Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

СВОЙСТВА И РЕГУЛЯЦИЯ ГЛУТАМИНСИНТЕТАЗЫ AZOSPJRILLUM BRASILENSE С РАЗНЫМИ СТЕПЕНЯМИ АДЕНИЛИРОВАНИЯ

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "СВОЙСТВА И РЕГУЛЯЦИЯ ГЛУТАМИНСИНТЕТАЗЫ AZOSPJRILLUM BRASILENSE С РАЗНЫМИ СТЕПЕНЯМИ АДЕНИЛИРОВАНИЯ"

¿'ЪЫВ^

На правах рукописи

СМИРНОВА Виктория Евгеньевна

СВОЙСТВА И РЕГУЛЯЦИЯ ГЛУТАМИНСИНТЕТАЗЫ АХОБРХМЬЬиМ ВЯАБИЕХЗЕ С РАЗНЫМИ СТЕПЕНЯМИ АДЕНИЛИРОВАНИЯ

Специальности: 03.00.04, - Биохимия,

03.00.07. — Микробиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Саратов - 2003

Диссертация выполнена в Институте биохимии и физиологии растений и микроорганизмов Российской академии наук.

Научные руководители: доктор биологических наук Л.П.Антонюк

доктор химических наук А.А.Камнев

Официальные оппоненты: доктор биологических наук,

профессор A.A. Щербаков; кандидат медицинских наук, старший научный сотрудник М.Н. Киреев

Ведущая организация —

Институт биохимии нм, А.Н. Баха РАН

Защита состоится «21» января 2004 г. в Ю0*1 на заседании диссертационного совета Д 002.146.01 при Институте биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН по адресу 410049, г. Саратов, проспект Энтузиастов, 13.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Институкх биохимии и физиологии растений и микроорганизмов Российской академии наук.

Автореферат разослан « / » декабря 2003 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета

доктор биологических наук В.Е. Никитина

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы; В последние голы проявляется повышенный интерес к микроорганизмам, обитающим в ризосфере возделываемых человеком растений. Известно, что высшие растения поддерживают на своих корнях существо* ванне целых- бактериальных сообществ, которые, в свою очередь, фиксируют молекулярный азот атмосферы, передавая связанные его формы растению-хозяину (Becker et а/., 2002; Умаров, 1986; Кацы, 2003). Среди ассоциативных бактерия есть штаммы, способные колонизировать преимущественно внутренние части корня и проводящую систему растения-хозяина (Dobereiner et ah, 1995). Эти бактерии получили название энд офитов. Они оказывают значительно более выраженное позитивное влияние на рост и развитие растения-хозяина по сравнению с бактериями, не способными проникать внутрь хорня (Steenhoudt and Vanderleyden, 2000; Dobereiner and Pedrosa, 1987). Среди азоспирилл, пожалуй, единственным штаммом, принадлежность которого к эндофитам строго доказана, является Azospiritlum brastlense Sp245, природный симбионт пшеницы (Baldani et al„ 1983; 'Assmus et al, 1995). Инокуляция пшеницы в палевых условиях этим штаммом приводила к более чем двукратному (237 % по сравнению с контролем) увеличению содержания азота в наземной части растения-хозяина (Dobereiner and Pedrosa, 1987). В связи с этим изучение азотного обмена азоспирилл, в частности; A, brastlense Sp245, представляет большой интерес. ~

Плутами нсинтетаза (FC) считается ключевым ферментом азотного обмена, так как с одной стороны, катализируемая данным ферментом реакция'представляет собой единственный путь синтеза глутамина, а с другой - глутамин является донором аминогруппы в биосинтезе целого ряда клеточных метаболитов. В конце 8 0-х! годов прошлого столетия структурный ген ГС A. brastlense был секвенирован (Bozouklian and Elmerich, 1986); таким образом, аминокислотная последовательность фермента к настоящему времени уже известна. В '90-х годах вышел ряд публикаций по ГС A. brasüense (Piróla et al, 1992; Беспалова и др., 1994;,Bespa!ova et al, 1999; Чернышев, 1999). Усилиями итальянских и российских ученых ГС азоспириллы была частично охарактеризована: опреде-тены молекулярные массы мономерной и олигомерной форм фермента, пучены каталитические особенности среднеаденилированной ГС. В 90-е годы 5ыл описан неизвестные ранее для глутаминеннтетаз тип регуляции активности |>ермента - регуляция экстраклеточным сигналом растения-хозяина (Anionyuk ;/ al, 1993; Антогаок и др., 1997). Так,-было установлено, что при росте A bra~ ilcnse Sp245 в условиях азотфиксации связывание агглютинина зародышей нпеницы (АЗП) с клетками азоспириллы приводит к увеличению активности "С (Antonyuk et al, 1993), а также к активации биосинтеза данного фермента Антонюк и др., 1997). Оставалось, однако, неизвестным, реализуется ли юнный тип регуляции фермента только в азотфиксирующих условиях роста um он характерен для ГС азоспириллы независимо от nnvnmpg ц кцдлрррпппгп

татуса клетки.

СЦ-£> WCXA iwfwwit лгггчнг,^

у Л-ЪМЪ*-_

Бактериальные аденилируемые глута мн н с и нтетаэы считаются сложно-организованными ферментами, как в отношении структурной организации, так и в отношении регуляции активности и биосинтеза фермента. Важно отметить, что представления о бактериальных глутам и ней нтетазах ограничены пониманием строения и функционирования фактически только ГС энтеробактерий -Escherichia coli и Salmonella typhimurium (Eisenberg etal, 2000). Таким образом, важность ГС в азотном метаболизме бактерий, с одной стороны, и недостаточность сведений о строении и свойствах этого фермента у азоелнрилл, с другой стороны, побудили нас продолжить изучение ГС Л. brasilense и предпринять исследование, посвяшенное выделению, очистке и изучению свойств и регуляции ГС A. brasilense с разными степенями аденилирования.

Цель и задачи исследования

Целью данной работы было исследование свойств и регуляции глутаминсинтетазы — ключевого фермента азотного' метаболизма почвенной ассоциативной бактерии A, brasilense.'

В связи с этим были поставлены следующие задачи:

1. Подобрать условия культивирования A. brasilense Sp245, индуцирующие образование глутаминсинтетазы с определенной, степенью аденилирования.

2. Получить электрофоретически гомогенные препараты ГС азоспириллы с. разной степенью аденилирования для последующего изучения их свойств и регуляции; изучить термостабильность фермента.

3. Выяснить, зависит ли специфичность глутаминсинтетазы азоспириллы к Mg5+, Mni+ и Со:*от степени аденилирования фермента.

4. Изучить кинетическое поведение неаденилированной формы глутаминсинтетазы в биосинтетической реакции.

5. Изучить влияние' агглютинина зародышей пшеницы на активность глутаминсинтетазы у бактерий, растущих в аэробных условиях;

6. Исследовать, вторичную структуру глутаминсинтетазы и оценить влияние на нее катионов двухвалентных металлов и степени аденилирования фермента. .

7. Изучить связывание катионов в активных центрах фермента методом эмиссионной спектроскопии ядерного гамма-резонанса с.использованием радиоактивного изотопа i7Co.

Научная новизна работы. Проведено комплексное исследование структуры и свойств ГС, ключевого фермента азотного обмена азотфиксируюшей бактерии A, brasilense. Впервые получена неаденщшрованная форма,бактериальной ГС без использования мутантов и ковалентной модификации:фермента. Предложен новый метод определения степени аденилирования ГС, основанный на компьютерной обработке результатов электрофоретического анализа. Впервые охарактеризована вторичная структура глутаминсинтетазы A. brasilense; установлено, что ГС азоспириллы является высокоструктурированным белком, до 78% полипептидной цепи которой может быть представлено а-спиралью и р-структурой! Установлено, что активный центр ГС A. brasilense имеет два

металл связывающих сайта, обладающие различным сродством к катиону Со * и различающиеся координационной симметрией. Впервые продемонстрирована возможность использования эмиссионной спектроскопии ядерного гамма-резонанса для изучения организации металл связывающих центров ферментов. Изучены каталитические особенности неаденшшрованной ГС A. brasilense; проведен сравнительный анализ кинетических характеристик неаденилироваи-ной и аденилированноП ГС азоспир1Шы.

Практическая значимость работы. Полученные в работе данные о ГС А. brasilense имеют существенное значение для понимания одного из важнейших процессов, протекающих в бактериальной клетке, - усвоения неорганического азота и, кроме того, расширяют представления об азоспириллах — важных в практическом отношении бактериях. Полученные сведения о ГС азоспирнллы нашли применение при подготовке студентов старших курсов химического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова, биологического факультета С ГУ им. Н.Г. Чернышевского,

Работа выполнена в Институте биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН в лаборатории биохимии в рамках темы «Изучение моле-кулярно-генетических механизмов узнавания, контакта и обмена метаболитами азоспнрпл и культурных злаков» (научный руководитель заслуженный деятель науки РФ профессор д&н, Игнатов В.В., Кг гос. регистрации 01Б60024516) и в ла-берахорнн биохимии растительно-бактериальных симбиозов в рамках темы «Осо-бешюстн биохимии эидофитных и ассоциативных симбиоктов рода Azospiril-lum» (научный руководитель дбл. Л гггошок JITL, Ks гос. регистрации 01200012855).

Работа поддержана грантами Российского фонда фундаментальных исследований (проект As 01-04-48755), ИНТЛС (проектКг 96-1015) »Комиссии РАН по работе с молодежью (б-й Конкурс-экспертиза проектов, проект Kt 205).

Апробация работы. Материалы диссертации представлялись ua 20й FEBS Meeting (Hungaiy, 1990), XII юбилейной конференции «Ферменты микроорганизмов» (Казань, 2001), 2nd International Conference on Trace Element Speciation in Biomedical, Nutritional and Environmental Sciences (Germany, 2001), 4 INTAS Interdisciplinary Symposium on Physical and Chemical Methods in Biology, Medicine, and Environment (Moscow, 2001), 7® International Symposium on Metal Ions in Biology and Medicine (St.-Petersburg, 2002), III Съезде биохимического общества (Санкт-Петербург, 2002), Первой региональной конференции молодых ученых «Стратегия взаимодействия микроорганизмов с окружающей средой» (Саратов, 2002), М* European Conference on the Spectroscopy of Biological Molecules (Hungary, 2003).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 13 работ в зарубежных и отечественных научных изданиях.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описшшя материалов и методов исследования,'изложения полученных результатов и их обсуждения (в 3 главах), выводов ' и списка цитируемой литературы, содержащего 304 источника, в том числе - 255 зарубежных. Работа изложена на 141 странице машинописного текста, содержит 14 рисунков и 9 таблиц.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Материалы и методы исследования

В работе были использованы бактерии штамма A. bras ileus с Sp245, выделенные in поверхностно стерияизованных корней пшеницы (Baldan; .eí al, 1983), Штамм поддерживался в коллекции культур Института биохимии и, физиологии растений и микроорганизмов РАН. Биомассу микроорганизмов для выделения фермента наращивали аэробно в колбах Эрленмейера объемом 2000 -мл при 32°С.; Клетки'растили на минеральной синтетической среде (Day and Döberemer, 1976) с некоторыми модификациями. При выращивании культуры A, brasilense Sp245 для получения частично аденил про ванных ГС использовали хлорид аммония. в ■ качестве источника азота (5 мМ), Для получения неаденилированной формы ГС малат натрия заменяли сукиинатом натрия (5 г/л), а в качестве источника азота it с пользовали L-глутамат натрия (5 мМ), а не аммоний.

, Разрушение замороженной биомассы проводили двумя способами: продавливая замороженные клетки через фильеры Френч-пресса или же растирая их с кварцевым леском в фарфоровой ступке. Гомогенат клеток, выращенных , в условиях, индуцирующих образование неаденилированной. формы ГС, суспендировали в экстрагирующем, буферном растворе,, содержащем МпС12 (1.мМ) и имидазол-НС1-буфер(25 мМ) при конечном рН^ 7,Ь, а в условиях, индуцирующих образование частично аденилированных ГС — в растворе, содержащем: фенилметнлеульфонилфторид (0,5 мМ), этилен-днам интетраацетат натрия (ЭДТЛ) (1 мМ), Tris-HCl-буфер (75.мМ), ß-меркап-тоэтзнол (0,5 мМ), при конечном pH 7,0. Затем для освобождения от нуклеиновых кислот к полученным суспензиям добавляли ДНКазу I и стрептомицин сульфат до конечной концентрации 0,25 мг/мл и 2 мг/мл соответственно и инкубировали 30 мин при 4°С. От осадка освобождались центрифугированием.

Ионообменная колоночная хроматография проводилась на анионообменном носителе DEAE-Toypearl 650М ("Toyo Soda"). Колонку (S = 2 см1, h - 18 см) уравновешивали 0,05 М Трис-НС1-буфером (pH 7,0). После нанесения связавшиеся с носителем полимеры подвергали ступенчатой элюции исходным буфером, содержащим 0,2 и 0,3 М NaCl соответственно. Выход белковых фрак- . ций регистрировали на приборе Uvicord S-H (LKB) при 5v=278 нм.Ддя осво: бождения ог солей и смены буфера белковых препаратов проводили гель-фияь-трацию на сефадексе. G-25. Для проведения высокоэффективной хроматографии (FPLC) использовали колонки двух типов: Mono-Q и QTSepharose НР,-("Pharmacia Biotech"). В первом случае колонка уравновешивалась 0,02 МЛрис-HCl-буфером (pH 7,0). Элюцию проводами исходным, буфером в .градиенте NaCl от 0 до 1 М. Во втором случае колонку уравновешивали 0,05 М Трис-НС1-буфером (pH 8,0). Элюцию проводили тем же буфером в .градиенте NaCl от 0 до 1 М. Белковые фракции собирали и тестировали на проявление активности ГС трансфертным методом. Аффинная хроматография проводилась на носителе Añi-Gel Blue Gel ("Bio-Rad"). Ферментный препарат наносили на колонку (S=l см1, Ь=15 см), уравновешенную 0,02 М имилазол-HCl-буфером, pH 6,3,

содержащим 1 мМ MnClj. После выхода белков, не связавшихся с носителем, колонку промывали 3-5 объемами исходного буфера, содержащего I М КаС), и затем элюировали 0,02 М имидазол-НС1-буфером (pH 7,5), содержащим 1 мМ МпС12 и 5 мМ АДФ. Скорость элюцци во всех случаях составляла 10-20 мл/ч. Белковый препарат собирали лорщюиио н каждою фракцию тестировали на проявление активности ГС трансферазиым методом.

Концентрацию белка определяли по методу Бредфорд (Bradford, 1976). Электрофорез белков проводили в л ол и акрил ам и дном геле с додеш! л сульфатом натрия (SDS) (Laemmli, 1970). Белки окрашивали раствором Кумасси G-250 (Гааль и др., 1982) или ОД % раствором серебра (Блохин, 1988).

Активность фермента в процессе выделения и очистки контролировали двумя методами: трансфертным {Bender et al, 1977) и биосинтетическим (Пушкин и др., 1972),

Степень аденилирования ГС определяли двумя способами. Первый - метод Шапиро и Стэдмана (Shapiro and Stadtman, 1970), основанный на способности ионов'магння ингибировать активность аденилированной формы фермента в трансферазной реакции. Второй - с использованием программы Sigma Gel: электрофоретические гели препаратов ГС сканировали, определяли площади пиков (%), соответствующих аденилированным и неаденилированным субъединицам ГС, и рассчитывали степень аденилироаания ;(пР" n=12, FC содержит 100Уо аденилированных субъедшшц).

Вторичную структуру фермента изучали методом кругового дихроизма (КД). В работе использовался дихрограф JASCO J-500C (Япония). Измерения проводили в области 190-250 нм при 20®С в 1-мм кюветах при концентрации ! белка от 0,35 до 0,8-мг/мл; скорость сканирования - 2 нм/мин. Содержание элементов вторичной структуры рассчнтывхш с помощью программы CONT1N (Provencher, 1981). *"

Изучение металлсвязывающих центров ГС, допированнон "Со1*, ■ проводили методом эмиссионной спектроскопии ядерного гамма-резонанса (ЭС . ЯГР). Измерения проводили при помещении образца, служившего источником гамма-излучения, .непосредственно и держателе спектрометра в крностат с жидким азотом (Г - 80 К); поглотителем служил К4[Fc(CN)s]-3 Н2О.

Результаты исследовании и их обсуждение - * - , .. 1. Влияние различных источников азота и углерода в среде

культивирования на степень аденилирования ГС A. brasilense Sp245

Механизм аденилнрования-деадеиилирования дает возможность плавно и

гибко изменять свойства и активность ГС' в зависимости от реальных

потребностей бактериальной клетки в глутамнне. Известно, что степень'

аденнлирования бактериальных ГС сильно варьирует в зависимости от фазы

роста и состава питательной среды (Piróla et al, 1992; Беспалова и др., 1994).

Необходимо • было подобрать условия культивирования, позволяющие '

вырастить клетки A/brasilense Sp245, содержащие ГС с определенной степенью

аденнлирования. В этой связи было исследовано влияние трех факторов:

б

источников азота-(KNOj, NHjCt, L-глутамат натрия) и углерода (малаг и сукцинат натрия) в питательной среде, а также время культивирования. , . .

Клетки A, brasilense Sp245 выращивали аэробно в колбах Эрленмсйера на синтетической минеральной среде. При выращивании клеток на малатной среде (16-18 ч) при использовании KNO3 и NH4C1 в качестве источников азота степень аденнлировэння ГС колебалась следующих пределах: 25 мМ KNOj — 4,0-5,5; 50 mM K.NO, - 5,0-6,5; 5 мМ NH,C1 - 2,0-5,5; 50 мМ NH»CI - 7,5-9,0. Увеличение времени культивирования до 20-24 ч. приводило к возрастанию степени аденилироваиня. Проведенные .эксперименты позволили подобрать-, наиболее удобные условия выращивания А. brasilense Sp245 для последу ющего получения препаратов ГС с разной степенью адснилироваяия. Были отобраны три режима культивирования: для получения неаденилнрованной (ГСо), с низкой степенью аленилирования (ГС2д) и чуть ниже средней (ГС3,э). ГСи и rCjj получили при выращивании клеток на минеральной синтетической среде, содержащей малат натрия (5 г/л) и хлорид аммония (5 мМ); при этом время культивирования было разным - IS и.22 ч, соответственно. Для получения ГС0 клетки выращивали- на минеральной синтетической среде, содержащей сукцинат натрия (5 г/л) и L-глутамат натрия (5 мМ), в течение 18-20 ч. Следует отметить, что впервые были подобраны условия культивирования, позволяющие получить неаденилированную форму бактериальной ГС.

2. Получение эле ктрофорегн чески гомогенных препаратов ГС А. brasilense и исследование ее терчостабнльностн-

Дяя изучения свойств и регуляции ГС А. brasilense Sp245 были получены три электрофоретичесхи гомогенных препарата ГС: неаденилнрованной (ГСо), с низкой степенью аденилироваиня (ГС3д) и чуть ниже средней (ГСз,5).

Получение и очистка частично адетяироеанных форм ГС А. brasilense

Грубый экстракт клеток A. brasilense высаливали до 50 % насыщения сульфатом аммония. Осадок балластных белков отделяли центрифугированием'. К супернатанту добавляли сульфат аммония до 80 % насыщения. Образовавшийся осадок ресуспендировалц в минимальном объёме 50 мМ Tris-HCl-буфера (pH 7,0) и обессоливали. Обессоленный ферментный препарат подвергали очистке' методом ионообменной хроматографии на DEAE-Toyopearl 650М и FPLC-xpo-' матографии на анионообменной колонке Mono Q. Процедуры очистки позволили получить электрофоретически гомогенные препараты ГС А. brasilense со степенью аленилирования 2,2 и 5,3 с удельной активностью 150 мМ и. 120 мМ. у-глутамилтдроксамовой кислоты (7-ГГК) на мг белка соответственно. Активность фермента определяли трасферазным методом. При электрофорезе в при- . сутствии SDS очищенная ГС мигрировала двумя полосами (Mr = 52 кДа, М, = 53 кДа; неаденилированная и адеиилированная субъсаиницы ГС соответственно), что хорошо согласуется с данным» по молекулярной массе ГС А. brasilense, , полученными французскими исследователями при секвенировании гена glnA (Bozouklian and Elmerich, 1986), а также с данными итальянских ученых (Piróla,,. et al.i 1992). Для уточнения степени адеинлйрования гомогенных препаратов ГС полученные электрофореграммы сканировали н оценивали соотношение

зденилиро&анных и неалгнилирошзнных субъеднннц фермента с помощью программы Sigma Gel.

Очистка неоденилироеанной ГС A. brasi/etiic

Грубый экстракт клеток A. brasilaise высаливали до 35 % насыщения сульфатом аммония. Осадок балластных белков отделяли центрифугированием. К супер на та нгу добавляли сульфат аммония до 70 % насыщения и оставляли для формирования осадка, который затем собирали центрифугированием, ресуспен-дировали о минимальном объеме 20 мМ Hcpes-буфера (pH 7,5) и обессоливали.

Обессоленный ферментный препарат подвергали очистке методами: FPLC-хроматографин на аиионообменной колонке Q-Sepharose HP, ионообменной хроматографии на DEAE-Toyopcarl 65ОМ и FPLC-хроматографии на анноно* обменной колонке Mono Q. Полученная ГС содержала незначительное количеств) балластных белков и подвергалась аффинной хроматографии на AfE-Gel Г)!уе, чю привело к получению электрофоретнчески гомогенного препарата полностью неаденилированной ГС, который обладал удельной активностью 375 мМ y-ПК на мг белка (активность фермента определяли трасферззным методом).

Исследование тсрлюстабильности ГС A. brasilense

Известно, что у бзетерий встречаются как термостабильные (Е. coli, Bacillus itcarcíhcrmophrtuz), так и термолабильные ГС; например, у Rhizobhm japonicum л A. trifolti од»а m двух форм ГС тердюлзбильна (Пушкин, 1990). Таким образом, при характеристике ГС того или иного микроорганизма вопрос о термостобилыюето фермента требует отдельной экспериментальной проверки. Было исследовано два препарата ГС - электрофоретнчески гомогенный и частично очищенный (грубый экстракт клеток A, brasUense высаливали до 50 % насыщения сульфатом аммония). Было установлено, что при относительно мягком режиме обработки (50сС, 30 мин) у гомогенного и частично очищенного препаратов ГС сохранялось около 75% активности фермента. Увеличение времени обработки снижало активность ГС: неочищенного фермента — до 48,6%, а очншенного - до 67,8%. При 60'С очищенная ГС проявляла существенно большую термостабильностъ по сравнению с неочищенной — 29,3% и 6,9% соответственно, Двукратное увеличение времени обработки при 60РС обоих препаратов не приводило к существенному снижению активности ГС, что в целом гоио-ргт о существовании в молекуле конформационно жестких участков, обеспечивающих функционирование фермента в неблагоприятных условиях. Учитвая то, что ГС является ключевым ферментом азотного обмена, логично предположить, что подобная информационная стабильность важна для выживания бактерии в экстремальных условиях.

3. Специфичность фермента к катионам двухвалентных металлов

ГС требуют для проявления активности присутствия катионов двухвалентных металлов, причем наиболее эффективными катионами традиционно считаются Mg3*, Мп1* и Со1+ (Eisenberg et al, 2000; Bespalova et al, 1999). Фактически же ГС разных микроорганизмов существенно различаются по способности активироваться этими катионами (Segal and Stadtman, 1972; Matsuoka and Kimura, 1985). В этой связи интересно было выяснить эффективность данных

s

катионов в поддержании активности ГС азоспнриллы, Кроме того, важно было понять, меняется ли специфичность ГС А. ЬгеаИегае 5р245 к Мд2*, Со1* и Мп1* в зависимости от степени аэенилирования фермента. Эксперименты проводили с элекгрофоретически гомогенными препаратами ГС: иеаденилированным (ГСо) и частичноаяснилированным (ГС?.О- Оба фермента после очистки содержали связанные катионы, от которых не удавалось освободиться с помощью диализа против буфера {обе формы ГС проявляли активность при исключении калюнов из реакционной среды). Катионсодержашие препараты фермента получили название «нативной» ГС. Как видно из представленных в табл. 1 данных, включение о состав реакционной среды катионов двухвалентных металлов ~ Мп;* или Со1" - приводило к увеличению активности нативной иеаденплированной ГС, причем Мпг* был менее активен в поддержании активности ГС по сравнению с Мв** и Со2*.

Таблица 1. Влияние катионов двухвалентных металлов на активность нативной it свободной от металла ГС A. brasilense Sp245

Металл в Активность ГС в биосинтетической реакции (Р„ мкг/мии)

реакционной Нативная ГС Свободная от металла ГС

среде?. 1 мМ. п = 0 л = 0 п = 5,3

Без металла 9,5 ±05 0 0

Мп" 11,0±0,1 6,9 ±0,1 13,6 ±0,2

24,5 ¿0,1 8,5 ±0^ 33.0 ±0,1

Со** 24,5 ±0,1 19,1 ± 0,1 15,0 ±0,1

(Mg"+Co'*) 24,5 ± 0.2 19,8 ±0,2 20,5 ± 0.2

(Мп'*+ Со'*) Не определялась Не определялась 12,8 ±03

Примечания: доверительные интервалы дты для надежности 95 %.

'Реакционная еммьсодержала 0,5 мМ ЛТФ, 10 мМ NH<C1 и 20 мМ L-глутамата. Катионы в смеси были добавлены в рапном соотношении до конечной сумчзрноЯ коииентрашш 1 мМ.

Так как оставалось неизвестным, какие катионы связаны в активных цент-pax нативной ГС, была предпринята попытка получения препаратов фермента, свободных от катионов, что в нашем случае оказалось также необходимым для корректной оценки специфичности фермента к Mg2\ Мпг* и Со1*, Для удаления связанных с белковой глобулой катионов к препарату ГС (ГС0 или ГСз,з) добавляли ЭДТЛ до конечной концентрации 5 мМ, инкубировали 30 мин при комнатной температуре, а затем диализовали против 0,05 М Трис-НС1-буфера (рН 7,0) для удаления комплексов ЭДТЛ с металлами. Оба препарата ГС после обработки были свободны от катионов, так как не проявляли биосинтетической активности при использовании реакционной среды без кэгпюнов и проявляли активность в катионсодержащей реакционной среде (табл. 1). Необходимо отметить, что присутствие связанных катионов оказалось важным для конформа-ционной стабильности фермента. Так, нативные формы ГС A. brasilense хранились в течение нескольких месяцев без потери активности, в то время как свободные от катионов формы фермента не восстанавливали полностью

активность в катионсодержащей реакционной среде (она падала в среднем в 1,5 paia за неделю хранения препарата при -М°С).

Специфичность ГС A. brasilense к катионам была исследована также с использованием свободных от металлов препаратов фермента. Как видно из представленных а табл. 1 данных, все три исследованных катиона, Mg \ Мп и Со:*, были эффективны в поддержании активности как неаденилированной, так и адеиилированной ГС. Таким образом, ГС A, brasilense существенно отличается от ГС £ coli, у которой неаденилированная форма фермента активируется Mg:* и Со3*, но не активна с MnJt (Segal and Stadtman, 1972). Важно отметить, чго Мп"* был менее эффективен в поддержании активности ГС азоспириллы по сравнению с MgJ'n Со , причем как в случае ГСу,так и в случае ГСо- ГСо проявляла максимальную активность с Со5*, rCjj — с Mg1*.

Эксперименты с активацией ГС A. brasilense одновременно двумя катионами (Mg1*+Со2*, а также Mn"+Со3*) н е показали значительного прироста активности по сравнению активацией ГС с одним катионом (табл. 1) Важно в этой связи отметить, что для некоторых бактериальных-ГС описан активирующий эффект кобальта при субоптимальных значениях катионов магния (Hatanaka et а!., 1987). Основываясь на современных представлениях о механизме действия бактериальных ГС (Eisenberg е/ а!., 2000), некоторые авторы полагают, что ге-теробнядерный катализ более эффективен, чем гомобиядерный (Антонюк, 2002), но нам не удалось зарегистрировать значительного возрастания активности фермента,при одновременном добавлении Mft1*" и Со11 вреакционную смесь. Данный факт, по-видимому, говорит о том, что в выбранных нами условиях гетеробиядерный катализ-либо не протекает (металлсвязывающие сайты связывают только один катион, отличающийся большим сродством), либо имеет место, но менее эффективен, чем гомобиядерный.

Соотнося полученные нам» данные с имеющимися в литературе сведениями, можно отметить, что по специфичности к трем основным катионам ГС А. brasilense Sp24S не. идентична ни одной из изученных к настоящему времени глутамннсиктетаз. Учитывая представленные данные, а.также тот факт, что изученная ранее ГС A. brasilense Sp245 со степенью аденилирования 6,4 может . при определенных условиях давать ббльшие значения активности с Мп2*, чем с MgI+ (Беспалова и др., 1994), можно думать, что специфичность ГС азоспириллы к основным катионам все же меняется с изменением степени аденилирования, однако не так, как это имеет место в случае ГС кишечной палочки.

-1. Кинетическое поведение неаденилированной ГС прн активации катионами двухвалентных металлов

В рамках данной работы было предпринято также изучение кинетического поведения свободной от металлов неаденилированной ГС. Зависимость скорости глутаминсинтетазной реакции от концентрации трех субстратов - аммония, L-глутамата и АТФ—исследовалась при активации фермента Mg5" и ■

Изучение зависимости скорости реакции от концентрации аммония при активации Mg2* показало, что максимальные значения активности ГС достигались при относительно невысоких концентрациях аммония (2,6 мМ) Дальнейшее ее

повышение приводило к ннгибированйю активности фермента, которое достигало 76% (рис. 1а). Кинетическое поведение ГСо по отношению к другому субстрату, глутамату,^ при активации тем же катионом, сходно с таковым для аммония. Максимальное значение скорости реакции наблюдалось при концентрации субстрата 20 мМ. Субстратное ингибирование составляло 82% (рис. 1 б).' Кривая насыщения АТФ имела вид гиперболы. Наблюдалось плавное нарастание активности фермента с увеличением концентрации данного субстрата'{рис. 1в), что характерно и для других ГС (Пушкин и др., 1983; Bhandari and Nicolas, 1984).

При смене активирующего катиона с магния на марганец менялся и характер кинетического" поведения фермента. Так, в случае насыщения фермента аммонием-ил и глутаматом максимальная активность достигалась в том же диапазоне концентраций, но субстратное ингибирование было менее выраженным и; составляло лишь 6-? % (рис. 1г,-<Э). Функция насыщения ГС АТФ в выбранном нами диапазоне концентраций была представлена прямо пропорциональной зависимостью (рис. 1е).

Полученные - экспериментальные данные анализировались также в координатах Лзйнуивера-Берка и Корниш-Боудена, Ни в одном из исследованных случаев использование этих подходов не позволило рассчитать значение Кwtagt ). Сравнение кинетики неаденилированной ГС A. brasilertse, активируемой катионами магния и марганца (рис. 1), с кинетикой среднеаденилированной ГС азоспириллы' (ГСм), активируемой- теми же1 катионами (изучено ранее, Беспалова и др., 1994), позволяет увидеть ряд важных черт этого фермента.

Во-первых, во всех исследованных случаях кинетические зависимости изучаемого фермента сложны и не описываются уравнением Михаэлнса-Мен-тен, что обусловлено, вероятно, регуляторными функциями- данного фермента в метаболизме клетки,

■ Во-вторых, степень аденнлировання влияет на каталитические свойства как Мп1+-активнруемой, так и Мсг ^активируемой- ГС азоспириллы. Так, в случае среднеаденилированной Мп -активируемой формы ГС не происходило насыщение глутаматом и аммонием (повышение концентраций этих субстратов даже до больших, нефизиологических значений приводило к плавному нарастанию активности фермента). В случае ГСо, наоборот, Мпг*-акти виру ем ая форма не только достигала насыщения аммонием и глутаматом, но и демонстрировала небольшое ингибирование каждым из этих субстратов (рис. 1г, д). При активации фермента - магнием ингибирование активности фермента его субстратами наблюдали как для ГСо, так и для. ГС^, однако в случае неаденилированной формы оно было ярко выраженным, (82% и 76% для глутамата и аммония,соответственно), в то время как для. аденилированной формы - умеренным фВД соответственно).

• В-третьих, активирующий катион способен изменять каталитические свойства фермента - как неаденилированной, так и среднеаденилированной формы ГС. При этом:хара1сгер влияния активирующего катиона.был разным при разных степенях аденнлировання.

Глутамзт, мМ Глутамат, мМ

Рис. 1. Зависимость активности неадениянрованной формы глутамипсинтетазы Л. ЬгшИегие при активации М^* (а, б, в) и Мп2* (г, д, е) от концентрации: ЫНчС! - (в, г), Ь-глутамата натрия - (6, л), АТФ - (в, е).

Таким образом, полученные экспериментальные данные показали, что у А. ЪгсиНете 5р245 ГС подвергается сложной внутриклеточной регуляции; активирующий катион и степень аденилирования фермента являются, по-видимому, теми . регуляторными инструментами, посредством которых клетка быстро и гибко ■ изменяет активность ГС в ответ на меняющиеся условия окружающей среды.

4. Влияние агглютиннна зародышей пшежшы на активность н степень а леи н л и ро ванн я глутамнненнтетазы

Описанные в предыдущих разделах работы механизмы регуляции активности ГС А. ЬгазИепзе Бр245 - регуляция свойств и поведения фермента адени-лированнем-деаденилированием и сменой активирующего катиона - реализуются внутриклеточно. Мы исследовали также экстраклеточный тип регуляции активности ГС азоспириллы.

Характерной особенностью бактерий, живуших в условиях фитосимСиозз, является появление дополнительных факторов регуляции, исходящих от расте-ння-хозяина. В случае азоспнрилл, образующих ассоцизтивные и эндофитные симбиозы с пшеницей, одним из таких факторов регуляции является лектнк пшеницы (АЗП). Накопленные в 90-х годах экспериментальные данные способствовали формированию представления об АЗП как о молекулярном сигнале для А. ЬгазИете 5р245, изменяющем метаболизм этой бактерии в направлении, благоприятном для роста и развития растения-хозяина (Антонюк и Игнатов, 2001). Детальное исследование обнаруженного явления (способности лектина пшеницы служить молекулярным сигналом для азоспириллы) привело к накоплению фактов, позволяющих думать, что сигнальные свойства лектина реализуются только в условиях, характерных для симбиоза азоспириллы и пшеницы, то есть в микроаэробных азотфиксирующих условиях (Антонюк, 2002). Что касается глутачинсинтетазы, то установлено, что связывание АЗП с клетками азоспириллы, растущей в микроаэробных азотфиксирующих условиях, приводит к увеличению активности фермента и к активации его биосинтеза (Лто-пуик е* а!., 1995; Антонюк и соавт., 1997). Учитывая тог факт, что лектин связывается с поверхностью бактерии (Каграй а а\„ 1999), мы рассчитали удельное количество АЗП на клетку азоспириллы для диапазона концентраций, вызывающих активацию ГС. Эти величины находились в диапазоне от 12,5x10*' до 187,5*10"* мкг/кл. Интересно отметить, что авторы работы (АпЮпуик ы а/., 1993) наблюдали увеличение активности ГС даже при 10-минутном воздействия АЗП. .

В связи с этим одной из задач нашей работы была проверка предположения о том, что при росте А. ЬгазНеюе Бр245 в условиях аэрации на азотсодержащей среде клетки теряют способность увеличивать активность ГС в ответ на воздействие ЛЗП. Были проведены две серии экспериментов. В обоих случаях культуру растили аэробно в колбах Эрленмейера с использованием качалки на стандартной аммонийсодержащей синтетической малатной среде при температуре 32°С; Так хак в проведенных ранее исследованиях (АпЮпуик е! а1, 1993) было установлено, что активация лектином пшеницы максимально выражена в

логарифмической фазе роста культуры, то и в нашем случае воздействие АЗП на клетки азоспмрнллы оценивали в логарифмической фазе роста.

В первой серии экспериментов клетки после культивирования подвергали воздействию ЛЗП аналогично тому, как обрабатывали их ранее в азот-фикснруюших условиях (Лпгопуик е1 а1, 1993): осаждали центрифугированием, ресуспендпровали в 0,85% КаС1 (концентрацию клеток определяли по стандарту мутности; она составляла 5*10' клУмл). АЗП добавляли из расчета 62,5x10"* мкг/кл. (удельное количество АЗП, вызывавшее максимальную активацию ГС в условиях азотфнксации, Лтопуик с( а1, 1993) и инкубировали без дополнительно^ аэрации при комнатной температуре в течение 30 мин. Активность и степень аденилирования фермента определяли в пермезбилизиро-ваиных клетках. В суспензию контрольных клеток АЗП не добавляли. Измерение активности фермента показало, что клетки азоспмрнллы, подвергавшиеся воздействию лектина, и контрольные клетки имеют практически одинаковую активность (табл. 2). Степень аденилирования также была одинаковой в опыте и контроле (п = 3,6 ± 0,5). В описанном эксперименте воздействие АЗП на клетки оздспиркллы осуществлялось в достаточно жестких условиях - клетки подвергались сильному стрессу (центрифугирование и смена богатой среды культивирования на физиологический раствор).

Таблица 2. Влияние агглютинина зародышей пшеницы (ЛЗП) на активность глутаминсиктетазы клеток А. ЬгахИеюе, выращенных в аэробных условиях на аммоннйсодержащей среде

Варианты активации клеток ' Активность* ГС, мМ у-ГПС

Опыт (+АЗП) Контроль {6м АЗП)

1. Клетки, отмытые 0,85% N301, удельное количество АЗП 62^*10*мкгЛл. 149 ±3 145 ±3

2, Клетки в среде культивирования, удельное количество АЗП 210=ь 3" 260 ±3

3. Клетки в среде культивирования, удельное количество АЗП 0£25х10'мхгйа. 218 ± 4 215±5

'Активность ГС определялась трансферами методом. * 'Доверительные интервалы даны для надежности 95 fi.

Во второй серии схема эксперимента была немного изменена: культуру растили на той же среде и в тех же условиях, что н в первом случае. Далее стерильно отбирали алнквоту суспензии клеток для оценки их количества по стандарту мутности. Концентрация клеток в культуре составляла 10' кл/мл. В опытные колбы стерильно добавляли раствор АЗП из расчета 12^x10* мкг/кл (удельное количество АЗП, также вызывавшее активацию ГС в условиях азот-фиксации, Antonyuk et al, 1993). Опытные культуры подвергали активации лектином в течение часа, контроль растили без добавления АЗП Таким образом, активацию клеток лектином проводили в ходе культивирования (с использо-

вам нем качалки при температуре З^С), После этого клетки осаждали центрифугированием и ресуспвизировали в 0,85 %NaCl. Активность фермента и степень аденилировання определяли .так же, как.и:в первой серии экспериментов.1 Было установлено, что- в .клетках A. brasilense, подвергавшихся воздействию АЗП, регистрировалась более низкая активность, чем в контрольных клетках (табл. 2). Различие составляло 18%. Ингибирующий эффект АЗП исчезал при 20-кратном снижении' концентрации: добавляемого лектина: активность в контроле и опыте были'равны. Степень аденилировання ГС оставалась неизменной (и = 3,4¿0,2) и не зависела от присутствия АЗП в среде культивирования. ■

Таким образом, полученные данные свидетельствуют отш,чго у азоспириллы, выращенной в аэробных условиях на аммонийсодержащей среде,- АЗП не-увеличивает активность ГС и не оказывает влияния на степень ее аденилировання.

5. Вторичная структура глутаминеи ктетазы A. brasitense Sp245 ' Интерес к вторичной структуре ГС азоспириллы был предопределен тем, что сведения об этом типе структуры бактериальных глугаминеннтетаз единичны - (Hachimori et aL, 1974; Colombo and'VHIafranca, 1986 Kimura et a!.', 1989, Kimura and Sugano, 1992; Matsuoka and Kimura, 1985). Как видно из представленных выше данных, каталитические свойства изучаемого' нами фермента зависят от степени аденилировання и от активирующего катиона. В' этой связи интересно было исследовать вторичную структуру ГС A, brasilense,' а также оценнть влияние на нее катионов двухвалентных металлов »степени аденилировання фермента.

Для исследования были взяты две молекулярные формы фермента, различающиеся по степени аденилировання - ГСо и ГСзл-Для каждого из препаратов ГС был получен спектр КД нативной формы фермента, содержащей, как было показано выше, катионы, связанные с белковой глобулой. Кроме того, были получены спектры свободных от металлов форм ГС азоспириллы, приготовленных обработкой 5 мМ;ЭДГД и спектры ГС с'добавлением катионов (Мн2\ Mg1* или Со14). На основе, полученных спектров с использованием программы CONTIN было рассчитано содержание элементов вторичной структуры. Спектр КД нативной неаденилнрованной ГС в диапазоне длин волн 190-240 им представлен на рисунке 2 (спектр а). Спектры нативной ГС, к которой был добавлен один из исследуемых катионов (Mn1*, MgI+ или Со*Y в каждом случае в концентрации 1 мМ), были очень близки к спектру исходного препарата (не представлено), Удаление связанных катионов приводило к изменениям во вторичной структуре фермента (рис. 2,'cneicip б). Сделанные на основе полученных спектров КД расчеты по содержанию элементов вторичной структуры-показали, что нативная ГСо азоспириллы является высокоструктурированным белком: 59% полипептидной цепи субъединицы представлено а-спиралью,' 13% приходится на p-структуру (табл. 3). Удаление связанных с нативной ГСо азоспирил-лы 'катионов приводило к изменениям в содержании; элементов вторичной структуры фермента: доля а-спиральных участков полипептидной цепи снижалась на 21%; а доля p-структур возрастала на 19%.'

1ЭЬ 15900

граа* зоооо

см1*

дмоль"1 :)оо»

кооо

150(10

таоа

¡ооо

ю

ДЛНК1 ВФЛкМъ Н1

Рис. 2. Спектры КД неааекнлированкой глуттоинсиктетаэы А. ЬгазИегие Бр245: а - натнона* ГС, б - свободная от металлов ГС (обработанная 5 мМ ЭДТА).

Рис. 3. Спектры КД частично аденилироеанной формы глутаминсинтетазы А. ЬгшИете 5р245 (п-5,3): а - натавпая ГС, С - свободная от металлов ГС (обработанная 5 мМ ЭДГА).

Таблица 3. Содержание элементов вторичной структуры . Неаленилированной глутамннсинтетазы А. ЬгазНете Бр245

Варианты обработки Элементы вторичной структуры ГСо. %

«•спираль Р* структура Неупорядоченные фрагменты

ГС* 59 ±2 13 ±5 28 ± 3

ГС*" 38 ±2 32 ±4 30 ± 3

* ГС* + 52 ±4 21 ±7 27 ±7

ГС* + Мл3* 56 ±2 - 13 ± 4 31 ±3

ГС* + Со3* 57 ± 2 21 ± 4 22 ¿4

Примечания: доверительные интервалы даны дм надежности 95 "Л. *ГС - нзгивный фермент.

"ГС-свободный от металла фермент (обраСота1[ниЯ 5 мМЭДГА).

Полученные данные позволяют предположить, что высокоаффннное связывание катионов в металлсвязывающнх участках ГС0'азоспириллы вызывает структурно-конформационные переходы в молекуле фермента. В случае частично аденнл про ванной ГС А, Ьга$Исте (ГС5.3) спектр КД натнвного фермента (содержащего связанные катионы) также отличался от спектра фермента, свободного от катионов (рис. 3). Расчеты содержания элементов вторичной структуры показали, что нативные ГСо и ГС5.3 статистически достоверно не отличаются по содержанию а-спиральных и р-участков в молекуле (табл. 2, ср. табл. 3). Удаление катионов из нативной ГС^ приводило к снижению доли а-спи-рали в молекуле фермента и возрастанию числа Р-структурирован них участков (табл. 4), то есть характер изменений был таким же, как и в случае ГСо-

Таблица 4. Содержание элементов вторичной структуры частично аденилированной глутамннсинтетазы Л. ЬгазИепзе 5р245 {п=5,3)

Варианты обработки -• • Элементы вторичной структуры ГС^, %

а-спираль р-структура /' Неупорядоченные фрагменты

ГС* 58 ±2 ' 10±2 ' 32 ±2

ГС** 49 ¿3 20 ±2, 31 ±2

57±2_ 19±2 24 ±2

• ГС**+Мп^ 52 ±3 Ю±2 38 ±3

ГС** + Со2" 58±2 . 1б±2 2б±3

Примечания: доверительные интервалы даяы для надежности 95 %. •ГС - нативный фермент,

* *ГС - свободный от металла фермент (обработанный 5 мМ ЭДТА).

град"

см3*

дмодь'1

-яв

ояоо

Рис. 4. Спектры КД частично алели,iHpotiíH ной глутаминсинтстазы • A. brasiUnst Sp245 (п-5,3}: а -свободная от металлов ГС)д, б - TCjj + Со:\ в - TCj j + Mg**,r-rCíj + Mn1*.

Добавление двухвалентных катионов (Mn;\ Mg1* или Со1*) к свободной от катионов ГС;,} приводило к изменению в спектре КД(рнс.4) и, как показали расчеты, влияло на вторичную структуру фер-35 мента (табл. 4). Характер влияния зависел от добавляемого катиона. Так, Mg1* н Со1^ восстанавливали уровень содержания а-спиральных участков до значений, характерных для нативного фермента, в то время как Мп — нет. По-разному вели себя катионы и в способности восстанавливать - при добавлении к свободному от металлов ферменту — содержание ß-структур по-яипептндней цепи до уровня изтивного фермента. Так, добавление Мп2* восстанавливало уровень этого типа структуры, в то время как при добавлении Mg2* или Со1" подобного снижения в содержании {З-структур не происходило (табл. 4).

Анализ полученных данных позволяет сделать вывод о том, что в случае ГС A. brasilense Sp245 регулятор ное воздействие двухвалентных катионов сопровождается изменением также и вторичной структуры фермента, что в свою очередь согласуется с хорошо известным постулатом о взаимосвязи структуры и функиии белка. Так, аденнлированная ГС азоспириллы (п=5,3) была наименее каталитически активна с Мп2*, наиболее активна с Mg1*. Это хорошо коррелирует с данными по влиянию Мп1* и Mg1* на вторичную структуру фермента (табл. 4), Так, Мпг'-содержащая ГС была наименее структурирована (сумма а-спиральных и (^структурированных участков составляла 62% полипептидной цепи), и, наоборот, Mg '-содержащая ГС азоспириллы была наиболее структурированным ол игомером среди всех исследованных' в рамках данной работы вариантов (а-слиральные и ß-структурированные участки в сумме составляли 76%, и только 24% полипептидной цепи имели неупорядоченную конформа-цию). Способность свободной от катионов ГС при связывании катионов увеличивать долю a-спиральных участков и снижать долю ß-струетур не является исключительной способностью ГС A. brasilense Sp245. Ранее такое же свойство было описано н для Bacillus Stearothermophilus (Hachimori et al, 1974).

Сравнение результатов исследования по вторичной структуре ГС азоспирнллы с литературным л данными по ГС из других источников показало, что молекула ГС азоспирнллы более структурирована, чем другие к настоящему времени изученные бактериальные ГС (Данг Хоанг Фыок .Хьен, 19ББ; Hachimori et al., •1974; Colombo artd Villafhnea, 1986; Kimura et al., 1989, Kirnura and Sugano, 1992; Matsuoka and Kimura, 1995). В случае E. coli суммарная доля а-спнралн и р-структуры в молекуле ГС составляла 52?'о, для фермента Д stcarothcrmophîlus - 41% (Hachimorï et al, 1974), в то время как для ГС A. bras Нет с Sp245 эти показатели колебались от 62 % до 78 %.

6. Изучение металлсвязываюшнх центров методом эмиссионной спектроскоп it и ЯГР

Кобальт играет важною роль в клеточном метаболизме в качестве одного из существенных микроэлементов, в частности, о составе ферментов (Williams, Fraùsto da SÎIva, 2000). Участие кобальта в процессах, протекающих в живых организмах, ограничено обычно весьма малыми концентрациями, что затрудняет исследование химических форм его существования if их превращении. Метод ЭС ЯГР,при возможности получения образцов, содержащих физиологически активный кобальт в виде радионуклида !ТСо, позволяет получить уникальную информацию на атомном уровне о химической природе его биокочплексов.

g работе изучали электро-форетически гомогенный препарат ГС A. brasiknse Sp245 (ГСц), предварительно освобожденный от катионов обработкой 5 мМ ЭДТА (с последующим ди* ' атизом для отделения комплексов ЭДТА-металл), который был перед измерениями допирован "Со:* (из расчета не более 24 атомов кобальта на одну молекулу ГС в соответствии с максимальным количеством металл связывающих сайтов фермента). На рис. 5 а приведен его ЭС- ЯГР. Измерения проводили в замороженном водном растворе при температуре 80:' К. Соответствующие расчетные мёссбауэров-ские параметры приведены в табл. 5 (образец 1).

TIB

C.O©OC»V. Vtrft

Ряс. 5. Эмиссионные спектры ЯГР частично ааеннлиро-ванной ГС (n»2,2) A. brosiîtnst Sp245, активированной

катионами Со : а— в замороженном водном растворе; б - в: твердом вазе, (преобразовано в форму, соответствующую абсорбционному варианту). Приведены также отдельные спектральные компоненты, составляющие суммарный спектр (огибающая сплошная линия), полученный аппроксимацией экспериментальных данных (точки). Скобками над базовой (нулевой) линией показано положение максимумов отдель- " кьге спектральных компонент (квлдрупольнык дублетов).

Таблица 5. МСссОзуэровскнс параметры, рассчитанные из эмиссионных спектров ЯГТ глутаминсинтетазы (п=2,2) А. ЬгаьНсте Бр245, допированной катионами 1,Со1*, в замороженном водном растворе и в сухом виде

Образец С.О. Ô, мм/с Д, мм/с Г, мм/с S,. %

1. Раствор ГС "Со1*; заморожен после 60 мин ннкубашш (Г" 80 К) +2 1,08±0,02 3,08±0,08 0,48±0,05 18±1

+2 1,05±0,02 2,39±0,0б 0,75±0,08 60±1

*3 0,34±0,10 1,12±0,20 1,25±0,30 22±1

2. Раствор ГС + "Со1+; высушен на воздухе {7"= 80 К) +2 1,08*0,02 2,97±0,0б 0,52±0,12 24*1

+2 , 1,07±0,02 2,29±0,0б 0,бб±0,08 50±1

+3 - 0,39±0,10 1,37±0,20 1,19±0,27 2б±1

Примечания: СО. - степень окисления нуклеогенной компоненты ("Fe), стабилизированной после ядерного превращении исходного "Со1*; 6, ым/с - изомерный сдвиг (относительно ot-Fe; преобразовано в форму, соответстеутощую абсорбционному варианту); Д, мм'с - квадрупольиое расшеиленне; Г, мм/с - полни ширина лоренневской линии на половине интенсивности; S^ % - относительная площадь спектральной компоненты, представляющая относительное содержание соответствующей химической формы "ре, образук>-щеЯся при распаде исходного !'Сог', при условии равенства фактора Мессбау>рз для всех форм, содержащихся в образце н дающих вклад в спектр. .

Как следует из полученных данных, в спектре присутствуют две компоненты, соответствующие двум формам высокоспинового нуклеогенного железа(И) с различной координационной структурой (Ingalls, 1964), о чем свидетельствует заметное различие значений квадрупольного расщепления (3,08 и 2,39 мм/с). В первом приближении можно предположить, что форма Ре", которой соответствует меньшее значение квадрупольного расщепления, отвечает сайгу, характеризующемуся большей координационной симметрией. Отметим, что в случае ГС S. typhimurium катион, связанный в сайте ni (последний имеет приблизительно в 50 раз более высокое сродство к катиону, .чем п2), координирован тремя остатками Glu, т.е. тремя карбоксильными группами, тогда как в сайте п2 - остатком His и двумя остатками Glu, то есть одним донорным атомом азота гетероцикла His и двумя карбоксильными группами (Eisenberg et al, 2000; Yamashîtae/o/., 1989).

По данным работы (Eads et al, 1988), дополнительными лигандамн, связанными с катионом в активном центре ГС, служат молекулы воды. В таком случае для ГС из A. brasîlcnse б&льшее значение квадрупольного расщепления для одной из форм железа(И) (Д = 3,08 мм/с; табл. 5,* образец 1) может отражать пониженную координационную симметрию катиона, соответствующую различным донорным атомам (N, -0); при этом-значения - изомерных сдвигов для указанных выше координирующих лнпшдов в.сайгах л1 и п2 достаточно близки. Аналогичные параметры были приведены в работе (Vértes et al, 1979) для абсорбционного спектра ЯГР комплекса железа(Н) с ДНК, где имеется аналогичный остатку His гетероциклический фрагмент с донорным атомом-N. Таким образом, форма нуклеогенного iTFe11 с параметрами.5=** 1,05 мм/с, Д-

2,39 мм/с (табл. 5, образец 1) соответствует кати о »связывающему сайту п1 активного центра ГС, обладающему Солее высоким сродством к катиону, чем сайт п2, которому соответствует форма с параметрами 5 = 1,08 мм/с иЛ = 3,08 мм/с,. - Данный вывод вполне согласуется с значительно меньшим относительным содержанием последней (5,=18% против 60% для формы, соответствующей сайту п1). '. ,

. Заслуживает внимания также тот факт,' что выход стабилизированной нук-леогенной формы 5Тет, образовавшейся в результате пост-эффектов, который составляет 22% (табл. 5), значительно ниже, чем величина (57%), наблюдающаяся.в сильно разбавленных, быстро'замороженных (при Т »■ 80 К) водных растворах мСоСЬ (Вертеш, Надь, 1998), что соответствует аквокомплексам кобальта(П). Строго говоря, каждой исходной химической форме "Со2* может соответствовать образовавшаяся в результате пост-эффектов форма стабилизированного нуклеогенного яЕеш. Однако ввиду недостаточного разрешения линий "ре1* вклад последнего при очевидном отсутствии релаксационных эффектов был аппроксимирован одним квадрупольным дублетом, что в данном случае.не влияло на. разрешение полос "Рсг* (рис. 5, табл. 5). Данное снижение выхода стабилизированной формы "ре111 отвечает более прочному связыванию исходного иона 57Со2* вышеуказанными биолигандамн, имеющими'более сильные электрон од опорные свойства, в межсубьединнчиых пространствах двух гексамеров молекулы ГС (ШзепЬе^ е1 а!„ 2000).

7 Для. проверки стабильности комплекса кобальта с ГС и правильности сделанных выводов был также снят эмиссионный спектр высушенного образца (рис. 5 б). Спектр имел аналогичный вид, хотя интенсивность полос была в два раза больше, что в-целом характерно для твердых соединений в отличие от замороженных растворов. При этом параметры, рассчитанные для высушенного образца ГС£г (табл. 5, образец 2), статистически неотличимы от параметров для образца ГС« в растворе. - ' ' •'''

Тахим образом, с помощью метода ЭСЯГР, впервые примененного для изучения связывания катионов ферментами,' показано, что ГС'азоспириллы содержит два металл связывающих сайта в активном центре, обладающие различным , сродством-к катиону Со2* и различной ' координационной симметрией. Полученные данные дают основание полагать;'что ГС Л. Ъга$Неп$е близка по ■ организации активных центров ГС Е. соЦ и ^•рЫтигЫ'т.

/ выводы.

1. Подобраны условия культивирования/}. ЬгазИете 5р245, индуцирующие образование глутаминсинтетаэы с определенной степенью аденилировання.

2. Разработаны способы выделения и очистки глутаминсинтетазы А. ЬгахНетс 5р245, позволяющие тюлучшъ элеюроферепгкеки гомогенные препараты с разной степенью аденилировання. Исследована термостабильность фермента, -

. 3; Изучена , специфичность неаденилнрованной'и. адеиилированной (п='5,3) форм глутаминсинтетазы А, ЬгазОете к катионам двухвалентных металлов. Установлено, что специфичность глутаминсинтетазы к Г^1*, Со1+ и Мп5" зависит от степени азенилирования фермента.

4. Изучено кинетическое поведение неаденилированной глутами н си нтетазы А. brasilensc. Установлено, что, как и в случае среднеаденнлированной формы фермента, неаден11лированная глутамннсинтетаза имеет сложное каталитическое поведение, не описываемое уравнением Mихаэлиса-Ментен и зависящее от катиона, активирующего фермент.'

5. Установлено,, что при росте A. brasifense в аэробных аммоний ассимилирующих * условиях агглютинин'зародышей пшеницы не индуцирует активации глутаминсинтетазы и не влияет на се степень аденилирования.

6. Изучена вторичная структура двух молекулярных форм глутаминсинтетазы A. brasíleitse: неаденилированной и аденилированной (п=5,3). Показано, что глутаминсинтетазы азоспириллы независимо от степени аденилирования является высокоструктурированным белком: до 78% полипептидной цепи представлено a-спиралью и ß-структурой. Установлено, что добавление катиона (Mg1*, Mr1* или Со1*) к свободному от металлов ферменту изменяет соотношение элементов вторичной структуры белка.

7. Впервые методом эмиссионной спектроскопии ЯГР с использованием радиоактивного изотопа 17Со изучены особенности организации активного центра' глутам и нси нтетаз ы А. ' brasihnse. Показано, что активный центр фермента имеет два металлсвязывакицнх сайта, обладающих различным сродством к катиону Со1* и различающихся координационной симметрией.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Беспалова Л.А., Коршунова (Смирнова) В.Е., Антонкж Л.П., Игнатов В.В. Выделение, очистка и кинетические свойства глутаминсинтетазы со средней степенью аденилирования из AzospiriUum brasitense Sp245 it Биохимия. -1994.-T, 59, вып. 1. - С. 55-61.

2. Antonyuk L.P., Smirnova V.E., Kamnev A.A., Serefarennîkova O.B., Vanoni M.A., Zanetti Q., Kudetina I.A., Sokolov O.I., Ignatov V.V. Influence of divalent cations on the catalytic properties and secondary structure of unadenylylated glutamine synthetase from AzospiriUum brasilensc // BioMetals. - 2001. -V. 14. -P. 13-22.

3. Kamnev A.A., Antonyuk L.P., Smimova V.E., Serebrennikova O.B., Kulikov L.A., Perfiliev Yu.D. Trace cobalt speciation in bacteria and at enzymic active sites using emission M&ssbauer spectroscopy // Anal. Bioanal. Chem. - 2002. — V. 372, No. 3. — P. 431-435.

4.. Smimova V.E., Antonyuk L.P., Kamnev A.A., Kulikov L.A., Perfiliev Yu.D. The role of, cations in the functioning of glutamine synthetase from AzospiriUum brasilense // Metal Ions in Biology and Medicine/L. Khassanova, Ph.Collery, I, Maymard, Z. Khassanova, J.-C. Etienne (Eds.). John Libbey Eurotext, Paris, 2002. -V.l-P.306-311.

5. Кам'нев A.A., Антонюк Л.П., Смирнова B.E., Куликов Л.А., Перфильев Ю.Д., Кузманн Э., Вертеш А. Использование эмиссионной спектроскопии ядерного гамма-резонанса для изучения координации кобальта в активных

центрах бактериальной глутаминсшггетазы // Докл. РАН, 2003. - Т. 393, N, 3. -С.407-411. ' * ' . ,. ,

6..Kamnev А .Л., Antonyuk L.P„ Smimova V.E., Kulikov L.A., Perfiliev Yu.D.t . .Kudelina I.A., Kuzmann E., Wrtes A. Structural characterization of glutamine synthetase from AzospirUlum brasilense //,Biopolymers (Biospecuoscopy), 2004 /:,(принятавпечать 16.10.2003 г.).

7.: Antonyuk L.P., Bespalova L.A., Korshunova (Smimova) V.E. Some biochemical properties of AzospirUlum glutamine synthetase // Abstr. '20е1 Meet. FEDS. -Hungary, 1990.-P.21S,PrT4575;

. 8., Smimova V.E., Antonyuk L.P., Kamnev A.A., Serebrennikova O.B., Kulikov L.A., Perfiliev Yu.D. Structure and regulation* of glutamine synthetase from the . endophytic .bacterium AzospirUlum brasilense Sp245 // In:" Proc. Book, of 4tt INTAS Interdisciplinary Symposium on'Physical and Chemical Methods in Biology,"Mcdicine, and Environment. Moscow, Russia, 2001.-P. 12-13.

9. Смирнова B.E., АнтЫпок Л.П., Камнев A.A., Серебренникова О.Б., Игнатов В.В. Вторичная структура и 'каталитические свойства неаденнлнрованной глутамннсинтетазы AzospirUlum brasiknse / Сборник, докл. XII юбилейной конференции «Ферменты микроорганизмов».—Казань, 2001.-С, 30-31.,

10. Antonyuk L.P., Smimova V.E., Kamnev. А.А., Kulikov L.A., Saprykin АЛ., Perfiliev .Yu.D. Cobalt speciation in bacteria and at the enzymic active sites by emission MOssbauer spectroscopy // Second International Conference on Trace Element Speciation in Biomedical, Nutritional and Environmental Sciences. — Munich-Neuherberg,Germany,2601.-H38.-P.55. • •''

11 .Смирнова B.E., Беспалова - JI.А;, Антонюк Л.П. Глутаминсинтетаза • AzospirUlum brasiknse: некоторые каталитические ирегуляторные свойства фермента И Стратегия' взаимодействия микроорганизмов с окружающей средой. Первая региональная конференция молодых ученых. — Саратов, '2002.-С24-25. • , * •. '

П.Смирнова* В. Е., Камнев А.А., Куделина ILA^ Куликов JI.A., Перфильев ЮД,' Антонюк Л.П. Глутаминсшггетаза бактерии AzospirUlum brasilense: некоторые особенности структуры и регуляции фермента // Тез. науч. докл. на III съезде биохимического общества. - Санкт-Петербург, 2002. - С. 605. 13:Smimova V.E., Antonyuk L.P., Kamnev AAf, Kulikov LA, Perfiliev Yu.D. The irole of cations in the functioning of glutamine synthetase from AzospirUlum brasilense //7th Int. Symp. on Metal Ions in Biology and Medicine, St.-Petersburg, Russia, May 5-9, 2002. Abstracts. - Trace Elements in Medicine (Moscow), 2002.'-V.3.N.2.-P, 70-71. . *

I4.Kaimiev A.A.,' Antonyuk L.P., Smimova V.E.', Kulikov L.A., Perfiliev Yu.D., Kuzmann E., Vertes A. Two-metal-ion active centres in bacterial glutamine synthetase as probed by emission MSssbauer spectroscopy // Book of Abstracts. 10* Eur, Conf. on the Spectroscopy of Biological Molecules, Szeged, Hungary, t Aug. 30 —Sept. 4,2003. —P. " ,

»2033 3

Подписано » печать 27.11.2003 Формат 60x84 1/16. Бумага офсетная. Гарнитура Times, Печать RISO. О&ьеи 1,0 гтеч.л. Тире* (00 эгс. Змэа № 347.

Отпечатано с готового оригинал-микста Центр полиграфических и копировальных услуг Предприниматель Сср»ган Ю.Б Свидетельство Jtó 117

410600, Саратов, ул, Московская, д. 152, офис 19