Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

СВОЙСТВА И ПЕРВИЧНАЯ СТРУКТУРА 2,5 ? РНК ИЗ ВЕТВЯЩЕГО ФЕРМЕНТА

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "СВОЙСТВА И ПЕРВИЧНАЯ СТРУКТУРА 2,5 ? РНК ИЗ ВЕТВЯЩЕГО ФЕРМЕНТА"

.." ЛКАДЕЬЗК СССР ОРДША ДЖИНА ИНСТИТУТ Ша и^.А.Н.Баха

На правах рукописи

■■■/'. КОЩЕЕВА.

Галина Александровна

СЕЩСТЕА И ШШЧНЛЯ СТРЖГУ?А2,б$Ш: ИЗ ББГЕ&ЗГО ФШЛШТА

. 03.00,04 - биологическая хюлия

. \. ■ ■

Авго^&форат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических нарт..

Москва - 1973

Работа выполнена а лаборатории энзимодогш

Ордена Ленина Института биохимии им.А.Н.Баха АН СССР

'• * ^

Научные руководители: ... доктор биологических наук , старЁшй;научный сотрудник

. . " . А.Н.Пегрова, ' , ; " доктор биологических наук,-сгарпий научцрй сотрудник Т.В.Венкстерн . : •

Официальные огшоненты: доктор биологических наук Б.Ф.Шглазов , ■ . доктор химических неук В. Н. Шибаев . . _

Ведуне предприятие:. Институт биоарганической ■

хиши ик.^.К.Шемякина АН СССР ' " '

■ ■ • .-■■'■'■ ; ■ ' : 1 '

Защита диссертации состоится ■ " 1978 г, '

в " чйс; на заседании Специализированного совета

(К 002.96.01) по пртсуздеии» ученой степени кавдвдата ааук при-Институте.биохимии им.А.Н.Баха АН СССР (117 071, ¡цосква, В-71, Ленинский проспект 33, корп.2)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологической литература Ж СССР'(Ленинский пр.ЗЗ, корп.1)

Автореферат разослан _1978 г.

Ученый секретарь Специализированного -¡овета кандидат биологических наук /

* . . М«И.Молчанов

•i CEiiAH ХДОШТЕРИСША РАБОТЫ

: Актуальность работы. Среди важнейших процессов жизнедеятельности значительная роль принадлежит взаимодействиям нуклеиновых кислот с белками. Однако, несмотря на большое коли-: чество 'исследованийj посвященных этой проблеме, следует отметить, что многие ее стороны и в частности вопрос о природе взаимного узнавания белков и нуклеиновых кислот до сих'пор остается не выясненным. : :■'.■

' в связи с проблемой белково-нуклеиношх взаимодействий ', особый интерес представляет изучение ферментов нуклеопротеид- ■ ; ной порода. О существовании таких ферментов неоднократно со-обралось в литературе; изучение их представляет значительный интерес в различных аспектах. Исследование i-ц структурой функции, расшифровка механизма регуляции действия ферментов и использование их как естественной модели для изучения белко-во-нуклеинового взаимодействия - все это важные,. но пока еще мало изученные аспекты этой проблемы.

; ; ,Сведений, касающихся изучения рибонуклеоэнзимов, как они были удачно названы английскими учеными Фердинандом и др. (BaÊa8Îri3amJi'.i5ëï<3Î'/ici/)i/^9TO) сравнительно не^мйг'о. Так, например, известно, что эти фершнты катализируют раз личные' реакции и шделеньг из разных источников. Однако, несмотря;на^ 'это, важно отметить, что этим ферментам присущи общие.сэойетва* касающееся как. их строения, так и механизма действия. Показано} наличие в их составе нуклеинового компонента, который представляет собой ШК, по всей вероятности, низкого молекулярного

веса. FHK связана с белком этих ферментов прочной связью, . * : однако, характер этой связи до сих пор'остается не шясненным. Установлено, что удаление НИ из ферментных препаратов приводит : к понижению энзиматической активности. В раде случаев;показана возможность реконструкции'шсокоактишого препарата при добав-* лении RK, шделенной из данного ферлента.

Гетерогенность структуры является другой отличительной особенностью ферментов-рибонуклеопротевдов. Некоторые исследователи, объясняют это свойство присутствием в их составе, ; большего или меньшего количества ШК. Показано существование корреляции между содерканием FHK и активностью фракций фермент-

ный препаратов.

• Ксследоваше CTjyKTypa рибонуклеоэнзимов является необхо-» "дакым этапом .изучения механизма их-действия и функции, а опре-;V деление особенностей :.FHK, ассоциированных с белком этих феркен- " ■ тов составляет часть этой вгдной проблемы. ; / v

Не ль работы. Целью данной работы было:ввделение, очистка и изучение свойств РНК, ассоциированной с белком ветвящего фе-Vs-^l i рмента изомеразы амилозы из скелетных мышц кролика (I® 2.4.I.I8). Ч: Для установления индивидуальности дзлней» FHK было проведено - -

' определение ее первичной структурл. Часть работы, касающейся • •'.я- исследования ее первичной структур«, была шполнена в лабора- . 'L^'.; тории функциональной энзимологии (зав.лабораторной академик v;

. '» . А. А. гаев) института молекулярной биологии АН СССР. ' \ * ' : ' -'

•Л'ЗГУ '"i": ■,'" ■ '"' ^аучная^ новизна. Определение пёрвичной структуры ШК,ассо- -'. =

■ .л^с;,. циированной с ветвящим ферментом, является приоритетным: впе]>- * V f,: ше из данного фермента наделена ШК;в ввде гомогенного препарата и расшифрована ее первичная структура. Показано, что. '

f. исследуемая НЖимеет необычный нуклеотидный составил уникаль-

*ную последовательность нуклеотидов. НПГ обогащена гуанинами и' ' ; моди.^ицироваиныш ггуклеотидами! Установлены участки РНК, обра-■, ¿Mi ■ зумцие сБязи^р-.белком ветвяцего фермента", что также является ■ \ | . ':.'.. приоритетным: показано, что с белком связаны концеше звенья ■ ; ; • FHK, образующие согласно предложенной вторичной структуре FHK неспареннке участки цепи. .'••,.• ■>'';/'■

'•'. ■ " ' - -'.,. Пшктическая дешость. "Изучение первичной структур! RfrC,

.V которая образует прочный комплекс с белком ветвя^его фермента ■■.-. ' *

• ' .из мышц. кролика," изомераз<?й амилозы (К2 2.4.1.18), важно для

' - ' понимания механизма действия этого фергента. Как показано, эта .,

\ ; ■ FHK участвует в онзнматическом процессе, катализируемом ветвя- ^ ■

': .щим ферментом и играет большую роль активируя его действие. ... ■

■ V Изучение механизма действия ветвящего энзима важно и для прак- |

; тических целей, так как, во-первых, этот фермент играет большую j. 'роль в биосинтезе гликогена» обуславливая его компактную струх- ' . ; .: туру и биологическую функцию как соединения, резервирующего V • запас энергии в организме. Во-втор1Х, познание механизма дей-: ствия Еетвяцего энзима и факторов, .активирующих его действие '' -

ваяно для лечения заболеваний, свлзаншоис пониженным 'действием. .. > \

отсутствием этого фермента в организме. К таким заболеваниям относится гликогеноз типа 1У-"амклопектиноз". При этом заболевании ткань печени практически не содержит ветвяцего фермента, а гликоген, выделенный из печени, почек, сердца имеет длинные неразветвленше шейте и внутренние вегш. В связи с этим за- : болеванием" изучение РНК, связанной с'белком фермента и активиру-щей его действие,ккеет большое практическое значение.

' Апробация работы. Работа обсувдалась на заседании совместного научного семинара лаборатории энзимологии белкового синтеза и лаборатории биосинтеза нуклеиношх кислот в институте Молекулярной биологии АН СССР. В качестве стендового сообщения ре' зультагы работы были обсуздеш на советско-французском симпозиуме по "Взаимодействию белковой нуклеиновых кислот" (г.Ташкент, 1977), а такае на VI Всесоюзной конференции по "Химии и биохи->ш углеводов" (г.Ростов-на-Дону, 1977). В конкурсе на лучшую ; научную работу-Шститута биохимии им,А.Н.Еаха АН.СССР в 1976 г* работе присуждена 2 премия. В* конкурсе научных работ института Молекулярной биологии АН СССР в 1977 г. работе прюу^деяа 2 пре-■■■ мия. ( * : .

'П.■ ■

■ ч ■ ■ Публикации. По материалам диссертации опубликовано 5 печат-.V. них работ. / . . ■ * ' ■

■ * Об"ьем тзаботы. Диссертация состоит из введения,-., обзора литег ->ратур! (2 глаш), экспериментальной части, включающей разделы "Методы"« "Результаты и их обсуадение", -шводов и с пи ска. литература. В диссертации 130 страниц машинописного текста, 28 рис„:-. и 18 таблиц. Список литератур! содержит 131 ссылку. ( ••

ЕЮПЕРОДН1ГАЛЫШ ЧАСТЬ

, I.Выделение и очистка ШК, ассоциированной с белком . . *■ ветвяцего фермента.

. .Ветвящий фермент изомеразу ашлозы (ИА) (К£ 2.4.1.18) выделяли из скелетных ищ кролика, Шшцы после измельчения и гомогенизации дваада экстрагировали 0,0514 карбонатный буфером

рй 8,5 .(150 мл буфера на 100'г мышц). Ткань удаляли центр1фу-*

- yï-:у-\ - гйрованиеа в течении £0 мин,'.при. 4 000 об./Ьшн. Ферментный пре- -карат, осаздали из центрн£уг.ата после' его разбавления водой;и * .;'

■ подхисления 0,1 и НС2 до рн'б.С. 'Далее фериент экстрагировали ■

i , из осадка 0,005 M карбонатным- буфером pH 7,5 содерлац:-« 0,06 ]я . " V КС2. Повторяли пер«осавдение ферментного препарата при'рН 5,0, .'^Ä'* а затем экстрагировали осадок 0,005 Ы карбонатнкм. буЪероц jH:'' : ;■'■ • >'''. 7,5.с 0,06 M KCl.- Нераствориш^ся часть" осадка удаляли центри-

• r f ■фугироваЬием при" 14 ООО об, /'мин. На всех стадиях шделения |кон-

троировали выход белка по Лоурп. Определение содержания ШК в .*.';' у ^ -Ai - препаратах ИА проводили спектро^ото^етргчески по Спиринупосле

¿.- кислотного гидролиза. Активность ИА определяли методом, приня- -" -f^.V:'- там для ветвяцих ферментов из мыщ и других обтектов, измеряя ■,'.; .' .. г** понижение'экстйнкции йод-крахиадьного комплекса при 520 на

/ после кнкубащм'с" ферментом,-Покиеняе экстшкции на 64 ^ при- . ■-. "шшали.заЮО ед1!Я11ц активности, 7 : :'■' \ ,',' * ■ ■

' " Получаемые ферментные препараты ИА, очищенные по белку в

'■.;/.■■£>■ "70 раз, гасли активность порадка 150 ед./иг белка и содержали ^ от 6 до 10 процентов ШК. £ля кц^елеиля ШС использовал! пре- ;

- : параты Ш, .инелфе отрщательный контроль :на с<-а^ллазу. ' . •

¡5 : . КК выделявфенольной обработкой препаратов КА. Препарат : л фермента^встряхивали с равны;* объемом с ведаперегнанного водона-: ■ сьпценног* фенола' 45 мин,, при кошатной температуре. После цент-'. "■ , f ' р:($уп'фованил.пра: 4 ССО об./ыин. на холоду отбираки'водный сло;Г . " ;И; вновь: обрабатывал!! его фенолог в."течешш 30 мин.: HiK из полу- -. ченного водного слоя ооа'кдалц д^ля объемами охла^цеиного этако-- -y' v!,-: ла с добавлением 2 «i-ного CÜ3COOK. Шпаоий осадок собирали ■

• центрифугированием при I ООО об./мин. Дважды повторяли перео- ^ ; , ч . . сахдеш;е этанолом. :'■■> '■•" -v . ■■

*■ Л' ' - , Условия фенолькой депротеинкзации варьировала добавлением ¡- '.*'_ yi'Vi *""■■ 0,1- iä-ного додецилсульфата натрия и ярогревеинем при 60° в те- . -чении 15 ыин, Прт всех вариантах депротегакзбции ИА били nojiy-'/чены препараты'FKK с примерно одшакока! шходом и не отличаю- Л" :• циеся по коэ^ри^енту седиментации, молекулярному весу и нукле-

■ Т °тадНОмУ составу. . . '-.■'■.■ " ■

- 'У'. : Окончательну» очистку RK от фенола проводил;! на Софадексе ' ■■

■ G-25 {Phatma£ix\ Швеция). Колонку' 1,2x40;см ураЕНОвешвагл ■' : L^v: 0,01 M трю-НСЕ буфером pH 7,5. Наносили на колошу 5 ыг РЛК в. ^минимальном объеме и окзировали 0,1 W Л'аС£ в том ке öyJbete..'■

^■Собирали фракции по 2 мл и измеряли их У1>-спектр1. О&ьединяли фракции, - икещие шсокое поглощение при 260 нм и соотношение плотностей при 260/230 нм равное' 2,а 260/2Б0 разное 2,0. . Ш{ осаждали двойным объемом этанола с добавлением 2 ;«-ного ffl^COCK. Дальнейяую очистку FHK проводили колоночной хроматографией.на целлюлозе ДЕ-50 ( Whatman, Англия) в градиенте :. ыûCZ по методу Холли 1965 ). Использовали колонку

1»2х5 си уравновешенную 0,05 M ацетатным буфером ïH 5,0 с 0,05 U Ua.CZ » 0,5 мЫ ЭДГА. Опыты показали, что 90 £ нанесенного на колонну материала злюировалось 0,6 M МаСЕ. Для срав!-нения было проведено фракционирование тШК^"4 в тех ке услб-виях опыта. Оказалось, что эта FHK злшровалась 0,7 Iii NaCI, ■ лчто соответствовало литературным данным методики Холли.

ё,

ш

Й' • S

¥ !

: 100

80

60

40

à £0

■ й / 1 О

гак ад

- тШК

; ; ,...•• РЛС.1

Сравнительная

хроматография

ШК ИА->и- тШК

•Бал.

1

на колонке* с целлюлозой ^-50.

0.2 „ 0,4 0,6 . Ois ТГо

Концентрация WaCÎ, M

На-рис. I представлены результаты атиг опытов; онищаит ос-ч' новани® предположить, НЖ, - выделенная из ветвацего фермента/ является более шзкомоленулярной, че:! тРНХ. -".'■VВсе препараты РНК анализировали на присутствие белка, (по Лоури и диск-электрсфорезом в ПААГ) и на .примеси поли-саз^рццов. (суыажной'хроматографией после ^3 чай, гидролиза , в 0,6 н НС1), Опыты показали, что очищенный препарат РНК не

Ж:

: ■ содеркал примесей белка и полисахаридов. Концентрацию КК : <. • ■ определяли тремя независимыми методами: по У$-спектру, орци-новой реакций:;на рчбозу и по неорганическому фосфору" после ; саигания, Расхождение меяду результатами,, полученными. этими ' методами, не прешяало б процентов. - . - ■■"■■ Й

■

Ч '

■\ .'■■■- ' " 2. Физико-химический анализ ШС 1. ' -"О

' • Лиск-электтофотсз в полиактмламипном геле (ПААГ) - V

: ' > ■■ Использовали в. основном методику ЛеЬинга с.некоторыми ; ;' более поздними модификациями, применяя гели концентраций 5- , 14 процентов. Из предварительных опытов нами были шбраны У. . слёданмцие условия для электрофореза:трис~боратнкй буфер / С .."'/. ■ (0,09 и трис+2,5 мкЫ версен+0,05 М Л'аС1-и5оркая кислота до * рН 7,8), сила тока составляла 2 на на трубку, время электрофореза Сило 2 часа. Олектрофорез проводили в.стандартном аппарате фирмы (?еапй£ , используя платиновые электроды.Ге-леше столбики окрашивали I ^-ным акрвдиношы оранжешм в.:1;".'

15 ?ь-ной уксусной кислоте или 0,2 Х-ти метяленошм синим в 0,4 М ацетатном буфере рН 5,0. 1

• *?.

•' V ■ Л • '

V-' •

." *

'Ш 1

ь-

Ч'Ь-

V- •

''Ш'.

-"Я ■ ■■■ 5

Ж/ ;-'-

* ■ . 1 ' ' • • : ."А и » >

■

I .•

• ! '■ ' Т5"

Электрофорез Га) различных концентраций Н1К ИА г ' ; (100, 50 и 20 нкг) в 6 # геле и (б) сравнитель-

но с тШК^1 (2):и рШК 23-16 £ (3) в 8 % геле.

'4 .

■■■. гу

V

\ результаты . диск-электрофореза ШК в ПААГ npi ведены на рис.2. Как видно, при всех концентрациях геля препарат Сьгл гомогенный и< более подвихнкм, чек тШК. рНЖ оставалась на".: " старте как высокого ле кудярвдй препарат. Изучение зависимости электрофоретической подвижности РНК ИА и tHHC^j31 от концентрации геля (табл.1) показало, что относительная подвиа- ' кость при пересчетена У • 100 для; ИИ ИА прямолинейно увеличивается с возрастанием концентрации теля,- а для тЩИ®^ прямолинейной зависимости не обнаружено. Вероятно, такое * .различие связано о разной структурой иссдедуешх РНК. ; .:.■■■.'■ -Таблица I. -Изменение подвижности ШК от концентрации

■ ■ ■ . геля' :.■'■• '

Концентрация-' геля,?4 ■ .т..,-' НИЩ".-

■ 4 ■Сер 4 > юо - 1 , % 4-юо

- ■■ 5 - 1,045 19,1 .1,116 47,7

. . . 8 • V. 1,184'. 73,4 ; 1,158 63,3 ^

10 1,222; '. 87,1' 1,167 67,1 "

' 12 ч ■■;■ 1,242 - . • *S4,I 1,150 60,1 ....

14 ■ 1,266 ' 102,8 1,100 41,4 "

Дня оценки молекулярного' веса РНК ИА использовали 3 •кыи акриламид-агарозный гель; Нетчикаии следили тГНК*^ и рШК 23-16$ (рис.3). Опыты показали, что моленуляршй

вес Щ{, - ассоциированной с белком ИА, соответствует .10 ООО.

рРКК 235 , | $ -1 : рРНК 5 '

,?5

V а :

s *

трн«8!" as

РНК Z,5S

^з!

• Ot8 0,9 1,0

Относительная подлинность РИК/хроска ,7 Рис, 3. Калибровочная кривая для определения ыолекулярного'

■fi' ■ *. ЩК • **

Коэффициент седиментации -

Ста часть-работы била проведена совместно с Р.С.Шаиу-лошм. Использовали аналитическую ультрацентр;5$угу, оборудо- « ванную У$-оптиной. Для анализа использовали 150-200мкг ШК -з 0,05 К ацетатном буфере рН 5,0 с'0,1 Ы МаСН и 0,5 ккМ ЗДГА. ЭДГА. Центрифугирование проводили при скорости 52 640 об. /мин, и температуре 20° с интервалом съемки 16 мин. Коэффициент \ седиментации расчитывали по б снимкам, которые денситоыетрм- ■ ровали на ¿¡-'5 4. ' . .■ ■ •

Таблица и график для расчета коэффициента седиментации НОС приведены на рис.4.-Опыты показали, что препарат:НИ{ ■ ,: был гомогенным.при ультрацентрифугировании и 1£мел коэффи-"циент седиментации,2,53 . V ' '..■'■" ^ V ■

В1С.4. - Определение коэффициента седиментации НИ

*> нин. А см Иоэф. убелш. ■лм. е * * • Щ)

16 : 13,5 16,5 11,5 1,173 6,127 0,7673

32 ' - 13,0; 18,3 - 11,4 . .1.140- 6,160: 0,7896 ■

48 12,5 18,5 II, 5 ; 1,066 6,214 0,7934

64 : 12,1: 18,5 11,5 1,050' : 6,250 ' "0,7959 '

80 ■ —

96 , И,0;; .18,5 11,5 . ; 0,955 ; , 6,345' 0,8024

" -расщеплпемость Н1К нуклеаза'-'.и

Для установления природа связен в цепи ШК, ассоциированной с белком ветвящего фермента,, было проведено изучение . . ее ра£1й,епляемостц: нуклеазами. Доступность связей НЗК фср- , иентативноыу гидролизу определяли при по«оци панкреатической РНКазы1 и фосфодиэстеразы ;Ч5ДЭ). змеиного, ззда."''£яя орав- V' нёния использовали; тШК*5^ .. НЖ'инкубировали с-КйСазой при .'. 37° в 0,025 Ы трк-НО£ буфере рН 7,6 в присутствии 2,5 М^СЯ^ и 0,08 Н ЦаСВ прн отношении фермент: субстрат=1:60- . Затем к инкубационной сьеси добавляли ФДЭ в количестве 5Смхг: ферыента в 0,1 штрис-Ш£ буфере ^ 8,8 на I шсмоль ЕНК и ; продолжали инкубацию при 37°. Степень гвдролиза Ж{ оценивали спектрофотометрически по нарастанию кислотораствррдаой франция. Опыты показали, чтб ШК ИА расщепляется обоши ферментами,- однако скорость гидролиза несколько ниже, чек раковая (для тШК^1 (рис. 5). При данных .условиях опыта после инкубации с ШКазой в течении I часа прирост кислого-.растворимой. фракции составлял £5 % для ШК 2^55 и 28 Й для тШК1^, а при последующей инкубации с 'ЗДЭв^течении 48 час. прирост составлял 83 и' 98 5», соответственно.

Ейс.5. Расцепление 2,5$ НОС (Х> и тШК^ (2) панкреатической НЖазой (а) и ФДЭ после I час. гидролиза панкреатической НШазой (б). За 100 X пра-4 няга негодная энстинация НЁС* :

3. Шрвичная структура 2,5.5 НК ^ Ищеляя в достаточном количестве гомогенный по нескольким критериям препарат ШК ш. имели возможность определить ■ ее первичную структуру. Перша этапом было определение концевых групп ШК и ее нувлеотвдного состава; затем проводили . . анализ олигонунлеотедов, подученных контролируемым гидролизом рибонуклеазадги исследуемого препарата ШК.

Концешв гтжшы и нуклеоти^ны» состав 2.5^ РНК Как известно, рибонуклеаза Т^ не оказывает предпочтения какому-либо из оснований РНК и гидролизует последние до коно-нуклеотидов, шш,епляя при этом концевые звенья в виде иутелео-зида - вконец и нуклеозчдцифосфата - 5-конец. Концевые группы легко обна^туливаотоя по их характерной хроуатогра^ической ; подв/шюсти: цуклеозвд наиболее подвижен, а нуклеозидцифосфат обладает наименьшей подвижностью по отношению к остальным продуктам гидролиза - нуклеотидем. На рис.6 представлены результаты разделения З^-ШКазного гидролизата 2,5г ШК. Опыта показали, исследуемая НЕ! количественно расцепляется до моко-нуклеотидов. Идентификация, проведенная ¿осле глюции пятен, ' позволила обнаружить в составе исследуемой ШК кроме 4 основных нуклеотидов\8 различных модифицированных компонентов (ЕЮ. Наиболее подышшм продуктом гидролизата Сил аденозин, а наименее подвижным гуаноэиндифосфат, которые и являются, очевидно, концеййьи звеньями 2,5$ ЯК. * '

Для подтверждения особенностей нуклеотвдного состава 2,5а ШК и для его количественной оценки бил применен кислотный гвдролиз с последующим разделение« гвдролизата в тонком слое целлюлозы. О&чно, применяемая для разделения таких гид г-ролиз&тоэ двуыерн&я хроматография Ч^оЧ^г £ $уеиз$оц , 1967) приводит к недостаточно четкому разделению пиримидяношх нухлеотвдов. Поэтому ад дополнили методику последовательным разделением гвдролиз ато в в трех хроматографических системах. В результате было получено хорошее разделение всех основных и модифицированных кошонецтав гидролизата' (рис.7).

•■/■¿¿у. "

.■ г < ■■■■ Г-:

' ■■ '

.«К. !..;.-,■

■" ■ ■ ■

■ 1 '

1

> ■

а

£ I

''Г г Л

• ^ . ч ... :

'- --ч •• •

.: V ?

■ ■ ~ ■ К '

л*

Рис. б. Разделение Т^-НШазных гидролизатов 2,5-г НИ пето- . "•годом ддумэрноЯ хроматографии а тонком слое целлюлозы; а - ■ ; контактная фотография, С - схема. .1 система - изомасляная кис лота: С, 5н НН40Н(10:6); ,*П система - третичный бутанодЪкон- * .центрированная нС1:Н20(557:38:385> ;

V- ¿V ■ ? ■■'.■ ■ Ч ■ " ■ .,

^''Т»-

'У

г и--' V1,;- ! ■,«'- .■.

»./>"• ..... ., I ' л

I ; " у ■ ; ■ ■ . ^

т'С £>0

т'б (

. 1

В1С.7. ^деление кислотных гидролизатов £,5^ НОС в тон- ном слое целлюлозы; а - контактная фотография, схена» £ система- изопрзпанол:конц.НС1:Н20(42,5:11:9); II система-- -... н-бутанол;Н20, мн3 в газовой фазе (86:14); Ш система изоыасляная яисдота:0,5н ЯН^Ш (10:6) "

Элюцгао у$-логлоцшацих веществ с целлюлозы проводили по ' (Тт&шХ&уМЯ, J-ljVtShtiWü ¿.Р., 1973). Для идентификация продуктов гйдролига слектрофотомет пировали злюаты в стандартных условиях (Венкстерн Т.В., Баев A.A.» 1967) на регистрирующих спектрофотометрах HHacfu (Япония) или ВесЦап-25 (США). В таблице 2 приведены результаты, спектрофотометри-.ческой идентификации продуктов кислотного гидролиза 2,55 Й5К. Црфры в скобках соответствуют литературным данным. Дополнительную идентификацию проводили по совпадению хроматографической подвшшости продукта с соответствующим свцдеяелом в нескольких системах растворителей. Кроме указанных в• таблице продуктов цветной реакцией, по Финку , :1956)

в гвдролизатах была обнаружена дигадроурщиловзя кислота. * ' . ' ' •

Таблица 2. Идентификация продуктов кислотного гидролиза 2,55 ШК по УЬ-спектромх

Продукты 0,1 н HC2 ОД н КОН

Лнак, | ^ ?*мин. Я мая. Л мин.

: ср. Gua , Ade. m^Arfo i^Sua пфиь m^Si/a tn7Sua ~262 (262) 233 (230) ¿79 (280) 242 (241) 249 (248) 255 (224) 263 (263) 230 (229) 252 (263) 232 (233) 276 (276) 243 (240) 258 (259) 232 (230). 249 (251) '226 (228) 253 (252). 235 (232) 256 (256) 233 (235) 248 (249) 233 (228) 260 (261) 243(241) 269 (271) 249(249) 268 (265) 242(246) 267 (269) .240(237) 286. (286) 246(246) 266 (266) 243( - ) 269 (270) 240(242) 275 (277) 248(245) 279 (278) 260f263) 275 (277) 262(265) 277 (278) 254(256)

^Цифры в скобках соответствуют литературным данным.

Как показало определение количественного соотношения продуктов кислотного гидролиза 2,55 НП(. (таблица 3), преобладающими среди основных компонентов являются Ср и Буа. Кодифицированные компоненты присутствуют в количестве X моля на молекулу ШК, за исключением дигадроурвди ловой и псевдо-уридиловой кислот, найденных в количестве 2 молей каждая. Общее количество нуклеотвдов в молекуле 2,55 ШК равно 31, ' 10 из них являются моди^ицировашшиш. Другой особенностью нувлеотидного состава ШК является наличие большого количества гуанинов, составляющих около 40 всех нуклеотвдов. Молекулярный вес РНК, расчитанщй на основании нуйлеотидного состава, равняется 10 ООО, что подтвердило результаты, полученные ранее методом электрофореза в ПААГ.

Таблица 3. Нуклеотидный состав. 2,55 ШК по данный кйс лота ого гвдролиза

■ , Содержание Содержание 1

Продукт миыоль* ¡«Юль/моль НП-ь Продукт мкмоль моль/моль ВТК

■ ' - делитель. 5,5 округ." Ол^уГ.

> ср А<*е ,11,0 зз", е. 25,8 2,00 6.01 4,69 •2 в 5 ^Р гп Ас|е пгбМа з,2; , 3,4 :. 3,0 1,00 1.06 0,94" ; I ? Г

биа 43,5 7,92 - 8 Лиа 3,0 0,94 - I

Л Шр 8,8 1,68 2 ! , П^Суа ) л з;2 3,5 1,00 1,09

-^Среднее значение из 5 опытов; разница величин в каждом опыте составляла ¿8 й от приводимого значения.

Р™ Среднее значение для минорных компонентов. ' '

^^По данным олигонуклеотидног о анализа.

Таким образом, ассоциированный с белком .ветвящего фермента полирибонуклеотид представляет собой низкомолекуляр-ШК, богатую гуанина:® и модифицированными компонентами

ну»

Последовательность нуклеотилов 2.55 НИ ' ' ■ . : Определение перзичной ст£уктуры ШК проводили блочным методой с использованием для гидролиза пиримвдиювой и гуа-ниловой ШКаз. Для исчерпывающего гидролиза пириьаадиловой ШКазой 2 ед.А^эд ШК инкубировали с 5 мгсл фермента (1мг/мл), ' 15 шел Н20, I ш:л ОД К трю-НСЕ. буфера рН 7,4,' содержащего С,01 Ы сДГА, в течении 16 час. при 37°. Для поучения исчерпывающих гуанилШКазжх гедролизатов 2 ед. А^л РНК инкубировали с 20 ыкл гуаншовой ИКазн (4 200 ед. /ылУ, I мал 0,1 15 трис-НСЕ буфера« 'рЦ 7,4, содеркацего 0,01 М ЭДГА в течении 16 час. при 37°. За час до окончания ингубации добавляли дополнительно 10 мкл гуанкяовой РККгзы, разделение гвдролизатов проводили дверной ТСХ на целлюлозе (рю.8). Опыты показали, что расщепление 2,55 НК в подобранных наш условиях проходило стандартно от опита к опыту и для препаратов ШК разного : наделения. Совмещенных пятен при разделении не наблюдалось, а такяе не обнарямено пркиесшх пятен, которые свидетельствовали бы о загрязиетшх препаратов ШК. Продуктов неспецифического гидролиз ^ ис польз о ванны,¡и наш ШКазаш обнаружено не Сило. Продукты;ферментагивного гидролиза элюировали с целлюлозы и подвергали'анализу. Нуклеотидный состав продуктов определяли То^НЖазным и. кислотным гвдролизом, а последова---тельносТь: нуклеотидов в олигонунлеотндах определяли ферыен---тативно, .расцепляя продукта гари^вдилНййхзного гидролизата' : гуаниловой ШКазой, а продукты исчерпывающего гуанилШКазного гидролиза Й1К пиримвдиловой ЩКазой. ■ '

■ В пиртэди лШКазном гедролизат® 2,5£ РНК (таблица 4) . : обнару^сш в виде ыононуклеотидоз Аон, 2 моля Ср и по I молю и Чр. Свободного Ьр в гмдролнзате не обнаружено, Найдено олигонуклеот'ида, не ииеюцих пиршвдинов на ¿-конце; в состава этих олигонуклеотцдов реакцией по финку обнаружена дкгздроурвдилоЕая кислота. Все олигонукааотвды шршидил-НКазного гадролизата присутствуют* в количестве 1 на молекулу ШК. В их состазе обнаружены- все модифицированные коы-понекты,наеденные ранее при определения нукдеотидаого- состава исследуемой НИ.

рис.8. Разделение двуыерноЛ ТСХ на целлдтозе^исчергш-ваккних лиримвдилШСаэного (I) и гуанилШКазногот(г)._гвд-родизатов 2,55 РНК. а - контактная фотогра^ия,^ <5^- схема. I,направление - систгема изомасляная кис ло та:0,5нЛ'Н^ОН * V (10:6); II направление - система третичный бутанол;чуравь- :

иная кислота." -.Л.

. ■ , . * ■ * ■.

В гуанилШКазном гидролизате 2,55 РНК (таблица 5) обнаружен X моль р6р и 4 моля а также 8 олигоцуклеотадов по I молю на молеауду ГНН. Результата, полученные при изучении гуаналИКазних гидролизатов подтвердили' данные >. ка-саю^иеся нуулеотадного состава и коицешх групп ыолекущ РНК 2,5«*- . . ' *

Таблща 4.. Идентификация и содержание олигснуоеотидов : исчерпывающего пири^вди лИКазного гидролизата 2,55 PIK

nflfoÄaj Продукты . г syipq лиз а -'■

ÍH

ИЕ1

гШНзамй*

Структура

Ыолярое содер&а*

Up«ï,00

АО11-0,72

РХ

РЗ ср =2,18 ' Р4 ; Ч5р =0.90.: Р5 л?виа;пгС^

U 1*1, СО ^„--0,04 Ср »2,28 .

=0h95 rfent

Р6

=0,06:1 V > =0,03:1°^ Аг/е:Ср=0,73:1 Ap:Cp=I,C8:I

t/p

^он ' Ср V

w

Р? Aefe:^ =1,00:0,90 Ар:^Х,Х2:1

TVS . —¿"írt : . .. Л rtA . T- L -, Т\. л л Л 1

1,00 0,76 2,30 0,92 0,92

А-Ср . ' 1,00

А-^ ' 0,83

Р8 m^ei,'afDp=0,83:Iro|sp;î)p=0,84;I M¿S-])p -1,06

. «0,78:1,12:1 0,70:0, fe: X G-A-tfp ■ 0,84

"л (гуанкловоП). ■ ■' ..■.v-,

. ; .'.'■'"■ Ср:А- p»I:0,Ç3 , 0,84

PIO ft¿<3ya:Gua:Cp= o?«p:Sp:Cp= • т " ■ ■ > •

, 0,83ÍC,98:I • . 0,77:0;90:1 . MS-S-Cp 1,08

PII SUa:I>p=I,8fci"pép:Sp:Dp»

- -. :1,15:6,68:1 ■ Р<5-6-£р ' 1,05f

PI2 Acte :mIAde: Sua: ■ A-Sp:ft?Cp : »¿А-Ср* -- ;

% a:Cp= 1,05: =1,02:1:1,07 ofs-A-G-ZlÎA-Cp 0,73

. 0,94:1,07:0,69:1 . ■

PI3 &/a:Cp»2,98:I Sp:Cp*3,I8:I. S-S-S-Cp'

0,68

■i

Таблица 5. Идентификация и содержание ояигонукяеотздов » - . . исчерпывающего гуанилЩКазного гвдролизата 2,5?РЛК

'■-.В ' пятна

•TI Cva=3,25 ßp=3,13 6p 3,09

T2 №2SVa:Cp=I,I2:I Cp:(n2Sp=I:0,90 C-ïïfSp . 0,72

Ï3 Acie:6i)a=0,88:1 Ap:Sp=I,13:1 ■ A-Sp V : о,.78

T4 .. Gua»Q,92 pSp*0,83 • : ' pSp (¿конец) . 0,74

T5 тТАсЫт7б1/а:СЕ* (пириыидиловой) mIA-C-m Sp ' ¿0,72:0^8:1 . ..

.. -0,97:1 .0,96 ,T6 ftieoait/pWcp- i^Cp:tJp:^Sp» ; jn%-l^firSp ...-.;;0,7?ÏO,93ÎI . . 0,79:1,12:1"" \0,86 T7 Sua:Cp:Dp= Л)р:Ср:Ср» ЗИЗ-Sp

0,95:1,08:1 * «I:0,95U,05 \ . 0,88

T8 Acleat)|¿ua:4^: A-Ip: p: |cp* . ... "'. , V ■

:])p=G,87:0,96: * -1,1*4:1:1,02 , ; - í : 0,93

■ . 0,83^1 -V-." ' . Г ^. w " ■':.■

Т9 Ado:6ua:Cp=>. Ср:А-Ср:6р- ' ' •

• -0,69:1,10:2,13 =0,90:0,92:1 • С-А-С-вр. • ' С, 79

TIO Acfe:Cp:4fc:l>p» ' Cp^A-Up:/^- '

=2:1,30:0,87:1 ".»0,75:0^92:0,83: (З^конец) ' ' >

■■■ ■ : :0,78 ■. , ■.. ... ■ 0,60

)

Реконструкция последовательности нуклеотияов 2.55НЩ Полученные наш два набора блоков НЖ в результате "ее гидролиза рибонуклеазами были использованы для реконструкции последовательности нуклеотадов в цепи 2,55 НЖ, то-есть, для установления ее первичной структур*. 'В качестве' , taptepos для выявления мест перекрываний использовали встре-^ чач^еся в ыоле1суле I раз .небольшие последовательности и модифицированные куклеотиды. . л

По результатам:олигонуклеотвдного анализа концевыми : фрагментам FffiC явлжлтся олигонуклеотиды PII (вконец) и ,Т10 CSí-конец) (pic.9). Реконструкцию удобно начать с динук-: ' леотвда F5, содержащего два модифицированных нуклеогида. С ¿-конца F5 перекрывается однозначно с олигонуклеотвдом Т6 по' mnJp,. входяциы в состав* 2,5.SHBÎ в количестве Г моля. С, , ¿-конца подученную последовательность маяно достроить лиаь олигонуклеотидо« Т5 - благодаря присутст-шю в его составе m76j Полученный фрагмент цепи с 5^-конца мсадю продолжить лишь ■ олигонуклеотидом PI2, содерш^иц последовательность ^ rrv^A-Cp, , встречающейся:'вЧ:олекуле лкаь I раз, а затем динуклеотвдоы Т2, содержащим m'HSp в. своем составе. ■

■ ■'.'""' С, ^Цонца^, последовательность ыожно достроить^однознач-но тринукдёЬтвдом PIO, перекраващейся с ней по n/s^, а. затем_одагонуклеотидоы Т9 и концешм фрагментом молекулы

TIO. >Получив:шйся фрагмент, имекнций'на Оконце цитйдян,, '^àwi Продолкен' в этом направлении тетрацуклеотидоы PI3, со: дершда цитидин на 3-конце. Далее последовательность ре- . " конструировали тринуклеотвдом-T?, .вклотахнцим дигвдроурщи-ловую кислоту. '•

■ 5^-концевоЬ фрагмент ,2,5-S ГНК (PII) шеет в 3-положении • дигадроуридиловую кислоту. В связи с этим он мсисет ;быть до:: строен в 3^-направлении олигонуклеотвдеми Т8'или Т7, . ииен>- !;. . .дими на 5^-конце 1)р. Однако, реконструкция с Т7 отпадает, так как в пиршидилШКазноы гидролизате идентифицирован '■""■■' дануклеотвд Р8 (m|ç-î)p,) и поэтому последовательность' в

■ направлении макет Сыть линь Т8-Т7. ' '; ■■: ' ,

■ ' V''/;;: '■---'"■■■£■■." 18.-'-.ЦУ-

; Подученная Ег-концевая последовательность нуклеотидов 2,5£ НЗК .однозначно перекрывается с Зт-концешм фрагментом .по Т7. ,". у",.; ■'. ■ .

" Таким образом, при установленном олигонуклеотцдном составе 2,5$ РШ реконструированная последовательность нуклеотидов однозначна, и неопределенным остается лишь 'взаимное расположение С и ^ в Зг-донцевом фрагменте.

Рис.9. Реконструкция первичной структура 2,5^РНК

^РПГ-4 & -^сда^ ...

.... 4 ■ ;■ Т5 т<з ■■

■ -ЖАСп?Сгп?С1))Т?б-

. ' . Т2 ■ -.

- ■ РЙ ■ ' -И0 V..,.

• ?.:.■■ ■ ■ г.;

ЖГ^ Т7 . •''« : •

' ад — а.,'__—л. ...л. . .-х^д г : те ' 'г '" '

* ""И" ■ « ТГ Я ' »о 1 > и» и Н1 г* н м м м , и,

: ■■.■■ ■: ■ -.■.■■*■■"...■ . ...... ,:. . ■ ■ ■ *■

■■.■.'■'' ■ ■. ■.......■; ■ ■ ;,■'

■ 4. О вторичной структуре и возможных участках

: свяэыва&1я 2,5$ ВДС с белнш ветвлщего фермента

Для подтверждения реконструкции молекулы Я,55 НЕС и для получения информации о наличии вторичной структура был проведен гвдролиз НПС пириыидиловой ШКаэой в", условиях частичного гидролиза. Продукты гидролиза разделяли колоночной хроматографией на целлюлозе ДЕ-32-в 7 М иочевине с использованием градиента КаС1-в 0,02 Ы_тр1с-НС£- буфере рН 7»2 (рис. 10,Б). Дня сравнения в тех Яе услошях провэ-■■' . . ."*■ г:; '■."■■■ 19.-- ■-■.■■■ ■

дена хроматография негэдролнзованной РНК и продуктов ее . .исчерпывающего гвдролиза тем же ферцентом (Juc.IO, А). В ■ результате частичного гидролиза кроке продуктов исчерпывающего гидролиза был, получен один крупный фрагмент ШК ■ (рис.10,Б,I), элшрукцкйся перед пиком негвд ро лиз о ванной РНК. Этот фрагмент бил обнаружен и при некотором варьировании условий частичного гвдролиза, Идентификация фрагмента I по нуклеатвд*шыу и олигонуклеотидноау составу показа-да, что он вклшает'в себя среднюю часть молекулы ШК. Во фрагменте по сравнению с целой РНК отсутствовали олигонук-леотвды *Р2, Р4, Р9 и PII, составляющие согласно реконструированной первичной.структуре концеше участки'иолекудаг. ;

" • . „ ■И

Л Л ' . * • д^ Xraj | §А • ■ * .

<о ¿д So sa ■ j"

Б " ' г' •• цшла/ I

4« /

s—г—

г

И ч>

Чихжщи.

РисЛО. Црофиля элюции негидролиз о ванной 2,55 ШК f..,.) и ее исчерпывающего гвдролизата С—— ■ частичного гвдролизата 2,5 S ШК (Б). I -, . к^пнцй фрагмент £,5£ШК. .

(А)

Наличие шсокого гипохроыного афЬекта (23^) и температуры плавления (56°), а такяе данные частичного гвдролиза 2,5$ ШК указывает на наличие вторичной структура у молекулы. На. -рис.П представлена возможная модель вторичной структур! 2,55 ГНК, основанная на результатах частичного гидролиза и : на принципе образования максимального количества спаре.кных ' ■" ■ ■ •■ .':,..■"■■ . '■ ■.■ 20.

V

ч ■

Л'1'

^ оснований. В модели концешэ участки оставлены свободными, ■ так как согласно данным "частичного гидролиза они более дос: тупнн действии ЩСазы.' Остальные нуклеотида образуют более прочнуа часть- молекулы, ■ содершщю модифицированные нукле-• отида и несколько спарекюх пар оснований. - л ■'<_-:

рб-С'О'А ■■. С'С-А-и'(С,1у)-Аон

■ п *

V * А,

I |

, С . ;

Рио.И. Модель вторич-

О структуры 2,5 5 НК

■". 1 ' "' I ■■■' ■ " ' ' ■ V'

а • т3С '■: V ' •

I ~ - 1 ■■'":■-:•■:.г./ \ Л * ■■■■.- -

С • пГ0

I

/ - •. ■>■... г .Л /■ ■

т30 • С '.''■■■"■■■: ... V,.-

■■'■■;■■■ ■■■■ I Ч I \

А ' " -■■■:■■ ':.■:.". . . И : ,

- V. ; .. ч •...' I

Используя установленную структуру 2,55 РНК мы попыта-. . лись определить ее участки, образующие прочную связь с : * "... : белком ветвяцего фермента^ Для эгрй цели был подвергнут

действия ЙЗКази натишый рябо^клеопротёадшй комплекс - ' ветвя^его фермента (табл.б). Варьируя услов!Я гид^лиза мы -¡ ; надеялись4 шявпть участки в РНК, заци^енще от действия , , ЙГКазы белком ветвяцего фермента. Из таблицы 6 ввдно, что . . выход продуктов гвдролиэа ВДС-очень мал при 0°,' а активность

ИЛ не изменялась даяе после^ час. инкубации с ШКазой/ . ■ (ошт I). При 37° наблдцается увеличение шхода продуктов; • ' твдролиэа.РНК бо времени с параллельным понижением актив, : ности ИЛ (опыт 2).Подобрав соответствуйте условия (опыты . , '■■"■". 3 й;4) нал удалось добиться падения активности ИЛ до нуля, ■ однако шход продуктов гидролиза и в этом случае соста-

Таблица 6. Щцролиз пиримвдиловой ШКазоЙ свободной '* ТНК и ШК, находящейся в комплексе с белком ИА

№ Инкубационная смесь ■ Услошя Еыход — ■ ■ ■ ■ ■ i Актив-

опыта lipCMß; час. ÜO0THOC1. НИ'! ШКаза продуктов гтШ?% ность : ИА, ед. /мг белка

I ИА . 4 . 16 - — / 200" '

ИА+ШКаза ■ ■;'■ 4 16 1:1 ■'■.". " 5 , 200

Свободная ШК+РНКаза ■ - 4 16 ■ 1:1 45

2 ИА+ШКаза , 37 0,3 1:1 ю ; I loo

0,6 15 £75

.1.0';' ■21 ■■ £81

2,0 30 250 ■

3 ИА " гг? 16 - ■ * - ■ " 160

ИА+ИКаза' ■и.; 1:1 80 - 0

-4 ил 37 0 ■ - ' ' - .- '271

¿с;-. I - 2 ) ' : 1:7 1:7 . 65 85 ' ' 0 ■ • о

^За' 100 54 принято количество ШК, содержащееся в данной* 'инкубационной смеси. ■

влял лишь 60-85 ГЛ от теоретически возможного. Из этого можно'заключить, что некоторая участки ШК остаются связаннъаад *с: белкой сет вящего фермента. Для выяснения; какие именно ■ участки РНК отсутствуют в гидролизатах, ш подвергли после дние двуыерной;ТСХ на целлюлозе и действительно не обнаружили в них нескольких олигонуклеотидов по сравнению о ив-" , чершвающими, гидролиз атами свободной НЖ. Это были олиго-нуклеотиды, занимайтеI концевое полокениз в молекуле ШК. Ети результаты били несивданными, так как согласно данным, подученным пр! изучеши свободной ШК, эти участки гвдроли-зуятся в первую очередь даде в'условиях частичного гвдроли-за и составляют неспаренные участки цепи в предложенной ыо-

■ ; ' ■- ■ .,.■".■/■■ .-Л- о ■ -гг.* . V;

•дели вторичной структуры ШК. Отсутствие этих коицешх олиго--цуклеотвдов в продуктах гидролиза связанной с белкой ветзяце-го фермента 2,55 ШК позволяет заключить, что они, вероятно, защищены в данном случае бейкой ИА ^недоступны; расщепляющему действию ГЖазы. 'На основании порченных результатов моано сделать вывод о •т'ом, что связана с белком в нативноы

комплексе вётвящего фермента своими концешми участками.;

'■'■ - : . - Шводы..' ' ^ '. ' ';

1. Йэ ветвящего фермента изоцеразы амилозы скелетных шшц кролика фенольнойдепротеинизацией-наделена ШК. Колоночной

■ хроматографией на целлюлозе ; в градиенте НаСЬ препарат ШК очкцен до гомогенного состояния при электрофорезе в ПААГ и при ультрацентрифугиройании. ■.-; д ■. . '■

2.* Очищенный препарат ШК имеет коэффициент седиментации:2,55 и ыолекулярщЗ вес ТО ООО. "

3. Показано^ что полицукле'отвдная цепь РНК состоит 'йз 31 . . нуклеотида. Особенностям нуклеотидного состава язляотся

наличие 32 5« модифицированных нухлеотидов й^'о-богащешооть . гушином. - О ...'-„ _

4. На основе анализа олигонук леотвд о в, подученных при'Гадроли-■ зе 2,5$ ШК пиримидаловой и гуанидевой НЖазаиц,,одкозкач-

но реконструирована последовательность нунлеотвдов в цепи исследуемой Щ{. ■ ;-.'.:...■ : '' .. . -' г ;

5., Пиролизом нативного нуклеопротеидного комплекса изомеразы амилозы_ ЕНКазой и на основании) установленной структуры РНК *,.. определены возыо-шце 'участки, образующие прочную связь , этой ШК с белком ветвящего фермента. ■ ■ |

,у'..: ч • ■■ ■.""

Список работ,опубликованных по тале диссертации: '};'<

1. Г. А. Корнеева и А. Н. Петрова, Исследование ШК ветвящего " фермента изоцеразы амилозы методом электрофореза в поди-.:;

'л? : екрилаыядном геле. ;; *'■'■ "/.,:: '"^V-

- : Доклада АН СССР 219, V 3, 745-747 (1974). . : •

2. Г. А. Корнеева, Т.В.Венкстерн, А.Н. Петрова. - Нуклеотидный ' ; . ■■; состав и расщепляеыость нуклеаземи НКг' наделенной из

"изомеразы амилозы. -

Молекулярная биология II, № 2, 374-379 (1977)."-

3. Г.А.Корнеева, Т.*Л.Шведова, А.Н.Петрэва, Т.В.Венкстерн,

.. академик А. А. Баев. Первичная структура и участки связывания с белком пояирибонуклеотида, наделенного из вет-вящего фермента шщ кролика. .

.; / "Доклада АН СССР 237, В 3, 728-731 (1977).. ^ - ■' : 4. Г. А. Корнеева. Осо бенности нунлеотидного состава и пер- :"s, вичная структур FHK, гвделенной из ветвжцего фермента ■■■. мышц кролика.' >-' ': , .''...••: ■ j ■

: Тезисы докладов VI Всесоюзной конференции по химии, и биохимии углеводов. Изд. "Наука", ы., 1977,; стр.60 5. A.N.P«trova, T.A.Scbvedova, G.A.Koraeeva "Ш , 1

centre1 of multiple forms of tauscl« ЪглпсЫжй eazja«

/ "Abstracts** Thenth. Int Coagrese Biechinlatrjr, - V ■

Hamburg 1976» p.407. ■ V

_„:_____.iuEiSoo

Типография ХОЗО Госплана СССР ■■'