Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Состояние процессов свободнорадикального окисления липидов при экспериментальной сальмонеллезной инфекции

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Состояние процессов свободнорадикального окисления липидов при экспериментальной сальмонеллезной инфекции"

КОРНИЕНКО ИГОРЬ

На правах рукописи

ВАЛЕРИЕВИЧ

СОСТОЯНИЕ ПРОЦЕССОВ СВОБОДНОРАДИКАЛЬНОГО ОКИСЛЕНИЯ ЛИПИДОВ ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ САЛЬМОНЕЛЛЕЗНОЙ ИНФЕКЦИИ

03.00.04.- биологическая химия

АВТОРЕФЕРАТ ' диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

г. Ростов-на-Дону 1997г.

Работа выполнена в Ростовском НИИ микробиологии и паразитологии

Научный руководитель; Лауреат Государственной преыии РФ.

Заслуженный деятель науки ГО, член-корреспондент Академии Естествознания, доктор медицинских наук.' профессор А.П.Шепелев

Научный консультант: Лауреат Государственной премии ГО.

доктор медицинских наук, C.B.Соболева

Официальные оппоненты: доктор биологических наук.

профессор В.В.Внуков

доктор биологических наук, профессор Т.Н.Погорелова

Ведущая организация: Кубанская медицинская

академия (г.Краснодар)

Защита состоится "_" __ 1997 г. в __часов на

заседании диссертационного совета £.063.52.08. по биологическим наукам в Ростовском Государственном Университете (344006, г.Ростов-на-Дону, уд.Большая Садовая 105, РТУ, биолого-почввнный факультет, ауд. _).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке РТУ (344006, г.Ростов-на-Дону, ул.Пушкинская, 148).

Автореферат разослан "_н_ 1897 г.

Ученный секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук

¿[Г

В.Н.КИРОЙ

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Среди острых кишичных инфекционных болезней большое место занимают садьмснеллезн, в заболеваемости которыми в последние годы не проявляется заметной тенденции к снижению как в России, так и в других странах мира. Проблема усугубляется тем обстоятельством, что сальмонеллезы, являясь наиболее распространенной нозокомиальной инфекцией, поражают преимущественно детей первого года жизни, иммунная система которых характеризуется функциональной незрелостью. В связи с этим высокая заболеваемость сальмонеллезами дает основания рассматривать эту проблему как одну из серьезнейших не только с медицинской, но и народнохозяйственной точки зрения.

Сложность решения проблемы сальмонеллезов связана с большим многообразием клинических форм/ тяжестью течения, трудностью диагностики и терапии.

Сальмонеллез относится" к инфекциям, характеризующимся внутриклеточной персистенцией возбудителя. Особенно большую роль в локализации и обезвреживании возбудителя играет процесс фагоцитоза. Как и при многих других инфекциях, фагоцитарная реакция лейкоцитов при сальыонеллезе является основным звеном защиты макроорганизма, определяющим в значительной мере течение и исход болезни. Данные литературы свидетельствуют о незавершенности фагоцитоза при сальмонеллбзной инфекции (Ломакин М.С., 1990, Lindaren S.W., 1996). Известно, что завершённость фагоцитоза во многом определяется активностью систем, • генерирующих активные формы кислорода (АФК) (Говорова Н.Ю., 1989, Маянский А.Н., 1989) Важность окислительной ицрктивации бактерий подтверждается данными о повышенной восприимчивости к инфекциям людей, нейтрофилы которых не способны продуцировать АФК (Roos D., 1989).

Активированные фагоциты представляют серьезную опасность не только для бактерий, но и для макроорганизма. Кислородные радикалы продуцируются не только внутрь фагосомы, значительная часть их попадает во внеклеточное пространство, в результате чего возникает опасность развития свободнорадикального перекисного окисления в органах и тканях инфицированного организма (Владимиров O.A.. 1991).

Перекисное окисление является универсальным механизмом вза-

имодействия кислорода со многими органическими субстратами, прежде всего, с липидами (Меньшикова Е.Б.. 1994). Внедрение кислорода в молекулы окисляемого субстрата приводит к образовали реакционноспособных промежуточных продуктов - свободных радикалов, гидроперекисей и т.п., которые в дальнейшем вызывают повреждение других классов соединений - белков, нуклеиновых кислот, углеводов и пр. (Владимиров Ю.А., Арчаков А.И.. 1972).

Регуляция перекисного окисления липидов (ПОЛ) в тканях млекопитающих осуществляется с участием антиоксидантной системы включающей перехватчиков свободных радикалов и ферменты, обеспе чивахщие утилизацию активных форм кислорода, Н2О2 и липоперокси дов (Осипов А.Н., 1990, Wendel А., 1988).

Накопленные к настоящему времени данные литературы позволя ют сделать вывод о том, что свободнорадикальное окисление лини дов при сальмонеллезной инфекции играет определенную патогенети чес1сую роль (Снмованьян Э.Н., Шепелев А.П., 1988, Шепелев А.П. Мартыненко Л.Д., 1991). Однако работы по ферментативной регуля ции процессов перекисного окисления липидов при сальмонеллез практически отсутствуют. До сих пор не изучены механизмы и при рода окислительного стресса при сальмонеллезе.

Очень важно определить на каком этапе сальмонеллезной ил фекции происходят нарушения в системе антиоксидантной защиты какова степень дефицита антиоксидглтов в организме.' Это поможе _ определить тактику лечения в различные периоды заболевания предотвратить органные повреждения.

В связи с вышеизложенным, изучение изменений активное] ферментных систем генерирования радикалов кислорода и гидропер« кисей, а также системы ферментных антиотщантов в динамю сальмонеллезной инфекции лвллетск весьма актуальной задачей.

Целью исследования явилось выявление патогенетической ра процессов перегарного окисления липидов, а тагог.е состояния кк< лородзависимой реактивности фагоцитов крови при экслериментал] ном сальмонеллезе.

В работе были определены следующие задачи исследования:

1. Дать количественную характеристику процессов ПОЛ в пла кс крови, тканях печени и тонкого отдела кишечника в динами

экспериментального сальмонедлеза.

2. Оценить состояние ферментной антиоксидантной системы обезвреживания активных фори кислорода и лияопероксвдов в эритроцитах, тканях печени и тонкого отдела кишечника в динамике экспериментального сальмонедлеза.

3. Изучить изменение активности ксантиноксидазы в тканях печени и тонкого отдела! кишечника в динамике экспериментального сальмонеллеэа.

4. Исследовать биохимические особенности кислородзависимой реактивности фагоцитов крови при экспериментальном сальмонелле-зе.

б. Изучить взаимосвязь процессов ПОЛ и реактивности фагоцитов в условиях сальмонеллезной инфекции.

6. Исследовать механизм действия соединений, оказывающих влияние на свободнорадикальные процессы в организме, на течение сальмонеллезной инфекции.

Основные положения, выносимые на защиту:

- сальмонеллезная инфекция вызывает в организме животных комплекс биохимических нарушений, сопровождающихся активацией свободнорадикального окисления. Механизмы развития окислительного стресса в печени и тонком отделе кишечника инфицированных животных существенно различаются.

- снижение эффективности антиоксидантиой защиты в органах и тканях животных при экспериментальном сальмонеллезе приводит к развитию дисбаланса сопряженных процессов образования и ббезвре-лшвания активных форм кислорода и липопероксидов;

- наблюдаемая при сальмонеллезной инфекции гиперпродукция нейтрофилами активных^кислородных метаболитов обусловлена активацией системы НАДФН-оксидазы и миелопероксидазы;

- применение антрациклиновых антибиотиков, являющихся индукторами свободнорадикальных процессов в клетках, приводит к снижению летальности при экспериментальном сальмонеллезе.

Научная новизна работы. Впервые проведено систематическое исследование активности ферментных систем генерирования и утилизации активных кислородных метаболитов в крови, печени и тонкой кишке экспериментальных животных в динамике сальмонеллезной инфекции.

Выявлена важная роль ксантиноксидазы в инициации овоОодно-радикального окисления в органах зараженных животных. Активация ксантиноксидазы в тонкой кишке повышает устойчивость организма по отношению к сальмонеллам. Пероральное введение специфического ингибитора' ксантиноксидазы - аллопуринола - значительно снижает резистентность животных к инфекции.

Полученные данные свидетельствуют об устойчивом понижении активности каталазы в печени зараженных животных. .

Впервые установлено резкое снижение концентрации восстановленного глутатиона в органах зараженных животных.

• расбалансированность ферментной антиоксидантной системы печени сопровождается резкой активацией пентозного цикла.

Научно-теоретическая и практическая значимость работы заключается в экспериментальном подтверждении роди процессов ПОЛ в патогенезе сальмонеллеза.

Впервые проведено систематическое изучение активности ферментов внутриклеточной антиоксидантной защити в динамике сальмо-неллезной инфекции. •

Установлено, что ведущим фактором антиоксидантной 'защиты гепатоцитов является каталаза и система восстановленного глутатиона. В тканях тонкой юшки основным элементом биоантиоксидант-ной системы является восстановленный глутатион.

Показано, что в реализации токсических эффектов в печени при сальмонеллезе важную роль играет инактивировалие каталазы и снижение концентрации восстановленного глутатиона.

Впервые выявлена ведущая роль ксантиноксидазы как основного генератора активных кислородных радикалов в условиях сальмонел-лезной инфекции.

Впервые показана динамика изменений кислородзависимого метаболизма фагоцитов крови при сальмонеллезе. Подробно изучено влияние сальмонеллезной инфекции на активность основных ферментов "дыхательного взрыва" - НАДФН-оксвдазу и миелопероксидазу.

Впервые предложен показатель - коэффициент свечения отдельног нейтрофила, позволяющей дифференцировать повыаение интенсивности хемилюминесценции клеток цельной крови, обусловленное увеличением количества нейтрофилов, и интенсификацию хемилюминесценции, связанную с повышением функциональной активности нейтрофилов.

Получены данные, объясняющие механизм положительного дейс-

твия лекарственных средств, обладающих прооксидантным действием (в частности, антибиотиков антрациклинового ряда) в начальный период сальмонеллезной инфекции.

>

Апробация работы. Материалы диссертации доложены на 1-й научной сессии РГМУ (Ростов н/Д, апрель, 1996), на 7-м съезде Всероссийского общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов, Москва, январь 1997, на заседании Ростовского биохимического общества, февраль, 1997.

Публикация материалов исследования.

По теме диссертации опубликовано 5 научных работ, из них 2 в зарубежной печати.

Структура и объем работы.

Диссертация изложена на 179 страницах машинописного текста, иллюстрирована 25 таблицами, 32 рисунками и 10 схемами. Работа состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов и обсуждения собственных исследований, заключения, выводов, списка литературы, включающего 137 отечественных и 111 зарубежных источников.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Экспериментальные исследования проводили на модели сальмонеллезной инфекции, вызываемой S.enterltldls N 88 у мышей весом 16-20 г. Мыией после суточного голодания перорально однократно заражали суточной агаровой культурой Salmonella enterltldls в Дозе 5 млрд микробных клегок/мл в объеме 0,5 мл, Животных умерв-пщяли декапитацией через 18 часов, на 3-й, 6-е и 9-е сутки после заражения. Объектами микробиологических исследований служили печень, селезенка, содержимое тонкого и толстого отделов кишечника. На 3-е сутки в органах зараженных животных выявлены сальмонеллы, на 7-9 сутки наступала массовая гибель животных.

Объектами для биохимических исследований служили гепарини-зированная кровь, печень и слизистая тонкой кишки. Обработку биологического материала производили при температуре не выше +5°С.

Содержание белка в биологическом материале определяли унифицированным метолом, основанным на биуретовой реакции. Экстракция общих липидов проводили согласно методу В.П.Верболсвич

*

Ml f ^

(1*989). Содержание общих липидов в гексановых экстрактах определяли с помощью фосфованилинового метода D.D.Woodman, C.P.Price (1972). Содержание гемоглобина в лизатах эритроцитов определяли по унифицированному гемоглобинцианидному методу (приказ Ш СССР N 960 от 15.10.1974). Определение кислых протеиназ в печени определяли по методу В.В.Внукова (1979). Измерение хемшпоминесцен-ции плазмы крови, инициированной перекисью водорода, проводили разработанным нами методом. Определяли быструю вспышку (А^гог) и светосумму свечения (Бнгог) за 4 минуты (Г.А.Вабенко, 1983). Определение антиокислительной активности органов осуществляли по методу Г.И.Клебанова (1988) с использованием желточных липопро-теидов.

Определение активности антиоксидантных ферментов проводили в лизате эритроцитов и супернатанте гомогенатов тканей и пересчитывали с учетом содержания белка или гемоглобина. Активность каталазы в гомогенатах печени и лизате эритроцитов определяли по скорости утилизации пероксида водорода методом М.А.Королюка (1988). Активность каталазы в гомогенатах тонкой кишки определяли по скорости убыли субстрата методом R.F.Beers, I.W.Slzer (1952). Активность супероксиддисмутазы (СОД) оценивали по способности подавлять люцигенинзависимую хемшпоминесценцию, специфичную для супероксидных радикалов, образующихся при окислении адреналина в щелочных условиях' методом З.П.Черемисиной (1994). Определение концентрации восстановленного глутатиона проводили методом G.L.Ellman (1959). Активность глутатионпероксвдаэы определяли по скорости окисления востановленного глутатиона в присутствии гидроперекиси третичного бутила по методу В.М.Моина (1986). Активкость глутатионредуктаэы определяли по скорости окисления НАДФН методом Л В.Юсуповой (1989). Активность глюко-зо-6-фосфатдегидрогеназы определяли по скорости образования восстановленного НАДИ методом Г.А.Кочегова (1980). Активность ксантиноксидазы определяли по методу P.G.Avis (1955).

Способность фагоцитов генерировать / АФК. исследовали с помощью хемилюминесцентного метода, в качестве объекта исследования брали цельную кровь. Определение количественного и качественного состава лейкоцитов.периферической крови.проводили унифицированными методами (В.В.Меньшиков, 1987). Определение спонтанной и стимулированной опсонизированным зимозаноы хекшпоминесцен-

дии (ХЛ) проводили методом К.Van Dyke (1986), используя разведете крови 1:100, что практически ¡сключает влияние гуморальных ¡»акторов (Конышкина Т.М., 1989). Активность НАДФН-оксид азы опре-1еляли по методу В.И.Пыцкого (1994) в нашей модификации применительно к цельной крови. На хемилюминесцентных кривых определяли зветосумму ХЛ за 60 минут. По величине светосуммы вспышки ХЛ уценивали количество образованных кислородных радикалов (Ю.А.Владимиров, 1989). Хемшпоминесцентный анализ проводили на фиборе CL-3604 (СП "Диалог" Москва).

Влияние прооксидантов (адриабластин) и антиоксидантов (а-токоферол и дибунол) изучали на модели энтерального заражения 5елых мышей возбудителем сальмонеллеза..В опыте была использовала заражающая доза штамма Salmonella enterltldls N 88 - 2,5 млрд слеток/мл. Растворы адриабластина и суспензии ионола различных сонцентраций, приготовленных на физиологическом растворе, вводи-1И внутрибрюшинно в объеме 0,5 мл, витамин Е (масляный раствор) вводили внутриадшечно в объеме 0,1 мл спустя 2 часа после заражения. Контролем служили мыши, зараженные той же дозой S.enterltldls, с введением соответствующих растворителей в том же объеме. Параллельно ставили контроль на токсичность указанных пре-1аратов. Летальность животных опытных и контрольной групп регистрировали каждые сутки, начиная с 18 часов с момента введения возбудителя.

Статистическую обработку экспериментальных данных проводили з использованием программы STADIA версия 3,0 (авт. А.Кулайчев, 1989) на компьютере IBM PC 486 DX4-100, Статистическими досто-эерньш считали отличия соответствующие оценки ошибки вероятности р<0,05. «

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

L. Состояние системы перекисного окисления липидов и антиокисли-гельной активности в динамике сальмонеллезной инфекции.

Исследования хемилюминесценции плазмы крови показали, что у зараженных животных интенсивность быстрой вспышки (Аан202) повивалась, через 18 часов после заражения (175Z по отношению к контролю) . Можно предположить, что на первые сутки уменьшается содержание эндогенных антиоксидантов. На третьи сутки данный пока-

затель возвращался к норме и практически не изменялся в последу-: »Еще сутки. Светосумма свечения перекисной ХЛ (SH202) также резко повышалась через 18 часов после введения возбудителя (265Х по отношению к контролю) и оставалась повышенной весь период болезни животных, исключая третьи сутки, когда она снижалась до контрольных величин. ,

Кривые хемилюминограмм зараженных животных имели аномальные формы. Свечение плазмы крови зараженных животных сопровождалось ярко выраженной второй (медленной) вспышкой. У контрольных животных медленная вспышка отсутствовала.

Полученные данные об изменении антиокислительной.активности (ДОА) органов зараженных животных говорят о снижении эффективности системы биоантиоксидантов в динамике болезни животных. Уже через 18 часов после введения возбудителя отмечено достоверное снижение АОА слизистой тонкой кишки (Б6.4Х по отношению к контролю). В печени достоверное понижение АОА наблюдали только на 3-й сутки поело заражения. Антиокислительная активность органов оставалась пониженной весь период болезни животных.

По полученным нами данным важную роль в активации свободно-радикального окисления в органах зараженных животных играет ксантиноксидаза. Так; в печени ксантиноксидазная активность стабильно возрастает к 3~м суткам. На б-9-e сутки активность фермента в 8-9 раз превышала нормальные величины. Увеличение ксан-тиноксидазной активности в печени тесно коррелировало с активацией кислых протеиназ (г-0.958. р<0,05).

В слизистой тонкой кишки значительное повыаение активности ксантиноксидазы наблюдали на 3-е сутки (220,4Z по отношению к интактным животным). На 6-9-е сутки происходило снижение'активности фермента (64,9 и 58,81 соответственно). Снижение активности ксантиноксидазы на 6-9-е сутки, по-видимому, связано с дистрофическими изменениями, имеющими место в тонкой кишке в острый период болезни. . -

Активация ксантиноксидазы повышает устойчивость организма к данной инфекции. Пероральное введение специфического ингибитора ксантиноксидазы - аллопуринола - за 2 часа до перораььного введения культуры S.enterltldls, значительно снижало резистентность животных к инфекции.

Полученные нами данные свидетельствуют о том. что активация

Рмс.1. Переююеа хемигеглисарциа глазки крови (в % по (гтсажма к контроле) в динамке еальмоиеллезной ннфея?«. А1 - быстрая вслмика, Б • аетосуима докниц К - юктроль. * - достовернее!* в срзпие»« с контролем.

Рис.2. Апнскиамгаыая атаиок панеЯ печени н тонкой гсшжи (в % юопжэтк контроле) в дамке сшшжвютой инфекции. К - контроль ♦ - достоверность в сргвюнии с контролен

ксантиноксидазной системы при сальмонбдлезной инфекции является, с одной стороны, важной составляющей механизмов антибактериальной защиты организма, а. с другой - способна приводить к существенным повреждениям органов и тканей.

2. Реактивность полиморфноядериых лейкоцитов при экспериментальном сальмонеллезе.

На 6-е и 9-е сутки после заражения наблюдали достоверное увеличение уровня показателей спонтанной и стимулированной хеми-люминесценции цельной крови экспериментальных животных. Одновременно наблюдали достоверное увеличение содержания нейтрофилов крови по отношению к интактным животным.' Нами обнаружена тесная корреляция'между показателями ХЛ цельной крови и содержанием нейтрофилов. На 6-е и 9-е сутки интенсивность стимулированной ХЛ нейтрофилов крови превышала показатели контрольных животных.

Изменение активности НАДФН-оксидазы нейтрофилов крови линейно коррелировало с интенсивностью медленной вспышки и свето-суммой перекисной хемилюминесценции плазмы крови (г-0.911 и г=0,956 соответственно). Это свидетельствует о важной роли нейт- , рофилов зараженных животных в инициировании ПОЛ в плазме крови.

До проведения настоящего исследования природа возникновения второй вспышки перекисной ХЛ плазмы крови оставалась не ясной (Л.М.Еезрукавникова, 1987). Представляется наиболее вероятным, что причиной возникновения медленной вспышки перекисной ХЛ плазмы крови зараженных животных являются продукты взаимодействия активных форм кислорода, продуцируемых актированными фагоцитами. ;; '

Кислородзависиыая реактивность нейтрофилов крови при экспериментальном сальмонеллезе носила фазный характер. Повышение активности НАДФН-оксидазы через 18 часов после заражения, по-видимому, представляет собой защитнуюреакцию макроорганиэма против инфекции. Снижение продукции супероксиданион радикала нейтрофи-лами крови на 3-й сутки, вероятно, связано с мобилизацией анти-оксидантных систем. '

3. Динамика активности антиоксидантных Ферментных систем в крови. тканях печени и тонкой кишки в условиях экспериментального сальыонеллеза. :

Активность супероксиддисмутазы в эритроцитах, печени и тонкой кишке практически не изменялась в течение болезни, лишь нез-

\с.З. Атеист» ксакгмнотемдаза пеюм и слизистой тонкоЛ тш, активность лая&-мх протетаз в печени (в X гю отношено к кокгрото) в дошмке сальмонетезкой ин-{¡екции. К - ютропь * - достоверность в ершами с контролен

«АОюкпиая хемтмёсцвца (С-ОД ХЛ-стэет на опсонеирошный зммозан >3-ХЛ) и НвДфН-огадаэная акпеность мши цельной крови (в X по отношению к контро-а) в дина«« Салмоиеллезмай иифеия«. К - контроль показгтаюй, досго®^ иль в сравни«« с контролем^.

начительно снижалась на б-е сутки в эритроцитах (77,62 по отношению к контролю). Можно предположить, что в органах животных в процессе болезни не происходит эффективного ингибирования процессов ПОЛ на стадии инициации активными формами кислорода. Следовательно, на фоне усиленной генерации 0г~ ксантиноксидазой и активированными фагоцитами и не достаточно эффективной работы СОД, концентрация активных фор« кислорода в органах зараженных Животных достаточно велика для того, чтобы обеспечить Ог"-зависимую индукцию ПОЛ.

Обращает на себя внимание устойчивое понижение активности каталазы в печени зараженных животных. Начиная с 1-х и по 3-й сутки, активность каталазы снижалась вдвое по сравнению с ин-тактными животными. На 6-е сутки каталаэная активность резко упала (13,82 по отношению к интактным животным) и оставалась сниженной на 9-е сутки.

Нами било показано повышение активности кислых лротеиназ печени зараженных животных, начиная с 3-х суток, и дальнейшее увеличение активности ферментов в последующие сутки. Возможно, что резкое ингибирование печеночной каталазы на б-е и 9-е сутки связано с активацией в зтот период кислых протенназ (г--0,867).

Было установлено также, что в тонком отделе кишечника ката-лаза практически не участвует в утилизации Н2О2. эту функцию здесь выполняет система восстановленного глутатиона и глутатион-пероксидаза (ГПО). Увеличение активности фермента в тонкой кижо (151,6% от контроля) наблюдалось в первые сутки после заражения, что; вероятно, связано с усилением процессов ПОЛ иод влиянием возбудителя. На 3-й и последующие сутки активность фермента резко снижалась и в дальнейшем не повышалась, что может быть обусловлено значительным изменением метаболизма энтероцитов и деструкцией тканей. ~ ; ;

В печени активность ГПО снижалась через 18 часов после введения возбудителя, а на 9-е сутки незначительно повышалась (65,3 и 151,42 по отношению к интактным животным соответственно). Учитывая высокую чувствительность ГПО к зачислению среды (И.Л.Быш-кин, 1988), можно предположить, что уменьшение активности фермента в первые - третьи сутки после заражения связано с уменьшением рН среды вследствии гипоксии, которая, согласно литературным данным, развивается в тканях зараженных животных (Пак С.Г.,

Pwc.5. Концентрация воссгановашюго глутатиоиа в эритроцитах, почет и тонкой кмике (а% га (пномениэкксшрога)в дмнамжесальионагаезиойинфекции. К-контроле » - достоверность в сравнении с контролен

Рис.6. Актжиоеп шшшы эрмтроцт» м пмеим (» % по отжюомо к контролю) а шие самюнеляеэиой инфекцю«. К- контроле достоверность в сравнении с контролем.

1988). •

В динамике болезни отмечено прогрессивное снижение уровни восстановленного глутатиона в органах животных на 6-е и 9-е сутки. Снижение концентрации восстановленного глутатиона в печени зараженных животных коррелировало с понижением каталазной активности (г=0,924). Это можно объяснить тем, что в условиях значительного снижения каталазной активности в печени зараженных животных, компенсаторную функцию по утилизации перекиси водорода выполняет система восстановленного глутатиона, что приводит к значительным перегрузкам в его потреблении.

С другой стороны, активация печеночной ксантиноксидазы способствует интенсивному окислению восстановленного глутатиона (г--0,994, р<0,005). Возрастающая скорость реакции окисления восстановленного глутатиона, по-видимому, не компенсируется скоростью реакции его регенерации. Все это ведет к сдвигу динамического равновесия системы окисления-восстановления глутатиона в сторону окисления, что приводит к уменьиению в печени и тонкой кишке концентрации восстановленного глутатиона на 6-е и 9-е сутки болезни.

В эритроцитах и печени не наблюдали значительных изменений активности глутатионредуктазы в течение всего периода болезни Сднако, в слизистой тонкой кишки активность фермента уменьшалась через 18 часов после заражения и оставалась пониженной в течение воего эксперимента.

При изучении■активности глюкозо-6-фосфат дегидрогеназы нами обнаружены разнонаправленные изменении активности фермента в-тканях печени и слизистой тонкой кишки в процессе развития садь-монеллеза. Так, в тонком отделе кишечника она понижается, начиная с первых суток, а в печени - резко возрастает на б-е й 9-е сутки.

Стойкое повышение активности фермента в печени коррелировало с увеличением содержания липидов (г - 0,955, р<0,05). Это может объясняться тем, что активация пентозофосфатного цикла компенсируется усилением реакций биосинтеза жиров, использующих НДДФН. Избыток липидов создает условия для активации свободнора-дикального окисления, что повышает вероятность • интенсификации ПОЛ в печени. Представляется возможным, что свободнорадикальяое окисление липидов является одним из факторов развития дистрофи-

сема 1. РАЗВИТИЕ ОКИСЛИТЕЛЬНОГО ДИСБАЛАНСА В ТОНКОМ ОТДЕЛЕ КИШЕЧНИКА ЗАРАЖЕННЫХ ЖИВОТНЫХ

11

И

II

Глутатионредуктаэа

НДФ+__НАДФН

Глшозо-б-фосфат ДГ ||

Пт!М9чвниэ: || - снижение концентрации, активности || - увеличение концентрации, активности

Схема 2. РАЗБИТИЕ 0!ШСЖТЕЛЬН0Г0 ДИСБАЛАНСА В ПЕЧЕНИ ЗАРАЖЕННЫХ ЖИВОТНЫХ

Гипоксия ->> Ацидоз

Глутатионредуктаза

НАДО

Ннш

ш—»

Общие I Ц Л 3! п и д ы II

II'

Глюкозо-5-фосфат ДР

Субстрат Жировое ПОЛ перерождение

примечание: || - снижение концентрации, активности || - увеличение концентрации, активности

чесгаа изменений гепатоцитов.

Корреляция между изменением в печени активности каталазы и глутатионпероксвдазы в динамике сальмонеллеза не установлена, однако между изменением активности каталазы и глюкозо-6-фосфат дегидрогеназы обнаружена тесная взаимосвязь (г—0.848). Это указывает на возрастание скорости окисления глюкозы при ингибирова-нии активности каталазы.

Механизмы развития окислительного дисбаланса для тонкой юшки и печени представлены на схемах 1 и 2.

На основании наших результатов можно сказать, что в органах зараженных сальмонеллезом животных развивается окислительный стресс. Движущей силой возникновения огаслительного стресса является снижение каталазной активности, и, как следствие, уменьшение концентрации восстановленного глутатиона в печени и тонкой кишке зараженных животных. .

4. Влияние про- и антиоксидантов на течение экспериментального сальмонеллеза.

Полученные результаты свидетельствуют, что антиоксиданты дибунол и «-токоферол не оказывали влияние на летальность экспериментальных животных. А в дозе 50 мг/кг витамин Е ослаблял резистентность организма к сальыонеллезной инфекции. Массовый па-дед животных после введения а-токоферола приходился на 4-6-е сутки, в то время как гибель животных контрольной группы наступала на 7-9-е сутки после заражения.

Адриабластин оказывал протективиое действие в концентрации 0,5 мг/кг. На протяжении всего эксперимента летальность зараженных животных контрольной' группы была выше, чем для группы животных леченных адриабласрном: массовая гибель животных контрольной группы наступала на 7-8-е сутки, в то время как к 12-14-м суткам погибла только половина всех животных, получавших адриаб-ластин.

Вероятно, протективиое действие адриабластина связано с его способностью генерировать Ог" внутри фагоцитирующих клеток, в частности в нейтрофилах. С целью выявления изменений кислородза-висимой реактивности фагоцитов крови под влиянием адриабластина осуществляли хемилюминесцентиый анализ через 18 часов, на 3-й и 6-е сутки с момента введения препарата.

В группе животных, леченных адриабластином, уровень спои-

ЕЗ 1-е йз-и . Цв-е Э»-в

Ркс.7. Мпенэсп ггако»-6-(}хх4ат депуфогеназы гклеки и танкой юшкц концентрация общих люидое в пенам (в % по отношению к контролю) в д инамике салыюнеппезиой инфекции. К - контроль. ♦ - достоверность в сравнении с контролем.

01-е йз-к шв~<=

Рис.8. Интаошхть ошганиой (С-ХП) и стшулмроваююй огтизмрмшньм зимозаном хамлюмюесценции (03-ХЛ) клеток цельной кроен зараженных животных (в условных единицах) после введения адриакициа. К - показатели коктролжых животных (не леченных ад-рмамицнном\ А - показатели подопьтмх животных (лешых адриамщиюм). * - достоверность в сравнении с контролем.

анной хеыилюмшесценции на 1-е сутки практически не отличался 1Т аналогшного показателя контрольных животных. На 3-е и 6-е утки наблюдали достоверное повышение всех показателей ХЛ нейт-юфилов крови.

Представленные данные свидетельствуют, что протекторное |ействие адриабластина при сальмонеллезной инфекции связано с ¡го способностью усиливать кислородзависимий метаболизм фагоцитирующих клеток, тем самым повышая их антимикробную активность.

ВЫВОДЫ

1. Сальмонеллезная инфекция вызывает в организме животных комплекс биохимических нарушений, сопровождающихся активацией ;вободнор'адикалыюго окисления. Роль инициациатора ПОЛ в органах зараженных животных играет ксантиноксидаза. являющаяся одним из зсновных источников образования активных форм кислорода, облада-ощдх бактерицидными свойствами.

2. В печени, начиная с 1-х суток после заражения, снижается активность глталази; система восстановленного глутагиона печени становится ведущей в утилизации Н2О2 и других А£К. Снижение эффективности анткоксидантной задиты в органах и тканях животных при экспериментальном сальмонеллезе приводит 1; развитию дисбаланса сопряг.еяпих процессов образования и обезвреживания активных форм кислорода и лилопероксвдов.

3. Расбалалсированность ферментной антиоксидантной системы печени сопровождается резкой активацией .пенгозного цикла, и, ¡сак следствие, приводит к накоплению общих липидов печени зараженных ливотных.

4. В эритроцитах зараченных животных не наблюдается существенны): изменений ферментной системы глутатиона» каталазная активность незначительно снижена.

5. В основе механизма повышения интенсивности хемилюминес-ценщш цельной крови при сальмонеллезе ле;шт с одной стороны повышение количества нейтрофилоз крови, с другой - активация НАДН^огавдазы и миелопероксидазы.

6. Предложен показатель - ¡«ззффициент свечения отдельного нейтрофила, позволяющий дифференцировать повышение интенсивности

хемилюминесценции клеток цельной крови, обусловленное увеличеии ем количества нейтрофилов, и интенсификацию хемилюминесценции связанную с повышением функциональной активности нейтрофилов.

7. Применение антрациклиновых антибиотиков, являющихся, ин дукторами свободнорадикалъных процессов в клетках макроорганиз ма, приводит к снижению летальности при экспериментальном саль монеллезе.

СПИСОК РАБОТ. ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ .

1. Реактивность фагоцитов крови в динамике зксперименталь ного сальмонеллеза (А.П.Шепелев. Л.Н.Чернавская).- // Тезис; докладов Научной сессии РГМУ, апрель 1996 стр.124.

Z. Состояние антиоксидантной системы в динамике эксперимен тального сальмонеллеза (А.П.Шепелев, Л.Н.Чернавская).- // Тезис! докладов Научной сессии РГМУ, апрель 1996 стр.139,

3. The state of lipids peroxidation system In the dynamic: of experimental salmonellosis (A.P.Shepelev).- // Oxldatlvi Stress and Redox Regulation: cellular signaling, aids, cance; and other diseases. France, Paris, may 1996, N VI1.41. ' •

4. The state of lipids peroxidation system and the reactlvi ciiemilumlnescence of blood phagocytes in the dynamics of experimental salmonellosis (A.P.Shepelev).- // VIII Biennial Meeetlni International Society for Free Radical Research. Spain, Barcelona, october 1996, fl 9.113.

5. Состояние системы перекисного окисления липидов и реактивная хемилюминесценшя Фагоцитов крови в динамике экспериментального, сальмонеллеза (А.П.Шепелев).- // VII съезд Всероссийского общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов. Москва, январь 1997, стр.205-206.

Подписано к печати Формат 60x84/18.

Печать офсетная. Бумага газетная. Объём {0 п.л.

Тира« /СО экз. ООП ЦНТИ. Зак. /О/