5S pРНК-связывающие белки бактериальной рибосомы

Гонгадзе, Георгий Михайлович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
5S pРНК-связывающие белки бактериальной рибосомы
ВАК РФ 03.01.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "5S pРНК-связывающие белки бактериальной рибосомы"

На правах рукописи

ГОНГАДЗЕ Георгий Михайлович

58 рРНК-СВЯЗЫВАЮЩИЕ БЕЛКИ БАКТЕРИАЛЬНОЙ РИБОСОМЫ: СТРУКТУРА, ФУНКЦИЯ И ЭВОЛЮЦИЯ

03.01.03 - молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

094615395

- 2 ДЕК 20Т0

Москва-2010

004615395

Работа выполнена в лаборатории структурных исследований аппарата трансляции Института белка РАН

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ: Доктор химических наук, профессор, академик РАН Доктор биологических наук Доктор физико-математических наук

Богданов Алексей Алексеевич Железная Людмила Алексеевна Хенинашвили Николай Николаевич

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ

Филиал Института биоорганической химии имени М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН.

Защита состоится «/7- 2010 года в часов на заседании

диссертационного Совета Д 501.001.76. по защите докторских и кандидатских диссертаций при Московском государственном университете имени М.В. Ломоносова по адресу: 119992, Москва, ГСП-2, Ленинские горы, МГУ, НИИ физико-химической биологии имени А.Н. Белозерского, ауд. 536.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова.

Автореферат разослан « 2010 г.

Ученый секретарь диссертационного совета.

ди^^ршцииппши 1/ивыа, л

кандидат биологических наук И. А. Крашенинников

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБО ТЫ

Актуальность проблемы. Синтез белков на рибосоме является одним из ключевых процессов жизнедеятельности любого организма, поэтому выяснение принципов структурной организации рибосомы и молекулярных механизмов трансляции является одной из самых актуальных проблем молекулярной биологии. С одной стороны, рибосома - это уникальный рибонуклеопротеид, консервативность структуры которого определяет универсальность ключевых этапов биосинтеза белка в клетках разных организмов. С другой стороны, сама уникальная и консервативная структура рибосомы в значительной степени зависит от специфических молекулярных контактов между ее компонентами. В связи с этим, в рамках проблемы биосинтеза белка, одной из наиболее приоритетных задач является выяснение роли отдельных рибосомиых компонентов и их межмолекулярных контактов в формировании и функционировании рибосомы. Кроме того актуальность проблемы определяется еще тем, что ее решение имеет не только фундаментальное, но и прикладное значение, так как именно рибосома является мишеныо для целого ряда таких агентов, как антибиотики и токсины.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы являлось изучение структуры бактериального 5S рРНК-белкового комплекса и специфических взаимодействий в нем, а также выяснение роли 5S рРИК-связывающих белков в сборке функционально-активной бактериальной рибосомы. Для выполнения данной работы были поставлены следующие основные задачи:

• Идентификация 5S рРНК-связывающих белков рибосомы Thermits ¡hemophilus и выявление их гомологии с белками из других организмов.

• Определение участков связывания рибосомиых белков Т. ¡hemophilus на молекуле 5S рРНК. Выявление участков белков и РНК, определяющих специфическое взаимодействие в бактериальном 5S рРНК-белковом комплексе.

• Определение пространственных структур 5S рРНК-связывающих белков Т. themophilus и их комплексов с РНК.

• Установление степени необходимости каждого из 5S рРНК-связывающих рибосомиых белков Escherichia coli для выживания бактериальной клетки и функционирования ее аппарата трансляции.

Научная новизна и практическая значимость работы. В настоящей работе была поставлена точка в давнем вопросе о численности бактериальных 5S рРНК-связывающихся рибосомиых белков: их оказалось три, и один из них, белок-семейства СТС, является особенностью бактериального аппарата трансляции. Впервые было продемонстрировано, что представители семейства СТС, такие рибосомные белки как TL5 Т. themophilus и L25 Е. coli, а также основной стрессовый

белок СТС Bacillus subtilis, являются не только структурными, но и функциональными гомологами. Впервые показано, что местом специфического связывания рибосомного белка L5 на 5S рРНК является С-петля. Пространственная структура большей части 5S рРНК-белкового комплекса, определенная в данной работе с высоким разрешением, внесла существенный вклад в построение модели рибосомы, и является до сих пор востребованной в исследованиях детальной структурной организации бактериальной рибосомы. В работе получены данные, которые позволили впервые оценить степень необходимости каждого из 5S рРНК-связывающих белков для сборки функционально-активной рибосомы in vivo и для выживания бактериальной клетки. Впервые показано, что белок семейства СТС, не являясь необходимым для выживания клеток Е. coli, чрезвычайно важен для стабилизации структуры центрального протуберанца рибосомной 50S субчастицы.

Публикации и апробация работы. Материалы диссертационной работы опубликованы в 19 статьях в российских и международных журналах и 29 тезисах, представленных на международных и российских конференциях: "Thermophiles-96" (Атенс, США, 1996), "Structural aspects of protein synthesis" (Таллберг, Швеция, 1997), "Extremophiles-98" (Йокогама, Япония, 1998), "Thermophiles-98" (Брест, Франция, 1998), "The ribosome. Structure, function, antibiotics and cellular interactions" (Хельсинор, Дания, 1999), "Protein synthesis" (Пущино, Россия, 2001), "Crystallization of Biological Macromolecules" (Йена, Германия, 2002), "International Engelgardt conference on molecular biology" (Буран, Россия, 2006), International conference in honour of Alexander Spirin "Protein biosynthesis, structure and function" (Пущино, Россия, 2007), Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, Россия, 2001-2009), «Международной научной конференции по биоорганической химии, биотехнологии и бионанотехнологии, посвященной 75-летию со дня рождения академика Ю.А. Овчинникова» (Москва, Россия, 2009).

Личный вклад автора. Результаты работы получены лично автором, под его руководством или при его непосредственном участии в планировании и проведении экспериментов. Имена соавторов, которым автор искренне благодарен за плодотворное сотрудничество, указаны в соответствующих публикациях.

Финансовая поддержка работы. Работа выполнена при финансовой поддержке Российской академии наук, Российского фонда фундаментальных исследований (проекты: 1995-2008 гг.), Шведской академии наук и Федерации европейского биохимического общества.

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на у страницах, состоит из введения, трех глав, заключения, выводов и списка цитируемой литературы ( ссылок). Работа иллюстрирована тУ рисунками и

/О таблицами.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

К моменту начала нашей работы о 5S рРНК был уже накоплен значительный экспериментальный материал, однако о рибосомных белках, специфически связывающихся с этой РНК, было известно еще очень мало. Так в Археях, Бактериях и Эукариотах было обнаружено разное количество 5S рРНК-связывающихся белков. Более того даже в двух бактериях, для которых были идентифицированы 5S рРНК-связывающиеся белки, их число оказывалось различным: в Bacillus stearothermophilus - два, L5 и L18, а в Escherichia coli - три, L5, L18 и L25. Поэтому было неясно, сколько белков, специфически связывающихся с рибосомной 5S РНК, характерно для бактериальной рибосомы. Кроме того, несмотря на многолетние исследования, участки связывания бактериальных рибосомных белков L5 и L18 на 5S рРНК были определены только приблизительно. Роль указанных рибосомных белков в формировании и функционировании бактериальной рибосомы была практически не изучена. Было показано только, что присутствие обоих белков, L5 и L18, необходимо для образования комплекса между изолированными 5S рРНК и 23S рРНК. Вопрос о пространственной структуре 5S рРНК-белкового комплекса и его компонентов был совершенно не изучен, и потому оставался очень актуальным. Учитывая сложившуюся ситуацию, нами были определены три основных направления в исследованиях: идентификация и изучение 5S рРНК-связывающих свойств рибосомных белков Thermus thermophilus и их гомологов из других бактерий; определение пространственной структуры данных белков и их комплексов с 5S рРНК; выяснение роли 5S рРНК-связывающих белков в формировании функционально-активной бактериальной рибосомы.

1. Рибосомные белки Thermus thermophilus, специфически связывающиеся с 5S рРНК

В первых же экспериментах нами были обнаружены два рибосомных белка Т. thermophilus (20 и 23 kDa), образующие стабильный комплекс с изолированной 5S рРНК. По данным двумерного электрофореза в полиакриламидном геле (ПААГ) этими белками оказались TL4 и TL5 (Рис. 1 Б). Белок TL4 - это типичный основной рибосомный белок, а белок TL5 - один из самых кислых белков 50S рибосомной субчастицы Т. thermophilus (Рис. 1А). Белок с такой электрофоретической подвижностью среди рибосомных белков Е. coli, В. subtilis и В. stearothermophilus ранее не обнаруживался. Поэтому, выявленный нами 5S рРНК-связывающий белок TL5 можно было отнести к особенным белкам рибосомы данной бактерии. Рибосомные белки TL4 и TL5 Т. thermophilus были выделены и охарактеризованы. Эти белки как независимо, так и вместе образовывали эквимолярный комплекс с 5S

рРНК Т. thermophilus, Е. coli или В. stearothermophilus. Учитывая этот результат, была проверена способность белков TL4 и TL5 конкурировать с рибосомными белками L5, L18 и L25 из Е. coli за связывание 5S рРНК. Оказалось, что белок TL4

SW'iLtu«

1WS П.«6ПЛ7

изо

тггз • чя

TL26

TU1 «»TU«

ru»

Т1.2/ П. ¡О

ГС2Й ' Л

TL18

Рис. 1. Двумерный электрофорез в ПААГ рибосомных белков Т. themophilus. А - Суммарный белок SOS субчастицы; Б - 5S рРНК-связывающие белки.

конкурирует за связывание 5S рРНК с белком L5, a TL5 - с белками L18 и L25. То, что с 5S рРНК связывались только два рибосомных белка Т. themophilus в середине 90s годов не казалось необычным, так как статистических данных о числе бактериальных 5S рРНК-связывающихся белков на тот момент не было. Однако два появившихся в тот период времени факта подвигли нас на продолжение поисков других 5S рРНК-связывающихся белков этой бактерии. Во-первых, в нашей лаборатории при секвенировании участка хромосомы Т. thermophilus (часть spc-оперона) был обнаружен ген, кодирующий белок, гомологичный 5S рРНК-связывающему белку L18 Е. coli (Vysotskaya et al., 1997, Gene, 193, 23-30). Во-вторых, в некоторых наших реконструкционных экспериментах в комплексе с 5S рРНК обнаруживался в следовых количествах третий белок с молекулярной массой ; около 10 кПа. После оптимизации условий эксперимента нами был идентифицирован -третий 5S рРНК-связывающий белок Т. thermophilus. В соответствии с номенклатурой двумерного электрофореза им оказался белок TL18 (Рис. 1Б). Таким образом, нами было установлено, что три белка рибосомы Т. thermophilus, TL4, TL5 и TL18, образуют прочный специфический комплекс с изолированной 5S рРНК. В связи с полученными данными возникал вполне закономерный вопрос: есть ли среди известных белков других организмов гомологи белков TL4, TL5 и TL18?

К середине 90* годов только для нескольких белков большой рибосомной субчастицы Т. thermophilus была проведена сравнительная идентификация с белками из других организмов (Sedelnikova et al., 1994, Biochimie, 76, 440-51), все белки были

идентифицированы значительно позже (Katsani et al., 2000, Biol. Chem., 381, 1079-87). Поэтому, нами была определена N-концевая аминокислотная последовательность (39 остатков) белка TL4 (Рис. 2). Сравнение этого участка белка TL4 с первичными структурами известных белков выявило явную гомологию с 5S рРНК-связывающими ; рибосомными белками семейства L5. Как видно на рисунке 2, N-концевые участки

Рис. 2. Сравнение N-концевых аминокислотных последовательностей белков TL4 и TL5 Т. thermophilus с ■ соответствующими участками

| рибосомных белков из других организмов. EcoL5, BstL5 и TfN -| рибосомные белки L5 из Е. coli, В. sleumlhermaphilus и неизвестный 5S рРНК-связывающий белок из Thermus flaws, соответственно. * - идентичные остатки; + - консервативные остатки.

белков TL4 и 5S рРНК-связывающих рибосомных белков L5 Е. coli и В. stearothermophilus консервативны. Становилось очевидным, что белок TL4 Т. thermophilus является представителем семейства рибосомных белков L5. Учитывая полученные результаты и данные об организации генов spc оперона Т. thermophilus, полученные в нашей лаборатории, мы клонировали и экспрессировали гены гр!5 и гр118 Т. thermophilus в штамме-продуценте Е. coli. Сравнение свойств рекомбинантного белка TthL5 и рибосомного белка TL4 Т. thermophilus позволило окончательно убедиться в том, что белок TL4 является продуктом гена гр15. Кроме того сравнение свойств рибосомного белка TL18 и рекомбинантного белка TthL18 (продукт гена rpll8 Т. thermophilus) показало, что это один и тот же белок. Таким образом, учитывая все имеющиеся данные, мы могли с полной уверенностью заключить, что белки TL4 и TL18 Т. thermophilus являются гомологами известных 5S рРНК-связывающихся рибосомных белков L5 и L18 Е. coli, соответственно.

Ситуация с выявлением гомологов белка TL5 оказалась гораздо сложнее, чем с двумя указанными выше белками Т. thermophilus. Нами была определена N-концевая аминокислотная последовательность (53 остатка) белка TL5 Т.thermophilus (Рис. 2). Однако этот участок белка TL5 не обнаружил какой-либо достаточно выраженной гомологии с первичными структурами известных рибосомных белков из других организмов. В то же время, в лаборатории Волькера Эрдманна был выявлен 5S рРНК-связывающий белок из Т. flavus с практически идентичной N-концевой

*+ * ** *+ * * + +***.|.**.|.4.+*

TL4. PLDLALKRKYYEEVRPELIRRFGYQNVXEVPRLEKVVIN

EcoL5 AKLHDYYKDEWKKmTEFNYNSVMQVPRVEKITLNM. .

BstL5. MNRLKEKYVKEWPALMSKFNYKSIMQVPKIEKIVINM. .

*********************************** *

TL5. MEYRLKAYYREGEKPSALRRAGKLPGVMYNRHLNRKVYV

TfN. MEYRLKAYYREGEKPSALRRAGKLPGVMYNRHLN8XXYX

***+* ****** * ^

-DLVEFDKVFRQAXI

XDLVQFEKVFRQASIHHV. .

аминокислотной последовательностью (Рис. 2). Таким образом, становилось очевидным, что, по крайней мере, два представителя рода Thermus имеют такой 5S рРНК-связывающий белок. Используя метод ограниченного протеолиза, нами были исследованы некоторые свойства необычного рибосомного белка TL5. Было обнаружено, что при гидролизе трипсином от свободного белка отщепляется с N- ; конца очень нестабильный фрагмент примерно 8-9 lcDa (75-80 остатков). Белок, лишенный указанного N-кояцевого участка, оказывался неспособным связываться с | 5S рРНК. В то же время, данный N-концевой участок белка TL5 становился в комплексе с 5S рРНК недоступным для гидролиза. Из полученных данных следовало, ! что N-концевой участок белка TL5 примерно в 80 аминокислотных остатков строго необходим для связывания 5S рРНК. j

Так как, несмотря на все полученные данные, ситуация с обнаружением J гомологов белка TL5 так и не прояснилась, мы решили секвенировать ген этого белка. Используя информацию об аминокислотной последовательности некоторых

+ + * * -f. * ** * * * H-+* +

L25. MFTINAEVRKEßGKGASRRLRAÄNKFPAIIYGGKEAPLAIELDHDKVMN 49

TL5. MEYRLKAYYREGEKPSALRR . . AGKLPGLMYNRHL . NRKVYVDLVEFDK 46

СТС. MATLTAKERTDFTRSSLRNIRTSGHVPGIIYGKDTGNKPVSLDSVELIK 49

* * * * + ** +* + * 4.* ** *

+ *+++ + ** + + +*+ + + +*+**

L25. MQAKAEFYSEVLTIW. DGKEIKVKAQDVQRHPYKPKLQHIDFVRA 94

TL5. V. FRQAS IHHVIVLELPDGQSLPTLVRQVNLDKRRRRPEHVDFFVbS . DE 94

СТС. T. LRDEGKNAVITLEV. SGEKHSVMVTDLQTDPLKNEITHADFQWNMSE 97

+++ * + * ** *

TL5 PVEMYVPLRFVGTPAGVRAGGVLQEIHRDILVKVSPRNIPEFIEVDVSGL 144

СТС. DI EVE VPIHLTGEAIGVKNGGVLQQPL YALTVKAKPKAIPQT IE AD IS S L 147

+*+ **+ *****+ .). *+ **+ *

TL5. EIGDSLHASDLKLPPGVELAVSPEETIAAWPPEDVEKLAEEAAAEVAEP 194

СТС. DVNEVLTIADLPAGGDYSFNHESDEWASILPPQQQE......AAEVDEE 191

++ + * +** **-{-+ * **** *

TL5. EVIKKGKEEEEE 206

СТС. ESADAQPEGENEQ 204

* * * + *

Рис. 3. Сравнение первичных структур рибосомных белков TL5 Т. thermophihts и L25 Е. coli, а также основного стрессового белка СТС В. subtilis. Сравнение проведено попарно (L25/TL5 и TL5/CTC). * - идентичные остатки; + - консервативные остатки.

участков белка, был клонирован соответствующий фрагмент ДНК Т. 1кегторЫ\т. Анализ нуклеотидной последовательности этого фрагмента ДНК (1000 Ьр) выявил наличие в нем открытой рамки считывания (ОРС), которая была фланкирована

инициаторным и терминационным кодонами. Данная ОРС кодировала полипептид в 206 аминокислотных остатков (Рис. 3). N-концевой район и область 80-90 остатков этого полипептида были идентичны N-концевым участкам белка TL5 и его большого триптического фрагмента, соответственно. Таким образом, мы пришли к заключению, что выявленный нами ген в ДНК Т. themophilus кодирует рибосомный белок TL5.

Поиск гомологов белка TL5 в доступных базах данных (SWISS-PROT, PDB и PIR) не выявил выраженного сходства с известными 5S рРНК-связывающими или другими рибосомными белками. Неожиданным оказалось то, что наилучшее сходство с белком TL5 обнаруживал основной стрессовый белок СТС из Bacillus subtilis. Белки TL5 и СТС имеют сходный размер, 206 и 204 аминокислотных остатка, соответственно. Сравнение первичных структур этих белков продемонстрировало очевидную, хотя и не очень высокую гомологию между ними (Рис. 3). Аминокислотные последовательности этих белков оказались гомологичны по всей длине и имели 32% идентичных остатков и 53% общего сходства. На момент наших исследований о белке СТС было мало что известно. Было только показано, что экспрессия гена ctc индуцируется в клетках В. subtilis в ответ на различные типы стресса (Hecker & Volker, 1990, FEMS Microb. Ecol., 74, 197-214; Volker et al, 1994, Microbiology, 140, 741-52). О функции этого белка в бактериальной клетке ничего не было известно.

Еще одной удивительной находкой оказалось то, что аминокислотная последовательность N-концевого участка белка СТС обнаруживала достаточно очевидную гомологию с первичной структурой рибосомного белка L25 из Е. coli (Рис. 3). Поэтому нами был проведен более тщательный сравнительный анализ первичных структур всех трех белков. Соответствующее выравнивание аминокислотных последовательностей белков TL5, СТС и L25 расставило все точки над «и» (Рис. 3). Во-первых, даже при наилучшем выравнивании первичных структур белков L25 и TL5 наблюдался довольно низкий уровень гомологии (18% идентичности; 40% общего сходства) между ними. Становилось понятным, почему ранее поиск гомологов не давал результатов. Во-вторых, кластерность расположения идентичных и сходных остатков во всех указанных структурах свидетельствовала о выраженной консервативности отдельных участков этих белков. В-третьих, именно N-концевой участок белка TL5, необходимый для взаимодействия с 5S рРНК, обнаруживал гомологию с белком L25. Таким образом, тщательное сравнение первичных структур рибосомных белков TL5 и L25, а также основного стрессового белка СТС, позволило сделать заключение, что, несмотря на отсутствие ярко выраженной гомологии, эти белки являются родственными. Совокупность

полученных данных позволила нам сделать предварительный вывод о том, что именно N-концевой участок белка TL5 образует домен, который может играть роль белка L25 в рибосоме Т. thermophilus.

Как было отмечено выше, N-концевой триптический фрагмент (75-80 остатков) белка TL5 необходим для взаимодействия с 5S рРНК. Однако этот изолированный фрагмент и сходный по размеру N-концевой фрагмент TL5 (остатки 1-80), полученный генно-инженерным методом, были неактивны в связывании 5S рРНК. После того как стала известна полная аминокислотная последовательность TL5, стало очевидно, что участком белка, гомологичным и соразмерным 5S рРНК-связывающему рибосомному белку L25 из Е. coli, является район с 1 по 91 остаток

1 234 56789 10 11

11 с *м «4 ♦ mm

Ш в Ш т Ы *•

5S рРНК- V.

тРНК- 4 J

Рис. 4. Взаимодействие белка TL5 или его N-концевого фрагмента (TL5fr91) с 5S рРНК (12% ПААГ-электрофорез, неденатурирующие условия). 1 - 5S рРНК Е. coli; 2 - 5S рРНК Е. coli + TL5 (1:1); 3 - 5S рРНК Т. thermophilus + TL5fr91 (1:1); 4 - 5S рРНК £. coli + TL5fr„ (1:1); 5 - 5S рРНК + TL5fi„ (1:2); 6- 5S pPHK + TL5 + TL5fr„ (1:1:1); 7- 5S pPHK + TL5fr9l + TL5 (1:1:1); 8 - TL5 + TL5fr„ + 5S pPHK (1:1:1); 9 - 5S pPHK + TL5 + TL5fr„ (1:3:1); /0-тРНК£. со/;; //- тРНК + TL5fr„ (1:3). Отмечена последовательность смешения компонентов и их молярные соотношения (в скобках).

(Рис. 3). В связи с этим нами был получен соответствующий фрагмент белка, TL5fr<>i, и проверена его способность связываться с 5S рРНК. На рисунке 4 видно, что TL5fr9i j связывается с высокой специфичностью с 5S рРНК Т. thermophilus и Е. coli (дорожки 3-5), и более того, вытесняет интактный белок TL5 из комплекса (дорожки 6-9). Можно было считать доказанным, что изолированный TL5fr91 представляет собой функционально-активный РНК-связывающий домен белка TL5. Полученные данные \ также указывали на важность остатков 80-91 белка TL5 для формирования его РНК- -связывающего домена.

2. Формирование 5S рРНК-белкового комплекса Thermus thermophilus

Идентификация всех белков 5S рРНК-белкового комплекса Т. thermophilus позволила нам провести детальное исследование процесса формирования данного РНК-белкового комплекса. В отличие от гомологов из Е. coli, каждый из исследуемых нами рибосомных белков Т. thermophilus был способен образовывать эквимолярный прочный комплекс с изолированной 5S рРНК (Рис. 5Б и 6Б). Консервативность структуры бактериальной 5S рРНК дала нам возможность

использовать в работе не только гомологические, но гетерологические РНК-белковые комплексы. Кроме того комплексы 5S рРНК с белками TthL5, TL5 и TthL 18 оказались очень стабильны в широком диапазоне условий эксперимента. Все это позволило нам провести исследования, результаты которых внесли существенный вклад в локализацию участков связывания бактериальных рибосомных белков на молекуле 5S рРНК (сайты связывания белков L5 и L18 Е. coli были установлены только в 2005 году при кристаллографических исследованиях рибосомы).

Известно, что 5S рРНК из Е. coli и других бактерий при ограниченном гидролизе РНКазой А образует крупные стабильные фрагменты (Рис. 5А). Ранее было продемонстрировано, что один из фрагментов 5S рРНК Е, coli (Fr5Scry), состоящий из

Fr5Say

Ч-u»

С —G G —С G —С

5S рРНК

G — С n U-G 11 0 С—GC

UA — U

С —G G —С G —С A —U

С—G ,

\ G-с/с У

Vu-GC U* 111 С—GC А

in \

. ~ GCGCGGUGG CCACCUGÄ*

петля Ад I I I I I I I I I I I I 1 I I

.. Gg —с G CGUGCCGCA AGUGGACU-V G —С ' '

А —U

С—G C-G til С —G

5S рРНК-

Рис. 5. Участок связывания белка TL5 T. thermophihis на 5S рРНК. А - Схема вторичной структуры 5S рРНК Е. соИ, на которой отмечены стрелками участки доступные РНКазе А в изолированной РНК. В рамки взяты фрагменты 5S рРНК, образующие комплекс с белком TL5 (данные фрагменты были секвенированы). Б - Электрофоретический анализ (12% ПААГ, неденатурирующие условия) взаимодействия белка TL5 и его РНК-связывающего домена (TL5fr91) с полученными фрагментами 5S рРНК Е. coli. 1 - 5S рРНК; 2 - 5S рРНК + TL5; 3 - фрагмент РНК (Fr5Say); 4 - Fr5Say +TL5; 5 -фрагмент РНК (Fr5Sy); 6 - Fr5Sy + TL5; 7 - Fr5Sy + TL5 fr„.

двух или трех субфрагментов (1-11 и 69-120 (69-87 и 89-120) нуклеотиды), образует с белком L25 комплекс (Doutwaite et al, 1979, Nucl. Acids Res., 6, 2453-70). Другой фрагмент 5S рРНК Е. coli (Fr5Sß), состоящий из двух субфрагментов (15-36 и 44-65 нуклеотиды), с рибосомными белками не связывался (Leontis & Moore, 1986, Biochemistry, 25, 3916-25). Используя метод ограниченного гидролиза РНК рибонуклеазой А, нами был установлен участок 5S рРНК, взаимодействующий с рибосомным белком TL5 Т. thermophilus. Оказалось, что фрагмент 5S рРНК размером примерно 60 нуклеотидов (рис. 5А, Fr5Say), связывающий белок L25 Е. coli, образует

специфический комплекс и с рибосомным белком TL5 (рис. 5Б, дорожка 4). Далее нами был установлен минимальный фрагмент 5S рРНК, который формировал стабильный комплекс с TL5 и его РНК-связывающим доменом (TL5fr9i). В уже отмеченной выше работе Доутвейта с коллегами было показано, что 5S рРНК Е. coli, находясь в комплексе с белком L25, гидролизуется РНКазой А с образованием 40 нуклеотидного фрагмента (69-87 и 90-110 нуклеотиды). Мы получили аналогичный по размеру фрагмент 5S рРНК Е. coli (Рис. 5Б, дорожка 5), защищаемый белком TL5 от гидролиза РНКазой А. Этот фрагмент 5S рРНК состоял из двух цепочек, и по данным секвенирования соответствовал участку 5S рРНК G69-U87 и С9|-Сцо (Рис. 5А, Fr5Sy). Данный фрагмент был способен формировать стабильный комплекс с белком TL5 и TL5fr9i (Рис. 5Б, дорожки 6 и 7). Сходный по характеристикам TL5-связывающий 40 нуклеотидный фрагмент (Fr5Sy) 5S рРНК Т. themophilus был также получен. Из этих данных следовало, что область взаимодействия белка TL5 (его РНК-связывающего домена) на 5S рРНК ограничивается Е-петлей, спиралями IV и V (Рис. 5А). Таким образом, участки связывания на молекуле 5S рРНК для белка TL5 и его гомолога, белка L25 Е. coli, оказывались практически одинаковыми.

Для картирования на 5S рРНК участков связывания белков TthL5 и TthL18 (белки L5 и L18 Т. themophilus, соответственно) на первом этапе нами также был использован метод гидролиза РНК рибонуклеазой А. Картина энзиматического гидролиза или химической модификации нуклеотидов 5S рРНК Е. coli и В. stearothermophilus, изолированной или связанной с рибосомными белками, достаточно подробно описана в литературе. Однако к началу наших работ, несмотря на многочисленные данные об участках 5S рРНК, изменяющих свою доступность различным агентам в присутствии бактериальных рибосомных белков L5 и L18, конкретные сайты связывания этих белков на РНК не были установлены. Данные рибосомные белки Е. coli диссоциировали от РНК в процессе гидролиза 5S рРНК (Douthwaite et я/., 1982, Biochemistry, 21, 2313-20; Leontis & Moore, 1986, Biochemistry, 25, 3916-25). Поэтому было сделано предположение о том, что взаимодействие белков L5 и L18 Е. coli с 5S рРНК является недостаточно прочным для защиты собственных сайтов на молекуле РНК.

Два описанных выше стабильных фрагмента 5S рРНК, образующихся при гидролизе РНКазой А, были нами проверены на связывание исследуемых белков Т. thermophilus. Ни белок TthL18, ни белок TthL5 не были способны образовывать комплекс с этими фрагментами 5S рРНК. Такие результаты нас не очень удивили, так как совпадали с данными полученными для гомологичных белков из Е. coli. Однако, в отличие от своего аналога из мезофильного организма, белок L18 Т. thermophilus оказался способным защитить 5S рРНК от энзиматического гидролиза. Так, 5S рРНК,

гидролизованная в комплексе с белком ТЧЫЛВ, не диссоциировала на фрагменты (Рис. 6А, дорожка 4) и сохраняла способность специфически связывать этот белок (Рис. 6А, дорожка 6). Однако такая РНК была неспособна связывать белок ТАтЬЗ.

1 2 3 4 5 6

1 2 3 4 5 6 7 8

5SpPHK-* W

В 1 2 3 4 5 г 1 2 3 4

5S рРНК> 5 # -76 5S рРНК> ♦ ш -76

- - • -57 л» im -57

•mm - чтт

* • * т -33 • Шк ♦ -33

— т ш -18 ♦ -18

i 1 f

Рис. 6. Электрофоретический анализ взаимодействия белков TthL5 и TthLI 8 с интактной или обработанной РНКазой A 5S рРНК Е. соИ (А и Б - 10% ПААГ, неденатурирующие условия; В и Г -12% ПААГ, денатурирующие условия). А: ! - 5S рРНК; 2 - комплекс 5S pPHK-TthLl 8; 3 -гидролизат 5S рРНК (нуклеаза/РНК 1:25, w/w); 4 -гидролизат 5S рРНК (нуклеаза/РНК 1:25, w/w) в присутствии TthLI8 (обработанный фенолом); 5- гидролизат 5S рРНК (аналогично 3) + TthL18; 6- гидролизат 5S рРНК (аналогично 4) + TthLI8; Б: 1 - 5S рРНК; 2 - комплекс 5S pPHK-TthL18; 3 - комплекс 5S рРНК-TthL5; 4 - комплекс 5S pPHK-TthL5-TthLl 8; 5 -гидролизат 5S рРНК (нуклеаза/РНК 1:25, w/w) в присутствии TthL5 и TthLI8 (обработанный фенолом); 6 - гидролизат 5S рРНК (аналогично 5) + TthH8; 7-гидролизат 5S рРНК (аналогично 5) + TthL5; 8 - гидролизат 5S рРНК (аналогично 5) + TthL5 и TthLI8. В: / - 5S рРНК; 2, 3 -гидролизат 5S рРНК (нуклеаза/РНК 1:25 и 1:500, w/w, соответственно) в присутствии TthLlS; 4, 5 - гидролизат 5S рРНК (нуклеаза/РНК 1:25 и 1:500, w/w, соответственно). Г: I - 5S рРНК; 2 -гидролизат 5S рРНК (нуклеаза/РНК 1:25, w/w) в присутствии TthL18; 3,4 - гидролизат 5S рРНК (нуклеаза/РНК 1:500 и 1:25, w/w, соответственно) в присутствии TthLS и TthLI8. Справа отмечены размеры фрагментов РНК в нуклеотидных остатках. Звездочкой указано положение З'-меченого фрагмента 5S рРНК.

После гидролиза 5S рРНК в присутствии обоих белков, TthL5 и TthLI8, РНК не диссоциировала на фрагменты и была способна связывать не только TthLI8, но и TthL5 или оба белка одновременно (Рис. 6Б, дорожки 5-8, соответственно). Таким образом, нами было установлено, что белок TthLI8 способен защитить участок 5S

рРНК, важный для его связывания, в то время как участок, необходимый для связывания белка TthL5 с РНК, защищался от гидролиза только в комплексе с обоими белками - TthL 18 и TthL5. Сегодня, когда по кристаллографическим данным известно, что в бактериальной рибосоме белки L5 и L18 не образуют между собой прямых контактов, обнаруженный нами совместный эффект двух белков, по-видимому, можно интерпретировать стабилизацией этими белками определенной конформации 5S рРНК, Сравнительный анализ полученных продуктов гидролиза 5S рРНК показал, что состав субфрагментов, полученных при гидролизе РНК в комплексе с белком TthL 18 (Рис. 6В и 6Г, дорожка 2) или с белками TthL18 и TthL5 (Рис. 6Г, дорожка 4) отличается от такового для РНК в свободном состоянии (Рис. 6В, дорожка 4). Так, в случае комплекса 5S pPHK-TthL18 накапливается новый субфрагмент длиной ~45 нуклеотидов (Рис. 6В и 6Г, дорожки 2). В случае комплекса 5S рРНК с двумя белками появляется и накапливается субфрагмент длиной -50 нуклеотидов (Рис. 6Г, дорожки 3-4). Секвенирование данных субфрагментов показало, что субфрагмент 45 нуклеотидов охватывает участок G44-U87, а субфрагмент 50 нуклеотидов - Сз6-и87 (схема на Рис. 7А). Таким образом, из полученных данных следовало, что белок TthL18 защищает в 5S рРНК от гидролиза район и65-С68 (спираль II и А-петля), а белок TthL5, добавленный к комплексу 5S pPHK/TthL18, защищает район С36-С43 (С-петля). Кроме того, во всех экспериментах (свободная РНК или РНК в комплексе с белками) доступность рибонуклеазе других чувствительных участков 5S рРНК (петли А и D) не отличалась. Учитывая то, что белки TthL5 и TthL 18 не только эффективно защищали участки С36-С43 и U65-C6s, но и взаимодействовали повторно только с РНК, сохранившей указанные участки, можно было заключить - данные области 5S рРНК важны для связывания этих белков. В данной работе впервые удалось идентифицировать участки 5S рРНК, которые защищаются бактериальными рибосомными белками L5 и L18 от гидролиза ферментом. Полученные результаты пока еще не указывали на точные сайты связывания белков L5 и L18 Т. thermophilus на молекуле 5S рРНК. Поэтому нами были синтезированы три фрагмента 5S рРНК Е. coli, входящие в ее домен два коротких фрагмента, Fr5SpSi (Gi6-C27/G56-C68) и Fr5SPs2 (C28-G56), а также длинный фрагмент, Fr5S(3 (Gi6-C68), охватывающий весь домен (5 (Рис. 7А). Эти фрагменты были испытаны в экспериментах по связыванию исследуемых белков. Как видно на рисунке7Б, Fr5SpS2 образует прочный комплекс с белком TthL5 (дорожка 2). То, что 5S рРНК-связывающие белки TL5 и TthL 18 и некоторые другие рибосомные белки Т. thermophilus не взаимодействовали с Fr5SPs2, указывало на исключительную специфичность комплекса данного фрагмента 5S рРНК и белка TthL5. Таким образом, нам впервые удалось получить минимальный фрагмент 5S рРНК,

связывающий рибосомный белок 1.5, а также идентифицировать его сайт связывания (С-петля) на молекуле РНК. Удивительным оказалось то, что фрагмент РгбЗРзь

Рис. 7. Участки связывания белков TthL5 и TthL18 на 5S рРНК. А - Схема вторичной структуры 5S рРНК, на которой отмечены участки защищаемые белками TthL5 и TthL 18 от гидролиза рибоиуклеазой А. В рамку взягы фрагменты 5S рРНК, синтезированные in vitro. Б -Электрофоретический анализ (12% ПААГ, неденатурирующие условия) взаимодействия белков TthL5 и TthL 18 с синтезированным фрагментом Fr5SPsj. / (FrSSfis:); 2 FrSSfta + TthL5; Электрофоретический анализ (6-25% ПААГ, неденатурирующие условия) взаимодействия белков TthL5 и TthL 18 с синтезированным фрагментом Fr5Sp. 3 - FrSS|3 +TthL18; 4 - Fr5Sp +TtbL5: S -Fr5Sp +TthL5+TthLI8; 6-FrSSp.

включающий по нашим данным единственный защищаемый белком L18 участок РНК, а по литературным данным содержащий большую часть сайта связывания белка, не связывал белок TthL 18. В то же время, больший фрагмент, Fr5S[3, представляющий собой полноразмерный домен (3 5S рРНК, образовывал комплекс не только с белком TthL5, но и с белком TthL 18 или обоими белками (Рис 7Б, дорожки 3-5). Таким образом, область взаимодействия белка L18 Т. thermophilus с 5S рРНК оказывалась более протяженной, чем участок (U6j-C6S) защищаемый белком от гидролиза, и охватывала большую часть домена (3. Учитывая все полученные данные можно было предположить, что белок L18 имеет более одного участка связывания на молекуле 5S рРНК.

Сравнение полученных нами данных с сегодняшними кристаллографическими данными о пространственной структуре архейной и бактериальных рибосом позволяют выявить сходство и различия во взаимодействии белков L5 и L18 с 5S рРНК в изолированном комплексе и в составе рибосомы. Определенный нами 10 лет назад основной сайт связывания белка L5 на молекуле 5S рРНК сегодня полностью

подтверждается результатами структурных исследований. Что же касается участка 5S рРНК, связывающего бактериальный рибосомный белок L18, то результаты биохимических и кристаллографических исследований имеют одно принципиальное различие. По данным большинства биохимических исследований (в том числе наших) одним из основных участков связывания белка является спираль II. По кристаллографическим данным не спираль II, а спираль I участвует во взаимодействии с белком L18. Это противоречие может быть объяснено различностью конформаций 5S рРНК в растворе и в рибосоме. В изолированной РНК спираль I подвижна и расположена почти перпендикулярно основной части молекулы. В 5S рРНК, находящейся в рибосоме, спираль I расположена почти параллельно спирали II и образует с ней плотный контакт. Можно предположить, что в изолированном 5S рРНК-белковом комплексе, когда спираль I из-за высокой подвижности не может участвовать в формировании полноразмерного многоцентрового сайта связывания для белка L18, эту роль могла бы в какой-то степени выполнять спираль II. Учитывая это предположение, можно заключить, что формирование 5S рРНК-белкового комплекса завершается только в рибосоме.

Рис. 8. Кристаллы РНК-белковых комплексов. А - Комплекс 40 нуклеотидного фрагмента 5S рРНК (Fr5Sy) Е. coli с белком TL5; Б - Комплекс 34 нуклеотидного фрагмента 5S рРНК (Fr5Sßs2) Е. coli с белком TthL5.

3. Пространственная структура компонентов бактериального 58 рРНК-белкового комплекса

В данной работе был проведен поиск условий кристаллизации для идентифицированных 58 рРНК-связывающих белков Т. ЖегторЬИш и их комплексов

с 5S рРНК или ее фрагментами из разных бактерий. Для этого были использованы 5S рРНК Е. coli, Т. thermophilus и В. stearothermophilus, а также ряд специфических

фрагментов 5S рРНК: Fr5Say, Fr5Sy, Fr5SßS2, Fr5Sß E. coli и Fr5Sy T. thermophilus. Кроме белка TL5 для кристаллизации РНК-белковых комплексов использовался его фрагмент, TL5fr91. Для ряда объектов удалось получить кристаллы (белок TthL5, комплексы: TL5-Fr5Say Е. coli, TL5-Fr5Sy Е. coli, TL5fr9i-Fr5Sy Е. coli, TthL5-Fr5SßS2 E. coli, TthL18-5S рРНК T. thermophilus), однако, часть этих кристаллов отражали рентгеновские лучи с низким разрешением. Так как кристаллы комплекса TthL18-5S рРНК Т. thermophilus отражали рентгеновские лучи только до 8 А, для определения структуры белка TthLl 8 нами был использован метод ЯМР. Наиболее успешными в кристаллизации оказались два объекта. Комплекс TL5-Fr5Sy Е. coli кристаллизовался как гексагональные линзы (Рис. 8А), отражающие рентгеновские лучи с разрешением до 2.3 Ä. Кристаллы комплекса TthL5-Fr5SßS2 Е. coli представляли собой многогранные призмы (Рис. 8Б) и отражали рентгеновские лучи до 2.5 Ä. Именно эти кристаллы и были нами использованы для структурных исследований.

Определение пространственной структуры 5S рРНК-связывающих белков и их комплексов с РНК проводили в совместной работе с группами профессора Станислава Владимировича Никонова (Институт белка, РАН) и профессора Торлифа Харда (Королевский Технологический Институт Стокгольма, Швеция).

Модель пространственной структуры белка TL5 Т. thermophilus представлена на рисунке 9А. Молекула белка состоит из двух доменов, которые расположены друг относительно друга под углом 90°, и образует вытянутую L-образную структуру. С-концевой участок выступает из тела домена белка и очень подвижен: интерпретируемая электронная плотность распространяется только до Е;85. N-концевой домен (первый домен) белка TL5 охватывает 1-91 остаток молекулы. Этот результат подтвердил наш вывод, сделанный из биохимических экспериментов о том, что участок белка TL5 с 1 по 91 остаток формирует его самостоятельный домен. Этот домен белка включает ß-бочонок, образованный двумя почти перпендикулярно расположенными ß-листами (Рис. 9А). Один ß-лист состоит из двух параллельных (ßi, ß<t) и одного антипараллельного (ß5) тяжей. Второй ß-лист состоит из четырех ß-тяжей (ß2, ß3, ß5, ß6). ß-бочонок содержит обширное гидрофобное ядро, остатки которого недоступны растворителю и консервативны во всех известных белках семейства СТС, предполагая, что структура домена должна быть консервативна в них. Структура домена также стабилизирована сетью водородных связей и солевых мостиков. N-концевой домен белка TL5 топологически очень похож на белок L25 Е. coli (Рис. 9Б), несмотря на то, что сравнение их аминокислотных последовательностей выявляло только -19% идентичных остатков. Структура ß-

бочонка в двух белках чрезвычайно похожа (при наложении Са этого структурного элемента г.ш.в.с!. не превышает 0.71 А). Однако наблюдаются некоторые вариации в

Рис. 9. А Ленточная модель пространственной структуры рибосомного белка TL5 Т. themophilus. Структурные 1 элементы (а-спирали и ß-тяжи) белка пронумерованы, начиная с N-конца. Б -Сравнение структур белков TL5 Т. thermophilus (голубой цвет) и L25 Е. coli (красный цвет). Структура L25 (PDB code: 1DFU) взята из работы (Lu & Steitz, 2000, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 97,2023-28).

размере других структурных элементов указанных белков (Рис. 9Б). Так, спираль al в белке TL5 короче, чем в L25, а спираль сс2 в TL5 длиннее соответствующей спирали в L25.

Второй (ранее названный С-концевой) домен белка TL5, охватывающий 92-176 j остатки молекулы, сильно вытянут, и имеет сигарообразную форму (Рис. 9А). Полипептидная цепочка этого домена пять раз сложена вдоль его длины. Семь Р-тяжей этого домена белка формируют два антипараллельных (3-листа ((37, (39, р12) и (Р8, Рп, Р13) и один двутяжевый параллельный Р-лист (Р7 Рю). Обширное гидрофобное ядро протянулось через весь домен. Это гидрофобное ядро вместе с сетью -водородных связей стабилизирует структуру домена. Аминокислотные остатки, ! формирующие это ядро, консервативны во всех известных белках семейства СТС. ; Общая конформация второго домена белка TL5 уникальна и не обнаруживалась ранее в других белках. Относительное положение доменов белка также стабилизировано гидрофобным ядром, которое протянулось через всю молекулу и вовлекает остатки, расположенные на границе двух доменов. Структура TL5 является первой структурой многодоменного белка, представителя семейства белков СТС. | Сравнение аминокислотных последовательностей известных белков семейства СТС и анализ кристаллических структур выявляет, что остатки, которые формируют

гидрофобное ядро, стабилизирующее структуру обоих доменов белка ТЪ5, строго консервативны среди белков семейства СТС. Таким образом, первый и второй домены всех белков СТС могут свернуться в структуру с топологией как у белка ТЬ5. Фрагмент 58 рРНК, структура которого определена в комплексе с рибосомным

Рис. 10. Взаимодействие белка TL5 с 5S рРНК. А - Модель комплекса TL5-5S рРНК. Б -Модель комплекса L25-5S рРНК Е. coli. Структура L25-RNA (PDB code: 1DFU) взята из работы (Lu & Staitz, 2000, Proc. Natl Acad. Sei. USA, 97, 2023-28). В - Область межмолекулярного контакта TL5 с 5S рРНК (указаны консервативные водородные связи). Г - Схематичное изображение вторичной структуры фрагмента 5S рРНК и его контактов с белком TL5. Консервативные остатки белка отмечены красным цветом.

белком TL5 Т. thermophilus, включает спираль IV, E-петлю, спираль V и часть А-петли. За исключением нуклеотидов U87 и G^, Аюв, Аю9, Сцо на З'-концах и G6q на 5'-конце цепочек РНК, все другие нуклеотиды вовлечены во внутримолекулярные контакты, формирующие структуру двойной спирали (Рис. ЮГ). Эти взаимодействия приводят к образованию искаженной двойной спирали РНК, которая значительно отличается по своим параметрам от классической A-формы (Рис. 10А и Г). Расстояние между атомами СГ пар оснований в центральной части E-петли и на ее концах изменяется от 14.7 до 9.4 Á. В результате в районе трех центральных пар оснований E-петли малый желобок расширяется, а большой желобок - сужается. Данная структура очень похожа на структуру РНК в комплексе с белком L25 Е. coli. Нуклеотидная последовательность E-петли строго консервативна в бактериальных 5S рРНК и значительно отличается от аналогичного участка 5S рРНК Архей и Эукариот (Szymanski et al., 2002, Nucl. Acids Res., 30, 176-78). При этом белки семейства СТС способны формировать стабильные комплексы только с бактериальными 5S рРНК. Из этого можно заключить, что уникальная пространственная структура Е-петли бактериальной 5S рРНК является необходимым условием для специфического взаимодействия с белками семейства СТС. Как видно из структуры комплекса, только N-концевой домен белка TL5 взаимодействует с фрагментом 5S рРНК (Рис. 10А). Этот результат находится в полном согласии с другими нашими результатами, описанными в разделах 1 и 2. В формирование межмолекулярных водородных связей вовлечены атомы 10 нуклеотидных и 13 аминокислотных остатков (Рис. ЮГ). При образовании комплекса 1680 Л2 поверхности белка TL5 и 5S рРНК оказывается недоступной растворителю. Прилегающая область, сформированная боковыми группами девяти остатков четырех-тяжевого р-листа и четырех остатков спирали a¡, образует прямые и опосредованные через молекулы воды контакты с малым желобком E-петли (Рис. 10А, В и Г). Сравнительный анализ структур двух комплексов, TL5-PHK и L25-PHK, показал, что, несмотря на низкую гомологию первичных структур данных белков, их пространственные структуры и способ взаимодействия с РНК очень сходны (Рис. 10А и Б). Аминокислотные остатки одного из Р-слоев этих белков обеспечивают плотный контакт с сахарофосфатным остовом и основаниями малого желобка 5S рРНК в области E-петли, а остатки спирали al и смежной петли pi-al взаимодействуют с сахарофосфатным остовом большого желобка РНК. При этом пять аминокислотных остатков (Rio, Ri<¡, Y29, Н85 и D87 /R9, R21, Y31, Н88 и D9() в TL5/L25), взаимодействующие напрямую или через растворитель с сахарофосфатным остовом и с основаниями нуклеотидов РНК (Рис. 10В и Г), оказались идентичны в данных белках. При сравнении областей контакта белков TL5 и L25 с РНК было обнаружено, что указанные строго консервативные остатки

формируют консервативную сеть межмолекулярных водородных связей. Более того, как показал анализ первичных структур белков семейства СТС, указанные аминокислотные остатки строго консервативны в них (см. таблицу 2 в разделе 4). ! Учитывая все эти находки, мы предположили, что все белки семейства могут связываться с 58 рРНК через свой Ы-концевой домен. Сравнение структур комплексов ТЬ5-РНК и Ь25-РНК выявило также ряд интересных различий. Так, хотя число РНК-белковых контактов в обоих комплексах примерно одинаково, в Ь25-РНК комплексе значительная часть из них расположено в районе спирали а1, которая проникает в большой желобок РНК (Рис. 10Б). В белке ТЬ5 эта спираль оказалась | короче и расположена в комплексе вне большого желобка РНК (Рис. 10А).

Модель пространственной структуры рибосомного белка ТАЬ5 (Ь5 Т. МегторкИия) представлена на рисунке 11 (левая панель). Белок содержит 182 аминокислотных остатка и сворачивается в один а/р домен. Молекула ТШЬ5

Рис. 11. Ленточная модель j пространственной структуры

рибосомного белка L5 Т. thermophilus (TthL5) (левая панель) j и сравнение данной структуры (голубой цвет) со структурой рибосомного белка L5 (серый цвет) j Haloarcula marismortui (HmaL5) (правая панель). Структура HmaL5 I (PDB code: 1112) взята из работы (Ban et al., 2000, Science, 289, 90520). Нумерация а-спиралей и fi-тяжей дана по ходу полипептидной цепи белка TthL5.

содержит четыре а-спирали, расположенные с одной стороны сильно скрученного пяти-тяжевого антипараллельного Р-листа. Этот р-лист образует вогнутую поверхность белка, которая увеличивается за счет двух петель (arPi и Рг-Рз). Спираль Oj располагается отдельно от глобулярной части молекулы и связана с ней гидрофобными взаимодействиями и водородными связями. Примерно 50% аминокислотных остатков белка приходится на десять петель, включая N- и С-концевые. Топология укладки полипептидной цепи TthL5 сходна со структурами свободного бактериального белка BstL5 (Nakashima et al., 2001, RNA, 7, 692-701), a также архейного белка HmaL5 в составе рибосомы (Ban et al., 2000, Science, 289, 905-

20) (Рис. 11, правая панель), определенными немного раньше. Различия в структуре указанных белков Ь5 находятся в И-концевой области и в петлях Рга2, Р2-Р3, РгРг-

Фрагмент 5 Б рРНК Е. соИ, структура которого была нами определена в комплексе с рибосомным белком Т£ЫД включает С-петлю и спираль III (Рис. 12). За исключением двух выпетленных нуклеотидов (А52 и А53), спираль III образует регулярную двуспиральную структуру в А-форме, которая заканчивается триплетом Сз7'(и48-А34). Другой триплет (Сз8-044)-С47 является основанием трехгранной «пирамиды», примыкающей к спирали III. В формирование «пирамиды» вовлечены также две неканонические пары, А39'А46 и и40-А45, и три неспаренных нуклеотида С42 и С43). Таким образом, пирамидальная часть (С38-С47) данного структурного элемента 5Б рРНК построена полностью нуклеотидами петли С, за исключением нуклеотидов С35, Сзб и С37, два последних из них формируют триплеты (С36'С49-С33 и

C37'U48-A34) в верхней части спирали III. Положение оснований в «пирамиде» стабилизировано внутримолекулярными взаимодействиями, число которых уменьшается от основания в вершине структуры. При этом большой желобок А-спирали исчезает на поверхности пирамидальной части структуры, тогда как малый желобок сохраняется и переходит в плоскую экспонированную в растворитель платформу, которая формируется сахарофосфатным остовом G4i, С42, С43, А45 и кромкой их оснований. Известно, что нуклеотидная последовательность С-петли 5S рРНК чрезвычайно консервативна у Бактерий, Архей и Эукариот. На сегодняшний день определены структуры 50S рибосомных субчастиц из представителей разных

Рис. 12. Схематичное изображение пространственной структуры фрагмента 55 рРНК, специфически связывающего белок ТтИ Г .5. Неканонические водородные связи в РНК указаны зелеными стрелками, а стэкинг-взаимодействия - серыми пунктирными линиями.

доменов жизни, хотя и с различным разрешением. Однако уже сейчас можно заключить, что, по крайней мере, конформация пирамидальной части С-петли фактически оказывается идентичной в бактериальной и архейной 58 рРНК, что может предполагать консервативность межмолекулярных взаимодействий.

Модель пространственной структуры комплекса белка ТШЬ5 с фрагментом 5Э рРНК представлена на рисунке 13А, а их консервативные межмолекулярные контакты в таблице 1. Со стороны РНК во взаимодействии с белком участвуют

- голубой/красный цвета) и HmaL5-PHK (белок/РНК - серый/зеленый цвета). Структура HmaL5-РНК (PDB code: 1JJ2) взята из работы (Ban et at., 2000, Science, 289, 905-20).

практически только нуклеотиды пирамидальной части С-петли. Почти все межмолекулярные водородные связи приходятся на этот уникальный структурный элемент 5S рРНК. Единственным исключением для данного РНК-белкового комплекса является G33, который принадлежит спирали III 5S рРНК. Взаимодействующий с РНК участок белка сформирован атомами главной цепи и боковых остатков тяжей р2, р3 и петель 012-Р2, Рз-«з- Этот район белка сильно стабилизирован внутримолекулярными взаимодействиями, в которые вовлечены остатки, строго консервативные в белках семейства L5. Граница взаимодействия TthL5-5S рРНК стабилизирована обширной сетью водородных связей. В образовании водородных связей участвуют шесть нуклеотидов 5S рРНК и десять аминокислотных остатков белка. Из них 3 нуклеотида (С43, G44 и А45) и 3 аминокислотных остатка (Q66, Т93 и R95) являются строго консервативными (Табл. 1). С42, образующий, по крайней

мере, четыре межмолекулярные водородные связи, своим основание участвует еще в стэкинг-взаимодействии с боковой цепью R9i. Можно предположить, что С42 к является одним важнейших элементов специфического взаимодействия между 5S рРНК и белком L5. На момент проведения данной работы имелась возможность сравнить только область межмолекулярного контакта в комплексе TthL5-5S рРНК и соответствующей области рибосомной 50S субчастицы Н. marismortui (Рис. 13Б). Из данного рисунка видно, что положение белков семейства L5 относительно С-петли 5S рРНК почти идентично для обоих белков. Более того, оказалось, что сетка межмолекулярных водородных связей в этой области тоже консервативна (Табл. 1).

Таблица 1. Сравнение консервативных РНК-белковых i

водородных связей в комплексе TthL5-PHK и HmaL5-PHK.

TAL5-5S рРНК HmaL5-5S pPHK*

Gln66j NE2 - 02' C42 Gin 47 INK-OZ C41

C43 NE2 - 04' C42

Lys 67 O-02' C42 Met 48 0-02' C41

0-C1' 0-C1'

Thr 93 N-02 C42 Thr 74 N-02 C41

0G1 - N3 OG1 -N3

0G1 - 02 0G1 - 02

Arg 95 NE - 04' A45 Arg 76 NE - 04' A44

NH2 - 04' IMH2 - 04'

NE-02 C43 NE-02 C42

■"нумерация остатков дана в соответствии с таковой в 50S рибосомной субчастице Н. marismortui. Положение этих остатков в молекуле соответствует положению указанных остатков в белке Т. thermophilus.

Мы предположили, что молекулы РНК и белка узнают их специфические сайты посредством атомов образующих консервативную сетку РНК-белковых водородных связей. В определенных совсем недавно структурах рибосомных 50S субчастиц из разных бактерий, выделенный нами ранее интерфейс специфического г взаимодействия рибосомного белка L5 с 5S рРНК, полностью подтверждается. Важность консервативных межмолекулярных водородных связей также была ; отмечена выше, при описании нами специфического комплекса TL5-5S рРНК. Сравнение структуры комплекса TthL5-5S рРНК со структурой соответствующего комплекса Н. marismortui выявило также различия в области их РНК-белковых контактов. Так, петля fS5-a4 архейного белка L5, которая практически отсутствует в бактериальном белке, вовлечена в дополнительные взаимодействия с РНК (Рис. 13Б), образуя половину всех РНК-белковых водородных связей и взаимодействуя в основном с двуспиральным участком 5S рРНК. Как результат этого

межмолекулярный недоступный растворителю район в комплексе HmaL5-5S рРНК оказывается в два раза больше, чем в комплексе TthL5-5S рРНК. В отличие от бактериальных белков, у представителей семейства L5 всех таксономических групп Архей присутствует участок, соответствующий длинной петле |35-а4 HmaL5 (Рис. 13Б). Учитывая эти данные можно сделать предположение, что такой обширный дополнительный контакт архейного белка с 5S рРНК, является эволюционным приобретением этих организмов, необходимым для стабилизации комплекса.

Модель пространственной структуры рибосомного белка TthLl 8 представлена на рисунке 14. Белок содержит 111 аминокислотных остатков и сворачивается в один i; а/р домен по схеме Р^Рза^аг- Структура белка L18 в целом хорошо упорядочена,

Рис. 14. Ленточная модель пространственной структуры белка L18 Т. 1hemophilus (TthLl8). Нумерация а-спиралей и р-тяжей дана по ходу полипептидной цепи белка TthLl8.

за исключением N-концевого участка (21 остаток), который, по-видимому, обладает значительной подвижностью, и поэтому его положение в молекуле не было определено. Структурированная часть белка (остатки 22-111) содержит две а-спирали, р-лист, сформированный тремя антипараллельными Р-тяжами и одним маленьким параллельным Р-тяжом, и спиральный виток. Две а-спирали расположены j с одной стороны четырех-тяжевого р-листа. Гидрофобное ядро молекулы образовано остатками Р-листа и спирали аь Кроме невыявляемых из-за высокой подвижности NI концевых остатков белка, наблюдается еще некоторая внутренняя подвижность в петле 3.

j На момент определения нами пространственной структуры белка TthLl 8

имелась возможность сравнить ее только со структурой архейного гомолога из Н. ' marismortui (Ban et а/., 2000, Science, 289, 905-20). Белок HmaL18 значительно больше, чем TthL18 (186 и 111 остатков, соответственно, Рис. 15А), а

аминокислотные последовательности их соответствующих участков обнаруживают I не очень высокую гомологию (27% идентичных и 43% консервативных остатков). Аналогичный достаточно низкий уровень гомологии наблюдается между другими известными рибосомными белками L18 бактерий и архей. Однако пространственные структуры глобулярного домена белков HmaL18 и TthL18 оказались чрезвычайно похожи (Рис. 15А). При наложении 48 Са атомов элементов вторичной структуры (сс-

Рис. 15. Сравнение пространственных структур рибосомных белков LIК Т. themophilus (красный цвет) и (А) - L18 Н. marismortui (фиолетовый цвет), и (Б) - SI! Т. thermophilus (синий цвет). Структура белка L18 | Н. marismortui (PDB code". 1JJ2) взята из работы (Ban el al., 2000, Science, 289, 905-20), a Sll T. thermophilus (PDB codc: 2J00) взята из работы (Selmer et al., 2006, Science, 313, 1935-42).

спирали и Р-тяжи) HmaL18 и TthL18, r.m.s.d. равно 1.16 А. Различия в структуре в несвязанной и РНК-связанной формах белка наблюдаются в основном в петлях. I Петли 2 и 3 в белке L18 Я. marismortui несколько длиннее, чем в бактериальном L белке и конформация этих петель в данных белках отличается (Рис. 15А). Такие изменения в архейном белке L18, по-видимому, позволяют ему формировать дополнительные контакты с 5S рРНК. N-концевой участок белка, структуру которого

нам не удалось определить в TthLl 8, в белке HmaL18 образует а-спираль. Сегодня появилась возможность сравнить структуры рибосомного белка TthLl 8 со структурами белков семейства из разных бактериальных организмов. В данном случае - это структура свободного белка из В. stearothermophilus, определенная также методом ЯМР (Turner & Moore, 2004, J. Mol. Biol., 335, 679-84) и кристаллические структуры белков в составе рибосомных субчастиц Е. coli, Т. thermophilus, D. radiodurans (Schuwirth et al., 2005, Science, 310, 827-34; Selmer et al., 2006, Science, 313, 1935-42; Harms et al, 2008, Mol. Cell, 30, 26-38). Оказалось, что все

ранее сделанные нами выводы о сходстве пространственных структур HmaL18 и TthL18, полностью верны и для других представителей семейства бактериальных рибосомных белков LI8.

Хотелось бы отметить один интересный факт, обнаруженный нами в данной работе. Кроме сравнения структур белков семейства LI8, мы провели поиск в банке данных (Protein Data Bank, PDB) структурных гомологов белка TthL 18 среди других рибосомных белков. Оказалось, что наилучшее структурное сходство обнаруживается с белком Sil из Т. themophilus (Рис. 15Б). Имея 129 аминокислотных остатков, Sil слегка больше, чем LI8. В то время как N-конец Sil на шесть остатков короче, чем N-конец TthL 18, его С-конец длиннее и включает дополнительный ß-тяж. Исключая N- и С-концы, пространственные структуры белков LI8 и SI 1 оказались очень похожи (Рис. 15Б), несмотря на низкую гомологию их первичных структур (около 45% общей гомологии и 20% идентичных остатков). При наложении 45 аминокислотных остатков соответствующих участков структур белков TthSll и TthL18, r.m.s.d. было равно 1.4 Á. Кроме того оказалось, что гидрофобное ядро обоих белков сформировано сходным количеством консервативных аминокислотных остатков. Поэтому, учитывая все сказанное выше, можно на наш взгляд вполне допустить существование общего предка для рибосомных белков Sil и LI 8.

4.5S рРНК-связывающие белки семейства СТС - особенность аппарата трансляции бактерий

Как уже было отмечено выше, в 1996 году нами было обнаружено, что основной стрессовый белок СТС В. subtilis и два рибосомных белка, L25 Е. coli и TL5 Т. thermophilus, являются гомологами. Эта работа явилась ключевой в появлении такого понятия как «семейство белков СТС». Уже было известно, что два из них - это рибосомные белки, которые специфически связываются с консервативной для бактериальной 5S рРНК E-петлей. Кроме того, в 2001 году при кристаллографических исследованиях рибосомной 50S субчастицы Deinococcus radiodurans был выявлен еще один многодоменный представитель семейства белков СТС, контактирующий с E-петлей 5S рРНК своим N-концевым доменом (Harms et al., 2001, Cell, 107, 679-88). Становилось очевидным, что указанные белки семейства обладают одним общим свойством - специфически связываются с 5S рРНК. Однако, как уже было отмечено, белок СТС В. subtilis вырабатывается клеткой только в ответ на различные формы стресса и отсутствует в клетках при нормальных условиях роста. Поэтому, какое отношение к указанным выше рибосомным белкам имел основной стрессовый белок СТС В. subtilis, было совершенно неясно. Учитывая

невысокую, но выраженную гомологию указанных белков семейства, мы предположили, что основной стрессовый белок СТС В. зиЬНШ тоже может быть способен связываться с 58 рРНК. Нами был получен рекомбинантный белок СТС В. яиЬИШ и исследованы его РНК-связывающие свойства. Как видно на рисунке 16,

5S рРНК-

фр 23S рРНК-

Рис. 16. Взаимодействие белка СТС В. subtilis с РНК (12% ПААГ-электрофорез, неденатурирующие условия): 1,3,5 - 5S рРНК (Е. coli, В. stearothermophUus и Т. thermophüus, соответственно); 2,4,6 - 5S рРНК + СТС (РНК как в образцах 1,3,5); 7 - фрагмент 23S рРНК Т. thermophilus (55 нуклеотидов); 8 - фрагмент 23S рРНК + СТС; 9 - суммарная тРНК Е. coli; УО-тРНК + СТС.

белок BsuCTC образует прочный и стехиометрический комплекс с 5S рРНК различных видов бактерий (дорожки 2, 4 и 6), но не с фрагментом 23S рРНК Т. thermophilus или с тРНК Е. coli (дорожки 8 и 10). Кроме того нами было показано, что белок СТС В. subtilis, как и рибосомные белки L25 Е. coli или TL5 Т. thermophilus, взаимодействует с фрагментом 1 5S рРНК, содержащим Е-петлю, спирали I, IV и V. Эти результаты указывали на то, что как и другие уже известные белки семейства основной стрессовый белок BsuCTC специфически связывается с 5S рРНК. Учитывая полученные результаты, можно было предположить, что именно молекула 5S рРНК является мишенью для белка BsuCTC в клетке во время шока. Это предположение подтвердилось очень быстро. Вскоре появилось сообщение немецких исследователей о том, что белок СТС, синтезирующийся при тепловом шоке клеток В. subtilis, обнаруживается в рибосомной фракции (Schmalisch et al., 2002, J. Mol. Microbiol. Biotechnol., 4, 495-501).

За последние десять лет стремительно выросло число расшифрованных бактериальных геномов. Сегодня их известно уже несколько сотен. Оказалось, что геном большинства известных бактерий содержит один ген, кодирующий белок данного семейства. Более того, белки семейства СТС оказались особенностью бактерий, поскольку ген ctc не обнаружен в геномах известных Архей и Эукариот (Gasteiger et al., 2003, Nucl. Acids Res., 31, 3784-88). Все известные на сегодняшний день белки СТС содержат так называемый «5S рРНК-связывающий домен». Единственное исключение - это Aquifex aeolicus, у которого, как представлено в GenBank NCBI (Deckert et al., 1998, Nature, 392, 353-58), ген ctc кодирует белок, лишенный первых 50 аминокислотных остатков 5S рРНК-связывающего домена. Нас

заинтересовало, способен ли такой укороченный белок (151 аминокислотный остаток) связывать 5S рРНК. Проверка РНК-связывающих свойств данного рекомбинантного белка АаеСТС подтвердила наши сомнения - белок, лишенный половины 5S рРНК-связывающего домена, не связывался с 5S рРНК. Однако, при внимательном анализе соответствующего участка генома данного организма, мы ! обнаружили вторую открытую рамку считывания (ОРС), которая перекрывалась с началом ОРС ctc со сдвигом на один нуклеотид. При этом вторая ОРС кодировала ! недостающую часть 5S рРНК-связывающего домена белка СТС. Наиболее вероятно, | что в данном случае могла быть допущена ошибка при секвенировании генома, и ген ctc A. aeolicus в действительности кодирует полноразмерный белок. Из всех ! полученных данных следовало одно общее свойство для всех известных белков семейства - они содержат так называемый «5S рРНК-связывающий домен» и должны быть способны образовывать специфический комплекс с бактериальной 5S рРНК.

Данные из расшифрованных бактериальных геномов, позволили нам провести сравнительный анализ основных характеристик белков СТС из разных филогенетических групп. Как видно на рисунке 17, многодоменные белки СТС

Рис. 17. Встречаемость белков семейства СТС в представителях ряда бактериальных таксонов. Полученные данные для наглядности представлены на фоне гипотетического

эволюционного древа. Символы указывают наличие генов, кодирующие многодоменные (ш) и однодоменные (▼) белки, а также отсутствие таких генов в геноме (о). Численные значения рядом с символом указывают количество организмов (для анализа были взяты только полностью расшифрованные геномы из GenBank I NCBI). Символами а, |3, у и Д/е обозначены субдивизионы (классы) типа Proteobacteria.

встречаются у представителей большинства бактериальных таксонов, включая, самые древние (Aquificae, Thermotogae и Deinococcus-Thermus group). Можно предположить, что первые белки семейства СТС уже были многодоменными, когда они появились в бактериях. Только представители типа Cyanobacteria и у-субдивизиона Proteobacteria имеют однодоменный белок СТС (например, Nostoc sp. и

28 61 ■ ■

д/е а

2Ш Acidobacteria

221 Bacteroidetes/ Chlorobi group

7 Я Spirochaetes 3l Planctomycetes

7 ■ Chlamydiae

3 ■ Chloroflexi

о _ Deinococcus/ Thermus group

1 ■ Aquificae

31 ■

■ 33 ▼ 51

■19

о 3

Clostridia | 20 Bacilli

0 28

MollicutesO 11

FMmDn

Actinobacteria ■ 31

FusobacteriaOl

E. coli). При этом среди известных представителей указанных таксономических | групп эта форма белка преобладает. По-видимому, сохранение у данных бактерий J только так называемого «5S рРНК-связывающего домена» оказалось достаточным для выполнения белком его функций. В геномах же ряда представителей типа ! Firmicutes ген, кодирующий белок СТС, вообще не обнаружен (Рис. 17). У некоторых других представителей класса Bacilli, таких как В. subíilis и Listeria monocytogenes, белок СТС вырабатывается клеткой только в ответ на разные формы стресса. Все это ¡ наводило на мысль о возможности так называемой «регрессивной эволюции» белков i СТС у представителей отдельных таксонов бактерий. Можно предположить, что ¡ изменившиеся условия жизни позволили некоторым бактериям либо полностью, | либо частично обходиться без белка СТС. [

Анализ первичных структур первых исследованных белков семейства СТС J показал, что несколько аминокислотных остатков в них идентичны и большая часть | из них (RIO, R19, Р25, Y29, G30, Н85 и D87 по нумерации белка TL5) сосредоточена в N-концевом (5S рРНК-связывающем) его домене. Для более объективной оценки | степени консервативности отдельных остатков в белках СТС, используя программу | ClustalW (Chenna et al., 2003, Nucí. Acids Res., 31, 3497-3500), мы сравнили первичные 1 структуры трехсот белков семейства, известных на сегодняшний день. Оказалось, что и при такой выборке все семь аминокислотных остатков N-концевого домена «почти инвариантны» в белках семейства. При этом пять из них являются остатками, которые участвуют в связывании белков L25 и TL5 с 5S рРНК (см. в раздел 3). Все это может свидетельствовать о выраженной консервативности во взаимодействии j между белками семейства СТС и 5S рРНК у большинства бактериальных организмов. (

Таблица 2. Частота встречаемости аминокислотных остатков5в рРНК-узнающего модуля в трехстах белках семейства СТС

Аминокислотный остаток в белках TL5 (L25) количество наиболее часто встречающихся остатков количество других остатков

R10 (R9) R - 291 Q - 3; К - 6

R19(R21) R - 295 К - 5

Y29 (Y31) Y-293 1-1; F - 6*

Н85 (Н88) Н - 298 N - 1; S - 1

D87 (D90) D - 286 Е - 4**; S - 9*"; А - 1***

Эти остатки присутствуют в белках СТС представителей: * - а-субдивизион Proteobacteria; ** - класс Bacilli; *** - тип Cyanobacteria.

Полная картина встречаемости указанных пяти остатков в белках семейства представлена в таблице 2. Видно, что немногочисленные исключения не распределены случайным образом. Большинство из них встречается в белках

организмов, принадлежащих вполне конкретным филогенетическим группам. Такие исключения оказались характерны для всех известных белков СТС типа Cyanobacteria, отдельных представителей класса Bacilli и а-субдивизиона Proteobacteria. Указанные исключения подтверждают ранее высказанную мысль об эволюционной обособленности некоторых групп бактериальных организмов.

Сравнительный анализ TL5-5S рРНК и L25-5S рРНК комплексов позволил нам выявить идентичные структурные элементы РНК и белков, участвующие в межмолекулярных контактах, которые, по-видимому, должны играть ключевую роль в специфическом взаимодействии данных макромолекул. Все аминокислотные остатки белков TL5 и L25, образующие водородные связи с РНК, условно были разделены на две группы - неконсервативные и консервативные. Остатки первой группы расположены по периферии поверхности белка, контактирующей с РНК (Рис.

Рис. 18. Область контакта белка ТЬ5 с рРНК (область отмечена на поверхности белка серым цветом). Положения консервативных и неконсервативных остатков белка, образующих с РНК водородные связи, отмечены красными и зелеными рамками, соответственно.

18), и образуют доступные растворителю межмолекулярные водородные связи. Остатки второй группы (R9, R21, Y31, Н88 и D90 для L25; RIO, R19, Y29, Н85 и D87 для TL5) расположены в центральной части, контактирующей с РНК поверхности белка, и образуют межмолекулярные водородные связи, недоступные растворителю. Пять строго консервативных остатков, также как и некоторые неконсервативные остатки, которые участвуют во взаимодействии с РНК, были нами заменены, используя сайт-направленный мутагенез. 5S рРНК-связывающие способности мутантных форм белков TL5 и L25 были проверены несколькими методами. Результаты представлены в таблице 3. При одиночных мутациях неконсервативного остатка (К14, S16 или R20) и даже при двойной замене S16A/R20A, белок связывался с РНК при концентрации, сходной с концентрацией, характерной для белка TL5 дикого типа. Таким образом, замена данных неконсервативных остатков в белке TL5

I AS*. МI

не влияла на его 5S рРНК-связывающие свойства. В то же время, замена любого одного из пяти консервативных остатков приводила к дестабилизации или невозможности образования комплекса 5S рРНК с белком TL5 или L25. Замена RIO, R19 или Н85 в белке TL5 приводила к более чем 10-кратному увеличению K<i (Табл. 3). Таким образом, замена только одного из этих консервативных остатков в белке

Таблица 3.5S рРНК-связывающие свойства мутантных форм белков TL5 и L25

мутация 5S рРНК-связывание " Kd (мкМ) b

контроль (TL5) WT ++ 0.09

замены неконсервативных остатков К14А ++ 0.13

S16A ++ 0.12

R20A ++ 0.15

S16A/R20A ++ 0.15

замены консервативных остатков R10A + 1.40

R19A + 1.25

Y29S; Y29F; Y29R - NBB

Н85А + 1.20

Н85Т + 1.00

H85N + 1.00

H85F ■ NB

D87S;D87N - NB

D87E +/- 2.50

контроль (L25) WT ++ 0.1

замены консервативных остатков Y31A - NB

H88F - NB

D90A - NB

1 5S рРНК-связывающие свойства указанных белков исследовали методом "gel shift" («сдвиг полосы в геле») (электрофорез в 12% ПААГ, неденатурирующие условиях).

6 Кажущиеся константы диссоциации (Kj) были определены на основании данных сорбции РНК-белковых комплексов на нитроцеллюлозных фильтрах.

1NB, не детектируется связывание РНК при концентрации белка до 5.0 мкМ.

явно дестабилизировала РНК-белковый комплекс. Более драматический эффект был обнаружен при замене строго консервативного тирозина или аспартата в белках TL5 и L25 (Табл. 3). Исключая мутацию D87E в белке TL5, все остальные замены одного из этих остатков приводили к невозможности образования РНК-белкового комплекса. По данным структурных исследований боковые группы этих двух остатков в обоих комплексах образуют не только водородные связи с РНК, но и внутримолекулярную водородную связь друг с другом. Поэтому, замена указанного тирозина или аспартата должна была не только устранить внутримолекулярную связь между этими остатками и водородную связь замененного остатка с РНК, но и связь второго остатка с РНК. Мутация D87E не исключала возможности формирования

комплекса, но сильно его дестабилизировала (Табл. 3). Моделирование показало, что остаток глютаминовой кислоты может образовывать водородную связь с Y29 и молекулой РНК, но больший размер боковой группы этого остатка по сравнению с аспартатом будет создавать некоторые стерические препятствия в плотном РНК-белковом контакте. Следовательно, любое изменение боковой группы остатков, расположенных в этих позициях (особенно, сдвиг атомов, образующих водородную связь с рРНК) оказывается критичным для специфического связывания белка семейства СТС с 5S рРНК. Так как пять консервативных остатков и их межмолекулярные водородные связи недоступны растворителю, то разрушение межмолекулярной связи консервативного остатка не может быть компенсировано образованием новой водородной связи. Это объясняет, почему замена любого из указанных консервативных остатков, приводящая формально к исключению одной-двух межмолекулярных водородных связей, приводит к дестабилизации комплекса или к невозможности его образования.

Встречаемость в бактериальных организмах природных замен среди пяти строго консервативных аминокислотных остатков в белках семейства СТС могла бы пролить свет на их роль в связывании белка с РНК. Анализ 300 гомологичных белков

Рис. 19. Природные изменения в домене у (область контакта с белком СТС) бактериальных 5S рРНК. На схеме представлены участки (Е-петля и спирали IV, V) 5S рРНК Е. coli и представителей Bacillii и Cyanobacteria. В рамку заключен участок РНК, контактирующий с белком. Строго консервативные в бактериальных 5S рРНК нуклеотиды (> 80%) показаны черным символами, а неконсервативные (< 80%) -голубыми. Консервативные нуклеотиды, измененные в данных РНК, отмечены красными символами. Изменения консервативного аспартата в

соответствующем белке СТС указано справа от РНК.

Escherichia Enterococcus Nostoc sp.

coli faecalis

G-C70 G-C68 C-G70

,05G—С ,03G-C G-C

A G A G 105C U

U А U А U А

G U G U А С

A G <]D87 AU D87E A G D87S

100G G 98G G С А

A U A U тА U

G А G А С А

С —G U-G С —G

G—U80 G-U78 G —U80

95 U — G 93U — G и С

A-U U-A 95А—и

С — Я U-A U-A

C-G C-G С —G

семейства СТС выявил только семь случаев замены консервативного тирозина и 14 -консервативного аспартата (Табл. 2). Одна из этих природных замен - В/Е. Эта замена была обнаружена у представителей рода Еп1егососсш. В соответствии с нашими результатами, такая замена значительно снижает способность белка ТЬ5

связываться с 5S рРНК (Табл. 3). Однако у представителей данного бактериального рода, у которых произошла такая замена в соответствующей позиции белка СТС, обнаруживается интересное изменение в нуклеотидной последовательности 5S рРНК. На рисунке 19 показан соответствующий участок 5S рРНК Enterococcus faecalis. В сравнение с 5S рРНК Е. coli, есть только одна нуклеотидная замена в этой области: в 5S рРНК Е. faecalis G75 заменен на U. В комплексе TL5-5S рРНК (L25-5S рРНК), G75 формирует водородную связь с D87 (D90). Моделирование данной ситуации показало, что одновременная замена D/E в белке и G/U в РНК практически не сопровождается какими-либо изменениями в контактирующей области. Таким образом, данный случай можно считать примером коэволюции структур двух взаимодействующих макромолекул. Другие интересные случаи природных замен данного консервативного аспартата на серин или аланин были найдены в первичных структурах белков СТС Cyanobacteria. Такие мутации лишали белки TL5 и L25 способности связываться с 5S рРНК (Табл. 3). Однако оказалось, что в 5S рРНК цианобактерий тоже произошли изменения (Рис. 19). Нуклеотидная последовательность в районе Е-петли цианобактериальной 5S рРНК сильно отличается от таковой для большинства известных бактериальных 5S рРНК. Возможно, что и эти одновременные изменения в белке СТС и 5S рРНК данной группы организмов являются примером коэволюции.

На основании полученных данных можно сделать несколько основных заключений. Во-первых, уникальная поверхность Е-петли, образованная искаженной двойной спиралью 5S рРНК, является необходимым условием для специфического взаимодействия с белком семейства СТС. Во-вторых, 5S рРНК-узнающий модуль, формируемый пятью идентичными остатками белков TL5 и L25, образующими недоступные растворителю водородные связи с РНК, должен быть характерен для большинства белков семейства СТС. В-третьих, обнаруженные одновременные изменения в области контакта белков СТС и 5S рРНК, произошедшие в этих молекулах в процессе эволюции некоторых групп бактерий, по-видимому, направлены на сохранение ими способности формировать стабильный комплекс.

5. Участие 5S рРНК-связывающих белков в формировании функционально-активной рибосомы Escherichia coli

Несмотря на многолетние исследования рибосомы, и ее компонентов, до недавнего времени почти не было информации о роли индивидуальных рибосомных белков в формировании функционально-активной бактериальной рибосомы in vivo. Поэтому, описанные в этой главе работы можно считать одними из пионерских в этом направлении. Наша задача заключалась в установлении необходимости каждого

из 5S рРНК-связывающих белков Е. coli в формировании функционально-активной рибосомы в клетке. Для этого был использован недавно разработанный эффективный и точный метод осуществления нокаута конкретного гена в хромосоме Е. coli -«рекомбиниринг» (Court et al., 2002, Аппи. Rev. Genet., 36, 361-88).

Гены 5S РНК-связывающих белков Е. coli, rplE, rplR или rplY (кодирующие рибосомные белки L5, L18 или L25, соответственно), были нами нокаутированы в хромосоме, используя метод «рекомбиниринг». Эта техника позволяла точно произвести замену хромосомного гена на маркерный ген без неспецифических полярных эффектов на экспрессию генов, фланкирующих замененный ген. Ген указанного 5S рРНК-связывающего белка был инактивирован точной заменой его ОРС на кассету с ОРС хлорамфеникол-ацетилтрансферазы, cat (Рис. 20А). После

—ЕИ *Р"ЖКЧ1М1И.1И ¡55 хртюа;

Ж рекомбинация X W/Л ..» "WW ПЦГ-фри.ч

Рис. 20. А - Схема замены ОРС хромосомного гена Е. coli на маркерный ген (cal), позволяющий осуществлять отбор рекомбинантов на селективной среде. Участки ДНК, необходимые для гомологичной рекомбинации, показаны штриховкой. Б - Анализ эффекта нокаута гена rplY (левая колонка) или генов rplE и rplR (правая колонка). В колонке показаны: соответствующая схема генотипа (гаплоидный (eeH<>cat) или частично диплоидный (ген<>са//ген+)), рост соответствующих мутантов на чашках с LB-Cm средой, электрофоретический анализ продуктов ПЦР-амплификации соответствующих участков хромосомы мутантного штамма.

=€ZZZn

хромосомный ген заменен на маркерный ген

HZ2!= >/>""

енОкасычпа

хромосомный .хч

-10710"

V .СПОКИ

-10/10"

/уу

.1? J1 А* #

этого, для выявления рекомбинантов, была проведена селекция клеток на среде с соответствующим антибиотиком (хлорамфеникол, Cm). Оказалось, что в случаях успешной замены rplRocat или rplE<>cat, обнаруживается только ~ 10 CmR колоний на 108 выживших клеток (Табл. 4). PCR анализ подтвердил факт замены гена рибосомного белка rplR или rplE на ген cat. Однако было обнаружено, что хромосома данных рекомбинантных клеток также содержит еще интактный ген (Рис. 20Б, правая колонка). Такие частично диплоидные клетки встречаются с частотой ~10"2 для

любого одного участка хромосомы, и ранее было показано, что жизненно важные гены в таких диплоидных участках хромосомы являются мишенью для замен (Yu et al., 2000, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 97, 5978-83; Knowlton et al., 2003, Biochemistry, 42, 2275-81). Полученные нами результаты указывали на то, что два 5S рРНК-связывающих рибосомных белка L5 и LI8 строго необходимы для выживания клетки Е. coli. При нокауте гена (rplY), третьего 5S рРНК-связывающего белка L25 Е. coli,

Таблица 4. Эффективность рекомбинации и генотип клеток при нокауте генов 5S рРНК-связывающих белков Е. coli.

Ген-мишень Плазмида Эффективность рекомбинации* Генотип

rplE (L5) -10 rplE<>cat/rplE*

rplE (L5)" -10 rplE34<>cat/rplE *

rplE (L5) pCRIrplE -10' rplEocat

rplE (L5)** pCRIrplE -10' rplE34<>cat

rpIR (L18) -10 rplRocat/rpIR*

rpIR (L18) pCR/rp/R -10 rplRocat/rpIR"

rpIR (L18) pCRIrplH-rpIR-rpsE -10"" rplRocat

rplY (L25) ~1 о4 rplYocat

*Количество рекомбинантов/108 выживших клеток. ** Замещение З'-концевой части гена rplE (начиная с 34 кодона) на cat для получения в хромосоме гибридного гена rplE33-cat (дающего клеткам RplE фенотип) с сохранением в хромосоме участка, кодирующего шпильку, необходимую для регуляции spe оперона. *** Нокаут осуществлялся с помощью PI-переноса rplRocat аллеля из rplR<>cat/rplR+ штамма в штамм W3110.

клетки выживали. При этом мы наблюдали высокую частоту 104 колоний/108 выживших клеток) рекомбинации (Табл. 4). Рекомбинанты имели генотип только rplYocat, a PCR анализ хромосомного участка rplY в них подтвердил rplY<>cat замену в медленнорастущих CmR колониях (Рис. 20Б, левая колонка). Таким образом, становилось очевидным, что ген rplY и кодируемый им рибосомный белок L25 не являются необходимыми для выживания клеток Е. coli.

Известно, что 5'-концевой участок (около 100 нуклеотидов) цистрона rplE образует шпильку, необходимую для регуляции экспрессии генов jpc-оперона (Cerretti et al., 1988, J. Mol. Biol., 204, 309-29). Нами была осуществлена замена ОРС rplE или ее З'-концевой части (начиная с 34™ кодона) на cat в присутствии плазмиды, обеспечивающей экспрессию гена rplE (pCRIrplIZ). При условии экспрессии in trans гена rplE была более высокая частота рекомбинации в обоих случаях (Табл. 4) и рекомбинанты имели гаплоидный генотип rplE<>cat. Таким образом, нами впервые было показано, что рибосомный белок L5 строго необходим для выживания клеток Е. coli, в то время как отсутствие регуляторного элемент spe оперона не являлось летальным для клеток. Необходимо отметить, что в наших экспериментах удаление

этого регуляторного элемента, хотя и не было летальным, но приводило к ощутимому замедлению роста клеток (изменения оценивались визуально по размеру колоний рекомбинантов).

Для подтверждения того, что белок LI8, подобно белку L5, является необходимым для выживания клеток Е. coli мы осуществили нокаут гена rplR в присутствии плазмиды pCRJrplR, которая должна была обеспечивать конститутивную экспрессию этого гена. В данном случае эффективность рекомбинации также была низкой, и рекомбинанты имели характерный диплоидный генотип rplR<>cat/rplR+ (Табл. 4). Мы повторили эксперимент, по при этом в вектор pCR была клонирована большая часть зрс-оперона, содержащая три соседних гена, rplF (L6), rplR (LI8) и rpsE (S5). Было получено порядка ~102 клонов с гаплоидным генотипом rplRocat только в присутствии плазмиды pCRIrplF-rplR-rpsE (Табл. 4). Эти данные полностью подтверждают наш предварительный вывод о том, что белок LI 8 является жизненно необходимым для Е. coli.

Третий 5S рРНК-связывающий рибосомный белок, L25 Е. coli или другие белки семейства СТС, найдены только в бактериях, однако, даже не во всех бактериях. Можно было бы предположить, что белок данного семейства не является строго необходимым компонентом бактериального аппарата трансляции. Однако нами было обнаружено, что при нокауте rplY, клетки хотя и выживают, но растут значительно

Таблица 5. Скорости роста клеток родительского штамма (W3110) и rplY-нокаутированного штамма (K.NB800) Е. coli.

Штамм Плазмида Время удвоения, мин

W3110 32

KNB800 72

W3110 pCR 39

KNB800 pCR 120

KNB800 pCR/rp/Y 46

KNB800 pCR/cfc 54

KNB800 pCRINfr-ctc 54

Культивация клеток штамма KNB800 (ÄL25), трансформированных плазмидой, несущей ген белка L25 Е. coli (pCRIrpiY). СТС В. siibiilü (pCRJclc) или N-концевого фрагмента белка СТС (194 остатки) (рCR/Nfr-cfc), осуществлялась в среде LB при 37°С в присутствии канамицина (50 мкг/мл).

медленнее, чем клетки родительского штамма W3110 в широком диапазоне температур, от 20 до 42°С. При стандартных условиях роста (LB среда, 37°С), время удвоения Е25-дефицитных клеток было равно примерно 72 минуты, тогда как клеток W3110 штамма - 32 минуты (Табл. 5). В то же время, рост rplY-nокаутированных клеток восстанавливался при экспрессии гена rplY с плазмиды. Этот результат

свидетельствует о том, что дефект в росте гр/У-нокаутированных клеток связан с отсутствием белка L25, н в большей степени может быть восстановлен экспрессией гена белка 1,25 in trans. Результаты наших экспериментов показывают, что рибосомный белок L25 хотя и неважен для выживания клетки, но, тем не менее, необходим для нормальной жизнедеятельности Е. coli. Интересно отметить, что rplY-нокаутированные клетки были способны в значительной степени восстанавливать дефект в росте при экспрессии in trans гена основного стрессового белка СТС В. subtilis. Как ранее нами было показано, белок СТС В. subtilis специфически связывается с бактериальной 5S рРНК, а N-концевой домен этого белка имеет гомологию с рибосомным белком L25 Е. coli. В наших экспериментах синтез полноразмерного белка СТС или его N-концевого домена в значительной степени восстанавливал рост Ь25-дефицитных клеток Е. coli (Табл. 5). Таким образом, нами впервые было показано, что основной стрессовый белок СТС В. subtilis являегся не только структурным, но и функциональным гомологом рибосомного белка L25 Е. coli.

Мы проверили, влияет ли отсутствие белка 1.25 в клетках Е. coli на эффективность работы их аппарата трансляции in vivo и in vitro. Используя стандартный ß-галактозидазный тест, мы сравнили белоксинтезирующие способности клеток AL25 (KNB800) и родительского (W3110) штаммов. Оказалось, что ф/У-нокаутированные клетки накапливают ß-галактозидазу примерно в 4-5 раз медленнее, чем клетки родительского штамма (Рис. 21 А). Мы предположили, что это обнаруженное различие, по-видимому, и является главной причиной медленного роста клеток АЬ25-штамма. Рибосомы из мугантного штамма были выделены и проверена их белоксинтезирующая активность in vitro. Оказалось, что рибосомы из клеток L25-дефицитного и дикого штамма транслировали poly(U) матрицу с одинаковой скоростью, что указывало на то, что отсутствие белка L25 не влияет на способность рибосомы формировать полипептидную цепочку. Кроме того мы сравнили способности указанных рибосом транслировать in vitro природные мРНК для люциферазы и зеленного флюоресцирующего белка (GFP) (Рис. 21Б и В, соответственно). Активность люциферазы начинала появляться через одинаковое время (примерно 3 минуты) в образцах обоих рибосом. Известно, что люцифераза проявляет активность только после того, когда она покинула рибосому, поэтому мы заключили, что все этапы трансляции природной матрицы осуществляются со сходной скоростью рибосомами дикого типа и AL25 рибосомами. Однако количество синтезированных белков рибосомами АЬ25-штамма оказалось в 1.5-2 раза меньше, чем контрольными рибосомами. Эгог результат подтверждал данные синтеза ß-

галактозидазы (Рис. 21 А), однако, не давал ответа на вопрос о причине обнаруженных изменений в функциональных свойствах рибосом ДЬ25-штамма.

2000 3 1800 го 1600

0 1400 ■f1 1200 з- 1000 g 800 -о 600 Í3 400 х 200

1 0

W3110

20 30 40 50 60 время, мин

Рис. 21. Синтез природных полипептидов рибосомами штаммов KNB800 (AL25) (А) и W3110 (wild type) (•). А - способность штаммов K.NB800 (Ж) и W3110 (•) синтезировать Р-галактозидазу in vivo. Активность фермента представлена в миллеровских единицах. Н и В - синтез люциферазы Pholinus pyralis- и GFP Acquorca Victoria в бесклеточной системе трансляции, соответственно. При синтезе GFP, в систему добавлялся [14C]Leu, а синтезируемый продукт анализировали электрофорезом в ПААГ с последующей авторадиографией (вставка в секции В).

10 15 20 25 30 35 40 время, мин

5 5 CL

iL. 4

s 3'

та

е- 2-

х 03 ? 1-о

* О

IGFP

' 1 • ! > U4

О 10 20 30 40 50 60 70 80 90

время, мин

Одной из возможных причин низкого выхода синтезируемого полипептида могли быть ошибки в трансляции, приводящие к накоплению неактивного белка или укороченных пептидов. Проверка соотношения активного GFP (по флюоресценции) и тотального количества GFP полипептида (по включению [14C]Leu в белок) показала, что большая часть синтезированного полипептида является полноразмерным GFP и общая картина распределения синтезированных пептидов на электрофореграмме (вставка на Рис. 21В) в обоих случаях одинакова. Таким образом, ошибки в трансляции AL25 рибосомами, как главная причина низкой эффективности их белоксинтезируюших способностей нами была исключена.

Мы исследовали компонентный состав и некоторые другие характеристики рибосом AL25 штамма. Как видно на рисунке 22А рибосомные фракции контрольного и AL25 штаммов, анализированные непосредственно из цитоплазматической фракции клеток, принципиально не отличаются ни по компактности, ни по способности субчастиц ассоциировать. Соотношение и целостность всех трех рибосомных РНК не отличались для обоих образцов рибосом.

За исключением белка L25, все другие индивидуальные рибосомные белки присутствовали в рибосомах мутантного штамма в сравнимых количествах, как и в рибосомах дикого типа (Рис. 22Б). Таким образом, белок L25 не являлся строго необходимым для сборки 50S рибосомных субчастиц in vivo. Однако, как видно на рисунке 22В, в отличие от контрольных рибосом, рибосомы ДТ25-штамма, ¡ выделенные и очищенные по стандартной методике (центрифугирование в присутствии высокой концентрации соли), содержат значительно больше (от 30% до

Рис. 22. А - Анализ рибосомной фракции из штаммов KNB800 (AL25) и W3110 (WT) Е. coli центрифугированием в градиенте плотности сахарозы 15-30%, при 10 мМ Mg2Cl и 100 мМ KCl. Б -Анализ белкового состава рибосом ДЬ25-штамма и штамма дикого типа (двумерный ПААГ-электрофорез). В - Анализ очищенных рибосом из ДЬ25-штамма и штамма дикого типа центрифугированием в градиенте плотности сахарозы (условия как на панели А). На вставке показан |, фрагмент двумерного ПААГ-электрофореза белков 50S рибосомных субчастиц.

50% в разных образцах) диссоциированных рибосомных субчастиц. Учитывая то, что использованный способ очистки рибосом не влиял на свойства контрольного образца ; (Рис. 22В, верхняя панель), можно было сделать заключение, что образец рибосом ДЬ25-штамма содержит дефектную фракцию 50S рибосомных субчастиц, неспособную ассоциировать с 30S субчастицами. Ситуация, отраженная на рисунке 22В, принципиально не изменялась при варьировании концентраций буферных компонентов в эксперименте. Анализ компонентного состава фракции «дефектных 50S субчастиц» показал, что в ней кроме отсутствия белка L25 еще значительно редуцировано количество белка LI6 (Рис. 22В, вставка). Становилось очевидным, что

наиболее вероятной причиной сниженной эффективности в работе рибосом AL25-штамма вероятнее всего является присутствие фракции «дефектных 50S субчастиц». Мы задались вопросом: что же могло произойти с рибосомными субчастицами данного мутантного штамма?

На сегодняшний день известно, что именно у основания центрального протуберанца большой рибосомной субчастицы расположены два функциональных центра, пептидилтрансферазный и ГТФаза-ассоциированный (Рис. 23, левая панель), а сам протуберанец участвует в формировании межсубъединичных мостиков и тРНК- связывающих сайтов. Центральный протуберанец (Рис. 23) формируется 5S рРНК-белковым комплексом, структурными элементами II и V доменов 23 S рРНК и

Рис. 23. Модель пространственной структуры 50S рибосомной субчастицы Е. coli (левая панель). Отмечено положение í^pPHK-белкового комплекса, ГТФаза-ассоциированного (GAC) и пелтвдил-трансферазного (РТС) центров. Модель центрального протуберанца 50S рибосомной субчастицы (правая панель). Для построения моделей использована структура рибосомы (PDB code: 2AW4), взятая из работы (Schuwirth et al., 2005, Science, 310, 827-34).

белками L16, L27 и L30. По современным кристаллографическим данным (Ban et al., 2000, Science, 289, 905-20; Klein et a!., 2004, J. Mol. Biol., 340, 141-77; Schuwirth et al„ 2005, Science, 310, 827-34; Selmer et al., 2006, Science, 313, 1935-42; Harms et al., 2008, Mol. Cell, 30, 26-38) положение 5S pPHK (5S рРНК-белкового комплекса) в архейной и бактериальной рибосомах определяется несколькими консервативными контактами. Один из этих контактов приходится на р-домен 5S рРНК и спирали Н83-Н85 23S рРНК. Это взаимодействие осуществляется через белки L5 и L18 (Рис. 23, правая панель). Во втором консервативном межмолекулярном контакте участвуют Е-

петля 5S рРНК и спираль Н38 23S рРНК. В бактериальной рибосоме к указанным контактам добавляется еще один, осуществляемый белком семейства СТС. Как уже было отмечено выше, одна из сторон Е-петли 5S рРНК взаимодействует с белком L25. Таким образом, у-домен 5S рРНК в районе Е-петли оказывается как бы «зажат» между белком L25 (СТС) и спиралью Н38 23S рРНК. При этом положение белка L25 стабилизируется взаимодействием с С-концевым участком белка L16 (Рис. 23, правая панель). Причем это взаимодействие белка L16 в рибосоме Т. themophilus осуществляется с двумя доменами белка TL5, что значительно увеличивает и стабилизирует область контакта по сравнению с однодоменным белком L25. По-видимому, именно указанные консервативные межмолекулярные контакты и должны определять уникальное положение 5S рРНК в рибосоме.

Мы предположили, что отсутствие белка L25 могло повлиять на структуру центрального протуберанца рибосомной субчастицы, этого сложного ее структурно-

•<=. ï4.«cV

Cr CG С UG I

II X гА'л ™>

"JXA 5S рРНК

V». IV

GAC

U ииАДА АА

О С С А С A U GAG CGUa

С G G U G U A CUC GAUA

G С U A U ACCGC С GA°U<

jL.» - - - -I- -----

• Г i И5ЙГ 39

_ r.^ aga.. ..u

»CAG UC

G* дС

*ccc Ga

1040 G U

:.....- mju<~ ä,

(часть домена V) ^

23S рРНК (часть домена II) >

' -37 ; í 4 с

^ и* с S Аии Збс с

454?

Рис. 24. Изменения в доступности нуклеотидов 23S и 5S рРНК для модифицирующих агентов в рибосомах АЬ25-штамма. Измененные нуклеотиды в 70S рибосомах ДЬ25-штамма отмечены фиолетовым цветом. Дополнительные и более интенсивные изменения во фракции «диссоциированных 50S рибосомных субчастиц» отмечены розовым цветом. РНК-РНК контакты в рибосоме указаны зелеными линиями, РНК-белковые и белок-белковые контакты - стрелками. PTR - пептидил-трансферазное кольцо (фрагмент); GAC - ГТФаза-ассоциированный центр. Данные о межмолекулярных контактах взяты из структуры рибосомы Е. coli (PDB code: 2AW4).

функционального узла. Было решено провести более детальное исследование этого участка 50S субчастиц ДЬ25-штамма. Нас интересовали два вопроса: как отразилось отсутствие белка L25 на центральном протуберанце функционально-активных рибосом? и, какие изменения во фракции «дефектных 50S субчастиц» ДЬ25-штамма могли привести к последствиям, описанным выше? Используя метод химического пробинга РНК, был осуществлен сравнительный анализ доступности нуклеотидов 5S рРНК и доменов II и V 23S рРНК для модифицирующих агентов в образцах рибосом ДЬ25 и контрольного штаммов. На рисунке 24 суммированы данные об обнаруженных изменениях в рибосомных РНК ДЬ25-штамма. Оказалось, что изменения в доступности нуклеотидов химическим агентам обнаруживаются уже во фракции 70S рибосом ДЬ25-штамма. Наиболее яркие изменения произошли в Е-петле 5S рРНК, а также в спиралях Н38, Н39, петле Н41-Н42 (домен II) и спиралях Н86, Н89 (домен V) 23S рРНК. Эти же участки 23S рРНК оказались доступными для модификации и во фракции «дефектной 50S субчастицы» ДЬ25-штамма, однако, модификации в ней были более обширными и интенсивными, чем в 70S рибосомах данного штамма (Рис. 24). Кроме того в этой субчастице появились новые участки, спирали Н37, Н80 и Н81, изменившие свою доступность для модифицирующих агентов. Таким образом, полученные данные позволили заключить, что в районе центрального протуберанца 50S субчастицы ДЬ25-штамма (особенно во фракции «дефектной 50S субчастицы») происходят локальные, но значительные изменения в конформации рибосомной РНК.

Как видно на рисунке 24, именно те участки РНК, которые изменили свою доступность модифицирующим агентам в ДЬ25 рибосомной субчастице, участвуют в образовании межмолекулярных водородных связей, формирующих и стабилизирующих пространственную структуру центрального протуберанца. С одной стороны, белок L25 образует в рибосоме Е. colt контакты только с двумя молекулами, 5S рРНК и белком L16 (Рис. 23 и 24). С другой стороны, белок L16 и 5S рРНК образуют обширные межмолекулярные контакты (Н38, Н39 и Н89) в рибосоме. Именно в этих структурных элементах 23 S рРНК обнаруживаются значительные изменения в доступности модифицирующим агентам. Все это указывает на то, что отсутствие белка L25 приводит к дестабилизации межмолекулярных связей в значительной части центрального протуберанца большой рибосомной субчастицы и даже к ослаблению удержания рибосомой белка L16. Таким образом, можно заключить, что одной из функций белка семейства СТС, эволюционного приобретения бактериального аппарата трансляции, является стабилизация уникальной пространственной структуры центрального протуберанца 50S рибосомной субчастицы.

Заключение

Результаты, полученные в настоящей работе, а также данные о расшифрованных бактериальных геномах, позволяют сделать заключение о том, что подавляющее большинство бактерий содержит третий 5S рРНК-связывающий белок, белок семейства СТС. Все белки этого семейства, без исключения, содержат так называемый «5S рРНК-связывающий» домен. Впервые было продемонстрировано, что рибосомный белок L25 Е. coli и основной стрессовый белок СТС В. subtilis являются не только структурными, но и функциональными гомологами. В работе установлено, что пять идентичных аминокислотных остатков в белках TL5 и L25 формируют их 5S рРНК-узнающий модуль, а учитывая строгую консервативность этих остатков в белках семейства СТС, предполагается, что такой модуль должен быть характерен для большинства из них. Единичные случаи одновременных природных изменений, произошедших в контактирующих областях белков СТС и 5S рРНК, можно считать примерами коэволюции структур этих двух молекул. Таким образом, эти немногочисленные исключения подтверждают выдвинутый нами основной принцип специфического взаимодействия между 5S рРНК и белком семейства СТС. Сравнительный анализ структур бактериальных и архейных рибосомных белков семейства L5 и их комплексов с РНК позволил заключить, что структуры этих белков и их контакты с 5S рРНК эволюционно консервативны. Обнаруженная в работе практически идентичная укладка глобулярной части пространственных структур рибосомных белков семейств L18 и SI 1 может указывать на родство их происхождения. Определенная в данной работе пространственная структура большей части 5S рРНК-белкового комплекса с высоким разрешением внесла существенный вклад в построение модели рибосомы, и является востребованной до сих пор в исследованиях детальной структурной организации бактериальной рибосомы. Получены данные, которые позволили впервые оценить степень необходимости каждого из 5S рРНК-связывающих белков для формирования функционально-активной рибосомы и для выживания бактериальной клетки. Оказалось, что рибосомные белки L5 и L18 строго необходимы для выживания клеток Е. coli, а белок L25, не являясь необходимым для выживания клеток, оказался чрезвычайно важен для стабилизации структуры центрального протуберанца 50S субчастицы бактериальной рибосомы. Большинство полученных в работе данных имеют приоритетный характер и вносят значительный вклад в понимание тонкой структурной организации бактериальной рибосомы.

ВЫВОДЫ

1. Установлено, что 5S рРНК-связывающие рибосомные белки TL4 (TthL5), TL18 (TthLl 8) и TL5 (N-концевой домен) Thermits themophilus являются структурными и функциональными гомологами рибосомных белков L5, L18 и L25 Escherichia coli, соответственно.

2. Основной стрессовый белок СТС из Bacillus subiilis специфически связывается с 5S рРНК и гомологичен 5S рРНК-связывающим рибосомным белкам TL5 Т. themophilus и L25 Е. coli, поэтому указанные белки были объединены в семейство белков СТС. Известные на сегодняшний день представители семейства СТС (несколько сотен белков), найденные только в бактериях, содержат домен, соразмерный и гомологичный белку L25 Е. coli, из чего можно заключить, что все они должны обладать 5S рРНК-связывающими свойствами.

3. Консервативная Е-петля бактериальных 5S рРНК является специфическим местом связывания белков семейства СТС. Несмотря на довольно низкую гомологию первичных структур, пространственные структуры N-концевого домена белка TL5 и белка L25, и их взаимодействие с РНК очень сходны, а пять идентичных аминокислотных остатков в данных белках формируют их 5S рРНК-узнающий модуль. Учитывая строгую консервативность этих остатков в белках семейства СТС, предполагается, что такой модуль должен быть характерен для большинства из них. Единичные обнаруженные случаи одновременных изменений в контактирующих модулях белков семейства СТС и 5S рРНК можно считать примерами коэволюции структур двух взаимодействующих молекул.

4. Впервые показано, что уникальная по структуре С-петля 5S рРНК является специфическим местом связывания белка TthL5. Рибосомные белки семейства L5 в бактериях и археях образуют чрезвычайно сходную пространственную структуру, а при взаимодействии с С-петлей 5S рРНК формируют сеть консервативных межмолекулярных контактов. Все это свидетельствуют об эволюционной консервативности рибосомных белков данного семейства.

5. Глобулярная часть пространственных структур рибосомных белков семейств L18 и S11 укладывается практически идентично, что может свидетельствовать об их родственном происхождении.

6. Рибосомные белки L5 и L18 строго необходимы для выживания клеток Е. coli.

7. Отсутствие белка L25 не влияет на выживание клеток Е. coli, но приводит к значительному снижению количества синтезируемого белка рибосомами AL25-штамма. В структуре центрального протуберанца 50S рибосомной субчастицы ДЬ25-штамма обнаруживаются значительные конформационные изменения, приводящие к ослаблению ее способности ассоциировать с 30S субчастицей.

Таким образом, можно заключить, что белок семейства СТС необходим 50S субчастице бактериальной рибосомы для стабилизации структуры ее центрального протуберанца.

ОСНОВНЫЕ ПУБЛИКАЦИИ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи и обзоры в научных журналах, рекомендованных ВАК РФ

1. Korobeinikova, A.V., Shestakov, S.A., Korepanov, А.Р., Garber, M.B., Gongadze G.M. Protein CTC from Aqulfex aeolicus possesses a full-sized 5S rRNA-binding domain // Biochimie. - 2009. - V.91. - P.453-456.

2. Гонгадзе, Г.М., Корепанов, А.П., Коробейникова, A.B., Гарбер, М.Б. Бактериальные 5S рРНК-связывающие белки семейства СТС // Успехи Биолог. Химии. - 2008. - Т.48. -С.105-132.

3. Коробейникова, А.В., Гонгадзе, Г.М., Корепанов, А.П., Елисеев, Б.Д., Баженова, М.В., Гарбер М.Б. 5S рРНК-узнающий модуль белков семейства СТС и его эволюция // Биохимия. - 2008. - Т.73. - С.193-201.

4. Korepanov, А.Р., Gongadze, G.M., Garber, М.В., Court, D.L., Bubunenko, M.G. Importance of the 5S rRNA-binding ribosomal proteins for cell viability and translation in Escherichia coli II J. Mol. Biol. - 2007. - V.366. - P. 1199-1208.

5. Gongadze, G.M., Korepanov, A.P., Stolboushkina, E.A., Zelinskaya, N.V., Korobeinikova, A.V., Ruzanov, M.V., Eliseev, B.D., Nikonov, O.S., Nikonov, S.V. and Garber, M.B., Lim, V.I. The crucial role of conserved intermolecular H-bonds inaccessible to the solvent in formation and stabilization of the TL5-5S rRNA complex // J. Biol. Chem. - 2005. - V.280

- P.16151-16156.

6. Корепанов, А.П., Гонгадзе, Г.М., Гарбер, М.Б. Основной стрессовый белок СТС Bacillus subtilis специфически связывается с рибосомной 5S РНК // Биохимия. - 2004.

- Т.69. - С.749-754.

7. Garber, М., Gongadze, G., Meshcheryakov, V., Nikonov, О., Nikulin, A., Perederina, А., Piendl, W., Serganov, A, Tishchenko, S, Crystallization of RNA/protein complexes // Acta Crystallographica Section D. - 2002. - V.58. - P.1664-1669.

8. Woestenenk, E.A., Gongadze, G.M., Shcherbakov, D.V., Rak, A.V., Garber, M.B., Hard, T. and Berglund, H. The solution structure of ribosomal protein L18 Thermus thermophilus reveals a conserved RNA-binding fold // Biochem. J. - 2002. - V.363. - P.553-561.

9. Perederina, A., Nevskaya, N., Nikonov, O., Nikulin, A., Dumas, P., Yao, M., Tanaka, I., Garber, M., Gongadze, G. and Nikonov, S. Detailed analysis of RNA-protein interactions

within the bacterial ribosomal protein L5/5S rRNA complex // RNA. - 2002. - V.8. -P.l 548-1557.

Ю.Гонгадзе, Г.М., Передерина, A.A., Мещеряков, B.A., Федоров, Р.В., Москаленко, С.Е., Рак, А.В., Серганов, А.А., Щербаков, Д.В., Никонов, С.В., Гарбер, М.Б. 5S рРНК-белковый комплекс Thermus thermoph'rfus. Определение специфических участков связывания белков L5 и L18 на 5S рРНК // Мол. биология. - 2001. - Т.35. -С.610-616.

11.Fedorov, R., Meshcheryakov, V., Gongadze, G., Fomenkova, N., Nevskaya, N., Selmer, M., Laurberg, M., Kristensen, O., Al-Karadaghi, S., Liljas, A., Garber, M., Nikonov, S. Structure of ribosomal protein TL5 complexed with RNA provides new insights into the CTC family of stress proteins // Acta Crystallographica Section D. - 2001. - V.57. - P.968-976.

12.Woestenenk, E.A., Allard, P., Gongadze, G.M., Moskalenko, S.E., Shcherbakov, D.V., Rak, A.V., Garber, M.B., Hard, Т., Berglund, H. Assignment and secondary structure identification of the ribosomal protein LI 8 from Thermus themophilus II J. Biomol. NMR. - 2000. - V.17. - P.273-274.

13.Gongadze, G.M., Meshcheryakov, V.A., Serganov, A.A., Fomenkova, N.F., Mudrik, E.S., Jonsson, B.-H., Liljas, A., Nikonov, S.V. and Garber, M.B. N-terminal domain, residues 191, of ribosomal protein TL5 from Thermus thermophilus binds specifically and strongly to the region of 5S rRNA containing loop E // FEBS Lett. - 1999. - V.451. - P.51-55.

14. Мещеряков, В.А., Грязнова, О.И., Давыдова, H.Jl., Мудрик, Е.С., Передерина, А.А., Василенко, К.С., Гоигадзе, Г.М., Гарбер. М.Б. РНК-связывающие свойства необычного рибосомного белка TL5 из Thermus thermophilus II Биохимия. - 1997. -Т.62. - С.629-634.

15.Gryaznova, O.I., Davydova, N.L., Gongadze, G.M., Jonsson, B.-H., Garber, M.B. & Liljas, A. A ribosomal protein from Thermus thermophilus is homologous to a general shock protein // Biochimie. - 1996. - V.78. - P.915-919.

16.Gongadze, G., Kashparov, I., Lorenz, S., Shroeder, W., Erdmann, V.A., Liljas, A. & Garber, M. 5S rRNA binding ribosomal proteins from Thermus thermophilus: identification and some structural properties // FEBS Lett. - 1996. - V.386. - P.260-262.

17. Gongadze, G.M., Tishcbenko, S.V., Sedelnikova, S.E.& Garber, M.B. Ribosomal proteins, TL4 and TL5, from Thermus thermophilus form hybrid complexes with 5S ribosomal RNA from different microorganisms // FEBS Lett. - 1993. - V.330. - P.46-48.

18.Selivanova, O.M., Gongadze, G.M., Gudkov, A.T. and Vasiliev, V.D. Structure of protein-deficient 50S ribosomal subunits. Particles without 5S RNA-protein complex retain the L7/L12 stalk and associate with 30S subunits // FEBS Lett. - 1986. - V.197. - P.79-83.

Статьи в сборниках и избранные тезисы конференций

19.Корепанов А.П., Коробейникова А.В., Баженова М.В., Шестаков С.А., Бубуненко М.Г., Гарбер М.Б., Гонгадзе Г.М. Роль 5S рРНК-связывающих белков L5 и L25 в сборке бактериальной рибосомы in vivo // Сборник тезисов Международной научной конференции по биоорганической химии, биотехнологии и бионанотехнологии, посвященной 75-летию со дня рождения академика Юрия Анатольевича Овчинникова, 28 сентября - 2 октября. - 2009. - Москва, Россия. - С.250-251.

20. Баженова М.В., Корепанов А.П., Гарбер М.Б., Гонгадзе Г.М. Белок L25 стабилизирует структуру функционально важного участка бактериальной рибосомы // Сборник тезисов 13-ой Международной Пущинской школы-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века», 28 сентября - 2 октября. - 2009. - Пущино, Россия.-С.7-8.

21.Баженова М.В., Корепанов А.П., Сарских А.В., Гарбер М.Б., Гонгадзе Г.М. Изучение структурных особенностей рибосом Escherichia coii, лишенных белка L25 // Сборник тезисов 12-ой Международной Пущинской школы-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века», 10-14 ноября. - 2008. - Пущино, Россия. - С.7.

22.Korobeinikova, A.V., Korepanov, А.Р., Gongadze, G.M., Bazhenova, M.V., Sarskikh,

A.V., Garber, M.B. Properties of the bacterial CTC family proteins associated with ribosome // Abstracts of the International conference on "Protein biosynthesis, structure and function", June 9-13. - 2007. - Pushchino, Russia. - P.21.

23.Korepanov, A.P., Gongadze, G.M., Bazhenova, M.V., Garber, M.B., Court, D.L., Bubunenko, M.G. Role of 5S rRNA-binding ribosomal protein L25 of Escherichia coii in cell viability and translation // Abstracts of the International Engelgardt conference on molecular biology, august 19-24. - 2006. - Buran, Russia. - P.68.

24. Корепанов А.П., Гонгадзе Г.М., Столбоушкина, E.A., Зелинская, Н.В., Рузанов, М.В., Коробейникова, А.В., Елисеев, Б.Д., Никонов, О.С., Никонов, С.В., Гарбер М.Б., Диада консервативных остатков в белке TL5 Thermits thermophiius играет ключевую роль в узнавании этим белком 5S рРНК // Сборник тезисов 8-ой Международной Пущинской школы-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века», 1721 мая. - 2004. - Пущино, Россия. - С. 17.

25.Garber, М.В., Nikonov, S.V., Gongadze, G.M., Fedorov, R.V., Meshcheryakov, V.A., Nevskaya, N.A., Nikulin, A.D., Perederina, A.A., Tishchenko, S.V., Dumas, P., Ehresmann,

B., Ehresmann, C., Lamzin, V., Liljas, A., Piendl, W., Tanaka, I. Structural studies of ribosomal RNA-protein complexes // Abstracts of the International conference in honour of Alexander Spirin "Protein synthesis", August 27 - September 1. - 2001. - Pushchino, Russia.-P.5.

26.Korepanov, A.P., Gongadze, G.M., Garber, M.B. General stress protein CTC of Bacillus subtiiis specifically binds to 5S rRNA // Abstracts of the International conference in honour of Alexander Spirin "Protein synthesis", August 27 - September 1. - 2001. - Pushchino, Russia. - P.65.

27.Meshcheryakov, V., Fedorov, R., Gongadze, G., Fomenkova, N., Mudrik, E., Serganov, A., Selmer, M., Al-Karadaghi, S., Jonsson, B.-H., Liljas, A., Nikonov, S., Garber, M. Crystallization and structural studies of ribosomal protein TL5 from Thermus thermophilus in complex with 5S rRNA fragments // Abstracts of the International conference "The ribosome. Structure, function, antibiotics and cellular interactions", June 13-17. - 1999. -Helsingor, Denmark. - P.64.

28.Garber, M., Davydova, N., Fedorov, R., Gongadze, G., Kalinin, A., Meshcheryakov, V., Moskalenko, S., Mudrik, E., Nevskaya, N., Nikonov, S., Nikulin, A., Perederina, A., Rak, A., Serganov, A., Shcherbakov, D., Tin, O., Tishchenko, S., Vassilieva, J., Kraft, A., Piendl, W., Ehresmann, C., Ehresmann, B., AlJard, P., Helgstrand, M., Hard, T. Ribosomal proteins: Crystallization, crystallographic and solution studies // Proceedings of the first international workshop on "Structure research of the ribosome and its functional complexes", September 9-11. - 1998. - Geesthacht, Germany.-P.47-51.

29.Gongadze, G.M., Mcshcheryakov, V.A., Perederina, A.A., Moskalenko, S.E., Davydova, N.L., Gryaznova, O.I., Rak, A.V., Shcherbakov, D.V., Fomenkova, N.P., Nikonov, S.V., Jonsson, B.-H., Liljas, A., Garber, M.B. 5S rRNA-binding proteins from Thermus thermophilus II Abstracts of the International conference "Thermophiles-98", September 611. - 1998. - Brest, France. - BM-P48.

30.Gongadze, G.M., Davydova, N.L., Gryaznova, O.I., Meshcheryakov, V.A., Perederina, A.A., Sedelnikova, S.E., Tishchenko, S.V., Liljas, A., Jonsson, B.-H., Garber, M.B. An unusual 5S rRNA binding ribosomal protein TL5 from Thermus thermophilus II Abstracts of the International conference "Thermophiles-96", September 4-9. - 1996. - Athens, USA. -P.265.

Заказ № 14-аЛ 1/10 Подписано в печать 02.11.2010 Тираж 130 экз. Усл. п.л. 2,5

ООО "Цифровичок", тел. (495) 649-83-30 www.cfr.ru; e-mail:info@cfr.ru

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Гонгадзе, Георгий Михайлович

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1. ОТКРЫТИЕ 5S РНК.

2. СТРУКТУРА РИБОСОМНОЙ 5S РНК.

2.1. Первичная структура 5S рРНК и ее эволюция.

2.2. Вторичная структура 5S рРНК или самосборка молекулы.

2.3. Пространственная структура изолированной 5S рРНК.

3. 5S рРНК И РИБОСОМНЫЕ БЕЛКИ.

3.1. Белки, специфически связывающиеся с изолированной 5S рРНК.

3.2. Взаимодействие 5S рРНК и белков в комплексе.

4. 5S рРНК В РИБОСОМЕ.

4.1. Положение 5S рРНК в рибосоме и участие в сборке 50S субчастицы.

4.2. 5S рРНК-белковый комплекс и функционирование рибосомы.

Введение Диссертация по биологии, на тему "5S pРНК-связывающие белки бактериальной рибосомы"

1. Рибосомные белки Thermus thermophilus, специфически связывающиеся с 5S рРНК.100

1.1. Рибосомные белки TL4, TL5 и TL18 Т. thermophilus образуют прочный комплекс с изолированной 5S рРНК.100

1.2. Белки TL4 (TthL5) и TL18 (TthL18) являются типичными представителями семейств 5S рРНК-связывающихся рибосомных белков L5 и L18, соответственно.104

1.3. Белок TL5 является не только гомологом рибосомного белка L25 Е. coli, но и основного стрессового белка СТС Bacillus subtilis.106

1.4. 5S рРНК-связывающий домен белка TL5.112

2. Формирование 5S рРНК-белкового комплекса Thermus thermophilus

114

2.1. Участок 5S рРНК, с которым взаимодействует белок TL5.114

2.2. Участки 5S рРНК, с которыми взаимодействуют белки TthL5 (TL4) и TthL 18 (TL18).117

3. Пространственная структура бактериального 5S рРНК-белкового комплекса.126

3.1. Подготовка к структурным исследованиям 5S рРНК-связывающих белков Т. thermophilus, а также их комплексов с рРНК.126

3.2. Структура белка TL5 в комплексе со специфическим фрагментом 5S рРНК.129

3.3. Структура белка TthL5 (TL4) в комплексе со специфическим фрагментом 5S рРНК.139

3.4. Структура белка TthL 18 (TL18).148

Заключение.152

4. 5S рРНК-связывающие белки семейства СТС — особенность аппарата трансляции бактерий.154

4.1. Структурная организация белков семейства СТС, их свойства и эволюция.154

4.2. 5S рРНК-узнающий модуль белка семейства СТС.165

5. Участие 5S рРНК-связывающих белков в формировании функционально-активной рибосомы Escherichia coli.172

5.1. Эффект нокаута генов 5S рРНК-связывающих рибосомных белков L5, LI8 или L25 на выживание клеток Е. coli.173

5.2. В отсутствие рибосомного белка L25 клетки Е. coli хотя и выживают, но растут значительно медленнее, чем в его присутствии.178

5.3. Структурные и функциональные свойства рибосом AL25 штамма.181

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.192

ВЫВОДЫ.194

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Гонгадзе, Георгий Михайлович

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В завершении этой главы хотелось бы подвести итоги проделанной работы. Нами идентифицированы три рибосомных 5S, рРНК-связывающих белка Т. thermophilus, TL4 (TthL5), TL5 и TL18 (TthL18). Два из них, TthL5 и TthL18, обнаруживают гомологов среди рибосомных белков, всех доменов жизни. Третий белок, TL5 Т. thermophilus, является представителем семейства СТС, которое объединяет только бактериальные белки. Используя результаты, полученные в настоящей работе, а также данные о расшифрованных бактериальных геномах, делается заключение о том, что подавляющее большинство бактерий содержит третий 5S рРНК-связывающий белок, белок семейства СТС. Все белки этого семейства, без исключения, содерж:ат так называемый «5S рРНК-связывающий» домен. Впервые продемонстрировано, что рибосомный белок L25 Е. coli и основной стрессовый белок СТС В. subtilis являются не только структурными, но и функциональными гомологами.

Установлено, что пять идентичных аминокислотных остатков в белках TL5 и L25 формируют их 5S рРНК-узнающий модуль, а учитывая строгую консервативность этих остатков в белках семейства СТС, предполагается, что такой модуль должен быть характерен для большинства из них. Единичные случаи одновременных природных изменений, произошедших в контактирующих областях белков СТС и 5S рРНК, можно считать примерами коэволюции структур этих двух молекул. В данной работе впервые определен сайт связывания рибосомного белка семейства L5 на молекуле 5S рРНК, им оказалась консервативная во всех доменах жизни и уникальная по структуре С-■ петля рибосомной 5S РНК. Сравнительный анализ структур бактериальных и архейных рибосомных белков семейства L5 и их комплексов с РНК позволяет заключить, что структуры этих белков и их контакты с 5S рРНК эволюционно консервативны. Обнаружено, что глобулярная часть пространственных структур рибосомных белков семейств L18 и S11 укладывается практически идентично, что может свидетельствовать об их родственном происхождении. В данной работе определена пространственная структура большей части 5S рРНК-белкового комплекса (более 80%) с высоким разрешением. Эти данные внесли существенный вклад в построение модели рибосомы, и является до сих пор востребованной в исследованиях детальной структурной организации бактериальной рибосомы, так как имеют наилучшее разрешение на сегодняшний день. Получены данные, которые позволили впервые оценить степень необходимости каждого из 5S рРНК-связывающих белков для формирования функционально-активной рибосомы и для выживания бактериальной клетки. Впервые показано, что рибосомные белки L5 и L18 строго необходимы для выживания клеток Е. coli, а белок L25, не являясь ' необходимым для выживания клеток, оказывается чрезвычайно важен для стабилизации структуры центрального протуберанца 50S субчастицы бактериальной рибосомы. Большинство полученных в работе данных имеют приоритетный характер и вносят значительный вклад в понимание тонкой структурной организации бактериальной рибосомы.

Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Гонгадзе, Георгий Михайлович, Пущино

1. Богатырева, С. А., Трифонов, А.С. & Спирин, А.С. Зависимость бесклеточной системы синтеза полифенилаланина от соотношений двувалентных и одновалентных катионов // Докл. АН СССР. — 1970. -Т.195. С.213-216.

2. Богданов, А. А., Лаврик, И. Н., Докудовская, С. С. & Донцова, О. А. Структура и функция 5S рРНК в рибосоме // Мол. биология. 1995. -Т.29. - С.1218-1227.

3. Боуэн, Т. Введение в ультрацентрифугирование. М.: Мир, 1973. — 58-67 с.

4. Гаврилова, Л.П., Лерман, М.И. & Спирин, А.С. Структурные превращения рибосом // Изв. АН СССР, с. биология. 1966.№6. - С.826-831.

5. Гаврилова, Л. П. & Смолянинов, В. В. Изучение механизма транслокации в рибосомах. Синтез полифенилаланина в рибосомах Escherichia coli без участия гуанозин-5'-трифосфата и белковых факторов трансляции // Мол. биология. 1971.-Т.5.-С.883-891.

6. Гиршович, А. С., Поздняков, В. А. & Овчинников, Ю. А. О локализации ГТФ-связывающего центра при взаимодействии ГТФ с рибосомой и фактором элонгации G // Доклады АН ССР. 1974. - Т.219. --С.481-484.

7. Гонгадзе, Г. М. Исследование дефицитных по белкам рибосомных 50S субчастиц Escherichia coli. Роль белков и РНК в формировании рибосомной субчастицы: Дис. . канд. биол. наук. Пущино, 1986.

8. Лим, В. И. & Птицын, О. Б. Решеточная модель участков гидрофобного ядра белковой молекулы // Биофизика. 1972. - Т.17. - С.21-33.

9. Майметс, Т. О., Устав, М. Б., Виллемс, Р. Л., Саарма, М. Ю. & Линд, А. Я. Связывание белков 50S субчастицы рибосомь1 Escherichia coli с двумя фрагментами 5S РНК // Мол. биология. 1981. - Т.15. - С.569-574.

10. Остерман, Л. А. Методы исследования белков и нуклеиновых кислот. Электрофорез и ультрацентрифугирование. М.: Наука, 1981. - 223-239 с.

11. Седельникова, С. Э. Рибосомные белки Thermus thermophilics. Выделение, физико-химические свойства и кристаллизация: Дис. . канд. биол. наук. Пущино, 1991.

12. Спирин, А. С., Лерман, М. И., Гаврилова, JI. П., & Белицина, Н. В. Реконструкция биологически активных рибосом из обедненных белком рибонуклеопротеидных частиц и рибосомного белка // Биохимия. 1966. -Т.31.-424-430.

13. Спирин, А. С., Белицина, Н. В., Гал, Э. & Позднякова, Т. М. Самосборка рибосомо-подобных частиц из РНК и белка in vitro // Мол. биология. -1968. Т.2. - С.95-102.

14. Спирин, А. С. & Гаврилова, JI. П. Рибосома. М.: Наука, 1971.

15. Спирин, А. С. О структурных основах функционирования рибосом // Успехи современной биологии. 1974. - Т.77. - С.155-166.

16. Туманова, Л. Г., Гонгадзе, Г. М. & Гудков, А. Т. Выделение всех белков из 50S частиц рибосом Е. coli II Мол. биология. 1982. - Т. 16. - С.807-813.

17. Устав, М. Б., Ремме, Я. Л., Линд, А. Я. & Виллемс, Р. Л. Новый эффективный метод иммобилизации рибонуклеиновых кислот и нуклеотидов на агарозе // Биоорган, химия. 1979. - Т.5 - С.365-369.

18. Abdel-Meguid, S. S., Moore, Р. В. & Steitz, Т. A. Crystallization of а ribonuclease-resistant fragment of Escherichia coli 5S ribosomal RNA and its complex with protein L25 // J. Mol. Biol. 1983 - V.171. - P.207-215.

19. Abdurashidova, G.G., Tsvetkova, E.A. & Budowsky, E.I. Direct tRNA-protein interactions in ribosomal complexes // Nucl. Acids Res. 1991. - V.19. -P.1909-1915.

20. Agafonov, D. E., Kolb, V. A. & Spirin, A. S. Ribosome-associated protein that inhibits translation at the aminoacyl-tRNA binding stage // EMBO Rep. 2001. — V.2, - P.399-402.

21. Altschul, S. F., Madden, T. L„ Schaffer, A. A., Zhang, J., Zhang, Z., Miller, W. & Lipman, D. J. Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs // Nucl. Acids Res. 1997 - V.25. - P.3389-3402.

22. Aoyama, K., Tanaka, T., Hidaka, S. & Ishikawa, K. Binding sites of rat liver 5S RNA to ribosomal protein L5 // J. Biochem. 1984.- V.95. - P.l 179-1185.

23. Apgar, J., Everett, G. A. & Holley, R. W. Analyses of large oligonucleotide fragments obtained from a yeast alanine transfer ribonucleic acid by partial digestion with ribonuclease T1 // J. Biol. Chem. 1966.- V.241. - P. 1206-1211.

24. Arndt, E., Scholzen, T., Kromer, W., Hatakeyama, T. & Kimura, M. Primary structures of ribosomal proteins from the archaebacterium Halobacterium marismortui and the eubacterium Bacillus stearothermophilus // Biochimie. -1991. -V.73. -P.657-668.

25. Aubert, M., Bellemare, G. & Monier, R. Selective reaction of glyoxal with guanine residues in native and denatured Escherichia coli 5S RNA // Biochimie. 1973.— V.55. —P.135-142.

26. Avadhani, N. G. & Buetow, D. E. A proposed role for 5S ribosomal RNA // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1973. - V.50. - P.443-451.

27. Azad, A. A. & Lane, B. G. A possible role for 5S rRNA as a bridge between ribosomal subunits // Can. J. Biochem. 1973. - V.51. - P. 1669-1672.

28. Azad, A. A. Hybridization between 5S rRNA and 18S rRNA from barley embryos and mouse sarcoma 180 ascites cells // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1978.- V.83.-P.259-265.

29. Baca, O. G., Rohrbach, M. S. & Bodley, J. W. Equilibrium measurements of the interactions of guanine nucleotides with Escherichia coli elongation factor G and the ribosome // Biochemistry. 1976. - V.15. - P.4570-4580.

30. Bachmann, B. J. Pedigrees of some mutant strains of Escherichia coli K-12 // Bacteriol. Rev. 1972. - V.36. - P.525-557.

31. Bachvaroff, R. J. & Tongur, V. 5S ribonucleic acid in ribosomes from mammalian tissues // Nature. 1966. - V.211. - P.248-250.

32. Baer, R. J. & Dubin, D. T. The sequence of a possible 5S RNA-equivalent in hamster mitochondria // Nucl. Acids Res. 1980- V.8. - P.3603-3610.

33. Ban, N., Nissen, P., Hansen, J., Moore, P. B. & Steitz, T. A. The complete atomic structure of the large ribosomal subunit at 2.4 Ä resolution // Science. -2000. V.289. - P.905-920.

34. Bartetzko, A. & Nierhaus, K. H. Mg2+/NH4+/Polyamine system for polyuridine-dependent polyphenylalanine synthesis with near in vivo characteristics // Methods Enzymol. 1988. - V. 164. -P.650-658.

35. Bear, D. G., Schleich, T., Noller, H. F. & Garrett, R. A. Alteration of 5S RNA conformation by ribosomal proteins LI8 and L25 // Nucl. Acids Res. 1977 -V.4.-P.2511-2526.

36. Bellemare, G., Jordan, B. R. & Monier, R. Demonstration of a highly exposed region in Escherichia coli 5 s RNA by partial hydrolysis with ribonuclease IV and sheep kidney nuclease//J. Mol. Biol. 1972.-V.71. - P.307-315.

37. Bellemare, G., Vigne, R. & Jordan, B. R. Interaction between Escherichia coli ribosomal proteins and 5S RNA molecules: recognition of prokaryotic 5S RNAs and rejection of eukaryotic 5S RNAs // Biochimie. 1973. - V.55. - P.29-35.

38. Benson, D. A., Karsch-Mizrachi, I., Lipman, D. J., Ostell, J. & Wheeler, D. L. GenBank //Nucl. Acids Res. 2008. - Y.36. - P.25-30.

39. Bitar, K. G. & Wittmann-Liebold, B. The primary structure of the 5s rRNA binding protein L25 of Escherichia coli ribosomes // Hoppe Seylers Z Physiol Chem. 1975. - V.356. -P.1343-1352.

40. Blobel, G. Isolation of a 5S RNA-protein complex from mammalian ribosomes // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 1971. - V.68. -P.1881-1885.

41. Boedtker, H. & Kelling, D. G. The ordered structure of 5S RNA // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1967. - V.29. - P.758-766.

42. Bogdanov, A. A., Dontsova, O. A., Dokudovskaya, S. S. & Lavrik, I. N. Structure and function of 5S rRNA in the ribosome // Biochem. Cell Biol. -1995. V.73. - P.869-876.

43. Bosch, L., Bloemendal, H. & Sluyser, M. Metabolic interrelationships between soluble and microsomal RNA in rat-liver cytoplasm // Biochim. Biophys. Acta. 1959. - V.34. - P.272-274.

44. Boublik, M., Hellmann, W. & Roth, H. E. Localization of ribosomal proteins L7/L12 in the 50S subunit of Escherichia coli ribosomes by electron microscopy // J. Mol. Biol. 1976. - V.107. -P.479-490.

45. Boublik, M. & Hellmann, W. Comparison of Artemia salina and Escherichia coli ribosome structure by electron microscopy // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. — 1978. V.75. - P.2829-2833.

46. Bradford, M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding // Anal. Biochem. 1976. - V.72. - P.248-254.

47. Brosius, J., Schitz, E. & Chen, R. The primary structure of the 5S RNA binding protein LI8 from Escherichia coli ribosomes // FEBS Lett. 1975. - V.56. -P.359-361.

48. Brown, D. D., Wensink, P. C. & Jordan, E. A comparison of the ribosomal DNA's of Xenopus laevis and Xenopus mulleri: the evolution of tandem genes // J. Mol. Biol. 1972. - V.63. - P.57-73.

49. Brownlee, G. G. & Sanger, F. Nucleotide sequences from the low molecular weight ribosomal RNA of E. coli II J. Mol. Biol. 1967 - V.23, - P.337-353.

50. Brownlee, G. G., Sanger, F. & Barrell. B. G. Nucleotide sequences of 5S-ribosomal RNA from Escherichia coli II Nature. 1967. - V.215. - P.735-736.

51. Brownlee, G. G., Sanger, F. & Barrell. B. G. The sequence of 5S ribosomal ribonucleic acid // J. Mol. Biol. 1968. - V.34. - P.379-412.

52. Brownlee, G. G., Cartwright, E., McShane, T. & Williamson, R. The nucleotide sequence of somatic 5S RNA from Xenopus laevis II FEBS Lett. 1972. - V.25. — P.8-12.

53. Bruenger, E., Kowalak, J. A., Kuchino, Y., McCloskey, J. A., Mizushima, H., Stetter, K. O. & Crain, P. F. 5S rRNA modification in the hyperthermophilic archaea Sulfolobus solfataricus and Pyrodictium occultum 11FASEB J. — 1993. — V.7. P.196-200.

54. Brunei, C., Romby, P., Westhof, E., Ehresmann, C. & Ehresmann, B. Three-dimensional model of Escherichia coli ribosomal 5 S RNA as deduced fromstructure probing in solution and computer modeling // J. Mol. Biol. 1991. -V.221. -P.293-308.

55. Burrell, H. R. & Horowitz, J. Affinity binding of Escherichia coli ribosomal proteins to immobilized RNA // FEBS Lett. 1975. - V.49. - P.306-309.

56. Burrell, H. R. & Horowitz, J. Binding of ribosomal proteins to RNA covalently coupled to agarose II Eur. J. Biochem. 1977. - V.75. - P.533-544.

57. Cannon, M., Krug, R. & Gilbert, W. The binding of S-RNA by Escherichia coli ribosomes // J. Mol. Biol. 1963. - V.7. - P.360-378.

58. Cannon, M. & Richards, E. G. Electrophoresis in Polyacrylamide gels of different "soluble" ribonucleic acid preparations from Escherichia coli II Biochem. J. 1967. - V.103. - P.23-25.

59. Cantor, C. R. Possible conformations of 5S ribosomal RNA // Nature, 1967. -V.216. -P.513-514.

60. Ceri, H. & Maeba, P. Y. Association of a ribonuclease with the 50S ribosomal subunit of Escherichia coli MRE 600 // Biochim. Biophys. Acta. 1973. -V.312. - P.337-348.

61. Chan, Y.-L., Lin, A., McNally, J. & Wool, I. G. The primary structure of rat ribosomal protein L5. A comparison of the sequence of amino acids in the proteins that interact with 5S rRNA II J. Biol. Chem. 1987. - V.62. - P.12879-12886.

62. Chan, Y.-L., Olvera, J., Paz, V. & Wool, I. G. The primary structure of rat ribosomal protein LI 1 // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1992. - V.185. -P.356-362.

63. Chen, R. & Ehrke, G. The primary structure of the 5 S RNA binding protein L5 of Escherichia coli ribosomes // FEBS Lett. 1976. - V.69. - P.240-245.

64. Chenna, R., Sugawara, H., Koike, T., Lopez, R., Gibson, T. J., Higgins, D. G. & Thompson, J. D. Multiple sequence alignment with the Clustal series of programs//Nucl. Acids Res. -2003. -V.31. -P.3497-3500.

65. Chen-Schmeisser, U. & Garrett, R. A. A new method for the isolation of a 5S RNA complex with proteins L5, LI8 and L25 from Escherichia coli ribosomes // FEBS Lett. 1977. - V.74. -P.287-291.

66. Chinali, G., Wolf, H. & Parmeggiani, A. Effect of kirromycin on elongation factor Tu. Location of the catalytic center for ribosome-elongation-factor-Tu GTPase activity on the elongation factor // Eur. J. Biochem. 1977. - V.75. -P.55-65.

67. Chladek, S. Possible relationship of peptidyl transferase binding sites, 5S RNA and peptidyl-tRNA // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1971. - V.45. -P.695-700.

68. Christiansen, J., Douthwaite, S. R., Christensen, A. & Garrett, R. A. Does unpaired adenosine-66 from helix II of Escherichia coli 5S RNA bind to protein L18? II EMBO J. 1985. - V.4. - P.1019-1024.

69. Christiansen, J. & Garrett, R. A. How do protein LI8 and 5S RNA interact? // Structure, Function, and Genetics of Ribosomes /Hardesty, B. & Kramer, G., eds./ New-York, Berlin, Heidelberg, London, Paris, Tokyo: Springer-Verlag. -1986. -P.253-269.

70. Clark, M. W., Leonard, K. & Lake, J. A. Ribosomal crystalline arrays of large subunits from Escherichia coli II Science. 1982. - V.216. - P.999-1001.

71. Claußen, M., Rudt, F. & Pieler, T. Functional modules in ribosomal protein L5 for ribonucleoprotein complex formation and nucleocytoplasmic transport // J. Biol. Chem. 1999. - V.274. - P.33951-33958.

72. Comb, D. G. & Katz, S. Studies on the biosynthesis and methylation of transfer RNA // J. Mol. Biol. 1964. - V.8. - P.790-800.

73. Comb, D. G., Sarkar, N., DeVallet, J. & Pinzino, C. J. Properties of transfer-like RNA associated with ribosomes // J. Mol. Biol. 1965. - V.12. - P.509-513.

74. Comb, D. G. & Sarkar, N. The binding of 5S ribosomal acid to ribosomal subunits // J. Mol. Biol. 1967. - V.25. - P.317-330.

75. Comb, D. G. & Zehavi-Williner, T. Isolation, purification and properties of 5S ribosomal RNA: a new species of cellular RNA // J. Mol. Biol. 1967. - V.23. -P.441-458.

76. Connors, P. G. & Beeman, W. W. Size and shape of 5S ribosomal RNA // J. Mol. Biol. 1972. - V.71. - P.31-37.

77. Correll, C. C., Freeborn, B., Moore, P. B. & Steitz, T. A. Metals, motifs,' and recognition in the crystal structure of a 5S rRNA domain // Cell. 1997. - V.91. -P.705-712.

78. Court, D. L., Sawitzke, J. A. & Thomason, L. C. Genetic engineering using homologous recombination // Annu. Rev. Genet. 2002. - V.36. - P.361-388.

79. Cunningham, R. S., Bönen, L., Doolittle, W. F., & Gray, M. W. Unique species of 5S, 18S, and 26S ribosomal RNA in wheat mitochondria // FEBS Lett. -1976.-V.69.-P.116-122.

80. Czernilofsky, A. P., Collatz, E. E., Stöffler, G. & Kuechler, E. Proteins at the tRNA binding sites of Escherichia coli ribosomes // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 1974.-V.71.-P.230-234.

81. Dabbs, E. R. Selection for Escherichia coli mutants with proteins missing from the ribosome // J. Bacteriol. 1979. - V.140. - P.734-737.

82. Dabbs, E. R., Ehrlich, R., Hasenbank, R., Schroeter, B.-H., Stöffler-Meilicke, M. & Stöffler, G. Mutants of Escherichia coli lacking ribosomal protein LI // J. Mol. Biol. 1981. — V.149. -P.553-578.

83. Dabbs, E. R., Hasenbank, R., Kastner, B., Rak, K.-H., Wartusch, B. & Stöffler, G. Immunological studies of Escherichia coli mutants lacking one or two ribosomal proteins // Mol. Gen. Genet. 1983. - V.192. - P.301-308.

84. Dabbs, E. R. Mutant studies on the prokaryotic ribosome // Structure, Function, and Genetics of Ribosomes /Hardesty, B. & Kramer, G., eds./ New-York, Berlin, London, Paris, Tokyo: Springer-Verlag. 1986. - P.733-748.

85. Dallas, A., Rycyna, R. & Moore, P. B. A proposal for the conformation of loop E in Escherichia coli 5S rRNA // Biochem. Cell Biol. 1995. - V.73. - P.887-897.

86. Dallas, A. & Moore, P. B. () The loop E-loop D region of Escherichia coli 5S rRNA: the solution structure reveals an unusual loop that may be important for binding ribosomal proteins // Structure. 1997. - V.5. - P.1639-1659.

87. Davanloo, P., Rosenberg, A. H., Dunn, J. J. Studier, F. W. Cloning and expression of the gene for bacteriophage T7 RNA polymerase // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 1984. - V.81. -P.2035-2039.

88. Davis, D. R. & Segal, D. M. Protein crystallization: micro techniques involving vapor diffusion // Methods Enzymol. 1971. - V.22. - P.266-269.

89. Decatur, W. A. & Schnare, M. N. Different mechanisms for pseudouridine formation in Yeast 5S and 5.8S rRNAs // Mol. Cell. Biol. 2008. - V.28. -P.3089-3100.

90. Deckman, I. C. & Draper, D. E. Specific interaction between ribosomal protein54 and the a operon messenger RNA // Biochemistry. 1985. - V.24. - P.7860-7865.

91. Delihas, N. & Andersen, J. Generalized structures of the 5S ribosomal RNAs // Nucl. Acids Res. 1982. - V.10. — P.7323-7344.

92. Delihas, N., Andersen, J. & Singhai, R. P. Structure, function and evolution of55 ribosomal RNAs // Progress in nucleic acid research and molecular biology

93. Cohn, W. E. & Moldave, K., eds/ New York: Academic Press. 1984. V.31. -P.161-190.

94. Deshmukh, M., Stark, J., Yeh, L.-C. C., Lee, J. C. & Woolford, Jr. J. L. Multiple regions of yeast ribosomal protein LI are important for its interaction with 5S rRNA and assembly into ribosomes // J. Biol. Chem. 1995. - V.270. -P.30148-30156.

95. De Vendittis, E., Masullo, M. & Bocchini, V. The elongation factor G carries a catalytic site for GTP hydrolysis, which is revealed by using 2-propanol in the absence of ribosomes //J. Biol. Chem. 1986. - V.261. - P.4445-4450.

96. De Wachter, R., Chen, M-W. & Vandenberghe, A. Equilibria in 5S ribosomal RNA secondary structure. Bulges and interior loops in 5S RNA secondary structure may serve as articulations for a flexible molecule // Eur. J. Biochem. -1984. V.143 -P.175-182.

97. Dohme, F. & Nierhaus, K. H. Total reconstitution and assembly of 50S subunits from Escherichia coll ribosomes in vitro II J. Mol. Biol. 1976a. - V.107. -P.585-599.

98. Dohme, F. & Nierhaus, K. H. Role of 5S RNA in assembly and function of the 50S subunit from Escherichia coli II Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1976b -V.73. - P.2221-2225.

99. Dokudovskaya, S., Dontsova, O., Shpanchenko, O., Bogdanov, A., & Brimacombe, R. Loop IV of 5 S ribosomal RNA has contacts both to domain II and to domain V of the 23 S RNA II RNA. 1996. - V.2. - P. 146-152.

100. Donis-Keller, H., Maxam, A. M. & Gilbert, W. Mapping adenines, guanines, and pyrimidines in RNA // Nucl. Acids Res. 1977. - V.8. - P.2527-2538.

101. Dontsova, O., Tishkov, V., Dokudovskaya, S., Bogdanov, A., Döring, T., RinkeAppel, J., Thamm, S., Greuer, B. & Brimacombe, R. Stem-loop IV of 5S rRNA lies close to the peptidyltransferase center // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 1994.- V.91. P.4125-4129.

102. Douthwaite, S., Garrett, R. A., Wagner, R. & Feunteun, J. A ribonuclease-resistant region of 5S RNA and its relation to the RNA binding sites of proteins L18 and L25 // Nucl. Acids Res. 1979. - V.6. - P.2453-2470.

103. Douthwaite, S. & Garrett, R. A. Secondary structure of prokaryotic 5S ribosomal ribonucleic acids: A study with ribonucleases // Biochemistry. 1981.1. V.20. — P.7301-7307.

104. Douthwaite, S., Christiansen, A. & Garrett, R. A. Binding sites of ribosomal proteins on prokaryotic 5S ribonucleic acids: a study with ribonucleases // Biochemistry. 1982. V.21. - P.2313-2320.

105. Dovgas, N.V., Markova, L.F., Mednikova, T.A., Vinokurov, L.M., Alakhov, Y.B. & Ovhinnikov, Y.A. The primary structure of the 5 S RNA binding protein L25 from Escherichia coli ribosomes // FEBS Lett. 1975. - V.53. - P.351-354.

106. Draper, D. E., Deckman, I. C. & Vartikar, J. V. Physical studies of ribosomal protein-RNA interactions // Methods Enzymol. 1988. - V.164. - P:203-220.

107. Duan, J., Cai, X., Zhou, L. & Wang, J. Single-step method of total RNA isolation by sodium dodecyl sulfate/phenol extraction from cultured cells // Anal. Biochem. 1997. - V.251. - P.291 -292.

108. Dube, S. K. Recognition of tRNA by the ribosome. A possible role of 5S RNA // FEBS Lett. 1973. - V.36. - P.39-42.

109. Du Buy, B. & Weissmans, S. M. Nucleotide sequence of Pseudomonas fluorescens 5 S ribonucleic acid // J. Biol. Chem. 1971. - V.246. - P.747-761.

110. Dyer, T. A. & Leech, R. M. Chloroplast and cytoplasmic low-molecular-weight ribonucleic acid components of the leaf of Viciafaba L // Biochem. J. 1968. -V. 106. - P.689-698.

111. Dyer, T. A. & Bowman, C. M. Nucleotide sequences of chloroplast 5S ribosomal ribonucleic acid in flowering plants // Biochem. J. 1979. V.183. -P.595-604.

112. Dyer, T. A. & Zalik, S. Analysis of a 5S RNA-protein complex isolated from the ribosomes of rye embryos // Can. J. Biochem. 1979. - V.57. - P. 1400-1406.

113. Elson, D. A ribonucleic acid particle released from ribosomes by salt // Biochim. Biophys. Acta. 1961. V.53. -P.232-234.

114. Erdmann, V. A., Doberer, H. G. & Sprinzl, M. Structure and function of 5S RNA: the role of the 3' terminus in 5S RNA function // Mol. Gen. Genet. -1971a. V.l 14. -P.89-94.

115. Erdmann, V. A., Fahnestock, S., Higo, K. & Nomura, M. Role of 5S RNA in the functions of 50S ribosomal subunits // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 1971b. -V.68. -P.2932-2936.

116. Erdmann, V. A., Sprinzl, M. & Pongs, O. The involvement of 5S RNA in the binding of tRNA to ribosomes // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1973. -V.54. - P.942-948.

117. Erdmann, V. A. Structure and function of 5S and 5.8S RNA // Progress in nucleic acid research and molecular biology /Cohn, W. E., ed./ New York: Academic Press. 1976. - V. 18. - P.45-90.

118. Erdmann, V. A., Huysmans, E. Vandenberghe, A. & De Wächter, R. Collection of published 5S and 5.8S ribosomal RNA sequences //. Nucl. Acids Res. 1983 -V.il.-P105-133.

119. Erdmann, V. A., Volters, J., Huysmans, E. & De Wächter, R. Collection of published 5S, 5.8S and 4.5S ribosomal RNA sequences // Nucl. Acids Res. -1985. V.13. -P.105-153.

120. Erdmann, V. A., & Volters, J. Collection of published 5S, 5.8S and 4.5S ribosomal RNA sequences //Nucl. Acids Res. 1986. - V.l 1. - PI-59.

121. Evstafieva, A. G., Shatsky, I. N., Bogdanov, A. A. Vasiliev, V. D. Topography of RNA in the ribosome: location of the 5S RNA residues A39 and U40 on the central protuberance of the 50S subunit // FEBS Lett. 1985. V.l 85. - P.57-62.

122. Fahnestock, S. R. & Nomura, M. Activity of ribosomes containing 5S RNA with a chemically modified 3'-terminus // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 1972. -V.69.-P.363-365.

123. Färber, N. M. & Cantor, C. R. Accessibility and structure of ribosomal RNA monitored by slow tritium exchange of ribosomes // J. Mol. Biol. 1981. V.146. - P.241-257.

124. Feunteun, J., Monier, R., Garrett, R., Le Bret, M. & Le Pecq, J. B. (1975) Effect of 50S subunit proteins L5, LI8 and L25 on the fluorescence of 5S RNA-bound ethidium bromide //. J. Mol. Biol., 93, 535-541.

125. Finkelstein, A.V., Kozitsyn, S.A. & Ptysyn O.B. Prediction of the three-dimensional structure for ribosomal protein L25 // FEBS Lett. 1975. V.60. -P.137-140.

126. Forget, B. G. & Weissman, S. M. Low molecular weight RNA components from KB cells // Nature. 1967a. - V.213. - P.878-882.

127. Forget, B. G. & Weissman, S. M. Nucleotide sequences of KB cell 5S RNA // Science. 1967b. -V. 158. - P. 1695-1699.

128. Forget, B. G. & Weissman, S. M. The nucleotide sequence of ribosomal 5S ribonucleic acid from KB cells // J. Biol. Chem. 1969. - V.244. P.3148-3165.

129. Fox, G. E. & Woese, C. R. 5S RNA secondary structure // Nature. 1975a. -V.256. - P.505-507.

130. Fox, G. E. & Woese, C. R. The architecture of 5S rRNA and its relation to function // J. Mol. Evol. 1975b. - V.6. - P.61-76.

131. Franceschi, F. J. & Nierhaus, K. H. Ribosomal proteins LI5 and LI6 are mere late assembly proteins of the large ribosomal subunit // J. Biol. Chem. 1990. -V.265. — P.16676-16682.

132. Fried, M. & Crothers, D. M. Equilibria and kinetics of lac repressor-operator interactions by polyacrylamide gel electrophoresis // Nucl. Acids Res. 1981. V.9. - P.6505-6525.

133. Galibert, F., Larsen, C.J., Lelong, J.C. & Boiron, M. RNA of low molecular weight in ribosomes of mammalian cells//Nature. 1965. - V.207. - P. 1039-1041.

134. Garner, M. M. & Revzin, A. A gel electrophoresis method for quantifying the binding of proteins to specific DNA regions: application to components of the

135. Escherichia coli lactose operon regulatory system // Nucl. Acids Res. 1981. V.9. - P.3047-3060.

136. Garrett, R.A. & Noller, H.F. Structures of complexes of 5S RNA with ribosomal proteins L5, LI8 and L25 from Escherichia coli: identification of kethoxal-reactive sites on the 5S RNA // J. Mol. Biol. 1979. V.132. - P.637-648.

137. Garrett, R.A., Douthwaite, S. & Noller, H.F. Structure and role of 5S RNA-protein complexes in protein biosynthesis // Trends Biochem. Sei. 1981. - V.6. - P. 137-139.

138. Garrett, R. A. & Olesen, S. O. Structure of eukaryotic 5S ribonucleic acid: A study of Saccharomyces cerevisiae 5S ribonucleic acid with ribonuclease // Biochemistry. 1982.- V.21.-P.4823-4830.

139. Gasteiger, E., Gattiker, A., Hoogland, C., Ivanyi, I., Appel, R. D. & Bairoch, A. ExPASy: the proteomics server for in-depth protein knowledge and analysis // Nucl. Acids Res., -2003. V.31.-P.3784-3788.

140. Gaunt-Klopfer, M. & Erdmann, V. A. ATPase and GTPase activities associated with the 5S RNA-protein complex of Escherichia coli ribosomes // Biochim. Biophys. Acta. 1975. - V.390. - P.226-230.

141. Gavrilova, L. P., Ivanov, D. A. & Spirin, A. S. Studies on the structure of ribosomes. III. Stepwise unfolding of the 50S particles without loss of protein // J. Mol. Biol. 1966. V.16. - P.473-489.

142. Geroch, M. E., Richards, E. G. & Davies, G. A. 5S RNA 1. Preparation and characterization of highly purified 5S RNA from Escherichia coli II Eur. J. Biochem. 1968. - V.6. - P.325-330.

143. Gesteland, R. F. Unfolding of Escherichia coli ribosomes by removal of magnesium//J. Mol. Biol. 1966. - V.18. - P.356-371.

144. Gewirth, D. T., Abo, S. R., Leontis, N. B. & Moore, P. B. Secondary structure of 5S RNA: NMR experiments on RNA molecules partially labeled with nitrogen-15 // Biochemistry. 1987. - V.26. - P.5213-5220.

145. Gewirth, D. & Moore, P. B. Exploration of the LI 8 binding site on 5S RNA by deletion mutagenesis //Nucl. Acids Res. 1988. -V. 16. - P. 10717-10732.

146. Geyl, D., Bock, A. & Isono, K. An improved method for two-dimentional gel-electrophoresis: analysis of mutationally altered ribosomal proteins of Escherichia coli II Mol. Gen. Genet. 1981. - V. 181 - P.309-312.

147. Girshovich, A. S., Pozdnyakov, V. A. & Ovchinnikov, Y. A. Localization of the GTP-binding site in the ribosome-elongation-factor-G-GTP complex // Eur. J. Biochem. 1976. - V.69. - P.321-328.

148. Göringer, H. U., Bertram, S. & Wagner, R. The effect of tRNA binding on the structure of 5S RNA in Escherichia coli. A chemical modification study // J. Biol. Chem. 1984. - V.259. -P.491-496.

149. Göringer, H. U. & Wagner, R. Construction and functional analysis of ribosomal 5S RNA from Escherichia coli with single base changes in the ribosomal protein binding sites // Biol. Chem. Hoppe-Seyler. 1986. - V.367. - P.769-780.

150. Gray, P. N. & Monier, R. Formation of a complex between 23S RNA, 5S RNA and proteins from Escherichia coli 50S ribosomal subunits II FEBS Lett. 1971. V.18. -P.145-148.

151. Gray, P.N., Garrett, R.A., Stöffler,- G. & Monier, R. An attempt at the identification of the proteins involved in the incorporation of 5S RNA during 50S ribosomal subunit assembly // Eur. J. Biochem. 1972. - V.28. - P.412-421.

152. Gray, P. N., Bellemare, G., Monier, R., Garrett, R. A. & Stöffler, G. Identification of the nucleotide sequences involved in the interaction between

153. Escherichia coli 5S RNA and specific 50S subunit proteins // J. Mol. Biol. -1973. — V.77. P.133-152.

154. Gregory, R.J., Cahill, P. B. F., Thurlow, D. L. & Zimmermann, R.A. Interaction of Escherichia coli ribosomal protein S8 with its binding sites in ribosomal RNA and messenger RNA // J. Mol. Biol. 1988. - V.204. - P.295-307.

155. Gross, B., Welfle, H. & Bielka, H. Protein-RNA interaction in the rat liver 5S rRNA-protein L5 complex studied by digestion with ribonucleases // Nucl. Acids Res. 1985. - V.13. - P.2325-2335.

156. Grummt, F., Grummt, I. & Erdmann, V.A. ATPase and GTPase activities isolated from rat liver ribosomes // Eur. J. Biochem. 1974. - V.43. - P.343-348.

157. Grüne, M., Görlach, M., Soskic, V., Klussman, S., Bald, R., Fürste, J.P., Erdmann, V.A. Brown, L. R. Initial analysis of 750 MHz NMR spectra of selectively 15N-G, U labeled E. coli 5S rRNA // FEBS Lett. 1996. - V.385. - P. 114-118.

158. Grüne, M., Fürste, J.P., Klussman, S., Erdmann, V.A. Brown, L.R. Detection of multiple conformations of the E-domain of 5S rRNA from Escherichia coli in solution and in crystals by NMR spectroscopy // Nucl. Acids Res. 1996. -V.24. — P.2592-2596.

159. Gurevich, V. V., Pokrovskaya, I. D., Obukhova, T. A. & Zozulya, S. A. Preparative in vitro mRNA synthesis using SP6 and T7 RNA polymerases // Anal. Biochem. 1991. - V. 195. - P.207-213.

160. Guthrie, C., Nashimoto, H. & Nomura, M. Studies on the assembly of ribosomes in vivo II Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 1969. - V.34. - P.69-75.

161. Hancock, J. & Wagner, R. A structural model of 5S RNA from E. coli based on intramolecular crosslinking evidence // Nucl. Acids Res. 1982. - V.10. -P.1257-1269.

162. Hardy, S. J. S., Kurland, C. G., Voynow, P. & Mora, G. The ribosomal proteins of Escherichia coli. I. Purification of the 30S ribosomal proteins // Biochemistry. 1969. - V.8. - P.2897-2905.

163. Hardy, S. J. S. The stoichiometry of the ribosomal proteins of Escherichia coli H Mol. Gen. Genet. 1975. - V. 140. -P.253-274.

164. Harms, J., Schluenzen, F., Zarivach, R., Bashan, A., Gat, S., Agmon, I., Bartels, H., Franceschi, F. & Yonath A. High resolution structure of the large ribosomal subunit from a mesophilic eubacterium // Cell. 2001. - V.107. - P.679-688.

165. Harrison, L. C. & Itin, A. Purification of the insulin receptor from human placenta by chromatography on immobilized wheat germ lectin and receptor antibody//J. Biol. Chem. 1980. -V.255. - P. 12066-12072.

166. Hatakeyama, T. & Hatakeyama, T. Amino acid sequences of the ribosomal proteins HL30 and HmaL5 from the archaebacterium Halobacterium marismortui 1/ Biochim. Biophys. Acta. 1990. - V.1039. - P.343-347.

167. Hayes, F. & Hayes, D. H. Biosynthesis of ribosomes in E. coli. Properties of ribosomal precursor particles and their RNA components // Biochimie. — 1971. — V.53. -P.369-382.

168. Hay ward, G. S. Gel electrophoretic separation of the complementary strands of bacteriophage DNA // Virology. 1972. - V.49. - P.342-344.

169. Hecht, L. I., Stephenson, M. L. & Zamecnik, P. C. Binding of amino acids to the end group of a soluble ribonucleic acid 11 Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1959. -V.45. — P.505-518.

170. Hecker, M., Heim, C., Volker, U. & Wolfel, L. Induction of stress proteins by sodium chloride treatment in Bacillus subtilis 11 Arch. Microbiol. 1988. -V. 150. — P.564-566.

171. Hecker, M. & Volker, U. General stress proteins in Bacillus subtilis II FEMS Microbiol. Ecol. 1990. - V.74. - P.197-214.

172. Herr, W. & Noller, H. F. Protection of specific sites in 23S and 5S RNA from chemical modification by association of 30S and 50S ribosomes // J. Mol. Biol. 1979. - V.130. — P.421-432.

173. Herr, W., Chapman, N. M. & Noller, H. F. Mechanism of ribosomal subunit association: discrimination of specific sites in 16S RNA essential for association activity // J. Mol. Biol. 1979. - Y.130. - P.433-449.

174. Hill, W. E., Rossetti, G. P. & Van Holde, K. E. Physical studies of ribosomes from Escherichia coli // J. Mol. Biol. 1969. - V.44. - P.263-277.

175. Hoagland, M. B., Zamecnik, P. C. & Stephenson, M. L. Intermediate reactions in protein biosynthesis // Biochim. Biophys. Acta. 1957. - V.24. - P.215-216.

176. Hoagland, M. B. & Comly, L. T. Interaction of soluble ribonucleic acid and microsomes // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1960. -V.46. - P. 1554-1563.

177. Holley, R.W., Everett, G.A., Madison, J.T. & Zamir, A. Nucleotide sequences in the yeast alanine transfer ribonucleic acid // J. Biol. Chem. 1965. - V.240. -P.2122-2128.

178. Holmquist, R., Cantor, C. & Jukes, T. H. Improved procedures for comparing homologous sequences in molecules of proteins and nucleic acids // J. Mol. Biol. — 1972. V.64. -P.145-161.

179. Holmquist, R., Jukes, T. H. & Pangburn, S. Evolution of transfer RNA // J. Mol. Biol. 1973. - V.78. - P.91-116.

180. Holmquist, R. & Jukes, T. H. No evidence for a common evolutionary origin of 5S rRNA and tRNA // Nature New Biology. 1973. - V.245. - P. 127.

181. Hori, H. Evolution of 5S RNA // J. Mol. Evol. 1975. - V.7. - P.75-86.

182. Hori, H. Molecular evolution of 5S RNA // Mol. Gen. Genet. 1976. - V.145. -P.l 19-123.

183. Hori, H., Higo, K. & Osawa, S. The rates of evolution in some ribosomal components // J. Mol. Evol. 1977. - V.9. - P. 191-201.

184. Hori, H. & Osawa, S. Evolutionary change in 5S RNA secondary structure and a phylogenic tree of 54 5S RNA species // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1979. -V.76. -P.381-385.

185. Hori, H. & Osawa, S. Origin and evolution of organisms as deduced from 5S ribosomal RNA sequences // Mol. Biol. Evol. 1987. - V.4. - P.445-472.

186. Hörne, J. R. & Erdmann, V. A. Isolation and characterization of 5S RNA-protein complexes from Bacillus stearothermophilus and Escherichia coli ribosomes // Mol. Gen. Genet. 1972. - V.l 19. - P.337-344.

187. Hörne, J. R. & Erdmann, V. A. ATPase and GTPase activities associated with a specific 5S RNA-protein complex // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 1973. - V.70. -P.2870-2873.

188. Home, J.R. & Erdmann, V.A. Effects of ethanol, methanol and different antibiotics on the ATPase and GTPase activities associated with B. stearothermophilus 5S RNS-protein complex // FEBS Lett. 1974. - V.42. - P.42-45.

189. Huber, P. W. & Wool, I. G. Use of the cytotoxic nuclease a-sarcin to identify the binding site on eukaryotic 5S ribosomal ribonucleic acid for the ribosomal protein L5 //J. Biol. Chem. 1986. - V.261. -P.3002-3005.

190. Hultin, T. & Von Der Decker, A. The transfer of soluble polynucleotides to the ribonucleic acid of rat liver microsomes // Experimental Cell Res. 1959. -V.l6. -P.444-447.

191. Ikemura, T. & Dahlberg, J. E. Small Ribonucleic Acids of Escherichia coli. Characterization by Polyacrylamide gel electrophoresis and fingerprint analysis //J. Biol. Chem. 1973. - V.248. -P.5024-5032.

192. Inoue, H., Nojima, H. & Okayama, H. High efficiency transformation of Escherichia coli with plasmids // Gene. 1990. - V.96. - P.23-28,

193. Inoue-Yokosawa, N., Ishikawa, C. & Kaziro, Y. The role of guanosine triphosphate in translocation reaction catalyzed by elongation factor G // J. Biol. Chem. 1974. - V.249. - P.4321-4323.

194. Ivanov, Y. V., Grajevskaja, R. A. & Saminsky, E. M. On the mechanism of interaction of N-acetylphenylalanyl-tRNAphc with ribosomes of Escherichia coll Effect of antibiotics and ofTpYpCpGp // Eur. J. Biochem. 1981. - V.l 13. -P.457-461.

195. Jaenicke, L. A rapid micromethod for the determination of nitrogen and phosphate in biological material // Anal. Biochem. 1974. - V.61. - P.623-627.

196. Jahn, O., Hartmann, R. K., Boeckh, T. & Erdmann, V. A. Comparative analysis of ribosomal protein L5 sequences from bacteria of the genus Thermus II Biochimie. 1991. - V.73. -P.669-678.

197. Jordan, B. R. Studies on 5S RNA conformation by partial ribonuclease hydrolysis // J. Mol. Biol. 1971. - V.55. - P.423-439.

198. Jordan, B. R., Galling, G. & Jourdan, R. Sequence and conformation of 5S RNA from Chlorella cytoplasmic ribosomes: comparison with other 5S RNA molecules II J. Mol. Biol. 1974. - V.87. -P.205-225.

199. Kaltschmidt, E. & Wittmann, H. G. Ribosomal proteins. VII. Two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis for fingerprinting of ribosomal proteins // Anal. Biochem. 1970a. - V.36. - P.401-412.

200. Kaltschmidt, E. & Wittmann, H. G. Ribosomal proteins, XII. Number of proteins in small and large ribosomal subunits of Escherichia coli as determined by two-dimensional gel electrophoresis // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1970b.- V.67. — P. 1276-1282.

201. Kaziro, Y.} Inoie, N., Kuriki, Y., Mizumoto, K., Tanaka, M. & Kawakita, M. Purification and properties of factor G // Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol.- 1969. — V.34. P.385-393.

202. Kearns, D. R. & Wong, Y. P. Investigation of the secondary structure of Escherichia coli 5 S RNA by high-resolution nuclear magnetic resonance // J. Mol. Biol. 1974. - V.87. - P.755-774.

203. Kenmochi, N., Maeda, N. & Tanaka, T. The primary structure of chicken ribosomal protein L5 // Biochim. Biophys. Acta. 1991. - V.1088. - P.445-447.

204. Kim, J. K. & Wu, R. A rice (Oryza sativa L.) cDNA encodes a protein sequence homologous to the eukaryotic ribosomal 5S RNA-binding protein // Plant Mol. Biol. 1993.-V.23.-P.409-413.

205. Kime, M. J. & Moore, P. B. NMR evidence for the existence of two native conformations of 5S RNA // Nucl. Acids Res. 1982. - V. 10. - P.4973-4983.

206. Kime, M. J. & Moore, P. B. Physical evidence for a domain structure in Escherichia coli 5 S RNA // FEBS Lett. 1983a. - V. 153. - P. 199-203.

207. Kime, M. J. & Moore, P. B. Nuclear Overhauser experiments at 500 MHz on the downfield proton spectrum of a ribonuclease-resistant fragment of 5S ribonucleic acid //Biochemistry. 1983b. -V.22. -P.2615-2622.

208. Kime, M. J. & Moore, P. B. Escherichia coli ribosomal 5S RNA-protein L25 nucleoprotein complex: effect of RNA binding on the protein structure and the nature of the interaction // Biochemistry. 1984. - V.23. - P. 1688-1695.

209. Kimura, M. & Ohta, T. Eukaryotes-prokaryotes divergence estimated by 5S ribosomal RNA sequences // Nat. New Biol. 1973. - V.243. - P. 199-200.

210. Kimura, J. & Kimura, M. The complete amino acid sequences of the 5S rRNA binding proteins L5 and LI8 from the moderate thermophile Bacillus stearothermophilus ribosome // FEBS Lett. 1987. - V.210. - P.85-90.

211. Kirpekar, F., Douthwaite, S. & Roepstorff, P. Mapping posttranscriptional modifications in 5S ribosomal RNA by MALDI mass spectrometry // RNA. — 2000. V.6. - P.296-306.

212. Kischa, K., Möller, W. & Stöffler, G. Reconstitution of a GTPase activity by a 50S ribosomal protein from E. coli II Nat. New Biol. 1971. - V.233. - P.62-63.

213. Kjems, J., Olesen, O. & Garrett, R. A. Comparison of eubacterial and eukaryotic 5S RNA structures: a chemical modification study // Biochemistry. 1985. -V.24.-P.241-250.

214. Kloetzel, P.-M., Whitfield, W. & Sommerville, J. Analysis and reconstruction of an RNP particle which stores 5S RNA and tRNA in amphibian oocytes // Nucl. Acids Res. -1981.- V.9. P.605-621.

215. Kolb, V. A., Makeyev, E. V., Ward, W. W. & Spirin, A. S. Synthesis and maturation of green fluorescent protein in a cell-free translation system // Biotechnol. Lett. 1996. -V. 18. - P. 1447-1452.

216. Kolb, V. A., Makeyev, E. V. & Spirin, A. S. Co-translational folding of an eukaryotic multidomain protein in a prokaryotic translation system // J. Biol. Chem. 2000. - V.275. - P. 16597-16601.

217. Krassnigg, F., Erdmann, V. A. & Fasold, H. The synthesis of a photoreactive puromycin analogue and its application for labeling proteins in the 50S subunit of Escherichia coli ribosomes // Eur. J. Biochem. 1978. - V.87. - P.439-443.

218. Kraulis, P. J. ANSIG: a program for the assignment of protein 'H 2D NMR spectra by interactive graphics // J. Magn. Reson. 1989. - V.24. - P.627-633.

219. Kiintzel, H., Piechulla, B. & Hahn, U. Consensus structure and evolution of 5S rRNA // Nucl. Acids Res. 1983. - V.l 1. - P.893-900.

220. Laemmli, U. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 //Nature. 1970. - V.227. - P.680-685.

221. Lake, J. A. Ribosomal structure determined by electron microscopy of Escherichia coli small subunits, large subunits and monomeric ribosomes // J. Mol. Biol. 1976. - V.105. - P. 131-159.

222. Lake, J. A. & Strycharz, W. A. Ribosomal proteins LI, L17 and L27 from Escherichia coli localized at single sites on the large subunit by immune electron microscopy//J. Mol. Biol. 1981. - V. 153. -P.979-992.

223. Leaver, C. J. & Harmey, M. A. Higher-plant mitochondrial ribosomes contain a 5S ribosomal ribonucleic acid component // Biochem. J. 1976. - V.157. -P.275-277.

224. Lecompte, O., Ripp, R., Thierry, J.C., Moras, D., Poch, O. Comparative analysis of ribosomal proteins in complete genomes: an example of reductive evolution at the domain scale // Nucl. Acids Res. 2002. -V.30. - P.53 82-5390.

225. Lee, J. C. & Ingram, V. M. Reaction of 5S RNA with a radioactive carbodiimide // J. Mol. Biol. 1969. - V.41. - P.431 -441.

226. Lee, J. C., Turgeon, C. L. & Yeh, L.-C. C. The accessibility of yeast ribosomal protein L1 as probed by proteolysis and site-directed mutagenesis is different in intact 60 and 80 S ribosome // J. Biol. Chem. 1996. - V.271. - P.7429-7434.

227. Leer, R. J., vanRaamsdonk-Duin, M. M. C., Mager, W. H. & Planta, R. J. The primary structure of the gene encoding yeast ribosomal protein L16 // FEBS Lett. -1984. V. 175. - P.371 -376.

228. Leontis, N. B. & Moore, P. B. NMR evidence for dynamic secondary structure in helices II and III of the 5S RNA of Escherichia coli II Biochemistry. 1986a.- V.25.-P.3916-3925.

229. Leontis, N. B. & Moore, P. B. Imino proton exchange in the 5S RNA of Escherichia coli and its complex with protein L25 at 490 MHz // Biochemistry.- 1986b. — V.25. — P.5736-5744.

230. Lo, A. C. & Nazar, R. N. Accessibility of the 5S RNA in yeast ribosomes // J. Mol. Biol. 1982. - V.158. - P.559-565.

231. Lorenz, S., Perbandt, M., Lippmann, C., Moore, K., DeLucas, L. J., Betzel, C. & Erdmann, V. A. Crystallization of engineered Thermus flavus 5S rRNA under earth and microgravity conditions // Acta Crystallogr. 2000. - V.56. - P.498-500.

232. Lorenz, S., Betzel, C., Raderschall, E., Dauter, Z., Wilson, K. S. & Erdmann, V. A. Crystallization and preliminary diffraction studies of 5S rRNA from thermophilic bacterium Thermus flavus //J. Mol. Biol. 1991. -V.219. -P.339-402.

233. Lotti, M., Noah, M., Stoffler-Meilicke, M. & Stoffler, G. Localization of L4, L5, L20 and L25 on the ribosomal surface by immune-electron microscopy // Mol. Gen. Genet. 1989. - V.216. - P.245-253.

234. Lu, M. & Steitz, T. A. Structure of Escherichia coli ribosomal protein L25 complexed with a 5S rRNA fragment at 1.8-Ä resolution // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 2000. - V.97. - P.2023-2028.

235. Luehrsen, K. R. & Fox, G. E. Secondary structure of eukaryotic cytoplasmic 5S ribosomal RNA // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 1981. - V.78. - P.2150-2154.

236. Luoma, G. A. & Marshall, A. G. Lasar raman evidence for a new cloverleaf secondary structure for eukaryotic 5S RNA // J. Mol. Biol. 1978. - V.125. -P.95-105.

237. Lupski, J. R., Roth, J. R. & Weinstock, G. M. Chromosomal duplications in bacteria, fruit flies, and humans // Am. J. Hum. Genet. 1996. - V.58. - P.21-27.

238. Maassen, J. A. & Möller, W. Identification by photo-affmity labeling of the proteins in Escherichia coli ribosomes involved in elongation factor G-dependent GDP binding // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 1974. - V.71. - P.1277-1280.

239. Maat, J. & Smith, A. J. H. A method for sequencing restriction fragments with dideoxynucleoside triphosphates // Nucl. Acids Res. 1978. - V.5. - P.4537-4545.

240. MacDonell, M. T. & Colwell, R. R. Nuclease SI analisis of 5S rRNA secondary structure // J. Mol. Evol. 1985. - V.22. - P.237-242.

241. Madison, J. T. Primary structure of RNA // Annu. Rev. Biochem. 1968. -V.37. -P.131-148.

242. Marcot-Queiroz, J., Julien, J., Rosset, R. & Monier, R. Ribonucleic acids of yeast ribosomes//Bull. Soc. Chim. Biol. 1965.-V.47.-P.183-194.

243. Marquardt, O., Roth, H. E., Wystup, G. & Nierhaus, K. H. Binding of Escherichia coli ribosomal proteins to 23 S RNA under reconstitution conditions for the 50S subunit // Nucl. Acids Res. 1979. - V.6. - P.3641-3650.

244. Maxam, A. M. & Gilbert, W. A new method for sequencing DNA // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 1977. - V.74. - P.560-564.

245. McCarthy, B. J., Britten, R. J. & Roberts, R. B. The synthesis of ribosomes in E, coli. III. Synthesis of ribosomal RNA // Biophys. J. 1962. - V.2. - P.57-82.

246. McDougall, J. & Nazar, R. N. Accessibility of phosphodiester bonds in the yeast ribosomal 5S RNA protein complex // FEBS Lett. 1986. - V.209. - P.52-56.

247. McDougall, J. & Nazar, R. N. Evolutionary changes in the higher order structure of the ribosomal 5S RNA//Nucl. Acids Res. 1987. - V.15. -P.161-179.

248. McDougall, J. & Wittmann-Liebold, B. Comparative analysis of the protein components from 5S rRNA-protein complexes of halophilic archaebacteria // Eur. J. Biochem. 1994. - V.221. - P.779-785.

249. McPherson, A. Preparation and analysis of protein crystals. New York: John Wiley and Sons, Inc. 1982.

250. Merryman, C., Moazed, D., McWhirter, J. & Noller, H. F. Nucleotides in 16S rRNA protected by the association of 30S and 50S ribosomal subunits // J. Mol. Biol. 1999a. - V.285. -P.97-105.

251. Merryman, C., Moazed, D., Daubresse, G. & Noller, H. F. Nucleotides in 23S rRNA protected by the association of 30S and 50S ribosomal subunits // J. Mol. Biol. 1999b. - V.285. - P. 107-113.

252. Meselson, M., Nomura, M., Brenner, S., Davern, C. & Schlessinger, D. Conservation of ribosomes during bacterial growth // J. Mol. Biol. 1964. V.9. - P.696-711.

253. Metspalu, E., Ustav, M., Maimets, T. & Villems, R. The composition and properties of the Escherichia coli 5S RNA-protein complex // Eur. J. Biochem. -1982a.-V.121.-P.383-389.

254. Metspalu, E., Ustav, M. & Villems, R. The properties of the tRNA protein complex of the Escherichia coli ribosome. Interaction with tRNA, 5S RNA and 30-S ribosomal subunit // Eur. J. Biochem. 1982b. - V.124. - P.269-273.

255. Metspalu, E., Ustav, M. & Villems, R. 5S RNA-protein complex is involved in ribosomal subunit association//FEBS Lett. 1983. -V. 153. - P. 125-127.

256. Miall, S. H. & Walker, I. O. Structural studies on ribosomes. II. Denaturation and sedimentation of ribosomal sununits unfolded in EDTA // Biochim. Biophys. Acta. 1969.-V. 174.-P.551-560.

257. Michael, W. M. & Dreyfuss, G. Distinct domains in ribosomal protein L5 mediate 5S rRNA binding and nucleolar localization // J. Biol. Chem. — 1996. -V.271. — P. 11571-11574.

258. Miller, J. H. Experiments in molecular genetics. N.Y.: Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor. - 1972.

259. Milligan, J. F. & Uhlenbeck, O. C. Synthesis of small RNAs using T7 RNA polymerase //Methods Enzymol. 1989. - V. 180. -P.51-62.

260. Mirzabekov, A. D. & Griffin, B. E. 5S RNA conformation. Studies of its partial T1 ribonuclease digestion by gel electrophoresis and two-dimensional thin-layer chromatography // J. Mol. Biol. 1972. - V.72. - P.633-643.

261. Mitchell, P., Osswald, M. & Brimacombe, R. Identification of intermolecular RNA cross-links at the subunit interface of the Escherichia coli ribosome // Biochemistry. 1992. - V.31. -P.3004-3011.

262. Miyazaki, M. Studies on the nucleotide sequence of pseudouridine-containing 5S RNA from Saccharomyces cerevisiae II J. Biochem. 1974. -V.75. - P. 1407-1410.

263. Moazed, D., Stern S. & Noller, H.F. Rapid chemical probing of conformation in 16 S ribosomal RNA and 30S ribosomal subunits using primer extension // J. Mol. Biol. 1986. - V.187. -P.399-416.

264. Moazed, D. & Noller, H.F. Interaction of tRNA with 23S rRNA in the ribosomal A, P, and E sites II Cell. 1989. - V.57. - P.585-597.

265. Monier, R., Feunteun, J., Forget, B., Jordan, B., Reynier, M. & Varricchio, F. 5S RNA and the assembly of bacterial ribosomes // Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 1969. -V.34. - P. 139-148.

266. Monier, P. 5S RNA //. Ribosomes /Nomura, M., Tissieres, A. & Lengyel, P., eds./ New York: Cold Spring Harbor Laboratory. 1974. - P. 141-168.

267. Moore, P. B., Abo, S., Freeborn, B., Gewirth, D. T., Leontis, N. B. & Sun, G. Preparation of 5S RNA-related materials for nuclear magnetic resonance and crystallography studies //Methods Enzymol. 1988. - V.164. -P.158-174.

268. Morell, P. & Marmur, J. Association of 5S ribonucleic acid to 50S ribosomal subunits of Escherichia coli and Bacillus subtilis II Biochemistry. 1968. - V.7. — P.1141-1152.

269. Morikawa, K., Kawakami, M. & Takemura, S. Crystallization and preliminary X-ray diffraction study of 5S rRNA from Thermus thermophilus HB8 // FEBS Lett. 1982. - V.145. - P.194-196.

270. Morikawa, K., Fujiyoshi, Y., Ishizuka, K., Kawakami, M. & Takemura, S. Various types of 5S rRNA crystals as studied by X-ray diffraction and electron microscopy//Nucleic Acids Symp. Ser. 1984. - V.15. - P.143-146.

271. Mougel, M., Allmang, C., Eyermann, F., Cachia, C., Ehresmann, B. & Ehresmann, C. Minimal 16S rRNA binding site and role of conserved nucleotides in Escherichia coli ribosomal protein S8 recognition // Eur. J. Biochem. 1993. - V.215. -P.787-792.

272. Möller, W. The ribosomal components involved in EF-G- and EF-Tu-dependent GTP hydrolysis // Ribosomes /Nomura, M., Tissieres, A. & Lengyel, P., eds./ • New York: Cold Spring Harbor Laboratory. 1974. - P.711-731.

273. Möller, A., Wild, U., Riesner, D. & Gassen, H. G. Evidence from ultraviolet absorbance measurements for a codon-induced conformational change in lysine tRNA from Escherichia coli II Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 1979. - V.76. -P.3266-3270.

274. Mullins, D. W., Lacey, J. C. & Hearn, R. A. 5S rRNA and tRNA: Evidence for a common evolutionary origin // Nature New Biology. 1973. - V.242. - P.80-82.

275. Nathans, D. & Lipmann, F. Amino acid transfer from aminoacyl-ribonucleic acids to protein on ribosomes of Escherichia coli II Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1961. — V.47. - P.497-504.

276. Nazar, R. N. & Matheson, A. T. Nucleotide sequence of Thermus aquaticus ribosomal 5S ribonucleic acid//J. Biol. Chem. 1977. - V.252. -P.4256-4261.

277. Nazar, R. N. The ribosomal protein binding site in Saccharomyces cerevisiae ribosomal 5S RNA. A conserved protein binding site in 5S RNA // J. Biol. Chem. 1979. - V.254. - P.7724-7729.

278. Nazar, R. N., Willick, G. E. & Matheson, A. T. The 5S RNA-protein complex from an extreme halophile, Halobacterium cutirubrum. Studies on the RNA-protein interaction//J. Biol. Chem. 1979. - V.254. -P.1506-1512.

279. Nazar, R. N., Yaguchi, M., Willick, G. E., Rollin, C. F. & Roy, C. The 5S RNA binding protein from yeast {Saccharomyces cerevisiae) ribosomes. Evolution1 of the eukaryotic 5S RNA binding protein // Eur. J. Biochem. 1979. - V.102. -P.573-582.

280. Nazar, R. N., Yaguchi, M. & Willick, G. E. The 5S RNA-protein complex from yeast: a model for the evolution and structure of the eukaryotic ribosome // Can. J. Biochem. 1982. - V.60. - P.490-496.

281. Nazar, R. N. & Wildeman, A. G. Three helical domains form a protein binding site in the 5S RNA-protein complex from eukaryotic ribosomes // Nucl. Acids Res. 1983.-V.11.-P.3155-3168.

282. Nendza, R., Digweed, M., Meyer, H. E., Erdmann, V. A. & Mayr, G. W. 5S-rRNA-containing ribonucleoproteins from rabbit muscle and liver. Complex and partial primary structures // Eur. J. Biochem. 1987. - V.169. - P.85-95.

283. Newberry, V., Brosius, J. & Garrett, R. Fragment of protein LI8 from Escherichia coli ribosome that contains the 5 S RNA binding site // Nucl. Acids Res. 1978. - V.5. - P.1753-1766.

284. Newberry, V. & Garrett, R. A. The role of the basic N-terminal region of protein L18 in 5S RNA-23S RNA complex formation // Nucl. Acids Res. 1980. - V.8. -P.4131-4142.

285. Nicholson, A. W. & Cooperman, B. S. Photoaffmity labeling of Escherichia coli ribosomes with an aryl azide analogue of puromycin // FEBS Lett. 1978. -V.90. - P.203-208.

286. Nierhaus, K. H., Bordasch, K. & Homann, H. E. Ribosomal proteins XLIII. In vivo assembly of Escherichia coli ribosomal proteins // J. Mol. Biol. 1973. -V.74. -P.587-597.

287. Nierhaus, K. H. & Dohme, F. Total reconstitution of functionally active 50S ribosomal subunits from Escherichia coli II Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1974. -V.71.-P.4713-4717.

288. Nierhaus, К. H. & Dohme, F. Total reconstitution of 50S subunits from Escherichia coli ribosomes // Methods Enzymol. 1979. V.59. - P.443-449.

289. Nierhaus, К. H. The assembly of prokaryotic ribosomes // Biochimie. 1991. -V.73. - P.739-755.

290. Nishikawa, K. & Takemura, S. Structure and function of 5S ribosomal ribonucleic acid from Torulopsis unilis II J. Biochem. 1974. - V.76. - P.935-947.

291. Nissen, P., Ippolito, J. A., Ban, N., Moore, P. B. & Steitz, T. A. RNA tertiary interactions in the large ribosomal subunit: The A-minor motif // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2001. - V.98. - P.4899-4903.

292. Noller, H. F. & Herr, W. Accessibility of 5S RNA in 50S ribosomal subunits // J. Mol. Biol. 1974. - V.90. - P. 181 -184.

293. Nomura, M. & Erdmann, V. A. Reconstitution of 50S ribosomal subunits from dissociated molecular components // Nature. 1970. - V.228. - P.744-748.

294. Nygard, O. & Nilsson, L. The ribosomal binding site for eukaryotic elongation factor EF-2 contains 5S ribosomal RNA // Biochim. Biophys. Acta. 1987. -V.908. - P.46-53.

295. Ogata, K. & Nohara, H. The possible role of the ribonucleic acid (RNA) of the pH 5 enzyme in amino acid activation // Biochim. Biophys. Acta. 1957. -V.25. -P.659-660.

296. Ogata, K., Terao, K. & Uchiumi, T. Stimulation by aminoacyl-tRNA of the GTPase and ATPase activities of rat liver 5S RNA protein particles in the presence of EF-2 // J. Biochem. 1980. - V.87. - P.517-524.

297. Ohkubo, S., Muto, A., Kawauchi, Y., Yamao, F. & Osawa, S. The ribosomal protein gene cluster of Mycoplasma capricolum II Mol. Gen. Genet. 1987. -V.210.-P.314-322.

298. Olson, H. M., Nicholson, A. W., Cooperman, B. S. & Glitz, D. G. Localization of sites of photoaffinity labeling of the large subunit of Escherichia coliribosomes by arylazide derivative of puromycin // J. Biol. Chem. 1985. -V.260. - P.10326-10331.

299. Osawa, S., Otaka, E., Itoh, T. & Fukui, T. Biosynthesis of 50S ribosomal subunit in Escherichia coli H J. Mol. Biol. 1969. - V.40. - P.321-351.

300. Oshima, T. & Imahori, K. Description of Thermus thermophilus (Yoshida and Oshima) comb, nov., a nonsporulating thermophilic bacterium from a Japanese thermal spa II Inter. J. System. Bacteriol. 1974. - V.24. - P. 102-112.

301. Osswald, M., Döring, T. & Brimacombe, R. The ribosomal neighbourhood of the central fold of tRNA: cross-links from position 47 of tRNA located at the A, P or E site // Nucl. Acids Res. 1995. - V.23. - P.4635-4641.

302. Pace, B., Matthews, E. A., Johnson, K. D., Cantor, C. R. & Pace, N. R. Conserved 5S rRNA complement to tRNA is not required for protein synthesis // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 1982. - V.79. - P.36-40.

303. Parker, K. K. & Wickstrom, E. Crosslinking of Escherichia coli 50S ribosomal subunits with chlorambucilyl oligoprolyl phenylalanyl-tRNA molecular rules // Nucl. Acids Res. 1983.- V.ll.-P.515-524.

304. Payne, P. J. & Dyer, T. A. Characterization of cytoplasmic and chloroplast 5S ribosomal ribonucleic acid from broad-bean leaves // Biochem. J. 1971. — V.124. - P.83-89.

305. Peacock, A. & Dingman, W. Molecular weight estimation and separation of ribonucleic acid by electrophoresis in agarose-acrylamide composite gels // Biochemistry. 1968. - V.7. - P.668-674.

306. Peattie, D. A., Douthwaite, S., Garrett, R. A. & Noller, H. F. A "bulged" double helix in a RNA-protein contact site // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1981. -V.78. - P.7331-7335.

307. Perbandt, M., Nolte, A., Lorenz, S., Bald, R., Betzel, C., Erdmann, V. A. Crystal ctructure of domain E of Thermus flavus 5S rRNA: a helical RNA structure including a hairpin loop // FEBS Lett. 1998. - V.429. - P.211-215.

308. Petermann, M. L., Hamilton, M. G. & Pavlovec, A. A 5S ribonucleic acid-protein complex extracted from rat liver ribosomes by formamide // Biochemistry. 1972. - V.l 1. - P.2323-2326.

309. Picard, B. & Wegnez, M. Isolation of a 7S particle from Xenopus laevis oocytes: a 5S RNA-protein complex // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1979. - V.76. -P.241-245.

310. Pieler, T. & Erdmann, V. A. Three-dimentional structural model of eubacterial 5S RNA that has functional implications // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1982. - V.79; — P.4599-4603.

311. Pieler, T., Digweed, M., Bartsch, M. & Erdmann, V. A. Comparative structural analysis of cytoplasnic and chloroplastic 5S rRNA from spinach // Nucl. Acids Res. 1983.- V.11.-P.591-604.

312. Pieler, T. & Erdmann, V. A. Isolation and characterization of a 7 S RNP particle from matureXenopus laevis oocytes // FEBS Lett. 1983. - V.157. - P.283-283.

313. Pieler, T., Digweed, M. & Erdmann, V. A. RNA structural dynamics: Pre-melting and melting transitions in E. coli 5S rRNA // J. Biomol. Struct. & Dinam. 1985. - V.3. -P.495-514.

314. Pichon, J., Marvaldi, J. & Marchis-Mouren, G. The in vivo order of protein addition in the course of Escherichia coli 30S and 50S subunit biogenesis // J. Mol. Biol. 1975. - V.96. - P.125-137.

315. Pipas, J. M. & McMahon, J. E. Method for predicting RNA secondary structure // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1975. - V.72. - P.2017-2021.

316. Poupon, A. & Mornon, J.-P. Predicting the protein folding nucleus from a sequence // FEBS Lett. 1999. - V.452. - P.283-289.

317. Puglisi, J. D. & Wyatt, J. R. Biochemical and NMR studies of RNA conformation with an emphasis on RNA pseudoknots // Methods Enzymol. -1995. V.261. - P.323-350.

318. Raacke, I. D. 'Cloverleaf conformation for 5S RNAs // Biochem. Biophys. Res. Commun. — 1968. V.31. - P.528-533.

319. Raacke, I. D. A model for protein synthesis involving the intermediate formation of peptidyl-5S RNA //Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1971. - V.68. -P.2357-2360.

320. RajBhakdary, U. L. & Chang, S. H. Studies on polynucleotides LXXXII. Yeast phenylalanine transfer ribonucleic acid: partial digestion with ribonuclease T1 and derivation of the total primary structure // J. Biol. Chem. 1968. - V.243. -P.598-608.

321. Ramaley, R. F. & Hixton, J. Isolation of a nonpigmented, thermophilic bacterium similar to Thermus aquaticus II J. Bacteriol. 1970. - V.103, -P.527-528.

322. Reich, P. R, Forget, B. G. & Weissman, S. M. RNA of low molecular weight in KB cells infected with adenovirus type 2 // J. Mol. Biol. 1966. - V.17. - P.428-439.

323. Richards, E. G., Coll, J. A. & Gratzer, W. B. Disc electrophoresis of ribonucleic acid in polyacrylamide gels //Anal. Biochem. 1965. - V.12. -P.452-471.

324. Richter, D., Erdmann, V. A. & Sprinzl, M. Specific recognition of TpvFpCpGp loop (loop IV) of tRNA by ribosomal subunits from E. coli II Nuture New Biology. 1973. - V.246. - P.132-135.

325. Richter, D., Erdmann, V. A. & Sprinzl, M. A new transfer RNA fragment reaction: Tp^pCpGp bound to a ribosome-messenger RNA complex induces the synthesis of guanosine tetra- and pentaphosphates // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1974. — V.71. -P.3226-3229.

326. Romaniuk P. J., deStevenson, I. L., Ehresmann, C., Romby, P. & Ehresmann, B. A comparison of the solution structures and conformational properties of the somatic and oocyte 5S rRNA of Xenopus laevis II Nucl. Acids Res. 1988. -V. 16. — P.2295-2312.

327. Romby, P., Westhof, E., Toukifimpa, R., Mache, R., Ebel, J. P., Ehresmann, C. & Ehresmann, B. Higher order structure of chloroplastic 5S ribosomal RNA from spinach II Biochemistry. 1988. - V.27. - P.4721-4730.

328. Rosendahl, G., Andreasen, P. H. & Kristiansen, K. Structure and evolution of the Tetrahymena thermophila gene encoding ribosomal protein L21 // Gene. -1991. V.98. -P.161-167.

329. Rosset, R. & Monier, R. Apropos of the presence of low molecular weight RNA in the ribosomes of Escherichia coli II Biochim. Biophys. Acta. 1963. - V.68. -P.653-656.

330. Rosset, R., Monier, R. & Julien, J. Escherichia coli ribosomes. Demonstration of a ribosomal RNA of low molecular weight // Bull. Soc. Chim. Biol. 1964. -V.46. -P.87-109.

331. Roth, H. E. & Nierhaus, K. H. Structural and functional studies of ribonucleoprotein fragments isolated from Escherichia coli 50S ribosomal subunits // J. Mol. Biol. 1975. - V.94. - P. 111-121.

332. Röhl, R. & Nierhaus, K. H. Assembly map of the large subunit (50S) of Escherichia coli ribosomes 11 Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 1982. - V.79. -P.729-733.

333. Rubin, G. M. Preparation of RNA and Ribosomes from Yeast //. Methods in Cell Biology /Prescott, D. M., ed./ New York, San Francisco, London: Academic Press. 1975.- V.12. - P.45-64.

334. Sambrook, J., Fritsch, E. F. & Maniatis, T. Molecular cloning: A laboratory manual // Cold Spring Harbor, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press. 1989.

335. Sander, G., Marsh, R. C., & Parmeggiani, A. Isolation and characterization of two acidic proteins from the 50S subunit required for GTPase activity of both EF G and EF T // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1973. - V.47. - P.866-873.

336. Sander, G., Marsh, R. C., Voigt, J. & Parmeggiani, A. A comparative study of the 50S ribosomal subunit and several 50S subparticles in EF-Tu and EF-G-dependent activities // Biochemistry. - 1975. - V.14. - P.1805-1814.

337. Sanger, F., Nicklen, S. & Coulson, A. R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1977. - V.74. -P.5463-5467.

338. Sankoff, D., Morin, A-M. Cedergren, R. J. The evolution of 5S RNA secondary structures // Can. J. Biochem. 1975. - V.56. - P.440-443.

339. Sarkar, N. & Comb, D. Studies on the attachment and release of 5S ribosomal RNA from the large ribosomal subunit // J. Mol. Biol. 1969. - V.39. - P.31-44.

340. Schaffner, W. & Weissmann, C. A rapid, sensitive, and specific method for the determination of protein in dilute solution // Anal. Biochem. 1973. - V.56. -P.502-514.

341. Schagger, H. & von Jagow, G. Tricine-sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis for the separation of proteins in the range from 1 to 100 kDa // Anal. Biochem. 1987. - V. 166. - P.368-379.

342. Schrier, P. I., Maassen, J. A. & Moller, W. Involvement of 50S ribosomal proteins L6 and L10 in the ribosome dependent GTPase activity of elongation factor G // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1973. - V.53. - P.90-98.

343. Schuwirth, B. S., Borovinskaya, M. A., Hau, C. W., Zhang, W., Vila-Sanjurjo, A., Holton, J. M. & Cate, J. H. D. Structures of the bacterial ribosome at 3.5 A resolution // Science. 2005. - V.310. - P.827-834.

344. Schwarz, U., Liirmann, R. & Gassen, H. G. On the mRNA induced conformational change of AA-tRNA exposing the T-VP-C-G sequence for binding to the 50S ribosomal subunit // Biochem. Biophys. Res. Commun. -1974.-V.56.-P.807-814.

345. Schwarz, U., Menzel, H. M. & Gassen, H. G. Codon-dependent rearrangement of the three-dimentional structure of phenylalanine tRNA, exposing the T-^-C

346. G sequence for binding to the 50S ribosomal subunit // Biochemistry. 1976. -V.15. - P.2484-2490.

347. Scripture, J. B. & Huber, P. W. Analysis of the binding of Xenopus ribosomal protein L5 to oocyte 5 S rRNA // J. Biol. Chem. 1995. - V.270. - P.27358-27365.

348. Sedman, J., Maimets, T., Ustav, M. Villems, R. The interaction of 5S RNA and its large fragments with ribosomal proteins // FEBS Lett. 1981. - V. 136. -P.251-254.

349. Selmer, M., Dunham, C.M., Murphy F.V. IV, Weixlbaumer, A., Petry, S., Kelley, A.C., Weir, J.R. & Ramakrishnan, V. Structure of the 70S ribosome complexed with mRNA and tRNA // Science. 2006. - V.313. - P.1935-1942.

350. Sergiev, P., Dokudovskaya, S., Romanova, E., Topin, A., Bogdanov, A., Brimacombe, R., & Dontsova, O. The environment of 5S rRNA in the ribosome: cross-links to the GTPase-associated area of 23S rRNA // Nucl. Acids Res. -1998. V.26. - P.2519-2525.

351. Shakhnovich, E., Abkevich, V. & Ptitsyn, O. Conserved residues and the mechanism of protein folding // Nature. 1996. - V.379. - P.96-98.

352. Shatsky, I. N., Evstafieva, A. G., Bystrova, T. F., Bogdanov, A. A. & Vasiliev, V. D. Topography of RNA in the ribosome: location of the 3'-end of 5S RNA on the central protuberance of the 50S subunit//FEBS Lett. 1980. - V. 121. -P.97-100.

353. Shimizu, N., Hayashi, H. & Miura, K. Functional sites of transfer RNA for the binding to messenger RNA-ribosome complex // J. Biochem. -1970.—V.67.—P.373-387.

354. Shpanchenko, O. V., Zvereva, M. I., Dontsova, O. A., Nierhaus, K. H. & Bogdanov, A. A. 5S rRNA sugar-phosphate backbone protection in complex with specific ribosomal proteins II FEBS Lett. 1996. - V.394. - P.71-75.

355. Siddiqui, M. A. Q. & Hosokawa, K. Role of 5S ribosomal RNA in polypeptide synthesis. II. Dissociation of 5S ribosomal RNA from 50S ribosomes in Escherichia coli II Biochem. Biophys. Res. Commun. 1968. - V.32. - P. 1-8.

356. Siddiqui, M. A. Q. & Hosokawa, K. Role of 5S ribosomal RNA in polypeptide synthesis // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1969. - V.36. - P.711-720.

357. Siegrist, S., Moreau, N. & le Goffic, F. About the specificity of photoinduced affinity labeling of Escherichia coli ribosomes by dihydrorosaramicin, a macrolide related to erythromycin//Eur. J. Biochem. 1985.-V. 153.-P. 131-135.

358. Singhai, R. P. & Shaw, J. K. Prokaryotic and eukaryotic 5S RNAs: primary sequences and proposed secondary structures // Progress in nucleic acid research and molecular biology /Cohn, W. E., ed./ New York: Academic Press. — 1983. -V.28. P.177-209.

359. Smith, K. C. Studies on the amino acid acceptor RNA in washed liver microsomes // Biochemistry. 1962. - V. 1. - P.866-874.

360. Smith, N., Matheson, A. T, Yaguchi, M., Willick, G. E. & Nazar, R. N. The 5S RNA-protein complex from an extreme halophile, Halobacterium cutirubrum. Purification and characterization // Eur. J. Biochem. 1978. - V.89. -P.501-509.

361. Specht, T., Wolters, J. & Erdmann, V. A. Compilation of 5S rRNA and 5S rRNA gene sequences // Nucl. Acids Res. 1991. - V. 19. - P.2189-2191.

362. Speek, M. & Lind, A. Structural analyses of E.coli 5S RNA fragments, their associates and complexes with proteins LI8 and L25 // Nucl. Acids Res. 1982. - V.10. - P.947-965.

363. Spencer, D. F., Bönen, L. & Gray, M. W. Primary sequence of wheat mitochondrial 5S ribosomal ribonucleic acid: functional and evolutionary implications // Biochemistry. 1981. - V.20. - P.4022-4029.

364. Spierer, P. & Zimmermann, R. A. RNA-protein interactions in the ribosome. VIII. Co-operative interactions in the 50S subunit of Escherichia coli II J. Mol. Biol. 1976. - V.103. -P.647-653.

365. Spierer, P., Bogdanov, A. A. & Zimmermann, R. A. Parameters for the interaction of ribosomal proteins L5, LI8 and L25 with 5S RNA from Escherichia coli II Biochemistry. 1978. -W.U.- P.5394-5398.

366. Spierer, P. & Zimmermann, R. A. Stoichiometry, cooperativity, and stability of interactions between 5S RNA and proteins L5, LI8, and L25 from the ribosomal subunit of Escherichia coli II Biochemistry. 1978. - V. 17. - P.2474-2479.

367. Spierer, P., Wang, C.-C., Marsh, T. L. & Zimmermann, R. A. Cooperative interactions among protein and RNA components of the 5OS ribosomal subunit of Escherichia coli //Nucl. Acids Res. 1979. - V.6. - P. 1669-1682.

368. Spirin, A. S., Belitsina, N. V. & Lerman, M. L. Use of formaldehyde fixation for studies of ribonucleoprotein particles by caesium chloride density-gradient centrifugation II J. Mol. Biol. 1965. - V. 14. - P.611-615.

369. Sprinzl, M., Wagner, T., Lorenz, S. & Erdmann, V. A. Regions of tRNA important for binding to the ribosomal A and P sites // Biochemistry. 1976. -V.15. -P.3031-3039.

370. Staehelin, T., Maglott, D. M. & Monro, R. E. On the catalytic center of peptidyl transfer: a part of the 50 S ribosome structure II Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 1969. - V.34. - P.39-48.

371. Stahl, D. A., Luehrsent, K. R., Woese, C. R. & Pace, N. R. An unusual 5S rRNA, from Sulfolobus acidocaldarius, and its implications for a general 5S rRNA structure // Nucl. Acids Res. 1981. - V.9. - P.6129-6137.

372. Steitz, J. A., Berg, C., Hendrick, J. E., La Branche-Chabot, H., Metspalu, A., Rinke, J. & Yario, T. A 5S rRNA/L5 complex is a precursor to ribosome assembly in mammalian cells // J. Cell Biology. -1988. V. 106. -P.545-556.

373. Stern S., Moazed, D. & Noller, H.F. Structural analysis of RNA using chemical and enzymatic probing monitored by primer extension // Methods Enzymol. -1988. V.164. -P.481-489.

374. Stöffler-Meilicke, M., Stöffler, G., Odom, O. W., Zinn, A., Kramer, G. & Hardesty, B. Localization of 3' ends of 5S and 23 S rRNAs in reconstituted subunits of Escherichia coli ribosomes // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. — 1981. — V.78. P.5538-5542.

375. Stoldt, M., Wöhnert, J., 0hlenschläger,0., Görlach, M.& Brown, L.R. The NMR structure of the 5S rRNA E-domain-protein L25 complex shows preformed and induced recognition // EMBO J. 1999. - V. 18. - P.6508-6521.

376. Stöffler-Meilicke, M„ Noah, M. & Stöffler, G. Location of eight ribosomal proteins on the surface of the 50S subunit from Escherichia coli II Proc. Natl. Acad. Sei. USA. -1983. V.80. - P.6780-6784.

377. Stöffler, G. & Stöffler-Meilicke, M. () Immunoelectron microscopy of ribosomes // Annual review of biophysics and bioengineering /Engelman, D. M., Cantor, C. R., Pollard, T. D. eds/ Palo Alto, California: Annual reviews inc. -1984. V.13. - P.303-330.

378. Strycharz, W. A., Nomura, M. & Lake, J. A. Ribosomal proteins L7/L12 localized a single region of the large subunit by immune electron microscopy // J. Mol. Biol. 1978. - V.126. - P.123-140.

379. Studier, F. W., Rosenberg, A. H., Dunn, J. J. & Dubendorff, J. W. Use of T7 RNA polymerase to direct expression of cloned genes // Methods Enzymol. -1990. V.185. -P.60-89.

380. Szymanski, M., Barciszewska, M. Z., Barciszewski, J. & Erdmann, V. A. 5S ribosomal RNA database Y2K // Nucl. Acids Res. 2000. - V.28. - P. 166-167.

381. Szymanski, M., Barciszewska, M. Z., Erdmann, V. A. & Barciszewski, J. 5S ribosomal RNA database // Nucl. Acids Res. 2002. - V.30. - P. 176-178.

382. Szymkowiak, C. & Wagner, R. Analysis of a sequence region of 5S RNA from E coli cross-linked in situ to the ribosomal protein L25 // Nucl. Acids Res. -1985. V.13. - P.3953-3968.

383. Takanami, M. Transfer of amino acids from soluble ribonucleic acid to ribosome. II Trasfer of soluble ribonucleic acid to ribosome // Biochim. Biophys. Acta. 1962.- V.55.-P.132-138.

384. Tamura, S., Kuwano, Y., Nakayama, T., Tanaka, S., Tanaka, T. & Ogata, K. Molecular cloning and nucleotide sequence of cDNA specific for rat ribosomal protein L5 // Eur. J. Biochem. 1987. - V. 168. - P.83-87.

385. Tang, B. & Nazar, R. N. Structure of the yeast ribosomal 5S RNA-binding protein YL3 // J. Biol. Chem. 1991. - V.266. - P.6120-6123.

386. Terao, K., Takahashi, Y. & Ogata, K. Differences between the protein moieties of active subunits and EDTA-treated subunits of rat liver ribosomes with specific references to a 5S rRNA-protein complex // Biochim. Biophys. Acta. -1975.-V.402.-P.230-237.

387. Trakhanov, S. D., Yusupov, M. M., Agalarov, S. C., Garber, M. B., Ryazantsev, S. N., Tischenko, S. V. & Shirokov, V. A. Crystallization of 70S ribosomes and 30S ribosomal subunits from Thermus thermophilics II FEBS Lett. 1987. -V.220. - P.319-322.

388. Trakhanov, S., Yusupov, M., Shirokov, V., Garber, M. B., Mitschler, A., Ruff, M., Thierry, J.-C. Moras, D. Preliminary X-ray investigation of 70S ribosomes crystals from Thermus thermophilus II J. Mol. Biol. 1989. - V.209. - P.327-328.

389. Traub, P. & Nomura, M. Structure and function of E. coli ribosomes, V. Reconstitution of functionally active 30S ribosomal particles from RNA and proteins // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1968. - V.59. - P.777-784.

390. Traut, R. R., Moore, P. B., Delius, H., Noller, H. & Tissieres, A. Ribosomal proteins of Escherichia coli. Demonstration of different primary structures // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1967.-V.57.-P.1294-1301.

391. Tsay, Y.-F., Shankweiler, G., Lake, J. & Woolford, Jr., J. L. Localization of Saccharomyces cereuisiae ribosomal protein LI6 on the surface of 60 S ribosomal subunits by immunoelectron microscopy // J. Biol. Chem. 1994. -V.269. - P.7579-7586.

392. Tumminia, S. J., Hellmann, W., Wall, J. S. Boublik, M. Visualization of protein-nucleic acid interactions involved in the in vitro assembly Escherichia coli 5OS ribosomal subunit // J. Mol. Biol. 1994. - V.235. - P. 1239-1250.

393. Ustav, M., Villems, R., Saarma, M. & Lind, A. The interaction of transfer ribonucleic acid with 50S ribosomal subunit proteins // FEBS Lett. 1977. -V.83. -P.353-356.

394. Ustav, M., Saarma, M., Lind, A., & Villems, R. The domain for transfer ribonucleic acid binding to the Escherichia coli ribosome // FEBS Lett. 1978. — V.87. - P.315-317.

395. Valdar, W. S. J. & Thornton, J. M. Conservation helps to identify biologically relevant crystal contacts // J. Mol. Biol. 2001. - V.313. - P.399-416.

396. Vandenberghe, A., Wassink, A., Raeymaekers, P., DeBaere; R., Huysmans, E. & DeWachter, R. Nucleotide sequence, secondary structure and evolution of the 5S ribosomal RNA from five bacterial species // Eur. J. Biochem. 1985. -V. 149. - P.537-542.

397. Vasiliev, V. D. & Zalite, O. M. Specific compact selfpacking of the ribosomal 23S RNA // FEBS Lett. 1980. - V.121. -P.101-104.

398. Vigne, R. & Jordan, B. R. Conformational analysis of RNA molecules by partial RNAse digestion and two dimensional acrylamide gel electrophoresis. Application to E. coli 5S RNA // Biochimie. 1971. - V.53. - P.981-986.

399. Vigne, R., Jordan, B. R. & Monier, R. A common conformational feature in several prokaryotic and eukaryotic 5S RNAs: a highly exposed, single-stranded loop around position 40 // J. Mol. Biol. -1973. V.76. - P.303-311.

400. Völker U., Engelmann S., Maul B., Rithdorf S., Völker A., Schmid R., Mach H., Hecker M. Analysis of the induction of general stress proteins of Bacillus subtilis II Microbiology. 1994. - V.140. - P.741-752.

401. Wabl, M. R. Electron microscopic localization of two proteins on the surface of the 50S ribosomal subunit of Escherichia coli using specific antibody markers // J. Mol. Biol. 1974. - V.84. - P.241-247.

402. Wagner, R. & Garrett, R. A. A new RNA-RNA crosslinldng reagent and its application to ribosomal 5S RNA // Nucl. Acids Res. 1978. - V.5. - P.4065-4075.

403. Waller, J.-P. & Harris, J. I. Studies on the composition of the protein from Escherichia coli ribosomes // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. -1961.- V.47. P. 18-23.

404. Weber, H. J. Stoichiometric measurements of 30S and 50S ribosomal proteins from Escherichia coli II Mol. Gen. Genet. 1972. - V.l 19. - P.233-248.

405. Weller, D. L., Schechter, Y., Musgrave, D., Rongvie, M. & Horowitz, J. Conformation changes in Escherichia coli ribosomes at low magnesium ion concentration // Biochemistry. 1968. - V.7. - P.3668-3675.

406. Westhof, E., Romby, P., Romaniuk, P. J., Ebel, J-P., Ehresmann, C. & Ehresmann, B. Computer modeling from solution data of spinach chloroplast and of Xenopus laevis somatic and oocyte 5S rRNAs // J. Mol. Biol. 1989. -V.207. -P.417-431.

407. White, S. A., Nilges, M., Huang, A., Brünger, A. T. & Moore, P. B. NMR analysis of helix I from the 5S RNA of Escherichia coli II Biochemistry. 1992. — V.31. — P.1610-1621.

408. Wildeman, A. G. & Nazar, R. N. Structural studies of 5S ribosomal RNAs from a Thermophilic fungus, Thermomyces lanuginosus II J. Biol. Chem. — 1982. — V.257.-P.11395-11404.

409. Willick, G. E., Williams, R. E., Matheson, A. T., & Sendecki, W. Salt stabilization of a 5S RNA-protein complex from an extreme halophile, Halobacterium cutirubrum IIFEBS Lett. 1978. - V.92. -P.187-189.

410. Willick, G. E., Nazar, R. N. & Matheson, A. T. 5S RNA-protein complex from an extreme halophile, Halobacterium cutirubrum. Comparative studies on reconstituted complex // Biochemistry. 1979. - V.18. -P.2855-2859.

411. Willick, G. E., Nazar, R. N. & Van, N. T. Physicochemical studies on the 5S ribonucleic acid-protein complex from a eucaryote, Saccharomyces cerevisiae II Biochemistry. 1980. - V.19. - P.2738-2742.

412. Wimberly, B. T., Brodersen, D. E., demons Jr. W. M., Morgan-Warren, R. J., Carter, A. P., Vonrhein, C., Hartsch, T. & Ramakrishnan, V. Structure of the 30S ribosomal subunit // Nature. 2000. - V.407. - P.327-339.

413. Woese, C. R., Luehrsen, K. R., Pribula, C. D. & Fox, G. E. Sequence characterization of 5S ribosomal RNA from eight gram positive prokaryotes // J. Mol. Evol. 1976. - V.8. - P.143-153.

414. Woese, C. R., Kandler, O. & Wheelis, M. L. Towards a natural system of organisms: Proposal for the domains Archaea, Bacteria and Eucarya // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1990. - V.87. - P.4576-4579.

415. Wolters, J. & Erdmann, V. A. Compilation of 5S rRNA and 5S rRNA gene sequences //Nucl. Acids Res. 1988. -V. 16. - P. 1-70.

416. Wool, I. G., Chan, Y. L., Gluck, A. & Suzuki, K. The primaiy structure of rat ribosomal proteins P0, PI, and P2 and a proposal for a uniform nomenclature for mammalian and yeast ribosomal proteins //Biochimie. 1991. -V.73. -P.861-870.

417. Wormington, W. M. Developmental expression and 5S rRNA-binding activity of Xenopus laevis ribosomal protein L5 // Mol. Cell. Biol. 1989. V.9. -P.5281-5288.

418. Wrede, P. & Erdmann, V. A. Escherichia coli 5S RNA binding proteins LI8 and L25 interact with 5.8S RNA but not with 5S RNA from yeast ribosomes // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 1977. - V.74. -P.2706-2709.

419. Yaguchi, M., Rollin, C. F. Roy, C. & Nazar, R. N. The 5S RNA binding protein from yeast (Saccharomyces cerevisiae) ribosomes. An RNA binding sequence in the carboxyl-terminal region // Eur. J. Biochem. 1984. - V.139. - P.451-457.

420. Yang, D., Günther, I., Matheson, A. T., Auer, J., Spicker, G. & Böck, A. The structure of the gene for ribosomal protein L5 in the archaebacterium Sulfolobus acidocaldarius II Biochimie. 1991. - V.73. - P.679-682.

421. Yarus, M. & Breeden, L. Mutants of Su+7 tRNA include a functional tRNA with an altered T-^P-C-G sequence // Cell. 1981. - V.25. - P.815-823.

422. Yeh, L.-C. C., Horowitz, P. M. & Lee, J. C. Studies of RNA-protein interactions in the yeast 5S ribonucleoprotein particles by fluorescence and tritium exchange. Implications for ribosomal assembly // J. Biol. Chem. 1988. - V.263. -P.17412-17417.

423. Yeh, L.-C. C. & Lee, J. C. Probing the RNA structure within the yeast 5S RNA-Lla protein complex by fluorescence and enzymatic digestion // J. Biol. Chem. -1988. V.263. - P. 18213-18219.

424. Yeh, L.-C. C. & Lee, J. C. Contributions of multiple basic amino acids in the C-terminal region of yeast ribosomal protein LI to 5S rRNA binding and 60S ribosome stability // J. Mol. Biol. 1995. - V.246. - P.295-307.

425. Yonath, A. E., Missing, J., Tesche, B., Lorenz, S., Erdmann, V. A. & Wittmann, H. G. Crystallization of the large ribosomal subunits from Bacillus stearothermophilus II Biochem. Intern. 1980. - V.l. - P.424-435.

426. Yu, D., Ellis, H. M., Lee, E. C., Jenkins, N. A., Copeland, N. G. & Court, D. L. An efficient recombination system for chromosome engineering in Escherichia coli II Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 2000. - V.97. - P.5978-5983.

427. Yu, R. S. T. & Wittmann, H. G. The sequence of steps in the attachment of 5S RNA to cores of Escherichia coli ribosomes // Biochim. Biophys. Acta. 1973. - V.324. - P.375-385.

428. Yukioka, M. & Omori, K. Identification of ribosomal proteins with affinity for tRNA molecule by affinity chromatography on tRNA-Sepharose // FEBS Lett. -1977. V.75. - P.217-220.

429. Yusupov, M. M., Yusupova, G. Zh., Baucom, A., Lieberman, K., Earnest, T. N., Cate, J. H. D. & Noller, H. F. Crystal structure of the ribosome at 5.5 Ä resolution // Science. 2001. - V.292. - P.883-896.

430. Zachau, H. G., Acs, G. & Lipmann, F. Isolation of adenosine amino acid esters from a ribonuclease digest of soluble, liver ribonucleic acid // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 1958. - V.44. - P.885-889.

431. Zagorska, L., Van Duin, J., Noller, H. F., Pace, B., Johnson, K. D. & Pace, N. R. The conserved 5S rRNA complement to tRNA is not required for translation of natural mRNA // J. Biol. Chem. 1984. - V.259. - P.2798-2802.

432. Zehavi-Willner, T & Comb, D. G. Studies on the relationship between transfer RNA and transfer-like RNA // J. Mol. Biol. 1966. - V.16. - P.250-254.

433. Zhang, P. & Moore, P. B. An NMR study of the helix V-loop E region of the 5S RNA from Escherichia coli II Biochemistry. 1989. - V.28. - P.4607-4622.

434. Zhang, P., Popieniek, P. & Moore, P. B. Physical studies of 5S RNA variants at position 66 // Nucl. Acids Res. 1989. - V.17. -P.8645-8656.

435. Zhang, P., Rycyna, R. & Moore, P. B. A study of the conformation of 5S RNA by 31P NMR// Nucl. Acids Res. 1989. - V.17. - P.7295-7302.

436. Zimmermann, J. & Erdmann, V. A. Identification of Escherichia coli and Bacillus stearothermophilus ribosomal protein binding sites on Escherichia coli 5S RNA // Mol. Gen. Genet. 1978. - V.160. - P.247-257.

437. Zimmermann, J. & Erdmann, V. A. Binding sites of E. coli and B. stearothermophilus ribosomal proteins on B. stearothermophilus 5S RNA // Nucl. Acids Res. 1978. - V.5. - P.2267-2288.

438. Zuckerkandl, E. & Pauling, L. Molecules as documents of evolutionary history // J. Theor. Biol. 1965. - V.8. - P.357-366.

439. Zuker, M. Mfold web server for nucleic acid folding and hybridization prediction // Nucl. Acids Res. 2003. - V.31. - P.3406-3415.

440. ОСНОВНЫЕ ПУБЛИКАЦИИ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

441. Статьи и обзоры в научных журналах, рекомендованных ВАК РФ

442. Korobeinikova, A.V., Shestakov, S.A., Korepanov, A.P., Garber, M.B., Gongadze G.M. Protein CTC from Aquifex aeolicus possesses a full-sized 5S rRNA-binding domain // Biochimie. 2009. - V.91. - P.453-456.

443. Гонгадзе, Г.М., Корепанов, А.П., Коробейникова, A.B., Гарбер, М.Б. Бактериальные 5S рРНК-связывающие белки семейства СТС // Успехи Биолог. Химии. 2008. - Т.48. - С. 105-132.

444. Коробейникова, A.B., Гонгадзе, Г.М., Корепанов, А.П., Елисеев, Б.Д., Баженова, М.В., Гарбер М.Б. 5S рРНК-узнающий модуль белков семейства СТС и его эволюция // Биохимия. 2008. - Т.73. - С.193-201.

445. Korepanov, А.Р., Gongadze, G.M., Garber, М.В., Court, D.L., Bubunenko, M.G. Importance of the 5S rRNA-binding ribosomal proteins for cell viability and translation in Escherichia coli II J. Mol. Biol. 2007. - V.366. - P. 11991208.

446. Gongadze, G.M., Korepanov, A.P., Stolboushkina, E.A., Zelinskaya, N.V., Korobeinikova, A.V., Ruzanov, M.V., Eliseev, B.D., Nikonov, Ö.S., Nikonov, S.V. and Garber, M.B., Lim, V.l. The crucial role of conserved intermolecular

447. H-bonds inaccessible to the solvent in formation and stabilization of the TL5-5S rRNA complex // J. Biol. Chem. 2005. - V.280 - P. 16151 -16156.

448. Корепанов, А.П., Гонгадзе, Г.М., Гарбер, М.Б. Основной стрессовый белок СТС Bacillus subtilis специфически связывается с рибосомной 5 S РНК // Биохимия. 2004. - Т.69. - С.749-754.

449. Garber, M., Gongadze, G., Meshcheryakov, V., Nikonov, О., Nikulin, A., Perederina, A., Piendl, W., Serganov, A, Tishchenko, S. Crystallization of RNA/protein complexes // Acta Crystallographica Section D. 2002. - V.58. -P. 1664-1669.

450. Woestenenk, E.A., Gongadze, G.M., Shcherbakov, D.V., Rak, A.V., Garber, M.B., Hard, T. and Berglund, H. The solution structure of ribosomal protein LI8 Thermus thermophilus reveals a conserved RNA-binding fold // Biochem. J. — 2002. V.363. - P.553-561.

451. Мещеряков, В.А., Грязнова, О.И., Давыдова, H.JT., Мудрик, Е.С., Передерина, А.А., Василенко, К.С., Гонгадзе, Г.М., Гарбер. М.Б. РНК-связывающие свойства необычного рибосомного белка TL5 из Thermus thermophilus II Биохимия. 1997. - Т.62. - С.629-634.

452. Gryaznova, O.I., Davydova, N.L., Gongadze, G.M., Jonsson, B.-H., Garber, M.B. & Liljas, A. A ribosomal protein from Thermus thermophilus is homologous to a general shock protein // Biochimie. 1996. - V.78. - P.915-919.

453. Gongadze, G., Kashparov, I., Lorenz, S., Shroeder, W., Erdmann, V.A., Liljas, A. & Garber, M. 5S rRNA binding ribosomal proteins from Thermus thermophilus: identification and some structural properties // FEBS Lett. 1996.- V.386.-P.260-262.

454. Gongadze, G.M., Tishchenko, S.V., Sedelnikova, S.E.& Garber, M.B. Ribosomal proteins, TL4 and TL5, from Thermus thermophilus form hybrid complexes with 5S ribosomal RNA from different microorganisms // FEBS Lett.- 1993. — V.330. P.46-48.

455. Статьи в сборниках и избранные тезисы конференций

456. Korepanov, A.P., Gongadze, G.M., Bazhenova, M.V., Garber, M.B., Court, D.L., Bubunenko, M.G. Role of 5S rRNA-binding ribosomal protein L25 of

457. Escherichia coli in cell viability and translation // Abstracts of the International Engelgardt conference on molecular biology, august 19-24. 2006. - Buran, Russia. - P.68.

458. Искренне благодарен Станиславу Владимировичу Никонову и сотрудникам его группы, Наталье Невской, Наталье Фоменковой, Роману Федорову и Алексею Никулину, за успешное и приятное сотрудничество в определении структур белков и РНК-белковых комплексов.

459. Благодарю Михаила Бубуненко за приятное и продуктивное сотрудничество. Выражаю большое спасибо Андерсу Лильясу, Торлейфу Харду и Волкеру Эрдману, а также сотрудникам их научных групп, за плодотворное сотрудничество в данной работе.

460. Отдельное спасибо Олегу Никонову за помощь в оформлении работы, а Наталье Леоновой за помощь во всем.

461. Всех сотрудников лаборатории структурных исследований аппарата трансляции благодарю за помощь, участие, ценные советы и просто приятную атмосферу в коллективе.

462. Спасибо сотрудникам Института белка за помощь при выполнении работы. Отдельное спасибо моим родным и близким за величайшее терпение, участие в моих делах, за теплоту и понимание.

Информация о работе

Гонгадзе, Георгий Михайлович
доктора биологических наук
Пущино, 2010
ВАК 03.01.03

Диссертация

5S pРНК-связывающие белки бактериальной рибосомы - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы