Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Свободно-радикальный механизм взаимодействия ксантиноксидазы и лактопероксидазы в антибактериальной системе молока

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Свободно-радикальный механизм взаимодействия ксантиноксидазы и лактопероксидазы в антибактериальной системе молока"

Тс:с«1с*я*-гур-.^стаегия*

Мпы^екс^^ — О 3

Втд)«/ : .

МИНИСТГРС Г ВО ЗДРАВ» ЮХРАНЕНПЯ V/ российской фЕНЕРАШШ .

РОСГОР.СКНП ОРДГНЛ ДРУЖБЫ НАРОДОВ МЕпшптскгт институт

НА ПРАВАХ РУКОПИСИ

КЕСЕЛЬМАН Эллина Викторовна

СВОБОДНО - РАДИКАЛЬНЫМ МЕХАНИЗМ ВЗАИМОДЕИСТ15МЯ КСАНТИНОКСИДАЗЫ И ЛАКТОПЕРОКСИДЛзы ' В А11 ГИБ А К Г Е Р И А Л Ы! ОII СИСТЕМ! МОЛОКА

03.00.04 - БИОХИМИЯ

АВТОРИФЕГЛТ ДИССЕРТАЦИИ ПА СОИСКАНИЕ УЧЕНОЙ СТЕПЕНИ КАНДИДАТА БИОЛОГИЧЕСКИХ НАУК

РОСТОВ-НА-ДОНУ 1493

РаСота выполнена в Ростовской НИИ микробиологии и паразитологии НТО "Биопрепарат".

Научный руководитель: доктор медицинских наук,

профессор А.ЕШзпелев

Научный консультант: доктор медицинских наук,

старший научный сотрудник С. а Соболева

Официальные оппоненты: доктор биологических наук,

профессор А. И. Лукаш

доктор биологических наук, профессор Т. н. Погорелова

Ведущая организация: НИИ Биологии Ростовского

Государственного Университета

Защита состоится (Хи^С&ЛЛ 1993 г> в /^¿часов на

заседаний специализированного совета Д. 084.63.01 при Ростовском ордена Дружбы народов медицинском институте (344718 г.Ростов-на-Дону, пер. Нахичеванский, 29).

С диссертацией модно ознакомиться в библиотеке Ростовского ордена Дружбы народов медицинского инсхлута.

. Автореферат разослан

^ШХ1993 г.

Учёный секретарь специализированного совета, доцент

Н. Я. Корганов

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА - РАБОТЫ -----

Актуальность проблемы: Исследованиями последних десятилетии установлено, что молозиво ir молоко яивотша и человека содержит комплекс специфических (иммунных) и шсяэцифическкх антимикробаьл. компонентов, которые выполняют защитную фупхцг/ю в сргашзме новорожденного. Неспецифические антимикробные факторы молока (НА®), - это ферменты ксантиноксидаза, лантонероксидаза, РНК-азы, ДНК-азы, лизоцим; некоторые другие белки и фзктори не барсовой природц; фагоцитирующий клетки. Они окэзызаит собственный немедленный антимикробный эффект во временном промежутке между поступлением антигена и собственным иммунным ответом ребенка, а т атаке усиливают действие антител (Reiter В., 1978). НА«1М необходимы для защиты новорожденного при попадании в его организм антигена, к которому отсутствуют антитела в молоке матери.

Известно, что в организме существует универсальный механизм антимикробной защиты, связанный с активацией фагоцитов ц

генерацией активных форм кислорода (0¿, 'о2, HgO,, ОН"), в котором участвуют НАДФН-оксидаза и миелопероксидаза фагоцитов (Роговин В.В. и др., IS77; Rosen Н.. Klebanofí S.J., 1977; bel Maestro R.F., 1980 и др.). Представляется возможным, что молоко обладает подобным механизмом защиты, т.к. имеет в своем составе аналогичные меточные и ферментные системы перекисного окисления, в частности,

кеангдаоксидазу (КО), генерирующую 0¿, и лактспероксидазу (ЛП), действующую аналогично миелопероксидазе.

Изучение этой проблемы представляет значительный интерес в связи с тем, что ICO и ЛИ оказывают антимикробный эффект на многие виды возбудителей кишечных инфекций. Показано антибактериальное действие ЛП на стрептококки, внтвропатогвпные евротилы кишечных палочек, сальмонеллы, псевдомонада, клебсиеллы, шигеллы. КО оказывает антимикробный эффект в отошенки стафилококков, Eacherlcla coli, Vitarlo cholerae.

Несмотря на то,что структура и функции фвршнтпв КО и ЛП в определенной степени изучены, возможность функционального обьвданвния антибактериальных ферментов молока - КО и ЛП - в единую систему до сих пор не рассматривалась. Отсутствуют в литературе и данные о взаимодействии этих ферментов с

антиоксидантной защитой бактерий, вызывающих кишечные инфекции.

Целью настоящей работы явилось экспериментальное обоснован® свободно-радикального механизма действия антибактериальной систем ферментов молока ~ ксантиноксвдазы и лактопероксидазы.

Для реализации указанной цели были поставлены следувдш задачи:

1. Разработать способы выделения ксантиноксвдазы j лактопероксидазы и получить очищенные ферменты да експеримектальных исследований.

2. Изучить взаимодействие ксантиноксвдазы и лактошроксидазг с ферментом антиоксидантной защиты бактерий - супероксидцисмутазо! (СОД) - в модельной системе.

3. Определить супероксиддисмутэзную активность интактныз клеток энтеропатогенных штаммов Escherichia coli и Salmonell« typhlBiurluia.

4. Исследовать in vitro антимикробное действ® ксантиноксидазы, лактопероксидазы и их комплекса ю антеропатогенныв штаммы Escherichia coll и Salmonella typhlmirlum,

5. Изучить протективное действие комплекса ферменто! ксантиноксидазы и лактопероксидазы на модели сальмонвллэзноЗ инфекции у экспериментальных животных In vivo.

Положения, выносимые на защиту:

- Разработаны способы выделения ферментов молока ■ ксантиноксидазы и лактопероксидазы высокой степени чистоты ) активности; разработан метод определения лактопероксидазво! активности в растворах, биологических кидкостях и полиакриламидны: гелях.

- Антимикробная система ферментов КО и ЛП молока образуется i реализует свое действие при наличии супероксиддисмутазы источником которой могут быть патогенные бактерии.

- В опытах in vitro ферменты КО и ЛП оказываю' антибактериальное действие в отношении энтеропатогенных штаммо: Escherichia coli и Salmonella typhiimrlm, усиливавдееся пр: объединении этих ферментов в систему.

- В опытах in vivo комплекс ферментов КО и ЛП обладав протективным действием, о чем свидетельствует снижение степей тяжести течения экспериментальной с а лъмоне лле з:юй инфекции степени инфицированности подопытных животных.

Научная нонизпа; В результата проведенных исследований юлучены новые факты, имеющие существенное зппчошга для раскрытия шханиэмов антимикробного действия неспещирнчесля компонентов юлска. Разработаны нсьые бффективныэ и простыв способы получения »тащенных ферментов КО и ЛП. Разработан новый метод определении [актопероксидазной актш .ости в растворах, биологических жидкостях t полиакриламидних гелях. Разработана модель свободно-радикального юханизма взаимодействия антимикробных фермзнтоз КО и Jill молока с 'чистием фермента СОД в единой системе. Механизм действия геспецифической внтзмикробной систелШ КО и. ДП молока подтвержден жеперименталыга в опытах In vitro на энтероыатогенных штаммах юзбудлтелей кишечных инфекций и In vivo на модели сальюнеллезной тфекции.

Теоретическая и практическая значимость работы: теоретически эбоснован и экспериментально доказан свободно-радикальный механизм азаимодействия ферментов КО и ЛП, осуществляющих антибактериальную функцию в молоке, что дает возможность рассматривать комплекс антимикробных 'факторов молока как единое целое, а механизм генерации активных форм кислорода - как одно из связуюшнх авеньев зтогс комплекса. Результаты работы послужили основанием для планирования новых разработок по обогащению препарата лактеглобулина ферментами неспоцифической защиты молока и по созданию новых биологически активных добавок к детскому питанию. Технологии получения очищенных ферментов КО и ЛП войдут ь документацию на обогащенный препарат лактоглосулина.

Апробация работы: материалы диссертации доложены на Всесоюзной конференции "Методы получения, анализа и применения ферментов" (Юрмала, декабрь 1990 г.); Международной школе "Кислородные радикалы в химии, биологии и медицине" (С.-Петербург, сентябрь 1991 г.); 1-ом Российском Национальном конгрессе "Человек и лекарство" (Москва, апрель 1992 г.); 4-й Всесоюзной конференции "Биоантиоксидант" (Москва, mcm> 1992 г.); Международной конференции "International conference on critical aapecta of free radicals In chemistry, biochemistry and medicine" (Австрия, Вена, февраль 1993 г.). Апробация диссертации проведена на заседании ученого совета НПО "Биопрепарат" 15 января 1903 г.

Публикация материалов исследования: по теме диссертации опубликовано 7 научных работ, из них I в международной, 6 в

- Б -

центральной печати.

Структура и объем работы: Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов собственных исследований, заключения, выводов, списка литературы. Работа изложена на 136 страницах машинописного текста, иллюстрирована 15 рисунками и 13 таблицами. Список литератур« включает 27 отечественных и IOO зарубежных источников.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В работе были использованы ферменты КО сливок и ЛП ыолозиьа коров, полученнные по разработанным камл технологиям, я коммерческие препараты ферментов: ЛП фирмы "Sigma" ((Ж), KO"Calbolcíiem"(США), СОД эритроцитов человека (НПО "Биопрепарат"). Для изучения анпштсробного действия КО и ЛП In vitro и In vivo использовали штаммы Ei jherlcMa coll 0-111 B-4(K-5g) N 241 и Salmonella typhimurium N 67, выделенные у больных детей лабораторией лактоглобулшов НПО "Биопрепарат" и используемые в качестве производственных для изготовления вакцин. Эксперименты In vivo проводил* ва белых беспородных мышах массой 10-12 г.

■ Получение очищенных ферментов ЛП и КО проводили с помощью разработанных нами способов, описанных в разделе "Результаты исследования и их обсуждениеи. Ферментативную активность ЛП определяли разработанным наш методом (Альгэрович Д.В., Кбсельман Э.В., I9S0), описание которого приводится в разделе "Результаты исследования и их обсуждение". Ферментативную активность КО определяли по методу Эвиса (Avis P.G. et al., 1955). Количество белка определяли по методу Седмака (Sedmalc J.J., Grossberg S.E., 1977). Определение количества сульфата вшония в растворах белков проводили методом фордалового титрования (Кушманова О.Д., Ивченко Г.М.,' 1974). Электрофоретическузо чистоту ферментов КО и ЛП определяла методом вертикального диск-электрофореза в блоке полиакриламщдаого геля (Маурер Г., 1971; Гааль Э. и др., 1982).

Изучение взаимодействия КО и ЛП проводили в модельной системе in vitro.

Изучение СОД-активности интактшх клеток E.coll и S. typhimurium проводили модифицированным методом трения хешшшнесцешда (ХЛ) (Klmura Н., Nakano Н., 1988).

Антимикробное действие - НО, ЛТ и их комплекса in vitro изучали в отношении E.coll и S.typhlmurlum. 18-часовые культур« микроОши клеток в конечных концентрациях I03 КОЕ/мл инкубировали с экспериментальными системами и контролями в фосфотно-солевсм буфере pH 7,2 при 37°С. Через. 0,5 ч, I ч, 3 ч, в ч и 24 ч производили высев из инкубационных смесей по 0,1 мл в параллелях на чашки Петри с агаром Эндо (E.coll) или висмут-сульфитным агаром (S. typhiinurlm). Подсчитывали число колоний, выросших на чашках через I сутки. Антимикробный эффект рассчитывали как пронент внживюях клеток по относешяз к общему контролю. Опытные ферментные системы содержали следующие компоненты в конечных концентрациях: ЛП-СИСтема - ЛП (12 Ед/мл), KSCN (0,4 мМ), HgOj, (0,4 мМ); КО-система - КО (0,5 Ед/мл), ксантин (3 t-¡M); КО+ЛП-система - КО (0,5 Ед/мл), ЛП (12 Ед/мл), ксантин (3 мМ), KSCN (0,4 Ш). Каадая из 6 контрольных систем содержала один из ферментов или субстратов в указанных концентрациях; общим контролем служил фосфатно-солевой буфер.

Протбктивное действие системы КО + ЛП In 7l?o изучали па модели знтерального заражепня белых i-melt возбудителем езльмонеллеза (Сальмонеллезы. Мотоднчоасе ряка^ндации, 1980 г).

Статистическую обработку цифрового материала проводали общепринятыми методами (Г.Ф.Лакин, 19(30) и с помощью программного средства "CHART" фирмы "Microsoft"(США) на компьютере IBM PC/AT 286/287. Достоверность отливай измеряемых параметров сцениваль по z - критерию Стьюдвята и ли по критерию знаков Z для сравнения выборок с попарно связанными вариантами в микробиологических экспериментах.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Выделение и характеристика лактопероксидазы.

На основе существующих способов получения ЛП (K.J.Paul er. al., 1980; Koldoveanu Z. et al., 1992; Ohlsson P.I., Paul K.J., 198-3; Pfell Я., Otilasen P Л., 1986; Денисова И.И. и др.. 1Э8в; Laiigbakk В., Fia linar к Т., 1989) нами был разработан относительно простой, не требувдий многостадийной хроматографической очистки способ препаративного получения ЛП, обладавдей высокой чистотой и

активностью. Процедура получения включала в себя следующие стад и операции:

ОБЕЗЖИРЕННОЕ МОЛОЗИВО

{разведение, осаждение казеина, твнстаивание, центрифух"ирование ЛАКТОСЫВОРОТКА

^дробное высаливание сульфатом аммония

ФРАКЦИЯ ЛП-1

прогрев, центрифугирование

т

ФРАКЦИЯ ЛП-11

Iдиализ, хроматография на КМ-сефарозе, |концентрировааие, стабилизация

ОЧИЩЕННАЯ ЛП

Разработанный нами способ отличается от известных ранее i многим параметрам:

В нашем способе присутствует стадия разведения обезжиренно! молозива для снижения его высокой буферной емкости и облегчеш последующего осаждения казеина. Казеин осаждали в ei изоэлектрической точке при рН 4.6, достигая этим наиболее полное эффективное освобождение лактосыворотки от примесей этого белкг Центрифупфование проводили при скорости вращения ротора не боле 1200 g. Высаливание фракции ЛП-I проводили в пределах от 50 до 8С насыщения сульфатом аммония для наиболее полного извлечения ЛП i дактосыворотки. В отличие от всех известных ранее способов очисти ЛП, мы применили стадии прогрева ЛП-экстракта с целью осавдеш примесных термолабильных белков. Нами были экспериментальЕ найдены. параметры прогрева ЛП-экстракта, при которь лактопероксидаза сохраняла свою активность полносты Окончательную очистку ЛП проводили в одну стадию с помоац высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) на колонке ионообменной КМ-сэфарозой CL-6B.

Полученные разработанным наш способом лиофильно высувенни серии ЛП обладали удельной активностью 60,3+7,4 Ед/мг белка сравнимой с активностью лиофилизированного коммерческого препарат ЛП фирмы "Sigma" (77 1$д/мг). Серии фермента, стабилизирований! глицерином, были в 5 раз более активны (339,3+28,5 Ед/мг) использовались в дальнейшее биохимических и микробиологически

МОЛОЗИВО

экспериментах. Хроматографическая чистота всех получешш. серий ли составляла не менее 955 (Рис. 1а) и не уступали чгютимо коммерческого препарата ЛП фирмы "Sigma"(США). Все серии пили илектрофаротически гомогенны и давали одиночную зону окрашшацин по белку и по актпнности при диск-электрофорезе в полиакриламндиом геле (МАГ) (Рис. 16).

Выделение н характеристика ксантмвоксидоаи.

существуют различные способы выделения КО из сливок, молокл, fr°.T™í (Яаззсу V. Ы al., ÍSnH; Warn 4.R. et al., 1975; Hw'J"»p Л.Р», ISSQJ. В настоящей раооте КО была получена модифицированным нами способом из сливок. Процедура получения включала в себя следующие стадии и операции: СЛИВКИ

i смешивание с ЗДТА, салицилатом Na, т цистеином, прогрев, центрифугирование ОБЕЗЖИРЕННЫЕ СЛИВКИ

¡ фракционирование бутанолом т и сульфатом аммония ЭКСТРАКТ-!

t осаждение сульфатом аммония ОСАДОК-I

J, осазденне ацетоном

ЭКСТРAKT-II

! хроматография на КМ-сефарозе т концентрирование, стабилизация ОЧИЩЕННАЯ КО

По сравнению с существующими способами выделения КО нами бил* ксгслючена стадия ферментативного гидролиза белков панкреатином, введена стадия осандешш ацетоном, и, по сравнению с методом Л.Г.Наглер, значительно сокращено количество стадий в пропессс высаливания сульфатом аммония. Кроме того, для очистки фермент* использовали одностадиз^нуа препаративную ВЭЖХ на колонке с КМ-сефарозой С1-6В.

Полученные разработанным наш способом серии КО обладали удельной активностью 1,69±0,37 Ед/мг белее, сравнимой с активностью коммерческих препаратов КО фирм "Sigma" (1-2 Ед/мг), "Serva" (I Ед/мг), "Galblochem" (Т Ед/мг) тт были использованы в биохимических и микробиологических экспериментах.

Хроматографическвя чистота всох полученных серий КО составляла не менее 48% (Рис. 2а) и не уступала чистоте коммерческих препаратов зарубежных фирм. Все серии полученной нами КО оыди

OpLcctar response

"I " " I " 1 1 I " " I 1 " T

14 1.Й il.M 11.И JIM it и

RT.min

окраска на окраска на активность белок

Рис.1, хроматографяеская (а) и злектрофоретическая (б) чистота ЛП,

н—■ I' м ,,,,,,,„,,,,,

о.и VB и.» и.» ».а ыо

окраска на активность

окраска на белок

а) 6)

Рис.2. Xроматографичеекая (а) и электрофореттеская (б) чистота КО

олоктрофоретически гомогеннн и давали одиночную зону окраоивания по белку и по активности при диск-электрофорезе в ПАЛГ (Рис. 23).

Таким образом, нами были разработаны способы наделения ферментов ЛП и КО, обладавших чистотой и удельной активностью,

сравнимой с коммерческими препаратами КО зарубежных Фирм.

Метод определения лактопароксидазной активности.

Существуют различные способы определения активности иероксадаз, основанные на окислении гваякола, иодида и производных Зензидииа. Нами был разработан новый метод опродвлолия пактопероксидазной активности в растворах, биологических жидкостях i полиакриламидных гелях (Алыгеровггч Д.В., Кесельман Э.В., 1990; рационализаторские предложения 16/89, 24/89, 38/90, 39/SO) с ^пользованием вещества бензидинового ряда - ортс-толидана, -ранее не применявшегося для определения пероксидазной активности.

Основные отличия разработанного нами метода от наиболее Злизких прототипов - бензидик-гваяколового (Бакуqb М., 1901) к £енилендиаминового методов (Wrlglit R.S., Trauer J., 1958, ■модификация Денисовой И.И., 1987) заключаются в следующем: в качестве донора электронов используется раствор о-толидика в 10% /ксусной кислоте; не требуется инкубация субстратной смеси; определение активности производится за I мин при 630 нм в щ:апазон0 pH-оптимума ЛП-активности; цвет продукта реакции -■ipico-синий; стойкость окраски - 1,5 - 2 ч; способ позволяет определить до 0,2 мкг ЛП в I мл раствора, что является границей чувствительности известных ранее способов.

?/етодика определения: В кювету спектрофотометра с длиной оптического пути 1 см вносили: I мл пробы, исследуемой на Ш-активность, в физиологическом растворе; 2 мл 0,1 М Уо-фосфатного буфера pH 7,4; 0,2 мл С,Ii Н202- Эта смэсь реактивов служила контролем оптической плотности. Для запуска реакции в шва ту вносили 0,2 мл орто-толидинового реактива (раствор о-толидша в IOS CHg СООН 1,5 мг/мл), и измеряет прирост оптической плотности за I минуту при длине волы 630 ш. Расч&т активности производили по формуле:

С =-jjl— х разведение, где

iE - изменение оптической плотности за I минуту; К - коэффициент

Рис. 3. Калибровочные графики для

определения концентрации ЛП. Е 57Ь нм - фенилендиаминовый метод Е 630 нм —. разработанный нами метод.

- 12 -

¡расчета: для Срдкг/Щ К - 0,077, для К - 0,001

Сравнение калибровочных графиков, построенных по двум методам ?ис. 3), показывает, что разработанный нами метод обладает более гсокой чувствительностью, чем наиболее близкий ему прототип -яшендиамнновый метод.

Разработанную нами модификацию этого способа для определения шганости ЛП и других пероксидэз в подиакриламидных гелях гпользовали для определения локализации ЛП среди других белков зеле диск-электрофореза на стадиях очистки фермента.

Взаимодействие КО и ЛП в модельной системе.

КО и ЛП являются единственными неспецифическими зтимикробными факторами молока (креме клеток), механизм действия эторых связан с генерацией и утилизацией активных форм кислорода, згично было предположить, что КО и ЛП могут действовать згласованно. По нашим предположениям, с ними должны каким-либо Зразом взаимодействовть антиоксидантныо системы задан эзбудателей кишечных инфекций. Это послужило основанием для роведения модельного эксперимента Ш тНго, в котором была экозана потенциальная возможность сопряжения КО- и ЛП-реакций в дологических системах. Модельная система представляла собой нкубационную среду (фосфатпый буфер), в которую последовательно • косили: КО, СОД (в качестве модели внтиоксиданткой защиты актерий), ясантин (субстрат КО). Смось инкубировали, ожидая аработку перекиси водорода в реакциях:

02 К^сантин_> о| С°Д ■> ,

село чего в систему добавляли ЛП и ее субстрат о-толвдвж ксрость пвроксидязиой рэекцга определяли спвктрофотометричэски, спользуя разработанный нами способ определения ЛП-активности Альперовяч Д.Б., Кесвльмая З.В., 1930).

В этой модельной системе га обтару~~д взкогтлзкио продукте ы," опороксидазной реакций, несмотря па изначальное отсутсиодо в гож- инкубации одного ио двух необходимых ее субстратов -кгогшю.» перекиси водороде, очевидно, ЛцОг гаф&батквалаеь идегенно з результате последовательности ко- и СОД-роакций из лслорода, растворенного в среде инкубации (Рис.4а). (коперимептально были найдены оптималыие соотношения компонентов >9шшионной смеси и параметры реакции (рН, временной и

й) МОДШЛДЯ СНСТЕШ

0-ТОЩЩ1Н

КСАНТИН

ОКРАШЕННЫЙ ПРОДУКТ

О) ШОЙОГИЧЕСКАЯ СИСТША

Рис.4. Механизм действия антимикробной системы КО+ЛП. а - схеме эксперимента In vitro; б - схема действия системы In vivo.

температурный), яри которых ЛП проявляла максимальную актавноот!., соответствующую 0,65 (гО.ОЗ) х 10"^ Ед/мл, то есть 72 ± 3 % от теоретически возможной. Это показывает высокий уровень сопряжения трех ферментативных реакций и потешщальную возможность осуществления такого сопряжения в биологических системах.

Для того, чтобы проверить возможность использование лактонероксидазой в качестве субстрата перекиси водорода, которая образуется в ходе ксантиноксадазной реакции наряду о образованием

0|. мы провели контрольный окспврзшент, исшшчив иэ модельной системы супероксиддисмутазу. Накопления продукта ЯП-реакции в этом эксперименте обнаружено не было. Этот результат согласуется с данными литературы о том, что ЛП необратимо инактивируется супероксидным анион-радикалом с разрушением гема и освобождением иона железа, но эта инактивация предотвращается при введении в систему супероксиддисмутазы (Jerizer Н. et al., 1986; Jenzer Н., Kohler H.t 1986; Huwller И. et al., 1986; Iíetodleva D., Duníord H.B., 1989).

Таким образом, в модельной системе наш была показана возможность сопряжения ферментативных реакций ICO и ЛП с помощью

СОД, которая превращает продукт КО-реакции (повреждающий агент ö|) в субстрат для ЛП-реакции (HgOg). Такая ситуация может возникать при атаке не специфическими антимикробными ферменташ молока - ИО и ЛП - патогенных бактерий, которые обладают собственной антиоксидантной защитой в виде фермента СОД (Рис. 46).

Изучение СОД-активности E.coll и S-typhlmurlum. В качества связующего звена биологической системы, в которой может осуществляться сопряжение реакций, описанное выше, были выбраны два возбудителя кишечных инфекций - Esherlchla coll 0-111 и Salmonella typiilinurlum 67. Модифицированным нами для микробиологических экспериментов методом гашения хешшшшесценщш было показано , что штакпше клетки E.coll 0-111 в конечной концентрации 8x10® кл/мл гасят на 50Ж хемилкмшзсценл'нув вспышку,

вызванную продукцией Og системой КО-гипоксантин. Зто соответствует СОД-активности 0,13 Ед/мл (конечная концентрация), определенной в контрольных эксперименты с чистым Оерментом. Следовательно, интактные клетки E.coll 0-111 обладают СОД-активностью 0,16 Ед/Ю9

клеток. Аналогичные результаты были получены наш для S.typhimurium. Показано 50 %-ное гашение хемиламинесценции интактными клетками S.typhtaurlum 67 (4xI08 кл/мл) в системе КО(О,04 Ед/мл) / гапоксаятин (10"3М). Это соответствовало СОД-активностн 0,065 Ед/мл, определенной в контрольных экспериментах с чистым ферментом. Следовательно, интактяые клетки суточной культуры S.typhlmurlum 67 обладают СОД-активностыо 0,16 Ед/109 гле ток.

Таким образом, в этих экспериментах было показано, что кнтактнне клетки возбудителей кишечных инфекций E.coli 0-111 и S.typhimurlum 67 обладают супероксиддисмутазной активностью, равной 0,16 Ед/Ю9 клеток. E.M.Gregory и соавторы (1973) показали, что E.coli обладает двумя видами супероксиддасмутаз: Мп-содаркащая

СОД находится в матриксе и служит для защиты от эндогенного 0|, тогда как Fe-содоркащая СОД локализуется в периплазматическом пространстве клеток и предназначена для защиты от экзогенных активных форм кислорода. Это позволяет предположить, что суп&роксиддисмутазная активность бактериальных клеток в нашем эксперименте была обусловлена периплазматичоской СОД.

Одним из этапов нашей работы было исследование действия антимикробных ферментов молока - КО и ЛП - на бактерии изучаемых штаммов в экспериментах In vitro.

Изучение антимикробного действия КО и ЛП In vitro.

Действие КО, ЛП и их комплекса In vitro изучали, инкубируя суспензии культур клеток E.coli 0-111 и S.typMmurlum 67 с опытными ферментными системами (ЛП-, КО- ц КО+ЛП-) и контролями в фосфатно-солевом буфере при 37°С и высевая аликвсты через 0,5 ч, I ч,3ч, 6 ч и 24 ч. Необходимо вновь подчеркнуть, что ЛП- и КО-систеыы содержали все необходимые субстраты для своей работы, тогда как система КО+ЛП не содержала перекиси водорода - одного иг двух необходимых субстратов для ЛП.

Црк изучении In vitro действия КО, ЛП и их комплекса на E.colJ пок&зано (Рис. 5а), что все исследованные системы оказывал! антимизфоСшО эффект, который начинал проявляться к I чаоз инкубации. В системе КО+ЛП число выживших клеток было наименьшим i составляло в среднем 4Э,ь % от контроля. Через 3 часа инкубации i ЛП-система осталось в среднем 56,7 % жизнеспособных клеток п<

E.coli 0-111

■<;< к1*

л.

х.

^

о

х' №

т КО-ьПП

ш ко

EES ЛП .

в Контроль

0.5

1.0

3.0

6.0

24.0

Рис.5. Антимикробное действие систем КО, Ж и КО+ЛП на Е.col 1(a) и S.typhimurium(б) in vitro.

По оси абсцисс - время (в ч По оси ординат - количество жизнеспособных клеток ( в процентах по отношению к контролю). Достоверность различий с контролем: » -- Р < 0,05; ** - Р < 0,01.

сравнению с контролем, в КО-системэ - 24,3 % , в системе КО+ЛП 20,8 % . Так же, как и при 1-часовой инкубации, система КО+ЛП проявляла наибольший антимикробный эффект. К 6 часам инкубации все опытные системы - КО, ЛЯ и КО+ЛП оказывали полный бактерицидный эффект - в среде инкубации не оставалось ни одной кизнеспособной клетки E.coll. Этот бактерицидный эффект был устойчивым и сохранялся через 24 ч инкубации, в то время как в контрольных чашках наблюдали сплошной рост колоний E.coll.

При изучении in vitro действия КО, ЛП и их комплекса на S.typhliiurluffl показано (Рис.Бб), что все исследованные системы оказывали антимикробный эффект. Но, в отлччие от эксперимента с E.coll (Рис. 5а), здесь ЛП-система обладала гораздо более слабым действием. В первые 0,5 часа инкубации опытные системы не оказывали достоверного антимикробного бффокта. К 1 чесу инкубации только одна из опытных систем - КО+ЛП - обнаружила достоверный антимикробный эффект (74,9% выдавших клеток по сравнению с контролем). КО-система также проявляла некоторое антимикробное действие (среднее количество выживших клеток - 87,7 %), однако различия с контролем были недостоверны. ЛП-система после 1-часовой к 3-часовой инкубации не проявляла достоверного антибактериального эф$екта. Системы КО и КО+ЛП через 3 часа оказывали полный бактерицидный эффект, который сохранялся к 24-чаоовой инкубации -посевы были стерильны. К 6 часам инкуба'пди на фоне полного бактерицидного эффекта систем КО и КО+ЛП стала проявляи достоверное антимикробное действие ЛП-система. При этом в среде инкубации осталось в среднем "V3,3% выживших клеток. К 24 ^ инкубации действие ЛП-сястемы на культуру S. typhlmurium перэсталс проявляться - в опыте был отмечен сплошной рост бактериальные клеток, так же, как и в контроле.

Тагам образом, первой к 1 часу инкубации проявил£ антимикробное действие на S. typhlmurlum H 67 система КО+ЛП, КО-система проявила достоверный антимикробный эффект к 3 часаь инкубации, а ЛП-система - к 6 часам инкубации с клеткам! S.typhlraurlum.

Слабое антибактериальное действие опытной ЛП-системы нг S.typhîir.urlum подтверждается данными литературы. Устойчивости сальмонелл к действию лактопероксидазной системы объясняете! сраннительно непроницаемой клеточной стенкой этих бактерий, причег

- IS - ..

татжн с шероховатой клеточной стенкой более чувствительны к ействшо ЛП, чем штаммы с гладкой оболочкой (PurOy и.A. et ai., 983; Денисова И.И. и др., 1987; Prultt K.U. et al., 1991).

Контрольные системы, содержавшие по одному из субстратов ила ерментов, не оказывали достоверного антимикробного действия на сследуемую культуру, кроме одной контрольной системы, состоявшей з фермента КО без субстратов. В этой системе бнл с тканей ни'имикробша эффект, составлявший 40 х ю % от действия оштпсй 0-системы (КО и ее субстрат гипоксантин). Этот результат Зъясняется низкой субстратной специфичностью ксантияоксидазы, эторая могет использовать для своей работы разнообразные вещества этероциклического строения, альдегиды и другае соединения Ягнятинская кМ., 1985), очевидно, присутствовавшие в среде зкубации среда продуктов жизнедеятельности бактерий.

Сопоставляя три опытные системы друг с другом, ш получили «щи®» результата. По сравнению с лп обе опытные спстьт, эдеркащие КО, обладали' достоверно большим авгашкроЗши» эйствиек. Сравнивая КО к КО+ЛП, т подушим дашше. зидетельствумцие о достоверно более высоком антимикробном эффекте ■j+jffl.

Более высогай антимикробный эфТект систзш KOiJiTI по сравнению КО-системой и ЛП-системой мог бить обусловлен только совместной аботой ксантиноксидазы и лшстопероксидазы в ней. Так как ^начально в зтоЯ системе отсутствовала перекись водорода, юбходамая для работы ЛП, мы заключили, что она появилась в среде шубации в результате превращения продукта КО-реакцш гпероксидаого анион-радикала - антиоксидантшм защитны?.! ферментом шроорганизмов - супероксиддисмутазой (Рио.Дб),

Описанные вше результаты свидетельствуют о том, что целительные ферменты молока - ксактшюксвдаза и дактопероксидаза объединяются в антимикробную систему In vitro, и связующим юном в этой системе является супероксидцисмутаза патогенных серобактерий.

Антимикробное действие системы КО+ЛП 1д vivo.

Действие системы ко+лп m vivo было изучено на модели

ентерального заражения бели мышей возбудителем сальмонеллеза. Контрольную и опытную группы мышей заракали культурой S.typhlmurlum N 67 перорально. Опытной группе, кроме этого, вводили также per оз смесь ферментов КО и ЛП без субстратов. Сравнительная оценка эффективности защитного действия система показала, что при 100% заражении сальмонеллами мышей контрольно! группы ь опытной группе было инфицировано только 47% животных. Ш одна мышь из опытной группы не пала, в то время как в контроле погибло 20% животных. Во все сроки вскрытия из внутренних органов контрольных мышей высевали сальмонеллы, причем количество Ш1фицированных органов к массивность обсеменения в 2,5 - S раз£ превышали эти показатели у мышей из опытной группы. Таким образом, в опытной • группе мышей отмечено более легкое течение генерализованной сальмонеллезной инфекции.

Полученные результаты показали, что система антимикробнш ферментов молока - ксантиноксидазы и лактопероксидазы - эффэктивнс защищает мышей при экспериментальном заражении возбудителе)! сальмонеллеза Salmonella typhlmurlum N 67.

В целом полученные результаты явились экспериментальны» обоснованием выдвинутой нами гипотезы о том, что антимикробные ферменты молока - ксантиноксидаза и лактопероксидаза - могу? объединяться в функциональную антимикробную систему, котора$ образуется и реализует свое действие при наличш супероксиддисмутазы патогенных энтеробактерий. Представленные данные имеют существенное значение для раскрытия механизмо1 антимикробного действия. молока в организме ребенка и даж основание для новых разработок по обогащению препарат! лактоглобулина неспецифическими компонентами молока и по создашя новых биологически активных добавок к детскому питанию.

ВЫВОДЫ

I. Разработаны технологии выделения и очистки неспецифичаски: антимикробных факторов молока - ферментов ксантиноксидазы i лактопероксидазы; разработан новый метод определена ляктопвроксидазноЯ активн ;ти в растворах, биологических жидкостя и полиакриламидннх гелях.

2. Полученные с помощью разработанных технологий фермента .'саятиноксидаза и лактопероксидаза соответствуют коммерческим налогам зарубезхных фирм по электрофоретической гомогенности, роматографической чистоте и удельной активности.

3. Антимикробная система ферментов ксантиноксид83Ы и [актопероксидазы молока образуется и реализует свое действие при 'лшпт супероксиддисмутазы, источником которой могут быть !атогеннне энтеробактерии.

4. В опытах In vitro выявлено антибактериальное действие ерментов ксантиноксндазн н лактопероксидазы в отношении ■нтеропатогенных штаммов Escherichia coli 0-111 и Salmonella ;ур1лшг1ш N 67, усиливающееся при объединении этих ферментов в 'диную систему;

5. В опытах in у Ivo показано, что комплекс ферментов ¡сантиноксидаБы и лактопероксидазы обладает протективным действием, о чем свидетельствует снижение степени тяжести течения жспериментальной сальмонелле зной инфекции и степени

птфйцлрованности подопытных животных,

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Влияние комплекса пврокисных ферментов молока на некоторые зиды микроорганизмов (А.П.Шепелев, Д.В.Альперович,Л.Д.Мартынешсо). - //Всес. конф. "Методы получения, анализа и применения рзрментов". Тез. докл. - Юрмала, I9S0. - С. 165.

2. Новый способ определения активности лактопероксидазы (Д.В.Альперович). - //Всес. конф.. "Метода получения, анализа гг применения ферментов",Тез. докл. - Юрмала, 1990. - С. 114.

3. Перспективы использования анкшикробных ферментов молока для лечения инфекционных заболеваний желудочно-кишечного, тракта (А.П.Шепелев, Д.В.Альперович). - // I Российский Национальный конгресс "Человек и лекарство", Тез. докл.- Москва,1992. - с. 528.

4. Бактерицидная система лрооноиданткых и антаоксвдзнт}шх ферментов (Д.В.Альперович, А.П.Шепелев, Л.Н.Чернавская и др.). -// 4 Всесоюзная конференция "Биоантиоксидант", Тез.докл. - Москва, 1992. - том I - С.61.

5. Свободно-радикальный механизм антимикробного действия ксантиноксидазы и лактопероксидазы (Д.В.Альперович, A.n.Шепелев,

Л.Н.Чернавская). - //я. "Бюллетень экспериментальной биологии медицины". - 1992. - Н 9. - С. 272-274. '

6. Взаимосвязь неспецифических антимшфобшх факторов мош (Обзор) (Д.В.Альперович, А.Д.Шетлев). - // Курн. микробиологи эпидемиологии и иммунобиологии. - 1993. - с.

7. Xanthine oxidase - lactoperoxldase antibacterial system : milk (D.V.Alperovlch, A.P.Shepelev, L.N.Chernav3kaJa et al.). - , International conference on critical aspects oi free radicals chemistry, biochemistry and medicine. Book of abstracts. Vienna, Austria. - Pebruary, 1993. - P-II-3. - P.114.