Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Регуляция активности глутаминсинтетазы у пурпурных серобактерий

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Регуляция активности глутаминсинтетазы у пурпурных серобактерий"

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

имени М.В.ЛОМОНОСОВА _Биологический факультет_

На правах рукописи УДК 576.8.095

ХАТИПОВ ЭМИР-АСАН АМЕДОВИЧ

РЕГУЛЯЦИЯ АКТИВНОСТИ ГЛУТАМИНСИНТЕТАЗЫ У ПУРПУРНЫХ СЕРОБАКТЕРИЙ.

Специальность 03.00.07 - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биолопгческих наук

Москва — 1994

Работа выполнена на кафедре микробиологии биологического факуль Московского государственного университета им. М.ВЛомоносова.

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор,

Р.Н. ИВАНОВСКИЙ Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

В.К.ПЛАКУНОВ

кандидат биологических наук, доцент В.В.ГРОШЕВ

Диссертация направлена на официальный отзыв в Институт почвоведе и фотосинтеза РАН.

Защита диссертации состоится "24" февраля 1994 г. в 1510 часов на заседании специализированного совета 053.05.66 в Московском государственном университете им. М.ВЛомоносова по адресу: 119899, Москва, Воробьёвы горы, МГУ, биологический факультет, аудитория М-1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета МГУ.

Автореферат разослан

Ученый секретарь специализированного совета, канд!Шат биологических наук

Н.Ф. Пискунко

Актуальность проблемы.

Пурпурные бактерии широко используются при исследовании фотосинтеза и других биологических процессов. К числу таковых относится метаболизм разных соединений азота. Важное место в метаболизме азота у многих микроорганизмов принадлежит глутаминсинтетазе (ГС), участвующей в ассимиляции аммония. Среди фототрофных микроорганизмов основными объектами изучения свойств ГС до сих пор являлись пурпурные несерные бактерии, а также некоторые цианобактерии. Данных об азотном метаболизме и ферментах, которые в нем участвуют, у пурпурных серобактерий значительно меньше. Но даже они свидетельствуют о том, что могут быть определенные различия в метаболизме азота и путях его регуляции у отдельных представителей этих микроорганизмов.

Цель и задачи работы.

Целью настоящей работы было изучение регуляции активности ГС у фототрофных пурпурных серобактерий, относящихся к разным семействам. Для достижения этой цели решались следующие задачи.

1) Определить, какие ферменты участвуют в ассимиляции аммония у Пиосарха гоаеоретс'иш и разных видов ЕсЮ1Ыог1юс1о$р'1га для оценки роли ГС.

2) Исследовать способы регуляции у этих бактерии активности ГС.

Научная новизна.

Показано, что у Т.гоьеорепкта в ассимиляции аммония основное значение независимо от источника азота имеет глутаминсинтетазный/глутаматсин-тазный путь. У разных видов ЕсШМогкос1о5р'1га данный путь ассимиляции Г-Ш^ является основным при росте бактерий в условиях азотфиксации. При росте на средах с ИЩ"1" у этих бактерий в ассимиляции аммония участвует также глута-матдегидрогеназа, ГС Т.го$еорег5кта очищена в 194 раза. Эксперименты с суспензиями и экстрактами клеток, а также очищенными препаратами фермента показали, что ГС Т.гохеоретста регулируется аденилированием. Установлено, что снижение активности ГС у Т.гозеоретсша в результате аденилирования в ответ на внесение в среду >1Н4+ зависит от освещения, а следовательно от энергетического статуса клеток. Исследование роли трансмембранного электрохимического градиента протонов (ДцН) в инактивации ГС Т.гозеорегзгста аммонием показало, что основную роль в этом процессе играет ДрН. Добавление МЩ+ в среду инкубации суспензий клеток разных видов ЕсшЫог1юс1озр'1га также приводит к инактивации ГС. Регуляция активности ГС у Е.$Иароз]иикоуп, как и у Т.гохоретапа, опосредована энергетическим статусом клеток.

Практическая ценность.

Знание азотного метаболизма фототрофных пурпурных бактерий и механизмов его регуляции важно для отбора высокопродуктивных штаммов и оптимизации условий их культивирования с целью применения как продуцентов

биомассы, богатой белком, витаминами и каротиноидами, а также в качес азотфиксаторов и для получения молекулярного водорода в целях возобиог ния энергетических ресурсов.

Апробация работы.

Материалы диссертации доложены на конференции "Регул® микробного метаболизма", Пущино, 1989 г. По теме диссертации опубликов; две работы.

Структура и объём диссертации.

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, методического ма риала, изложения результатов и их обсуждения, выводов и списка литератур!

Объекты и методы исследования.

Объектами нее л е до ваши служили пурпурные серобактерии Thioca roseopersicina BBS и разные виды Ectothiorhodospira: E.shaposhnikovii DSM 1 Emobi/is BN 8115, E.vacuolata DSM 2111, E.halophila BN (51/1) 9624, E.halochl ABN 9850 ir E.abdelmalekii BN (51/20) 9840. В целях сравнения некоторые опь проводили с пурпурной несерной бактерией Rhodobacter sphaeroides 2R. ] штаммы были получены из коллекции кафедры микробиологии МГУ.

Для культивирования T.roseopersîcïna использовали среду Пфеннига модн-фикации Богорова (1974). Культивирование E.shaposhnikovii проводили среде (Larsen, 1953), содержащей lr/л NaCl. Умеренно галофильные ви E.mabilis и E.vacuolata выращивали на средах Пфеннига (Truper, 1968) Имхоффа (Immhoff et al., 1981), соответственно, содержащих 30 г/л Na Галофильные виды (E.abdelmalekii, E.halochloris и E.halophila) культивировали среде с 130 г/л NaCl (Immhoff, Truper, 1977). Все среды содержали бнкарбо} (0,2%), сульфид (0,1%), тиосульфат (0,2%) и ацетат (0,1%). В качестве истс ника азота в среду добавляли NH4CI (0,1%) или культивирование проводил! атмосфере молекулярного азота. R.sphaeroides выращивали на срс (Ormerod, 1961) с бикарбонатом (0,2%), малатом (0,1%) и (NH4)2SÛ4 (0,135 Культуры выращивали в анаэробных условиях на свету (1000 лк). Для опыт использо-вали клетки из культур, находящихся в экспоненциальной фазе рои

Активность глугаматдегидрогеназы (ГДГ), глутаматсинтазы (ГОГАТ) и ал ниндегидрогеназы (АДГ) определяли спектрофотометрически (Meers et al.,197 Johansson, Gest, 1976) в экстрактах клеток, полученных их разрушение ультразвуком. Активность ГС определяли как в экстрактах, так и в клетка пермеабилнзованных бромидом цетилтриметлламмония (ЦТАБ) в биосинтет! ческой и трансферазной реакциях (Bender et al., 1977). В пристутствии ïiohî Мп2+ измеряли полную трансферазную активность, то есть сумму аденилирс ванной и неаденилированной форм ГС. По степени подавления трансферазнс активности 60 мМ вычисляли степень аденшгарования фермента.

При изучение действия света, аммония и различных мембранных ингибиторов на активность ГС биомассу бактерий вносили в свежую среду без источника азота или среду, содержащую NH41" (20мМ)и инкубировали в течение 4,0-5,5 часов при 10000 люкс (если не указано иначе). Инкубацию клеток (0,05-0,15 мг белка/мл) проводили во флаконах (500 мл), содержащих 250 мл среды. Через каждые 15-60 мин. отбирали пробы, добавляли в них ЦТАБ, отмывали клетки трис-HCl буфером (40 мМ, pH 7,75) и измеряли биосинтетическую цАпи трансфертную активности ГС. Через 4 часа инкубации во флаконы с суспензиями вносили NH41" (20 мМ, если не указано иначе) и/или карбонилцианид-3-хлор-фенилгидразон (50 мкМ), бензойную кислоту (ЮмМ), олигомицин (1мкМ) и отбирали пробы суспензий для определение активности ГС.

При исследовании действия на активность ГС наложенной ДЧ' суспензии клеток (2-6 мг белка/мл), содержащие KCl (100 мМ) и валиномицина (ЮмкМ), инкубировали в темноте 1 ч. для обеспечешш проникновения антибиотика в мембраны и выравнивания вне- и внутриклеточной концентрации К+. Далее суспензии разводили в 40 раз в среде с или без NH4+, отбирали пробы на измерение активности ГС.

Для выяснения влияния pH среды на активность ГС, суспензию клеток прединкубировали 4 ч. на свету при pH 7,0, после чего значение pH увеличивали до 8,5 и затем вновь возвращали к исходному значению. Эксперименты по наложению разнонаправленного ДрН проводили в темноте с использованием клеточных суспензий (2-6 мг белка/мл), имевших исходные значения pH 6,0 и 8,0. Их инкубировали в течение 60 мин. Далее суспензии разбавляли в 40 раз в среде (pH 8,0 и 6,0, соответственно) с или без NH4+.

Все описанные выше эксперименты проводили в анаэробных условиях.

Деаденилирование ГС проводили, инкубируя экстракты клеток T.roseoper-sicina и R.sphaeroides (pH 7,2), полученные из суспензий, которые инкубировали 4 ч. в условиях азотного голодания и затем добавляли в них аммоний, в присут-ствии фосфодиэстеразы змеиного яда (Johansson, Gest, 1977). Фосфодиэстеразу (Millipore), ресуспендированную в 0,1 М Трис-буфере, содержащем 5,0 мМ M^Jj и 2,0 мМ M11CI2, вносили в реакционную смесь в количестве 50мкг/мл. При инкубации очищенного препарата ГС T.roseopersicina с фосфодиэстеразой пос-леднюю (0,16 мг/мл) вносили в раствор (pH 7,8) ГС (0,33 мг/мл).

Аденилирование ГС T.roseopersicina проводили в экстрактах клеток, полученных из суспензий, проинкубированных на свету в условиях азотного голодания. Экстракты инкубировали в 100 мМ Трис-HCl буфере (pH 7,5), содержащем (мМ): MgCl2 - 5,0; МиС12 - 1,0; ДТЭ - 5,0; ЭДТА - 0,1; АТФ - 5,0, глугамин - 15,0 (Foor et al., 1975).

Зависимость активности ГС T.roseopersicina от pH реакционной см определяли как в клетках, обработанных ЦТАБ, так и в очищенном препар фермента. Реакционная смесь кроме субстратов для трансферазной реаю. содержала (0,1 М) Трис и МЭС.

Очистку аденилированной ГС T.roseopersicina проводили из 10-12 г. вл; ной биомассы отмытой и ресуспендированной в безазотистой среде. Суспен: клеток инкубировали 4,5 часа при освещении, после чего с них вносили NH, продолжали инкубацию еще 30 мин и биомассу собирали центрифугировани После получения экстрактов клеток проводили выделение из них ГС в две с дни: ультрацентрифугированием (60 мин, 120000 g) и ионообменной хрома' графией на ДЕАЕ-целлюлозе. Молекулярную массу субъединиц ГС определи после электрофореза (Laemli, 1970) препарата в полиакриламидном геле.

В экспериментах по включению 32р в клетки T.roseopersicina их суспенэ из культур, выросших на среде с NH4+, инкубировали 4 ч. в анаэробных ycj виях на свету в безазотистой среде в присутствие 32р_фосфата (40ц0/мл). Че] 15 мин после внесения аммония (40 мМ) клетки отделяли от среды центрифу] рованием (1 мин., 15000 в), отмывали фосфатным буфером (50мМ, pH 7,2 NH4+, проводили лизис клеток и электрофорез (Laemli, 1970) в полиакр! амидном геле (ПААГ). Высушенные гели радиоавтографировали на пленке (PN ООСР)в кассете с флюоресцентным экраном (20°С).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ I. Ферменты, участвующие в ассимиляции аммония.

Исследованный штамм T.roseopersicina BBS проявлял активности ] ГОГАТ, а также аминирующие активности ГДГ и АДГ (табл.1). Akthbhoi аминирующих дегидрогеназ и ГС были примерно в два раза выше при ро культур в условиях азотфиксации, чем на среде с аммонием. Одн; независимо от источника азота в среде, активности ГДГ и АДГ бь значительно ниже, чем ГС и ГОГАТ. Активность ГС была выше в клет: T.roseopersicina, выращенных в условиях азотфиксации, чем за счёт утилиза!, аммония. ГОГАТ, независимо от источника азота, была на одном уровне, полученных данных следует, что у T.roseopersicina BBS при росте культу! условиях азотфиксации и за счёт использования аммония основную рол! ассимиляции NH4+ играет ГС путь.

ГС T.roseopersicina была очищена в 194 раза. Электрофорез очищенной (чистота препарата ä£5%) в ПААГ показал одну главную полосу, соответст ющую молекулярной массе субъединицы фермента 52800 Да. Такую же моле] лярную массу (в среднем 50000 Да) имеют ГС других исследованных pai бактерий (Dalton, 1979; Johansson et al., 1983).

Таблица 1.

Активность ферментов (нмоль/мин-мг белка), участвующих в ассимиляции аммония у Т.гозеоретста, при использовании разных источников азота.

Источник азота ГДГ АДГ ГС ГОГАТ

(НАДФН) (НАДН) (НАДН)

ища 2,1 2,2 145,0 38,0

N2 4,1 3,8 245,0 38,0

Активность ГС у разных видов ЕсШ!иог!юс1озр1га, как и у Т.гозеоретста, была значительно выше (от 10 до 400 раз у разных видов) при их росте за счёт использования N2, чем Активность ГОГАТ в меньшей степени зависела

от источника азота, чем ГС, хотя в условиях азотфиксации активность данного фермента, как и ГС, была несколько выше, чем при росте культур на средах с аммонием (табл.2). Активность ГДГ у Е.зНароэиткот, Е.тоЬШз и Е.гасиоШа при росте на среде с аммонием была выше, чем в условиях азотфиксации. У Е.Иа1орМ1а, Е.ка1осЫот и Е.аЬёе1та1аШ активность этого фермента проявлялась только при их росте за счёт утилизации аммония. Активности АДГ у разных видов ЕсшЫогЬос1о$р'1га не обнарузено.

Таблица 2.

Активность ферментов (нм/мин-мг белка), участвующих в ассимиляции аммония у разных видов Ее/о /Л ¡ог!юс1озр ¡га при использовании разных источников азота.

Вид ГДГ ГС ГОГАТ

(НАДН) (НАД(Ф)Н)

ЫН4С1 N2 ища N2 МН4С1 N2

Е.ьЬарозНмкох'Н 39,88 22,5 33,82 543,60 15,68 46,41

Е.тоЬШз 16,86 4,2 3,97 185,95 13,52 53,38

Е.уасиоЫа 26,75 6,8 3,74 233,01 6,85 39,50

15,4*

Е.каЬсЫот 2,80 0 0,37 165,75 3,38 5,55

Е.аЬс1е!та1екИ 1,78 0 0,51 84,34 4,73 10,11

Е.ка1орЫ1а 0,44 0 0,23 70,10 0,69* 1,71*

♦Активности ГОГАТ, специфичной к НАДФН. Во всех остальных случаях ГОГАТ специфична к НАДН.

Таким образом, у разных видов рода ЕсШкогкойогрка в услов азотфиксации ассимиляция аммония также, как у Т.гоьеорепи осуществляется в результате функционирования ГС и ГОГАТ. При росте э бактерий на среде с ИЩ* в его ассимиляции, видимо, участвует и ГДГ ЕлЪароькп¡кочи в таких условиях роста активности ГС и ГДГ примерно равны

II. Регуляция активности глутаминсинтетазы у Т.гозеоретста.

При инкубации клеток Т.го$еореЫста на свету без источника азе активность ГС после 5,5 часов возрастала по сравнению с исходной более че] восемь раз (рис. 1) и достигала значений в несколько раз больших, чем в кл ках, выросших в условиях азотфиксации (табл.1). Увеличения активности Т.говеоретста не происходило, если клетки находились в темноте, или на св в среде, содержащей В присутствии хлорамфеникола активность ГС у

личивалась в 2,5-3 раза (в основном - за 30-60 мин.). Отсюда следует, что н людаемое увеличение активности ГС обусловлено двумя факторами: 1) акти цией исходно присутствующих в клетках молекул ГС и 2) синтезом ное молекул фермента. Оба процесса, возможно, зависят от интенсивно« освещения суспензий, т.к. при освещенности ниже 2000 люкс быстрого ро активности ГС не происходило.

Активность, нмоль/мин мг белка.

Рис. 1. Изменение трансферазной активности ГС Т.говеоретста при инкубации суспензий клеток:

1. - на свету в среде без хлорамфеникола (ХА) и ЫН^;

2. - на свету в среде с ХА без КН4+;

3. - на свету в присутствие МЩ"1" без ХА

4. - в темноте в отсутствие МЩ"1" и ХА;

Ативность ГС Т.гозеоретста регулируется путем аденилирования/ деаденилирования. Такой вывод позволяют сделать следующие данные.

1. После добавления аммония (>1,0 мМ) к суспензиям клеток Т.гозеоретс'та, находившимися в условиях азотного голодания, происходило быстрое (за 10-30 минут) снижение как трансферазной (рис.2,А), так и биосинтетической (рис.2,В) активности ГС.

2. При инкубации экстрактов клеток Т.гозеоретста, полученных из суспензий этой бактерии, в которые был добавлен аммоний, в присутствии фосфодиэстеразы, степень аденилирования ГС уменьшалась (табл.3). Аналогичные данные были получены в опытах с экстрактом клеток К^р!1асго1(!еЕ. Для данной пурпурной несерной бактерии ранее было доказано, что ее ГС регулируется аденилированием (Сахно и др., 1981).

Время, мин. Время, мин.

Рис. 2. Изменение трансферазной (А), биосинтетической (В) активности ГС в клетках Т.гозеоретста в ответ на внесение аммония в среду инкубации. N -степень аденилирования. Аммоний добавлен в 0 минут.

Таблица 3.

Изменение степени аденилирования ГС (%) Т.говеорепюпа и В^ркаегоШ5 при инкубации экстрактов клеток с фосфодиэстеразой.

Время инкубации, мин. 0 30 60 180

Т.гозеореЫста ВВ5 94,0 93,7 90,5 72.1

КзрЬаего'^еБ 2Л 86,8 82,8 80,3 55,9

3. При инкубации очищенного препарата ГС Т.гозеорепк'ша в присутствии фосфодиэстеразы, происходило увеличение трансферазной и биосинтетической активности фермента (рис.3).

4. При инкубации экстрактов клеток T.roseopersicina в буфере, содержаи глутамин и АТФ, происходило снижение биосинтетической активности ГС 40% в течении 40 минут. Аналогичныые данные были получены ранее для р. хемотрофных бактерий (Foor et al., 1977), а также R.sphaeroides (Johansson, G 1983, Engetoardt, Klemme, 1982), у которых ГС регулируется аденшшровани Данный эффект свидетельствует о смещении равновесия в системе аденилир! вания, зависящем от соотношения концентраций глутамина и 2-оксоглутар (Tyfcr, 1978). Чем выше это соотношение, тем более аденилирована ГС, и наобор

5. На рапиоавпяраммах, полученных после эжгарофорешческого разделения б ков T.roseopersicina среди других 32р-меченых полипептидов обнаруживался 6ej с молекулярной массой 48000 Да (табл.4), если в среду при инкубации кле был добавлен аммоний. В клетках, инкубировавшихся без добавления NH4*", Кой белок отсутствовал. С учетом разрешающей способности метода радио тографии (»10%), данный белок ■ идентифицирован как субьединица

Т. roseopersicina.

Активность, rot/мин мг (х 10001.

Активность, нм/мин мг.

0 10 20 30 40 50 60 0 10 20 30 40 50 61 Время, мин. Время, мш

Рис. 3. Изменение трансферазной (А)и биосинтетической (В)активности очшц<

ной ГС T.roseopersicina в присутствии фосфодиэстеразы (ФЭ).

Таблица <

Молекулярные массы белков, меченых 32р-ф0сфатом до и после внесения аммония в суспензии клеток T.roseopersicina.

№ пика 1 2 3 4 5 6 7

Мол. масса, Да 32000 40000 48000 62000 70000 77000 93000

-nh4+ + + - + + + +

+NH4+ + + + + + + +

Примечание. Знак "-" означает, что полосы, соответствующие данным белка меченым 32р_ф0Сфах0М) на радиоавтограммах не обнаруживаются.

Активность ГС T.roseopersicina регулируется также путем ретроингибиро-вания некоторыми аминокислотами и нуклеотидами. Трансферазная активность ГС пермеабилизованных клеток T.roseopersicina подавлялась (табл. 5) в присутствии глицина, аланина и серина. Ингибирование ГС указанными соединениями было сильнее в клетках, к суспензиям которых был добавлен аммоний, чем инкубированных в среде без источника азота. Это, видимо, отражает изменение свойств фермента при его аденилировании в ответ на добавление NH4+.

Для ряда бактерий показано, что в результате аденилирования ГС происходят изменения ее рН-зависимости и сродства к двухвалентным ионам (Johansson et al., 1983, Merrick, 1988). У T.roseopersicina, несмотря на заметное снижение активности ГС, таких изменений не происходило. ГС клеток T.roseopersicina, выращенных на среде, содержащей NH4+, как и проинкубированных в условиях азотного голодания, имела рН-оптимум 7,75 и в реакции с Мц2+, и Mg2+. Это указывает на отсутствие точки изоактивности фермента при различной степени его аденилирования. Оптимальные концентрации в реакционной смеси Mg2+ и Мп2+ - 0,25 и 10,0 мМ, соответственно, как для аденшшрованной, так и деаденилированной ГС.

Таблица 5.

Действие некоторых аминокислот и нуклеотидов на трансферазную активность ГС клеток Т.говеорепкта, инкубированных в среде с и без НН4+.

Соединение Концентрация, мМ Ингибирование, %

-NH4C1 +NH4CI

Алании 20 80 83

Аспарагин 40 7 11

Гистидин 40 18 29

Глицин 40 54 73

Глутамат 40 -2 6

Серии 20 56 63

АТФ 5 -17 7

ЦТФ 25 20 13

Примечание. Активность ГС измеряли в присутствие указанных соединений в клетках, проинкубированных в условиях азотного голодания и через 30 мин. после добавления к их суспензиям аммония.

Снижение активности ГС клеток Т.го.чеореЫс'та в ответ на добавлен! ИН4+ в их суспензии происходило только на свету (рис. 4, А). Активное] инактивированной аммонием ГС практически полностью восстанавливалась д исходного уровня при дальнейшей инкубации клеток в темноте (рис. 4, В). Эт результаты позволяют заключить, что аденилирование ГС клеток Т.шеоре, $1с1па, происходящее в ответ на добавление к их суспензиям ИЩ"1- - процес< связанный с энергетическим статусом мембран. Фактором, определяющи снижение активности ГС клеток данной бактерии при добавлении в среду к инкубации М-Ц"*", является наличие трансмембранного градиента рН. Об это свидетельствуют следующие данные.

1. В присутствии мембранного разобщителя карбонилцианид-3-хлорфени. гидразона (ХКФ) снижения трансферазной активности ГС при добавлен! №14+ к суспензиям клеток Т.гоьеорегзкта, инкубируемых на свету в среде б источника азота, не происходило (рис.5). Действие ХКФ, как извести проявляется в снятии как АрН, так и АЧ' на мембранах клеток.

2. Подщелачивание среды инкубации клеток Т.гоьеоретста, не содерж щей аммония, до значений рН больше 8,0 (снятие ДрН) приводило к снижет трансферазной активности ГС. При доведении рН до исходного значения (7, активность фермента восстанавливалась (рис. 6).

Рис. 4. Изменение трансферазной активности ГС в клетках Т.гозеоретста ответ на внесение в среду аммония (0 мин.) в зависимости от наличия света.

3. При наложении ДрН на мембраны T.roseopersicina, направленного внут] клеток, в присутствии NH4+ активность ГС снижалась через 20 минут в 6 р (рис.7). В отсутствии аммония 'снижения активности фермента не происходил Наложение ДрН, направленного из клеток наружу, как в присутствии NH4 так и без него не приводило к снижению активности ГС (рис. 7, кривые lui Таким образом, и без освещения аммоний способен оказывать ингибирующ

действие на активность ГС Т.го$еоретс'та при условии одновременного увеличения ДрН на мембранах клеток.

4. Наложение ДЧ' на мембраны клеток Т.гохеореккта с помощью валиномицина и КС1 в отсутствие освещения не приводило к снижению активности ГС как в присутствии, так и в отсутствие аммония (рис. 8)

5. Снижение активности ГС клеток Т.гозеоргтапа, инкубируемых на свету, в ответ на внесение бензойной кислоты, приводящей к снятию ДрН на мембранах, происходило столь же быстро, как и после внесения ЫН4+ (рис.9). При одновременном добавлении ГШ4+ и бензойной кислоты инактивация ГС усиливалась.

2000 1500

1000 500

О

Рис. 5. Действие аммония и ХКФ на трансферазную активность ГС Т.гозеорептпа. Указанные соединения вносили в суспензии клеток в 0 минут.

1200 1000 800 600 400 200 0

0 30 60 90 120

Время, мин.

Рис. 6. Зависимость трансферазной активности ГС клеток Т.говеоретста от изменения рН среды.

Активность, им/мин мг белка

ХКФ

,— Контроль -

\ ХКФ + аммоний

\ Аммоний

-------е

О 15 30 45 60

Время, мин.

Активность, нм/мин мг белка

Активность, %

Время, мин.

Рис. 7. Действие наложенного искусственного градиента рН и аммония на трансферазную активность ГС Т.гозеоретета.

1 - суспензии клеток (рН 6,0) переносили в среду (рН 8,0) без МН4+.

2 - суспензии клеток (рН 6,0) переносили в среду (рН 8,0) с 1ЧН4+.

3 - суспензии клеток (рН 8,0) переносили в среду (рН 6,0) без ИН4+.

4 - суспензии клеток (рН 8,0) переносили в среду (рН 6,0) с ИН4+.

Активность, нм/мин мг белка

Рис. 8. Действие валиномицина (ВМ) и аммония на активность ГС T.roseopersicina.

1 - суспензии клеток без ВМ и KCl переносили в среду с NH4+.

2 - суспензии клеток с ВМ и KCl нереносили в среду с NH4+.

3 - суспензии клеток без ВМ и KCl нереносили в среду без NH4+.

4 - суспензии клеток с ВМ и KCl нереносили в среду без NH4+.

Активность, нм/мин мг белка

Время, мин.

Рис. 9. Влияние бензойной кислоты (БК) на активность ГС

Т.гозеорепкта в присутствии и в отсутствие аммония.

Регуляция активности глутамиисинтетазы у ЕсМЫогЬойозрЪга зрр.

Как и у Т.гоьеорепк'та, инкубация суспензий клеток различных видов ЕстЫогкоЛтрка в условиях азотного голодания на свету (10000 лк) сопровождалась ростом активности ГС. Наиболее заметно этот процесс был выражен у ЕлИпрохЬткоуИ.

Внесение аммония в суспензии клеток разных видов ЕсюЫог]\ос1о5р\га^ проинкубированные в отсутствии источника азота, приводило к снижению активности ГС через 30 минут в 2-14 раз (табл.6).

Таблица 6.

Действие аммония на трансферазную активность ГС у разных видов ЕсШМогко(!о$р1га (в % от исходной).

Вид А(МП2+) А(Мп2+ + Мв2+)

ЕлкарозИткомп 27 14

Е.тоЬИк 35 29

ЕласиоШа 34 32

Е.ка1осМопз 51 52

Е.аЬ(1е!та1екИ 26 25

Е.ка!ор1и!а 7 16

Примечание. Активность ГС измеряли. через 30 мин. после внесения в среду аммония. А(Мп2+) - активность.с Мп2+, А(Мп2+ + - актив-

ность в присутствии Мп2+ и

В отличие от Т.гозеоретста, на активность ГС в клетках Е^ИароэНткох проинкубированных в условиях азотного голодания, аммоний оказывал пода ляющее действие не только при наличии освещения, но и в темноте. П[ перенесении суспензий клеток этой бактерии в темноту без внесения в ш аммония активность ГС снижалась примерно на 40% за 60 минут (рис. 1С Снижение активности ГС при переносе суспензий клеток в темноту было пок зано ранее для пурпурной несерной бактерии Я.$р1шего1(1е5 (Сахно и др., 1981).

Также, как у Т.гозеорепкта, смещение значения рН среды с 7,0 до 8,0 пр] водило к снижению активности ГС ЕяНарозНткоуЦ (рис.11).

Добавление ХКФ к суспензиям голодающих по азоту клет< Ел/шрозЬткохЦ не приводило, в отличие от Т.гозеорепкта, к снятию репре сирующего действия аммония на активность их ГС. Более того, внесение суспензии клеток ХКФ отдельно от аммония также сопровождалось снижение активности фермента (рис. 12).

Оптимальные значения рН для трансферазной активности ГС Е^1шров}ийко\'И в присутствии ионов магния и марганца неодинаковы. Ферме! имеет рН-оптимумы активности в присутствии ионов а также Мп2+

,8 и 7,3, соответственно, как в клетках, проинкубированных в условие азотного голодания, так и после добавления к ним аммония. Оптимум р активности ГС в реакции с ионами марганца смещался после добавлен! аммония со значения 7,5 до 7,3 (рис.13).

Добавление аммония к суспензиям клеток ЕлкарозИткохИ также, как и Т.говеореЫста, не приводило к изменению сродства ГС к ионам Мп2+ и Мц2'

Активность, нм/мин мг белка

120

100

ВО

60

40

20

0

О

20

40

60

Время, мин

Рис. 10. Изменение трансферазной активности ГС в клетках ЕлИаро^ЫИсот, проинкубированных в течение 4 часов на свету в условиях азотного голодания, после перенесения их в темноту и добавления аммония (1) и без него (2).

Активность, нм/мин мг белка

Время, мин.

Рис. 11. Влияние значения рН среды на трансферазную активность ГС ЕзкарохИткоуи. В 0 мин. значение рН среды изменено с 7,0 до 8,5.

Активность, нм/мин мг белка

Время, мин.

Рис. 12. Влияние ХКФ и аммония на трансферазную активность ГС ЕлкарозЬткоуЦ Указанные соединения вносили в 0 мин.

Активность, нм/мин мг Активность, нм/мин мг

Значение рН

Рис. 13. Зависимость трансферазной активности ГС клеток Е.вкарозкткоуЦ от значений рН. Активность ГС измеряли в суспензиях клеток после их инкубации: на свету (10000 лк):

1- в условиях голодания по азоту до (левая ось ординат);

2-й после добавления в них >Ш4+ (правая ось ординат).

Рассмотренные данные свидетельствуют о регуляции активности Г( разных видов Ес1о1кюг}юс1о5р¡га, как и у Т.юьеорепк'та, на уровне измене активности этого фермента. Быстрое падение активности ГС при увеличен! среде концентрации аммония характерно для бактерий, у которых доказан м низм регуляции активности данного фермента аденилированием. Отсюда мо: заключить, что регуляция активности ГС у Е.я/шрозкмкоуи (и, видимо, у др; видов данного рода), как и у Т.говеоретс'та, осуществляется посредством аде лирования. Очевидно, что подобно ферменту Т.гоьеорепШпа, регуляция ак' ности ГС Е.зкарохкшкоу'й сопряжена с энергетическим статусом клеток.

17

ВЫВОДЫ

1. Thiocapsa roseopersicirta штамм BBS при росте за счёт использования аммония и в условиях азотфиксации имеет высокие активности глутаминсинтетазы и глутаматсинтазы, но низкие активности глутаматдегидрогеназы и аланинде-гидрогеназы. Это свидетельствует о преобладании глутаминсинтетазного пути ассимиляции NH4+ у данного вида фототрофных пурпурных серобактерий в разных условиях роста.

5. У пурпурных серобактерий рода Ectothiorhodospira (E-shaposhnikoviiE.mobilis, E.vacuolata, E.halophila, E.halocliloris и E.abdelmalekii) при росте в условиях азотфиксации ассимиляция аммония также происходит в основном в результате функционирования глутаминсинтетазного пути. При росте культур на среде с аммонием в ассимиляции этого соединения принимает участие и глутаматдегидрогеназа.

2. Активность глутаминсинтетазы T.roseopersicina регулируется аденилированием/ деаденилированием, а также ингибированием некоторыми аминокислотами по принципу обратной связи.

3. Инактивация глутаминсинтетазы T.roseopersicina аммонием зависит от энергетического статуса клеток и сопряжена с утилизацией трансмембранного градиента протонов. Необходимым условием инактивации глутаминсинтетазы при добавлении в среду аммония является наличие на мембранах T.roseopersicina ДрН, направленного внутрь.

4. Молекулярная масса субъединиц глутаминсинтетазы T.roseopersicina -52800 Да, что соответствует данным для фермента других исследованных ранее бактерий.

6. Судя по действию аммония на активность глутаминсинтетазы E.shaposhnikovii и других видов Ectothiorhodospira, регуляция данного фермента у этих пурпурных серобактерии также осуществляется путем аденилирования. Для E.shaposhnikovii показано, что важным фактором регуляции активности глутаминсинтетазы, как и у T.roseopersicina, является энергетический статус клеток.

По теме диссертации опубликованы следующие работы.

1. Ивановский Р.Н., Сахно О.Н., Хатипов Э.-А.А. Особенности азотного метаболизма у пурпурных серных бактерий и свойства глутаминсинтетазы. // Всесоюзная конференция "Регуляция микробного метаболизма", г. Пущино. 1989.

2. Хатипов Э.-А.А., Нгуен Фыонг Тьи, Ивановский Р.Н. Ассимиляция аммония фототрофиыми бактериями рода Ectothiorhodospira. // Микробиология. 1993. Т.62. №6. стр. 35-40.

3. Хатипов Э.-А.А., Ивановский Р.Н. Действие света и аммония на глутаминсинтетазу пурпурной серной бактерии Thiocapsa roseopersicina штамм

. BBS. Ц Микробиология. 1994. Т.63. (в печати).