Структурное исследование НАД+-зависимых формиатдегидрогеназ из различных организмов

Шабалин, Иван Григорьевич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Структурное исследование НАД+-зависимых формиатдегидрогеназ из различных организмов
ВАК РФ 03.01.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Структурное исследование НАД+-зависимых формиатдегидрогеназ из различных организмов"

На правах рукописи

Шабалин Иван Григорьевич

СТРУКТУРНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ НАД+-ЗАВИСИМЫХ ФОРМИАТДЕГИДРОГЕНАЗ ИЗ РАЗЛИЧНЫХ ОРГАНИЗМОВ

Специальность 03.01.04 - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата химических наук

МОСКВА 2010

004609122

Работа выполнена в лаборатории инженерной энзимологии Учреждения Российской академии наук Института биохимии им. А.Н. Баха РАН

Научные руководители:

Официальные оппоненты:

Ведущая организация:

доктор химических наук, профессор В.О. Попов кандидат физико-математических наук K.M. Поляков

доктор биологических наук,

профессор

Д.И. Левицкий

доктор химических наук,

В.З. Плетнёв

Учреждение Российской академии наук Институт кристаллографии им. A.B. Шубникова РАН

Защита состоится « 10 » июня 2010 г. в « 14 » часов на заседании диссертационного совета (Д 002.247.01) при Учреждении Российской академии наук Институте биохимии им. А.Н. Баха РАН по адресу: 119071, Москва, Ленинский проспект, д. 33, стр. 2.

С диссертацией можно ознакомиться в Библиотеке биологической литературы РАН по адресу: 119071, Москва, Ленинский проспект, д. 33, стр. 1.

Автореферат разослан « 7 » мая 2010 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

А.Ф. Орловский

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. НАД+-зависимые формиатдегидрогеназы (ФДГ, КФ 1.2.1.2) окисляют ионы формиата при сопутствующем восстановлении кофермента НАД+ до НАДН:

НСОО" + НАД* <-> С02 Т + НАДН

ФДГ широко распространены в природе: они были найдены в бактериях, грибах и высших растениях. В метилотрофных микроорганизмах этот фермент играет важную роль в обеспечении их энергией, катализируя последний этап катаболизма метанола. В растениях ФДГ участвует в ответе на стрессовые воздействия: в стрессовых условиях содержание этого фермента в митохондриях достигает 9% от всех митохондриальных белков.

Особенностью молекулярного механизма действия ФДГ является прямой перенос гидрид-иона от субстрата на атом С4 никотинамидного кольца НАД+ без дополнительных стадий переноса протона, присутствующих в реакциях, катализируемых другими родственными НАД+-зависимыми дегидрогеназами. Поэтому реакция, катализируемая ФДГ, является удобной моделью для изучения механизма переноса гидрид-иона в каталитическом центре НАД+-зависимых дегидрогеназ методами квантовой механики и молекулярной динамики. ФДГ используется на практике для регенерации кофермента НАДН в ферментативных процессах синтеза оптически активных соединений с помощью дегидрогеназ. Практическая необратимость формиатдегидрогеназной реакции и широкий pH-оптимум активности сделали этот фермент универсальным биокатализатором, способным эффективно работать при значениях pH, оптимальных для целевого процесса.

Ранее проведен большой объем исследований по кинетическим и физико-химическим свойствам ФДГ в растворе из ряда организмов. Решены пространственные структуры ano- и холо-форм ФДГ из метилотрофной бактерии Pseudomonas sp.101 (РэеФДГ) с разрешением около 2 А и структура апо-формы ФДГ из метилотрофных дрожжей Candida Boidinii (СЬоФДГ) с разрешением 1.7 А. Предложен молекулярный механизм действия фермента, многие детали которого подтверждены методом сайт-направленного мутагенеза и методами молекулярного моделирования. Однако, ряд важных вопросов, связанных с особенностями каталитического действия фермента, оставались невыясненными. В частности, оставался открытым вопрос о том, как устроены холо-формы эукариотических ФДГ, в том числе активный центр и сайт связывания кофермента. Неизвестно, какие структурные особенности определяют отличия эукариотических ФДГ от бактериальных по таким параметрам как кинетический механизм, активность и термостабильность. Кроме того, к моменту начала работы не было получено пространственных структур ФДГ с атомным разрешением, которые могли бы уточнить некоторые детали молекулярного механизма

действия фермента и послужить надежной стартовой моделью для его исследования методами квантовой механики. Таким образом, изучение структурно-функциональных особенностей НАД+-зависимых

формиатдегидрогеназ из различных организмов является актуальным как с фундаментальной (особенности структурной организации ФДГ из различных организмов и детали молекулярного механизма действия ФДГ и процессов переноса гидрид-иона в каталитических центрах НАД+-зависимых дегидрирогеназ в целом), так и с практической точки зрения (разработка рекомбинантных ферментов и их биотехнологическое применение). Цель работы. Целью данной работы является структурное исследование ФДГ из различных организмов. Для достижения указанной цели в работе были поставлены и решены следующие задачи:

1) Получение кристаллов апо- и холо-форм НАД+-зависимой формиатдегидрогеназы из метилотрофной бактерии Moraxella sp. С-1 (МогФДГ) и высшего растения Arabidopsis thaliana (АгаФДГ).

2) Решение пространственных структур апо- и холо-форм МогФДГ и АгаФДГ методом рентгеноструктурного анализа с высоким разрешением.

3) Сравнительный анализ решенных структур с ранее известными структурами ФДГ.

Научная новизна. Впервые решены пространственные структуры апо- и холо-форм МогФДГ и АгаФДГ. Структуры АгаФДГ являются первыми структурами растительных ФДГ, причем структура холо-АгаФДГ является первой структурой холо-формы эукариотической ФДГ. Проведен сравнительный анализ решенных структур с ранее исследованными структурами ФДГ, выявлены структурные отличия бактериальных и эукариотических ФДГ. Решена структура апо-формы МогФДГ в закрытой конформации, представляющая собой редкий пример структуры апо-формы НАД+-зависимой дегидрогеназы в закрытой конформации, характерной для холо-формы ферментов. Показана роль связывания кофермента, структурирования С-концевого фрагмента 375-399 и связывания субстрата/ингибитора в переходе бактериальных ФДГ к закрытой конформации. Впервые решена структура ФДГ с атомным разрешением (структура тройного комплекса МогФДГ-НАД+-азид с разрешением 1.1 А) и подтвержден ряд предположений о молекулярном механизме действия ФДГ. Личный вклад автора. Поиск и оптимизация условий кристаллизации, участие в сборе дифракционных данных, обработка полученных данных. Решение и уточнение пространственных структур. Анализ полученных атомных моделей. Большая часть работы выполнялась лично соискателем, за исключением работы по кристаллизации, решению, уточнению и анализу структур апо-МогФДГ (разрешение 2.3 А) и холо-МогФДГ (разрешение 1.95 А), которая проводилась совместно с Е.В. Филлиповой. Большая часть работы (более 85%) выполнялась соискателем.

Практическая значимость работы. Значительно расширена структурная основа для понимания механизма действия используемого в биотехнологии фермента. Полученная структурная информация может быть с успехом использована для дальнейшего дизайна рекомбинантного биокатализатора для систем регенерации никотинамидных коферментов в биотехнологии. Предложен ряд перспективных мутаций для увеличения термостабильности АгаФДГ и повышения сродства АгаФДГ и СЬоФДГ к НАД+. Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы были представлены на следующих конференциях: международная конференция «Biocatalysis - 2007» (Москва, 2007), VI Национальная конференция по применению рентгеновского, синхротронного излучений, нейтронов и электронов для исследования материалов (РСНЭ-2007) (Москва, 2007), IV съезд Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, 2008), Recent Developments in Macromolecular Crystallography (India, Pune, 2008), международная конференция "Рентгеновское, Синхротронное излучения, Нейтроны и Электроны для исследования наносистем и материалов. Нано-Био-Инфо-Когнитивные технологии" (Москва, 2009).

Публикации. По материалам настоящей диссертации опубликовано 2 статьи в рецензируемых журналах (из них одна статья в журнале, входящем в Перечень ведущих рецензируемых научных журналов и изданий ВАК РФ), одна статья в сборнике и 6 тезисов конференций. Объем и структура работы. Диссертационная работа состоит из введения, литературного обзора, описания материалов и методов, изложения результатов и их обсуждения (4 главы), заключения, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 157 ссылок. Работа изложена на 133 страницах, содержит 46 рисунков и 6 таблиц.

ВВЕДЕНИЕ

Обсуждена актуальность темы диссертации, сформулированы цели и задачи исследования.

ОБЗОР ЛИТЕРА ТУРЫ

Рассмотрена физиологическая роль ФДГ в различных организмах, проведен сравнительный анализ аминокислотных последовательностей фермента. Проанализирована литература по кинетическим свойствам ФДГ в растворе, по пространственным структурам ФДГ и по исследованию механизма действия этого фермента.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 1. Объекты исследования

В качестве объекта исследования были выбраны НАД+-зависимые формиатдегидрогеназы из метилотрофной бактерии Moraxella sp. С-1 (МогФДГ) и высшего растения Arabidopsis thaliana (АгаФДГ). Белки были

экспрессированы, выделены и очищены сотрудниками группы генетической инженерии и белкового дизайна кафедры химической энзимологии химического факультета МГУ под руководством профессора В.И. Тишкова.

2. Кристаллизация

Кристаллизация проводилась методом диффузии в парах в висячих каплях при температуре 20°С в термостатированной комнате. В случае кристаллизации холо-формы ФДГ к раствору белка добавляли кофермент НАД+ и азид натрия до концентрации каждого 5 мМ. Раствор белка с концентрацией от 6 до 14 мг/мл перед кристаллизацией центрифугировался. Для приготовления каждой капли бралось 2 мкл белка и смешивалось с резервуарным раствором в соотношении 1:1. После нахождения первоначальных условий кристаллизации для улучшения качества и размеров кристаллов проводилась серия экспериментов по оптимизации состава противораствора и концентрации раствора белка. Оптимизированные условия кристаллизации представлены в таблице 1.

Таблица 1. Условия кристаллизации МогФДГ и АгаФДГ.

Структура Разрешение, А Состав раствора белка Состав противораствора

Апо-МогФДГ открытая 2.3 8 мг/мл МогФДГ, 2.5 мМ АДФР, 5 мМ формиат натрия, 0.1 М калий-фосфатный буфер рН 7.0 0.1 M ацетат аммония, 21% ПЭГ 8000, 0.1 M Bis-Tris буфер рН 5.5

Апо-МогФДГ закрытая 1.96 10.5 мг/мл МогФДГ, 0.1 М калий-фосфатный буфер рН 7.0 0.1MHEPES рН 7.5, 2.2 M Сульфат аммония, 2% PEG400

Холо-МогФДГ 1.95 11 мг/мл МогФДГ, 5 мМ НАД*, 5 мМ азид натрия, 0.1М калий-фосфатный буфер рН 7.0 0.1 M Bis-Tris буфере рН 6.5, 2.3 M сульфат аммония

Холо-МогФДГ 1.1 10.5 мг/мл МогФДГ, 5 мМ НАД*, 5 мМ азид натрия, 0.1М калий-фосфатный буфер рН 7.0 0.1 M Bis-Tris буфере рН 6.5, 2.0 M сульфат аммония

Апо-АгаФДГ 1.7 6 мг/мл АгаФДГ, ЮтМ ЭДТА, 0.1 М калий-фосфатный буфер рН 7.0 0.1 M Bis-Tris рН 6.0, 2.1 M сульфат аммония

Холо-АгаФДГ 2.0 14 мг/мл АгаФДГ, 5 мМ НАД*, 5 мМ азид натрия, ЮтМ ЭДТА, 0.1 М калий-фосфатный буфер рН 7.0 0.1 M Bis-Tris рН 5.5, 2.1 M сульфат аммония

3. Рентгеноструктурный эксперимент, решение и уточнение пространственных структур

Дифракционные данные были получены: на станции К4.4 Курчатовского центра синхротронного излучения и нанотехнологий (структуры апо-МогФДГ-закрытая и холо-АгаФДГ), на источнике рентгеновского излучения ELLIOT GX-6 с вращающимся анодом в Институте Белка РАН, г. Пущино (структура холо-МогФДГ (1.95 А)) и на станциях Х11 и Х13 синхротрона Гамбургского отделения EMBL (структуры апо-МогФДГ, холо-МогФДГ (1.1 А) и апо-АгаФДГ). Статистические характеристики наборов дифракционных данных представлены в таблице 2.

Таблица 2. Статистические характеристики наборов дифракционных данных. В скобках приведены данные для последнего слоя разрешения.

Набор данных Апо-МогФДГ открытая Апо-МогФДГ закрытая Холо-МогФДГ Холо-МогФДГ Апо-АгаФДГ Холо-АгаФДГ

Станция EMBL-Hamburg, Х13 кцси K4.4 Институт белка РАН ELLIOTT GX-6 EMBL-Hamburg, Х11 EMBL-Hamburg, Х13 кцси К4.4

Температура, К 100 100 293 100 100 100

Длина волны, А 0.80 1.05 1.54 0.82 А 0.81 0.99

Разрешение, А 20-2.3 (2.33-2.3) 39.1-1.96 (2.05-1.96) 27.8-1.95 (2.0-1.95) 20-1.1 (1.11-1.10) 20-1.7 (1.8-1.7) 20-2.0 (2.07-2.0)

Группа симметрии и параметры кристаллической ячейки (А и град) Р21 а=77.9, Ь=123.5, с=85.3; а=у=90, Р=95 С2 а=80.66, Ь=66.09, с=75.55; a=Y=90, Р=104.13 С2 а=80.45, Ь=66.50, с=75.55; a=Y=90, Р=103.57 С2 а=79.24, Ь=66.24, с=74.20; a=Y=90, р=103.40 Р2,2,21 а=70.33 Ь=106.23 с=106.50; а= P=Y=90 С2 а=229.62, Ь=217.68, С=139.11; a=Y=90, р= 92.62

Число измеренных рефлексов 107292 88327 67848 586345 892591 912286

Число уникальных рефлексов 68344 27648 27554 145564 84701 428654

Мозаичность, град 1.7 0.7 0.35 0.7 0.45 0.18

Полнота, % 96.1 (83.1) 99.5 (100) 97.1 (95.1) 96.5 (73.8) 95.9 (90.4) 93.6 (87.9)

Ктегде, % 12.1 (15.5) 12.2 (47.6) 9.4 (35.7) 5.1 (52.9) 4.6 (32.3) 7.5 (32.8)

I/ о1 9.2 6.0 (2.1) 8.0 (3.0) 44 (1.9) 31.3 (5.4) 8.9 (2.6)

Температурный фактор из графика Вилсона, А2 43 33.1 25.7 11.5 25.6 21.7

Дифракционные данные для структур апо-МогФДГ и холо-МогФДГ (1.1 А) были обработаны программами DENZO и SCALEPACK. Данные для структуры апо-МогФДГ-закрытая обрабатывались программой AUTOMAR. Дифракционные данные для всех остальных структур были обработаны программой XDS. Пространственные структуры были решены методом молекулярного замещения по программе MOLREP. В качестве стартовой модели для решения структур ano- и холо-МогФДГ использовались структуры одной субъединицы ano- и холо-РзеФДГ, соответственно. Для решения структур ano- и холо-АгаФДГ использовалась структура кофермент-связывающего домена холо-МогФДГ, каталитические домены были достроены в процессе уточнения вручную. Кристаллографическое уточнение структур проводили по программе REFMAC. Для всех неводородных атомов структуры холо-МогФДГ (1.1 А) температурные факторы уточнялись в анизотропном приближении, все остальные структуры уточнялись в изотропном приближении. При уточнении структуры холо-МогФДГ (1.1 А) и структуры апо-АгаФДГ (1.7 А) учитывался вклад атомов водорода в рассеивание. Для визуального контроля за ходом уточнения, внесения существенных изменений в атомную модель структуры и локализации молекул воды использовали графическую программу COOT. Статистические характеристики уточнения структур и атомных моделей приведены в таблице 3.

Таблица 3. Статистические характеристики уточнения структур и атомных моделей.

Структура Апо-МогФДГ открытая Апо-МогФДГ закрытая Холо-МогФДГ Холо-МогФДГ Апо-АгаФДГ Холо-АгаФДГ

Разрешение, А 2.3 1.96 1.95 1.1 1.7 2.0

R-Фактор/ Rfree, % 23.1/32.7 18.7/24.0 14.2/18.4 13.4/15.9 16.8/19.7 18.9/23.1

Число рефлексов: в уточнении в расчете R,,« 64841 3451 26255 1382 26730 1407 138020 7275 83414 4170 421051 21052

RMSD длин валентных связей,А 0.019 0.020 0.018 0.015 0.017 0.019

RMSD валентных углов, град 1.9 1.8 1.6 1.7 1.6 1.6

Средневзвешенная ошибка координат атомов (DPI), А 0.321 0.175 0.165 0.028 0.093 0.144

Число неводородных атомов

в модели: белок 12101 3005 3097 3106 5442 32870

вода 480 97 181 437 559 3745

лиганды 3 12 47 84 30 723

Средний темп-ный фактор, А2: атомов белка 37.1 32.4 18.6 19.1 30.7 23.5

молекул воды атомов лигандов 34.2 26.5 33.1 30.1 27.4 12.6 31.8 24.9 40.2 39.8 32.1 23.6

Доля остатков на графике Рамачандрана в областях, %: наиболее благоприятных 83.7 86.4 89.4 90.0 89.8 88.7

разрешенных запрещенных 16.0 0.3 13.3 0.3 10.3 0.3 9.7 0.3 10.2 0 11.3 0

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 1. Структуры холо- и апо-форм МогФДГ Холо-форма МогФДГ

Пространственная структура холо-МогФДГ содержит в независимой части элементарной ячейки одну молекулу белка в закрытой конформации в комплексе с НАД+ и ионом азида, аналогом субстрата в переходном состоянии ферментативной реакции. Молекулу димера МогФДГ образуют субъединицы, связанные кристаллографической поворотной осью симметрии второго порядка (Рис. 1). На С-конце полипептидной цепи структуры холо-МогФДГ были обнаружены 8 дополнительных аминокислотных остатков (392-399), которые не удавалось локализовать по картам электронной плотности в структуре холо-РэеФДГ. Часть дополнительных остатков образуют а-спираль а20 и способствуют более прочному междоменному взаимодействию в результате образования двух водородных связей (Азп317-С1и397) и гидрофобного кластера (Тгр99, Рго314, Туг396 и Тгр177 соседней субъединицы димера). Два С-концевых остатка 400-401 не локализованы.

Полипептидная цепь субъединицы МогФДГ организована в глобулярную двухдоменную структуру, подобную структуре РэеФДГ: кофермент-связывающий домен образован аминокислотными остатками

147-333, а каталитический сформирован остатками 1-147 и 333-401 (Рис. 1). Холо-МогФДГ и холо-РэеФДГ имеют практически одинаковый ход полипептидной цепи: при суперпозиции отдельных субъединиц этих структур ЯМБО Са атомов равно 0.42 А. Отклонения, превышающие 1 А, были обнаружены только в каталитическом домене. Вторичные структуры холо-МогФДГ и холо-РэеФДГ практически одинаковы (Рис. 2). Однако МогФДГ и РэеФДГ отличаются организацией димерного контакта: при практически одинаковой площади (3953 и 3799 А2, соответственно), димерный контакт в холо-МогФДГ содержит 54 водородных связей, а в холо-РэеФДГ - 42 водородных связей. При этом все водородные связи между субъединицами в димере холо-РэеФДГ сохраняются и в холо-МогФДГ.

Рис. 1. Ход полипептидной цепи димерной молекулы МогФДГ в холо- (слева) и апо- (справа) форме. Левая субъединица димера окрашена в голубой цвет, кофермент-связывающий домен правой субъединицы - в фиолетовый, каталитический домен правой субъединицы - в розовый. В структуре холо-МогФДГ остатки 375-391, не структурированные в апо-МогФДГ, показаны моделью красного цвета, дополнительные остатки 392-399 (относительно структуры холо-РэеФДГ) -темно-красного цвета, молекула НАД* - зеленого цвета, ион азида - красного цвета. Ось второго порядка, связывающая субъединицы димера, направлена перпендикулярно плоскости рисунка.

Кофермент связывается в междоменной щели и взаимодействует в основном с остатками кофермент-связывающего домена (Рис. 3). В связывании кофермента в структурах холо-МогФДГ и холо-РэеФДГ участвуют одинаковые остатки и молекулы воды, единственным отличием является отсутствие молекулы воды у атома N1A кофермента в МогФДГ. Каталитические центры холо-РэеФДГ и холо-МогФДГ устроены практически одинаково (Рис. 4). Единственным отличием является наличие водородной связи между ионом азида и остатком His332 в структуре холо-МогФДГ (расстояние равно 3.2 А, в холо-РэеФДГ - 3.6 А). Наличие этой связи подтверждает высказанную ранее на основе теоретических расчетов и данных сайт-направленного мутагенеза гипотезу о том, что остаток His332 может образовывать водородную связь с субстратом как в комплексе Михаэлиса, так и в переходном состоянии ферментативной реакции.

РэефДГ 1

МогфДГ 1

АгаФДГ 21

СЪоФДГ 1

РЫАЭ Э ОР Э К

«1 «2

Еьа Ь И К У Ь Е 64

ЕЬб Ь ЕКУЬЕ 64

А Ь й I ЕОИЬ Е 64

К Ь в I АНИЬК 34

[52

РэеФДГ 65 "эЫсн ТЬУ УТ ЭРКР

МогФДГ 65 г|2д н Е Ь V V Т Э Э КР

АгаФДГ 65 0 У I V т Р Р К Е

СЪоФДГ 35 РЮв н ЕЫТТ Б Р К Е

РзеФДГ 13 5 МогфДГ 13 5 АгаФДГ 13 5 СЪоФДГ 107

NN I А1вЬ К К I

Р5

Т V А Е УТ У с N Б

Т V А Е УТ У с N Э

Т V А Е УТ е в N V

Э УЬ Е УТ с э N У

Ь о - - 8А1Я ЫЭ--АА1Б| Ь0--АААА Ь Р У I N О т[5"

а9 Ц7 а10 |Э8

РэеФДГ 207 ■ V- ■ ьнут 1)ЕН8ЬР Е 3 V Е К Ell.NL ТЧ Н АТ

МогФДГ 207 Ь| |ьа| ■ м- Вьнут Р Я Н I? Ь Р Е А V Е К L ти НАТ

АгаФДГ 135 нькр ЛЬ Ь У н Р К Ь ОМА Р Е Ь Е К Ед)с А| К Р V Е Р

СЪоФДГ 179 1 |ъу| Црк Е Ь Ь У У Р У Ч А Ь Р К Р А Е Е к|у в|А я я У Е N

Б! Е Р М У Р У1СИУУТ Ь БЕОЫ у[^А СИУ УТЬ Ь N Е М Ь Р к|С ШУ I V I I Е Е Ь У|А О А р| I V Т V

рю а13

РзеФДГ 278 ■ I У N ТАЕ бКЬ

МогФДГ 278 Иь V N ТАИ вкь

АгаФДГ 135 ПУН НАР О А I

СЪоФДГ 251 ТАР вА1

«14

ЯРАУАРАЬЕ БИ1? К Р АIV И А ЬЕдНи КОАУ УРАУЕ[Г<ЗН А Е Р V АА АЬ Е З1о0

ьИсуАдаУ ьИс УАЮРV I в вУ ЗЮБУ ьИо у сс|ру|

НСРЬНРЕТЕНМГЫБ НСЯНРЕТЕНтИБ МИРЫЕКТВЗМР ЯАРЬЕАаТКСЧ ы^с

рсЪо

МРУ-----ыомтрн!

мрн-----ЖашЕлтя

МРЯ-----ОАДТРНТ Е

м|ик|ал иаИтриуе

«17

РзеФДГ 345 МогфДГ 34 5 АгаФДГ 135 СЪоФДГ 3 23

ААвШЕ1ЬЕСГ РЕ|б К - Р I КБ Е У ААвТИЕ1ЬЕСУРЙв И - Р IЬ Р Е У ААСТКРМЬЕБУ ЕИвЕ -ВРРТЕЯ

АооткьгтьЕЗР ?|т акту и|р о р

«18 Р12

_ 013 «19

ъ I Уо|в о|дь|дд|тед1Г8|у э к г N а т в вдй

ЬIУЮвв ВЬАЮУОАНэкЭ К й

У 1 УД]р О|Е Ь|а----1р О -----

I I ьГЕи Э Е У V - - -ТКАУвКНРКК

а2 0

Рис. 2. Сравнение аминокислотных последовательностей всех ФДГ, для которых решены пространственные структуры. Остатки, участвующие в димерном контакте, выделены зеленым фоном. Остатки, не локализованные ни в одной из пространственных структур каждого фермента, выделены красным цветом. Каталитически важные остатки отмечены звездочками. Остатки, участвующие в димерном контакте и элементы вторичной структуры приведены для холо-форм ферментов, за исключением СЬоФДГ.

ЫН1 Агд284 ......МГМГМ» \ *Р2 А«п146 |

^ [ооВегЗи!

и С.М ^

Иа127 О.И-.^.С,«

| онтуз8<|х' | ^О.И

С.Н-^С^Ч-^ 002 А»р]08 I 1.. 001А«р308

ИаН2

Мб!у203

наугоо

ОЛ-РМ—о.м.

ОРР /

[ 001 ТЬг143| У¥аШ У7а13 О,*--0,А

О.'А

С.'А

ОС БегЗвО

N ||а202 . НАгд201 ■ • • НН1 Агд201 \Vat94

,ИаВ1 ^Е2Н1»379

С,» - 0,'А

о;» |

Л. _С, А

^ "о;А 001Атр221 /

с_АХ .-"Л

I I

....."Е2Н1»258

Ш Агд284 | НИ«122|

НН1 Лгд284 | МРД А»п14<|

МЕгн|»332 Г^л

10Р2 А«р1251

10Ё2 аи141]

0.Н I

I I

С,Н

см %С.Н ы

I Г

|О А5П282

II \

002 Аар308 001 А»р309

№■1238

ОЛ*Г|254 .«237 "О"2"

иоугоо

N 11*202

\ N Ыу144|

_ \

ОРР

I-1 /

| 001 ТНМ43| У»а1249 «Уа|236 0,А-РА-о/.

| НЕ2 С1п37б| £ ,д

/ '

\Hat241

С4'А »О'А

Wat242 / "С,А 002А«р221

О,А

МН1 Атд201 N42 Агд201

N Агд201 НН1 Агд201

Жа1243 \Wat305 М2Агд204 Иа1240

N£2 Н1а220 УУа131

С,'А /

_ С »

I Г >

"0,'А О01 Аар221

Иа123Э N41 Агд222 N£2 Агд222

Н,А \Wal244 I о Агд378 I

Рис. 3. Схема связывания НАД* и иона азида в структурах холо-МогФДГ (слева) и холо-АгаФДГ (справа). Водородные связи показаны пунктиром. Остатки, отличающиеся характером боковой цепи в этих структурах, выделены синим цветом. Остатки и молекулы воды, не участвующие в связывании кофермента в одной из структур, выделены красным цветом. Остатки каталитического домена обведены рамкой. Молекулы воды, сохранившиеся и в структуре апо-МогФДГ-закрытая, выделены синим фоном на схеме для холо-МогФДГ.

Авп 282

Рис. 4. Каталитический центр холо-МогФДГ (слева) и холо-АгаФДГ (справа). Водородные связи изображены в виде красных пунктирных линий. Структура холо-РэеФДГ приведена моделью черного цвета.

Апо-форма МогФДГ

В независимой части элементарной ячейки структуры апо-МогФДГ содержится два димера фермента в открытой конформации, образованные субъединицами (А)(В) и (С)(0). Субъединицы в димере связаны некристаллографическими поворотными осями второго порядка (Рис. 1). Все субъединицы в структуре апо-формы МогФДГ очень похожи: КМБй Са атомов при попарном наложении субъединиц равно 0.35-0.46 А. В субъединицах (А) и (О) были локализованы по 374 аминокислотных остатка, а в субъединицах (В) и (С) по 369. Таким образом, как и в апо-РэеФДГ, большой С-концевой фрагмент (остатки 375-401) структуры апо-МогФДГ не локализован. Апо-МогФДГ имеет более открытую (на 2-5° при сравнении разных субъединиц) конформацию по сравнению с апо-РэеФДГ.

Как и в апо-РэеФДГ, боковая цепь остатка каталитического центра Агд284 имеет разные конформации в различных субъединицах, что свидетельствует о его конформационной подвижности в апо-форме. Конформация петли каталитического центра 122-125 различна в субъединицах структуры апо-МогФДГ, что подтверждает высказанное ранее предположение о её гибкости в апо-форме ФДГ. Боковые цепи остатков Агд222, Шз223, Н1з258 и С1и260 аденин-связывающего сайта имеют различные конформации во всех субъединицах (как и в апо-РэеФДГ), что позволяет сделать вывод о лабильности аденин-связывающего сайта ФДГ в открытой конформации в отсутствие кофермента.

Как следует из сравнения структур апо- и холо-форм МогФДГ, при связывании НАД* и иона азида молекула МогФДГ приобретает закрытую конформацию, как это было описано ранее для РэеФДГ. Каталитический домен смещается как единое целое в сторону кофермент-связывающего на угол -12° (на 2-4° больше, чем для РэеФДГ), что приводит к компактизации каталитического центра. При этом структурируются остатки каталитического центра 123-124 и Агд284 и остатки аденин-связывающего сайта Агд222, Н1э223, Нз258 и С1и260. Кроме того, структурируются С-концевые остатки

375-399 с образованием а-спиралей а19 и а20 (Рис. 1, Рис. 2). Небольшие отличия в организации доменов в апо- и холо-МогФДГ (отклонения Са атомов на 1.0-2.4 А относительно домена, к которому они относятся) вызваны связыванием кофермента (остатки 223-224, 257-262), структурированием С-концевых остатков (130-136, 223-224, 257-262, 316317), структурированием каталитического центра (123-124) и подстройкой остатков, участвующих в междоменных взаимодействиях (17-29).

2. Структура апо-формы МогФДГ в закрытой конформации

Пространственная структура апо-формы МогФДГ в закрытой конформации представляет собой редкий пример структуры апо-формы НАД+-зависимой дегидрогеназы с закрытой междоменной щелью. Кристаллы апо-МогФДГ в закрытой конформации изоморфны кристаллам холо-МогФДГ. Ход полипептидной цепи этих структур практически одинаков: КМБй Са атомов при суперпозиции по 399 остаткам составляет 0.31 А. При этом различия более 1 А в положениях Са атомов наблюдаются только в области связывания адениновой части кофермента (остатки 222-224). Как и в холо-МогФДГ, в структуре апо-МогФДГ-закрытая структурированы С-концевые остатки 375-399 (Рис. 1). Таким образом, переход фермента к закрытой конформации сопровождается структурированием С-концевого фрагмента 375-399 даже без связывания кофермента.

В междоменной полости структуры апо-МогФДГ-закрытая локализованы молекула воды и ион сульфата на месте связывания пирофосфатной части НАД+, а также молекула глицерина с половинной заселенностью и молекула воды на месте связывания никотинамидной части НАД* и субстрата (т.е. в каталитическом центре). Других молекул, связанных на месте НАД+, обнаружено не было. В структуре апо-МогФДГ-закрытая шесть из девяти молекул воды, участвующих в связывании НАД+ в структуре холо-МогФДГ, имеют те же позиции и вовлечены в такую же сетку водородных связей, что и в холо-МогФДГ (Рис. 3). Возможными причинами кристаллизации апо-МогФДГ в закрытой конформации являются наличие дополнительных С-концевых остатков 392-399 и связывание иона сульфата на месте пирофосфатной части НАД+, поскольку эти факторы способствуют междоменным взаимодействиям. Кроме того, нельзя исключать возможное влияние межмолекулярных контактов в кристалле на конформацию фермента. Молекула глицерина в каталитическом центре не могла способствовать кристаллизации фермента в закрытой конформации, поскольку глицерин содержался только в растворе криопротектанта, в который кристаллы помещались непосредственно перед сбором данных.

Остатки каталитического центра структуры апо-МогФДГ-закрытая находятся практически в тех же конформациях, что и в холо-МогФДГ (отклонения в позициях атомов не превышают 0.6 А), т.е. находятся в каталитически-активной конформации. Этот факт является значительным

отличием структуры апо-МогФДГ-закрытая от структур апо-РэеФДГ и апо-МогФДГ, в которых остатки каталитического центра, относящиеся к разным доменам, пространственно удалены друг от друга из-за открытой конформации фермента, петля 122-125 имеет две конформации основной цепи, а остаток Агд284 имеет несколько конформаций боковой цепи. Таким образом, можно сделать вывод, что переход фермента к закрытой конформации приводит к фиксации остатков каталитического центра в каталитически-активной конформации даже без связывания кофермента.

Сравнение структур апо-МогФДГ-закрытая и холо-МогФДГ показало, что связывание кофермента вызывает конформационные изменения фермента, которые не происходят при переходе фермента в закрытую конформацию без связывания кофермента. В сайте связывания адениновой части НАД+ позиции Са атомов в этих структурах различаются более чем на 0.5 А для остатков 221-226, 259-260 и 379-383 (Рис. 5). В структуре апо-МогФДГ-закрытая эти три фрагмента не связаны между собой водородными связями, а боковые цепи четырех остатков (Агд222, С1и260, Н^379 и 5ег382) разупорядочены и не локализованы по картам электронной плотности. Кроме того, в сайте связывания адениновой части НАД+ не обнаружены дополнительные молекулы, что указывает на заполнение этого сайта неупорядоченным растворителем в отсутствие кофермента. Таким образом, независимо от конформации фермента, ряд остатков аденин-связывающего сайта разупорядочен в апо-форме МогФДГ.

Ser 382

Glu 260

Рис. 5. Аденин-связывающий сайт в структурах апо-МогФДГ-закрытая

(зеленая) и холо-МогФДГ (малиновая). Водородные связи изображены в виде красных пунктирных линий. Боковые цепи остатков Arg222, Glu260, His 379 и Ser382 в структуре апо-МогФДГ-закрытая не локализованы по картам электронной плотности.

Рис. 6. Различие конформаций петли 221-226 в апо-МогФДГ-закрытая (серая), апо-МогФДГ (фиолетовая), апо-РзеФДГ (зеленая), холо-МогФДГ (красная) и холо-РэеФДГ (желтая). Структуры совмещены по всем Са атомам кофермент-связывающего домена.

В холо-форме МогФДГ кофермент образует пять водородных связей с остатками на участках 221-226, 259-260 и 379-383: с остатками Аэр221 (две связи), С1и260, 1-Пз379 (через молекулы воды) и 8ег380 (Рис. 5, Рис. 3). По-видимому, взаимодействие с коферментом вызывает смещение этих трех участков друг навстречу другу, что приводит к образованию пяти прямых водородных связей между ними. В результате, область связывания адениновой части НАД+ структурируется и компакгизируется (Рис. 5). Максимальный сдвиг Са атомов происходит на участке 221-226 кофермент-связывающего домена и составляет 2.3 А (остаток Н1б223). Конформация этой петли одинакова в структурах апо-МогФДГ, апо-МогФДГ-закрытая и апо-РэеФДГ, несмотря на то, что в случае апо-МогФДГ-закрытая фермент имеет закрытую конформацию. Конформация петли 221-226 в холо-формах МогФДГ и РэеФДГ также совпадает и отличается от её конформации в апо-формах (Рис. 6). Таким образом, можно сделать вывод, что изменение конформации петли 221-226 вызвано только связыванием кофермента, и не связано с переходом фермента в закрытую конформацию.

Решение уникальной структуры апо-формы МогФДГ в закрытой конформации позволило более полно охарактеризовать роль С-концевого фрагмента 375-399 и кофермента в стабилизации закрытой конформации бактериальных ФДГ. Остатки каталитического домена 375-391 структурируются при переходе фермента к закрытой конформации и способствуют её стабилизации, поскольку в результате этого между каталитическим и кофермент-связывающим доменами образуется 7 дополнительных водородных связей посредством этих остатков. Дополнительные остатки МогФДГ 392-399 также участвуют в междоменных взаимодействиях, образуя две водородные связи (Азп317-61и397) и гидрофобный кластер (Тгр99, Рго314, Туг396 и Тгр177 соседней субъединицы димера).

Кофермент связывается в основном с кофермент-связывающим доменом, но также образует 9 водородных связей (6 из них через молекулы воды) с каталитическим доменом (Рис. 3). Таким образом, кофермент значительно стабилизирует закрытую конформацию фермента, поскольку он связывает домены между собой. Однако, кофермент также способствует структурированию С-концевого фрагмента 375-399, поскольку образует водородные связи с остатками 1-Пз379 (через молекулу воды \/\/21), Туг381 (через молекулы воды \ZV27 и \Л/84) и 3ег380 (Рис. 5). Кроме того, связывание кофермента вызывает изменение конформации петли 221-226 (Рис. 6), приводя к образованию пяти водородных связей между этой петлей и С-концевыми остатками 379-382 (Рис. 5), что также способствует структурированию С-концевого фрагмента 375-391 и является междоменными взаимодействиями.

Данные малоуглового рентгеновского рассеивания свидетельствуют о том, что одного кофермента недостаточно для перехода ФДГ в закрытую

конформацию, также необходимо связывание субстрата (иона формиата) или ингибитора (иона азида). Анализ структур ФДГ показал, что это происходит по двум причинам. Во-первых, субстрат/ингибитор связывается с остатками из обоих доменов, связывая их между собой. Во-вторых, отрицательный заряд субстрата/ингибитора способствует уменьшению электростатического отталкивания между положительно заряженными остатком каталитического центра Агд284 и никотинамидной частью НАД*.

3. Структуры холо- и апо-форм АгаФДГ Холо-форма АгаФДГ

При анализе пространственных структур АгаФДГ выяснилось, что ход полипептидной цепи АгаФДГ и РэеФДГ на участке 48-374 (нумерация по РэеФДГ) практически одинаков. Поэтому, для удобства сравнительного анализа, остатки структур АгаФДГ были пронумерованы в соответствии с аминокислотной последовательностью 48-374 РэеФДГ (Рис. 2).

В независимой части элементарной ячейки структуры холо-АгаФДГ содержится 6 молекул (т.е. 12 субъединиц) АгаФДГ в закрытой конформации в комплексе с НАД* и ионом азида. В ходе сравнительного анализа выяснилось, что в структуре присутствуют два сорта этих молекул: две молекулы (А)(В) и (С)(0), в которых субъединицы похожи друг на друга, и остальные четыре молекулы, в которых субъединицы одной молекулы несколько отличаются. Субъединицы холо-АгаФДГ отличаются относительным расположением каталитических доменов относительно соответствующих кофермент-связывающих (разница 0.7-2.7°) и конформацией остатков 39-48 (максимальное различие в позициях Са атомов 4.8 А). На Рис. 7 представлена суперпозиция по Са атомам

кофермент-связывающих доменов максимально различающихся

субъединиц в структуре - (А) и (I) (РМЭЭ Са атомов составляет 0.53 А).

Рис. 7. Суперпозиция по кофермент-связывающим доменам субъединиц (А) (синяя) и (I) (зеленая) структуры холо-АгаФДГ. Молекула НАД+ показана фиолетовым цветом, ион азида -красным цветом.

Полипептидная цепь субъединицы АгаФДГ организована в глобулярную двухдоменную структуру, подобную структуре бактериальных ФДГ (Рис. 8): кофермент-связывающий домен АгаФДГ образован аминокислотными остатками 147-333, а каталитический домен сформирован остатками 28-146 и 334-378. Во всех субъединицах структуры холо-АгаФДГ

не локализованы по картам электронной плотности шесть 1М-концевых остатков (Рис. 2). С другой стороны, в отличие от структур холо-форм бактериальных ФДГ, в структуре холо-АгаФДГ локализованы все С-концевые аминокислотные остатки полипептидной цепи. Отчасти, это связано с тем, что в АгаФДГ С-конец короче на 22 остатка, чем в РэеФДГ.

Рис. 8. Ход полипептидной цепи димерной молекулы АгаФДГ в холо- (слева) и апо-(справа) форме. Окраска приведена в соответствии с элементами вторичной структуры. Некристаллографическая ось второго порядка, связывающая субъединицы димера, направлена перпендикулярно плоскости рисунка. Молекула НАД+ показана моделью малинового цвета, ион азида - красного.

Кофермент-связывающие домены МогФДГ и АгаФДГ имеют практически одинаковый ход полипептидной цепи (Рис. 9) и основные элементы вторичной структуры (Рис. 2). Значение РМБЭ Са атомов при суперпозиции остатков 147-333 холо-форм МогФДГ и АгаФДГ составило 0.96 А, различия в позициях Са атомов сравниваемых остатков не

превышают 2.3 А.

Рис. 9. Сравнение кофермент-связывающих доменов

субъединиц (А) холо-форм АгаФДГ (синяя) и МогФДГ (темно-красная) при

суперпозиции по остаткам 147-333. Молекула НАД+ показана фиолетовым цветом, ион азида - красным цветом.

Сравнение каталитических доменов структур холо-АгаФДГ и холо-МогФДГ при суперпозиции по остаткам 30-38 (1-9 в МогФДГ), 49-146 и 334369 приведено на Рис. 10. М-концевые остатки 39-48 и С-концевые остатки 370-378 структуры холо-АгаФДГ в сравнении не участвовали, поскольку ход полипептидной цепи ферментов на этих участках значительно отличается. Значение РМБО Са атомов при такой суперпозиции составило 0.58 А, при этом различия в позициях Са атомов сравниваемых остатков не превышают

1.3 А. На участках 30-38 (1-9 в МогФДГ), 49-146 и 334-369 основные элементы вторичной структуры каталитических доменов структур холо-АгаФДГ и холо-МогФДГ практически одинаковы, за исключением небольших отличий в их длине (Рис. 2).

Рис. 10. Сравнение каталитических доменов холо-форм АгаФДГ (синяя) и МогФДГ (темно-красная), при суперпозиции по остаткам 30-38 (1-9 в МогФДГ), 49-146 и 334369. Отличающиеся остатки МогФДГ 10-48 и 370-399 показаны красным цветом. Молекула НАД+ показана фиолетовым цветом, ион азида - красным цветом.

Основные отличия пространственной структуры АгаФДГ от структур бактериальных ФДГ заключаются в замене длинной 1М-концевой петли 10-48 коротким участком 39-48 и в отсутствии С-концевых остатков 375-378 и 383401 (Рис. 10). Остатки 40-46 образуют дополнительную, по отношению к структурам бактериальных ФДГ, а-спираль а0 (Рис. 2). Из-за отличия в организации Ы-конца площадь димерного контакта в АгаФДГ меньше на 24% в сравнении с МогФДГ и составляет 3023 А2. При этом в димерном контакте АгаФДГ участвует всего 32 водородных связи, что гораздо меньше в сравнении с 42 у РэеФДГ и 54 у МогФДГ.

Анализ структуры холо-АгаФДГ, являющейся первой структурой холо-формы эукариотической ФДГ, показал, что каталитические центры эукариотических и прокариотических устроены практически одинаково (Рис. 4). Каталитический центр АгаФДГ отличается только одной заменой ТИг282Азп среди остатков, имеющих водородные связи с субстратом и/или коферментом. Однако эта замена не приводит к изменению количества и характера водородных связей, поскольку 282-й остаток в этих структурах взаимодействует с коферментом посредством атома кислорода основной цепи.

Связывание кофермента в структурах холо-АгаФДГ и холо-МогФДГ значительно отличается (Рис. 3). Водородные связи между молекулой кофермента и остатками Эег147, Эег380, Н1э258 и С1и260, присутствующие в структуре холо-МогФДГ, в структуре холо-АгаФДГ отсутствуют или заменены на водородные связи через молекулы воды. Причем дополнительных, относительно структуры холо-МогФДГ, прямых водородных связей

кофермента с белком в структуре холо-АгаФДГ нет. В результате, адениновая часть кофермента, имеющая две прямые водородные связи с белком в структуре холо-МогФДГ (с остатками His258 и Glu260), в структуре холо-АгаФДГ имеет только опосредованные молекулами воды водородные связи с белком. Пирофосфатная часть кофермента также образует на две водородные связи меньше: в структуре АгаФДГ остаток Ser147 заменен на валин, а остаток Ser380 заменен на Gln376 (пространственное расположение остатка Gln376 в структуре холо-АгаФДГ эквивалентно расположению остатка Ser380 в структуре холо-МогФДГ). При этом в структуре холо-АгаФДГ больше на три водородных связей кофермента с молекулами воды, связанными с ферментом. Гидрофобный аденинин-связывающий карман кофермент-связывающего домена в АгаФДГ и МогФДГ устроен практически одинаково. На основе проведенного анализа пространственных структур для улучшения связывания кофермента предложены мутации Val147Ser, Thr258H¡s, Lys260Glu и Gln376Ser для АгаФДГ и мутации Valí 19Ser, Gly233Glu и Ala356Ser для СЬоФДГ.

Ano-форма АгаФДГ

В независимой части элементарной ячейки структуры апо-АгаФДГ находится одна молекула фермента в открытой конформации, т.е. две субъединицы, связанные некристаллографической поворотной осью симметрии второго порядка (Рис. 8). Субъединицы в структуре апо-формы АгаФДГ очень похожи: RMSD Са атомов при попарной суперпозиции субъединиц равно 0.05 А. В апо-АгаФДГ, как и в холо-АгаФДГ, не локализованы по картам электронной плотности шесть N-концевых остатков (Рис. 2). В отличие от структур апо-форм бактериальных ФДГ, в структуре АгаФДГ локализованы все С-концевые аминокислотные остатки полипептидной цепи, также как и в холо-форме.

Апо-форма АгаФДГ имеет гораздо более открытую конформацию, в сравнении с бактериальными ФДГ, что может быть объяснено заменой длинной жесткой петли 10-48 на короткий и гибкий участок 39-48 в пространственной структуре АгаФДГ (Рис. 7, Рис. 10). Как и в апо-формах других ФДГ, остатки каталитического центра в апо-АгаФДГ, относящиеся к разным доменам (Пе122 и Asn146 каталитического домена и Arg284 и His332 кофермент-связывающего домена), пространственно разнесены друг от друга из-за расхождения доменов в открытой конформации фермента. Остаток Arg284 имеет одну конформацию, однако атомы боковой цепи этого остатка имеют относительно высокие температурные факторы, что свидетельствует о его высокой конформационной подвижности. Петля каталитического центра 122-125 имеет такую же конформацию, как в холо-АгаФДГ.

Как следует из сравнения структур ano- и холо-форм АгаФДГ, при связывании НАД+ и иона азида молекула АгаФДГ приобретает закрытую конформацию, как и в бактериальных ФДГ. Каталитический домен

смещается как единое целое в строну кофермент-связывающего на угол -22°, что на 10-14° больше, чем для бактериальных ФДГ, из-за более открытой конформации апо-АгаФДГ. Небольшие отличия в организации доменов в ano- и холо-АгаФДГ (отклонения Са атомов на 1.0-3.4 А относительно домена, к которому они относятся) вызваны связыванием кофермента и образованием водородных связей с приблизившимися остатками С-концевого фрагмента 369-378 к кофермент-связывающему домену (остатки 222-223 и 257-261), подстройкой остатков каталитического центра (остатки 123 и 125) и подстройкой остатков, участвующих в междоменных взаимодействиях (остатки 39-48, 174-177, 184-185, 313, 316, 334-336, 369-378). Сближение доменов приводит к компактизации каталитического центра. Значительным отличием АгаФДГ от бактериальных ФДГ является отсутствие длинного С-концевого фрагмента, который структурируется при переходе к закрытой конформации: вместо этого С-концевые остатки 369-378 меняют свою конформацию со сдвигом Са атомов не более чем на 1.1-2.9 А. Кроме того, в случае АгаФДГ нет такого значительного изменения конформации петли 221-226 (максимальное смещение Са атомов составляет 1.3 А в сравнении с 2.3 А в МогФДГ) при связывании кофермента, что может быть связано с отличиями в организации аденин-связывающего сайта (Рис. 3).

4. Структура холо-формы МогФДГ с атомным разрешением

Значительным преимуществом атомного разрешения является большое количество дифракционных данных относительно количества уточняемых параметров, что позволяет уточнять температурные факторы неводородных атомов в анизотропном приближении. Путем увеличения времени кристаллизации удалось вырастить кристалл холо-МогФДГ (тройной комплекс МогФДГ-НАД+-азид), пригодный для сбора дифракционных данных с атомным разрешением.

"П* 282

Asp 308

V ti

Нчсг'чА"'"

lf © I

le 122

н.

INÍ^H I1

A0PR

Рис 11. Структура каталитического центра холо-МогФДГ с разрешением 1.1 А. Карта электронной плотности с коэффициентами 2|Р0| - |РС| показана для НАД* и азида с уровнем срезки 1.0 а.

Рис. 12. Переход никотинамидной группы НАД* в биполярную форму.

Кристалл оказался изоморфным кристаллам, использованным для решения структуры холо-МогФДГ с разрешением 1.95 А. Эти структуры практически идентичны: РМБй Са атомов равно 0.30 А, при этом максимальное отклонение Са атомов составляет 1.1 А (остаток Эег18). Координаты атомов боковых цепей 18 остатков, локализованных на поверхности белковой глобулы, отличаются более чем на 1 А, причем максимальное отличие составляет 9 А (остаток Агд26).

Структура с атомным разрешением позволила гораздо более полно и достоверно определить структуру растворителя и более точно идентифицировать альтернативные конформации остатков. На основании анализа значений температурных факторов и пиков электронной плотности удалось различить большинство атомов азота, кислорода и углерода, что дало возможность однозначно установить поворотные изомеры боковых цепей остатков гистидина и большинства остатков аспарагина и глютамина. Данные структуры с атомным разрешением подтвердили, что в каталитическом центре МогФДГ карбоксамидная группа кофермента зафиксирована водородными связями с остатками каталитического центра в транс-конформации (Рис. 11, атом 07 направлен в сторону атома С4), которая, согласно квантово-механическим расчетам для газовой фазы, на 2 ккал/моль менее выгодна чем цис-конформация. Кроме того, подтверждено наличие водородной связи между ионом азида и остатком Н1э332 в структуре холо-МогФДГ (расстояние равно 3.2 А).

Согласно литературным данным, тройной комплекс ФДГ-НАД+-азид является стабильным аналогом переходного состояния ферментативной реакции. Ранее на основании исследования кинетических изотопных эффектов, а также расчетными теоретическими методами, было показано, что в переходном состоянии катализируемой ФДГ реакции молекула кофермента, находящаяся в энергетически-возбужденной транс-конформации, может приобретать т.н. биполярную форму (Рис. 12). При этом должно наблюдаться возрастание отрицательного заряда на атоме 07 карбоксамидной группы, а также уменьшение длины связи СЗ-С7 и увеличение длины связи С7-07 по сравнению с молекулой кофермента в свободном состоянии. Данные изменения способствуют увеличению частичного положительного заряда на атоме С4 кофермента, повышая его электрофильность и тем самым благоприятствуя скорость-лимитирующему переносу гидрид-иона и протеканию ферментативной реакции.

В результате отдельного цикла уточнения программой ИЕРМАС с ослабленными ограничениями на длины связей никотинамидной группы длина связи С7-07 составила 1.29 А , что на 0.06 А длиннее стандартного значения, а длина связи СЗ-С7 составила 1.43 А, что на 0.07 А короче стандартного значения. Эти различия всего в 1.3 раза больше, чем ошибка в определении длин связей, оцененная как сумма двух средневзвешенных ошибок координат атомов (таблица 3). Тем не менее, наши

экспериментальные данные отражают тенденцию к изменению длин ковалентных связей, соответствующую приобретению никотинамидной группой кофермента биполярной формы в переходном состоянии ферментативной реакции, постулированной ранее.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ВЫВОДЫ

1. Решены пространственные структуры ФДГ из бактерии Moraxella sp. С-1 (МогФДГ) в апо- и холо-формах с разрешением 2.3 и 1.95 А, соответственно. Показано, что МогФДГ имеет одинаковые с ранее исследованной ФДГ из бактерии Pseudomonas sp. 101 (РэеФДГ) пространственную укладку полипептидной цепи, каталитический центр и сайт связывания кофермента. При этом МогФДГ отличается организацией димерного контакта в молекуле и наличием восьми дополнительных С-концевых остатков в структуре холо-формы.

2. Решена пространственная структура апо-формы МогФДГ в закрытой конформации с разрешением 1.96 А. Переход фермента к закрытой конформации сопровождается фиксацией остатков каталитического центра в каталитически-активной конформации и упорядочиванием С-концевого фрагмента 375-399 даже без связывания кофермента. С другой стороны, изменение конформации петли 221-226 в аденин-связывающем сайте происходит только при связывании кофермента. Показана роль С-концевого фрагмента 375-399, кофермента и субстрата/ингибитора в стабилизации закрытой конформации бактериальных ФДГ.

3. Решены пространственные структуры ФДГ из высшего растения Arabidopsis thaliana (АгаФДГ) в апо- и холо-формах с разрешением 1.7 и 2.0 А, соответственно. Показано, что АгаФДГ и бактериальные ФДГ имеют похожие ход полипептидной цепи, вторичную структуру и устройство каталитического центра. АгаФДГ отличается заменой длинной N-концевой петли 10-48 (нумерация по РэеФДГ) на короткий участок 39-48, укороченным на 22 остатка С-концом, более открытой информацией апо-формы и меньшим количеством водородных связей между НАД* и ферментом.

4. Впервые для ФДГ решена с атомным разрешением пространственная структура тройного комплекса МогФДГ-НАД+-азид, имитирующего переходное состояние ферментативной реакции. Подтверждено, что карбоксамидная группа кофермента имеет транс-конформацию, а остаток каталитического центра His332 может образовывать водородную связь с субстратом в переходном состоянии реакции. В структуре обнаружена тенденция к изменению длин ковалентных связей никотинамидной группы кофермента в сторону образования биполярной формы, существование которой в переходном состоянии ферментативной реакции было постулировано ранее.

Список работ по теме диссертации

Shabalin, I. G., Filippova, Е. V., Polyakov, К. M., Sadykhov, E. G., Safonova, T. N., Tikhonova, T. V., Tishkov, V. I., Popov, V. 0. Structures of the apo and holo forms of formate dehydrogenase from the bacterium Moraxella sp. C-1: towards understanding the mechanism of the closure of the interdomain cleft. Acta Crystallogr. D Biol. Crystallogr., 2009, V. 65, № 12, P. 1315-1325.

Шабалин И. Г., Поляков К. M., Тишков В. И., Попов В. О. Пространственная структура НАД+-зависимой формиатдегидрогеназы из бактерий Moraxella sp. С-1 при атомном разрешении. Acta Naturae, 2009, N°. 3, С. 98-102.

Shabalin, I.G., Tikhonova, T.V., Polyakov, K.M., Skirgello, O.E, Tishkov, V.l., Dorovatovskiy, P.V., Popov, V.O. Crystal structures of novel NAD+-dependent formate dehydrogenases from bacterium Moraxella sp. C-1 and higher-plant Arabidopsis thaliana. EMBL Annual Reports, 2007, V. 2, P. 109-110.

Polyakov K.M., Shabalin I.G., Tikhonova T.V., Skirgello O.E., Serov A.E., Dorovatovskiy P.V., Tishkov V.l. and Popov V.O. The Structure of NAD+-dependent formate dehydrogenase from plant Arabidopsis Thaliana at 2 A resolution. International conference "Biocatalysis - 2007. Structure, functions, applications", Moscow, St.-Petersburg, 2007, P. 117-118.

Шабалин И.Г., Поляков K.M., Скиргелло O.E., Дороватовский П.В., Тихонова Т.В., Тишков В.И., Попов В.О. Пространственные структуры формиатдегидрогеназы из бактерии Moraxella sp.C-1 и из растения Arabidopsis thaliana. VI Национальная конференция по применению рентгеновского, синхротронного излучений, нейтронов и электронов для исследования материалов (РСНЭ-2007), Москва, 2007, С. 69.

Шабалин И.Г., Поляков K.M., Тишков В.И., Попов В.О. Пространственные структуры комплексов формиатдегидрогеназы из бактерии Moraxella sp. C-1 с окисленным и восстановленным коферментом. IV съезд Российского общества биохимиков и молекулярных биологов, Новосибирск, 2008, С. 35.

Shabalin I.G., Tikhonova T.V., Polyakov K.M., Skirgello O.E., Dorovatovskiy P.V., Tishkov V.l., Popov V.O. Apo- and holo-forms of NAD+-dependent formate dehydrogenases from a bacterium Moraxella sp. C-1 and the higher-plant Arabidopsis thaliana. Recent Developments in Macromolecular Crystallography, India, Pune, 2008, P. 34.

Шабалин И.Г., Поляков K.M., Тишков В.И., Попов В.О. Пространственная структура НАД+-зависимой формиатдегидрогеназы из бактерии Moraxella sp. С-1 при атомном разрешении. Рентгеновское, Синхротронное излучения, Нейтроны и Электроны для исследования наносистем и материалов. Нано-Био-Инфо-Когнитивные технологии, Москва, 2009, С. 111.

Дороватовский П.В., Шабалин И.Г., Поляков K.M., Садыхов Э.Г., Тишков В.И., Попов В.О. Пространственная структура апо-формы формиатдегидрогеназы из бактерии Moraxella sp. С-1 в закрытой конформации. Рентгеновское, Синхротронное излучения, Нейтроны и Электроны для исследования наносистем и материалов. Нано-Био-Инфо-Когнитивные технологии, Москва, 2009, С. 72.

Заказ № 120-1/05/10 Подписано в печать 05.05.2010 Тираж 120 экз. Усл. п л. 1,2

ООО "Цифровичок", тел. (495) 649-83-30 www.cfr.ru; е-таН:info@cfr.ru

Содержание диссертации, кандидата химических наук, Шабалин, Иван Григорьевич

1. ИСПОЛЬЗУЕМЫЕ СОКРАЩЕНИЯ.

2. ВВЕДЕНИЕ.

3. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

3.1. Физиологическая роль ФДГ в различных организмах.

3.1.1. Микроорганизмы.

3.1.2. Высшие растения.

3.2. Пространственная структура ФДГ.

3.2.1. Структуры ano- и холо-форм РзеФДГ.

Пространственная организация РэеФДГ.

Структурные изменения РэеФДГ при переходе к закрытой конформации.

Связывание кофермента и структура каталитического центра РэеФДГ.

Субстратный канал.

3.2.2. Структура комплекса РзеФДГ с АДФР.

3.2.3. Тетрагональная кристаллическая модификация апо-формы РэеФДГ.

3.2.4. Структуры комплексов РэеФДГ с ионом формиата.

3.2.5. Структуры мутантных форм РвеФДГ.

3.2.6. Структура апо-формы СЬоФДГ.

3.3. Сравнительный анализ аминокислотных последовательностей ФДГ.

3.4. Молекулярные и кинетические свойства ФДГ в растворе.

3.4.1. Стабильность.

3.4.2. Формально-кинетический механизм.

3.4.3. Кинетические параметры.

3.4.4. Субстратная специфичность.

3.4.5. Коферментная специфичность.

3.5. Механизм ферментативного катализа ФДГ

3.5.1. Переход ФДГ в закрытую конформацию.

3.5.2. Исследования изотопных эффектов формиатдегидрогеназной реакции.

Дрожжевые ФДГ.

Бактериальные ФДГ.

3.5.3. Сайт-направленный мутагенез остатков активного центра ФДГ.

3.5.4. Изучение механизма действия ФДГ методами in silico.

Квантово-механические расчеты в газовой фазе и симуляции молекулярной динамики. 54 Расчеты гибридными методами квантовой механики и молекулярной динамики (QM/MM).

3.6. Практическое применение ФДГ.

4. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

Поиск и выравнивание аминокислотных последовательностей.

Объекты исследования.

Кристаллизация.

Рентгеноструктурный эксперимент, решение и уточнение пространственных структур.

5. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

5.1. Структуры холо- и апо-форм МояФДГ.

5.1.1. Холо-форма МогФДГ.

Общий анализ структуры.

Дополнительные С-концевые остатки 392-399.

Димерный контакт.

Каталитический центр и связывание кофермента.

5.1.2. Апо-форма МогФДГ.

Общий анализ структуры.

Каталитический центр и сайт связывания кофермента.

Конформационный переход МогФДГ из открытой конформации в закрытую.

5.2. Структура апо-формы МоиФДГ в закрытой конформации.

Общий анализ структуры.

Каталитический центр.

Сайт связывания адениновой части кофермента.

Возможные причины кристаллизации апо-МогФДГ в закрытой конформации.

Роль С-концевого фрагмента 375-399, кофермента и субстрата/ингибитора в переходе бактериальных ФДГ к закрытой конформации.

5.3. Структуры холо- и апо-форм АиаФДГ.

5.3.1. Холо-форма АгаФДГ.

Общий анализ структуры.

Димерный контакт.

Каталитический центр и связывание кофермента.

Коферментная специфичность.

5.3.2. Апо-форма АгаФДГ.

Общий анализ структуры.

Каталитический центр и сайт связывания кофермента.

Конформационный переход АгаФДГ из открытой конформации в закрытую.

5.4. Структура холо-формы МоиФДГ с атомным разрешением.

Преимущества атомного разрешения.

Сравнение структур холо-МогФДГ при разрешениях 1.1 и 1.95 Á.

Структура активного центра.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Шабалин, Иван Григорьевич

6. ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ВЫВОДЫ

1. Решены пространственные структуры ФДГ из бактерии Moraxella sp. C-l (МогФДГ) в апо- и холо-формах с разрешением 2.3 и 1.95 Ä, соответственно. Показано, что МогФДГ имеет одинаковые с ранее исследованной ФДГ из бактерии Pseudomonas sp. 101 (РБеФДГ) пространственную укладку полипептидной цепи, каталитический центр и сайт связывания кофермента. При этом МогФДГ отличается организацией димерного контакта в молекуле и наличием восьми дополнительных С-концевых остатков в структуре холо-формы.

2. Решена пространственная структура апо-формы МогФДГ в закрытой конформации с разрешением 1.96 Ä. Переход фермента к закрытой конформации сопровождается фиксацией остатков каталитического центра в каталитически-активной конформации и упорядочиванием С-концевого фрагмента 375-399 даже без связывания кофермента. С другой стороны, изменение конформации петли 221-226 в аденин-связывающем сайте происходит только при связывании кофермента. Показана роль С-концевого фрагмента 375-399, кофермента и субстрата/ингибитора в стабилизации закрытой конформации бактериальных ФДГ.

3. Решены пространственные структуры ФДГ из высшего растения Arabidopsis thaliana (АгаФДГ) в апо- и холо-формах с разрешением 1.7 и 2.0 Ä, соответственно. Показано, что АгаФДГ и бактериальные ФДГ имеют похожие ход полипептидной цепи, вторичную структуру и устройство каталитического центра. АгаФДГ отличается заменой длинной N-концевой петли 10-48 (нумерация по РБеФДГ) на короткий участок 3948, укороченным на 22 остатка С-концом, более открытой конформацией апо-формы и меньшим количеством водородных связей между НАД4^ и ферментом.

4. Впервые для ФДГ решена с атомным разрешением пространственная структура тройного комплекса МогФДГ-НАД^-азид, имитирующего переходное состояние ферментативной реакции. Подтверждено, что карбоксамидная группа кофермента имеет транс-конформацию, а остаток каталитического центра His332 может образовывать водородную связь с субстратом в переходном состоянии реакции. В структуре обнаружена тенденция к изменению длин ковалентных связей никотинамидной группы кофермента в сторону образования биполярной формы, существование которой в переходном состоянии ферментативной реакции было постулировано ранее.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата химических наук, Шабалин, Иван Григорьевич, Москва

1. Тишков, В. И.; Попов, В. О., Механизм действия формиатдегидрогеназы и ее практическое применение. Биохимия 2004, 69, (11), 1537-1554.

2. Vinals, С.; Depiereux, Е.; Feytmans, Е., Prediction of structurally conserved regions of D-specific hydroxy acid dehydrogenases by multiple alignment with formate dehydrogenase. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1993, 192, (1), 182-8.

3. Popov, V. O.; Lamzin, V. S., NAD+-dependent formate dehydrogenase. Biochem. J. 1994,301,(3), 625-643.

4. Colas des Francs-Small, C.; Ambard-Bretteville, F.; Small, I. D.; Remy, R., Identification of a major soluble protein in mitochondria from nonphotosynthetic tissues as NAD-dependent formate dehydrogenase. Plant Physiol. 1993, 102, (4), 1171-7.

5. Bandaria, J. N.; Dutta, S.; Hill, S. E.; Kohen, A.; Cheatum, С. M., Fast enzyme dynamics at the active site of formate dehydrogenase. J. Am. Chem. Soc. 2008, 130, (1), 22-3.

6. Castillo, R.; Oliva, M.; Marti, S.; Moliner, V., A theoretical study of the catalytic mechanism of formate dehydrogenase. J. Phys. Chem. В 2008, 112, (32), 10012-22.

7. Torres, R. A.; Schitt, В.; Bruice, Т. C., Molecular dynamics simulations of ground and transition states for the hydride transfer from formate to NAD+ in the active site of formate dehydrogenase./. Am. Chem. Soc. 1999, 121, (36), 8164 -8173.

8. Bommarius, A. S.; Schwarm, M.; Stingl, K.; Kottenhahn, M.; Huthmacher, K.; Drauz, K., Synthesis and use of enantiomerically pure tert-leucine. Tetrahedron: Asymmetry 1995, 6, 28512888.

9. Anthony, C., The biochemistry of methylotrophs. Acad. Press.: New York, 1982.

10. Laukel, M.; Chistoserdova, L.; Lidstrom, M. E.; Vorholt, J. A., The tungsten-containing formate dehydrogenase from Methylobacterium extorquens AM 1: purification and properties. Eur. J. Biochem. 2003, 270, (2), 325-33.

11. Leopoldini, M.; Chiodo, S. G.; Toscano, M.; Russo, N., Reaction mechanism of molybdoenzyme formate dehydrogenase. Chemistry 2008, 14, (28), 8674-81.

12. Raaijmakers, H. C.; Romao, M. J., Formate-reduced E. coli formate dehydrogenase H: The reinterpretation of the crystal structure suggests a new reaction mechanism. J Biol Inorg Chem 2006, 11,(7), 849-54.

13. Jormakka, M.; Tornroth, S.; Byrne, В.; Iwata, S., Molecular basis of proton motive force generation: structure of formate dehydrogenase-N. Science 2002, 295, (5561), 1863-8.

14. Jansch, L.; Kruft, V.; Schmitz, U. K.; Braun, H. P., New insights into the composition, molecular mass and stoichiometry of the protein complexes of plant mitochondria. Plant J. 1996, 9, (3), 357-68.

15. Emanuelsson, O.; Nielsen, H.; von Heijne, G., ChloroP, a neural network-based method for predicting chloroplast transit peptides and their cleavage sites. Protein Sci 1999, 8, (5), 97884.

16. Hourton-Cabassa, C.; mbard-Bretteville, F.; Moreau, F.; Davy, d. V.; Remy, R.; Francs-Small, С. C., Stress Induction of Mitochondrial Formate Dehydrogenase in Potato Leaves. Plant Physiol. 1998, 116,(2), 627-635.

17. Suzuki, K.; Itai, R.; Suzuki, K.; Nakanishi, H.; Nishizawa, N. K.; Yoshimura, E.; Mori, S., Formate dehydrogenase, an enzyme of anaerobic metabolism, is induced by iron deficiency in barley roots. Plant Physiol. 1998, 116, (2), 725-32.

18. Thompson, P.; Bowsher, C. G.; Tobin, A. K., Heterogeneity of mitochondrial protein biogenesis during primary leaf development in barley. Plant Physiol. 1998, 118, (3), 1089-99.

19. Hanson, A. D.; Gage, D. A.; Shachar-Hill, Y., Plant one-carbon metabolism and its engineering. Trends. Plant Sci. 2000, 5, (5), 206-13.

20. Bykova, N. V.; Stensballe, A.; Egsgaard, H.; Jensen, O. N.; Moller, I. M., Phosphorylation of formate dehydrogenase in potato tuber mitochondria. J Biol Chem 2003, 278, (28), 26021-30.

21. Lamzin, V. S.; Dauter, Z.; Popov, V. O.; Harutyunyan, E. H.; Wilson, K. S., High resolution structures of holo and apo formate dehydrogenase. J. Mol. Biol. 1994, 236, (3), 759785.

22. Lamzin, V. S.; Aleshin, A. E.; Strokopytov, В. V.; Yukhnevich, M. G.; Popov, V. O.; Harutyunyan, E. H.; Wilson, K. S., Crystal structure of NAD-dependent formate dehydrogenase. Eur. J. Biochem. 1992,206, (2), 441-452.

23. Филлипова, Е. В.; Поляков, К. М.; Тихонова, Т. В.; Стеханова, Т. П.; Бойко, К. М.; Попов, В. О., Структура новой кристаллической модификации бактериальной NAD-зависимой формиатдегидрогеназы при разрешении 2. iA . Кристаллография 2005, 50, (5), 823-827.

24. Филлипова, Е. В., Рентгеноструктурное исследование комплексов бактериальных формиатдегидрогеназ с коферментом и субстратом. Канд. дисс. 2006.

25. Schirwilz, К.; Schmidt, A.; Lamzin, V. S., High-resolution structures of formate dehydrogenase from Candida boidinii. Protein Sci. 2007, 16, (6), 1146-56.

26. Устинникова, Т. Б.; Попов, В. О.; Егоров, А. М., Структурные исследования NAD+-зависимой формиатдегидрогеназы метилотрофных бактерий. Локализация существенного остатка цистеина. Биоорган, химия 1988,14, (2), 905-909.

27. Одинцева, E. P.; Попова, А. С.; Рожкова, A. M.; Тишков, В. П., Роль остатков цистеина в стабильности бактериальной формиатдегидрогеназы. Вести. Моск. Ун-та. Сер. 2. Химия 2002, 43, (6), 356-359.

28. Egorov, А. М.; Tishkov, V. I.; Dainichenko, V. V.; Popov, V. О., Chemical modification of lysine residues in bacterial formate dehydrogenase. Biochim Biophys Acta 1982, 709, (1), 812.

29. Тишков, В. П.; Галкин, А. Г.; Егорова, О. А.; Марченко, Г. Н.; Цыганков, Ю. Д.; Егоров, А. М., Направленный мутагенез бактериальной формиатдегидрогеназы: роль остатка Cys-255 в катализе и стабильности фермента. Докл. Акад. Наук 1993, 328, ( 3), 407410.

30. Derewenda, Z. S.; Vekilov, P. G., Entropy and surface engineering in protein crystallization. Acta Crystallogr. D Biol. Crystallogr. 2006, 62, (Pt 1), 116-24.

31. Tishkov, V. L; Popov, V. O., Catalytic mechanism and application of formate dehydrogenase. Biochemistry Mosc. 2004, 69, (11), 1252-67.

32. Egorov, A. M.; Avilova, Т. V.; Dikov, M. M.; Popov, V. O.; Rodionov, Y. V.; Berezin, I. V., NAD-dependent formate dehydrogenase from methylotrophic bacterium, strain 1. Purification and characterization. Eur J Biochem 1979, 99, (3), 569-76.

33. Avilova, Т. V.; Egorova, O. A.; Ioanesyan, L. S.; Egorov, A. M., Biosynthesis, isolation and properties of NAD-dependent formate dehydrogenase from the yeast Candida methylica. Eur. J. Biochem. 1985, 152, (3), 657-62.

34. Slusarczyk, H.; Felber, S.; Kula, M. R.; Pohl, M., Stabilization of NAD-dependent formate dehydrogenase from Candida boidinii by site-directed mutagenesis of cysteine residues. Eur. J. Biochem. 2000, 267, (5), 1280-9.

35. Tishkov, V. I.; Popov, V. O., Protein engineering of formate dehydrogenase. Biomol. Eng. 2006,23,(2-3), 89-110.

36. Yamamoto, H.; Mitsuhashi, K.; Kimoto, N.; Kobayashi, Y.; Esaki, N., Robust NADH-regenerator: improved alpha-haloketone-resistant formate dehydrogenase. Appl Microbiol Biotechnol 2005, 67, (1), 33-9.

37. Ordu, E. В.; Cameron, G.; Clarke, A. R.; Karaguler, N. G., Kinetic and thermodynamic properties of the folding and assembly of formate dehydrogenase. FEBS Lett 2009.

38. Karaguler, N. G.; Sessions, R. В.; Clarke, A. R., Effects of disulphide bridges on the activity and stability of the formate dehydrogenase from Candida methylica. Biotechnol Lett 2007.

39. Karaguler, N. G.; Sessions, R. В.; Binay, В.; Ordu, E. В.; Clarke, A. R., Protein engineering applications of industrially exploitable enzymes: Geobacillus stearothermophilus LDH and Candida methylica FDH. Biochem. Soc. Trans. 2007, 35, (Pt 6), 1610-5.

40. Serov, A. E.; Odintzeva, E. R.; Uporov, I. V.; Tishkov, V. I., Use of Ramachandran plot for increasing thermal stability of bacterial formate dehydrogenase. Biochemistry (Mosc.) 2005, 70, (7), 804-808.

41. Ansorge-Schumacher, M. В.; Slusarczyk, H.; Schumers, J.; Hirtz, D., Directed evolution of formate dehydrogenase from Candida boidinii for improved stability during entrapment in polyacrylamide. FebsJ2006, 273, (17), 3938-45.

42. Slusarczyk, H.; Felber, S.; Kula, M. R.; Pohl, M., Novel mutants of formate dehydrogenase from Candida boidinii. US Patent Application Publication US2003/0157664, 21.09.2003.

43. Тишков, В. И.; Галкин, А. Г.; Егоров, А. М., NAD- зависимая формиатдегидрогеназа метилотрофных бактерий Pseudomonas sp. 101: клонирование, экспрессия и изучение структуры тепа. Докл. Акад. Наук 1991, 317, (3), 345-348.

44. Serov, А. Е.; Popova, A. S.; Fedorchuk, V. V.; Tishkov, V. I., Engineering of coenzyme specificity of formate dehydrogenase from Saccharomyces cerevisiae. Biochem J. 2002, 367, (3), 841-7.

45. Садыхов, Э. Г., Получение, термостабильность и структурные исследования формиатдегидрогеназ из различных источников. Канд. дасс. 2007.

46. Nanba, Н.; Takaoka, Y.; Hasegawa, J., Purification and characterization of an alpha-haloketone-resistant formate dehydrogenase from Thiobacillus sp. strain KNK65MA, and cloning of the gene. Biosci. Biotechnol. Biochem. 2003, 67, (10), 2145-2153.

47. Galkin, A.; Kulakova, L.; Tishkov, V.; Esaki, N.; Soda, K., Cloning of formate dehydrogenase gene from a methanol-utilizing bacterium Mycobacterium vaccae N10. Appl.Microbiol.Biotechnol 1995, 44, (3-4), 479-483.

48. Nanba, H.; Takaoka, Y.; Hasegawa, J., Purification and characterization of formate dehydrogenase from Ancylobacter aquaticus strain KNK607M, and cloning of the gene. Biosci.Biotechnol.Biochem. 2003, 67, (4), 720-728.

49. Allen, S. J.; Holbrook, J. J., Isolation, sequence and overexpression of the gene encoding NAD-dependent formate dehydrogenase from the methylotrophic yeast Candida methylica. Gene 1995, 162,(1), 99-104.

50. Karaguler, G. N.; Sessions, R. В.; Clarke, A. R.; Holbrook, J. J., A single mutation in the NAD-specific formate dehydrogenase from Candida methylica allows the enzyme to use NADP. Biotechnol. Lett. 2001,23, (4), 283-287.

51. Andreadeli, A.; Platis, D.; Tishkov, V.; Popov, V.; Labrou, N. E., Structure-guided alteration of coenzyme specificity of formate dehydrogenase by saturation mutagenesis to enable efficient utilization of NADP+. FEBSJ. 2008, 275, (15), 3859-69.

52. Мезенцев, А. В.; Устинникова, Т. Б.; Тихонова, Т. В.; Попов, В. О., Выделение и кинетический механизм действия НАД -зависимой формиатдегидрогеназы метилотрофных дрожжей Hansenula polymorpha. Прикл. биохим. и микробгюл. 1996, 32, (6), 589-595.

53. Baack, R. D.; Markwell, J.; Herman, P. L.; Osterman, J. C., Kinetic behavior of the Arabidopsis thaliana leaf formate dehydrogenase is thermally sensitive. J.Plant Physiol 2003, 160, (5), 445-450.

54. Kato, N.; Sahm, H.; Wagner, F., Steady-state kinetics of formaldehyde dehydrogenase and formate dehydrogenase from a methanol-utilizing yeast, Candida boidinii. Biochim Biophys Acta 1979, 566, (1), 12-20.

55. Peacock, D.; Boulter, D., Kinetic studies of formate dehydrogenase. BiochemJ 1970, 120, (4), 763-9.

56. Попов, В. О.; Родионов, Ю. В.; Егоров, А. М.; Березин, И. В., NAD-зависимая формиатдегидрогеназа из метилотрофных бактерий. Изучение кинетической схемы действия. Биоорган, химия 1978, 4, 117-129.

57. Asano, Y.; Sekigawa, Т.; Inukai, П.; Nakazawa, A., Purification and properties of formate dehydrogenase from Moraxella sp. strain C-l. J.Bacteriol. 1988, 170, (7), 3189-3193.

58. Ohyama, Т.; Yamazaki, I., Formate dehydrogenase. Subunit and mechanism of inhibition by cyanide and azide. J. Biochem. (Tokyo) 1975, 77, (4), 845-52.

59. Попов, В. О.; Шумилин, И. А.; Устинникова, Т. Б.; Ламзин, В. С.; Егоров, Ц. А., NAD-зависимая формиатдегидрогеназа из метилотрофных бактерий Pseudomonas sp.101. Аминокислотная последовательность. Биоорган, химия 1990, 16, (3), 324-335.

60. Тишков, В. И.; Галкин, А. Г.; Гладышев, В. Н.; Карзанов, В. В.; Егоров, А. М., Анализ структуры гена, оптимизация экспрессии в Е. Coli и свойства рекомбинантной формиатдегидрогеназы бактерий Pseudomonas sp. 101. Биотехнология 1992, 5, 52-59.

61. Slusarczyk, Н.; Felber, S.; Kula, M. R.; Pohl, M., Eur. Patent. EP1295937-A2N of 26.03.2003.

62. Тишков, В. И., Регенерация кофакторов в биосинтезе хиральных соединений с помощью дегидрогеназ. Вестн. Моск. Ун-та. Сер. 2. Химия. 2002, 43, (6), 381-388.

63. Mesentsev, А. V.; Lamzin, V. S.; Tishkov, V. I.; Ustinnikova, Т. В.; Popov, V. О., Effect of pH on kinetic parameters of NAD+-dependent formate dehydrogenase. Biochem.J. 1997, 321, (2), 475-480.

64. Blanchard, J. S.; Cleland, W. W., Kinetic and chemical mechanisms of yeast formate dehydrogenase. Biochemistry 1980, 19, (15), 3543-50.

65. Serov, A. E.; Popova, A. S.; Tishkov, V. I., The kinetic mechanism of formate dehydrogenase from bakery yeast. Dokl Biochem Biophys 2002, 382, 26-30.

66. Tishkov, V. I.; Galkin, A. G.; Egorov, A. M., Kinetic isotope effect and the presteady-state kinetics of the reaction catalyzed by the bacterial formate dehydrogenase. Biochimie 1989, 71, (4), 551-7.

67. Rozzell, J. D.; Hua, L.; Mayhew, M.; Novick, S. Mutants of enzymes and methods for their use. US Patent Application Publication US2004/0115691. 17.06.2004.

68. Lamzin, V. S.; Asadchikov, V. E.; Popov, V. O.; Egorov, A. M.; Berezin, I. V., Conformation changes in bacterial formate dehydrogenase during complex-formation with cofactor and its analogs. Dokl. Akad. NaukSSSR 1986, 291, (4), 1011-4.

69. Razeto, A.; Kochhar, S.; Hottinger, H.; Dauter, M.; Wilson, K. S.; Lamzin, V. S., Domain closure, substrate specificity and catalysis of D-lactate dehydrogenase from Lactobacillus bulgaricus. J. Mol. Biol. 2002, 318, (1), 109-19.

70. Dengler, U.; Niefind, K.; Kiess, M.; Schomburg, D., Crystal structure of a ternary complex of D-2-hydroxyisocaproate dehydrogenase from Lactobacillus casei, NAD+ and 2-oxoisocaproate at 1.9 A resolution. J Mol Biol 1997,267, (3), 640-60.

71. Kumar, S.; Ma, В.; Tsai, C. J.; Wolfson, H.; Nussinov, R., Folding funnels and conformational transitions via hinge-bending motions. Cell Biochem. Biophys. 1999, 31, (2), 141-64.

72. Kovari, Z.; Vas, M., Protein conformer selection by sequence-dependent packing contacts in crystals of 3-phosphoglycerate kinase. In 2004; Vol. 55, pp 198-209.

73. Qiu, L.; Gulotta, M.; Callender, R., Lactate dehydrogenase undergoes a substantial structural change to bind its substrate. Biophys .72007, 93, (5), 1677-86.

74. Cleland, W. W., The use of isotope effects to determine enzyme mechanisms. Arch. Biochem. Biophys. 2005, 433, (1), 2-12.

75. Xue, H.; Wu, X.; Huskey, W. P., Carbon Isotope Effects on kcat for Formate Dehydrogenase Determined Using a Continuous-Flow Stirred-Tank Reactor. Journal of the American Chemical Society 1996, 118, (24), 5804-5805.

76. Hermes, J. D.; Morrical, S. W.; O'Leary, M. H.; Cleland, W. W., Variation of transitionstate structure as a function of the nucleotide in reactions catalyzed by dehydrogenases. 2. Formate dehydrogenase. Biochemistry 1984, 23, (23), 5479-88.

77. Rotberg, N. S.; Cleland, W. W., Secondary 15N isotope effects on the reactions catalyzed by alcohol and formate dehydrogenases. Biochemistry 1991, 30, (16), 4068-71.

78. LaReau, R. D.; Wan, W.; Anderson, V. E., Isotope effects on binding of NAD+ to lactate dehydrogenase. Biochemistry 1989, 28, (8), 3619-24.

79. Тишков, В. И.; Галкин, А. Г.; Егоров, А. М., NAD-зависимая формиатдегидрогеназа метилотрофных дрожжей: выделение и физико-химические свойства. Биохимия 1989, 54, (2).

80. Labrou, N. E.; Rigden, D. J., Active-site characterization of Candida boidinii formate dehydrogenase. Biochem J. 2001, 354, (Pt 2), 455-63.

81. Shinoda, Т.; Arai, K.; Taguchi, H., A highly specific glyoxylate reductase derived from a formate dehydrogenase. Biochem Biophys Res Commun 2007, 355, (3), 782-7.

82. Birgit Schitt, Y.-J. Z., Thomas C. Bruice, Theoretical Investigation of the Hydride Transfer from Formate to NAD+ and the Implications for the Catalytic Mechanism of Formate Dehydrogenase. J. Am. Chem. Soc. 1998, 120, (29), 7192 -7200.

83. Bruice, T. C.; Lightstone, F. C., Ground State and Transition State Contributions to the Rates of Intramolecular and Enzymatic Reactions. Acc. Chem. Res. 1999, 32, (2), 127-136.

84. Li, H.; Goldstein, B. M., Carboxamide group conformation in the nicotinamide and thiazole-4-carboxamide rings: implications for enzyme binding. J Med Chem 1992, 35, (19), 3560-7.

85. Miwa, Y.; Mizuno, T.; Tsuchida, K.; Taga, T.; Iwata, Y., Experimental charge density and electrostatic potential in nicotinamide. Acta Crysl. 1999, B55, (Pt 1), 78-84.

86. Kahn, K.; Bruice, T. C., Diphtheria toxin catalyzed hydrolysis of NAD+: molecular dynamics study of enzyme-bound substrate, transition state, and inhibitor. J. Am. Chem. Soc. 2001, 123,(48), 11960-9.

87. Schmidt, T.; Michalik, C.; Zavrel, M.; Spiess, A.; Marquardt, W.; Ansorge-Schumacher, M. B., Mechanistic model for prediction of formate dehydrogenase kinetics under industrially relevant conditions. Biotechnol Prog 2009.

88. Sun, Y.; Zhang, R.; Xu, Y., Co-expression of formate dehydrogenase from Candida boidinii and (R)-specific carbonyl reductase from Candida parapsilosis CCTCC M203011 in Escherichia coli. Wei Sheng WuXue Bao 2008, 48, (12), 1629-33.

89. Kratzer, R.; Pukl, M.; Egger, S.; Nidetzky, B., Whole-cell bioreduction of aromatic alpha-keto esters using Candida tenuis xylose reductase and Candida boidinii formate dehydrogenase co-expressed in Escherichia coli. Microb Cell Fact 2008, 7, 37.

90. Huang, Z. FI.; Zhang, Y. P.; Liu, M.; Wang, B. G.; Cao, Z. A., Expression and characterization of formate dehydrogenase gene in Klebisella pneumoniae. Wei Sheng Wu Xne Bao 2007,47,(1), 64-8.

91. Parmentier, S.; Arnaut, F.; Soetaert, W.; Vandamme, E. J., Application ofNAD-dependent polyol dehydrogenases for enzymatic mannitol/sorbitol production with coenzyme regeneration. Commim.Agric.Appl.Biol.Sci. 2003, 68, (2 Pt A), 255-262.

92. Takeshita, K.; Ishida, Y.; Takada, G.; Izumori, K., Direct production of allitol from D-fructose by a coupling reaction using D-tagatose 3-epimerase, ribitol dehydrogenase and formate dehydrogenase. JBiosci Bioeng 2000, 90, (5), 545-8.

93. Hummel, W., New alcohol dehydrogenases for the synthesis of chiral compounds. Adv. Biochem. Eng. Biotechnol. 1997, 58, 145-84.

94. Kula, M. R.; Wandrey, C., Continuous enzymatic transformation in an enzymemembrane reactor with simultaneous NADH regeneration. Methods Enzymol 1987, 136, 9-21.

95. Egorov, A. M.; Osipov, A. P.; Pozharskii, S. B.; Iavarkovskaia, L. L., Kinetics of the NADH regenerating system using bacterial formate dehydrogenase. Biokhimiia 1981,46, (2), 361-7.

96. Geertman, J. M.; van Dijken, J. P.; Pronk, J. T., Engineering NADH metabolism in Saccharomyces cerevisiae: formate as an electron donor for glycerol production by anaerobic, glucose-limited chemostat cultures. FEMS Yeast Res 2006, 6, (8), 1193-203.

97. Bai, Y.; Yang, S. T., Biotransformation of R-2-hydroxy-4-phenylbutyric acid by D-lactatc dehydrogenase and Candida boidinii cells containing formate dehydrogenase coimmobilized in a fibrous bed bioreactor. Biotechnol Bioeng 2005, 92, (2), 137-46.

98. Tishkov, V. I.; Galkin, A. G.; Fedorchuk, V. V.; Savitsky, P. A.; Rojkova, A. M.; Gieren, H.; Kula, M. R., Pilot scale production and isolation of recombinant NAD+- and NADP+-specific formate dehydrogenases. Biotechnol.Bioeng. 1999, 64, (2), 187-193.

99. Zhang, L.; Jiang, Y.; Jiang, Z.; Sun, X.; Shi, J.; Li, L.; Li, J., Biomimetic fabrication of hydroxyapatite-polysaccharide-formate dehydrogenase composite capsules for efficient CO(2) conversion. JBiomater Sci Polym £¿/2009, 20, (12), 1661-74.

100. Bolivar, J. M.; Wilson, L.; Ferrarotti, S. A.; Fernandez-Lafuente, R.; Guisan, J. M.; Mateo, C., Stabilization of a formate dehydrogenase by covalent immobilization on highly activated glyoxyl-agarose supports. Biomacromolecules 2006, 7, (3), 669-73.

101. Lu, Y.; Zhao, H.; Zhang, C.; Lai, Q.; Wu, X.; Xing, X. FI., Expression of NAD(+)-dependent formate dehydrogenase in Enterobacter aerogenes and its involvement in anaerobic metabolism and H(2) production. Biotechnol Lett 2009.

102. Lupa, B.; Hendrickson, E. L.; Leigh, J. A.; Whitman, W. B., Formate-dependent H2 production by the mesophilic methanogen Methanococcus maripaludis. Appl Environ Microbiol 2008, 74, (21), 6584-90.

103. Schaller, K. H.; Triebig, G., Determination with formate dehydrogenase. In Methods of enzymatic analysis, 3rd ed.; Bergmeyer, H. U., Ed. Verlag Chemie: Weinheim, 1984; Vol. 6, pp 668-672.

104. Hatch, M.; Bourke, E.; Costello, J., New enzymic method for serum oxalate determination. 1977, 23, (1), 76-78.

105. Waterhouse, A. M.; Procter, J. B.; Martin, D. M. A.; Clamp, M.; Barton, G. J., Jalview Version 2~a multiple sequence alignment editor and analysis workbench. In 2009; Vol. 25, pp 1189-1191.

106. Edgar, R. C., MUSCLE: multiple sequence alignment with high accuracy and high throughput. In 2004; Vol. 32, pp 1792-1797.

107. Otwinowski, Z.; Minor, W., Processing of X-ray diffraction data collected in oscillation mode. In Methods in enzymology, Carter, C. W. J.; Sweet, R. M., Eds. Academic Press: New York, 1997; Vol. 276, pp 307-326.

108. Klein, C.; Bartels, K., Automar, marFLM, marHKL and marXDS: Data reduction software for mar detectors. Acta Cryst. 2000, A56, 295.

109. Kabsch, W., Automatic processing of rotation diffraction data from crystals of initially unknown symmetry and cell constants. In J. Appl. Cryst., 1993; Vol. 26, pp 795-800.

110. Vagin, A.; Teplyakov, A., MOLREP: an Automated Program for Molecular Replacement. J. Appl. Cryst. 1997, 30, (6), 1022-1025.

111. Murshudov, G. N.; Vagin, A. A.; Dodson, E. J., Refinement of macromolecular structures by the maximum-likelihood method. Acta Crystallogr. D Biol. Crystallogr. 1997, 53, (3), 24055.

112. Painter, J.; Merritt, E. A., Optimal description of a protein structure in terms of multiple groups undergoing TLS motion. In Acta Crystallogr. D Biol. Crystallogr., 2006; Vol. 62, pp 439-450.

113. Emsley, P.; Cowtan, K., Coot: model-building tools for molecular graphics. Acta Crystallogr. D Biol. Crystallogr. 2004, 60, (12), 2126-32.

114. Potterton, L.; McNicholas, S.; Krissinel, E.; Gruber, J.; Cowtan, K.; Emsley, P.; Murshudov, G. N.; Cohen, S.; Perrakis, A.; Noble, M., Developments in the CCP4 molecular-graphics project. Acta Cryst. 2004, D60, (12), 2288-2294.

115. Collaborative Computational Project Number 4, The CCP4 suite: programs for protein crystallography. In Acta Cryst., 1994; Vol. D50, pp 760-763.

116. Krissinel, E.; Henrick, K., Inference of macromolecular assemblies from crystalline state. J. Mol. Biol. 2007, 372, (3), 774-97.

117. Kabsch, W.; Sander, C., Dictionary of protein secondary structure: pattern recognition of hydrogen-bonded and geometrical features. Biopolymers 1983, 22, (12), 2577-637.

118. Poornam, G. P.; Matsumoto, A.; Ishida, H.; Hayward, S., A method for the analysis of domain movements in large biomolecular complexes. In 2009; Vol. 76, pp 201-212.

119. Li, W. F.; Zhou, X. X.; Lu, P., Structural features of thermozymes. Biotechnol. Adv. 2005, 23,(4), 271-81.

120. Folch, B.; Rooman, M.; Dehouck, Y., Thermostability of Salt Bridges versus Hydrophobic Interactions in Proteins Probed by Statistical Potentials. J. Chem. Inf. Model. 2007, 48,(1), 119-127.

121. Dauter, Z.; Lamzin, V. S.; Wilson, K. S., The benefits of atomic resolution. Curr. Opin. Struct. Biol. 1997, 7, (5), 681-8.

122. Rubach, J. K.; Plapp, B. V., Amino acid residues in the nicotinamide binding site contribute to catalysis by horse liver alcohol dehydrogenase. Biochemistry 2003, 42, (10), 29072915.

123. Meijers, R.; Morris, R. J.; Adolph, H. W.; Merli, A.; Lamzin, V. S.; Cedergren-Zeppezauer, E. S., On the enzymatic activation of NADH. J. Biol. Chem. 2001, 276, (12), 93169321.

124. Meijers, R.; Adolph, H. W.; Dauter, Z.; Wilson, K. S.; Lamzin, V. S.; Cedergren-Zeppezauer, E. S., Structural evidence for a ligand coordination switch in liver alcohol dehydrogenase. Biochemistry 2007,46, (18), 5446-54.

125. Engh, R. A.; Huber, R., Accurate bond and angle parameters for X-ray protein structure refinement. Acta Crystallogr. A Found. Crystallogr. 1991, 47, (4), 392-400.1. Благодарности

126. Работа была выполнена при финансовой поддержке гранта Федерального агентства по науке и инновациям № 02.512.12.2002 игранта РФФИ № 08-04-00830-а

Информация о работе

Шабалин, Иван Григорьевич
кандидата химических наук
Москва, 2010
ВАК 03.01.04

Диссертация

Структурное исследование НАД+-зависимых формиатдегидрогеназ из различных организмов - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы