2m-g_c-i52i r Gc структура района

18S pPHK человека, соответствующего фрагменту 3Dm, согласно (Cannone et ни al., 2002). Нумерация

шпилек и спиралей рРНК приведена согласно (Brimacombe, 1991). нумерация нуклеотидов дана для 18S рРНК человека (Cannone et al., 2002). Участки РНК,

доступность которых зондам при

связывании фрагмента 3Dm с rpSl 6 уменьшалась, отмечены красными стрелками с голубыми кружками, увеличивалась - с

зелеными кружками. Нуклеотиды, доступность которых одним зондам увеличивалась, а другим зондам - уменьшалась, отмечены красными стрелками с сиреневыми кружками. Ширина всех стрелок пропорциональна интенсивности модификации нуклеотидных остатков.

уч»

участокIV

_С С А

часток II

участок III

Нуклеотид 01648, доступность которого химическим зондам в присутствии гр516 повышалась, и нуклеотиды Ш673 и С1674, чья доступность РНКазе Т2, наоборот, уменьшалась, соответствуют нуклеотидам 01328,Ш354 и 01355 16Э рРНК.

08ТРГ7 P-S9_ANASP POA7.ïî|PJJ9_ECOLI Р057£}| PJ3S_HALMA P54024|P-S<i_METJA Q9HL0S PJ>&_THEAC P402i}|P.Sii_YEAST i Q?SK221 P.S 16 1_APATH I Pi 2 & IPJ3 INHUMAN

........heqyyg

rv-VAESHSalïAVYWa

------maenqyyo

---------frvTNT

-------HGKI IT.

...........4it|

.....мзатрвд

--HATQPATE& QC •-MPSKOPL0S QV]

globular cori

I PS224 S| P.S15_HUMAN

¡КАЕТЯ edil'îh DZL1Q C-t^minsl tAil

Рис. 7. Филогенетическое сравнение первичной структуры rpS16 человека и его гомологов из бактерий, архей н низших эукарнот, выполненное при помощи программы CLUSTAL W (Thompson et al., 1994), с использованием также программы BoxShade. Слева указаны индексы аминокислотных последовательностей белков в UniProtKnowlegebase

(www.expasy.uniprot.org/database/knowledgebase.shtml). Идентичные аминокислоты выделены черным цветом. Стрелками внизу отмечены аминокислотные последовательности, формирующие "кор" и С-концевой хвост rpS9 Т. thermophilic. Кроме того, стрелками внизу указаны границы фрагментов экспансии в rpS 16. Звездочками вверху отмечены остатки rpS9 T. thennophilus, контактирующие с участком 16S рРНК, соответствующим фрагменту 3Dm 18S рРНК человека.

Рис. 8. Пространственная структура rpS9 Т. thermophilus и rpS16 человека: структура rpS9 взята из базы данных PDB (индекс 1FJG), а структура rpS 16 построена с помощью программы EsyPred3D (Lambert et al., 2002). Буквы N и С указывают соответствующие концы полипептидных цепей белков; стрелкой указан район 93-118 в rpS 16. содержащий участок низкой гомологии и фрагменты экспансии, выявленный при филогенетическом сравнении первичной структуры rpS 16 и rpS9 (см. рис. 7).

Эти остатки по данным РСА 30S субчастицы рибосомы Т. thermoplulus также вовлечены в связывание с rpS9 и контактируют с R10 и К11 (Brodersen et al., 2002), которым соответствуют К15 и К16 в rpS 16 человека (рис. 7). Основываясь на сходстве пространственной структуры rpS9 Т. thermoplulus и рассчитанной структуры rpS16 человека (см. выше) (рис. 8), можно предположить, что остатки G1648, U1673 и GI674 фрагмента 3Dm контактируют с К15 и К16 в rpS 16.

Наконец, район фрагмента 3Dm. включающий нуклеотидные остатки A1647-G1652 (участок V) и С1670-А1675 (участок IV). которые изменяли свою доступность ферментативным и химическим зондам при связывании с rpS 16 (рис. 6), соответствует району 16S рРНК, взаимодействующему с консервативным неструктурированным С-концевым участком rpS9 (Brodersen et al., 2002).

Что касается участков II и III фрагмента 3Dm (см. рис. 6), то они соответствуют районам I6S рРНК, которые не принимают участие в формировании сайтов связывания rpS9 (Brodersen et al., 2002). Одной из причин этих расхождений могли быть индуцированные связыванием rpS16 структурные перестройки во фрагменте 3Dm, приводившие к изменению эффективности расщепления этого фрагмента (рис.5б). Другая причина могла быть связана с наличием дополнительных участков связывания у длинной неструктурированной С-концевой части rpS16, по сравнению с rpS9. Как видно из рис. 7 и рис. 8 С-концевая часть rpS16 человека длиннее соответствующей части rpS9 на 11 аминокислот, расположенных на границе центральной и С-концевой частей rpS16.

Рис. 9. Вычлененный район пространственной структуры 30S ™ рибосомной субчастицы Т. thermophilus

участок IV (PDB индекс 1FJG), включающий rpS7 -"1 | (отмечен красным цветом), rpS9 (зеленым) и фрагмент 16S рРНК, соответствующий фрагменту 3Dm (синим). Районы РНК. соответствующие участкам 1-V фрагмента 3Dm, подписаны и окрашены желтым. Красными пунктирными стрелками отмечены предполагаемые варианты расположения С-конца rpSI6. Черной стрелкой указано возможное направление движения шпильки НЗО. Рисунок выполнен с использованием программы PyMol (DeLano, 2002).

участок III

С-концевая часты

Как и большинство неструктурированных участков во многих других белках (Tompa and Cresmely, 2004) С-конец rpS16 обладает значительной подвижностью, а наличие у него большого положительного заряда, характерного для большинства рибосомных белков (Wilson and Nierhaus, 2005), обеспечивает ему высокое сродство к РНК Анализ структуры фрагмента 3Dm на наличие возможных альтернативных участков связывания С-концевой части rpS 16 показал, что возможно как минимум два варианта укладки С-конца rpSlö относительно нуклеотидов фрагмента 3Dm (рис 9) Один из возможных вариантов -укладка этой части в малую бороздку Н43, при которой она может достигать петли в основании Н42, где находится участок III Другое возможное расположение связано с подвижностью шпильки Н30 в 3Dm, которая в результате электростатических взаимодействий может отклоняться от Н42 таким образом, что «хвост» S16 будет способен глубоко проникать в образующуюся расщелину и достигать Н42 с другой стороны, где расположен участок II (рис 9)

Таким образом, можно заключить, что расположение центральной и N-концевой частей rpS 16 на 18S рРНК человека в целом согласуется с расположением соответствующих им частей гомологичного ему rpS9 на 16S рРНК в составе малой субчастицы прокариотической рибосомы Вместе с тем, неструктурированная С-концевая часть rpS16 благодаря своей высокой подвижности может взаимодействовать с двумя альтернативными участками 18S рРНК в дополнение к участку, соответствующему району 16S рРНК, в котором происходит связывание С-концевой части rpS9

4 2 Ферментативный футпринтинг фрагмента 3Dm в комплексе с rpS5 Для того, чтобы установить каким образом взаимодействие rpS 16 с фрагментом 18S рРНК влияет на связывание rpS5, сначала определяли участок связывания rpS5 на фрагменте 3Dm Поскольку результаты, полученные с помощью различных ферментативных и химических зондов при футпринтннге этого фрагмента в присутствии rpS 16, значительно перекрывались друг с другом, то при футпринтинге фрагмента 3Dm в комплексе с rpS5 мы сочли возможным ограничить набор используемых зондов до РНКаз Т1 и Т2 Результаты футпринтинга представлены на рис 10 Видно, что rpS5 наиболее сильно защищает от действия РНКаз последовательности нуклеотидов A1533-G1536 (участок А) и G1598-A1601 (участок Б) (см рис 11), образующие часть внутренней петли фрагмента, прилегающую к основанию шпильки Н41, а также фосфодиэфирную связь между G1224 и U1225 в спирали Н29 Кроме этого, найдены 4 участка с более слабой защитой К ним относятся участок В (нуклеотиды в положениях С1628-А1633 у основания шпильки Н42), участок Г, включающий последовательность C1670-G1674 в центральной части шпильки Н43, участок Д, расположенный у основания петлевой части шпильки Н42 (нуклеотиды в положениях С1618-А1623), и участок Е, содержащий несколько нуклеотидов (А1545, G1546, G1548 и G1550), находящихся вблизи центральной петли шпильки Н41 (см рис 10 и 11)

Результаты ферментативного футпринтинга фрагмента 3Dm в комплексе с rpS5 в целом согласуются с данными, полученными при изучении взаимодействия rpS7 бактерий с 16S рРНК (Powers et al, 1988, Powers and Noller, 1995, Urlaub et al, 1997), за исключением

результатов, касающихся изменения доступности нуклеотидов к действию РНКаз в участках В-Е.

и-

г-4

l.f - *

т -

.1570

• 1560

• 1550

• 1540

. 1530

.1250

• 1230

Г-1

• s

А" —

re ri -

.1570

♦ 1560

♦ 1550

♦ 1540

.1530

Б"'

д-в-

» i I

>1230 Е-

>1220

.1600 .1610 •1620

■1630

• 1640

• 1650

.1660

• 1670

• I6S0

Рис. 10. Ферментативный футпрннтинг комплекса гр.Ч5 с фрагментом ЗОш. Гидролиз РНКазой Т2 (я) п РНКазой Т1 (6) 5'-,2Р-меченого фрагмента 3 Пт свободного (-) и в комплексе с грв5 (+). в - Гидролиз РНКазами Т2 п Т1 3'-,2Р-меченого фрагмента 3 От свободного (-) и в комплексе с грв5 (+). Дорожки О. А+и и ОН - определение последовательности нуклеотидов меченого фрагмента ЗОш при помощи РНКаз Т1. РЬу М и ограниченного щелочного

гидролиза соответственно.

Дорожки К и КВ - меченый фрагмент ЗОт до и после инкубации с гр55 в условиях связывания соответственно. Слева от каждой панели буквами отмечены участки РНК. защищаемые гр55 от гидролиза, справа приведена нумерация

Ранее с помощью химического футпринтинга было показано, что основания 16S рРНК. соответствующие основаниям участков В и Д в 18S рРНК, защищаются от модификации при связывании с rpS7 (Powers et al., 1988).

,ArG '

i-u"C

gg-i"

123i-G - С"132' G — C*

H30

G-C

с<У.\ д-и» .ccc

"»3-G участок A и" u

H41

GAC6 AAG6GCA Л С

I I I I I I I I I I I II

AC UGU U U С С С G U U G

с" А

С А

Рис. 11. Вторичная структура района 18S рРНК человека, соответствующего фрагменту ЗПш, согласно (Cannone et al., 2002). Нумерация шпилек и спиралей рРНК приведена согласно (Brimacombe. /991). нумерация нуклеотидов дана для 18S рРНК человека (Cannone et al.. 2002). Участки РНК, доступность которых РНКазам при связывании фрагмента 3Dm с rpS5 уменьшалась, отмечены синими стрелками с голубым кружком на конце стрелки, увеличивалась — с зелёным кружком.

Однако по данным РСА

(Вгоёегееп е! а!.. 2002), эти основания, как и основания, соответствующие участкам Г и Е,

С1М00

Л G а А г _ G A4yj^ <J участок В

участок Г

'•»V. = 31-О H4J '" -fo^c-Ji

Ади

участок Д

удалены от области контакта 16S рРНК с этим белком Нельзя исключить, что наблюдаемые изменения в реакционной способности данных оснований отражают конформационные изменения, происходящие в 16S рРНК при связывании с rpS7 Возможно, с этим же связана защита участков В-Е в 18S рРНК от действия РНКаз при связывании с rpS5 Однако, на наш взгляд, эти защиты, скорее всего обусловлены более сложным строением эукариотического rpS5 по сравнению с бактериальным rpS7 Так, rpS5 человека существенно больше (204 аминокислотных остатка), чем rpS7 Т thermophilic (155 аминокислотных остатков) Гомология между ними существует только в центральной и С-концевой частях (рис 12), а N-концевой район rpS5, состоящий примерно из 80 аминокислотных остатков, не имеет гомологичного района в rpS7 бактерий Действительно, при сравнении карт малых субчастиц рибосом про- и эукариот, полученных с помощью криоэлектронной микроскопии (Spahn et al, 2004), можно видеть дополнительную плотность в районе расположения rpS5 в 40S субчастице

P55_HUHWf -----HTBUETAAPAVASTPDIKLrSKWSTDIVQIliDXSLODÏIAVKEKÏAKÏLeHSAC

RS7_HALMA 5AEDTFEWADMEE3EmAMKLFGmDITBIEY5Df,5TmiTVTP-----IAHTMG

R57_THET2 —.................-.....................................ARR

R5S_HUMW RÏAAKRFRKAQCPIVERLTHSMMHHGRNNGKKIHTVRIVKHAFEXIHLLTGENPLÛVLVH

US 7 "НАША. RHADK(jrKKSEISIVEflLI«fUt»3TDEitI5KKCLATSIVTEAFEI.VHERT[)E»P IÛVLVS

HS7_THET2 RRAEVRQLÇPDLVYGDVLVTAFINKIKRDGKKWIAARIFYDACKIIÇEKTGÇEPLKVFKÇ

* * « . « ¡1 , t, * * <{•*

PSSJWMWT AIIIfSGFREDSTHIGRAGIVRFQAVDVSPliPR\NQAIHIjlCTGASEAAnWIKIIAECLA RS7_HALHA AVEKWREETVHLKÏWISWKAVCVAîSRRVBQAbKFLAEGVYGGSrKTTTIAAEAIA RS7 ТИЕТ2 AVEKVKriWEVR3RRVGGAHÏQVÎMEVSÏRRÛQ3LALRHLVQAMQ---RPLRRAAVRIA

4*4* * ^ » I « I .*

Pue. 12. Филогенетическое сравнение первичной структуры rpS5 человека (эукарноты), rpS7 Haloarcula mansmortui (археи) и rpS7 T thermophihis (бактерии), выполненное при помощи программы CLUSTAL W (Thompson et al., 1994) Универсальные аминокислотные остатки отмечены звездочками, консервативные - точками

Можно предположить, что эта плотность соответствует N-концевой части rpS5, которая, по-видимому, образует отдельный большой домен, контактирующий с основаниями участков Г и Е 18S рРНК Таким образом, совокупность изложенных данных указывает на то, что расположение С-концевой и центральной частей гомологичных рибосомных белков S5 (человека) и S7 (прокариот) относительно рРНК малой субчастицы рибосомы в целом одинаково, а ориентация их N-концевых частей отличается

4 3 Ферментативный и химический футпринтинг фрагмента 3Dm в комплексе

с rpS16 и rpS5

Для того чтобы установить влияет ли взаимодействие rpS16 с фрагментом 3Dm на связывание rpS5, мы провели футпринтинг данного фрагмента в присутствии обоих этих белков и сравнили полученные результаты с данными футпринтинга для комплекса фрагмента 3Dm с rpS5 В качестве зондов использовали РНКазы Tl, Т2 и VI и систему Fe^/EDTA/HjOi (гидроксил-радикальный футпринтинг) Результаты футпринтинга приведены на рис 13 Видно, что при одновременном присутствии rpS5 и rpS16 доступность нуклеотидов A1533-G1536 фрагмента 3Dm (участок 1) для действ™ РНКазы Т2 понижалась сильнее (рис 13а, 14), чем в случае одного rpS5 (рис 10а, 11, участок А)

Кроме того, происходила также защита от гидролиза соседних с этим участком нуклеотидов А1531 -С 1532 и А 1537-и 1539 (рис. 13а), чего не наблюдали для комплекса фрагмента ЗОт с гр85. Такие же закономерности в снижении доступности указанных выше нуклеотидов выявлены также в экспериментах с РНКазой Т1 (рис. 106, 13а). а б

ц I2. V- е -

12 34567 89 1011 1213141516

1 2 3 45 67 89 1011 1213141516

оо

сз о

Й-

«-

1640

12 34567 89

Рис. 13. Футпринтннг фрагмента 31)т в комплексе с грв16 и грЯ5. Радиоавтографы гелей после электрофоретического разделения продуктов расщепления ЗОгп: 5'-[,2Р]-меченого (панель я), либо 3'-[,2Р]-меченого (панель о). Дорожки Т1, Т2 и VI - гидролиз фрагмента ЗОт свободного (-) и в комплексе с гр516 и гр55 (+) РНКазами Т1. Т2 и VI соответственно. Дорожка Ре - модификация ЗОт свободного (-) и в комплексе с гр816 и гр55 (+) гидроксильными радикалами, генерируемыми в системе Ре24/Е0ТА/Н202. Дорожки О. А+и и ОН - определение последовательности нуклеотидов меченого ЗОт с помощью РНКаз Т1 и РЬуМ и ограниченного щелочного гидролиза соответственно. Дорожки К и КВ - меченый ЗОт до и после инкубирования с гр516 и гр85 в условиях связывания соответственно. Цифры слева от панели а и справа от панели 6 - номера нуклеотидов. Цифры внизу панелей а и б - номера дорожек. Стрелками отмечены участки наблюдаемого изменения доступности нуклеотидных остатков ЗОт зондам при комплексообразовании с гр516 и гр55.

Панель в - Фугпринтинг фрагмента ЗОт РНКазой Т2 при постоянной концентрации грБ 16 и увеличивающейся (от 5 нМ до 0.2 мкМ) концентрации гр85.

Что касается результатов футпринтинга фрагмента ЗОт в присутствии гр85 и грБ 16 РНКазой VI и гндроксил-радикалами, то они полностью согласуются с данными, полученными для этого же комплекса в экспериментах с РНКазами Т1 и Т2. Таким

образом, на основании вышеизложенного с учетом того, что нуклеотиды обсуждаемого района не изменяли своей доступности действию зондов при связывании фрагмента ЗБт с гр816 в отсутствие гр85, можно предположить, что взаимодействие этого фрагмента с гр816 влияет на его структуру в участке 1 таким образом, что в связывание с тр85 вовлекается большее число нуклеотидов. Менее выраженное, чем в районе, соответствующем участку 1, понижение доступности нуклеотидных остатков наблюдали в участках 2 (нуклеотиды С1628-А1633) и 4 (нуклеотиды С1670-01674) (рис. 136). Нуклеотиды этих участков перекрываются с теми нуклеотидами, доступность которых действию зондов изменялась в присутствии либо гр816 (участки II и IV соответственно на рис. 6), либо тр85 (участки В и Г соответственно на рис. 11), при этом в первом случае степень расщепления в участке 2 была ниже, чем во втором, то есть гр816 сильнее защищал этот участок от действия зондов, чем гр85. Скорее всего, более сильное понижение доступности нуклеотидов в участках 2 и 4, наблюдаемое в эксперименте с двумя белками, могло быть обусловлено взаимным влиянием этих белков на связывание друг друга или по крайней мере влиянием трБ5 на связывание грв 16 (см. ниже). Кроме того, при одновременном связывании двух белков с фрагментом ЗОт наблюдали слабые защиты нуклеотидов 1550-1552 (участок 3) (рис. 13, 14), расположенных с 3' стороны от участка Е, защищаемого от гидролиза РНКазами гр55 (рис. 10, 11). Поскольку гр.816 не защищал нуклеотидов. расположенных в районе этого участка, то можно предположить, что эти защиты вызваны влиянием грБ16 на связывание гр85. Наконец, в присутствии двух вышеуказанных белков мы практически не наблюдали защит нуклеотидов 01598-А1601 и С1618-А1623, экранируемых от действия РНКаз и гидроксильных радикалов гр55 (см. рис. 10, 11).

/о.

и участок 3

с - g нзо 3 ~ о

У""«' ,

1230-с - g уч»сток 1

g — с .15« с

д _ ¡5-1530 ^v'-g1-СО

g с g . „ .. i<0

h 29 / H28 1220 лои,

ОС cXG°V А

а г1- Ч ч

.16400

- С .1540 с

- U"1530 • G

' иА 15И

G а с g aagggca ас I I I II I I I I I I M ас ugu u u с с с g u ug с А ССС'А

«90 1М0д

c.1M0S

G-1600

Рис. 14. Вторичная структура района 18S рРНК человека,

соответствующего фрагменту 3Dm,

согласно (Cannone et al., 2002). Нумерация шпилек и спиралей рРНК приведена

согласно (Brimacombe. 1991), нумерация

нуклеотидов дана для 18S рРНК человека (Cannone et al.. 2002). Участки РНК,

доступность которых зондам при связывании фрагмента 3Dm с rpS16 и rpS5 уменьшалась, отмечены стрелками с голубыми кружками, увеличивалась - с зелеными кружками.

Нуклеотиды. доступность которых

одним зондам увеличивалась, а другим зондам - уменьшалась, отмечены стрелками с сиреневыми кружками. Красные стрелки - зависимые от rpS 1 б изменения доступности нуклеотидов 3Dm, синие - от rpS5. Ширина стрелок пропорциональна интенсивности модификации нуклеотидных остатков.

УЧ.СТОК8 Î^.u

участок 2

участок 8

участок 6

Таким образом, на основании данных футпринтинга можно заключить, что связывание сердцевинного rpSlô с фрагментом 3Dm хотя в значительной степени и не влияет на связывание другого сердцевинного белка - S5, но приводит к заметным изменениям в наборе нуклеотидов, изменяющих свою доступность в присутствии rpS5 Эти изменения, по-видимому, отражают конфорчационные перестройки во фрагменте 3Dm, индуцируемые связыванием с rpS16, благодаря которым усиливалось взаимодействие rpS5 с отдельными районами РНК, формирующими его участок связывания

Как уже отмечалось, согласно нашим данным величина Ка для комплекса фрагмента 3Dm с rpS5 превышает величину К„ rpSlô, в то же время при диссоциации 40S субчастицы рибосомы под действием моновалентных катионов rpSlô сильнее удерживается на 18S рРНК, чем rpS5 Возможно, rpS5 хотя прямо и не влияет на связывание rpS 16 с фрагментом 3Dm (подобно тому как у прокариот rpS7 обеспечивает связывание rpS9 с 16S рРНК), но каким-то образом может стабилизировать связывание rpS 16 с 18S рРНК в 40S субчастице, что могло бы отчасти объяснить расхождения между данными о порядке отщепления rpS5 и rpS 16 от 18S рРНК и данными по связыванию этих белков с фрагментом 3Dm Действительно, оказалось, что вместе rpS5 и rpSlô сильнее защищают нуклеотиды С1628-А1633 (участок 2) от гидролиза РНКазой Т2 (рис 136, 14), чем один rpS16 (рис 56, участок II) В присутствии обоих белков наблюдали также защиты этого участка от гидролиза РНКазой Т1 и гидроксил-радикалами (см рис 136,14) Кроме того, происходило заметное понижение доступности нуклеотидов С1670-А1674 (участок 4) и A1647-G1652 (участок 5) действию РНКаз и гидроксильных радикалов (см рис 13б) по сравнению с их доступностью в присутствии одного rpSlô (рис 56, участки IV и V соответственно) Нуклеотиды С1544 (участок 7) и С1618-А1623 (участок 8) фрагмента 3Dm, напротив, в присутствии rpS5 и rpSlô слабее понижали свою доступность действию ферментативных зондов и гидроксильных радикалов (рис 14), чем в присутствии одного rpS 16 (участки I и III на рис 6) Так, например, в первом случае была практически незаметна защита нуклеотидных остатков С1618-А1623 от действия РНКазы Т2, наблюдаемая в последнем случае Как уже обсуждалось выше, участки II, IV и V соответствуют связыванию неструктурированной С-концевой части rpS16 с фрагментом 3Dm в отсутствие rpS5 Следовательно, данные футпринтинга, полученные в присутствии двух белков, можно рассматривать как указание на то, что связывание 3Dm с rpS5 стабилизирует взаимодействие этого фрагмента в вышеуказанных участках с С-концевой частью rpS16

Наконец, обращает на себя внимание тот факт, что в присутствии двух белков происходит защита от гидроксил-радикального расщепления участка U1659-A1663 (участок 6) фрагмента 3Dm (см рис 13, 14), которую не наблюдали при футпринтинге этого фрагмента ни с одним из этих белков, взятых по отдельности В пространственной структуре 16S рРНК нуклеотиды, соответствующие этому району 18S рРНК, удалены от участков связывания rpS7 и rpS9 (Brodersen et al, 2002) По-видимочу, понижение степени расщепления нуклеотидов U1659-A1663 в участке 6 вызвано не участием этих нуклеотидов в комплексообразовании с белками, а конформационными изменениями фрагмента 3Dra в этом участке, индуцируемыми одновременным связыванием rpS5 и rpS 16 с этим фрагментом

Чтобы доказать наше предположение о том, что rpS5 стабилизирует взаимодействие фрагмента 3Dm с С-концевой частью rpS16, мы проследили за изменением доступности участка 2 действию РНКазы Т2 при увеличении концентрации rpS5 в реакционной смеси Данные приведены на рис 13в Можно видеть, что при увеличении концентрации rpS5 происходит резкое понижение интенсивности сигнала в районе этого участка, что однозначно свидетельствует о стабилизации взаимодействия rpS 16 с участком 2 под влияниемrpS5

5. Заключение

В представленной работе впервые проведен детальный анализ диссоциации белков из малой субчастицы эукариотической рибосомы при возрастающей концентрации моновалентных катионов, что позволило установить порядок диссоциации рибосочных белков из 40S субчастиц рибосом человека при увеличении концентрации LiCl (0 3-15 M) в присутствии 4 мМ MgClî и 0 5 M КС1 Оказалось, что рибосомы высших эукариот гораздо чувствительнее к высокой концентрации моновалентных катионов, чем прокариотические рибосомы (Спирин, 1986) Диссоциация большинства сердцевинных рибосомных белков 40S субчастицы уже заканчивается при концентрации соли 1 55 М, при которой в прокариотах большая часть рибосомных белков еше связана с 16S рРНК С использованием рекомбинантных рибосомных белков человека изучено связывание сердцевинных rpS16 и rpS5 с фрагментом 1203-1236/1521-1698 18S рРНК, соответствующим району 16S рРНК, содержащему участки связывания их прокариотических гомологов - rpS9 и rpS7 соответственно Оказалось, что оба белка способны образовывать комплекс с вышеуказанным фрагментом 18S рРНК, однако rpS16, в отличие от своего гомолога rpS9, связывается с этим фрагментом в отсутствие rpS5, гомолога rpS7, предварительное связывание которого с 16S рРНК абсолютно необходимо для последующего ее комплексообразования с rpS9 Возможно, эти отличия вместе с особенностями диссоциации рибосомных белков из 40S субчастиц отражают принципиально различные пути сборки малых субчастиц рибосом в клетках про- и эукариот

Изучая изменение доступности нуклеотидов фрагмента 1203-1236/1521-1698 18S рРНК действию РНКаз и химических зондов в присутствии rpS 16 и/или rpS5, мы пришли к заключению, что в целом их расположение на 18S рРНК соответствует расположению гомологичных им белков на 16S рРНК, что свидетельствует об эволюционной консервативности большинства контактов гомологичных белков с рРНК в рибосомах про-и эукариот Вместе с тем, в отсутствие rpS5 неструктурированная С-концевая часть rpS16 благодаря своей высокой подвижности может взаимодействовать с двумя альтернативными участками 18S рРНК в дополнение к основному участку, соответствующему району 16S рРНК, в котором происходит связывание С-концевой части rpS9 В присутствии rpS5 происходит стабилизация комплекса 18S рРНК с rpS16 за счет усиления взаимодействия его С-концевой части с основным участком связывания и одним из альтернативных участков Кроме того, результаты настоящей работы позволили заключить, что одновременное связывание rpS5 и rpS16 приводит к таким конформационным перестройкам в РНК, которые способствуют стабилизации образующегося комплекса, за счет появления в ней новых участков, вовлекаемых в

связывание, которых не наблюдали в комплексах фрашенга 3Dm ни с одним из эшх белков, взятых по отдетыюсти Таким обозом, используя информацию о нуклеотндах РНК, меняющих свою доступность действию химических и ферментативных зондов, удалось впервые получить представление об участках связывания сердцевшшых белков S5 и S16 40S субчастицы рибосомы человека ira 18S рРНК и об их взаимном влиянии на это связывание

ВЫВОДЫ

1 Исследована диссоциация белков из малой субчастицы рибосомы человека при возрастающей концентрации моноваленшых катионов

• Установлен порядок диссоциации рибосочных белков из 40S субчастиц при увеличении концентрации моноваленшых катионов от 0 8 до 2 О M в присутствии 4 мМ MgCl2

• Определены сердцевинные рибосочные белки S3, S5, S7, S10, S15, S16, S17, S19, S20 и S28 40S субчастицы, которые удерживаются на I8S рРЯК до I 55 M концентрации моновалентныч катионов, при этом следовые количества S7, S10, S16 и S19 остаются связанными с ней до 1 63 M концентрации

2. Изучено связывание сердцевинных рибосомных белков S16 н S5 с фрагментом 12031236/1521-1698 (3Dm) 18S рРНК человека, соответствующим району I6S рРНК бактерий, содержащему участки связывания рибосомных белков S9 и S7, гомологов эукариотических S16 п S5 соответственно

• Показано, что оба белка способны связываться с фрагментом 3Dm при 20° С в присутствии 4 мМ Mg2+ и 250 мМ К1", образуя стабильные комплексы со значениями констант диссоциации порядка 10 9 M

• Установлено, что для связывания белка S16 с фрашентом 3Dm не требуется присутствия белка S5, прокариотнческий гомолог которого - рибосомныи белок S7 абсолютно необходим для связывания 16S рРНК с белком S9

3. С помощью футпринтинга определены нуклеотидные остатки фрагмента 3Dm, изменяющие свою доступность зондам в присутствии рнбосомного белка S16 и/шш белка S5

• Установлено, что большинство из остатков, меняющих свою доступность при связывании белка S16, расположено в районах 18S рРНК, гомологичных участкам связывания центральной и N-концевой частей рибосочного белка S9 на 16S рРНК, а при связывании белка S5 - в районах, соответствующих участкам связывания центральной и С-концевой частей белка S7 Остальные из выявленных остатков расположены в тех районах 18S рРНК, которые соответствуют нуклеотидным последовательностям в 16S рРНК, не участвующим в комплексообразованпп с белками S9 и S7

4 Установлено, что, несмотря на принципиально различные пути сборки рибосом про- и зукариот, характер взаимодействия рибосомных белков S5 и S16 человека и

гомологичных им S7 и S9 бактерий с рРНК малой субчастицы рибосомы в целом сохранился, хотя на I8S рРНК и возникли дополнительные участки для свяшвапия специфичных фрагментов белков S16 и S5,01с,утствуюших у их юмологов

Результаты диссертации опубликованы в следующих работах

1 Мачыгип А А, Шауло Л Л. Карпова Г Г Диссоциация белков m 40S субчастиц рибосом человека в градиете концентрации хлористого янгия // Молекуляр биология 2000 Т 34 С 887-893

2 Malygm A A ShauloDD. Kaipom G G Piotein S7, S10, S16 and SI9 ot the human 40S ubosonul subunit aie most lesistant to dissociation by salt // Biochym Biophys Acta 2000 Vol 1494 P 213-216

3 Янышша ДД, Маныгин А 'I, Карпова Г Г Связывание рнбоеомною белка S5 человека о фра! ментом 1203-1236/1521-1698 I8S рРНК // Молекуляр и нолей in

2006 Г 40 С 460-467

4 Янышша ДД, Малыгин А А, Карпова Г Г Связывание рибосомного белка S16 человека с фрагментом 1203-1236/1521-1698 I8S рРНК // Молекуляр биология

2007 Т 41 С 1023-1030

Подписано в печать 13 04 08г Формат 60x84 1/16 Усшечл 1,2

Тираж 100 зкз_Заказ №94_Печать цифровая

Отпечатано в ООО « Омега Принт» 630090, г Новосибирск пр Лаврентьева, 6

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Яньшина, Дарья Дмитриевна

ОГЛАВЛЕНИЕ

ПРИНЯТЫЕ СОКРАЩЕНИЯ

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. РНК-белковые взаимодействия в малых субчастицах рибосом про- и эукариот (Обзор литературы)

1.1. Сборка малой субчастицы рибосомы прокариот in vitro

1.2. Подходы к изучению РНК-белковых взаимодействий в малых субчастицах рибосом

1.2.1. Футпринтинг

1.2.2. Метод SELEX

1.2.3. Мутагенез

1.2.4. Метод сшивок

1.2.5. Протеомный анализ

1.3. Взаимодействие сердцевинных белков 30S субчастицы рибосомы с 16S рРНК

1.3.1. Взаимодействие рибосомного белка S15 с 16S рРНК

1.3.1.1. Участок связывания rpS15 нарРНКпо данным, полученным биохимическими методами

1.3.1.2. Участок связывания rpS15 на рРНКпо данным рентгеноструктурного анализа

1.3.2. Взаимодействие рибосомного белка S8 с 16S рРНК

1.3.2.1. Участок связывания rpS8 на рРНКпо данным, полученным биохимическими методами

1.3.2.2. Участок связывания rpS8 на рРНКпо данным рентгеноструктурного анализа

1.3.3. Взаимодействие рибосомного белка S7 с 16S рРНК

1.3.3.1. Участок связывания rpS7 на рРНКпо данным, полученным биохимическими методами

1.3.3.2. Участок связывания rpS7 на рРНКпо данным рентгеноструктурного анализа

1.3.4. Взаимодействие рибосомного белка S4 с 16S рРНК 43 1.3.4.1. Участок связывания rpS4 на рРНК по данным, полученным биохимическими методами 43 1.3.4.2. Участок связывания rpS4 нарРНКпо даннымрентгеноструктурного анализа

1.3.5. Взаимодействие рибосомного белка S17 с 16S рРНК

1.3.5.1. Участок связывания rpS17 на рРНК по данным, полученным биохимическими методами

1.3.5.2. Участок связывания rpS17 на рРНКпо данным рентгеноструктурного анализа

1.3.6. Взаимодействие рибосомного белка S20 с 16S рРНК

1.3.6.1. Участок связывания rpS20 на рРНКпо данным, полученным биохимическими методами

1.3.6.2. Участок связывания rpS20 на рРНКпо данным рентгеноструктурного анализа

1.4. Сборка малой субчастицы рибосомы эукариот

1.5. Подходы к изучению структуры 40S субчастицы

Введение Диссертация по биологии, на тему "Связывание рибосомных белков S5 и S16 человека с участком 1203-1236/1521-1698 3`-концевого домена 18S pРНК"

Рибосома - это многокомпонентная макромолекулярная клеточная машина, осуществляющая процесс биосинтеза белка в клетке. Изучение структурно-функциональной топографии рибосом важно не только для понимания молекулярных механизмов биосинтеза белка, но и для разработки подходов к регуляции этого процесса. К настоящему времени пространственная структура рибосом прокариот детально изучена с помощью рентгеноструктурного анализа (см. [1, 2]), в то же время структура рибосом эукариот, особенно высших, остаётся намного менее исследованной. По-видимому, это связано с тем, что многие из методов, успешно применяемых для изучеиия бактериальных рибосом, пока что не могут быть использованы для исследования структуры рибосом эукариот. Это касается прежде всего метода рентгеноструктурного анализа (РСА), поскольку кристаллы эукариотических рибосом, пригодные для РСА, пока не получены, а также методов, основанных на реконструкции рибосомных субчастиц из белков и рРНК, поскольку до сих пор не найдено подходов к сборке функционально-активных субчастиц рибосом эукариот из рРНК и белков in vitro.

Один из наиболее доступных на сегодняшний день подходов к изучению РНК-белковых взаимодействий в рибосомных субчастицах эукариот основан на использовании рекомбинантных рибосомных белков и фрагментов РНК, отвечающих за эти взаимодействия. Такие фрагменты могут быть получены в системе транскрипции in vitro. Аналогичный подход был успешно использован ранее для изучения взаимодействия различных прокариотических рибосомных белков с РНК-трапскриптами, соответствующими фрагментам 16S рРНК, содержащим сайты связывания этих белков (см., например, [3-5]).

Целью настоящей работы являлось изучение диссоциации 40S субчастиц рибосом человека в градиенте концентрации моновалентных катионов для выявления так называемых сердцевинных рибосомных белков, которые наиболее прочно удерживаются на 18S рРНК, и исследование связывания некоторых из них, в частности белков S5 и S16, с 18S рРНК с помощью вышеуказанного подхода. Рибосомный белок (гр от аигл. ribosomal protein) S5 - гомолог rpS7 прокариот, a rpS16 - гомолог rpS9 [6], участки связывания rpS7 и rpS9 на 16S рРНК известны. В качестве модельной РНК выбран фрагмент главного 3'концевого домена 18S рРНК человека (нуклеотиды 1203-1236/1521-1698) (фрагмент 3Dm), гомологичный району 16S рРНК, содержащему участки связывания rpS7 и rpS9. Основными задачами являлись: определение порядка диссоциации рибосомных белков из 40S субчастиц при увеличении концентрации LiCl (0.3-1.5 М) в присутствии 4 мМ MgCb и 0.5 М КС1 и идентификация белков, наиболее сильно удерживающихся на 18S рРНК; характеризация связывания rpS5 и rpS16 человека с фрагментом 3Dm и определение нуклеотидных остатков этого фрагмента, изменяющих свою доступность зондам в присутствии этих белков; определение взаимного влияния rpS16 и rpS5 на связывание каждого из них с фрагментом 3Dm; сопоставление полученных результатов по связыванию rpS5 и rpS16 с фрагментом 3Dm с рентгеноструктурными данными о контактах rpS7 и rpS9 с 16S рРНК в 30S субчастице.

На момент начала настоящей работы данные о молекулярных контактах в 40S субчастице эукариотической рибосомы практически отсутствовали.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Яньшина, Дарья Дмитриевна

Выводы

1. Исследована диссоциация белков из малой субчастицы рибосомы человека при возрастающей концентрации моновалентных катионов.

• Установлен порядок диссоциации рибосомных белков из 40S субчастиц при увеличении концентрации моновалентных катионов от 0.8 до 2.0 М в присутствии 4 мМ MgCb.

• Определены сердцевинные рибосомные белки S3, S5, S7, SIO, S15, S16, S17, S19, S20 и S28 40S субчастицы, которые удерживаются на 18S рРНК до 1.55 М концентрации моновалентных катионов, при этом следовые количества S7, S10, S16 и S19 остаются связанными с ней до 1.63 М концентрации.

2. Изучено связывание сердцевинных рибосомных белков S16 и S5 с фрагментом 12031236/1521-1698 (3Dm) 18S рРНК человека, соответствующим району 16S рРНК бактерий, содержащему участки связывания рибосомных белков S9 и S7, гомологов эукариотических S16 и S5 соответственно.

• Показано, что оба белка способны связываться с фрагментом 3Dm при 20° С в

24- 4присутствии 4 мМ Mg и 250 мМ К , образуя стабильные комплексы со значениями констант диссоциации порядка 10'9 М.

• Установлено, что для связывания белка S16 с фрагментом 3Dm не требуется присутствия белка S5, прокариотический гомолог которого - рибосомный белок S7 абсолютно необходим для связывания 16S рРНК с белком S9.

3. С помощью футпринтинга определены нуклеотидные остатки фрагмента 3Dm, изменяющие свою доступность зондам в присутствии рибосомного белка S16 и/или белка S5.

• Установлено, что большинство из остатков, меняющих свою доступность при связывании белка S16, расположено в районах 18S рРНК, гомологичных участкам связывания центральной и N-концевой частей рибосомного белка S9 на 16S рРНК, а при связывании белка S5 - в районах, соответствующих участкам связывания центральной и С-концевой частей белка S7. Остальные из выявленных остатков расположены в тех районах 18S рРНК, которые соответствуют нуклеотидным последовательностям в 16S рРНК, не участвующим в комплексообразовании с белками S9 и S7.

• Показано, что одновременное связывание белков S5 и S16 с фрагментом 3Dm усиливает взаимодействие каждого из них с этим фрагментом, свидетельствуя о кооперативности их связывания. 4, Установлено, что, несмотря на принципиально различные пути сборки рибосом про- и эукариот, характер взаимодействия рибосомных белков S5 и S16 человека и гомологичных им S7 и S9 бактерий с рРНК малой субчастицы рибосомы в целом сохранился, хотя на 18S рРНК и возникли дополнительные участки для связывания специфичных фрагментов белков S16 и S5, отсутствующих у их гомологов.

3.2. Заключение

В представленной работе впервые проведен детальный анализ диссоциации белков из малой субчастицы эукариотической рибосомы при возрастающей концентрации моновалентных катионов, что позволило установить порядок диссоциации рибосомных белков из 40S субчастиц рибосом человека при увеличении концентрации LiCl (0.3-1.5 М) в присутствии 4 мМ MgCh и 0.5 М КС1. Оказалось, что рибосомы высших эукариот гораздо чувствительнее к высокой концентрации моновалентных катионов, чем прокариотические рибосомы [7, 23]. Диссоциация большинства сердцевинных рибосомных белков 40S субчастицы уже заканчивается при концентрации соли 1.55 М, при которой в прокариотах большая часть рибосомных белков ещё связана с 16S рРНК. С использованием рекомбинантных рибосомных белков человека изучено связывание сердцевинных rpS16 и rpS5 с фрагментом 1203-1236/1521-1698 18S рРНК, соответствующим району 16S рРНК, содержащему участки связывания их прокариотических гомологов - rpS9 и rpS7 соответственно. Оказалось, что оба белка способны образовывать комплекс с вышеуказанным фрагментом 18S рРНК, однако rpS16, iв отличие от своего гомолога rpS9, связывается с этим фрагментом в отсутствие rpS5, гомолога rpS7, предварительное связывание которого с 16S рРНК абсолютно необходимо для последующего её комплексообразования с rpS9. Возможно, эти отличия вместе с особенностями диссоциации рибосомных белков из 40S субчастиц отражают принципиально различные пути сборки малых субчастиц рибосом в клетках про- и эукариот.

Изучая изменение доступности нуклеотидов фрагмента 1203-1236/1521-1698 18S рРНК действию РНКаз и химических зондов в присутствии rpS16 и/или rpS5, мы пришли к заключению, что в целом их расположение на 18S рРНК соответствует расположению гомологичных им белков на 16S рРНК, что свидетельствует об эволюционной консервативности большинства контактов гомологичных белков с рРНК в рибосомах про-и эукариот. Вместе с тем, в отсутствие rpS5 неструктурированная С-концевая часть rpS16 благодаря своей высокой подвижности может взаимодействовать с двумя альтернативными участками 18S рРНК в дополнение к основному участку, соответствующему району 16S рРНК, в котором происходит связывание С-концевой части rpS9.- В присутствии rpS5 происходит стабилизация комплекса 18S рРНК с rpS16 за счёт усиления взаимодействия его С-концевой части с основным участком связывания и одним из альтернативных участков. Кроме того, результаты настоящей работы позволили заключить, что одновременное связывание rpS5 и rpS16 приводит к таким конформационным перестройкам в РНК, которые способствуют стабилизации образующегося комплекса, за счёт появления в ней новых участков, вовлекаемых в связывание, которых не наблюдали в комплексах фрагмента 3Dm ни с одним из этих белков, взятых по отдельности. Таким образом, используя информацию о нуклеотидах РНК, меняющих свою доступность действию химических и ферментативных зондов, удалось впервые получить представление об участках связывания сердцевинных белков S5 и S16 40S субчастицы рибосомы человека на 18S рРНК и об их взаимном влиянии на это связывание.

Полученная в настоящей работе информация является исключительно важной для понимания молекулярных основ РНК-белковых взаимодействий в малых субчастицах рибосом млекопитающих, а накопление такого рода информации служит первым шагом в их реконструкции in vitro.

I i

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Яньшина, Дарья Дмитриевна, Новосибирск

1. Selmer M., Dunham C.M., Murphy IV F.V., Weixlbaumer A., Petry S., Kelley A.C., Weir J.R., Ramakrishnan V. Structure of the 70S ribosome complexed with mRNA and tRNA // Science. 2006. Vol. 13. P. 1935-1942.

2. Dragon F., Brakier-Gingras L. Interaction of Escherichia coli ribosomal protein S7 with 16S rRNA //Nucleic Asids Res. 1993. Vol. 21. P. 1199-1203.

3. Gregory R.J., Cahill P.B.F., Thurlow D.L., Zimmermann R.A. Interaction of Escherichia coli ribosomal protein S8 with its binding sites in ribosomal RNA and messenger RNA // J. Mol. Biol. 1988. Vol. 204. P. 295-307.

4. Wilson D.N., Nierhaus К.Н. Ribosomal proteins in the spotlight // Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 2005. Vol. 40. P. 243-267.

5. Спирин А. С. Молекулярная биология. Структура рибосомы и биосинтез белка. М.: Высшая школа, 1986. 303 с.

6. Dresios J., Panapoulos P., Synetos D. Eukaryotic ribosomal proteins lacking a eubacterial counterpart: important players in ribosomal functions // Mol. Microbiol. 2006. Vol. 59. P. 1651-1663.

7. Wool I.G., Chan Y.-L., GluckA. Mammalian ribosomes: the structure and the evolution of the proteins // Translational control / Eds J.W.B. Hershey, M.B. Mathews, N. Sonenberg. Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1996. P. 685-732.

8. Noller H.F., Woese C.R. Secondary structure of 16S ribosomal RNA // Science. 1981. Vol. 212. P. 402-411.

9. Wimberly B.T., Brodersen D.E., Clemons W.M., Jr., Morgan-Warren R.J., Carter A.P., Vonrhein C., Hartsch Т., Ramakrishnan V. Structure of the 30S ribosomal subunit // Nature. 2000. Vol. 407. P. 327-339.

10. Gonzalez I.L., Schmickel R.D. The human 18S ribosomal RNA gene: evolution and stability // Am. J. Hum. Genet. 1986. Vol. 38. P. 419-427.

11. Spahn C.M., Beckmann R., Eswar N., Penczek P.A., Sali A., Blobel G., Frank J. Structure of the 80S ribosome from Saccharomyces cerev/s/ae-tRNA-ribosome and subunit-subunit interactions // Cell. 2001. Vol. 107. P. 373-386.

12. Gutell R.R. Comparative sequence analysis and the structure of 16S and 23S rRNA // Ribosomal RNA: structure, evolution, processing, and function in protein synthesis / Eds R.A. Zimmermann, A.E. Dahlberg. New York: CRC Press, 1996. P. 111-128.

13. Mueller F., Srark H., van Heel M., Rinke-Appel J., Brimacombe R. A new model for the three-dimensional folding of Escherichia coli 16S ribosomal RNA. III. The topography of the functional centre // J. Mol. Biol. 1997. Vol. 271. P. 566-587.

14. Schluenzen F., Tocilij A., Zarivach R., Harms J., Gluehmann M., Janell D., Bashah A., Bartels H, Agmon I., Franceschi F., Yonath A. Structure of functionally activated small ribosomal subunit at 3.3 resolution // Cell. 2000 . Vol. 102. P. 615-623.

15. Traub P., Nomura M. Structure and function of E. coli ribosomes. V. Reconstitution of functionally active 30S ribosomal particles from RNA and proteins // Proc. Natl. Sci. USA. 1968. Vol. 59. P. 777-784.

16. Mizushima S., Nomura M. Assembly mapping of 30S ribosomal proteins in E.coli II Nature. 1970. Vol. 226. P. 1214-1218.

17. Held W.A., Ballou В., Mizushima S., Nomura M. Assembly mapping of 30S ribosomal proteins from Escherichia coli. Further studies. Further studies. // J. Biol. Chem. 1974. Vol. 249. P. 3103-3111.

18. Culver G.M., Noller H.F. Efficient reconstitution of functional Escherichia coli 30S ribosomal subunits from a complete set of recombinant small subunit ribosomal proteins // RNA. 1999. Vol. 5. P. 832-843.

19. Culver G.M., Noller H.F. In vitro reconstitution of 30S ribosomal subunits using complete set of recombinant proteins // Methods Enzymol. 2000. Vol. 318. P. 446-460.

20. Лерман Н.И. Диссоциация структурных белков от рибосом печени крысы и реконструкция in vitro биологически активных рибосом из дефицитных по белку производных РНП-частиц и отделенных белков //Молекуляр. биология. 1968. Т. 2. С. 209-220.

21. Dutca L.-M., Jagannathan I, Grondek J.F., Culver G.M. Temperature-dependent RNP conformational rearrangements: analysis of binary complexes of primary binding proteins with 16S rRNA // J. Mol. Biol. 2007. Vol. 368. P. 853-869.

22. Samaha R.R., O'Brien В., O'Brien Т., Noller H.F. Independent in vitro assembly of a ribonucleoprotein particle containing the 3' domain of 16S rRNA // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1994. Vol. 91. P. 7884-7888.

23. Weitzmann C.J., Cunningham P.R., Nurse K., Ofengand J. Chemical evidence for domain assembly of the Escherichia coli 30S ribosome // FASEB. J. 1993. Vol. 7. P. 177-180.

24. Holmes K.L., Culver G.M. Analysis of conformational changes in 16S rRNA during the course of 30S subunit assembly // J. Mol. Biol. 2005. Vol. 354. P. 340-357.

25. Guthrie C„ Nashimoto H„ Nomura M. Structure and function of E.coli ribosomes. VIII. Cold-sensitive mutants defective in ribosome assembly // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1969. Vol. 63. P. 384-391.

26. Nashimoto Н., Held W., Kaltschmidt E., Nomura M. Structure and function of bacterial ribosomes. XII. Accumulation of 21S particles by some cold-sensitive mutants of E.coli II J. Mol. Biol. 1971. Vol. 62. P. 121-138.

27. Nierhaus K.N., Bordasch К., Homann H.E. Ribosomal proteins. XLIII. In vivo assembly of Escherichia coli ribosomal proteins // J. Mol. Biol. 1973. Vol. 74. P. 587-597.

28. Lindahl L. Intermediates and time kinetics of the in vivo assembly of Escherichia coli ribosomes // J. Mol. Biol. 1975. Vol. 92. P. 15-37.

29. Alix J.H., Guerin M. Mutant DnaK chaperones cause ribosome assembly defects in Escherichia coli И Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1993. Vol. 90. P. 9725-9729.

30. Traub P., Nomura M. Srtucture and function of E.coli ribosomes. VI. Mechanism of assembly of 30S ribosomes studed in vitro II J. Mol. Biol. 1969. Vol. 40. P. 391-413.

31. Held W.A., Nomura M. Rate determining step in the reconstitution of Escherichia coli 30S ribosomal subunits//Biochemistry. 1973. Vol. 12. P. 3273-3281.

32. Tarn M.F., Hill W.E. Physical characteristics of the reconstitution intermediates (RI30 and RI30*) from the 30S ribosomal subunit of Escherichia coli II Biochemistry. 1981. Vol. 20. P. 6480-6484.

33. Holmes K.L., Culver G.M. Mapping structural differences between 30S ribosomal subunit assembly intermediates // Nat. Struct. Mol. Biol. 2004. Vol. 11. P. 179-186.

34. Held W.A., Mizushima S., Nomura M. Reconstitution of Escherichia coli 30S ribosomal subunits from purified molecular components // J. Biol. Chem. 1973. Vol. 248. P. 57205730.

35. Culver G. M. Assembly of the 30S subunit II Biopolymers. 2003. Vol. 68. P. 234-249.41 .Brunei C., Romby P. Probing RNA structure and RNA-ligand complexes with chemical probes // Methods Enzymol. 2000. Vol. 318. P. 3-21.

36. Fenton H.J.H. Oxidation of tartaric acid in presence of iron // J. Chem. Soc. 1894. Vol. 65. P. 899-910.

37. Hertzberg R.P., Dervan P.B. Clevage of double helical DNA by methidiumpropyl-EDTA-iron (II) // J. Am. Chem. Soc. 1982. Vol. 104. P. 313-315.

38. Tuerk G., Gold L. Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: RNA ligands to bacteriophage T4 DNA polymerase // Science. 1990. Vol. 249. P. 505-510.

39. Moine К, Cachia С., Westhof E., Ehresmann В., Ehresmann C. The RNA binding site of S8 ribosomal protein of Escherichia coli: Selex and hydroxy! radical probing studies // RNA. 1997. Vol. 3. P. 255-268.

40. A6.Allmang C., Mougel M., Westhof E., Ehresmann В., Ehresmann C. Role of conserved nucleotides in building the 16S rRNA binding site of E. coli ribosomal protein S8 // Nucleic Acids Res. 1994. Vol. 22. P. 3708-3714.

41. Robert F., Brakier-Gingras L. Ribosomal protein S7 from Escherichia coli uses the same determinants to bind 16S ribosomal RNA and its messenger RNA // Nucleic Acids Res. 2001. Vol. 29. P. 677-682.

42. Ревтович C.B., Никулин А.Д., Никонов С.В. Роль N-концевой спирали во взаимодействии рибосомного белка S15 с 16S рРНК // Биохимия. 2004. Т. 69. С. 1619-1624.

43. Rubin J.R., Sabat M., Sundaralingam M. Binding of cis- and trans-/Pt(NH2Cl2/ to tRNAphe // Nucleic Acids Res. 1983. Vol. 11. P. 6571-6586.

44. Yates J.R. 3rd, Gilchrist A., Howell K.E., Bergeron J.J.M. Proteomics of organelles and large cellular structures //Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2005. Vol. 6. P. 702-714.

45. Miiller R., Garrett R.A., Noller H.F. The structure of the RNA binding site of ribosomal proteins S8 and S15 //J. Biol. Chem. 1979. Vol. 254. P. 3873-3878.

46. Zimmermann R.A., Muto A., Fellner P., Ehresmann C., Branlant C. Location of ribosomal protein binding sites on 16S ribosomal RNA // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1972. Vol. 69. P. 1282-1286.

47. Svensson P., Changchien L.-M., Craven G.R., Noller H.F. Interaction of ribosomal proteins, S6, S8, S15 and S18 with the central domain of 16S ribosomal RNA // J. Mol. Biol. 1988. Vol. 200. P. 301-308.

48. Mougel M., Philippe С., Ebel J.-P., Ehresmann В., Ehresmann C. The E.coli 16S rRNA binding site of ribosomal protein SI5: higher-order structure in the absence and in the presence of the protein //Nucl. Acids Res. 1988. Vol. 16. P. 1225-1239.

49. Stern S., Weiser В., Noller H.F. Model for the three-dimensional folding of 16S ribosomal RNA // J. Mol. Biol. 1988. Vol. 204. P. 447-481.

50. Powers Т., Noller H.F. Hydroxyl radical footprinting of ribosomal proteins on 16S rRNA //RNA. 1995. Vol. 1. P. 194-209.

51. Portier C., Dondon L., Grunberg-Manago M. Translational autocontrol of the Escherichia coli ribosomal protein SI5 //J. Mol. Biol. 1990. Vol. 211. P. 407-414.

52. Benard L., Philippe C., Dondon L., Grunberg-Manago M., Ehresmann В., Ehresmann C., Portier C. Mutational analysis of the pseudoknot structure of the SI5 translational operator from Escherichia coli II Mol. Microbiol. 1994. Vol. 14. P. 31-40.

53. Scott L.G., Williamson J.R. Interaction of the Bacillus stearothermophilus ribosomal protein S15 with its 5'-translational operator mRNA // J. Mol. Biol. 2001. Vol. 314. P. 413-422.

54. Serganov A., Polonskaia A., Ehresmann В., Ehresmann C., Patel D.G. Ribosomal protein SI5 represses its own translation via adaptation of an rRNA-like fold within its mRNA // EMBO J. 2003. Vol. 22. P. 1898-1908.

55. Nikulin A., Serganov A., Ennifar E., Tishchenko S., Nevskaya N., Shepard W., Portier C., Garber M., Ehresmann В., Ehresmann C., Nikonov S., Dumas P. Crystal structure of the S15-rRNA complex // Nature Struct. Biol. 2000. Vol. 7. P. 273-277.

56. Clemons W.M., May J.L.C., Wimberly B.T., McCutcheon J.P., Capel M.S., Ramakrishnan V. Structure of bacterial 30S ribosomal subunit at 5.5 resolution // Nature. 1999. Vol. 400. P. 833-840.

57. Orr J. W., Hagerman P.J., Williamson J.R. Protein and Mg2+-induced conformational changes in the SI5 binding site of 16S ribosomal RNA // J. Mol. Biol. 1998. Vol. 275. P. 453-464.

58. Batey R. Т., Williamson J.R. Effects of polyvalent cations on the folding of an rRNA three-way junction and binding of ribosomal protein S15 // RNA. 1998. Vol. 4. P. 984-997.

59. Levitt M. Detailed molecular model for transfer ribonucleic acid // Nature. 1969. Vol. 224. P. 759-763.

60. Batey R.T., Williamson J.R. Interaction of the Bacillus stearothermophilus ribosomal protein SI5 with 16S rRNA. II. Specificity determinants of RNA-protein recognition // J. Mol. Biol. 1996. Vol. 261. P. 550-567.

61. Allain F.H., Varani G. Structure of the PI helix from group I self-splicing introns // J/ Mol. Biol. 1995. Vol. 250. P. 333-353.

62. Agalarov S.C., Sridhar Prasad G., Funke P.M., Stout C.D., Williamson J.R. Structure of the SI 5, S6, S18-rRNA complex: assembly of the 30S ribosome central domain // Science. 2000. Vol. 288. P. 107-113.

63. Wower I., Brimacombe R. The localization of multiple sites on 16S RNA wich are cross-linked to proteins S7 and S8 in Escherichia coli 30S ribosomal subunits by treatment with 2-iminothiolane// Nucleic Acids Res. 1983. Vol. 11. P. 1419-1437.

64. Mougel M., Allmang C., Eyermann F., Cachia C., Ehresmann В., Ehresmann C. Minimal 16S rRNA binding site and role of conserved nucleotides in Escherichia coli ribosomal protein S8 recognition // Eur. J. Biochem. 1993. Vol. 215. P. 787-792.

65. Zengel J.M., Lindahl L. Diverse mechanisms of regulating ribosomal protein synthesis in Escherichia coli II Prog. Nucleic Asids Res. Mol. Biol. 1994. Vol. 47. P. 331-370.

66. Cerretty D.P., Mattheakis L.S., Kearney K.R., Vu L., Nomura M. Translation regulation of the spc operon in Escherichia coli: Identification and structural analysis of the target site for S8 repressor protein // J. Mol. Biol. 1988. Vol. 204. P. 309-329.

67. Merianos H.J., Wang J., Moore P.B. The structure of a ribosomal protein S81 spc operon mRNA complex // RNA. 2004. Vol. 10. P. 954-964.

68. Fallon A.M., Jinks C.S., Strycharz G.D., Nomura M. Regulation of ribosomal protein synthesis in Escherichia coli by selective mRNA inactivation // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1979. Vol. 76. P. 3411-3415.

69. Fiil N.P., Friesen J.D., Downing W.L., Dennis P.P. Posttranscriptional regulatory mutants in a ribosomal protein-RNA polymerase operon of E. coli И Cell. 1980. Vol. 19. P. 837844.

70. Lindahl L., Zengel J.M. Operon-specific regulation of ribosomal protein synthesis in Escherichia coli II Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1979. Vol. 76. P. 6542-6546.

71. Nomura M., Yates J.L., Dean D., Post L.E. Feedback regulation of ribosomal protein gene expression in Escherichia coli: Structural homology of ribosomal RNA and ribosomal protein mRNA // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1980. Vol. 77. P. 7084-7088.

72. Gutell R.R., Weiser В., Woese C.R., Noller H.F. Comparative anatomy of 16S-like ribosomal RNA // Prog. Nucleic Acids Res. Mol. Biol. 1985. Vol. 32. P. 155-216.

73. Kalurachchi K., Uma K., Zimmermann R.A., Nikonowisz E.P. Structural features of the binding site for ribosomal protein S8 in Escherichia coli 16S rRNA defined using NMR spectroscopy // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1997. Vol. 94. P. 2139-2144.

74. Kalurachchi K., Nikonowisz E.P. NMR structure determination of the binding site for ribosomal protein S8 from Escherichia coli 16S rRNA // J. Mol. Biol. 1998. Vol. 280. P. 639-654.

75. Novotny V., Nierhaus K.N. Assembly of the 30S subunit from Escherichia coli ribosomes occurs via two assembly domains which are initiated by S4 and S7 // Biochemistry. 1988. Vol. 27. P. 7051-7055.

76. Yusupov M.M., Yusupova G.Zh., Baucom A., Lieberman K., Earnest T.N., Cate J.H.D., Noller H. Crystal structure of the ribosome at 5.5 A resolution // Science. 2001. Vol. 292. P. 883-896.

77. Carter A.P., Clemons W.M., Brodersen D.E., Morgan-Warren R.J., Wimberly B.T., Ramakrishnan V. Functional insights from the structure of the 30S ribosomal subunit and its interaction with antibiotics //Nature. 2000. Vol. 407. P. 340-348.

78. Buck M.A., Cooperman B.S. Single protein omission reconstitution studies of tetracycline binding to the 30S subunit of Escherichia coli ribosomes // Biochemistry. 1990. Vol. 29. P. 5374-5379.

79. Bischof O., Kruft V., Wittmann-Viebold B. Analysis of the pyromicin binding site in the 70S ribosome of Escherichia coli at the peptide level // J. Biol. Chem. 1994. Vol. 269. P. 18315-18319.

80. Ehresmann В., Bachendorf C., Ehresmann С., Millon R., Ebel J-P. Effect of ultraviolet irradiation on 30S ribosomal subunits. Identification of the RNA region crosslinked to protein S7 // Eur. J. Biochem. 1980. Vol. 104. P. 255-262.

81. Zweib C., Brimacombe R. RNA-protein cross-linking in Escherichia coli 30S ribosomal subunits: precise localization of the nucleotide in 16S RNA which is coupled to protein S7 by ultraviolet irradiation // Nucleic Asids Res.1979. Vol. 6. P. 1775-1790.

82. Powers Т., Changchien L.-M., Craven G.R., Noller H.F. Probing the assembly of the 3' major domain of 16S ribosomal RNA. Quaternary interactions involving ribosomal proteins S7, S9 and S19 // J. Mol. Biol. 1988. Vol. 200. P. 309-319.

83. Dragon F., Payant C„ Brakier-Gingras L. Mutational and structural analysis of the RNA binding site for Escherichia coli ribosomal protein S7 // J. Mol. Biol. 1994. Vol. 244. P. 74-85.

84. Saito К., Mattheakis L.C., Nomura M. Posttranscriptional regulation of the str operon in Escherichia coli. Ribosomal protein S7 inhibits coupled translation of S7 but not its independent translation // J. Mol. Biol. 1994. Vol. 235. P. 111-124.

85. Saito K., Nomura M. Post-transcriptional regulation of the str operon in Escherichia coli. Structural and mutational analysis of the target site for translational repressor S7 // J. Mol. Biol. 1994. Vol. 235. P. 125-139.

86. Golovin A., Spiridonova V., Kopylov A. Mapping contacts of the S12-S7 intercistronic region of str operon mRNA with ribosomal protein S7 of E.coli II FEBS lett. 2006. Vol. 580. P. 5858-5862.

87. Hosaka H., Nakagawa A., Tanaka I., Harada N., Sano K., Kimura M., Yao M., Wakatsuki S. Ribosomal protein S7: a new RNA-binding motif with structural similarities to a DNA architectural factor // Structure. 1997. Vol. 5. P. 1199-1208.

88. Wimberly B.T., White S.W., Ramakrishnan V. The structure of ribosomal protein S7 at 1.9 resolution reveals a beta-hairpin motif that binds double-stranded nucleic acids // Structure. 1997. Vol. 5. P. 1187-1198.

89. Mueller F., Brimacombe R. A new model for the three-dimensional folding of Escherichia coli 16S ribosomal RNA. I. Fitting the RNA to a 3D electron microscopic map at 20 // J. Mol. Bi ol. 1997. Vol. 271. P. 524-544.

90. Tanaka I., Nakagawa A., Hosaka H., Wakatsuki S., Mueller F„ Brimacombe R. Matching the crystallographic structure of ribosomal protein S7 to a three-dimensional model of the 16S ribosomal RNA // RNA. 1998. Vol. 4. P. 542-550.

91. Brimacombe R. RNA-protein interactions in the Escherichia coli ribosome // Biochimie. 1991. Vol. 73. P. 927-936.

92. Robert F., Gagnon M., Sans D., Michnick S., Brakier-Gingras L. Mapping of the RNA recognition site of Escherichia coli ribosomal protein S7 // RNA. 2000. Vol. 6. P. 16491659.

93. Stern S., Wilson L.C., Noller H.F. Localization of the binding site for protein S4 on 16S ribosomal RNA by chemical and enzymatic probing and primer extension // J. Mol. Biol. 1986. Vol. 192. P. 101-110.

94. Heilek G.M., Marusak R., Meares C.F., Noller H.F. Directed hydroxyl radical probing of 16S rRNA using Fe(II) tethered to ribosomal protein S4 // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1995. Vol. 92. P. 1113-1116.

95. Stern S., Changchien L.-M., Craven G.R., Noller H.F. Interaction of proteins SI6, S17 and S20 with 16S ribosomal RNA // J. Mol.Biol. 1988. Vol. 200. P. 291-299.

96. Markus M.A., Gerstner R.B., Draper D.E., Torchia D.A. The solution structure of ribosomal protein S4 delta41 reveals two subdomains and a positively charged surface that may interact with RNA // EMBO J. 1998. Vol. 17. P. 4559-4571.

97. Noller H.F. Biochemical characterization of the ribosomal decoding site // Biochimie. 2006. Vol. 88. P. 935-941.

98. Ogle J.M., Ramakrishnan V. Structural insights into translational fidelity // Annu. Rev. Biochem. 2005. Vol. 74. P. 129-177.

99. Golden B.L., Hoffman D.W., Ramacrishnan V., White S.W. Ribosomal protein S17: characterization of the three dimensional structure by !H and I5N NMR // Biochemistry. 1993. Vol. 32. P. 12812-12820.

100. Jaishree T.N., Ramakrishnan V., White S.W. Solution structure of prokaryotic ribosomal protein S17 by high-resolution NMR spectroscopy // Biochemistry. 1996. Vol. 35. P. 2845-2853.

101. Murzin A.G. OB (oligonucleotide-oligosaccharide binding)-fold: common structural and functional solution for non-homologous sequences // EMBO J. 1993. Vol. 12. P. 861-867.

102. Klein D.J., Schmeing T.M., Moore P.В., Steitz T.A. The kink-turn: a new RNA secondary structure motif// EMBO J. 2001. Vol. 20. P. 4214-4221.

103. Dabbs E.R. Selection for Escherichia coli mutants with proteins missing from the ribosome //J. Bact. 1979. Vol. 140. P. 734-737.

104. Gotz F., Fleischer C., Pon C.L., Gualerzi C.O. Subunit association defects in Escherichia coli ribosome mutants lacking proteins S20 and LI 1 // Eur. J. Biochem. 1989. Vol. 183. P. 19-24.

105. Ryden-Aulin M., Shaoping Z, Kylsten P., Isaksson L.A. Ribosome activity and modification of 16S RNA are influenced by deletion of ribosomal protein S20 // Mol. Microbiol. 1993. Vol. 7. P. 983-992.

106. Culver G.M., Noller H.F. Directed hydroxyl radical probing of 16S ribosomal RNA in ribosomes containing Fe(II) tethered to ribosomal protein S20 // RNA. 1998. Vol. 4. P. 1471-1480.

107. Cormack R.S., Mackie G.A. Mapping ribosomal protein S20-16S rRNA interaction by mutagenesis//J. Biol. Chem. 1991. Vol. 266. P. 18525-18529.

108. Mangiarotti G., Chiaberge S. Reconstitution of functional eukaryotic ribosomes from Dictyostelium discoideum ribosomal proteins and RNA // J. Biol. Chem. 1997. Vol. 272. P. 19682-19687.

109. Doudna J.A., Rath V.L. Structure and function of the eukaryotic ribosome: the next frontier// Cell. 2002. Vol. 109. P. 153-156.

110. Fromont-Racine M., Senger В., Saveanu C., Fasiolo F. Ribosome assembly in eukaryotes//Gene. 2003. Vol. 313. P. 17-42.

111. Nierhaus K.H. The assembly of prokaryotic ribosomes // Biochimie. 1991. Vol. 73. P. 739-755.

112. Maki J.A., Schnobrich D.J., Culver G.M. The DnaK chaperone system facilitates 30S ribosomal subunit assembly // Mol. Cell. 2002. Vol. 10. P. 129-138.

113. Grummt F., Bielka H. Stepwise dissociation of rat-liver ribosomes into core particles and split proteins //Biochym. Biophys. Acta. 1970. Vol. 199. P. 540-542.

114. Welfle К, Henkel В., Bielka H. Ionic interactions in eukaryotic ribosomes: splitting of the subunits of rat liver ribosomes by treatment with monovalent cations // Acta Biol. Med. Germ. 1976. Vol. 35. P. 401-411.

115. Lutsch G., Noll F„ Theise H., Enzmann G., Bielka H. Localization of proteins SI, S2, S16 and S23 on the surface of small subunits of rat liver ribosomes by immune electron microscopy//Mol. Gen. Genet 1979. Vol. 176. P. 281-291.

116. Lutsch G., Bielka H., Enzmann G., Noll F. Electron microscopic investigations on the location of rat liver ribosomal proteins S3a, S5, S6, S7 and S9 by means of antibody labeling // Biomed. Biochim. Acta. 1983. Vol. 42. P. 705-723.

117. Lutsch G., StahlJ., Kargel H.-J., Noll K., Bielka H. Immunoelectron microscopic studies on the location of ribosomal proteins on the surface of the 40S ribosomal subunit from rat liver//Eur. J. Cell. Biol. 1990. Vol. 51. P. 140-150.

118. Bommer U.-A., Nol ,F., Lutsch G., Bielka H. Immunochemical detection of proteins in the small subunit of rat liver ribosomes involved in binding of the ternary initiation complex//FEBS Lett. 1980. Vol. 111. P. 171-174.

119. Tolan D.R., Traut R.R. Protein topography of the 40 S ribosomal subunit from rabbit reticulocytes shown by cross-linking with 2-iminothiolane // J. Biol. Chem. 1981. Vol. 256. P. 10129-10136.

120. Gross В., Westermann P., Bielka H. Spatial arrangement of proteins within the small subunit of rat liver ribosomes studied by cross-linking // EMBO J. 1983. Vol. 2. P. 255260.

121. Yeh Y.~C., Traut R.R., Lee J.C. Protein topography of the 40 S ribosomal subunit from Saccharomyces cerevisiae as shown by chemical cross-linking // J. Biol. Chem. 1986. Vol. 261. P. 14148-14153.

122. Xiang R.H., Lee J.C. Identification of proteins crosslinked to RNA in 40S ribosomal subunits of Saccharomyces cerevisiae II Biochimie. 1989. Vol. 71. P. 1201-1204.

123. Uchiumi Т., Terao K., Ogata K. Ribosomal proteins cross-linked to 28-S and 18-S rRNA separated by sedimentation after ultraviolet irradiation of rat liver ribosomes // Eur. J. Biochem. 1983. Vol. 132. P. 495-499.

124. Malygin A.A., Dobrikov M.I., Repkova M.N., Shishkin G.V., Ven'yaminova A.G., Karpova G.G. Proteins neighboring 18S rRNA conserved sequences 609-618 and 10471061 within the 40S human ribosomal subunit // RNA. 1999. Vol. 5. P. 1656-1664.

125. Alexander R.W., Muralikrishna P., Cooperman B.S. Ribosomal components neighboring the conserved 518-533 loop of 16S rRNA in 30S subunits // Biochemistry. 1994. Vol. 33. P. 12109-12018.

126. Muralikrishna P., Alexander R.W., Cooperman B.S. Placement of the alpha-sarcin loop within the 50S subunit: evidence derived using a photolabile oligodeoxynucleotide probe //Nucleic Acids Res. 1997. Vol. 25. P. 4562-4569.

127. Bernstein K.A., Gallagher J.E., Mitchell B.M., Granneman S., Baserga S.J. The small-subunit processome is a ribosome assembly intermediate // Eucaryot. Cell. 2004. Vol. 3. P. 1619-1626.

128. Kruger Т., ZentgrafH., Scheer U. Intranucleolar sites of ribosome biogenesis defined by the localization of early binding ribosomal proteins // J. Cell. Biol. 2007. Vol. 177. P. 573578.

129. Puvion-Dutilleul F., Puvion E., Bachellerie J.P. Early stages of pre-rRNA formation within the nucleolar ultrastructure of mouse cells studied by in situ hybridization with a 5'ETS leader probe // Chromosoma. 1997. Vol. 105. P. 496-505.

130. Puvion-Dutilleul F., Bachellerie J.P., Puvion E. Nucleolar organization of HeLa cells as studied by in situ hybridization // Chromosoma. 1991. Vol. 100. P. 395-409.

131. Lazdins I.B., Delannoy M., Sollner-Webb B. Analysis of nucleolar transcription and processing domains and pre-rRNA movements by in situ hybridization // Chromosoma. 1997. Vol. 105. P. 481-495.

132. Morgan D.G., Menetret J.-F., Neuhof A., Rapoport T.A., Akey Ch.W. Structure of the mammalian ribosome-channel complex at 17 A resolution // J. Mol. Biol. 2002. Vol. 324. P. 871-886.

133. Бабкина ГЛ., Владимиров C.H., Грайфер Д.М., Матасова Н.Б., Смоленская И.А., Карпова Г.Г. Выделение рибосом и субчастиц из плаценты человека и определение их функциональной активности // Изв. Сиб. Отд. АН СССР. 1989. Вып. 2. С. 92-98.

134. Bradford М.М. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding // Anal. Biochem. 1976. Vol. 72. P. 248-254.

135. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 //Nature. 1970. Vol. 277. P. 680-685.

136. Madjar J.-J., Arpin M., Buisson M., Reboud J.-P. Spot position of rat liver ribosomal proteins by four different two-dimentional electrophoresis in polyacrylamide gel // Mol. Gen. Genet. 1979. Vol. 171. P. 121 -134.

137. Lastic S.M., McConkey E.H. Exchange and stability of HeLa ribosomal protein in vitro II J. Biol. Chem. 1976. Vol. 251. P. 2867-2875.

138. Knopf U.C., SoMMer A., Kenny J., Traut R.R. A new two-dimensional gel electrophoresis system for the analysis of complex protein mixtures: Application to the ribosome of Я coli И Mol. Biol. Rep. 1975. Vol. 2. P. 34-40.

139. Kaltschmidt E., Wittmann H.G. Ribosomal proteins. VII. Two-dimensional polyacrilamyde gel electrophoresis for fingerprinting of ribosomal proteins // Anal. Biochem. 1970. Vol. 36. P. 401-412.

140. Малыгин А.А., Грайфер Д.М., Лалетина E.C., Шатский И.Н., Карпова Г.Г. Подход к выявлению функционально важных участков РНК, основанный на комплементарно-адресованной модификации // Молекуляр. биология. 2003. Т. 37. С. 1027-1034.

141. Иванов А.В., Малыгин А.А., Карпова Г.Г. Рибосомные белки, связывающиеся с первым интроном пре-мРНК рибосомного белка S26 человека, стимулируют взаимодействие белков экстракта клеток HeLa с этим интроном // Молекуляр. биология. 2002. Т. 36. С. 503-510.

142. Clarke P. A. RNA Footprinting and modification interference analysis // RNA-protein interaction protocols / Eds S.R. Haynes. Totowa, New Jersey: Humana Press, 1999. P. 7391.

143. McConkey Е.Н., Bielka К, Gordon J., Lastick S.M., Lin A., Ogata K., Reboud J.P., Traugh J.A., Traut R.R., Warner J.R., Welfle H., Wool I.G. Proposed uniform nomenclature for mammalian ribosomal proteins // Mol. Gen. Genet. 1979. Vol. 169. P. 16.

144. Chaudhuri S., Vyas K., Kapasi P., Komar A.A., Dinman J.D., Barik S., Mazumder B. Human ribosomal protein LI3a is dispensable for canonical ribosome function but indispensable for efficient rRNA methylation // RNA. 2007. Vol. 13. P. 2224-2237.

145. Mazumder В., Sampath P., Seshadri V., Maitra R.K., DiCorleto P.E., Fox P.L. Regulated release of LI3a from the 60S ribosomal subunit as a mechanismof transcript-specific translational control // Cell. 2003. Vol. 115. P. 187-198.

146. DeLano W.L. The PyMOL Molecular Graphics System // DeLano Scientific. San Carlos, CA, USA. 2002.

147. Zuker M. Mfold web server for nucleic acid folding and hybridization prediction // Nucleic Acids Res. 2003. Vol. 32. P. 3406-3415.

148. Klein D.J., Moore P.В., Steitz T.A. The roles of ribosomal proteins in the structure assembly, and evolution of the large ribosomal subunit // J. Mol. Biol. 2004. Vol. 340. P. 141-177.

149. Lambert С., Leonard N., De Bolle X., Depiereux E. ESyPred3D: Prediction of proteins 3D structures // Bioinformatics. 2002. Vol. 18. P. 1250-1256.

150. Tompa P., Cresmely P. The role of structural disorder in the function of RNA and protein chaperones // FASEB J. 2004. Vol. 18. P. 1169-1175.

151. Автор признателен рецензенту Валентине Николаевне Буневой за внимательное прочтение работы и ценные советы по оформлению полученных результатов.

Информация о работе

Яньшина, Дарья Дмитриевна
кандидата биологических наук
Новосибирск, 2008
ВАК 03.00.04

Диссертация

Связывание рибосомных белков S5 и S16 человека с участком 1203-1236/1521-1698 3`-концевого домена 18S pРНК - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы