Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Структуры комплексов бактериальных формиатдегидрогеназ с коферментом и субстратом

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Структуры комплексов бактериальных формиатдегидрогеназ с коферментом и субстратом"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ МОЛЕКУЛЯРНОЙ БИОЛОГИИ им. В.А. Энгельгардта

На правах рукописи

Филиппова Екатерина Валерьевна

СТРУКТУРЫ КОМПЛЕКСОВ БАКТЕРИАЛЬНЫХ ФОРМИАТДЕГИДРОГЕНАЗ С КОФЕРМЕНТОМ И СУБСТРАТОМ

Специальность 03.00.03 - «Молекулярная биология»

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата физико-математических наук

Москва 2006

Работа выполнена в Институте молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН

Научный руководитель: кандидат физико-математических наук

K.M. Поляков

Научный консультант: доктор химических наук, профессор

В.О. Попов

(Институт биохимии им. А.Н. Баха РАН)

Официальные оппоненты: доктор химических наук

Т.В. Демидкина

(Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН) доктор физико-математических наук В.Р. Мелик-Адамян (Институт кристаллографии им. A.B. Шубникова РАН)

Ведущая организация: Институт белка РАН

Защита диссертации состоится «2^» октября 2006г. в У/-00 на заседании Диссертационного Совета Д 002.235.01

при Институте молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН по адресу: 119991 Москва, ул. Вавилова, 32

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН.

Автореферат разослан « » сентября 2006г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

кандидат химических наук ' ' ___А^Я.Крицын

Актуальность работы. NAD^-записимая формиатдегидрогеназа (FDH) катализирует реакцию окисления формиат-иона до углекислого газа при сопряженном восстановлении никотинамидадениндинуклеотида (NAD+) до NADH. В метилотрофных организмах реакция, катализируемая FDH, является одним из основных источников энергии. FDH является хорошо изученным в биохимическом плане ферментом. Схожие по физико-химическим свойствам формиатдегидрогеназы были обнаружены в разных организмах, включая, бактерии, дрожжи, грибы, высшие растения и млекопитающих. FDH из метилотрофных бактерий является одним из наиболее интенсивно изучаемых ферментов из числа КА0+-зависимых дегидрогеназ и используется в качестве универсального биокатализатора для регенерации NADH в процессах ферментативного синтеза оптически активных соединений.

FDH относится к суперсемейству D-специфичных дегидрогеназ и имеет схожую структурную организацию с белками данного семейства. В силу простоты структуры субстрата (формиат-иона) и отсутствия в ходе каталитической реакции стадий переноса протонов FDH изучается как модельный фермент для выяснения основных закономерностей переноса гидрид-иона в активном центре D-специфичных дегидрогеназ.

На сегодняшний момент детально исследованы две пространственные структуры FDH из метилотрофных бактерий Pseudomonas sp.101: свободный фермент (код PDB - 2NAC) и тройной комплекс FDI 1-ЫАО+-азид-ион (код PDB - 2NAD). На основе данных структур был предложен механизм катализа FDH и, было показано, что в ходе реакции молекула фермента претерпевает значительные конформационные перестройки. Несмотря на то, что FDH является хорошо изученным объектом, многие аспекты в механизме его действия остаются непонятными. Не выясненными остаются роль некоторых каталитически важных аминокислотных остатков активного центра фермента, как происходит связывание молекулы кофермента и субстрата в двойных комплексах FDH-NAD4" и FDH-формиат, причины конформационных изменений структуры во время ферментативной реакции.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы было определение структур двойных и тройных комплексов FDH из метилотрофных бактерий Pseudomonas sp.101 и Moraxella sp.C2 с формиатом, NAD+, аналогом NAD+ (NADH), а также изучению структур мутантных форм FDH из бактерий Pseudomonas sp.101. Для выполнения работы были сформулированы следующие задачи: 1) получение кристаллов комплексов FDH из метилотрофных бактерий Pseudomonas sp.101 и Moraxella sp.C2 с формиатом, NAD+, кристаллы мутантных форм FDH из бактерий Pseudomonas sp.101 и их комплексов с NADH; 2) решение структур полученных комплексов; 3) сравнение структур активных центров и структур молекул близкородственных FDH; 4) исследование свободного фермента, двойных и тройных комплексов FDH методом малоуглового рентгеновского рассеяния.

Научная ценность и практическая значимость работы. Впервые решена и охарактеризована структура двойного комплекса фермента с субстратом (формиат-ионом). Обнаружены два места связывания субстрата в активном центре FDH. Впервые определены структуры свободного фермента и тройного комплекса с NAD+ и азид-ионом FDH из метилотрофных бактерий Moraxella sp. С2. Полученные данные позволили уточнить структуру тройного комплекса FDH-NAD+-a3U4-noH и получить новую информацию о строении активного центра фермента. Показано участие каталитически важного остатка гистидина (332) в связывании молекулы субстрата (формиат-иона) и выяснена роль С-концевого участка молекулы FDH в связывании кофермента (NAD+). Впервые решены структуры мутантных форм FDH из бактерий Pseudomonas sp.101, содержащие замены в области активного центра и на поверхности белка. В работе проведен сравнительный анализ двух бактериальных FDH, выявлены общие закономерности и различия в пространственной организации близкородственных ферментов и в их взаимодействии с NAD+ и формиатом. Полученные результаты позволяют расширить представление о молекулярном механизме катализа и понять причины конформационных изменений структуры молекулы FDH в ходе реакции.

Полученные в данной работе три структуры были занесены в PDB (Банк Трехмерных Структур Белков) и могут быть использованы в качестве модели для решения структур FDH из других организмов и ферментов семейства D-специфичных дегидрогеназ. Структура двойного комплекса FDH из бактерий Pseudomonas sp.101 с формиатом и структура тройного комплекса FDH из бактерий Moraxella sp.C2 с NAD+ и ионом азида могут служить моделью для изучения механизма катализа и выяснения основных закономерностей переноса гидрид-иона в активном центре D-специфичных дегидрогеназ. Апробация работы. Результаты работы были представлены на IV Национальной конференции по применению рентгеновского, синхротронного излучений, нейтронов и электронов для исследования материалов (Москва -Россия, 2003), на международной конференции «Biocatalysis-2005: Fundamentals and Applications» (Санкт-Петербург — Россия, 2005), на международной школе-конференции молодых ученых по системной биологии и биоинженерии (Москва - Россия, 2005).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано четыре печатные работы. Атомные координаты трех структур депонированы в Банк Белковых Структур.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, трех глав, выводов и списка литературы. Объем диссертации составляет 110 страниц и содержит 36 рисунков и 11 таблиц. Список цитируемой литературы содержит 102 наименования.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во введении обсуждена актуальность темы диссертации, сформулированы цели и задачи исследования.

Глава 1 посвящена обзору литературы по структурам ферментов семейства D-специфичных дегидрогеназ 2-гидроксикислот. В первой части литературного обзора описаны пространственные структуры и особенности структурной организации молекул ферментов семейства D-специфичных дегидрогеназ. Описано связывание молекулы кофермента (NAD+) и субстратов с D-специфичными дегидрогеназами. Вторая часть литературного обзора включает в себя описание пространственных структур FDH из бактерий Pseudomonas sp.101 и их сравнение со структурами D-специфичных дегидрогеназ. Охарактеризована структура активного центра FDH и модель связывания формиат-иона в активном центре фермента.

В главе 2 представлены материалы и методы исследования. Описана кристаллизация комплексов FDH, сбор дифракционных данных от кристаллов, решение и уточнение структур комплексов FDH из бактерий Pseudomonas sp.101 (FDHP) и Moraxella sp.C2 (FDHM), мутантных форм FDHP, а также проведение съемки и обработки данных малоуглового рассеяния соответствующих холокомплексов FDH.

Кристаллизация и сбор дифракционных данных. Кристаллы FDH получали методом равновесной диффузии через газовую фазу в висячих и сидячих каплях. В таблице 1 представлены условия кристаллизации полученных кристаллов FDH. Все комплексы FDH получали методом сокристаллизации. Соотношение резервуарного раствора и раствора белка в капле было 1:1. Белок растворяли в 0,05М К фосфатном буфере (pH 7,5).

Наборы дифракционных данных были собраны с кристаллов двойных комплексов FDHP с NADH, формиатом, тройного комплекса FDHP с формиатом и NADH, двух мутантных форм FDHP Т7 и GAV, двойного комплекса мутанта FDHP GAV с NADH и двух тройных комплексов FDHM-ADPR-формиат и FDHM-NAD^-азид-ион. Дифракционные данные от кристаллов комплекса FDHP с NADH, формиатом, тройного комплекса FDHP с формиатом и NADH, и тройного комплекса FDHM с ADPR и формиатом были получены с использованием CCD детектора на станции XI3 накопительного кольца DORIS синхротрона DESY (г. Гамбург, Германия) на длине волны 0,8019А при температуре жидкого азота (110 К). Дифракционные данные с кристаллов двух мутантов FDHP Т7 и GAV и с кристалла комплекса мутанта FDHP GAV с NADH были получены с использованием CCD детектора на станции COM CAT (32) накопительного кольца синхротрона Национальной Лаборатории Аргон (г. Чикаго, США) на длине волны 0,9793Ä при температуре жидкого азота. Дифракционные данные с кристаллов тройного комплекса FDHM с NAD+ и азид-ионом были получены с использованием IMAGE PLATE

MAR 345 на источнике рентгеновского излучения ELLIOTT GX-6 с вращающимся анодом в Институте белка РАН (г. Пущино, Моск. обл.) на длине волны 1,5418А при комнатной температуре. Данные обрабатывались программами DENZO, SCALEPACK, XSCALE. Статистические характеристики набора дифракционных данных от кристаллов полученных комплексов FDHP и FDHM представлены в таблице 2.

Таблица 1. Условия кристаллизации комплексов и мутантов FDH.

Комплекс, мутант Температура (°C) Концентрация белка в капле (мг/мл) Состав противораствора в капле

FDHP-NADH 16-17 9,6 48% (от насыщ.) сульфата аммония, 8% МПД, 5цМ NADH, 0,1 M HEPES рН 7,3

FDHP-формиат 11 9,6 17% (от насыщ.) сульфата аммония, 0,85% ПЭГ, 2цМ Na формиат, 0,1М HEPES рН 7,3

FDHP-формиат-NADH 20 8,5 18,5% (от насыщ.) сульфата аммония, 0,8% ПЭГ, 2цМ Na формиат, 0,1М HEPES рН 7,4

FDHP Т7 20 3,35 0,2М ацетат аммония, 12,5% ПЭГ3350, 0,1M Bis-Tris рН 6,5

FDHP GAV 20 8,82 0,2М ацетат аммония, 12,5% ПЭГ3350, 0,1 M HEPES рН 7,5

FDHP 11-NADH 20 3,35 0,2М ацетат аммония, 12,5% ПЭГ3350, 5цМ NADH, 0,1М HEPES рН 7,5

FDHP GAV-NADH 20 8,82 0,056М Na фосфат, 1.344М К фосфат

FDHM-ADPR- формиат 20 4 0,1 M ацетат аммония, 21% ПЭГ 8000, 2,5цМ ADPR, 5 цМ формиат, 0,1М Bis-Tris рН 5,5

FDHM-NAD+-азид-ион 20 8,5 2,ЗМ сульфат аммония, 5цМ NAD+, 5цМ азид, 0,1М Bis-Tris рН 6.5

Решение и уточнение структур. Структуры FDHP и FDHM были решены методом молекулярного замещения по программе MOLREP. Исходной моделью для всех структур, кроме структуры комплекса FDHM с NAD+ и азид-ионом, служила структура молекулы апо-формы фермента (код PDB - 2NAC), для структуры тройного комплекса FDHM с NAD+ и ионом азида моделью была структура холо-формы FDHP (код PDB - 2NAD). Кристаллографическое уточнение структур проводили по программе REFMAC. Для визуального контроля над ходом уточнения, внесения существенных изменений в атомную модель структур и локализации молекул воды использовали программы О, COOT и TURBOFRODO. Статистические характеристики уточнения структур приведены в таблице 2.

Таблица 2. Статистические характеристики набора дифракционных данных и уточнения структур РБН.

Структура FDH FDHP FDHP FDHP FDHP FDHP FDHP FDHM FDHM

NADH форм NADH Т7 GAV GAV ADPR NAD*

форм NADH форм азид

Разрешение, А 2,1 2,19 2,28 2,31 2,39 3,1 2,3 1,95

Общее число измеренных 115593 119473 110635 119943 96266 55892 107292 65949

рефлексов

Полнота, % 94,3 98,1 97,9 99,8 96,41 96,6 96 99,3

Пр. Гр. Р422,2 Р2| Р2, С2, С2, P2, P2, C2,

Параметры ячейки:

а, А 93,3 117,85 117 143,33 142,63 69,06 77,9 80,45

b, А 93,3 57,94 54,98 53,65 53,83 54,71 123,5 66,5

с, А 103,05 132,62 128,91 117,01 116,66 109,24 85,3 75,55

fc° 95,38 95,74 122,94 123,21 101,48 95,8 103,57

Rftctor, % 20,7 22,3 20,5 16,1 17,9 20,7 23,12 14,2

Rftte, % 25,0 27,9 27,6 22,5 24,5 30,5 32,7 18,4

RMS длин связей, А 0,02 0,019 0,019 0,02 0,02 0,02 0,019 0,018

RMS валентных углов (°) 1,9 1,7 1,8 1,8 1,8 1,9 1,9 1,6

Число рефлексов:

В уточнении 24447 85999 69594 31161 27164 13512 64841 26730

В расчете Rfrec 1321 4083 3582 1583 1412 708 3451 1359

Ошибка в координатах 0,21 0,22 0,29 0,2 0,26 0,49 0,33 0,167

Число атомов в молекуле 2923 11566 11530 11658 11614 11661 12101 3325

белка

Число молекул ПЭГ - 1 8 12 4 - - -

Число молекул воды 181 303 359 317 276 78 480 181

Средний В-фактор, А2:

для всех атомов 30,7 42 36,7 26,7 30,5 21,5 36,9 18,9

атомов осн. цепи 29,4 41,2 36,1 25,2 30,1 21,2 36,9 17,4

атомов бок. цепей 31,1 42,8 37,3 28,1 30,8 22,2 37,1 20,4

молекул воды 37,1 42,5 34,4 30,6 27,3 20,2 34,2 27,4

Съемка и обработка данных малоуглового рассеяния. Для эксперимента были приготовлены препараты гомогенного фермента FDHP концентрацией 5 и 10 мг/мл. Исследовались комплексы для каждой концентрации FDHP с NAD+, НАВ+-азид-ионом, NADH, ADPR, ADPR-формиатом.

Съемку образцов проводили на станции ХЗЗ накопительного кольца DORIS синхротрона DESY (г. Гамбург, Германия). Обработку и анализ данных малоуглового рассеяния проводили по программе PRIMUS. Для расчета теоретических кривых рассеяния для свободного белка и холокомплекса с NAD+ и азид-ионом FDHP использовали структуры апо- и холо-форм FDHP (PDB код: 2NAC и 2NAD). Теоретические кривые рассчитывали программой CRYSOL.

Глава 3 диссертационной работы посвящена результатам исследования полученных структур комплексов FDH из метилотрофных бактерий Pseudomonas sp. 101 vi Moraxella sp. C2.

Структура новой кристаллической модификации апо-формы РБНР. При

попытке получения комплекса РБНР с продуктом ферментативной реакции NADH была получена новая кристаллическая структура апо-формы РБНР с пространственной группой Р422[2 с разрешением 2,1А и уточнена до Кгасюг=20,7% (Таблица 2). В отличие от структур апо- и холо-форм РБНР, которые в независимой части элементарной ячейки содержат молекулу димера [1], в исследуемой структуре БВПР в независимой части элементарной ячейки содержится одна субъединица димера. Упаковка молекул РБНР в ячейке показана на рисунке 1.

Рис. 1. Стереоизображение упаковки молекул ГОНР в элементарной ячейке, молекула димера показана толстой линией.

Данная структура является первой структурой РБН, в которой биологически активный димер образуют субъединицы, связанные диагональной кристаллографической осью симметрии второго порядка. Сравнительный анализ и анализ контактов с симметричным окружением молекул в кристалле показал, что структура молекул димера двух апо-форм БВНР в разных пространственных группах одинакова. Кристаллографическое окружение молекул локально влияет на конформацию отдельных участков полипептидной цепи на поверхности белка и не влияет на конформацию молекулы в целом.

Структура комплекса ГОНР с формиат-ионом. Были получены две структуры комплексов РБНР с формиат-ионом, решенные при разрешении 2,19А и 2,28А, соответственно РБНР1 и РБНР2 (Таблица 2). Данные структуры являются первыми из числа исследованных Б-специфичных дегидрогеназ в комплексе фермента с субстратом. Кристаллы РБНР1 были получены при сокристаллизации фермента с формиатом (Таблица 1). Кристаллы РБНР2 были

получены при сокристаллизации фермента с NADH и формиатом (Таблица 1). Однако молекулу NADH в этой структуре не удалось локализовать по картам электронной плотности. Обе структуры в независимой части элементарной ячейки содержат два димера (А и В) и (С и D) подобные димеру апо-формы FDHP [1].

В отличие от структуры апо-формы отдельные субъединицы в молекулах димеров не идентичны. Отличие наблюдается в положении петли, образованной аминокислотными остатками с 256 по 263. В субъединицах В и D эти остатки не локализованы по карте электронной плотности. Во всех субъединицах полученных структур FDHP1 и FDHP2 было обнаружено, что атом серы остатка Cys354 окислен до SO3. Данные по направленному мутагенезу остатка Cys354 показали, что он не является существенным для проявления каталитической активности. Химическая модификация или замена Cys354 на остатки Ser и Ala не влияют на величину кса1, но приводят к увеличению величины Км по формиату в 1,5-2 раза и снижают его термостабильность в 1,3-2 раза.

По карте электронной плотности в районе активного центра была обнаружена молекула формиата в четырех субъединицах структуры FDHP1 и в трех субъединицах FDHP2. В структурах FDHP1 и FDHP2 молекула формиата связывается различным образом в районе активного центра фермента. Расстояние между атомами углеродов формиат-ионов в активном центре структуры FDHP равно 5Ä.

В структуре FDHP1 формиат-ион был локализован в области петли, образованной остатками с 200 по 203, расположенной в кофермент-связывающем канале. На рисунке 2а показано место связывания молекулы формиата в структуре FDHP1. В структуре тройного комплекса холо-формы FDHP-NAD+-a3Hfl-noH этот участок контактирует с пирофосфатной частью молекулы NAD+ [ 1 ].

Молекула формиата во всех субъединицах FDHP1 связывается одинаково. Схема связывания формиата в активном центре FDHP1 представлена на рисунке 2Ь. Атом Ol формиат-иона образует водородные связи с атомами азота основной цепи остатков Gly200 и Gly203. Атом 02 молекулы формиата образует водородную связь с атомом N остатка Ие202.

В отличие от FDHP1 в структуре FDHP2 молекула формиата была обнаружена в каталитическом центре вблизи короткой петли, образованной 123-125 остатками. На рисунке За показано положение формиата в структуре FDHP2.

Положение формиата в структуре FDHP2 почти идентично положению азид-иона в тройном комплексе холо-формы FDHP [1]. Схема связывания формиата в активном центре FDHP2 представлена на рисунке ЗЬ. Во всех трех субъединицах (А, В, С) белка формиат связывается одинаково. Атом кислорода 02 образует водородные связи с атомом азота остатка Asp 146 и азотом

основной цепи lie 122. Атом OI формиата через молекулу воды образует водородную связь с остатком His332.

При сравнении структур активных центров в FDHP1 и FDHP2 и ранее исследованных FDHP не были обнаружены изменения конформации остатков активного центра, существенных для катализа FDHP.

Все субъединицы FDHP в структурах комплексов с формиат-ионом имеют открытую конформацию, аналогичную конформации молекул в структурах апо-форм FDHP. Связывание формиат-иона не приводит к изменению конформации фермента. Полученные структуры показывают, что в отсутствие кофермента (NAD+) формиат-ион может связываться как продуктивно (аналогично связыванию молекулы азид-иона в структуре тройного комплекса FDHP), так и в другом месте (FDHP1) активного центра фермента.

Структура мутантных форм FDHP. Методом направленного мутагенеза в группе генетической инженерии и белкового дизайна профессора В.И. Тишкова (МГУ им. М.В. Ломоносова) было получено более 60 мутантов FDHP и изучены их кинетические и термодинамические характеристики [2]. На основе анализа этих данных были сделаны два мутанта бактериальной FDHP с множественными аминокислотными заменами, содержащимися в области активного центра и на поверхности фермента: FDHP Т7, FDHP GAV. Были получены структуры этих мутантов и структура двойного комплекса мутанта GAV FDHP с NADH.

Структуры мутантов FDHP Т7 и GAV были решены с разрешением 2,3Á и 2.39Á, соответственно (Таблица 2). Структура комплекса мутанта FDHP GAV с NADH была решена с разрешением 3,1Á (Таблица 2). Структуры мутантов FDHP Т7 и GAV и двойного комплекса FDHP GAV с NADH в независимой части элементарной ячейки содержат две субъединицы, которые образуют димер. Обе субъединицы в димере имеют открытую конформацию и похожи на структуру таковых в димере апо-формы FDHP [1]. Сравнительный анализ структур мутантов со структурами ano- и холо-формы FDHP показал, что замены не приводят к изменению конформации структуры в мутантах FDHP.

В структуре двойного комплекса FDHP GAV с NADH были локализованы пирофосфат и рибоза никотиновой части молекулы NADH в одной из субъединиц димера (В) и пирофосфат в другой субъединице (А). Основания и рибоза аденина не локализованы на карте электронной плотности из-за того, что эта часть молекулы NADH имеет несколько конформаций. Положение пирофосфата и рибозы никотиновой части молекулы NADH в структуре комплекса показано на рисунке 4. Атом кислорода 02 пирофосфата адениновой части NADH образует водородную связь с атомом NH1 Arg201, атом OI никотиновой части образует водородные связи с атомами азота основной цепи остатков Arg201, Gly202, атом Ó2 с атомом кислорода остатка Serl47 OG. Рибоза не образует в структуре ни одной водородной связи. Положение пирофосфата и рибозы в структуре комплекса FDHP GAV с NADH аналогично

а)

АН1254

Ь)

Рис. 2. а) Положение формиат-иона в активном центре РОНР1. Карта электронной плотности 2Р„-РС дана с уровнем срезки 1 о. Ь) Схема связывания формиата в активном центре 1ТОНР1.

N146

С123

а)

Аяп 146

Ь)

Рис. 3. а) Связывание формиат-иона в активном центре ГОНР2. Карта электронной плотности 2Г0-РС дана с уровнем срезки 1о. Ь) Схема связывания формиат-иона в активном центре ГОНР2.

Рис. 4. Положение молекулы NADH в структуре мутанта ГОНР СЛУ. Карта электронной плотности 2К„-КС показана с уровнем срезки 1<т.

Рис. 5. Упаковка молекул К1>НМ в независимой части элементарной ячейки.

Ь)

Рис. 6. а) Связывание формиат-иона в субъединице (В) структуры Г[)НМ. Карта электронной плотности показана с уровнем срезки 1<т. Ъ) Положение формиат-иона

в структуре КОНМ (в модели цвета соответствуют типу атомов) и в структуре ГПНР2 (зеленая).

Рис. 7. Сравнение молекул димеров апо-формы РИНР (желтый) и апо-формы ГЭНМ

(синий).

Рис. 8. Ход полипептидной цепи структуры димера тройного комплекса РОНМ. Поворотная ось симметрии второго порядка димера направлена перпендикулярно плоскости рисунка. Остатки с 392 по 399 (дополнительные С-концевые остатки) в молекуле ГВНМ показаны синим цветом. Молекула NAD* и азид-иона в структуре показаны атомной моделью фиолетового цвета.

Рис. 9. Сравнение структуры ano- (синий) и холо-формы (желтый) FDHM. Направление оси, вокруг которой осуществляется поворот на 8° каталитического домена FDHM перпендикулярно плоскости рисунка. Субъединицы ano- и холо-формы сравнивали по Са атомам кофермент-связывающих доменов.

Рис. 10. Положение молекул NAD* и азид-иона в активном центре FDHM. Карта электронной плотности 2F0-FC приведена с уровнем срезки 1о в структуре.

Рис. 11. Схема связывания NAD* и азид-иона в структуре холо-формы FDHM.

С1п313

Рис. 12. Положение азид-иона в структуре ГОНМ.

Рго97« И *

а)

Ь)

Рис. 13. а) Положение азид-иона в структуре тройного комплекса КЦНМ. Ь) Положение формиат-иона в структуре КОНР2.

положению пирофосфата и рибозы никотиновой части молекулы NAD+ в структуре холо-формы FDHP [1].

Кристаллическая структура комплекса формиатдегидрогеназы из метилотрофных бактерий Moraxella sp.C2 с формиатом. При попытке получения структуры тройного комплекса FDHM-ADPR-формиат была получена структура двойного комплекса FDHM с формиатом. Пространственная структура комплекса FDHM была решена с разрешением 2,3Ä и уточнена до Rfactor=23,l% (Таблица 2). FDHM отличается от FDHP по первичной структуре 53 остатками [EMBL accession Y13245]. Все остатки в FDHM, участвующие в катализе и в формировании активного центра, являются консервативными. Биохимические свойства FDHM рассмотрены в работе [4].

Подобно структуре FDHP полипептидная цепь субъединицы FDHM организована в глобулярную двухдоменную структуру [5]. Кофермент-связывающий домен FDHM образован остатками с 147 по 333, каталитический сформирован остатками с 1 по 147 и с 333 по 374 (369 для субъединиц В и С). Оба домена в FDHM имеют схожую структурную организацию и состоят из параллельного левозакрученного ß-листа, окружённого а-спиралями.

В независимой части элементарной ячейки полученная структура FDHM содержит два димера, которые образуют между собой субъединицы А, В и С, D. Упаковка субъединиц FDHM в ячейке показана на рисунке 5. Подобная структурная организация фермента была обнаружена в структурах комплексов FDHP с формиатом (см. выше). В одной из субъединиц (В) в районе активного центра была обнаружена молекула формиата. Молекулу ADPR не удалось обнаружить в структуре комплекса FDHM.

В димере субъединицы (А (синий цвет) и В (фиолетовый цвет)) связаны некристаллографической осью симметрии второго порядка (Рисунок 5) которая проходит вдоль кофермент-связывающего домена, подобно димерам апо- и холо-форм FDHP [1]. Упаковка субъединиц FDHM в ячейке такова, что димеры (показаны на рисунке разными цветами) являются симметричными и связаны ещё одной некристаллографической поворотной осью симметрии второго порядка, которая параллельна оси «у» кристаллической решетки (Рисунок 5).

В субъединице (В) в структуре FDHM молекула формиата была обнаружена в каталитическом центре вблизи короткой петли, образованной 123-125 остатками. Положение формиат-иона в структуре FDHM показано на рисунке 6а. Атом кислорода Ol молекулы формиат-иона в FDHM образует водородные связи с атомом азота основной цепи 11е122 и атомом ND2 боковой цепи Asnl46. Атом 02 формиата образует Н-связь с атомом кислорода основной цепи остатка А1а 120.

Положение формиата в структуре FDHM почти аналогично положению формиата в двойном комплексе FDHP2 (Рисунок 6Ь). Структуры совмещали по их каталитическим доменам. Конформация остатков активного центра

существенных для катализа FDH, при сравнении структур активных центров в FDHM и FDHP, не изменилась.

При сравнении двух апо-форм FDH, оказалось, что структура молекулы FDHM имеет более открытую конформацию. Сравнение исследуемой структуры молекулы FDHM со структурой молекулы апо-формы FDHP приведено на рисунке 7 (структуры совмещены по Са атомам кофермент-связывающих доменов).

Анализ контактов структур димеров двух апо-форм показал, что контакт для субъединиц, формирующих димер FDHM, значительно сильнее контакта между субъединицами, формирующими димеры в апо- и холо-формах FDHP. В этой области субъединицы димера образуют между собой 54 водородные связи. В случае FDHP число водородных связей между субъединицами димера равно 46. Наличие более прочного взаимодействия субъединиц в димере FDHM вызвано присутствием 20 остатков, которыми отличаются структуры FDHM и FDHP в этой области.

Таким образом, субъединицы FDHM имеют более «открытую» структуру по сравнению с ранее исследованными структурами апо-формы FDHP. Такие изменения в структуре свободного фермента не связаны с различным кристаллографическим окружением субъединиц FDHM в кристалле. Кристаллическая структура комплекса FDH из метилотрофных бактерий Moraxella sp.C2 с NAD+ и азид-ионом. Структура тройного комплекса FDH из метилотрофных бактерий Moraxella sp.C2 с NAD+ и азид-ином была решена методом молекулярного замещения и уточнена до Rfactor=14,2% при разрешении 1,95Ä (Таблица 2). Структура комплекса FDHM содержит в независимой части элементарной ячейки одну субъединицу димера, подобно структуре апо-формы FDHP с тетрагональной решеткой (см. выше). Молекулу димера исследуемой структуры FDHM образуют субъединицы, связанные кристаллографической поворотной осью симметрии второго порядка, аналогично димеру FDHP с тетрагональной решеткой. На рисунке 8 показана структура димера тройного комплекса FDHM с NAD+ и азид-ионом.

В структуре тройного комплекса были локализованы 399 аминокислотных остатков. На С-конце исследуемой структуры FDHM были локализованы 8 дополнительных остатков, которые не удавалось локализовать по картам электронной плотности в структуре холо-формы FDHP [1]. Атомная модель молекулы тройного комплекса FDHM не содержит только двух последних остатков (в соответствии с первичной структурой фермента). Остатки с 388 по 395 структуры тройного комплекса FDHM образуют дополнительный элемент вторичной структуры - а-спираль (а 10, в соответствие с номенклатурой элементов вторичной структуры описанной в работе [5]). Положение С-конца с 392 по 399 остаток стабилизировано в основном гидрофобными контактами с 316 по 319 остатки (ß-поворот) кофермент-связывающего домена FDHM. Кроме того, боковые цепи остатков Glu397 и Asn317 образуют между собой солевой

мостик. Остатки с 392 по 399 в кристалле образуют контакты с остатками со 174 по 178 (ß-поворот) соседней субъединицы димера. В структуре холо-формы FDH остатки 374-391 фиксируют положение кофермента в активном центре, образуя четыре водородных связи с молекулой NAD+, и закрывают активный центр от растворителя.

Сравнение структуры ano- и холо-формы FDHM представлено на рисунке 9. RMS отклонения координат Са атомов 373 остатков холо-формы FDHM и апо-формы FDHM равно 1,48Á. При связывании молекул NAD+ и азид-иона молекула FDHM приобретает закрытую конформацию, аналогично структуре холо-формы FDHP [1]. Изменение конформации от ano- к холо-форме FDHM можно описать поворотом каталитического домена к кофермент-связывающему домену вокруг Са атомов контактных остатков 147 и 334 на угол ~ 8° (Рисунок 9).

В активном центре исследуемого тройного комплекса FDHM были локализованы молекула NAD+ и азид-иона. Положение молекул NAD+ и азид-иона на карте электронной плотности 2F0-FC с уровнем срезки 1а в структуре FDHM показано на рисунке 10.

Положение молекулы NAD+ в структуре холо-формы FDHM показано на рисунке 8. Молекула NAD+ имеет открытую конформацию, как и в структуре комплекса FDHP с NAD+ и азид-ионом [1]. Схема связывания NAD+ и азид-иона показана на рисунке 11. Молекула NAD+ в структуре холо-формы FDHM связывается аналогично связыванию NAD+ в структуре холо-формы FDHP.

Адениновая часть NAD+ связывается между остатками Arg241 и Cys255 и находится в гидрофобной области, образованной боковыми цепями остатков: Val 197, Leu253, Cys255, Thr261, Met264 и Leu287, аналогично связыванию NAD+ в структуре холо-формы FDHP [1]. Атом AN7 аденина образует водородную связь с NE2 атомом His258, а атом AN6 с ОЕ1 атомом Glu260. Положение аденинрибозы NAD+ стабилизировано двумя водородными связями атомов 02 и ОЗ с карбоксильной группой Asp221. Пирофосфатная группа NAD+ связывается в районе остатков Alai98 и Gly203. Атом А02 пирофосфата образует водородные связи с атомами N и NH1 остатка Arg201, А01 атом образует водородную связь с атомом боковой цепи OG остатка Ser380, а атомы N02 и NOl образуют водородные связи с атомами OG Ser 147 и N 11е202, соответственно. Все взаимодействия с рибозой никотинамида осуществляются через молекулы воды в структуре FDHM. Карбоксамидная группа никотинового кольца молекулы NAD+ стабилизируется водородными связями с остатками Thr282, Asp308, Ser334 и Gly335. При этом N07 атом образует водородные связи с атомами О Thr282, OD1 и OD2 Asp308, а атом NN7 с атомами OG Ser334 и N Gly335. Положение карбоксамидной группы никотинового кольца молекулы NAD+ имеет «транс» конформацию (атом N7 направлен в сторону NC4 атома). Качество данных полученной структуры позволяет уверено различить положение атомов азота и кислорода в боковых

цепях остатков Gin, Asn, и молекулы NAD+ (по анализу значений атомных температурных факторов). Следует отметить, что в данной структуре положение атомов NN7, N07 карбоксамидной группы никотинамида меняется на противоположное по сравнению со структурой холо-формы FDHP.

В структуре тройного комплекса FDHM N1 атом азид-иона образует водородные связи с атомами NH1 и NH2 остатка Arg284, атомом NE2 His332 и атомом О основной цепи остатка Не 122. Атом N3 азид-иона образует водородные связи с атомами N и О основной цепи lie 122 и атомом ND2 остатка Asnl46 (Рисунок 12). Аналогично молекуле NAD+, в данной структуре полученного комплекса FDHM положение атомов OD1, ND2 боковой цепи остатка Asn 146 меняется на противоположное по сравнению со структурой холо-формы FDHP.

Положение азид-иона в структуре исследованного комплекса FDHM практически совпадает с его положением в структуре холо-формы FDHP, однако он связывается по-другому. Основное отличие состоит в том, что обнаружена водородная связь иона азида с остатком His332. В структуре тройного комплекса FDHP ион азида не образует водородной связи с His332, хотя данные направленного мутагенеза FDHP показали, что остаток His332 является существенным для связывания формиат-иона [7]. Расстояние между N1 атомом азид-иона и NE2 His332 в структуре холо-формы FDHP равно 3,бА [1]. В белках семейства D-специфичных дегидрогеназ остаток His входит в триаду каталитически важных остатков (Arg, His, Glu) и образует цепь переноса протона с остатком глютаминовой кислоты (в структурах FDH на месте данного остатка находится глютамин), связывается с карбоксильной группой субстрата и стабилизирует переходное состояние. В структуре FDHM остаток His332 имеет частично протонированное состояние за счет образования связи между атомом ND2 His332 и атомом NE2 Gln313 (Рисунок 12). Длина водородной связи в структуре FDH для этой пары атомов равна 2,8А. Частичный перенос протона от глютамина на гистидин формирует положительный заряд на имидазольном кольце гистидина и облегчает связывание отрицательно заряженного формиат-иона.

Если принять место связывание азид-иона за место связывания субстрата (формиат-иона), при котором N1 атом азид-иона соответствует 01 атому формиат-иона, а N3 атому 02 формиата, то формиат-ион в структуре исследованного комплекса FDHM образует водородные связи с остатками Arg284, His332, 11е122 и Asnl46. Остатки Arg284 и His332 принадлежат кофермент-связывающему домену, а остатки Ие122 и Asnl46 принадлежат каталитическому домену. Такое связывание молекулы азид-иона (формиат-иона) может являться причиной изменения конформации фермента при образовании тройного комплекса (FDH-кофермент-субстрат). В структуре двойного комплекса (FDH-формиат) формиат-ион образует водородные связи с остатками 11е122 и Asnl46 каталитического домена, при этом структура имеет

открытую конформацию. Положение формиат-иона в структуре двойного комплекса FDHP2 совпадает с положением иона азида в структуре FDHM при совмещении структур по координатам Са атомов их каталитических доменов (Рисунок 13).

Структура тройного комплекса (FDHM-NAD+-a3im-Hon) является первой для формиатдегидрогеназ, в которой было получено кристаллографическое доказательство участия остатка His332 в связывании формиата в активном центре. Она подтвердила данные направленного мутагенеза [7] и позволила уточнить роль каталитически важного His332 в связывании субстрата (формиат-иона) ферментом. Более прочное связывания азид-иона в структуре полученного комплекса FDHM позволило предположить, что изменение конформации фермента при образовании тройного комплекса вызвано связыванием азид-иона (формиата). Кроме того, полученная структура позволила определить роль С-концевого фрагмента (391-399), который не был локализован в ранее полученных структурах FDHP, в связывании кофермента. Исследование свободного фермента, двойных и тройных комплексов FDH методом малоуглового рентгеновского рассеяния. Метод малоуглового рентгеновского рассеяния позволяет исследовать геометрические характеристики свободных белков и их комплексов в растворе. В случае FDH ферментативная реакция сопровождается большими конформационными перестройками, которые надежно детектируются этим методом [6]. На данный момент не удалось решить пространственные структуры комплексов FDH с коферментом (NAD+), его аналогами (ADPR, NADH) и ADPR-формиатом. Для установления пространственного строения этих комплексов и для сравнения структурных характеристик свободного фермента и его двойных и тройных комплексов в кристалле и в растворе были проведены эксперименты по их исследованию методом малоуглового рентгеновского рассеяния.

Результаты малоуглового рентгеновского рассеяния хорошо согласуются с данными рентгеноструктурного анализа. Кривые малоуглового рассеяния для комплексов FDHP с NAD+, ADPR, ADPR-формиатом практически совпадают с кривой для свободного фермента. В случае тройного комплекса FDHP с NAD+ и азид-ионом и двойного комплекса FDHP с NADH происходит изменение структуры FDH и кривая рассеяния для этих комплексов заметно изменяется. Таким образом, молекула FDHP имеет два конформационных состояния: открытую форму (апо-форма), которую имеет свободный фермент и его двойные комплексы с субстратами или их аналогами и закрытую форму (холо-форма), которую имеет тройной комплекс FDHP с NAD+ и азид-ионом.

По данным малоуглового рентгеновского рассеяния молекула FDHP в комплексе с NADH также должна претерпевать конформационные изменения, однако попытка получения структуры комплекса FDHP с NADH были не успешными из-за того, что кристаллы комплексов получались методом

сокристаллизации при временах образования кристаллов более одной недели, что могло привести к превращению молекулы NADH в NAD+.

ВЫВОДЫ:

1. Разработана методика кристаллизации формиатдегидрогеназы из метилотрофных бактерий Pseudomonas sp.101 (FDHP) и бактерий Moraxella sp.C2 (FDHM) в свободном состоянии и комплексов ферментов с коферментом (NAD+), субстратом (формиат-ионом) и его аналогом (азид-ионом), а также мутантных форм и их комплексов с NADH.

2. Решена и уточнена до Rfactor=20,7% при разрешении 2,1Â структура новой кристаллической модификации апо-формы FDHP.

3. Решены две структуры комплекса FDHP с формиат-ионом (Rfactor=22,3% при разрешении 2,19Â, Rfactor=20,5% при разрешении 2,28Â). Найдено два места связывания формиат-иона в активном центре фермента.

4. Решены структуры двух мутантных форм, содержащие замены в области активного центра и на поверхности белка, FDHP Т7 (Rfactor=16,l% при разрешении 2,31Â) и FDHP GAV (Rfactor=17,9% при разрешении 2,3 9Â) и структура двойного комплекса мутанта FDHP GAV с NADH (Rfactor=20,7% при разрешении 3.1Â).

5. Решены структуры двойного комплекса с формиатом (Rfactor=23,l% при разрешении 2,3Â) и тройного комплекса с NAD+ и азид-ионом (Rfactor=14,2% при разрешении 1,95Â) FDH из бактерий Moraxella sp.C2. Сравнение полученных структур между собой и со структурами ano- и холо-форм FDHP позволило понять причины конформационных изменений структуры в процессе катализа. Выявлена роль каталитически важного гистидина (332) в связывании субстрата (формиат-иона) и роль С-коцевого участка цепи в связывании кофермента (NAD1).

Цитируемая литература:

1. Lamzin V.S., Dauter Z, Popov V.O., Harutyunyan E.H., Wilson K.S. High resolution structures of holo and apo formate dehydrogenase. (1994) J.Mol. Biol, 236, 759-785

2. Tishkov, V.I, Popov, V.O. Protein engineering of formate dehydrogenase. (2006) Biomolecular Engineering, 23, №2-3, 89-110

3. Wierenga R.K, Terpstra P, Hol W.G.J. Prediction of the occurrence of the ADP-binding ßaß-fold in proteins, using an amino acid sequence fingerprint. (1986) J. Mol. Biol, 187, 101-107

4. Тишков В.И, Попов В.О. Механизм действия формиатдегидрогеназы и её практическое применение. (2004) Биохимия, 69, 1537-1554

5. Kutzenko A.S, Lamzin V.S, Popov V.O. Conserved supersecondary structure motif in NAD-dependent dehydrogenases. (1998) FEBS Let, 423, 105-109

6. Asadchikov V.E., Dickov M.M., Egorov A.M., L'vov Yu.M., Mogilevsky L.Yu., Malashkevich V.N., Osipov A.P., Feigin L.A. X-ray small-angle scattering of formate dehydrogenase as a function of saturation with nicotinamide adenine denucleotide. (1980) Studia Biophysica, 79, №1, 157158

7. Tishkov V.I., Matorin A.D., Rojkova A.M., Fedorchuk V.V., Savitsky A.P., Dementieva L.A., Lamzin V.S., Mezentzev A.V., Popov V.O. Site-directed mutagenesis of formate dehydrogenase active centre: role of the His332-Gln313 pair in enzyme catalysis. (1996) FEBS Letters, 390. №1, 104-108

Публикации по материалам диссертации

Журнальные статьи

1. Е.В. Филиппова, К.М. Поляков, Т.В. Тихонова, Т.Н. Стеханова, К.М. Бойко, В.О. Попов // Кристаллография, 2005, Том 50, №5, стр. 823-827

2. Е.В. Филиппова, К.М. Поляков, Т.В. Тихонова, Т.Н. Стеханова, К.М. Бойко, И.Г. Садыхов, В.И. Тишков, Н.Лабру, В.О. Попов // Кристаллография, 2006, Том 51, №4, стр. 663-667

3. К.М. Boyko, T.V. Tikhonova, К.М. Polyakov, E.V. Filippova, E.G. Sadikhov, P.V. Konarev, D.I. Svergun, V.I. Tishkov, V.O. Popov // HASYLAB Annual Report, 2005, №2, p.411-412

4. K.M. Polyakov, T.V. Tikhonova, E.V. Filippova, V.S. Lamzin, V.O. Popov // HASYLAB Annual Report, 2005, №2, p.l 13-114

Тезисы докладов

1. E.V. Filippova, K.M. Polyakov, T.V. Tikhonova, E.G. Sadikhov, T.N. Stehanova, K.M. Boiko, V.I. Tishkov, V.S. Lamzin, V.O. Popov // International Conference "Biocatalysis-2005: Fundamentals and Applications", p.78

2. Е.В. Филиппова, K.M. Поляков, Т.В. Тихонова, K.M. Бойко, И.Г. Садыхов, В.И. Тишков, В.О. Попов // Материалы международной школы-конференции молодых ученых «Системная биология и биоинженерия». Москва, 2005, стр. 69

3. К.М. Бойко, К.М. Поляков, В.О. Попов, Т.Н. Стеханова, Т.В. Тихонова, Е.В. Филиппова, B.C. Ламзин // IV Национальная конференция по применению рентгеновского, синхротронного излучений, нейтронов и электронов для исследования материалов (РСНЭ-2003), стр. 44

Представление атомных координат в PDB (База Трёхмерных Структур Белков)

1. www.rcsb.org/pdb Filippova E.V., Polyakov К.М., Tikhonova T.V., Stekhanova T.N., Boiko K.M., Popov V.O. Structure of a new crystal

modification of the bacterial NAD-dependent formate dehydrogenase with a resolution of 2.1 А. (код - 2G01)

2. www.rcsb.org/pdb Filippova E.V., Polyakov K.M., Tikhonova T.V., Shabalin I.G., Sadykhov E.G., Tishkov V.l., Popov V.O. NAD-dependent formate dehydrogenase from bacterium Moraxella sp.C2 in complex with NAD and azide. (код - 2GSD)

3. www.rcsb.org/pdb Filippova E.V., Polyakov K.M., Tikhonova T.V., Stekhanova T.N., Boiko K.M., Sadykhov E.G., Tishkov V.l., Popov V.O. NAD-dependent formate dehydrogenase from bacterium Pseudomonas sp.101 in complex with formate, (код - 2GUG)

Тираж 80 экз., срок подписи в печать 25.08.06. Типография «Борус», г.Тула, ул.Сойфера, д.6. Телефон: (4872) 30-74-48. Факс: (4872) 30-11-22.

Содержание диссертации, кандидата физико-математических наук, Филиппова, Екатерина Валерьевна

Введение.

1. Обзор литературы

1.1. Рентгеноструктурное исследование D - специфичных дегидрогеназ 2-гидрокси кислот.

1.1.1. Структура D - специфичных дегидрогеназ.

1.1.2. Связывание кофермента (NAD+) и субстратов с D-специфичными дегидрогеназами.

1.2. Структура ЫАО+-зависимой формиатдегидрогеназы из метилотрофных бактерий Pseudomonas sp.IOl.

1.2.1. Общая характеристика бактериальных NAD '-зависимых формиатдегидрогеназ.

1.2.2. Пространственные структуры апо- и холо-формы формиатдегидрогеназы Сравнение со структурами D-специфичных дегидрогеназ.

1.2.3. Структура активного центра холо-формы формиатдегидрогеназы.

1.2.4. Модель связывания формиат-иона в активном центре фермента.

2. Материалы и методы исследования

2.1. Получение кристаллов комплексов формиатдегидрогеназы из бактерий Pseudomonas sp. 101 и Morcixella sp.C2.

2.2. Сбор и обработка дифракционных данных.

2.3. Решение и уточнение структур.

2.4. Съемка и обработка данных малоуглового рассеяния.

3. Результаты и их обсуждение

3.1. Новая кристаллическая модификация апо-формы формиатдегидрогеназы из бактерий Psendomonas ар. 101.

3.2. Структура формиатдегидрогеназы в комплексе с формиат-ионом.

3.3. Структуры мутантных форм формиатдегидрогеназы.

3.4. Кристаллическая структура новой формиатдегидрогеназы из бактерий Moraxella sp.C2.

3.4.1. Кристаллическая структура комплекса формиатдегидрогеназы из бактерий Moraxella sp.C2 с формиатом.

3.4.2. Кристаллическая структура комплекса формиатдегидрогеназы из метилотрофных бактерий Moraxella sp.C2 с NAD1 и азид-ионом.

3.5. Исследование свободного фермента, двойных и тройных комплексов формиатдегидрогеназы методом малоуглового рентгеновского рассеяния.

Основные результаты работы и выводы.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Структуры комплексов бактериальных формиатдегидрогеназ с коферментом и субстратом"

NAD'-зависимая формиатдегидрогеназа (FDH) катализирует окисление формиат-иона до углекислого газа при сопряженном восстановлении никотинамидадениндинуклеотида (NAD"') до NADH. Схожие по физико-химическим свойствам формиатдегидрогеназы были обнаружены в разных организмах, включая, бактерии, дрожжи, грибы, высшие растения и млекопитающих. FDH из метилотрофных микроорганизмов является основным кандидатом на использование в качестве универсального биокатализатора, регенерирующего NADH.

FDH принадлежит к суперсемейству D-специфичных дегидрогеназ 2-гидроксикислот. Белки данного семейства имеют схожую структурную организацию полипептидной цепи. Молекулы D-специфичных дегидрогеназ состоят из двух доменов: кофермент-связывающего домена и каталитического домена. Кофермент-связывающий домен является консервативным в структурах D-специфичных дегидрогеназ и ответственен за связывание NAD+. Каталитический домен специфичен для каждого белка и определяет его каталитические свойства. В растворе и кристаллах молекулы ферментов формируют димерную структуру, в которой две субъединицы димера связаны поворотной осыо симметрии второго порядка. В димере субъединицы контактируют кофермент-связывающими доменами. В силу простоты структуры субстрата (формиат-иона) и отсутствия в ходе каталитической реакции стадий переноса протонов FDH изучается как модельный фермент для выяснения основных закономерностей переноса гидрид-иона в активном центре D-специфичных дегидрогеназ.

На сегодняшний момент детально исследованы две пространственные структуры FDH из метилотрофных бактерий Pseitclomoncis sp.101: свободный фермент (апо-форма FDH) и тройной комплекс FDH-NAD+-a3Hfl-HOH (холо-форма FDH). Молекулы FDH в структурах свободного белка и тройного комплекса различаются относительным положением доменов. Апо-форма FDH имеет «открытую» конформацию, а холо-форма FDH «закрытую». Конформационные перестройки молекулы во время ферментативного процесса относят к одному из основных свойств D-специфичных дегидрогеназ. Конформационные перестройки при переходе молекулы FDH в закрытую (продуктивную) конформацию могут быть вызваны связыванием ферментом молекулы NADT, формиата или их одновременным связыванием. Получение структур двойных и тройных комплексов FDH с субстратом (формиат-ионом), коферментом (NAD"1") и его аналогами позволит расширить представления о молекулярном механизме катализа и понять причины изменения структуры ферментов данного семейства.

Данная работа посвящена рентгеноструктурному исследованию структур FDH из метилотрофных бактерий Pseudomonas sp.IOI и Moraxella sp.C2, их двойных и тройных комплексов с формиатом, NAD+, аналогом NAD"1" (NADH), а также изучению структур мутантных форм FDH из бактерий Pseudomonas sp.IOI.

В рамках данного исследования были решены следующие задачи: (Г) получены кристаллы комплексов FDH из метилотрофных бактерий Pseudomonas sp.IOI и Moraxella sp.C2 с формиатом, NAD"'", а также кристаллы мутантных форм FDH из бактерий Pseudomonas sp.IOI и их комплексов с NADH; (2) проведено решение структур; (3) проведен сравнительный анализ структуры апо-формы FDH в двух разных кристаллических модификациях и исследовано влияние кристаллографического окружения на структуру молекулы; (4) проведен сравнительный анализ структур FDH из метилотрофных бактерий Pseudomonas sp.IOI и Moraxella sp.C2\ (5) проведен анализ структур комплексов FDH и её мутантыых форм; (6) обсуждены причины структурных изменений молекулы фермента в процессе ферментативного катализа на основе данных рентгеноструктурного анализа и малоуглового рентгеновского рассеяния.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Филиппова, Екатерина Валерьевна

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ И ВЫВОДЫ:

1. Разработана методика кристаллизации формиатдегидрогеназы из метилотрофных бактерий Pseudomonas sp.IOI (FDHP) и бактерий Moraxella sp. С2 (FDHM) в свободном состоянии и комплексов ферментов с коферментом (NAD+), субстратом (формиат-ионом) и его аналогом (азид-ионом), а также мутантных форм и их комплексов с NADH.

2. Решена и уточнена до Rlac(or=20,7% при разрешении 2,1 А структура новой кристаллической модификации апо-формы FDHP.

3. Решены структуры двух комплексов FDFIP с формиат-ионом (IW=22,3% при разрешении 2,19А, Rractol.-20,5% при разрешении 2,28А). Найдено два места связывания формиат-иона в активном центре фермента.

4. Решены структуры двух мутантных форм, содержащие замены в области активного центра и на поверхности белка, FDFIP Т7 (Riac,(ll=l 6,1 % при разрешении 2,31 A), FDFIP GAV (Rraci«r=17,9% при разрешении 2,39А) и двойного комплекса FDFIP GAV с NADFl (Rraclor=20,7% при разрешении 3,1 А).

5. Решены структуры двойного комплекса с формиатом (Rfack,r=23,l% при разрешении 2,ЗА) и тройного комплекса с NAD"r и азид-ионом (Rlack:il=14.2% при разрешении 1,95A) FDH из бактерий Moraxella sp.C2. Сравнение полученных структур между собой и со структурами апо- и холо-формы FDHP позволило понять причины конформационных изменений структуры в процессе катализа. Выявлена роль каталитически важного гистидина (332) в связывании субстрата (формиат-иона) и роль С-коцевого участка цепи в связывании кофермента (NAD+).

БЛАГОДАРНОСТИ

Выражаю искреннюю благодарность своему научному руководителю Полякову Константину Михайловичу за внимание, помощь и поддержку в осуществлении данной работы. Я признательна своему научному консультанту Попову Владимиру Олеговичу за помощь на всех стадиях нашей совместной работы. Благодарю за неоценимый вклад и обсуждение результатов работы Тихонову Тамару Викторовну и Тишкова Владимира Ивановича. За возможность сбора дифракционных данных от исследованных кристаллов благодарю группу Ламзина B.C. (EMBL Hamburg Outstation), группу Майнора Владека (University of Virginia, Molecular Physiology and Biological Physics) и группу структурных исследований рибосомных белков под руководством Никонова С.В. (Институт Белка РАН). Благодарю Садыхова И.Г., аспиранта Института Биохимии РАН, за предоставление фермента. Благодарю Сосфенова Никиту Ильича, сотрудника Института Кристаллографии РАН, за внимание и помощь в проведении предварительных экспериментов на лабораторном источнике рентгеновского излучения. За всевозможную поддержку и внимание благодарю Строкопытова Бориса Владленовича и Самыгину Валерию.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата физико-математических наук, Филиппова, Екатерина Валерьевна, Москва

1. Grant G.A. A new family of 2-hydroxyacicl dehydrogenases. (1989) Biochem. Biophys. Res. Commun., 165, 1371-1374

2. Hummel W., Kula M.-R. Dehydrogenases for synthesis of chiral compounds. (1989) Eur. J. Biochem., 184, 1-13

3. Wierenga R.K., TerpstraP., Hoi W.G.J. Prediction of the occurrence of the ADP-bincIing |3a(3-folcl in proteins, using an amino acicl sequence fingerprint. (1986) J. Mol. Biol., 187, 101-107

4. SCOP: wvvw.rcsb.org/pdb/browse

5. Hummel W. Large-scale applications of NAD(P)-dependent oxidoreductases: recent developments. (1999) Trends Biotechnol., 17, 487-492

6. Schuller D.J., Grant G.A., Banaszak L.J. The allosteric ligancl site in the Vmax-type cooperative enzyme phosphoglycerate dehydrogenase. (1995) Nature Struct. Biol., 2, 69-76

7. Bell J.K., Grant G.A., Banaszak LJ. Multiconformational states in phosphoglycerate dehydrogenase. (2004) Biochem., 43, 3450-3458

8. Dey S., Grant G.A., Sacchettini J.C. Crystal structure of Mecobacterium tuberculosis D-3- phosphoglycerate dehydrogenase. (2005) J. Biol. Chem., 280, 14892-14899

9. Goldberg J.D., Yoshida Т., Brick P. Crystal structure of a NAD-dependent D-glycerate dehydrogenase at 2.4 A resolution. (1994) J. Mol. Biol., 236, 1123-1140

10. Stoll V.S., Kimber M.S., Pai E. Insight into substrate binding by D-2-ketoacid dehydrogenases from the structure of Lactobacillus pentosus D-lactate dehydrogenase. (1996) Structure, 4, 437-447

11. Razeto A., Kochhar S., Hottinger H., Dauter M., Wilson K.S., Lamzin V.S. Domain closure, substrate specificity and catalysis of D-lactate dehydrogenase from Lactobacillus bulgaricus. (2002) J. Mol. Biol., 31 8, 109-119

12. Niefmd K, Hecht HJ, Schomburg D. Crystallization and preliminary characterization of crystals of D-2-hydroxyisocaproate dehydrogenase from Lactobacillus casei. (1994) J. Mol. Biol., 240, 400-402

13. Dengler U., Niefmd K., Kiess M., Schomburg D. Crystal Structure of a ternary complex of D-2-hydroxyisocaproate dehydrogenase from Lactobacillus casei, NAD+ and 2-oxoisocaproate at 1.9 A resolution. (1997) J. Mol. Biol., 267, 640-660

14. Martins B.M., Macedo-Ribeiro S., Bresser J., Buckel W., Messerschmidt A. Structural basis for stereo-specific catalysis in NAD"'-dependent (R)-2-hydroxyglutarate dehydrogenase from Aciclaminococcus fermentans. (2004) FEBS, 272, 269-281

15. Lamzin V.S., Aleshin A.E., Strokopytov B.V., Yukhnevich M.G., Popov V.O., Flarutyunyan E.FI., Wilson K.S. Crystal structure of NAD-dependent formate dehydrogenase. (1992) FEBS, 206, 441-452

16. Lamzin V.S., Dauter Z., Popov V.O., Flarutyunyan E.FI., Wilson K.S. Fligh resolution structures of holo and apo formate dehydrogenase. (1994) J.Mol. Biol., 236, 759-785

17. Lamzin, V.S., Popov, V.O., and Wilson, K.S. Formate Dehydrogenase complexed with substrate and coenzyme analogue. (1993) Hamburger Synchrotronstrahlungslabor HASYLAB am Deutschen Electronen-Synchrotron DESY, Jahresbericht, 819-820

18. Bernan H.M., Westbrook J., Feng Z, Gilliland G., Bhat T.N., Weissig H., Shindyalov I.N., Bourne P.E.: The Protein Data Bank (www.rcsb.org/pdb). (2000) Nucleic Acid Research, 28, 235-242

19. Ohlsson I., Nordstron В., Brenden С. -I. Structural and functional similarities within the coenzyme binding domains of dehydrogenases. (1974) J. Mol. Biol., 89, №2, 339-354

20. Rossmann M.G., Moras D., Olsen K.W. Chemical and biological evolution of a nucleotide-bincling protein. (1974) Nature, 250, 194-199

21. Darby N.J., Creighton T.N. Protein Structure. (Rickwood D., Male D. ed.), (1993) Oxford University Press, Oxford-New York-Tokyo, 69

22. Rao ST., Rossmann M.G. Comparison of super-secondary structures in protein. (1973) J. Mol. Biol., 76, №2, 241-256

23. Wierenga R.K., Terpstra P., Hoi W.G.J. Prediction of the occurrence of the ADP-binding |3a|3-fold in proteins, using an amino acid sequence fingerprint. (1986) J. Mol. Biol, 187, 101-107

24. Bell J.K., Pease P.J, Bell J.E, Grant G.A, Banaszak L.J. De-regulation of D-3-phosphoglycerate dehydrogenase by domain removal. (2002) Eur. J. Biochem, 269,4172-4184

25. Nardini M, Spano S, Cericola C, Pescei A, Massaroi A, Millo E, Luini A, Corda D, Bolognesi M. CtBP/BARS: a dual-function protein involved in transcription co-repression and Golgi membrane fission. (2003) EMBO J, 22, №12, 3122-3130

26. Kumar V., Carlson J.E., Ohgi K.A., Edwards T.A., Rose D.W., Escalante C.R., Rosenfeld M.G., Aggarwal A.K. Transcription corepressor CtBP is an NAD+-regulated dehydrogenase. (2002) Mol. Cell, 10, 857-869

27. Marmorstein R. Dehydrogenases, NAD, and transcription What's the connection? (2002) Structure, 10, 1465-1472

28. Retey J., Robinson J.A. Stereospecificity in organic chemistry and enzymology. (1982) Verlag Chemie, Weinheim

29. Benner S.A. The stereoselectivity of alcohol dehydrogenases: a stereochemical imperative? (1982) Experientia., 38, 633-636

30. Oppenheimer N.J., Arnold L.J., Kaplan N.O. Stereospecificity of the intramolecular association of reduced pyridine coenzymes. (1978) Biochem., 17,2613-2619

31. Eklund H., Branden C.-I. Crystal structure, coenzyme conformations and protein interactions. In Pyridine Nucleotide Coenzymes (Dolphin D.N.Y. ed.) (1987) Wiley, New York., 51-98

32. Grau U.M. Structural interactions with enzymes. In the pyridine nucleotide coenzymes (Everse J., Anderson В., You K. ed.). (1982) Academic press New York, 135-187

33. Bernard N., Johnesen K., Holbrook J.J., Delcour J. D175 discriminates between NADFI and NADPFI in the coenzyme binding site of Lactobacillus delbrueckii subsp. Bidgaricus D-lactate dehydrogenase. (1995) Biochem. Biophys. Res. Commun., 208, 895-900

34. Branden C.I, Eklund N. Structure and mechanism of liver alcohol dehydrogenase, lactate dehydrogenase and glyceraldehydes-3-phosphate dehydrogenase. In "dehydrogenases requiring nicotinamide coenzymes" (Jeffery J. ed.), Birkhauser, Basel, 1980, 41-84

35. Jeck R. The properties of (w-(3-acetylpyridinio)-n-aIkyr) adenosine pyrophosphates as structural analogues of the coenzyme NAD. (1977) Z. Naturforech, 320, №7-8, 550-555

36. Schmid R, Hinz H.J, Jaenicke R. Studies on an energy structure-function relationship of dehydrogenases. I. Calorimetric investigation on the interaction of coenzyme fragments with horse liver alcohol dehydrogenase. (1978) FEBS Lett, v.87, №1, 80-82

37. Anderson B.M, Kaplan N.O. Enzymic studies with analogs of diphosphopyridine nucleotide. (1959) J. Biol. Chem, 233, №3, 12261232

38. Li FI, Goldstein B.M. Carboxamide group conformation in the nicotinamide and thiazole-4-carboxamide rings: implications for enzyme binding. (1992) J. Med. Chem, 35, 3560-3567

39. Almarsson O, Bruice T.C. Evalution of the factors influencing reactivity and stereospecificity in NAD(P)H dependent dehydrogenase enzymes. (1993) J. Am. Chem. Soc, 115, 2125-2138

40. Blow D.M, Birktoft J.J, Flartley B.S. Role of a buried acid group in the mechanism of action of chymolrypsin. (1969) Nature, 221, 337-340

41. Taguchi H., Ohta T. Histicline 296 is assential for the catalysis in Lactobacillus plantamm D-lactate dehydrogenase. (1993) J. Biol. Chem., 268, 18030-18034

42. Vinals C., De Bolle X., Depiereux E., Feytmans E. Knowledge-based modeling of the D-lactate dehydrogenase three-dimensional structure. (1995) Proteins Struc. Funct. Genet., 21, 307-318

43. Popov V.O., Lamzin V.S. NAD"1-dependent formate dehydrogenase. (1994) Biochem. J., 301, 625-643

44. Popov V.O., Tishkov V.I. NAD+-dependent formate dehydrogenase. From a model enzyme to a versatile biocatalyst. (2003) Protein Structures: Kaleidoscope of Structural Properties and Functions (Uversky, V.N., ed) Research Signpost, Kerala, India, 441-473

45. Tishkov V.I., Popov V.O. Catalytic mechanism and application of formate dehydrogenase. (2004) Biochemistry (Moscow), 69, 1252-1267

46. Tishkov, V.I., Popov, V.O. Protein engineering of formate dehydrogenase. (2006) Biomolecular Engineering, 23, №2-3, 89-110

47. Tishkov V.I., Galkin A.G., Marchenko G.N. Formate dehydrogenase from methylotrophic bacterium Pseudomonas sp. 101: gene cloning and expression in Escherichia coli. Biotechnol. (1993) Appl. Biochem., 18, 201-207

48. Galkin A., Kulakova L., Tishkov V., Esaki N., Soda K. Cloning of formate dehydrogenase gene from a methanol- utilizing bacterium Mycobacterium vaccae N10. (1995) Appl. Microboil. Biotechnol., 44, 479-483

49. Mitsunaga Т., Tanaka Y., Yoshida Т., Watanabe K. Patent of Japan, JP245471A2, 12.09.2000

50. Nanda H, Takaoka Y, Hasegawa J. Purification and Characterization of Formate Dehydrogenase from Ancylobacter aquaticus Strain KNK607M, and Cloning of the Gene. (2003) Biosci. Biotechnol. Biochem, 67, 720728

51. Nanda PI, Takaoka Y, Hasegawa Purification and Characterization of an a-Haloketone-resistant Formate Dehydrogenase from Thiobcicilliis sp. Strain KNK65MA, and Cloning of the Gene. (2003) J. Biosci. Biotechnol. Biochem, 67, 2145-2153

52. Попов В.О, Родионов Ю.В, Егоров A.M., Березин И.В. 1ТАД-зависимая формиатдегидрогеназа из метилотрофных бактерий. Изучение кинетической схемы действия. (1978) Биоорг. Химия, т. 4, №1, 117-129

53. Vinals К, Depiereux Е, Feytmans Е. Prediction of structurally conserved regions of D-specific hydroxyacid dehydrogenases by multiple alignment with formate dehydrogenase. (1993) Biochem. Biophys. Res. Commun, 192, 182-188

54. Lamzin V.S., Dauter Z., Wilson K.S. Dehydrogenation through the looking-glass. (1994) Nature Pabl. Group http://www.nature.c-om/nsmb, 1,281-282

55. Shaked Z., Whitesides G.M. Enzyme-catalyzed organic synthesis: NADH regeneration by using formate dehydrogenase. (1980) J. Am. Chem. Soc., 102, 7104-7105

56. Ohsuima Т., Wandrey C., Kula M.-R., Soda K. Improvement for L-leucine production in a continuously operated enzyme membrane reactor. (1985) Biotechnol. Bioeng., 27, 1616-1618

57. Тишков В.И. Регенерация кофакторов в биосинтезе хиральных соединений с помощью дегидрогеназ. (2002) Весн. Моск. Ун-та. Сер. 2. Химия, 43, 381-388

58. Zhao Н., Van der Donlc W.A. Regeneration of Cofactors for Use in Biocatalysis. (2003) Curr. Opin. Biotechnol., 14, 583-589

59. Kutzenko A.S., Lamzin V.S., Popov V.O. Conserved supersecondary structure motif in NAD-dependent dehydrogenases. (1998) FEBS Let., 423, 105-109

60. Popov V.O., Shumilin I.A., Ustinnikova T.B., Lamzin V.S., Egorov T.A. NAD dependent formate dehydrogenase from the methylotrophic bacterium Pseudomonas sp.IOl. Amino acid sequence. (1990) Bioorg. Khim., 16, 324-335

61. Rossmann M.G., Adams M.J., Buehner M., Ford G.C., Hacker M.L., Liljas A., Rao S.T., Banaszak L.J., Hill E., Tsernoglou D., Webb L. Molecular symmetry axes and subunit interfaces in certain dehydrogenases. (1973) J. Mol. Biol., 76, 533-537

62. Алешин А.Е. Рентгеноструктурное исследование бактериальной формиатдегидрогеназы с разрешением 3.0А. (1992) Диссертационная работа, РАН Институт Кристаллографии им. А.В. Шубиикова

63. Potterton Е, McNicholas S, Krissinel Е, Cowtan К, Noble М. The ССР4 molecular-graphics project. (2002) Acta Cryst, D58, 1955-1957

64. Potterton L, McNicholas S, Krissinel E, Gruber J, Cowtan K, Emsley P, Murshuclov G. N, Cohen S, Perrakis A, Noble M. Developments in the CCP4 molecular-graphics project. (2004) Acta Cryst., D60, 22882294

65. The SERC (UK) Collaborative Computing Project No. 4. (1994) Acta. Crystallog. Sect. A, A46, 585-593

66. Rossmann M.G, Liljas A, Branden C.-I, Banaszak L.J. Evolutionary and structural relationship among dehydrogenases. In the enzymes (Boyer P.D. ed.), 3rd. Edit, vol. 11 A, (1975) Academic Press, New York, London, 61-102

67. Slusarczyk H., Felber S., Kula M.R., Pohl M. Stabilization of NAD-dependent formate dehydrogenase from Candida boidinii by site-directed mutagenesis of cysteine residues. (2000) Eur. J. Biochem., 267, 12801289

68. Davies D.R., Segal D.M. Protein crystallization: Micro techniques involving vapor diffusion. In "Methods in enzymology", (Jakoby W.B. ed.), (1971), Acad. Press, New York-London, 22, 266-269

69. Бланделл Т., Джонсон Л. Кристаллография белка М. :Мир, (1979)

70. McPherson A. Preparation and analysis of protein crystals. (1982) A Wiley-Interscience Publication John Wiley&Sons Inc. New York Chichester Brisbane Toronto Singapore, 96-97

71. Ducruix A., Giege R. Crystallization of nucleic acids and proteins. A practical approach. (1992) Oxford University Press

72. Otwinowski Z., Minor W. Processing of X-ray diffraction data collected in Oscillation mode. (1997) Methods in Enzymology, Vol. 276: Macromolecular Crystallography, part A, C.W. Carter, Jr. and R.M. Sweet, Eds., Academic Press, 307-326

73. Kabsch, W. Evaluation of single-crystal X-ray diffraction data from a position-sensitive detector. (1988) J. Appl. Cryst. 21, 916-924

74. Vagin A.A., Teplyakov A. MOLREP: an Automated Program for Molecular Replacement. (1997) J. Appl. Cryst., 30, 1022-1025

75. Vagin A.A, Teplyalcov A. An approach to multi-copy search in molecular replacement. (2000) ActaCryst.D, 56, 1622-1624

76. Vagin A.A, Isupov M.N. Spherically averaged phased translation function and its application to the search for molecules and fragments in electron-density maps. (2001) Acta Cryst.D, 57, 1451-1456

77. Murshudov G.N, Vagin A.A, Dodson E.J. Refinement of macromolecular structures by the maximum-likelihood method. (1997) Acta Crystallog. Sect. D, 53, 240-255

78. Pannu N.J, Murshudov G.N, Dodson E.J, ReadA R.J. Incorporation of Prior Phase Information Strengthen Maximum-Likelihood Structure Refinemen. (1998) Acta Cryst. section D54, 1285-1294

79. Murshudov G.N, Lebedev A, Vagin A.A, Wilson K.S, Dodson E.J. Efficient anisotropic refinement of Macromolecular structures using FFT. (1999) Acta Cryst. section D55, 247-255

80. Jones T.A, Zou J.-Y, Cowan S.W, Kjelclgaard M. Improved methods for the building of protein models in electron density maps and the location of errors in these models. (1991) Acta Crystallogr. Sect. A, 47, 110-119

81. Emsley P, Cowtan K. Coot: Model building tools for molecular graphics. (2004) Acta Crystallographica Section D - Biological Crystallography, 60, 2126-2132

82. Roussel A, Cambillau C. Silicon Graphics Geometry Partners Directory.1991) Mountain View, CA, USA: Silicon Graphics, 81

83. Svergun D.I. Propagating errors in small-angle scattering data treatment.1992). J. Appl. Cryst, 25, 495-503

84. Malfois, M. & Svergun, D.I. SasCIF: an extension of core Crystallographic Information File for small angle scattering. (2000) J. Appl. Crystallogr. 812-816

85. Svergun D.I., Barberato C., Koch M.H.J. CRYSOL a program to evaluate X-ray solution scattering of biological macromolecules from atomic coordinates. (1995) J. Appl. Cryst., 28, 768-773

86. Kabsch W. A solution for the best rotation to relate two sets of vectors. (1976) Acta. Cryst. A, 32, 922-923

87. Устинникова Т.Б., Попов В.О., Егоров Ц.А. Структурные исследования ИАО^-зависимой формиатдегидрогеназы метилотрофных бактерий. Локализация существенного остатка цистеина. (1988) Биоорганическая Химия, 14, 905-909

88. Одинцева Е.Р., Попова А.С., Рожкова В.И., Тишков В.И. Роль остатков цистеина в стабильности бактериальной формиатдегидрогеназы. (2002) Весн. Моск. Ун-та. Сер. 2. Химия, 43, 356-359

89. B.Lee, F.M.Richards The interpretation of protein structures: estimation of static accessibility. (1971) J.Mol.Biol., 55, 379-400

90. Rojkova AM, Galkin AG, Kulakova LB, Serov AE, Savitsky PA, Fedorchuk VV, Tishkov VI 1999 Bacterial formate dehydrogenase. Increasing the enzyme thermal stability by hydrophobization of alpha-helices. FEBS Lett. 445: 183-188

91. Асадчиков B.E., Дембо А.Т., Диков M.M., Осипов А.П., Егоров A.M., Березин И.В. Изучение формиатдегидрогеназы методом малоуглового рентгеновского рассеяния. Доклады Академии Р1аук СССР, 1979, т.246, №1, 130-133

92. Ламзин B.C. Структура и механизм действия бактериальной формиатдегидрогеназы. (1986) Диссертационная работа, РАН Институт Кристаллографии им. А.В. Шубникова