Сверхслабое излучение и оптическое взаимодействие яйцеклеток и зародышей шпорцевой лягушки

Володяев, Илья Владимирович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Сверхслабое излучение и оптическое взаимодействие яйцеклеток и зародышей шпорцевой лягушки
ВАК РФ 03.00.30, Биология развития, эмбриология

Автореферат диссертации по теме "Сверхслабое излучение и оптическое взаимодействие яйцеклеток и зародышей шпорцевой лягушки"

На правах рукописи УДК 577 357, 591 31

Володяев Илья Владимирович

СВЕРХСЛАБОЕ ИЗЛУЧЕНИЕ И ОПТИЧЕСКОЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ЯЙЦЕКЛЕТОК И ЗАРОДЫШЕЙ ШПОРЦЕВОЙ ЛЯГУШКИ

03 00 30-03 — биология развития, эмбриология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

ООЗ163383 Москва, 2007

003163383

Работа выполнена на кафедре эмбриологии Биологического факультета Московского государственного университета им М В Ломоносова

Научный руководитель

доктор биологических наук, профессор Белоусов Лев Владимирович

Официальные оппоненты

доктор химических наук, профессор Егоров Владислав Викторович (Московская ветеринарная академия им К И Скрябина)

доктор биологических наук, профессор Воейков Владимир Леонидович (каф биоорганической химии Биологического факультета МГУ)

Ведущая организация

институт Биохимической физики им Эммануэля РАН

Защита состоится 18 декабря 2007 г. в 15 ч. 30 мин. на заседании

Диссертационного Совета _ПрИ мОСКОвском

государственном университете им М В Ломоносова по адресу 119992, Москва, Ленинские горы, д 1, корп 12, МГУ, Биологический факультет, ауд М1

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ им М В Ломоносова

Автореферат разослан «16» ноября 2007 г

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

Калистратова Е Н

1. ПРИНЯТЫЕ СОКРАЩЕНИЯ

МГЭ — митогенетический эффект Спектральные области электромагнитного излучения ИК — инфракрасная (740 нм — 1 мм), УФ — ультрафиолетовая (10 — 380 нм)

2. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

2.1. Актуальность проблемы

Первые данные по нехимическим дистантным взаимодействиям биологических объектов появились более 80 лет назад в работах А ГГурвича по тн митогенетическому эффекту (МГЭ) [Gurwitsch, 1923] Феномен МГЭ состоит в изменении ритма клеточных делений в культурах микроорганизмов, культурах клеток и тканях многоклеточных организмов при оптическом контакте с рядом биологических или химических систем Явление МГЭ многократно подтверждено и детально исследовано в этой и других лабораториях в СССР, Италии, Германии, Нидерландах и США (обзор ранних работ см в [Залкинд, Франк, 1930, Гурвич А и J1, 1934, Rahn, 1936]) Несколько появившихся работ с отрицанием МГЭ [Hollaender а Claus, 1937, Westenberg, 1937, 1941] были выполнены с серьезными отклонениями от методики и опровергнуты в ответной критике [Залкинд, 1937, Гурвич А и Л , 1948]

В дальнейшем феномены, связанные с дистантным нехимическим взаимодействием наблюдали неоднократно

• ускорение роста клеток и микроорганизмов при оптическом контакте культур [Киркин, 1981, Grasso et al, 1991, Wainwright et al, 1997, Trushin, 2003],

• стимуляция созревания спор бактерий [Николаев, 1992, Nikolaev et al, 2006],

• пространственная ориентация клеток при оптическом контакте с другой культурой [Albrecht-Buehler, 1991, 1992, 1994, 1997, 2000],

• стимуляция секреции клеток молочной железы при оптическом контакте культур [Молчанов, 1985, Moltchanov, Golantzev, 1995],

• изменение содержания белка, активация транскрипционного фактора NFkB и изменение морфологии актинового цитоскелета и плотных контактов в культуре клеток при оптическом контакте с культурой, находящейся под действием перекиси водорода [Farhadi et al, 2007],

• появление цитопатического эффекта в культуре клеток при оптическом контакте с культурой, зараженной вирусом [Казначеев с соавт, 1972],

• аномальное развитие зародышей морского ежа при оптическом контакте с культурой бактерий [Magrou I et М , 1927, 1932],

• изменение скорости развития и процента аномалий зародышей вьюна при оптическом контакте кладок икры разных стадий развития [Бурлаков с соавт, 1999, 2000],

• стимуляция сверхслабой люминесценции образцов крови при их оптическом контакте [Voeikov, Novikov, 1997, Xun Shen et al , 1994],

• синхронизация ритмов сверхслабой люминесценции динофлагеллят [Рорр F-A et al, 1992],

• различные биологические эффекты, вызываемые тн вторичным биогенным излучением [Кузин с соавт, 1994]

Общее для всех этих эффектов — отсутствие химического носителя Явления дистантного взаимодействия наблюдаются при разделении объектов пластинками из кварца [Gurwitsch, 1923, Будаговский, 2004, Бурлаков с соавт, 1999], стекла [Albrecht-Buehler, 1992, Trushin, 2003, Farhadi et al, 2007] и исчезают при их замене на матовые пластинки из того же материала [Будаговский А В , 2004, Trushin М , 2003] В ряде случаев доказано участие электромагнитных волн УФ [Гурвич А и Л , 1934, 1945], ИК [Albrecht-Buehler, 1991, 2000], получены спектры дистантного взаимодействия [Frank, Rodionow, 1932] Показано, что сверхслабое излучение от физических источников того же спектрального диапазона, что и предполагаемое излучение биологических объектов, действует аналогично последнему [Frank, 1929, Chariton et al, 1930, Albrecht-Buehler, 1991, 1994]

Авторы [Кузин с соавт, 1987, Бурлаков с соавт, 1999, Voeikov and Novikov, 1997, Молчанов, 1985] также предполагают электромагнитную природу эффекта, Ю А Николаев (1992) допускает участие акустических волн

Впервые с помощью физических детекторов электромагнитное излучение

биологических объектов зарегистрировано от «индукторов» МГЭ [Rajewsky, 1930, 1931, Frank, Rodionow, 1932] (обзор работ см в [Гурвич, 1966]) Однако серьезное развитие проблема сверхслабого излучения получила после работ [Colli, Facchini, 1954, Тарусов с соавт, 1961, Владимиров, Львова 1964], в основном в исследованиях школы Б Н Тарусова Показано, что во всех биологических объектах и в ряде модельных систем постоянно идут процессы свободно-радикального окисления, являющиеся источниками сверхслабой хемилюминесценции в видимой области спектра [Тарусов и др (ред), 1972, Журавлев, 1972, Владимиров, Шерстнев, 1989]

В работах школы Б Н Тарусова эти процессы рассматривали как чисто деструктивные Позже показано, что их определенная интенсивность необходима для нормального функционирования клетки (см обзор [Voeikov, 2001]), открыто ферментативное производство активных форм кислорода [Babior et al, 1973, Krieger-Brauer, Kather, 1995] и их влияние на важнейшие клеточные процессы [Downs et al, 1998, Chiarugi et al, 2003, Gordeeva et al, 2004] В настоящее время NO и 02" рассматривают, наряду с Са2+, как основные вторичные мессенджеры в клетке [Khan and Wilson, 1995, Droge, 2002, Saran, 2003] Ряд авторов [Воейков, 2003, Новиков, 2004] связывает регуляторную роль АФК с излучением при их рекомбинации

Однако до настоящего времени механизмы дистантного взаимодействия остаются неизвестными Электромагнитное излучение от большинства биологических объектов имеет очень низкую интенсивность по данным разных авторов ~102 квант/см2сек [Rajewsky, 1930, 1931], ~103 квант/см2сек [Frank, Rodionow, 1932], -0,5—5 квант/сек [Журавлев, 1972] По оценке [Popp, 1992], мощность электромагнитного взаимодействия биологических объектов лежит в диапазоне 10~17—10"15 Вт (эквивалентно -10°—103 квант/сек в диапазоне ближний УФ — ближний ИК)

Наиболее дискуссионный вопрос в этой области как столь слабый сигнал может оказывать специфическое действие (стимуляцию клеточных делений или физиологических функций, изменение скорости развития и его аномалий) на фоне световых потоков значительно более высокой интенсивности'?

В школе АГГурвича обращали особое внимание на спектр излучения и «режим» взаимодействия объектов периодическое прерывание, экранирование отдельных частей и др Авторы [Залкинд и Франк, 1930, Гурвич А и Л, 1934] предполагали, что излучение, вызывающее МГЭ,

происходит отдельными квантами или группами квантов, а получение максимального эффекта связано с определенной корреляцией их появления

В работах [Орел и Дзятковская, 2000, Бурлаков, 1999, Beloussov, 2002, 2006] использовали Фурье-анализ и автокорреляционный анализ спонтанного излучения зародышей вьюна, клеточных культур и др (диапазон 200—800 нм) Авторы подтверждают, что излучение происходит отдельными группами квантов, находят характерные частоты их появления (~103—103 Гц) и указывают на корреляции в спектре этих частот В [Orel et al , 2004] показано, что автокоррелограммы Фурье-спектров механоиндуцированного излучения крови раковых больных более хаотичны, чем у здоровых людей По утверждению [Загускин, 2007], чувствительность биосистем к внешним сверхслабым воздействиям также связана не с «магическими частотами», а с общей структурой их набора

В работах [Popp, Ke-hsuch, 1993, Bajpai, 1999, Popp et al 2002] предполагается, что излучение биологических объектов обладает особыми квантовыми свойствами высокой степенью когеррентности, свойствами тн сжатого света и др , а их оптическое взаимодействие может проявляться в снижения суммарной интенсивности излучения (тн субрадиации) [Popp, 2006] Последнее согласуется с результатами, полученными на зародышах вьюна [Белоусов с соавт, 2003]

Тем не менее, вопрос о механизмах дистантного нехимического взаимодействия остается нерешенным Не исследованы корреляции различных свойств излучения биологических объектов и их способности индуцировать дистантные биологические эффекты Практически отсутствуют систематические измерения излучения от основных модельных объектов биологии по ходу их развития Большинство работ связано с оптическим взаимодействием или излучением клеточных культур или кладок икры При этом оптический контакт клеток или зародышей внутри культуры или кладки затрудняет выявление эффекта от взаимодействия между ними и может влиять на суммарное излучение

2.2. Цели и задачи исследования

В связи с изложенным были поставлены следующие цели и сформулированы задачи исследования

Цель- определить, возможно ли и за счет чего оптическое взаимодействие зародышей X laevis

Задачи:

• Определить роль оптических контактов для развития отдельных зародышей X laevis сравнить развитие зародышей с нормальными и нарушенными оптическими контактами по основным морфологическим критериям

• Зарегистрировать излучение отдельного зародыша X laevis в спектральном диапазоне 200—800 нм на разных стадиях развития Провести анализ основных свойств этого излучения

• Зарегистрировать излучение зародышей X laevis при их оптическом взаимодействии

2.3. Научная новизна работы

Работа впервые проведена на индивидуальных яйцеклетках и зародышах Использован эмбриональный материал от одного из модельных объектов современной биологии развития — шпорцевой лягушки Xenopus laevis Daudin

Впервые показано оптическое взаимодействие зародышей X laevis в период дробления, влияющее на темп и пространственно-временную скоррелированность развития

Впервые измерено сверхслабое излучение зародышей X laevis от оплодотворения (ст 1) до стадии хвостовой почки (ст 24) Показано, что несмотря на равенство фону по средней интенсивности, излучение зародышей имеет свои стадио-специфичные спектры Фурье В период дробления (ст 1—4) ССИ зародышей выше фона по мощности на группе частот в диапазоне 0,01—50 Гц и ниже фона в диапазоне 0,1—500 Гц, на ст 8 (средняя бластула) обнаружены группы частот в ССИ зародышей в диапазонах 0,01—50 Гц и 0,1—500 Гц Их появление совпадает со временем внезапной активации генома зародыша — mid-blastula transition

Показано снижение интенсивности суммарного излучения при оптическом взаимодействии зародышей X laevis

Разработано и успешно применено программное обеспечение для

поточной цифровой обработки сигналов со статистическим анализом

2.4. Практическое значение работы

Показанное оптическое взаимодействие зародышей Xlaevis позволяет исследовать явление сверхслабого излучения биологических объектов на этом объекте — стандартном, удобном в использовании и хорошо изученном при нормальном развитии

Использованный метод наблюдения за индивидуальным развитием зародышей позволяет строго и детально исследовать их оптическое взаимодействие

Разработанное программное обеспечение позволяет быстро, строго и в автоматическом режиме анализировать сверхслабое излучение разных объектов

Анализ излучения зародышей потенциально является мощным экспресс-методом определения их состояния и взаимодействия

2.5. Апробация работы

Основные результаты диссертационной работы были изложены на конференциях

• III Международной конференции «Электромагнитные поля и излучения в биологии» (Калуга, 2005),

• IV Международном конгрессе «Слабые и сверхслабые поля и излучения в биологии и медицине» (СПб, 2006),

• VII Международной крымской конференции «Космос и биосфера» (Судак, Крым, 2007),

• на летних школах по «биофотонике и ее применению» (Международный институт биофизики, Нойсс, Германия, 2006 и 2007),

на заседании кафедры эмбриологии Биологического факультета МГУ

2.6. Публикации

По теме диссертации опубликовано 6 печатных работ

2.7. Объем и структура диссертации

Диссертация состоит из следующих разделов «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты и обсуждение», «Заключение», «Выводы», «Список литературы», «Приложения» Работа изложена на 120 страницах, включает 5 таблиц, 4 иллюстраци В списке литературы приведено 150 публикаций

3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Исследования проводили на яйцеклетках и зародышах шпорцевой лягушки (Xenopus laevis Daudin ), полученных методом гормональной стимуляции

Использовали стандартные методы синхронного и индивидуального оплодотворения in vitro, стандартные растворы для инкубации холоднокровных (10%, 100% MMR, рН 7,4) Регистрировали развитие зародышей по таблицам нормального развития [Nieuwkoop, Faber, 1956, Детлаф, Руднева, 1975]

Задача 1. Исследование оптического взаимодействия дробящихся яйцеклеток X.laevis.

Яйцеклетки X laevis синхронно оплодотворяли in vitro Через 30 мин с них снимали третичные оболочки 2% раствором цистеина (рН 8), отбирали оплодотворенные яйцеклетки и помещали их в кварцевые кюветы с индивидуальными ячейками для каждого зародыша (рис1) Использовали две кюветы.

• кювета А — с сохранением оптических контактов (с прозрачными перегородками между зародышами),

• кювета Б — с нарушением оптических контактов (с матовыми перегородками между зародышами)

Зародыши в двух кюветах находились в идентичных условиях химических, температурных, освещенности и др Эксперимент начинался через 50—60 мин после оплодотворения и длился от 1,5 до 2 часов По ходу опыта определяли количество анимальных бластомеров каждого зародыша Все ячейки каждой кюветы условно делили на три группы

1 ячейки с четырьмя ближайшими «соседями» (64 шт) — внутренние 8*8

ячеек;

2. ячейки с тремя ближайшими «соседями» (32 шт.) — ячейки в рядах по периферии кюветы за вычетом угловых;

3. ячейки с двумя ближайшими «соседями» (4 шт.) — угловые ячейки.

Сравнивали развитие зародышей в группе 1 кювет А и Б; отдельно сравнивали развитие в группах 1 и 2 каждой из кювет. В качестве контроля сравнивали развитие в левой и правой половинах кювет.

Рис.1. Кювета с индивидуальными ячейками для каждого зародыша. Материал: кварц КУ1; изготовлена по технологии спекания. Размер одной ячейки: 2*2*3 мм; толщина стенки 1,5 мм. Размер кюветы: 10*10 ячеек.

? VI ЯВЬ? ; ЯШШЩ

Оценивали различия в следующих характеристиках:

• среднее число анимальных бластомеров (по критерию Вилкоксона-Манна-Уитни);

• распределение зародышей по числу анимальных бластомеров (по критерию Колмогорова-Смирнова);

• пространственное распределение зародышей старшей стадии, присутствующей в выборке. Его оценивали по двум показателям:

о % ячеек с зародышами старшей стадии, образующих кластеры (группы ячеек, имеющих общие стенки, т.е. группы, в пределах которых возможен прямой оптический контакт);

о средний размер кластера (число ячеек).

Эксперименты проводили в разные дни, при разной температуре и на

разных кладках, поэтому сравнение любых показателей возможно только в пределах одного эксперимента Тем не менее, по относительной разности показателей (Аотнос = (Х1—Х2)/Х1г где Х1 и X¡ — выбранные показатели для двух групп зародышей) допустимо оценить и всю совокупность экспериментов насколько достоверно Лотнос в среднем отличается от О Здесь корректно применить критерий знаков по Вилкоксону

Задача 2 Анализ излучения яйцеклеток и зародышей X.laevis

Излучение яйцеклеток и зародышей измеряли с помощью ФЭУ (диапазон чувствительности 200—800 нм, катод охлаждаемый до -25°С, режим счета фотонов [Meig et al, 1992]) в Международном институте биофизики (Нойсс, ФРГ) Запись излучения вели во времени, получая тн временной ряд, длительностью от 1 до 20 мин в разных сериях Время отдельного измерения в ходе эксперимента — период накопления сигнала — составляло

• 1 мсек (длительность эксперимента 1 мин — 60000 измерений),

• 10 мсек (длительность 5 мин — 30000 измерений),

• 100 мсек (длительность 20 мин — 12000 измерений) Рассчитывали основные свойства излучения, как математического сигнала

k = Ktx)

• среднюю интенсивность излучения (/л),

• дисперсию (ст2 = Z(lk — mf) — флуктуации интенсивности излучения,

• эмпирическую функцию плотности вероятности (р(1)) — % измерений с различной интенсивностью излучения в зависимости от этой интенсивности (гистограмму излучения),

• спектр Фурье (в варианте спектра мощности по Уэлчу с окном Хэмминга шириной в У* длины сигнала и перекрыванием окон 50%) — показатель периодических компонент в излучении

Каждый эксперимент выполняли в 7—10 повторах, для каждого повтора измеряли фон — излучение кюветы со средой с той же длительностью и временем накопления

Свойства излучения яйцеклеток и зародышей сравнивали со свойствами фона по критерию Стьюдента Различия в гистограмме и Фурье-спектре

рассчитывали отдельно по каждой полосе

Для расчета свойств излучения и статистического анализа использовали программы БТАПЭТЮА и МАНАВ, разработан оригинальный пакет программ в среде МАНАВ

Во всех случаях для отражения достоверности различий приводится уровень значимости Р «Достоверность» считается, как (1—Р)*100%

4. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

4.1. Оптическое взаимодействие зародышей Хепориэ laevis

Распределение зародышей по числу анимальных бластомеров не соответствует нормальному, поэтому для статистического сравнения выборок неприменим критерий Стьюдента Для сравнения средних использовали II-критерий Вилкоксона—Манна—Уитни, для сравнения самих распределений — критерий Колмогорова—Смирнова (он позволяет делать более серьезные выводы, но является менее мощным, те требует большего различия в выборках для того, чтобы отличить их) Применение обоих критериев корректно в условиях данного эксперимента [Ван дер Варден, 1960]

4 11 Корректность постановки эксперимента: проверка однородности выборки

% аномалий и распределение зародышей по числу анимальных бластомеров (в тч среднее) не имели достоверных различий между правой и левой половинами каждой из кювет ни в одном эксперименте В ряду экспериментов относительная разность (Аотнос) по этим показателям также не имела тенденций (табл 1)

Следовательно, при синхронном оплодотворении и идентичных условиях содержания зародышей Х/аемв использованных выборок достаточно, чтобы избежать артефактных различий в отдельном эксперименте и артефактных тенденций в группе опытов по выбранным статистическим критериям

4.1.2. Влияние оптических контактов на дробление яйцеклеток Х.1аеу!в

Количество аномалий.

По % аномалий кюветы А и Б не имели устойчивого различия в ряду экспериментов (Р = 0,313) При этом в трех опытах оно было более чем двукратно выше в матовой кювете и в шести опытах разница не превышала 2% Во всех случаях, когда различие наблюдалось, оно появлялось по ходу эксперимента в ранее не отличавшихся выборках зародышей (табл 2) То, несмотря на отсутствие достоверных различий, делать вывод о том, что количество аномалий не зависит от оптического взаимодействия дробящихся яйцеклеток, неправомочно

Табл 1. Проверка однородности скоростей дробления яйцеклеток Xlaevls в кюветах с индивидуальными ячейками для каждой яйцеклетки (зародыша) Сравнение левой и правой половин кювет Кювета А — с сохранением оптических контактов, кювета Б — с нарушением оптических контактов Относительные различия рассчитаны, как (прав —лев ) /лев Р (уровень значимости) различия среднего числа бластомеров рассчитан по критерию Вилкоксона—Манна—Уитни, Р различия распределений по стадиям развития — по критерию Колмогорова—Смирнова

Р совокупного результата рассчитан по критерию знаков по Вилкоксону

дата Т,°С время от оплодо творен ия, мин время взаимо действ ия, мин Относительные различия Р различия среднего числа анимальных бластомеров Р различия распределени й по числу анимальных бластомеров

% аномалий среднее число анимальных бластомеров

кюв А кюв Б кюв А кюв Б кюв А кюв Б кюв А кюв Б

25 05 07 23 130 70 -100% 0% 1% -6% 0,828 0,289 1,000 0,678

29 05 07 26 100 50 -67% 17% -4% -7% 0,689 0,189 0,919 0,887

29 05 07 26 140 90 -60% -33% 3% 9% 0,480 0,173 1,000 0,679

31 05 07 28 100 50 67% 0% -7% -2% 0,154 0,733 0,520 1,000

31 05 07 28 130 80 -100% -40% 8% 10% 0,398 0,153 0,572 0,768

05 06 07 23 100 50 67% 0% -1% -2% 0,943 0,965 1,000 1,000

05 06 07 23 140 90 53% -100% 0% -10% 0,442 0,284 0,996 0,914

05 06 07 23 170 120 100% -57% 8% 9% 0,099 0,219 0,286 0,625

19 09 07 22 160 110 0% 67% 2% -11% 0,950 0,108 0,950 0,231

Р совокупного результата 0,836 0,438 0,477 0,676

Табл. 2 Влияние оптических контактов на дробление яйцеклеток Х/аемв Кювета А — с сохранением оптических контактов, кювета Б — с нарушением оптических контактов

Относительные различия рассчитаны, как (кюв Б — кюв А) /кюв А Критерии для расчета Р (уровня значимости) те же

Относительные различия Р Р

дата Т,°С время от оплодо творен ия, мин время взаимо действ ия, мин % анома лий среднее число анимапь ных бластом еров % зароды шей старше й стадии % ячеек, входя щихв класте ры средни й размер кпасте ра различия среднего числа анимапь ных бластом еров различия распред елений по числу анимапь ных бластом еров

25 05 07 23 130 70 0% -15% -67% -46% -36% 0,005 0,103

29 05 07 26 100 50 0% -17% -58% -100% -100% 0,000 0,023

29 05 07 26 140 90 392% -11% -61% -72% -67% 0,096 0,139

31 05 07 28 100 50 -2% 3% -50% 0% 0% 0,293 0,558

31 05 07 28 130 80 0% -16% -70% -100% -100% 0,014 0,065

05 06 07 23 100 50 0% -9% -11% 1% -32% 0,041 0,304

05 06 07 23 140 90 133% -8% -29% 8% -23% 0,065 0,230

05 06 07 23 170 120 100% -14% -36% -11% -24% 0,031 0,022

19 09 07 22 160 110 0% -11% -17% -8% -69% 0,039 0,196

Р совокупного результата 0,313 0,008 0,004 0,047 0,008

В среднем по совокупности - -11% -44% -36% -50%

Скорость дробления.

Среднее число анимальных бластомеров (во всех опытах кроме одного) в кювете Б было на 8—17% ниже, чем в кювете А, в шести опытах это различие было достоверным (Р < 0,05), а в двух из них достоверно отличались и сами распределения (Р < 0,025)

Достоверность различия в разных опытах не коррелирует с температурой В каждом эксперименте, где не наблюдалось достоверной разницы (Р > 0,05), она появлялась или исчезала по ходу взаимодействия (см табл 2) Различие в среднем числе анимальных бластомеров между кюветами А и Б было

достоверно при всех испробованных температурах (22—28°С), но не во все время эксперимента

В ряду опытов среднее число анимальных бластомеров в кювете Б было в среднем на 11% ниже, чем в кювете А (Р = 0,008)

Во всех опытах % зародышей старшей (см табл 2) стадии в кювете Б был ниже, чем в кювете А По совокупности отличие составило в среднем 44% (Р = 0,004) При этом сама старшая стадия от опыта к опыту колебалась от 4 бластомеров до морулы

Пространственное распределение зародышей старшей стадии.

Количество (%) зародышей старшей стадии, образующих кластеры, в четырех опытах слабо различалось и в пяти опытах было на 50—100% ниже в кювете Б (табл 2) В среднем по совокупности экспериментов нарушение оптических контактов вело к снижению % зародышей старшей стадии, образующих кластеры, на 36% (Р = 0,047)

Средний размер кластера в кювете Б также был во всех случаях ниже, чем в кювете А (за исключением одного наблюдения, где количество зародышей старшей стадии было недостаточно для образования кластеров) — табл 2 В среднем эффект составил 50% (Р = 0,008)

4.1.3. Дробление с различным числом оптических контактов Нормальные оптические контакты (кювета А)

% аномалий в группах 1 (с четырьмя «соседями») и 2 (с тремя «соседями») в среднем не отличался (Р = 1) Среднее число анимальных бластомеров в большинстве экспериментов в группе 2 было ниже, чем в группе 1, но достоверно — только в одном наблюдении (Р = 0,012) По совокупности наблюдений среднее различие между группами 1 и 2 недостоверно (Р = 0,195)

Нарушенные оптические контакты (кювета Б)

Различия между группами 1 и 2 случайны и недостоверны В среднем по % аномалий Р = 0,906, по числу анимальных бластомеров Р = 1 Достоверных отличий по среднему числу анимальных бластомеров не было ни в одном эксперименте

4 1.4. Обсуждение

Сравнение дробления яйцеклеток Х/ает при нормальных и нарушенных оптических контактах между ними свидетельствует о том, что оптическое взаимодействие дробящихся яйцеклеток с более «передовыми» стимулирует ускорение дробления При этом увеличивается общее количество «передовых» яйцеклеток, количество и размер их кластеров и скорость дробления в среднем

При снижении числа нормальных (ненарушенных) оптических контактов каждого зародыша с четырех до трех прослеживается тенденция к снижению среднего числа анимальных бластомеров, но не выходящая на уровень достоверности Снижение числа нарушенных оптических контактов не влияет на развитие

Итак, решающим фактором для нарушения дистантного взаимодействия зародышей является установка между ними т н фазового оптического экрана (замена прозрачной кварцевой перегородки на матовую)

4.2. Сверхслабое излучение яйцеклеток и зародышей Хепориэ 1аеу1э

4.2 1 Корректность расчетов. Статистические характеристики фона

Характеристики (см Материалы и методы) темнового тока ФЭУ, излучения кювет со средой, яйцеклеток и зародышей имеют распределение близкое к нормальному Учитывая объем выборок (7—10 объектов), для их сравнения допустимо применить критерий Стьюдента

Уровень значимости Р, при котором различие между выборками принимали за достоверное, выбрали равным 0,005 При этом спонтанные флуктуации темнового тока ФЭУ и излучения кювет со средой не выходили на уровень достоверности

В спектре Фурье темнового тока достоверно встречающихся полос не наблюдалось Излучение кювет со средой отличалось от темнового тока по средней интенсивности, дисперсии и гистограмме и не отличалось по спектру Фурье Таким образом, при использованном объеме выборок, критерии сравнения и уровне значимости, артефактных флуктуаций фона не обнаружено

4.2.2. Излучение яйцеклеток X.laevis

Излучение неактивированных, активированных и оплодотворенных яйцеклеток измеряли в течение 1 мин (период накопления сигнала 1 мсек) Спектры Фурье рассчитывали в диапазоне 0,01—50 Гц Достоверных отличий от фона ни по одной из характеристик не обнаружено

4.2.3. Излучение зародышей X.laevis по ходу развития

По средней интенсивности, диспекрсии и гистограмме излучение зародышей не отличалось от фона (излучения кюветы со средой) По спектрам Фурье наблюдали достоверные (Р < 0,005) отличия «+» полосы — более выраженные в излучении зародыша, чем в фоне и «—» полосы — более выраженные в фоне

В диапазоне частот 0,01—50 Гц (длительность эксперимента 5 мин, период накопления сигнала 10 мсек) наблюдались следующие наборы полос (рис 2) -10 «+» полос на стадии 2, ~30 «+» полос на стадии 3, снижение их числа на стадии 4 с появлением «—» полос на стадии 5 и сохранением лишь одной «+» полосы на стадии 6 На стадии 8 (средняя бластула) количество «+» полос снова увеличивалось и постепенно снижалось до нуля к стадии 14 На стадиях 14, 20, 24 достоверных отличий излучения зародыша от фона не обнаружено

В диапазоне частот 0,1—500 Гц (длительность эксперимента 1 мин, период накопления сигнала 1 мсек) наблюдались следующие наборы полос (рис 3) 1 «+» полоса на стадии 2, набор «—» полос на стадиях 3—6, наименее выраженный на стадии 4, резкое появление обширной группы «+» полос на стадии 8 (~20), ее дальнейший рост на стадии 9 (до ~40) и полное исчезновение на стадии 11 На стадии 14 повторно возникал набор «+» полос (-20), и снова пропадал на стадии 20 На стадии 24 наблюдалось 3 «+» полосы

Рис. 2. Излучение отдельного зародыша разных стадий — фон. Статистический разностный спектр мощности по Уэлчу. Диапазон 0,01—50 Гц, период накопления сигнала 10 мсек, длительность измерений 5 мин.

Стадия развития

§ 2

1 о

2 -2 л

I-

1 2

« О

I -2

с пз о.

Ф 2 О л

I IX !!.„!„ .X. к 1.{1 1 1:..... 1 1 ■ . 1- 1 ! 1 1

1п III11 и: 1 1 ! 1 Е ЙИИЙЙ ж I 1 1 1 1

I I !-- 1I

\ 1 1 ! 1

1111 ! г !

- г 51 -■ 1 ? 1 1 ^

I 1 '| 1 1 1111 1 1 1 I

I II 7Х31 I 1 1 II I И 3

I- I 1 'Г'" 1... 1 1 1

111

! ! 1 I г

1 1 1 1 1 I 1

: 1 1111

1 1 1 1 1 ! 1

I ] 1 ! | ] ! ] 1 1 1 1

1 1

1 ! ! ! !

! ¡111

ЩШШ

11 ГО-

20 £

5 10 15 20 25 30 35 Частота, Гц

45 50

Рис. 3. Излучение отдельного зародыша разных стадий — фон. Статистический разностный спектр мощности по Уэлчу. Диапазон 0,1—500 Гц, период накопления сигнала 1 мсек, длительность измерений 1 мин.

Стадия развития 2

2г 0 -2

2 О -2

§ 2 I о

5 .2

1 2 « О

! -2 с го о.

1 1 1 1 || 1

1111111

------ I 1 1 1 I I 1 1 I I с I I Т I I 1 I А 1 А......

1 '!"!!'! ! !

! ! 1111111

------ 1 1111111 I Г ^------ 1« -гГ 1 1 1 1 1 1

III ------- 1111111

II I 12 ШП г I И I ,1 п ! . 1 ,1 1 1 ! 1

<Е1ЗЕ I I I Ь 1й ГЙМЙ ¡1 ш * 1 1 1......-... 1 -. 1 1 1

1 1 1111111 1 1 1 1 1 1 1

II 1 Ш I II III I ¡11111!

1 !!'!!!"!

1 1 ! 1 ! 1 1 !

1 1 Г |! !

1 ! ! ! ' 1

штш

и Го

О 50

150 200 250 3£ Частота, Гц

450 500

4.2 4 Излучение зародышей X.laevis при оптическом контакте

Перед катодом ФЭУ располагали две одинаковые прозрачные кварцевые (КУ1) кюветы с 10% MMR Горизонтальные размеры кювет (2*10 мм) позволяли разместить на дне каждой из них ряд из 5 зародышей

Стадия 6 Кюветы ставили узкой стороной к катоду и широкими сторонами друг к другу Измеряли излучение от десяти зародышей стадии 6 (ранняя бластула), расположенных по пять на дне обеих кювет Кюветы разгораживали экраном из черной бумаги Измеряли излучение

1 до взаимодействия,

2 во время взаимодействия (экран удален, но оставлен в камере люминометра),

3 после взаимодействия (экран повторно установлен между кюветами)

Период накопления сигнала — 1 мсек, длительность всего эксперимента — 1 мин (60000 измерений) 10 повторов

Излучение (3) не отличалось от (2) и от фона (излучения кювет со средой) ни по одной из характеристик (Фурье-спектр не рассчитывали) Средняя интенсивность излучения (3) была достоверно ниже, чем (2) на ~8% (1,5*10 3 квант /1 мсек) (Р < 0,02)

Стадия 19 Одну из кювет (кювета 1) ставили непосредственно перед катодом, другую (кювета 2) — за ней Измеряли излучение от

1 5 зародышей стадии 19 (стадия хвостовой почки), расположенных в ряд на дне кюветы 1,

2 10 зародышей той же стадии, расположенных по 5 на дне обеих кювет

Период накопления сигнала — 100 мсек, длительность всего эксперимента — 20 мин (12000 измерений) 11 повторов

Излучение (1) не отличалось от фона ни по одной из характеристик (Фурье-спектр не рассчитывали) Средняя интенсивность излучения (2) была достоверно ниже, чем (1) на -5% (0,07 квант /100 мсек) (Р < 0,02)

4.2.5 Обсуждение

Итак, статистические спектры Фурье излучения отдельного зародыша обладают стадие-специфичностью Состояние проблемы не позволяет

перейти к их интерпретации в связи с молекулярно-биологическими или морфогенетическими процессами К настоящему времени можно отметить лишь следующие совпадения

• в период максимальной синхронности дробления (стадии 2—4) наблюдаются «+» спектральные полосы в диапазоне 0,01—50 Гц (за время измерения 5 мин),

• на стадиях 8—9 внезапно появляются наборы «+» полос в обоих диапазонах, особенно в диапазоне 0,1—500 Гц (за время измерения 1 мин) По стадии развития это совпадает с активацией генома зародыша (mid-blastula transition)

Во всех случаях в наборах частот нет внутренней кратности Изменение длительности эксперимента ведет к изменению всего набора спектральных полос, что говорит об апериодичности излучения Превышение излучения зародыша над фоном (излучением кюветы со средой) или фона над излучением зародыша по спектральной мощности на группах частот не коррелирует с различием по средней интенсивности исходного сигнала и связано исключительно с его временной структурой В отношении оптического взаимодействия это соответствует утверждению С Л Загускина о чувствительности биосистем (см Актуальность проблемы)

Оптическое взаимодействие зародышей наблюдается и на стадиях, более поздних, чем дробление (по крайней мере на стадиях 6 и 19) и проявляется в снижении суммарной интенсивности излучения сразу после взаимодействия длительностью 1 мин (стадия 6) или во время взаимодействия длительностью 20 мин (стадия 19) Описанное явление подпадает под определение субрадиации, однако оснований для утверждения ее квантовой природы недостаточно

5. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В настоящей работе показано оптическое взаимодействие зародышей шпорцевой лягушки (Xenopus laevis Daudm) по крайней мере в период дробления и по крайней мере в отсутствие третичных оболочек Это взаимодействие «проходит» через прозрачный кварц КУ1 и приграничные слои воды на расстояние не менее 2 мм (толщина водного слоя не менее 0,5 мм) Взаимодействие проявляется в стимуляции «передовыми» яйцеклетками

отстающих «соседей»

Естественно возникает вопрос о механизмах оптического взаимодействия Первые шаги к его разрешению состоят в измерении излучения от зародышей и анализе его свойств Этой проблеме посвящена вторая часть работы Показано, что хотя по средней интенсивности излучение зародышей не отличается от фона, оно обладает особой стадие-специфичной временной структурой, связанной с апериодическими процессами, но с характерным для выбранной длительности опыта набором полос в Фурье-спектрах

Из изложенного следует еще один вопрос влияет ли оптическое взаимодействие биологических объектов на их сверхслабое излучение7 В настоящей работе на новом объекте подтверждены результаты Л В Белоусова на зародышах костистых рыб оптическое взаимодействие зародышей ведет к снижению суммарной интенсивности их излучения Это нетривиальное явление, названное ранее субрадиацией, может служить дополнительным инструментом для решения проблемы механизмов дистантного взаимодействия

6. ВЫВОДЫ

1 Показано оптическое взаимодействие дробящихся яйцеклеток Хепорив /ает, проявляющееся в стимуляции «передовыми» яйцеклетками отстающих «соседей»,

2 Показано оптическое взаимодействие групп зародышей на стадиях 6 и 19, проявляющееся в явлении субрадиации (снижения суммарной интенсивности излучения при взаимодействии),

3 Измерено излучение зародышей Хепориз laevls на стадиях 2—24, приведены его стадие-специфичные разностные (с фоном) спектры Фурье при равенстве фону по средней интенсивности,

4 Показано, что на стадиях 2—4 излучение зародыша выше фона по спектральной мощности на группе частот в диапазоне 0,01—50 Гц на временах <5 мин и ниже в диапазоне 0,1—500 Гц на временах <1 мин,

5 Показано резкое появление в излучении зародыша на стадиях 8—9 групп спектральных полос, превышающих фон, совпадающее по стадии с активацией собственного генома зародыша, и постепенное их исчезновение на более поздних стадиях (11—24),

6 Предложена и успешно применена конструкция кювет для постановки экспериментов по оптическому взаимодействию индивидуальных зародышей,

7 Разработано и успешно применено программное обеспечение для анализа сверхслабого излучения

7. СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ

[1] Volodyaev I Bridging the gap between physics and biology Rivista di Biología / Biology Forum, Vol 98 №2, Pp 237-264 ÍZOCO¿j

[2] Володяев И , Браже А, Белоусов Л В Мультифрактальный анализ сверхслабого излучения зародышей вьюна Труды III международной конференции «Электромагнитные поля и излучения в биологии», стр 277-278 05-07 10 2005, Калуга АП «Полиграфия»

[3] Володяев И, Белоусов Л В Некоторые закономерности в сверхслабом излучении зародышей Xenopus laevis Труды IV международного конгресса «Слабые и сверхслабые поля и излучения в биологии и медицине», стр 88 03-07 07 2006, СПб

[4] Белоусов Л В , Володяев И В Некоторые свойства сверхслабых излучений (ССИ) яйцеклеток, зародышей и клеточных культур Сборник избранных трудов IV международного конгресса «Слабые и сверхслабые поля и излучения в биологии и медицине», стр 27-33 (Zoo6

[5] Володяев И В, Белоусов Л В Сверхслабые излучения развивающихся яйцеклеток и зародышей шпорцевой лягушки Онтогенез, т38 №5, стр 386-393 (ZooJ)

[6] Володяев И В, Белоусов Л В Оптическое взаимодействие и сверхслабое излучение зародышей шпорцевой лягушки Сборник трудов VII международной крымской конференции «Космос и биосфера», стр 158-159 01-06 10 2007, Судак, Крым

Заказ № 185/11/07 Подписано в печать 12 11 2007 Тираж 150экз Уел пл 1,5

ООО "Цифровичок", тел (495) 797-75-76, (495) 778-22-20 www cfr ru, e-mail info@cfr ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Володяев, Илья Владимирович

2 ИСПОЛЬЗОВАННЫЕ СОКРАЩЕНИЯ.

3 ВВЕДЕНИЕ.

4 ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР.

4.1 Дистантные нехимические взаимодействия.

4.1.1 Митогенетический эффект Гурвича.

Понятие митогенетического эффекта.

Физические свойства митогенетического взаимодействия.

4.1.2 Эффект Магру.

4.1.3 Дистантное взаимодействие бактериальных культур.

В нормальных условиях.

В стрессовых условиях.

4.1.4 Дистантное взаимодействие культур клеток и тканей.

В нормальных условиях.

В стрессовых условиях.

4.1.5 Дистантное взаимодействие яйцеклеток и зародышей.

4.2 Сверхслабое излучение биологических объектов.

4.2.1 Митогенетическое излучение.

4.2.2 Хемилюминесценция биологических объектов.

4.2.3 Свидетельства сигнальной роли сверхслабого излучения.

4.2.4 Свойства сверхслабого излучения яйцеклеток и зародышей.

4.3 Состояние проблемы и перспективы.

5 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

5.1 Объект.

5.2 Получение и содержание эмбрионального материала.

5.3 Постановка эксперимента.

5.3.1 Задача 1. Исследование оптического взаимодействия дробящихся яйцеклеток X.laevis.

5.3.2 Задача 2. Анализ излучения яйцеклеток и зародышей X.laevis.

6 РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

6.1 Оптическое взаимодействие зародышей Xenopuslaevis.

6.1.1 Выбор статистического критерия.

6.1.2 Корректность постановки эксперимента: проверка однородности выборки б. 1.3 Влияние оптических контактов на дробление яйцеклеток X.laevis.

Количество аномалий.

Скорость дробления.

Пространственное распределение зародышей старшей стадии.

6.1.4 Влияние числа оптических контактов на дробление яйцеклеток X.laevis

Нормальные оптические контакты (кювета А).

Нарушенные оптические контакты (кювета Б).

6.1.5 Обсуждение.

6.2 Сверхслабое излучение яйцеклеток и зародышей Xenopus laevis.

6.2.1 Выбор статистического критерия.

6.2.2 Корректность расчетов. Статистические характеристики фона.

Темновой ток ФЭУ.

Излучение кюветы со средой.

6.2.3 Излучение яйцеклеток X.laevis.

6.2.4 Излучение зародышей X.laevis по ходу развития.

6.2.5 Излучение зародышей X.laevis при оптическом контакте.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Сверхслабое излучение и оптическое взаимодействие яйцеклеток и зародышей шпорцевой лягушки"

Проблемы оптического взаимодействия биологических объектов и их сверхслабого электромагнитного излучения в сущности глубоко связаны, хотя и далеко разошлись в последние тридцать лет.

Дистанционное нехимическое взаимодействие биологических объектов впервые исследовали А.Г.Гурвич, его ученики и современники; затем многие другие авторы. Проблема содержит немало сложностей. Не все эффекты воспроизводимы, большинство из них зависит от множества различных факторов; не всегда ясна интерпретация условий наблюдения эффекта. Так, эффект Магру (см. Литературный обзор, стр.) пропадал перед грозой; эффект взаимодействия бактериальных культур В.П.Казначеева наблюдался только при вращении взаимодействующих объектов (Литературный обзор, стр. 19).

Тем не менее, эффекты дистанционного нехимического взаимодействия показаны, воспроизведены и детально исследованы в работах многих авторов. Только ми-тогенетический эффект Гурвича, и только в 1920-е — 1940-е гг, исследовало более ста ученых в различных странах мира. Опубликовано более 500 работ на русском, немецком, французском, итальянском и английском языках.

Однако не исследованным остается вопрос о механизмах нехимических дистанционных взаимодействий. В большинстве работ показана их связь с электромагнитным излучением; некоторые авторы настаивают на первостепенной роли акустических колебаний (M.Matsuhashi, допускает их значимость Ю.Николаев). По совокупности большинство эффектов дистанционного взаимодействия зависит от оптических свойств среды, разделяющей объекты, т.е., по-видимому, передается с помощью очень слабого свечения.

По сверхслабому излучению биологических объектов первые работы появились еще в 1930-е гг — с целью исследовать природу дистанционного взаимодействия. Однако наибольший размах это направление получило после появления фотоэлектронных умножителей, и в первую очередь, в работах школы Б.Н.Тарусова. Интенсивные исследования сверхслабого свечения выделили эту проблему в самостоятельную бурно развивающуюся область. В настоящее время общепризнано, что большинство биологических объектов и многие модельные системы являются источниками сверхслабого излучения в видимой области спектра. Это излучение связано со свободно-радикальными процессами, в первую очередь, с участием активных форм кислорода (АФК). Излучение существует в норме, активируется в стрессовых условиях и отражает, в частности, важную регуляторную роль АФК ([18] и др.).

Вместе с тем, новые знания поставили новые проблемы. Интенсивность такого свечения в большинстве случаев не превышает 1000 квант/сек с 1 см2 поверхности. При этом ряд оптических взаимодействий наблюдается при дневном свете. Как может клетка, ткань или организм «чувствовать» столь слабый сигнал? В чем особенности, столь резко отличающие его от фона? В настоящее время эти вопросы — предмет острых дискуссий. Ряд авторов [9, 112—115] предполагает, что свечение биологических объектов (то, которое осуществляет дистанционные взаимодействия) высоко когерентно; другие [21,1, 2] утверждают его особую динамику во времени. В работах по митогенетическому эффекту показаны его особые спектральные характеристики [21,45, 53]. В любом случае неизвестны механизмы рецепции этих сигналов. И хотя различные авторы высказывают предположения об участии в этом процессе коллективных мембранных осцилляций (А.В. Будаговский), когерентных водных доменов (В.Л. Воейков, Е. Del Guidice) или особых УФ-чувствительных химических реакций [21], проблема остается на стадии дискуссий.

Таким образом, при накопленном объеме данных, исследования дистанционного взаимодействия в биологии необходимо привязать к исследованию сверхслабого свечения, свободно-радикальных процессов, а в будущем — к известным молекуляр-но-генетическим и морфогенетическим процессам. Особенно плодотворными подобные исследования должны стать применительно к индивидуальному развитию организма — благодаря многообразию и динамичности процессов в ходе развития и множеству возможных корреляций между ними.

Настоящая работа состоит из двух частей. Задачей первой части явилось определение роли оптических контактов для раннего развития зародышей шпорцевой лягушки, задачей второй части — определение статистических особенностей излучения этих зародышей. Во второй же части приведены результаты по изменению сверхслабого излучения при оптическом взаимодействии зародышей некоторых стадий.

4 Литературный обзор4.1 Дистантные нехимические взаимодействия4.1.1 Митогенетический эффект ГурвичаПонятие митогенетического эффектаПонятие о дистанционном нехимическом взаимодействии биологических объектов появилось в 1923 году вместе с первыми работами А.Г.Гурвича по т.н. митогенетиче-скому эффекту [90].

Определение: Митогенетический эффект (МГЭ) («основной митогенетический эффект» в терминологии А.Г.Гурвича [21]) состоит в изменении режима клеточных циклов в биологическом объекте при оптическом контакте с рядом биологических или химических систем.

Определение: Детектором митегентического эффекта назовем, вслед за А.Г.Гурвичем [21], биологический объект, в котором наблюдается митогенетический эффект.

Определение: Индуктором митогенетического эффекта [21] назовем объект, вызывающий митогенетический эффект в детекторе.

Детекторами МГЭ могут быть культуры микроорганизмов, ткани растительного или животного происхождения [31, 21, 119, 22, 19]. Общие качества всех детекторов: спонтанное (вне всяких воздействий) протекание клеточного деления и «более или менее значительный клеточный комплекс, притом в достаточно близком соседстве клеток друг с другом» ([21], стр. 332).

Индукторами МГЭ являются:• реакции электролитической диссоциации [21, 22],• большинство биологических объектов в стрессовых условиях [21, 22].

Последнее относится к явлению т.н. «деградационного МГЭ». В обширной серии исследований (см. [21, 22, 19]) показано, что в условиях обратимых стрессовых воздействий различные биологические объекты (культуры микроорганизмов, клеток, ткани и органы многоклеточных животных) индуцируют сильный МГЭ в детекторах. К таким воздействиям относятся:• охлаждение,• нагревание,• пропускание слабого электрического тока,• механическое воздействие,• помещение объекта в гипо- или гипертонические условия,Авторы особо подчеркивают, что эти воздействия должны быть обратимы (неразрушительны). Тем не менее, немедленная повторная стимуляция деградационного МГЭ от того же индуктора невозможна.

МГЭ зависит от состояния детектора, от индуктора и «режима» их взаимодействия и может проявляться как в ускорении, так и в замедлении клеточных циклов. Необходимое условие ускорения клеточных циклов — «неоптимальные» условия для размножения детектора, т.е. условия, при которых скорость спонтанного деления ниже, чем максимально возможная в нормальных физиологических условиях [21]. Замедление клеточных циклов может наблюдаться как при «оптимальных» условиях для размножения детектора, так и в специально созданных условиях его «гиперчувствительности» [21, 22]. Исследования МГЭ, кроме специальных случаев, проводили на детекторах, способных к ускорению клеточных циклов. При этом ускорение клеточных циклов проявлялось, как основной МГЭ, а замедление — как его угнетение при чрезмерной длительности или силе индукционного воздействия.

Основными в использовании были жидкие культуры дрожжей и бактерий в логарифмической фазе роста и однородные агаровые культуры дрожжей в фазе 20—30 клеточных слоев.

Величина и направленность МГЭ при выбранном детекторе зависит от многихфакторов (см. обзоры [21, 31]):1. Индуктор. При прочих равных условиях величина и направленность МГЭ сильно зависит от индуктора. Наиболее активные индукторы — злокачественные опухоли; также активны некоторые химические реакции, мышцы в состоянии тетануса, нервные волокна в состоянии раздражения, кровь некоторых здоровых животных и человека.

2. Расстояние. Величина МГЭ падает с увеличением расстояния между индуктором и детектором. Существует максимальное расстояние, при котором эффект еще наблюдается — «пространственный порог МГЭ». Для большинства индукторов (при стандартных детекторах) он составляет 1—5 см.

3. Длительность. Существует минимальное время взаимодействия, необходимое для получения эффекта — «временной порог МГЭ». При стандартных детекторах (и расстоянии индуктор—детектор 5 мм) временной порог МГЭ для разных индукторов составляет от 1 сек до 30 мин. Незначительное превышение порога длительности приводит к стимуляции деления. Дальнейшее увеличение времени взаимодействия для ряда индукторов не влияет на величину эффекта (наприм., musculus sartoriusлягушки в состоянии тетануса), для других ведет к его нарастанию с различной скоростью. Во всех случаях МГЭ имеет фазу «насыщения» при определенной длительности взаимодействия, а для ряда индукторов дальнейшее ее увеличение приводит к снижению МГЭ или смене ускорения клеточных циклов на замедление.

4. «Режим» начала взаимодействия. В [31, 21] описаны эксперименты с постепенным сближением индуктора и детектора МГЭ от расстояния выше порогового до стандартного (5 мм). При медленном сближении (0,5—1 см/мин) взаимодействие не дает МГЭ; сближение с большей скоростью (2 см/мин) приводит к МГЭ той же величины, что и «обычное» взаимодействие той же длительности. Быстрое сближение индуктора и детектора (б0 см/сек) напротив приводит к МГЭ при времени взаимодействия значительно ниже порогового (200—250 мсек).

5. «Режим» взаимодействия. В обширной серии экспериментов [21] взаимодействие индуктора и детектора МГЭ периодически прерывали с помощью вращающихся дисков с секторальными вырезами. Показано, что величинаМГЭ, временной и пространственный порог существенно зависят от частоты вращения, размера вырезов, их числа и взаимоположения. При правильном подборе этих параметров удавалось усилить МГЭ, многократно снизить временной порог (до 50 раз) и повысить пространственный порог (до 5—10 раз (10—30 см)). С другой стороны, апериодическое расположение вырезов или слишком малое расстояние между ними (зависящее от частоты вращения диска) давали МО существенно ниже, чем при оптимальном подборе параметров. Диски с вырезами слишком малого размера (зависящего от индуктора и частоты вращения диска) убирали МГЭ.

6. Освещение. Кроме того, показана зависимость МГЭ от освещения индуктора. Освещение видимым светом многократно усиливает МГЭ, ИК — подавляет.

Физические свойства митогенетического взаимодействияЭксперименты по выяснению физической природы носителя МГЭ делятся на несколько логических этапов.

1. Проверка участия химических веществВпервые нехимическая природа МГЭ показана уже в первых работах [91, 92, 79], затем подтверждена в ряде других лабораторий (см. [21]).

Итак,о МГЭ сохраняется без изменений при разделении индуктора и детектора кварцевой пластинкой (см., наприм., [91]).о МГЭ сохраняется при помещении индуктора в герметичную камеру (М.А.Барон и Зусманович, Л.Я.Бляхер, Г.М.Франк и др., цит. по [21]).

2. Проверка физических свойствФизические свойства МГЭ проверяли разделением индуктора и детектора пластинками из различных материалов ([91] и др.), использованием зеркал для «отражения» МГЭ (А.Г.Гурвич, В.В.Зиберт, Т.Рейтер и Д.Габор, цит. по [21]) и «биологическим спектральным анализом» ([124, 53] и др., см. [21]).

МГЭ сохраняется при разделении индуктора и детектора кварцевой пластинкой [90, 91] и исчезает при разделении пластинками из стекла, слюды илиинепрозрачных веществ [91, 79].

Носитель МГЭ взаимодействует с плоскими зеркалами в соответствии с законами геометрической оптики (А.Г.Гурвич, Т.Рейтер и Д.Габор, цит. по [21]), но область наблюдения МГЭ в детекторе оказывается шире, чем без отражения (при соответствии расстояний индуктор—детектор) [21].

Митогенетическое взаимодействие наблюдается и в экспериментах по «биологическому спектральному анализу» ([79, 21], см. далее). Использовали два варианта установки:о кварцевый спектрограф с набором детекторов МГЭ (обычно кюветы с дрожжевыми культурами) на месте фотопластинки;о монохроматор, прозрачный в видимой и ультрафиолетовой области, с детектором МГЭ за выходной щелью.

В обоих случаях МГЭ наблюдается в определенных «спектральных областях», соответствующих длине волны проходящего света от 190 до 250 нм. Получаемый набор областей наблюдения МГЭ характерен для каждого индуктора, что позволяет ввести понятие «спектра МГЭ».

На основании этих результатов А.Г.Гурвич, Г.М.Франк и др. сделали вывод, что носителем МГЭ является электромагнитное излучение ультрафиолетовой (УФ) спектральной области.

В работах ряда лабораторий 1930—1950 гг. получены спектры МГЭ для многих индукторов. Показано (см. [21, 19]), что по спектру МГЭ можно определить ряд идущих в системе химических реакций и обнаружить присутствующие в системе «радикалы» химических веществ (термин из [19]). По мнению авторов ([21, 19] и др.), накопленные данные по свойствам митогенетических спектров позволяют анализировать химический состав экспериментальной системы и протекающие в ней процессы на основе данных по ее спектру МГЭ.

3. Физическая регистрацияУтверждение о том, что носитель МГЭ — электромагнитное излучение, привело к постановке ряда экспериментов по его физической регистрации ([127, 120, 54], см. также [21,19]).

Использовано три типа детекторов:о фотографическая пластинка;о фотоэлектрические газоразрядные системы с использованием фотоэлемента как счетчика типа фотореле;о фотоэлектронные умножители (ФЭУ).

Использование фотографических пластинок не дало положительных результатов. Несколько сообщений об удаче (Т.Рейтер и Д.Габор, цит. по [31]) не подтвердилось; другие [116, 74] отклонены, как не относящиеся к МГЭ (см. [54, 21]).

Фотоэлектрические газоразрядные системы использованы в работах Раевского [120, 121, 122], Фридриха и Шрейбера [127], Франка [54], Зиберта и Зефферта [129, 130], Барта [68, 69], Кроста (цит. по [19, 21]), Пейкерта и Гре-бе (цит. по [19]), Одюбера [45] и др. Чувствительность системы регистрации достигала: 103 квант/сек (1,8х103 при длине волны падающего света 266 нм и ЗДхЮ3 при 366 нм) в [127], 100 квант/сек (при длине волны 253,7 нм) в [54] и 12 квант/секхсм2 (при длине волны 265 нм) в [122].

В [120, 121, 122] использован кадмиевый фотоэлемент, чувствительный в УФ и видимом диапазоне спектра; объект и счетчик расположены в полной темноте. Зарегистрировано электромагнитное излучение от корня лука, кашицы из лука, кашицы из карциномы мыши. Интенсивность излучения оценена в 100—200 квант/сек.

В [54] использован алюминиевый фотоэлемент, чувствительный в УФ диапазоне спектра и слабо чувствительный к видимому свету. В ряде экспериментов счетчик помещен за выходной щелью монохроматора, пропускающей излучение в диапазоне 200—270 нм; объект освещен рассеянным видимым светом. Показано излучение от работающей мышцы, кашицы из мышцы, изолированного сердца и ряда окислительно-восстановительных реакций, ранее проверенных на митогенетическую активность в лаборатории А.Е.Браунштейна [8]. Интенсивность излучения оценена в 1000 квант/сек.

Оценка интенсивности излучения в [54] в 5—10 раз выше, чем в [122], может быть связана как с использованием разных объектов, так и с различием условий. В работах ряда авторов (цит. по [21]) показано, что митогенетичеекая активность большей части индукторов МГЭ при рассеянном видимом свете существенно выше, чем в темноте.

В [127] использован калиевый фотоэлемент. Не обнаружено излучение от дрожжевой культуры в полной темноте. Однако, в работах А.П.Потоцкой (1930, 1932, цит. по [21]) показано исчезновение в темноте и МГЭ, вызываемого дрожжевой культурой. Кроме того, согласно оценкам [122] и [54], интенсивность излучения от индукторов МГЭ не превышает 103 квант/сек, что ниже пороговой чувствительности счетчика [127].

В [68, 69] подтверждены результаты [54] и зарегистрировано излучение от «реакции переваривания белка».

В [129, 130] показано излучение от различных индукторов МГЭ: крови, мочи и др. (более 500 экспериментов).

В [45] подтверждено излучение от ряда химических реакций, нерва в состоянии возбуждения и дробящихся яиц амфибий. По словам С.И.Вавилова: «Результаты. исследований Одюбера. позволяют нам считать, что эмиссия ультрафиолета как при многочисленных химических реакциях, так и при биологических процессах окончательно установлена обычными физическими методами. Длины волн, установленные Одюбером, принадлежат к той же спектральной области, к которой относятся и спектры, определенные в лаборатории Гурвича.» (Выступление на конференции Фарадеевского общества, 1938 г.; цит. по [22]).

Позже, благодаря использованию счетчиков с золотыми и платиновыми катодами, зарегистрировано сверхслабое УФ излучение от культур тканей и крови [71], дрожжевой культуры, сокращающегося сердца и раздробленной мышцы лягушки (Н.А.Троицкий с соавт., 1961, цит. по [19]) и др. В дальнейшем ряд результатов, полученных с помощью газоразрядных фотоэлектрических установок, подтверждены и разработаны на ФЭУ [19].

4. Моделирование эффекта физическими источникамиВ исследованиях [55] показано, что УФ излучение от физических источников также вызывает ускорение клеточных циклов в дрожжевой культуре. Источники монохроматического излучения (отдельные спектральные линии отискровых разрядов алюминия, цинка, кадмия и ртутной лампы) дают устойчивый эффект в спектральном диапазоне 205—265 нм при интенсивности 107— 109 квант/секхсм2. Случайная комбинация спектральных линий в области 205— 215 нм дает тот же эффект при интенсивности излучения 106 квант/секхсм2. Авторы считают, что более точный подбор спектральных характеристик и использование импульсного режима облучения могут снизить необходимую интенсивность излучения от физических источников до величин близких к биологическим.

4.1.2 Эффект МагруВ отличие от собственно МГЭ, при котором взаимодействие с объектом-индуктором влияло на продолжительность циклов клеток (или микроорганизмов) в детекторе без видимых аномалий, эффект Магру (название предложении А.Г.Гурвичем — см. [21]) связан с появлением выраженных уродств. В исследованиях [100—102] яйца морского ежа оплодотворяли спермой после ее оптического контакта с бактериальной культурой Bacillus tumefaciens. Показаны массовые аномалии в развитии полученных личинок. Длительное взаимодействие дробящихся яйцеклеток с аналогичной бактериальной культурой приводит к еще более выраженным аномалиям с заполнением всей полости тела личинки мезенхмальными клетками.

Эффект наблюдается при разделении объектов пластинками из кварца и исчезает при их разделении пластинками из стекла. При этом авторы склоняются к электрической природе эффекта; А.Г.Гурвич оспаривает их точку зрения [21, 22], ситая эффект связным со сверхслабым излучением.

В работах других авторов показано, что актериальная культура — индуктор эффекта Магру — являлась также индуктором МГЭ (см. [21]). Кроме того, ее кратковременный оптический контакт с оплодотворенными яйцеклетками морского ежа приводил к ускорению их дробления без видимых аномалий ([104, 105], Кастальди и Цирполо, цит. по [31, 22]). Вероятно, этот эффект также связан с МГЭ.

4.1.3 Дистантное взаимодействие бактериальных культурВ нормальных условияхЧувствительность бактериальных культур к дистантным нехимическим воздействиям активно исследовали в связи с МГЭ [21]. Показано ускорение роста суспензионной культуры Bacillus mesentericus при оптическом контакте с культурой дрожжей Nadsonia [128], удлинение клеток Escherichia coii и Lactobacillus bulgaricus при оптическом контакте с различными индукторами МГЭ (Христиансен, 1929, цит. по [21]). В обширной серии работ И.К.Вольф и Г.Расс исследовали влияние различных индукторов МГЭ на рост суспензионной культуры Staphylococcus aureus, укорочение лаг периода, ускорение роста и последующий эффект утомления (преждевременное замедление роста культуры) [140]. Аналогичные результаты на иных бактериальных культурах получены в работах Франка, Ача [56], Ломинского, Маркони, Иоффе и Биллиг (цит. по [21, 22]). Широкомасштабное исследование проведено в лаборатории О.Рана (обзор: [119]).

Во всех случаях авторы подчеркивают «капризность» эффекта: необходимость точного соблюдения набора условий для его наблюдения. Показано, что МГЭ в бактериальных культурах наблюдается только в лаг-периоде, начале фазы экспоненциального роста или в фазе насыщения ([119, 22, 19], см. ранее стр. 7—10). Доказана различная чувствительность разных видов бактерий к индукторам МГЭ (Иоффе и Биллиг, цит. по [22]). Известна сложная зависимость величины эффекта от длительности взаимодействия и его «режима» ([21], см. ранее стр. 7—10). Известно также, что облучение внешним УФ или ИК светом подавляет эффект, при чем УФ — уже при ничтожных дозах. Для уверенного наблюдения МГЭ необходимо полное экранирование детектора от внешнего УФ.

В работах [97, 140, 141], вопреки многократно опубликованной методике (см. обзоры [31, 21, 119]), МГЭ исследовался на бактериальных культурах в линейной фазе роста. При этом авторы использовали виды с неисследованной чувствительностью к индукторам МГЭ без предварительного подбора длительности взаимодействия. Ряд крупных ошибок авторов детально обсуждается в [30, 22] и др.

Исследование бактериальных культур в качестве индукторов дистантного взаимодействия также относится преимущественно к 1925—1955 гг. В обширной серии работ показан МГЭ от различных культур [65, 66, 119, 22]. Известно влияние оптического контакта спермы, яиц и личинок иглокожих с культурой бактерий на скорость их нормального развития и аномалии (см. ранее стр. 14).

Возобновление интереса к дистантному взаимодействию бактериальных культуротносится к 1990-м гг. Обнаружено дистантное взаимодействие культур Vibrio costi-coia [43]; культуры Pseudomonas corrugata с культурой гриба Gaeumannomyces graminis [139] и др. Показано дистантное взаимодействие культур Rhodospirillum ги-brum [61].

М.Трушин [134] исследовал оптическое взаимодействие культур Escherichia coii. Показано, что оптический контакт двух химически изолированных культур приводит к снижению времени удвоения (повышению скорости роста). Эффект наблюдается при их разделении стеклянной пластинкой, прозрачной в области 320—900 нм (и далее в ИК области), и отсутствует при разделении аналогичной пластинкой из матового стекла. Автор делает вывод, что взаимодействие не связано с акустическими волнами (т.к. оно не наблюдается при разделении культур матовой перегородкой) или УФ излучением.

В стрессовых условияхПервые данные о нехимическом влиянии биологических объектов в стрессовых условиях на иные биологические объекты (в частности культуры бактерий) связаны с исследованием деградационного МГЭ (см. ранее).

В дальнейшем работы по этой проблеме стали появляться в 1990-е гг.

М.Матсухаши с соавт. (цит. по [108]) исследовали дистантное взаимодействие культуры Bacillus carboniphillus с такой же культурой под действием стрессовых факторов (повышения температуры или концентрации солей). Показано ускорение прорастания спор и повышение чувствительности к антибиотикам в культуре-детекторе. Взаимодействие сохранялось при разделении культур пластиковым, стеклянным или металлическим экраном. Авторы приходят к выводу, что взаимодействие должно быть связано с акустическими волнами.

В серии работ Ю.Николаев исследовал реакцию культуры Pseudomonas fluorescens на ее разведение в свежей культуральной среде при оптическом и химическом контакте с другой культурой того же вида [108]. Автор рассматривает процесс разведения инокулята, как стрессовый для культуры и подтверждают это изменением кривой роста и наблюдением за выделением клетками химических факторов. Разведение суспензионной культуры в свежей среде вызывало массовую адгезию клеток на стенках сосуда за счет высокомолекулярного вещества адгезина и резкое снижениеплотности суспензии. Далее плотность суспензии повышалась (быстрее, чем экспоненциально) за счет выделения низкомолекулярного вещества, препятствующего адгезии («антиадгезина» в терминологии [108]) и выхода клеток с поверхности сосуда в суспензию. Дальнейший рост культуры шел по обычной S-образной кривой.

Химический контакт с другой культурой в фазе экспоненциального роста осуществлялся через воздух за счет пассивной диффузии или с использованием специального насоса. Показано снижение адгезии клеток к стенке сосуда на 10—30%. Оптический контакт с аналогичной культурой при химической изоляции снижает адгезию на 30—50%; оптический контакт без химической изоляции — в девять раз. Ни в одном случае влияние на дальнейший ход кривой роста не обнаружено. Автор указывает, что нехимическое взаимодействие наблюдается при разделении культур стеклянной перегородкой, непрозрачной для УФ, и может быть связано с излучением видимого, ИК диапазона или акустическими эффектами.

В работе обсуждается биологическая значимость начального колебания в кривой роста для адаптации клеток к новой среде обитания. При этом химические и нехимические сигналы, и особенно их взаимное усиление, рассматриваются, как важный фактор в регуляции этих адаптационных процессов.

4.1.4 Дистантное взаимодействие культур клеток и тканейВ нормальных условияхВ исследованиях школы А.Г.Гурвича и его современников большое внимание уделялось чувствительности различных тканей к МГЭ и их способности индуцировать МГЭ в других детекторах. Широко используемыми детекторами МГЭ были: меристема зоны деления корня лука [90, 91,124] и роговица глаза лягушки или крысы [97, 107].

Индукторами МГЭ являются ткани животных с активно идущим делением клеток [31, 21]:• некоторые эмбриональные ткани;• органы кроветворения взрослого животного;• рана в процессе заживления;• злокачественные опухоли [23, 45].

Активными индукторами МГЭ являются также:• зона разжижжения желтка куриного яйца;• кровь здорового человека или животного (МГЭ от крови пропадает при злокачественных заболеваниях);• гемолимфа беспозвоночных (показано для краба и мидии);• мышца при сокращении (показано для седалищной мышцы Rana temporaria, гладких мышц голотурии);• нерв при стимуляции.

В остальном ткани и органы взрослого животного не способны к индукции МО.

В растениях индукторами МГЭ являются:• верхушка корня целого растения (показано для лука, подсолнечника и фасоли);• сосудистые пучки (показано для подсолнечника, клубня картофеля);• зачатки листьев.

Позже оптическое взаимодействие культур клеток и тканей показано неоднократно для разных образцов и при различных условиях содержания ([42], цит. по [34]; [34] и др.).

В работе [34] показана стимуляция роста культуры опухолевых клеток мыши ХС более плотной культурой при оптическом контакте. Как известно, скорость роста клеточной культуры зависит от начальной концентрации клеток. Эффект дистантной стимуляции наблюдался при тех начальных концентрациях культуры-детектора, при которых собственная скорость ее роста не максимальна (аналогично МГЭ). Эффект исчезал при «плохих» начальных ростовых потенциях культуры-детектора: при повреждении клеток во время снятия культуры с флакона или при помещении их в токсические условия. Дистантное взаимодействие показано для культур, разделенных слоем полистирола (дном чашки Петри). Химическая изоляция культур не снимает эффекта.

В широкомасштабном исследовании Альбрехта-Бюлера [57—60, 62] исследовано оптическое взаимодействие различных клеточных культур. Показана взаимная ориентация клеток на противоположных сторонах стеклянной пластинки при химической изоляции культур. Автор считает, что взаимодействие связано со сверхслабым излучением ИК диапазона. В отдельных экспериментах он показывает тропизм клеток к излучению ИК лазера и связывает этот тропизм со способностью клеток воспринимать излучение других клеток. Указана первостепенная роль центриолей в рецепции ИК излучения. Предложена модель центриоли, как универсального рецептора ИК света и микротрубочек, как универсальных внутриклеточных световодов.

В стрессовых условияхПервые данные по этому вопросу также получены в школе А.Г.Гурвича (см. ранее).

В дальнейшем дистантное взаимодействие культур клеток в стрессовых условиях исследовали В.П.Казначеев с соавт. [33, 32]. При этом, в отличие от авторов ранних работ (см. обзор [21]), авторы использовали необратимые некробиотические воздействия. Культуру фибробластов эмбриона человека заражали вирусами Коксаки А13, классической чумы птиц (FPV), аденовирусом типа 5 или поражали токсической дозой HgCh или летальной дозой УФ облучения. Дозы экстремальных факторов подбирали так, чтобы вызванное ими цитопатическое действие завершалось не ранее, чем через 2—4 суток. Культуру под действием экстремального фактора помещали в оптический контакт с аналогичной интактной культурой. Показано появление «зеркального» цитопатического эффекта (с подобной морфологической картиной) в культуре-детекторе, отстающее по времени от индуктора на 12—14 часов. При этом в экспериментах с заражением вирусом в культуре-детекторе он не выявлялся. Во всех случаях культура оставалась стерильной. В контрольных культурах спонтанная дегенерация клеток не наблюдалась.

Эффект наблюдается при разделении индуктора и детектора парой кварцевых пластинок не толще 0,8 мм каждая и пропадает при их разделении стеклянными пластинками. Для наблюдения эффекта объекты должны находиться в полной темноте, вращаться в горизонтальной плоскости со скоростью 25 об/час, не меняя взаимоположения, и взаимодействовать не менее четырех часов.

В работах [41, 84] исследовали оптическое взаимодействие фрагментов молочной железы мыши. Показано, что подавление или стимуляция секреции белка в индукторе оказывает влияние на секрецию белка в детекторе (при их химической изоляции). Явление наблюдается при разделении индуктора и детектора пластинкой из кварца и пропадает при экранировании непрозрачными материалами, т.е., по-видимому,связано с излучением в области УФ, видимого света или ИК.

В исследовании [78] культуру-индуктор (клетки кишечного эпителия Сасо-2) подвергали действию Н2О2 в концентрации 0,5 мМ и 5 мМ. Индуктор и детектор (химически изолированные) разделяли стеклянной перегородкой или двумя стеклянными перегородками с расстоянием 1, 2, 3 или 4 см между ними. Контрольную культуру содержали в идентичных условиях в удаленной комнате лаборатории. В культуре-индукторе добавление Н2О2 вызывало снижение тотального содержания белка, активацию транскрипционного фактора NFkB и нарушение морфологии цитоскелета и структуры плотных контактов. Показаны параллельные изменения в культуре-детекторе при времени взаимодействия 10 мин немедленно по окончании взаимодействия.

Авторы подчеркивают, что добавление Н2О2 в тех же концентрациях к раствору белка in vitro не снижает его концентрации, т.е. что снижение концентрации белка в индукторе связано с активацией сигнальных путей. Далее они предполагают, что параллельный эффект в детекторе может запускаться теми же сигнальными каскадами и подчеркивают, что дистантное взаимодействие, обнаруженное в их исследовании, связано с функционированием классических молекулярно-генетических сигнальных путей (активация фактора NFkB). Как известно (цит. по [78]), NFkB активируется при ряде стрессовых воздействий и запускает несколько внутриклеточных сигнальных каскадов. Изменение морфологии цитоскелета и структуры плотных контактов в детекторе, параллельное с индуктором, показывает, что «дистанционная» активация этих «стрессовых» сигнальных путей приводит к аналогичному морфологическому результату. Эффект наблюдается при разделении индуктора и детектора двумя стеклянными пластинками и распространяется через воздух без достоверного «затухания» на расстояние не менее 4 см.

Авторы полагают, что подобные эффекты могут вносить артефакты в результаты стандартных культуральных исследований и провозглашают необходимость учета этих явлений при любой лабораторной работе. Работа выполнена, по-видимому, с большой тщательностью и впервые показывает влияние сверхслабых нехимических факторов на молекулярно-генетические сигнальные системы.

4.1.5 Дистантное взаимодействие яйцеклеток и зародышейПервые результаты по чувствительности эмбрионального материала животных кдистантным нехимическим воздействиям получены на яйцеклетках иглокожих (см. ранее) и червей (С.Я. Залкинд, 1930, цит. по [31]). Одновременно обнаружено, что индукторами МГЭ в дрожжевых и бактериальных культурах являются:• яйцеклетки морского ежа в период первого (Г.М. Франк и С.Я. Залкинд, 1927), второго и третьего (С.Я. Залкинд, 1929) делений дробления (цит. по [31]);• анимальный полюс зародышей амфибий на стадии морулы;• кашица из головы или закладки нервной системы «молодых головастиков» амфибий [63] (цит. по [31]);В дальнейшем в работах А.Б. Бурлакова с соавт. исследовано оптическое взаимодействие кладок икры вьюна {Missgurnus fossilis) по ходу развития [75, 10,11]. Зародыши размещали в стандартных фотометрических кюветах (1x1x4 см) и помещали кюветы с двумя взаимодействующими кладками друг на друга. Минимальное расстояние между зародышами верхней и нижней кладки составляло 1 см. Кладки были разделены двумя кварцевыми пластинками (толщиной по 1 мм), слоем воды в нижней кювете (5 мм) и слоем воздуха (5 мм). В контроле зародыши размещались в одной из двух кювет; вторая оставалась заполненной раствором для инкубации.

По данным авторов, кладки одной стадии развития не оказывают взаимного влияния (при времени взаимодействия не более 18 ч). Взаимодействие двух близких стадий развития (ст. 0 и ст. 1 в начале взаимодействия) приводит к ускорению развития зародышей младшей стадии и снижению их % аномалий (время взаимодействия 18 ч). Взаимодействие двух более сильно отличающихся стадий (ст. 0 и ст. 6; ст. 6 и ст. 33; ст. 0 и ст. 33 в начале взаимодействия) приводит к подавлению зародышей младшей стадии: снижению средней скорости развития и повышению смертности (время взаимодействия 18 ч). Зародыши старшей стадии во всех случаях претерпевают незначительное торможение развития.

Эффект исчезает при разделении взаимодействующих кладок стеклянной пластинкой. Учитывая разделение кладок несколькими слоями различных веществ (вода в нижней кювете — воздух в нижней кювете — первый слой кварца — второй слой кварца) с большим количеством поверхностей раздела фаз, авторы утверждают, что эффект не связан с акустическими колебаниями. Дополнительным аргументом в пользу этого утверждения служит исчезновение эффекта при замене кварцевых кювет на стеклянные.

4.2 Сверхслабое излучение биологических объектов4.2.1 Митогенетическое излучениеВпервые с помощью физических детекторов электромагнитное излучение биологических объектов зарегистрировано от индукторов МГЭ (см. ранее стр. 10—14). Доказано и исследовано излучение многих из них в спектральном диапазоне 190—320 нм. На основе обширного экспериментального материала (см. ранее) А.Г.Гурвич, С.Я.Залкинд, Г.М.Франк и др. отождествляют «носитель» МГЭ со сверхслабым УФ излучением специфического (для разных индукторов) спектрального состава [31, 21, 22]. Авторы подчеркивают временную упорядоченность излучения и его первостепенную сигнальную роль для осуществления клеточного деления. В работах С.Я. Залкинда (цит. по [21]) показано, что внесение в дрожжевую культуру фактора, подавляющего митогенетическое излучение, ведет к параллельному прекращению деления клеток. При этом внешнее облучение культуры другим индуктором МГЭ восстанавливает нормальный ход деления. Предварительное облучение фактора индуктором МГЭ не влияет на его способность тушить излучение и останавливать клеточные деления. Т.о., восстановление клеточных делений при облучении культуры извне не связано с инактивацией фактора.

В работах А.Г.Гурвича [21, 22] детально обсуждаются возможные источники этого излучения, как спонтанного, так и индуцированного стрессовыми воздействиями. Автор предполагает протекание разветвленных цепных реакций в биологических системах и связывает с ними спонтанное излучение. Автор уделяет центральную роль неравновесности живой клетки и постулирует существование неравновесных надмолекулярных структур, поддерживаемых за счет постоянного притока энергии. Резкий «всплеск» излучения при стрессовых воздействиях он объясняет разрушением этих надмолекулярных структур с потерей энергии возбуждения в виде квантов УФ излучения.

4.2.2 Хемилюминесценция биологических объектовВ дальнейшем в работах школы Б.Н.Тарусова и других исследователей (см. обзоры [13, 26, 49, 48, 15]) открыто сверхслабое излучение (ССИ) многих биологических и модельных объектов в диапазоне 360—800 нм:• объектов растительного происхождения (семян и корней) [76];• тканей млекопитающих и их гомогенатов [51];• выделенных митохондрий (Ю.А. Владимиров, 1964), лизосом и хлоропластов (цит. по [48]);• липидов в модельных системах [48].

Показано, что это излучение свойственно всем тканям растительного и животного происхождения. Доказано его свободно-радикальное происхождение; развиты представления о цепных свободно-радикальных процессах в биологических системах с участием активных форм кислорода (АФК). Показано, что основной субстрат свободно-радикальных процессов — липиды мембран (фракция фосфолипидов); реакции идут по механизму перекисного окисления. Другой постоянный источник АФК в клетке — ферменты дыхательной цепи [27]; механизм их появления — «утечка» электронов на кислород с его т.н. одноэлектронным восстановлением. Доказано существование антиокисдантных систем, тормозящих развитие цепных свободно-радикальных процессов.

Процессы с участием АФК протекают во всех без исключения биологических системах и сопровождаются сверхслабым излучением в видимой области спектра — биохемилюминесценцией (БХЛ). В норме эти процессы поддерживаются на стационарном уровне благодаря постоянному обновлению антиоксидантных систем. Интенсивность БХЛ растет с повышением температуры, но при любом физиологическом (для данного организма) значении температуры остается стационарной. В ряде случаев БХЛ поглощается в самом объекте, но может быть стимулирована добавлением ионов Fe2+ или т.н. веществ-репортеров (люцигенин и др.).

Аналогично явлению деградационного МГЭ (см. ранее), стрессовые условия вызывают повышение интенсивности БХЛ. Последнее носит пороговый характер (обозначает границу физиологического диапазона для изменяемого фактора). «Вспышка» БХЛ имеет два максимума. Первый соответствует началу повреждающего действия и связан с «распадом липопротеиновых комплексов наиболее слабого участка в звене биологических структур» (Б.Н.Тарусов, 1972). При этом стрессовое воздействие еще обратимо. Второй максимум связан с бурным развитием цепной реакции окисления липидов; интенсивность БХЛ нарастает с самоускорением. Это соответствует переходу к нестационарным процессам и необратимому разрушению ткани ([12, 25] и др.). Отметим, что деградационный МГЭ наблюдается только при обратимыхвоздействиях — условиях, соответствующих первому максимуму «деградационной» БХ/1 или более мягких.

В работах школы Б.Н.Тарусова БХЛ приобрела первостепенное значение, как показатель процессов, протекающих в ткани, физиологического состояния целого организма и его устойчивости к различным внешним воздействиям.

В то же время реакции с участием АФК авторы рассматривали, как чисто деструктивные, а БХЛ — как лишенную всякого сигнального значения [48, 27]. Позже в обширной серии работ разных авторов показано, что определенная интенсивность свободно-радикальных процессов необходима для нормального функционирования клетки (см. обзор [16]). Открыто ферментативное производство АФК (Babior et al., 1973; Krieger-Brauer, Kather, 1995, цит. по [18]) и их влияние на важнейшие клеточные процессы (Downs et al., 1998; Chiarugi et al., 2003; Gordeeva et al., 2004). В настоящее время NO и От рассматривают, наряду с Са2+, как основные вторичные мес-сенджеры в клетке (Khan and Wilson, 1995; Droge, 2002; Saran, 2003). В работах Ю.А. Лабаса и др. показано существование обратных связей между их внутриклеточными концентрациями.

Ряд авторов [18, 44] связывает регуляторную роль АФК с излучением при их рекомбинации. Развиты представления о регулируемом перекисном окислении липидов (см. обзор в [44]).

4.2.3 Свидетельства сигнальной роли сверхслабого излученияВ работе [33, 32] зарегистрировано ССИ от культуры фибробластов куриного эмбриона. В логарифмической фазе спектр ССИ относится к области ближнего УФ (280—320 нм) и сине-зеленой области и далее постепенно сдвигается в длинноволновую область. Облучение культуры летальной дозой УФ приводит к 8—12 кратному возрастанию интенсивности ССИ на срок 18 ч. Авторы предполагают связь зарегистрированного ССИ и открытого ими же дистантного взаимодействия клеточных культур при стрессовых воздействиях (см. ранее).

В исследовании применена оригинальная установка для выделения полезного сигнала с интенсивностью ниже уровня шумов приемника излучения. Установка основана на т.н. схеме совпадений, используемой в радиоизотопном анализе: излучение регистрируется одновременно двумя приемниками и записываются только коррелирующие отсчеты.

Позже А.Молчанов и В.Голанцев зарегистрировали ССИ молочной железы мыши в различные периоды лактации в диапазоне 400—600 нм [41, 84]. Показано, что воздействие факторов, подавляющих или стимулирующих лактацию, приводит к параллельному изменению интенсивности ССИ и перекисного окисления липидов. В ряде случаев показано одновременное изменение интенсивности перекисного окисления липидов и секреции белка в интакгной культуре, оптически контактирующей с данной.

В работе [134] зарегистрировано сверхслабое излучения культур Escherichia coli в диапазоне 450—820 нм. Показано отличие его спектров для лаг-периода, фазы экспоненциального и фазы линейного роста культуры. Спектры зависят от среды культивирования (сравнивались среды М9 и LB), но имеют общие стадие-специфичные черты. Оптическое взаимодействие культур приводит к существенному изменению спектров (зависящему от среды) в лаг-периоде и фазе экспоненциального роста и не влияет на них в фазе линейного роста.

4.2.4 Свойства сверхслабого излучения яйцеклеток и зародышейВпервые физическими методами ССИ развивающихся зародышей зарегистрировано в 30-е гг. от дробящихся яйцеклеток [45] и бластулы амфибий (см. [22]). Возобновление интереса к этому вопросу относится также к 1990-м гг.

В работе [117] зарегистрировано ССИ от дробящихся яйцеклеток Rana japonica в спектральном диапазоне 300—900 нм. Показано превышение интенсивности ССИ над фоном во все время ядерного и цитоплазматического деления. При этом максимальная интенсивность ССИ относится ко времени деления цитоплазмы (прохождения борозды).

Авторы сопоставили результаты измерения ССИ при трех методах регистрации сигнала ФЭУ: аналоговом, цифровом (стандартный метод счета фотонов) и цифровом методе с высоким порогом дискриминатора (при этом регистрируются не отдельные фотоны, а только их группы). Показано, что стандартный метод счета фотонов ФЭУ наименее чувствителен.

В работах [1, 2] исследовано ССИ яйцеклеток и зародышей вьюна {Misgurnus fos5/7/5) в спектральном диапазоне 200—800 нм. ССИ регистрировали на ФЭУ методом счета фотонов. Запись вели во времени, получая т.н. временные ряды; проводили анализ различных свойств излучения для групп яйцеклеток, зародышей различной стадии развития и их яйцевых оболочек. Сравнивали характеристики излучения для групп зародышей различных стадий до и после их оптического взаимодействия.

Записи ССИ анализировали методами спектрального (Фурье) анализа, двойного Фурье-анализа и автокорреляционного анализа Фурье-спектров. Также рассчитывали некоторые характеристики функции распределения для излучения: % нулевых значений и коэффициент эксцесса (в терминологии авторов — куртозис).

Обнаружены следующие свойства ССИ от групп яйцеклеток и зародышей вьюна:• выделенные яйцевые оболочки хорошо поглощают свет от внешних источников и легко его отдают;• зародыши в яйцевых оболочках не обладают этими особенностями;• характерным элементом ССИ дробящихся яйцеклеток являются «каскады» кратковременных (<1 мсек) «вспышек», приуроченных к прохождению борозд дробления;• в ССИ зародышей более поздних стадий также наблюдаются кратковременные «вспышки», но не составляющие таких четких групп;• Фурье-спектры ССИ яйцеклеток и зародышей имеют группы максимумов (наиболее выраженных спектральных полос). Эти группы более стабильны в излучении зародышей, чем неоплодотворенных яйцеклеток (имеют более высокий средний коэффициент автокорреляции).

Авторы делают вывод, что ССИ яйцеклеток и зародышей вьюна характеризуется в первую очередь не средней интенсивностью, а определенной «временной упорядоченностью». Последняя имеет сложный характер, который зависит от стадии развития и проявляется в наличии групп максимумов в Фурье-спектрах ССИ. В положении максимумов для развивающихся зародышей наблюдается определенная внутренняя корреляция.

Показаны следующие изменения в ССИ групп зародышей вьюна при их оптическом взаимодействии (в течение 1 часа):• уменьшается число высоких «пиков» в ССИ зародышей младшей стадии(коэффициент эксцесса распределения ССИ после взаимодействия ниже, чем до взаимодействия);• увеличивается число высоких «пиков» в ССИ зародышей старшей стадии;• изменения в коэффициенте эксцесса распределения ССИ тем более выражены, чем больше различие в стадии взаимодействующих групп зародышей;• коэффициент автокорреляции Фурье-спектров имеет меньшее среднее значение, чем при отсутствии взаимодействия (группы максимумов в Фурье-спектре ССИ теряют свою стабильность).

Показано, что длительное оптическое взаимодействие групп зародышей разных стадий (12—22 ч) приводит к изменению автокорреляционной структуры Фурье-спектров их ССИ. По утверждению авторов, между ними «происходит обмен автокорреляционными характеристиками» [2].

Авторы делают вывод, что описанные ранее [10, 75] эффекты оптического взаимодействия разновозрастных групп зародышей могут быть связаны с изменением временной структуры их ССИ.

Следует отметить, что при меньшей, чем в [117], чувствительности метода регистрации авторам удалось выявить многочисленные особенности ССИ зародышей благодаря последующей цифровой обработке результатов регистрации.

4.3 Состояние проблемы и перспективыИтак, в многочисленных исследованиях разных авторов показано явление оптического взаимодействия разных биологических объектов. Обнаружен широкий спектр возможных эффектов; показано взаимодействие для объектов разной природы и в различных состояниях. К настоящему моменту данные в этой области, несмотря на свою многочисленность, очень разнородны. Их дисперсность столь велика, что не позволяет даже заключить, имеет ли эффект в разных случаях общую природу, или это множество различных эффектов.

В любом случае для каждого обнаруженного эффекта естественно возникает вопрос о его физической природе: механизме генерации сигнала, его природе и структуре и механизме его рецепции. Для ряда эффектов на этом пути сделаны важные шаги. Исследования физической природы сигнала привели к уверенному утверждению об участии электромагнитного излучения в передаче сигнала. Тем не менее, ряд эффектов относится, по-видимому, к области акустики.

Эта часть проблемы породила обширную серию исследований, выделившихся в отдельное направление: исследование сверхслабого свечения биологических систем. Развитие этой области шло, в основном, уже вне связи с явлением дистантного взаимодействия. Не проводилось параллельного исследования свойств излучения или содержания свободных радикалов в объекте и его участия в дистантном взаимодействии; условия экспериментов в основном не имели отношения к условиям, при которых могут наблюдаться биологические эффекты. Т.о. несмотря на обширные результаты и детально изученные механизмы, их использование для исследования собственно дистантного взаимодействия очень затруднительно.

Возвращаясь к основанию проблемы, я еще раз формулирую основные вопросы:Существует ли дистантное взаимодействие биологических объектов? Если да, то: При каких условиях оно проявляется? Каков его механизм?Огромный накопленный материал позволяет ответить на первую часть вопроса утвердительно. Условия проявления взаимодействий также во многом исследованы, однако окончательный ответ возможен только на основании изученного и доказанного механизма. Т.о. первостепенную значимость в настоящее время приобретает третья часть поставленного вопроса.

Последовательное исследование в этом направлении, с учетом современного уровня науки, должно включать синхронные исследования по:• собственно биологическому эффекту;• различным свойствам ССИ каждого из взаимодействующих объектов; поиску тех их свойств, которые коррелируют с биологическим эффектом;• свободно-радикальным процессам, протекающим в каждом из взаимодействующих объектов;• молекулярно-генетическим и морфогенетическим процессам, протекающим в них.

Наиболее рационально этот комплекс работ проводить на одном (выбранном) объекте в процессе его развития. При этом по ходу развития в объекте будут активироваться различные генетические системы и молекулярные каскады, идти процессы морфогенеза. Соответственно, будет меняться и содержание свободных радикалов. Последовательное исследование объекта в развитии позволит проверить множество возможных корреляций этих процессов, различных характеристик ССИ и ди-стнатных биологических эффектов. Для облегчения задачи необходимо подобрать стандартный биологический объект с хорошо изученными процессами развития.

Изложенные задачи относятся, очевидно, к широкомасштабному коллективному исследованию. В настоящей же работе сформулированы конкретные, более узкие задачи, выполнение которых позволит делать следующие шаги к решению общей проблемы.

Цель работы: определить, возможно ли и за счет чего оптическое взаимодействие зародышей X.laevis.

Задачи:1. Определить роль оптических контактов для развития отдельных зародышей X.laevis. сравнить развитие зародышей с нормальными и нарушенными оптическими контактами между ними по основным морфологическим критериям.

2. Зарегистрировать излучение отдельного зародыша X.laevis в спектральном диапазоне 200—800 нм на разных стадиях развития. Провести анализ основных свойств этого излучения.

3. Проверить явление субрадиации на зародышах X.laevis. оценить изменение сверхслабого излучения зародышей при их оптическом контакте.

5 Материалы и методы5.1 ОбъектИсследования проводили на яйцеклетках и зародышах шпорцевой лягушки (Xenopus laevis Daudin.), полученных методом гормональной стимуляции.

В ряде ранних работ показано дистантное взаимодействие зародышей амфибий (см. Литературный обзор); на яйцеклетках амфибий локализован момент наибольшей митогенетической активности по отношению к делению (С.Я. Залкинд, цит. по [31]). Измерено ССИ от зародышей Rana [45, 117]. Созданы постадийные карты содержания свободных радикалов в зародыше [39, 40]. Есть предварительные данные по ССИ зародышей X.laevislbaskdkoN].

В то же время X.laevis — стандартный объект биологии развития. Детально изучено его нормальное развитие в зависимости от температуры и других условий окружающей среды [148, 144]. Известны факторы дифференцировки клеток; изучены процессы морфогенеза [73]. Известны многочисленные сигнальные каскады, процессы генной активации и репрессии [153,152].X.laevis удобен в практическом смысле. Для него разработана методика гормональной стимуляции и искусственного оплодотворении, простая в использовании и действенная в любое время года. Он имеет крупные, удобные в обращении мезоле-цитальные яйцеклетки. Яйцеклетки имеют выраженную анимально-вегетативную полярность и после оплодотворения принимают точное положение в гравитационном поле. Это унифицирует их взаимное положение и делает эксперимент по оптическому взаимодействию более однородным и управляемым.

Итак, есть основания ожидать оптическое взаимодействие зародышей X.laevis. В то же время детально изучено его развитие, включая важные аспекты для исследования дистантного взаимодействия. Наконец, X.laevis удобен практически. Все это позволило выбрать яйцеклетки и зародыши X.laevis в качестве объекта исследования.

При индивидуальном оплодотворении:4. яйцеклетку помещали в кювету для последующего эксперимента;5. срезом семенника касались яйцеклетки;6. к яйцеклетке добавляли 10% MMR.

Как известно, оплодотворение происходит при снижении концентрации солей до уровня 20—30% MMR; для культивирования икры без операций оптимально использовать 10—15% MMR. Моментом оплодотворения считали добавление 10% MMR; конечная концентрация MMR составляла 10—10,5%.

Регистрировали развитие зародышей по таблицам нормального развития ([156, 146], использ. по [148]).

5.3 Постановка эксперимента5.3.1 Задача 1. Исследование оптического взаимодействия дробящихся яйцеклеток X.laevis.

Яйцеклетки XJaevisсинхронно оплодотворяли in vitro. Через 30 мин с них снимали третичные оболочки 2% раствором цистеина (рН 8), 4—5 раз отмывали 10% MMR; отбирали оплодотворенные яйцеклетки и помещали их в кюветы с индивидуальными ячейками для каждого зародыша (рис.1). Размер одной ячейки: 2x2x3 мм, толщина стенки 1,5 мм, размер кюветы: 10x10 ячеек.

Рис. 1. Кювета с индивидуальными ячейками для каждого зародыша. Размер одной ячейки: 2x2x3 мм; толщина стенки 1,5 мм. Размер кюветы: 10x10 ячеек.

Кюветы изготовлены по технологии спекания из кварцевого стекла КУ-1. Показатель преломления 1,46; спектр пропускания см. рис.2, оптически однородно и изотропно.

Рис. 2. Спектр пропускания кварцевого стекла КУ-1 (по [150, 147])тШИспользовали две кюветы:кювета А — с сохранением оптических контактов (с прозрачными перегородками между зародышами);кювета Б — с нарушением оптических контактов (с матовыми перегородками между зародышами).

В своей области прозрачности кварцевое стекло практически не влияет на «структуру» проходящего электромагнитного излучения: пространственно-временную неравномерность, поляризацию и когерентность. Матирование поверхности оптических материалов не изменяет их светопропускание и коэффициент преломления, но «хаотизирует» проходящий световой поток в большей или меньшей степени (в зависимости от длины волны и величины шероховатостей матовой поверхности).

Так как электромагнитное излучение зародыша X.laevis если и существует, то ничтожно по интенсивности (см. Литературный обзор), его влияние на соседние зародыши возможно только за счет определенной «структуры». Следовательно, если между зародышами X.laevis в условиях эксперимента существует оптическое взаимовлияние в спектральной области 180 нм — 2,5 мкм или 3—3,5 мкм, развитие зародышей в кюветах А и Сбудет иметь отличия.

Зародыши в двух кюветах находились в идентичных условиях: химических, температурных, освещенности и др. Эксперимент начинался через 50—60 мин после оплодотворения и длился от 1,5 до 2 часов. По ходу опыта подсчитывали количество анимальных бласгомеров (видимых для наблюдателя без изменения ориентации яйцеклетки) у каждого зародыша.

Все ячейки каждой кюветы условно делили на три группы:1. ячейки с четырьмя ближайшими «соседями» (64 шт.) — внутренние 8x8 ячеек;2. ячейки с тремя ближайшими «соседями» (32 шт.) — ячейки в рядах по периферии кюветы за вычетом угловых;3. ячейки с двумя ближайшими «соседями» (4 шт.) — угловые ячейки.

Сравнивали развитие зародышей в группе 1 кювет А и Б. Для проверки важности числа оптических контактов сравнивали развитие в группах 1 и 2 каждой из кювет. В качестве контроля сравнивали развитие в левой и правой половинах каждой из кювет.

Оценивали различия в следующих характеристиках:• среднее число анимальных бласгомеров (по критерию Вилкоксона-Манна-Уитни);Распределение зародышей по числу анимальных бласгомеров не соответствует нормальному (см. Результаты и обсуждение), поэтому для статистического сравнения выборок неприменим критерий Стьюдента. Наиболее мощные критерии для сравнения средних при неизвестном распределении — £Акритерий Вилкоксона-Манна-Уитни и ^-критерий Ван-дер-Вардена [145]. Здесь применяли ^/критерий, как более распространенный. Применение критерия корректно для любых выборок с числом объектов не менее трех в каждой. Недостаток критерия по сравнению с критерием Стьюдента (наиболее мощным статистическим критерием) — его меньшая мощность (т.е. меньшая чувствительность к различию между выборками) [145].• распределение зародышей по числу анимальных бласгомеров (по критерию Колмогорова-Смирнова);Для сравнения двух неизвестных распределений применяют критерий Колмогорова-Смирнова. Он существенно менее мощный, чем {/-критерий, и становится чувствительным к различию между выборками только при их большом объеме. В то же время он проверяет различие не средних, а распределений и может статистически различить распределения с равными средними, но различной дисперсией. Применение критерия корректно для любых распределений [145].• пространственное распределение зародышей старшей стадии, присутствующей в выборке. Его оценивали по двум показателям:о % ячеек с зародышами старшей стадии, образующих кластеры (группы ячеек, имеющих общие стенки, т.е. группы, в пределах которых возможен прямой оптический контакт);о средний размер кластера (число ячеек).

Эксперименты проводили в разные дни, при разной температуре и на разных кладках, поэтому сравнение любых показателей возможно только в пределах одного эксперимента. Тем не менее, по относительной разности показателей (Аотос, = (Хг— ХМи где Xi и Хг — выбранные показатели для двух групп зародышей) допустимо оценить и всю совокупность экспериментов: есть ли общие тенденции в Лотос., или насколько достоверно лОТНОС. в среднем отличается от 0. Здесь корректно применить критерий знаков по Вилкоксону [154].

Время отдельного измерения в ходе эксперимента — период накопления сигнала — составляло:• 1 мсек (длительность эксперимента 1 мин — 60000 измерений);• 10 мсек (длительность 5 мин — 30000 измерений);• 100 мсек (длительность 20 мин — 12000 измерений).

Сигнал, регистрируемый от ФЭУ, имеет две компоненты:• темновой ток ФЭУ — импульсы, спонтанно возникающие в ФЭУ даже в абсолютной темноте;• излучение от объекта (здесь: кюветы со средой или кюветы со средой и зародышем).

Измеряли отдельно темновой ток, излучение кювет, кювет со средой, яйцеклеток и зародышей (в кюветах со средой). Для каждого эксперимента (измерения излучения яйцеклетки или зародыша) измеряли фон (излучение кюветы со средой непосредственно до или после него); свойства излучения (см. ниже) представляли, как разность эксперимента и фона.

Запись излучения в использованном режиме соответствует определению цифрового математического сигнала (дискретной функции дискретного переменного 1к = I(tk), предположительно несущей некую информацию) [144, 151]. Следовательно, к ней применимы методы цифровой обработки сигналов.

Из-за темнового тока любая запись излучения имеет стохастическую компоненту, еще более выраженную для излучения кюветы. Во многих случаях собственно излучение объекта «тонет» в этих шумах. Однако применение методов цифровой обработки сигналов (спектральный анализ, дискретная фильтрация и др.) позволяет выявить особые свойства сигнала, невидимые «простым глазом». Эти методы применяются в радиотехнике, электронике, шифровании данных и др. Некоторые из них применены и в этой работе.

Рассчитывали основные свойства излучения, как математического сигнала:• Среднюю интенсивность (/77).• Дисперсию (я2 = I(Ik — mf) — флуктуации интенсивности излучения.• Эмпирическую функцию плотности вероятности {р(1]) — % измерений с различной интенсивностью излучения в зависимости от этой интенсивности (гистограмму излучения).

Это более тонкий метод сравнения интенсивностей. Два сигнала могут не отличаться по средней интенсивности или дисперсии, но иметь разные распределения. В радиотехнике это используют в некоторых типах кодировки. Когерентность излучения также оценивают по функции плотности вероятности. Дополнительными характеристиками р(1) могут служить коэффициенты асимметрии и эксцесса.

Рис. 3. Пример исходной записи излучения (а) и ее гистограмма (б)хC1Jтс; а) го иш<итг mи Xа>I— Is120 100 80 60 40 20 0а.

1000 2000 3000 4000время, сек5000 600035% 30% 25%Igj 20%о.<иZ 15% пsо 10% о45% 0%6.

9 10 11 12число импульсов за 0,1 сек• Спектр Фурье (в варианте спектра мощности по Уэлчу с окном Хэмминга шириной в лк длины сигнала и перекрыванием окон 50%) — показатель периодических компонент в излучении.

Преобразование Фурье — представление сигнала, как суммы гармонических колебаний с различными частотами. Спектр Фурье сигнала — зависимость амплитуды и фазы гармонических колебаний от их частоты. Преобразование Фурье корректно и однозначно для любого сигнала, возможного в эксперименте.

Стохастические сигналы имеют стохастические спектры Фурье. Наличие в сигнале гармонической компоненты выявляется как полоса в спектре с соответствующей частотой и амплитудой; более сложные периодики — как совокупность полос. Апериодические компоненты (наприм., кодировка речи) выявляются, как множество полос в спектре, при чем разное для разных участков сигнала.

На рис.4 приведена модель стохастического сигнала (левый столбец) и стохастического сигнала с периодическими компонентами (правый столбец). Различие плохо выявляется простым глазом и похоже на флуктуации фонового шума (рис.4 а и б). Однако Фурье-спектр сигнала (рис.4 виг) позволяет легко обнаружить эти компоненты. Кроме того, в левой части спектров видны две спектральные полосы с «нулевой» и «первой» (по счету) частотой. Эти полосы отражают среднюю интенсивность сигнала (здесь 5, см. рис.4 а и б). Они полностью пропадают, если сигнал центрирован вокруг нуля.

Рис. 4. Иллюстративная модель стохастического сигнала с периодическими компонентами (а) и без периодических компонент (б) (на рисунке представлены первые 2% сигналов). Амплитуда Фурье-спектров этих сигналов (в, г).а.б.время, секв.г.

1.50.50.IIшМ4 5 "0частота, ГцНа рис.4 (в, г) представлен не сам спектр Фурье, а его амплитуда. Вторая компонента спектра — фаза — делает его комплексной величиной. В большинстве случаев достаточно рассчитать только амплитудный спектр или спектр мощности (квадрат амплитудного спектра). Статистическое усреднение нескольких Фурье-спектров допустимо проводить независимо по каждой полосе,но только по амплитуде или мощности. При усреднении комплексного спектра Фурье теряется флуктуационная составляющая, которая для сложных сигналов (в частности, излучения) представляет наибольший интерес.

На рис.5 приведен статистически усредненный спектр мощности для 10 модельных стохастических сигналов (синий график). Появление в сигнале сложных периодических и особенно апериодических компонент может приводить не только к появлению более выраженных спектральных полос, но и к их исчезновению. Красный спектр дает модель набора статистически появившихся и исчезнувших полос при введении сложной апериодической компоненты.

Рис. 5. Иллюстрация статистического спектра мощности по Уэлчу для 10 стохастических сигналов (синий график) и набор статистически появившихся и исчезнувших полос при введении апериодической компоненты (красный график).

1|-,-!-1-!SЬ о.8.;.i.01частота колебаний, ГцДля сигналов со стохастической компонентой простой Фурье-спектр часто оказывается неприменим из-за высокой зашумленности. В этом случае используют различные модификации Фурье-спектра. Наиболее мощный метод — метод Уэлча:о Сигнал делят на несколько перекрывающихся участков равной длины; каждый участок «вырезают» из сигнала, умножая сигнал на функцию, равную нулю везде, кроме самого участка. Внутри участка функция может быть тождественна единице (приводит к искажению спектра) или плавно нарастать и убывать. Функция, с помощью которой вырезают участки из сигнала, называется окном.о Рассчитывают Фурье-спектр для каждого участка сигнала.о Усредняют Фурье-спектры всех участков (отдельно по каждой частоте). Полученный спектр называют периодограммой Уэлча, а квадрат его амплитуды — спектром мощности по Уэлчу.

Метод Уэлча приводит к потере наиболее низкочастотных компонент спектра (с периодом больше, чем ширина окна), но сильно снижает «зашумленность» спектра [151].

На рис.6 представлен пример реальной записи излучения (а) и ее спектр мощности по Уэлчу (б).

Рис. б. Пример исходной записи излучения (а) и ее спектр мощности по Уэлчу (б) а. б.время, сек частота колебаний, ГцРасчет всех перечисленных характеристик подразумевает, что сигнал стационарен за период расчета. Чем менее стационарен сигнал на самом деле, тем выше дисперсия («зашумленность») оценки его свойств. Применение перечисленных методов к нестационарным сигналам допустимо, но существенно снижает их мощность.

Помимо перечисленных, существует еще колоссальное количество методов математической обработки сигналов, вплоть до адаптивных систем, основанных на электронных нейросетях. Однако перечисленные выше методы выявляют базовые свойства сигнала, наиболее важные применительно к излучению и имеющие четкий физический смысл. Более сложные методы имеет смысл применять только на этапе окончательной «дешифровки» взаимодействия биологических объектов.

Каждый эксперимент выполняли в 7—10 повторах. Характеристики темнового тока ФЭУ, излучения кювет со средой, яйцеклеток и зародышей имеют распределение близкое к нормальному. Учитывая объем выборок (7—10 объектов), для их сравнения допустимо применить критерий Стьюдента.

Для расчета свойств излучения и статистического анализа использовали программы STATISTICA и MATLAB; разработан оригинальный пакет программ в среде MATLAB.

Во всех случаях для отражения достоверности различий приводится уровень значимости Р. «Достоверность» считается, как (1—Р)х100%.

6 Результаты и обсуждение6.1 Оптическое взаимодействие зародышей Xenopus laevis6.1.1 Выбор статистического критерияДля сравнения признака в двух выборках необходимо оценить его распределение. На рис.7 представлены примеры распределения зародышей по числу анимальных бластомеров и аппроксимация этих распределений. Видно, что оба распределения не соответствуют нормальному.

Рис. 7. Пример распределения зародышей по числу анимальных бластомерова. Кювета А б. Кювета 5Число анимальных бластомеровДля строгой проверки нормальности распределения используют критерий Колмогорова-Смирнова в модификации Лиллифорса [155]. Использование этого критерия показывает, что распределение зародышей по числу анимальных бластомеров во всех случаях соответствуют нормальному с вероятностью не более 1%.

Ненормальность эмпирически полученных распределений связана, в первую очередь, с тем, что число анимальных бластомеров (как и всякая формальная стадия развития) нелинейно растет со временем. Поэтому, даже если выборка зародышей абсолютно однородна, и их индивидуальная скорость развития — нормально распределенная случайная величина, их распределение по формальной стадии развития ненормально. Кроме того, переход между формальными стадиями происходит дискретно («скачком»), что дополнительно искажает распределение.

Итак, распределения не нормальны, а, следовательно, для статистического сравнения выборок неприменим критерий Стьюдента. Для сравнения средних использовали ^/-критерий Вилкоксона-Манна-Уитни; для сравнения самих распределений — критерий Колмогорова-Смирнова (см. Материалы и методы).

6.1.2 Корректность постановки эксперимента: проверка однородности выборки% аномалий и распределение зародышей по числу анимальных бластомеров (в т.ч. среднее) не имели достоверных различий между правой и левой половинами каждой из кювет ни в одном эксперименте. В ряду экспериментов относительная разность (Аотнос) по этим показателям также не имела тенденций (см. табл.1).

Следовательно, при синхронном оплодотворении и идентичных условиях содержания зародышей X.laevis использованных выборок достаточно, чтобы избежать ар-тефактных различий в отдельном эксперименте и артефактных тенденций в группе опытов по выбранным статистическим критериям. Применение выбранных показателей для сравнения выборок корректно в данном эксперименте.

6.1.3 Влияние оптических контактов на дробление яйцеклеток X.laevisКоличество аномалий.

По % аномалий кюветы А и Б не имели устойчивого различия в ряду экспериментов (Р= 0,313). При этом в трех опытах оно было более чем двукратно выше в матовой кювете и в шести опытах разница не превышала 2%. Во всех случаях, когда различие наблюдалось, оно появлялось по ходу эксперимента в ранее не отличавшихся выборках зародышей (табл.2). Т.о., несмотря на отсутствие достоверных различий, делать вывод о том, что количество аномалий не зависит от оптического взаимодействия дробящихся яйцеклеток, неправомочно.

Среднее число анимальных бласгомеров (во всех опытах кроме одного) в кювете Б было на 8—17% ниже, чем в кювете А; в шести опытах это различие было достоверным (Р < 0,05), а в двух из них достоверно отличались и сами распределения (Р < 0,025).

В ряду опытов среднее число анимальных бласгомеров в кювете Б было в среднем на 11% ниже, чем в кювете А (Р= 0,008).

Во всех опытах % зародышей старшей стадии в кювете Б был ниже, чем в кювете А (см. табл.3). По совокупности отличие составило в среднем 44% (Р = 0,004). При этом сама старшая стадия от опыта к опыту колебалась от 4 бласгомеров до морулы.

Количество (%) зародышей старшей стадии, образующих кластеры, в четырех опытах слабо различалось и в пяти опытах было на 50—100% ниже в кювете Б (табл.3). В среднем по совокупности экспериментов нарушение оптических контактов вело к снижению % зародышей старшей стадии, образующих кластеры, на 36% (/> = 0,047).

Средний размер кластера в кювете Б также был во всех случаях ниже, чем в кювете А (за исключением одного наблюдения, где количество зародышей старшей стадии было недостаточно для образования кластеров) (см. табл.3). В среднем эффект составил 50% {Р= 0,008).

Табл. 3. Влияние оптических контактов на пространственное распределение зародышей старшей стадии. Кювета А - - с сохранением оптических контактов; кювета Б — с нарушением оптических кон- тактов. Относительные различия рассчитаны, как ЛОТнос. = (кюв.Б — кюв.А) / кюв. А. Критерии для расчета ^(уровня значимости) те же. Дата Т, ' время 0£ взаи-; мод., ст. стадия, число аним. % зародышей старшей стадии % ячеек, входящих в кластеры средний размер кластера ; мин бласт. КЮВ. А КЮВ. Б Дэтнос. КЮВ. А КЮВ. Б Дзтнос. кюв. А кюв. Б Дэтнос.

6.1.5 ОбсуждениеИтак, проверка однородности выборок (часть 6.1.2, стр. 43) показывает корректность постановки эксперимента.

Нарушение оптических контактов между дробящимися яйцеклетками (часть 6.1.3, стр. 43) ведет к замедлению дробления и снижению его пространственной скоррели-рованности (снижению выраженности кластеров синхронно развивающихся зародышей в пространстве кюветы). Достоверного изменения количества аномалий не обнаружено.

Снижение числа нормальных (ненарушенных) оптических контактов каждого зародыша с 4 до 3 (часть 6.1.4, стр. 47) приводит к менее выраженным результатам, чем их нарушение (при сохранении количества). При этом прослеживается тенденция к снижению среднего числа анимальных бластомеров, но не выходящая на уровень достоверности. Изменение числа нарушенных оптических контактов с 4 до 3 не влияет на развитие. Т.о. решающим фактором для нарушения дистантного взаимодействия яйцеклеток является установка между ними т.н. фазового экрана (замена прозрачной кварцевой перегородки на матовую).

Колебания уровня значимости («достоверности») различия между выборками по числу анимальных бластомеров связаны, видимо, с погрешностью при оценке «биологического возраста» зародыша по его стадии развития (числу бластомеров). Погрешность в период дробления должна составлять времени между прохождением последовательных борозд (то). В синхронно оплодотворенной кладке до полной потери синхронности распределение клеточных делений во времени неоднородно. Случайно выбранный момент наблюдения может совпасть с периодом массового прохождения очередной борозды. Так как развитие не идеально синхронно, распределение зародышей по формальной стадии развития в этот момент будет наиболее широким, а следовательно, различие выборок — наименее явным. Дополнительный фактор «уширения» распределений по стадиям развития — то, что со временем число бластомеров растет быстрее, чем линейно, а в период синхронного дробления — даже в геометрической прогрессии. Все это ведет к тому, что при различии выборок по скорости развития зародышей, различие в их формальной стадии оказывается менее однородным, а потому менее достоверным.

Статистическая оценка характеристик, не усредняемых по группе (% аномалий, % ячеек, входящих в кластеры и средний размер кластера) невозможна по индивидуальному эксперименту. В группе экспериментов их разброс многократно выше разброса любой усредняемой характеристики (средней стадии развития или др.) [143]. Это также снижает формальную «достоверность» реально существующих различий.

Т.о. установленные изменения скорости и пространственной скоррелированности дробления яйцеклеток XJaevis при нарушении или снижении числа оптических контактов между ними являются нижней границей истинного эффекта.

Изложенные результаты свидетельствуют по крайней мере об одном эффекте оптического взаимодействия: яйцеклетки, дробящиеся с большей скоростью, чем соседние, стимулируют ускорение их дробления. При этом увеличивается количество яйцеклеток с большей скоростью дробления, количество и размер их групп и скорость дробления в среднем. Могут ли дробящиеся яйцеклетки стимулировать дробление синхронно оплодотворенных, но не начавших дробиться «соседей» - остается неизвестным. Также неизвестно, существуют ли эффекты коллективного взаимодействия и эффекты взаимной стимуляции.

6.2 Сверхслабое излучение яйцеклеток и зародышей Xenopus laevis6.2.1 Выбор статистического критерияРассчитанные характеристики (см. Материалы и методы) темнового тока ФЭУ, излучения кювет со средой, яйцеклеток и зародышей имеют распределение близкое к нормальному. Учитывая объем выборок (7—10 объектов), для их сравнения допустимо применить критерий Стьюдента.

6.2.2 Корректность расчетов. Статистические характеристики фонаТемновой ток ФЭУСредняя интенсивность излучения любого из задействованных объектов близка к фону. Регистрируемый сигнал (запись излучения) имеет существенную стохастическую компоненту и, соответственно, стохастический Фурье-спектр. В то же время, сигнал использованной длины (12000—60000 значений в разных сериях) дает Фурье спектр с высоким разрешением по частоте (2000—8000 спектральных полос при окне в 1А длины файла). Поэтому, даже при статистическом усреднении спектров, возможно появление артефактных спектральных полос — флуктуаций темнового тока ФЭУ. В соответствии с этим, уровень значимости Р, при котором различие между выборками принимали за достоверное, подобрали так, чтобы спонтанные флуктуации темнового тока ФЭУ и излучения кювет со средой не выходили на уровень достоверности. Это значение оказалось равным 0,005 («достоверность» 99,5%).

В то же время для сравнения других характеристик сигналов — среднего, дисперсии и гистограммы — достаточно менее жесткого критерия достоверности. Здесь ограничились уровнем значимости 0,01.

В качестве примера на рис.8 представлена разность гистограмм темнового тока ФЭУ, померенного в разное время в течение экспериментального сезона (период накопления сигнала 1 мсек, длительность измерений 1 мин), на рис.9 — разность Фурье-спектров (спектров мощности по Уэлчу). Аналогичные результаты получены при периоде накопления 10 мсек и длительности измерений 5 мин, а также для излучения кюветы со средой в обоих вариантах. Достоверных отличий ни в одном случае не наблюдается.

Таким образом, при использованном объеме выборок, критериях сравнения и уровнях значимости, артефактных флуктуаций фона не обнаружено. Метод можно применять для выяснения характеристик ССИ различных объектов.

Рис. 8. Темновой ток ФЭУ в разное время в течение экспериментального сезона. Период накопления сигнала 1 мсек, длительность измерений 1 мин.

Разность статистических гистограмм. Усреднение по 10 повторам. Р (уровень значимости) рассчитан по критерию Стьюдента. За достоверное принято различие с Р<0,005.

2 0 -2it: Щ.лJL.J1Lт—IОт-НXО £ О) го т О) Q.ьшного тоXm го о.I■ ■. 1 I JL2 h 0 -2 гIГГ---I-.1-. ■ ■ ■г- jiv.l2--2lIiгjrrrri"П.- - 11.

Заключение Диссертация по теме "Биология развития, эмбриология", Володяев, Илья Владимирович

8 Выводы

1. Показано оптическое взаимодействие дробящихся яйцеклеток Xenopus laevis, проявляющееся в стимуляции «передовыми» яйцеклетками отстающих «соседей»;

2. Показано оптическое взаимодействие групп зародышей на стадиях 6 и 19, проявляющееся в явлении субрадиации (снижения суммарной интенсивности излучения при взаимодействии);

3. Измерено излучение зародышей Xenopus laevis на стадиях 2—24; приведены его стадие-специфичные разностные (с фоном) спектры Фурье при равенстве фону по средней интенсивности;

4. Показано, что на стадиях 2—4 излучение зародыша выше фона по спектральной мощности на группе частот в диапазоне 0,01—50 Гц на временах <5 мин и ниже в диапазоне 0,1—500 Гц на временах <1 мин;

5. Показано резкое появление в излучении зародыша на стадиях 8—9 групп спектральных полос, превышающих фон, совпадающее по стадии с активацией собственного генома зародыша, и постепенное их исчезновение на более поздних стадиях (11—24);

6. Предложена и успешно применена конструкция кювет для постановки экспериментов по оптическому взаимодействию индивидуальных зародышей;

7. Разработано и успешно применено программное обеспечение для анализа сверхслабого излучения.

7 Заключение

В настоящей работе показано оптическое взаимодействие зародышей шпорцевой лягушки (Xenopus laevis Daudin.) по крайней мере в период дробления и по крайней мере в отсутствие третичных оболочек. Это взаимодействие «проходит» через прозрачный кварц КУ1 и приграничные слои воды на расстояние не менее 2 мм (толщина водного слоя не менее 0,5 мм). Взаимодействие проявляется в стимуляции «передовыми» яйцеклетками отстающих «соседей».

Естественно возникает вопрос о механизмах оптического взаимодействия. Первые шаги к его разрешению состоят в измерении излучения от зародышей и анализе его свойств. Этой проблеме посвящена вторая часть работы. Показано, что хотя по средней интенсивности излучение зародышей на большинстве стадий развития не отличается от фона, оно обладает особой стадие-специфичной временной структурой. Эта структура связана с апериодическими процессами, но обладает характерным для выбранной длительности опыта набором полос в Фурье-спектрах.

Из изложенного следует еще один вопрос: влияет ли оптическое взаимодействие биологических объектов на их сверхслабое излучение? В настоящей работе на новом объекте подтверждены результаты Л.В.Белоусова с соавт. на зародышах костистых рыб [1, 2]: оптическое взаимодействие зародышей ведет к снижению суммарной интенсивности их излучения. Это нетривиальное явление, названное ранее субрадиацией, может служить дополнительным инструментом для решения проблемы механизмов дистантного взаимодействия.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Володяев, Илья Владимирович, Москва

1. Основная литература по теме диссертации

2. Белоусов Л.В., Попп Ф.А., Казакова Н.И. (1997). Сверхслабые излучения куриных яиц и зародышей: неаддитивное взаимодействие двух излучателей и устойчивая неравновесность. // Онтогенез. Т. 28, С. 377—388.

3. Бляхер Л.Я., Бромлей Н.В. (1930). Резорбционные процессы как источник фор-мообразовнаия. II. Митогенетические излучения при регенерации хвоста у головастиков. // Медико-биологический журнал. Вып. 3. С. 171—177.

4. Браже А.Р. (2006). Фрактальный и вейвлет-анализ электрической активности нервных клеток. // Дисс. на соискание ученой степени канд. биол. наук, М.

5. Браже Н.А. (2006). Механизмы действия оксида азота на мембраны нервных клеток. // Дисс. на соискание ученой степени канд. биол. наук, М.

6. Браунштейн А.Е., Потоцкая А.П. (1934). О специфичности спектров митогенетического излучения при окислительно-восстановительных реакциях. // Архив Биол. наук. т. XXXV. Серия Б. Вып. 1. С. 73—86.

7. Будаговский А.В. (2004). Дистанционное межклеточное взаимодействие. НПЛЦ «Техника». М.

8. Бурлаков А.Б., Бурлакова О.В., Голиченков В.А. (1999). Дистантные взаимодействия разновозрастных эмбрионов вьюна. // ДАН. Т. 368. № 4. С. 562-564.

9. И. Бурлаков А.Б. Бурлакова О.В., Голиченков В.А. (2000). Дистантные волновые взаимодействия в раннем эмбриогенезе вьюна Misgurnus fossilis L. // Онтогенез. Т. 31. № 5. С. 340-347.

10. Веселовский В.А., Тарусов Б.Н. (1965). Действие гамма-лучей на сверхслабое свечение проростков ячменя. // Вестн. Моск. ун-та. Биол., почвоведение. № 4. С. 65.

11. Владимиров Ю.А. (1966). Сверхслабые свечения при биохимических реакциях. // Наука, М.

12. Владимиров Ю.А., Арчаков А.И. (1972). Перекисное окисление липидов в биологических мембранах. // Наука, М.

13. Владимиров.Ю.А., Шерстнев М.П. (1989). Хемилюминесценция клеток животных. // Итоги науки и техники, Биофизика, 24.

14. Воейков В.Л. (2001). «Благотворная роль активных форм кислорода.» Российский журнал гастроэнтерологии, гепатологии, колопроктологии, XI (4), 128-135.

15. Воейков В.Л. (2002). Био-физико-химические аспекты старения и долголетия. // Успехи геронтологии, (9), 54-66.

16. Воейков В.Л. (2003). Регуляторные функции активных форм кислорода в крови и в водных модельных системах. // Дисс. на соискание ученой степени докт. биол. наук, М.

17. Гурвич А.А. (1968). Проблема митогенетического излучения как аспект молекулярной биологии. // Медицина, Л.

18. Гурвич А.А., Еремеев В.Ф., Карабчиевский Ю.А. (1974). Энергетические основы митогенетического излучения и его регистрация на фотоэлектронных умножителях //. М. «Медицина»

19. Гурвич А.Г., Гурвич Л.Д. (1934). Митогенетическое излучение. Изд. ВИЭМ. Л. 355 с.

20. Гурвич А.Г., Гурвич Л.Д. (1948). Введение в учение о митогенезе. // Медгиз. М.

21. Гурвич А.Г., Гурвич Л.Д., Залкнид С.Я., Песоченский B.C. (1947). Учение о раковом тушителе. Теория и клиника. Изд. АМН СССР. М. 100 с.

22. Дорфман В., Шмерлинг Ж. (1934). Ритмичность митогенетического излучения в оплодотворенном яйце морского ежа. // Архив Биол. наук. т. XXXV. Серия Б. Вып. 1. С. 149-156.

23. Доскоч Я.Е., Лимбергер Г.Э., Тарусов Б.Н. (1967). Использование сверхслабого свечения для определения морозоустойчивости и теплостойкости плодовых деревьев. // Журн. с.-х. биологии. Т. 2. № 3. С. 423.

24. Журавлев А.И. (1965). Проблемы биолюминесценции. // В кн.: Биолюминесценция, труды МОИП, XXI, 184-191.

25. Журавлев А.И. (1972). Субстраты и механизмы эндогенной (химической) генерации возбужденных электронных состояний и сверхслабого свечения в тканях. // В кн.: Сверхслабые свечения в биологии, Труды МОИП, т. XXXIX, 17-32.

26. Журавлев А.И., Журавлева А.И. (1975). Сверхслабое свечение сыворотки крови и его значение в комплексной диагностике. // М.

27. Залкинд С.Я. (1937). Современное положение митогенетического излучения. // Успехи совр. биологии, 7(2), 216-233.

28. Залкинд С.Я., Франк Г.М. (1930). Митогенетические лучи и деление клеток. // Госиздат. М.-Л. 190 с.

29. Казначеев В.П., Михайлова Л.П. (1981). Сверхслабые излучения при межклеточных взаимодействиях. Наука. Новосибирск.

30. Казначеев В.П., Шурин С.П., Михайлова Л.П., Игнатович Н.В. (1972). О межклеточных дистантных взаимодействиях в системе двух тканевых культур, связанных оптическим контактом. // В кн.: Сверхслабые свечения в биологии, Труды МОИП, т. XXXIX, 224-227.

31. Киркин А.Ф. (1981). Нехимические дистанционные взаимодействия между клетками в культуре. // Биофизика. Т. 26. Вып. 5. С. 839—843.

32. Кузин A.M. (1995). Идеи радиационного гормезиса в атомном веке. М., Наука, 158 с.

33. Кузин A.M., Суркенова Г.Н., Ревин А.Ф. (1994). О значении дистанционного фактора в радиационном гормезисе. // Радиационная биология. Радиоэкология. Т. 34. Вып. 6. С. 832—837.

34. Латманизова Л.В. (1934). Изменение функциональных свойств нерва под влиянием митогенетического агента. // Архив Биол. наук. т. XXXV. Серия Б. Вып. 1. С. 219-228.

35. Лиознер Л.Л., Воронцова М.А., Ирихимович А.И. (1934). Исследования митогенетического излучения крови. // Архив Биол. наук. т. XXXV. Серия Б. Вып. 1. С. 229-238.

36. Мелехова О.П. (1976). Свободнорадикальные процессы в эмбриогенезе. // Онтогенез. Т. 7. № 2. С. 131-140.

37. Мелехова О.П. (2005). Свободнорадикальные процессы в пространственно-временной регуляции развития низших позвоночных. // Дисс. на соискание ученой степени докт. биол. наук, М.

38. Молчанов А.А. (1985). Влияние световых межклеточных взаимодействий на интенсивность экструзии белка секреторными клетками молочной железы. // Вестник ЛГУ. Биология. № 3. Вып. 1. С. 70—74.

39. Мостовников В.А., Хохлов И.В. (1977). Взаимодействие клеток крови человека с помощью волн оптического диапазона. Ин-т физики АН БССР. Минск.

40. Николаев, Ю.А. (1992). Дистантные взаимодействия между клетками бактерий. // Микробиология. Т. 61. Вып. 6. С. 1065—1071.

41. Новиков К.Н. (2004). Роль активных форм кислорода в биологических системах при воздействии факторов окружающей среды. // Дисс. на соискание ученой степени докт. биол. наук, М.

42. Одюбер Р. (1938). Излучение при химических реакциях. // Успехи химии, VII(12), 1858—1883, (пер. статьи опубликованной в Angew. Chemie, 51,153).

43. Песоченский Б.С. (1942). Феномен тушения митогенетического излучения при раке и предраковых состояниях. // Дис. на соискание ученой степени доктора мед. наук. Л.

44. Сапежинский И.И. (1983). Хемилюминесценция при фото- и радиационном окислении белков и других веществ. // В: кн. Биохемилюминесценция, М., Наука, 56-69. (Тр. МОИП, 58).

45. Тарусов Б.Н. (1972). Сверхслабое свечение живых организмов. Знание, М.

46. Тарусов Б.Н., Журавлев А.И. (1965). Биохемилюминесценция липидов. // В сб.: Биолюминесценция. Труды МОИП. Наука. М. С. 125.

47. Тарусов Б.Н., Иванов И.И., Петрусевич Ю.М. (1967). Сверхслабое свечение биологических систем. // Изд-во МГУ, М., 70.

48. Тарусов Б.Н., Поливода А.И., Журавлев А.И. (1961). Изучение сверхслабой спонтанной люминесценции животных клеток. // Биофизика, 6, 490-492.

49. Троицкий Н.А., Конев С., Катибников М. (1961), // Биофизика. Т. 86. С. 238. Цит. по Гурвич А.А. (1968).

50. Франк Г., Родионов С. (1932). Физическое исследование митогенетического окисления мышц и некоторых окислительных моделей. // Франк Г.М., Избранные труды, Наука, М., 1982, 167—185, (пер. статьи опубликованной в Biochem Zeitschrift, Bd 249, S. 323-343).

51. Харитон Ю., Франк Г., Каннегиссер Н. (1930). О длине волны и интенсивности митогенетического излучения. // Франк Г.М., Избранные труды, Наука, М., 1982, 161—166, (пер. статьи опубликованной в Naturwissenschaft., 18 Jg., Н. 19, S. 411-413).

52. Хрущов Г.К. (1934). Митогенетический эффект на тканевых культурах. // Архив Биол. наук. т. XXXV. Серия Б. Вып. 1. С. 317—326.

53. Acs L. Uber die mitogenetische Strshlung der Bakterien. // Centr. F. Bakt. I Abt. Orig. 120. 216.

54. Albrecht-Buehler G. (1991). Surface extensions of 3T3 cells towards distant infrared light sources. // J. Cell Biol., 114(3), 493-502.

55. Albrecht-Buehler G. (1992). Rudimentary form of cellular "vision". // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89. Pp. 8288-8292.

56. Albrecht-Buehler G. (1994). Cellular infrared detector appears to be contained in the centrosome. // Cell Motil. Cytoskelet. Vol. 27. Pp. 262-271.

57. Albrecht-Buehler G. (1995). Changes of cell behavior by near-infrared signals. // Cell Motil Cytoskeleton, 32(4), Pp. 299-304.

58. Albrecht-Buehler G. (1997). Autofluorescence of live purple bacteria in the near infrared. // Exp Cell Res. 236, 43-50.

59. Albrecht-Buehler G. (2000). Reversible excitation light-induced enhancement of fluorescence of live mammalian mitochondria. // FASEB Vol. 14, Pp. 1864-1866.

60. Anikin A. (1926). Das Nervensystem als Quelle u.s.w. // Arch. F. Entwicklungsmech, 108.

61. Bajpai R.P. (1999). Coherent nature of the radiation emitted in delayed luminescence of leaves. // J. theor. Biol. V. 198. P. 287-299.

62. Baron M. (1926). Uber mitogenetische Strahlung bei Protisten. // Ibid., 108.

63. Baron M. (1928). Bakterien als Quellen mitogen. Strahlung. // Centralblatt Bakte-riologie, 73.

64. Baron M. (1929). Ein mitogenetische Makroeffekt. // Naturwissenschaften., 17. Jahgr., H. 27.

65. Barth H. (1934). Versuche zum physikalischen Nachweis von mitogenetischer Strahlung. // Arch Sciences Biol, S.35.

66. Barth H., Glasser O. (1939). Weitere Studien zum Problem der mitogenetischen Strahlung. // Radiology. Vol. 33, Pp. 25-33.

67. Becher О. (1952). 11 Biol. Zbl. 76. 2. Цит. по Гурвич A.A. (1968).

68. Beloussov L.V., Baskakov I.V. (1995) A reproduction of the mitogenetic experiments of the Gurwitsch's scholl on frog and fish cleaving eggs. // In: Biophotonics, Eds. L.V. Beloussov, F.A. Popp, Moscow, Bioinform Services, 191—200.

69. Beloussov L.V., Luchinskaya N.N., Ermakov A.S., Glagoleva N.S. (2006). Gastrulation in amphibian embryos, regarded as a succession of biomechanical feedback events. // Int. J. Dev. Biol. V. 50. Pp. 113-122.

70. Brunetti R., Maxia C. (1930). Sulla fotografia e la accitazione della radiazioni del Gurwitsch. // Atti Soc. Cult. Sci. Med. E natur. Cagliari., 29.

71. Colli L., Facchini U. (1954). Light emission by germinating plants. // Nuovo cimento. V. 12. P. 150.

72. Elster J., Geitler H., (1916). Uber Stromschwankungen in Vakuumrohren bei Gegenwart von Alkalimetallen, ihre Bedeutung fur den Entladunsvorgang und fur die Messung ausserst kleiner Lichtintensitaten. // Phys. Ztschr., Bd, 17, H. 3, 268— 276.

73. Farhadi A., Forsyth C., Banan A., Shaikh M., Engen P., Fields J.Z., Keshavarzian A. (2007). Evidence for non-chemical, non-electrical intercellular signaling in intestinal epithelial cells. // Bioelectrochemistry. Vol. 71, Pp. 142-148.

74. Frank G., (1929). Das mitogenetische Reizminimum und- maximum und die Welletlange Mitogenetischen Strahlen. // Biol Zentralbl., Bd. 49, H. 3.

75. Frank G., Gurwitsch A. (1927). Zur Frage der Identitat mitogenetischer und ultravio-letter Strahlen. // Roux' Arch., Bd. 109, H. 3, S. 451-454.

76. Frank G., Rodionov S. (1932). Physikalische Untersuchung mitogenetischer Strahlung der Muskeln und eininger Oxydationsmodelle Biochem. // Z. 249,321.

77. Frank G., Salkid S. (1927). Mitogenetische Strahlung der Seerigeleier. // Ibid., 110.

78. Frankenburger W. (1933). Neuere Ansichten uber das Wesen photochemischer

79. Prosseze und ihre Bedeutung zu biologischeb Vorgangen. Strhlentherapie. 11 Bd. 47, S. 2.

80. Galantsev V. P., Kovalenko S. G., Moltchanov A. A., Prutskov V. I. (1993). Lipid peroxidation, low-level chemiluminescence and regulation of secretion in the mammary gland. // Experientia, 49,870-875.

81. Galle M. (1992.). Population density-dependence of biophoton emission from Daph-nia. // Recent Advances in Biophoton Research and its Applications (F.-A. Popp, K.H. Li and Q. Gu eds). World Scientific. Singapore etc. Pp. 345-356.

82. Gesenius H. (1929). Uber Stoffwechselwirkungen mitogen. Strahlen. // Biochem. Zeitschr., 212.

83. Gilento G. (1988). Photobiochemistry whithout light. // Experentia. 44, Pp 572-576.

84. Grasso F., Musumeci F., Triglia A., Yanbastiev M., Borisova S. (1991). Self-irradiation effect on yeast cells. // Photochemistry and Photobiology. V. 54. P. 147-149.

85. Grebe L., Krost A., Peukert L. (1937). Versuche zum physikalischen Nachweis der mitogenetischen Strahlung. // Strahlentherapie. Vol. 60, Pp. 575-581.

86. Gurwitsch A. (1923). Die Natur des specifischen Erregers der Zellteilung. // Roux' Archiv. 100.11.

87. Gurwitsch A. (1924). Physikalishes uber mitogenetische Strahlen. // Arch. Mikrosk. Anat. Und Entwicklungsmeh., Bd. 103, H. 3/4, S. 490-498.

88. Gurwitsch A.G., Frank G.M. (1927). Sur les rayons mitogenetiques et ler identite avec les rayons ultraviolets. // Compt rend Acad Sci, 184,903-904.

89. Gurwitsch A.G., Frenkel J.I. (1943). The physico-chemical basis of mitogenetic radiation. // Trans Farad Soc, 39, 201-204.

90. Gurwitsch A., Gurwitsch L. (1925). Uber den Ursprung der mitogenetischen Strahlen. // Arch. Mikrosk. Anat. Und Entwicklungsmeh., Bd. 105, H. 2, S. 470-472.

91. Gurwitsch A.G., Gurwitsch L.D. (1939). Ultraviolet chemiluminescence. // Nature, 143, 1022-1023.

92. Gurwitsch L., Anikin A. (1928). Das Cornealepithel als Detektor und Sender mito-genet. Strahlung. // Ibid., 113.

93. Hollaender A., Claus W.D. (1937). An experimental study of the problem of mitogenetic radiation. I I Bulletin of the National Research Council, Washington, No. 100.1.

94. Inaba H. (1995). Ultraweak biophoton imaging and information characterization // Ultrafast and Ultra-Parallel Optoelectronics (T. Sueta and T. Okoshi eds) Oh-msa/John Wiley & Sons. Tokyo. Pp. 570-580.

95. Kannegiesser N. (1927). Die mitogenetische Spektralanalyse. I. // Biochem. Ztschr. Bd. 236, S. 415-424.

96. Magrou I., Magrou M. (1927). Radiations mitogenetiques et genese des tumeurs. // Compt. Rend, de I'Acad. de Sc., 189.

97. Magrou I., Magrou M., Reiss P. (1929). Action a distance de divers facteurs sur le developpement des oeufs d'oursin. // Compt. Rend, de I'Acad. de Sc., 184.

98. Magrou J. (1932). Action a distance et embryogenese. // Radiobiologia. V. 1. Pp. 32-38.

99. Maxia C. (1929a). Conferma dell'existenza della radiaz. mitogen. // Monit. Zool. Ital., XL.

100. Maxia C. (1929b). Intensificazione della segmentazione di uova di Paracentrotus LividussoVio I'influenza di radiazione mitogenetiche. I IR. Comit. Tallassigraf. Italino, Memoria CLV.

101. Mieg R., Mei W.P., Popp F.A. (1992). Technical notes to biophoton emission. // In: Recent Advances in Biophoton Research and its Application. World Scientific Publishing Co. Pte. Ltd. Pp 197-205.

102. Naville A. (1929). Les rayons mitogeetiquesA expose de quelques resultats. // Revue Suisse de Zoologie., 36.

103. Nikolaev Yu.A. (2000). Distant interaction in the bacterium Pseudomonas fluoresces as a factor of adhesion regulation. // In: Biophotonics and Coherent Systems

104. V. Beloussov, F.-A. Popp and R. van Wijk eds). Moscow University Press. Moscow. P. 259-266.

105. Orel V.E., Dzyatkovskay N.N. (2000). Mechanoemission of blood and oncogenesis. // In: Biophotonics and Coherent Systems (L.V. Beloussov, F.-A. Popp and R. van Wijk eds). Moscow University Press. Moscow. P. 347-364.

106. Popp, F.-A., Chang J.J., Herzog A., Yan Z., Yan Y. (2002). Evidence of non-classical (squeezed) light in biological systems. // Physics Letters A. V. 293. P. 98-102.

107. Popp F.A., Gu Q., Li K.H. (1994). Biophoton emission: experimental background and theoretical approaches. // Modern Physics Letters В., 8(21), & 22, 1269-1296.

108. Popp, F.A., Li K.H. (1993). Hyperbolic relaxation as a sufficient condition of a fully coherent ergodic field. // J. theor. Physics. V. 32. P. 1573-1583.

109. Popp F.A., Ruth В., Bahr W., Bohm J., Gra(3 P., Grolig G., Rattemayer M., Shmidt H.G., Wulle P. (1981). Emission of visible and ultraviolet radiation by active biological systems. // Collective phenomena. Vol. 3, Ppl87-214.

110. Protti G. (1930). Communicazione alia Seduta scientifica dell'Ospidale Civile di Venezia. // XVIII, 7 Marz, 6 Mai.

111. Oonuki M., Ryuzaki M. (1992). Cortical photons in early development of frog eggs: comparative study of photon emission between nuclear division and cytoplasmic fission. // J. Cell. Physiol. V. 153. Pp. 518-522.

112. Quickenden T.I., Que-Hee S.S. (1976). The spectral distribution of the luminescence emitted during growth of the yeast Saccharomyces cerevisiae and its relationship to mitogenetic radiation. // Photochemistry and Photobiology. Vol. 23, Pp. 201-204.

113. Rahn. О. (1936). Invisible radiations of organisms. // Gebruder Borntraeger, Berlin.

114. Rajewsky B. (1930). Anordnung zur Messung kleinster Lichtintensitaten. // Strahlentherapie., Bd. 53, H. 7/8, S. 576.

115. Rajewsky B. (1931b). Ultraviolett-Stahlung des eiweiss. // Klin. Wochenschr., Jg. 10, H. 32, S. 1672-8.

116. Rawin W. (1924). Weitere Beitrage u.s.w. // Arch. F. Entwicklungsmech., 101.

117. Reiter Т., Gabor D. (1928). Zellteilug und Strahlung. // Sonderheft der Wessenschaftl.: Veroffentlichungen des Siemens — Konzern. В.: Verl. J. Springer.

118. Salkind S. (1925). Weitere Untersuchungen u.s.w. // Ibid., 104.

119. Salkind S. (1925). Uber den Rhytmus der mitogen. Strahlung bei bei der Entwick-lung u.s.w. // Ibid., 115.

120. Schreiber H., Friedrich W. (1930). Das Cornealepithel als Detektor und Sender mi-togenet. Strahlung. // Ibid., 113.

121. Sewertzowa L. (1928). Ober Nachweis und Intensitat der mitogenetischen Strahlung. // Biochem. Ztschr., Bd. 227, S. 386—400.

122. Siebert W.W., Seffert H. (1933). Physikalischer Nachweis der Gurwitsch-Strahlung mit Hilfe eines Differenzverfahrens. // Naturwis. H. 21. P 193. Цит. no: Гурвич А.Г., Гурвич Л.Д. (1934); Rahn (1936).

123. Siebert W.W., Seffert H. (1934). Zur Frage des Physikalischen Nachweis der Gurwitsch-Strahlung. // Arch. Sci. Biol. H. 35. S 177. Цит. no: Rahn (1936).

124. Slawinski J, (1988). Luminescence research and its relation to ultraweak cell radiation. // Experientia, 44, 559-571.

125. Slawinski J. (1990) Necrotic photon emission in stress and lethal interactions // Curr. Topics Biophys. V. 19. Pp. 8-27.

126. Slawinski J., Popp F. A. (1987). Temperature hysteresis of low level luminescencefrom plants and its thermodynamical analysis. I I Journal of Plant Physiology, 130, 111-117.

127. Trushin M.V. (2003). The possible role of electromagnetic fields in bacterial communication. // Journal of Microbiology, Immunology and Infection. V. 36. Pp. 153-160.

128. Trushin M.V. (2004). Distant non-chemical communication in various biological systems // Riv. Biol/Biol. Forum. V. 97(4). Pp. 399-432.

129. Veselovsky V.A., Veselova T.V. (1995). Spontaneous ultraweak light emission from plant tissues. // In: Biophotonics, Eds. L.V. Beloussov, F.A. Popp, Moscow, Bioinform Services, 267—276.

130. Vogel R., Sussmuth R. (1998). Weak light emission from bacteria and their interaction with culture media // Biophotons (Jiin-Ju Chang, J. Fish and F.-A. Popp eds) Kluwer Acad. Publ. Dordrecht/Boston/London. 1998. Pp. 19-46.

131. Wainwright M., Killham K., Russel C., Grayston J. (1997). Partial evidence for the existence of mitogenetic radiation. // Microbiology. V.143. P. 1-3.

132. Westenberg (1937). Цит. no 22,19].

133. Westenberg (1941). Цит. no 22,19].

134. Wolff I.K., Ras G. (1931). Einige Untersuehungen fiber die mitogenetischen Strahlen von Gurwitsch. // Zentr. Bakt. I. Orig. H. 123, S. 257.

135. Xun S., Mei W., Xun X. (1994). Activation of neutrophils by a chemically separated but optically coupled neutrophil population undergoing respiratory burst. // Experi-entia. V. 50. P. 963-968.

136. Вспомогательная литература

137. Айфичер Э., Джервис Б. (2004). Цифровая обработка сигналов: Практический подход. Изд. Дом «Вильяме». М.-СПб.-Киев.

138. Варден ван ден Б.Л. (I960). Математическая статистика. // М. Изд. Иностранной литературы.

139. Детлаф Т.А., Руднева Т.Б. (1973). Безразмерная характеристика продолжительности развития шпорцевой лягушки. // Онтогенез. Т. 4, № 5. С. 461-471.

140. Ландсберг Г.С. (1976). Оптика. Физматлит, М.

141. Объекты биологии развития. (1975). Наука. М.

142. Парфианович И.А., Саломатов В.М. (1975). Люминесценция кристаллических веществ. (Учебное пособие). Иркутск.

143. Петров Г.Н., Острун Б.Н. (2007). Оптические характеристики КУ (Кварцевое стекло). // http://www.optotechnolab.rU/mat/Si021#2.

144. Сергиенко А.Б. (2005). Цифровая обработка сигналов. Учебник для ВУЗов. Питер. М., СПб. И др.

145. Alberts В., Bray D., Lewis J., Raff M., Roberts K., Watson J.D. (1994). Molecular biology of the cell. (3-th edition) // Garland of Publishing Inc., New York, London.

146. Gilbert S.F. (2003). Developmental Biology. Sinauer Associates, Inc., Sunderland, MA.

147. Hollander M., Wolfe D. A. (1973). Nonparametric statistical methods. // Wiley.

148. Lilliefors H.W. (1967). On the Komogorov-Smirnov test for normality with mean and variance unknown. // Journal of the American Statistical Association, Vol. 62, Pp. 399-402.

149. Nieuwkoop P.D., Faber, J. (1956). Normal table of Xenopus laevis (Daudin) // North Nolland. Amsterdam.

Информация о работе

Володяев, Илья Владимирович
кандидата биологических наук
Москва, 2007
ВАК 03.00.30

Диссертация

Сверхслабое излучение и оптическое взаимодействие яйцеклеток и зародышей шпорцевой лягушки - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы