Новые биокатализаторы регенерации NADH на основе формиатдегидрогеназы

Савин, Святослав Сергеевич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Новые биокатализаторы регенерации NADH на основе формиатдегидрогеназы
ВАК РФ 03.01.06, Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Автореферат диссертации по теме "Новые биокатализаторы регенерации NADH на основе формиатдегидрогеназы"

На правах рукописи

005532086

САВИН Святослав Сергеевич

НОВЫЕ БИОКАТАЛИЗАТОРЫ РЕГЕНЕРАЦИИ МАРН НА ОСНОВЕ ФОРМИАТДЕГИДРОГЕНАЗЫ

03.01.06 - биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1Я АВГ 2013

Москва-2013

005532086

Работа выполнена в лаборатории молекулярной инженерии Федерального государственного бюджетного учреждения науки Институт биохимии им. А.Н. Баха Российской академии наук

Научный руководитель:

доктор химических наук, профессор Тишков Владимир Иванович

Официальные оппоненты:

Леонтьевский Алексей Аркадьевич

доктор биологических наук, профессор, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина Российской академии наук, заместитель директора по научной работе, заведующий лабораторией микробной энзимологии

Егоров Сергей Николаевич

доктор биологических наук, Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова», биологический факультет, доцент кафедры молекулярной биологии

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение

науки Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук

Защита диссертации состоится 24 сентября 2013 года в 15.30 на заседании Совета Д 501.001.21 при Московском государственном университете имени М.В. Ломоносова по адресу: 119991, Москва, Ленинские горы, д.1, стр. 12, биологический факультет МГУ, ауд. М-1.

Тел. 8(495)939-54-83, эл. почта: npiskunkova@rambler.ru

С диссертацией можно ознакомиться в Фундаментальной библиотеке Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова.

Автореферат разослан_августа 2013 года.

Ученый секретарь

диссертационного совета Д 501.001.21, кандидат биологических наук

Пискункова Н.Ф.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Многие органические соединения содержат от одного до нескольких хиральных центров, т.е. они могут существовать в виде двух и более энантиомеров. Как правило, полезной биологической активностью обладает только один из возможных энантиомеров, в то время как остальные могут оказывать сильный негативный эффект. Ярким примером является препарат талидомид, R-изомер которого активно рекламировали как седативный препарат для беременных женщин. Позднее было обнаружено, что в организме из-за его рацемизации образуется S-форма, которая вызывала неправильное развитие плода. Поэтому синтез оптически активных (хиральных) соединений является одним из наиболее активно развивающихся направлений современного органического синтеза. По данным ВСС Research LLC (http://www.bccresearch.com/report/chiral-products-technology-global-markets-bio012f.html) рынок хирального синтеза в 2011 году составлял 3,9 млрд., а в 2016 году составит 5,7 млрд. долларов США.

Согласно требованиям Администрации США по контролю качества пищевых продуктов и лекарственных препаратов (Food and Drug Administration of the USA) оптическая чистота по каждому хиральному центру в лекарственном препарате должна составлять не менее 99%. Очень немногие процессы классического химического ассиметрического синтеза позволяют получать оптически активные соединения такой степени чистоты. Поэтому безусловным выбором при разработке новых процессов хирального синтеза является использование ферментов. Существует два принципиальных подхода биокаталитического получения оптически активных соединений - разделение рацемата на энантиомеры и ассиметрический синтез. В случае первого процесса выход целевого продукта не может быть больше 50%, а при ассиметрическом синтезе выход составляет до 100%. Поэтому доля последнего подхода в общем объеме синтеза хиральных соединений неуклонно растет из года в год.

Среди ферментов различных классов, используемых в биокаталитическом ассиметрическом синтезе, наиболее высокой стереоселективностью обладают оксидоредуктазы, в первую очередь ЫАО(Р)*-зависимые ферменты (дегидрогеназы, редуктазы, монооксигеназы и др.). Например, алкогольдегидрогеназа из пекарских дрожжей совершает всего одну стереоспецифическую ошибку на 7*109 (!!!) каталитических циклов (Weinhold, E.G. et al, PNAS, 1991, 88, 8420). Ключевым фактором, сдерживавшим применение дегидрогеназ, была очень высокая стоимость восстановленной формы кофермента - NADH и, особенно, NADPH. Эта проблема решается введением в реакционную среду второго фермента, который регенерирует окисленную форму кофермента в восстановленную. Многочисленные исследования показали, что одним из наиболее оптимальных ферментов для регенерации NADH является МАО+-зависимая формиатдегидрогеназа* (ФДГ, КФ 1.2.1.2). В настоящее время самый крупнотоннажный процесс хирального синтеза с использованием индивидуальных ферментов - получение fert-L-лейцина, включает регенерацию восстановленного кофермента с помощью ФДГ из дрожжей Candida boidinii (реализован фирмой Degussa в конце 90-х годов прошлого века).

* Принятые сокращения: ФДГ - формиатдегидрогеназа; РэеФДГ, СЬоФДГ, ЭоуФДГ и АШФДГ -рекомбинантные ФДГ из бактерий Pseudomonas sp.101, дрожжей Candida boidinii, растений Arabidopsis thaliana и сои Glycine тах соответственно.

включая патогены, вызывающие туляремию, легионеллез и др. В метанолутилизирующих микроорганизмах синтез ФДГ индуцируется при росте на метаноле, в патогенах - при росте в виде биопленок. В растениях ФДГ находится не в цитоплазме, а в митохондриях. При стрессовых воздействиях содержание ФДГ достигает 9% от всех митохондриальных белков.

В нашей лаборатории ведутся систематические исследования ФДГ из различных источников. Были клонированы гены и созданы системы экспрессии рекомбинантных ФДГ из бактерий, дрожжей и растений. Для большинства ферментов получены кристаллы и решена структура как свободных ферментов (апо-форма), так и их комплексов с субстратами и ингибиторами. Для создания биокатализаторов регенерации NADH в качестве источника фермента была выбрана метилотрофная бактерия Pseudomonas sp.101 (штамм был любезно предоставлен в 70-х годах прошлого века сотрудниками кафедры микробиологии биологического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова). Методом направленного мутагенеза была получена мутантная РэеФДГ GAV, которая превосходит мутантную ФДГ из С. boidinii, разработанную фирмой Degussa, по активности в 1,7 раза, а по термостабильности - более, чем в 100 раз. Однако работы по созданию биокатализаторов регенерации NADH далеки от завершения. Это связано с тем, что таких биокатализаторов должно быть два типа. Из уравнения Михаэлиса следует, что при высоких, насыщающих концентрациях субстрата главным показателем для фермента является величина каталитической константы кса,. В случае использования низких концентраций субстрата главную роль играет не величина кса1, а каталитическая эффективность - отношение каталитической константы к константе Михаэлиса /сса,/Км. Поскольку самая высокая величина кса, у бактериальных ФДГ, то для биокатализатора регенерации NADH первого типа несомненным лидером является РвеФДГН GAV, которая также превосходит все известные ФДГ по термостабильности. Однако у этого фермента можно дополнительно повысить операционную (химическую) стабильность за счет замен остатков цистеина. В случае биокатализатора второго типа наиболее перспективной является рекомбинантная ФДГ из сои Glycine max (ЭоуФДГ), которая имеет самые низкие значения Км среди всех описанных в литературе ФДГ.

Цели исследования. Целью данной работы было проведение систематических исследований формиатдегидрогеназ из различных источников и создание на основе полученных данных новых биокатализаторов регенерации NADH с улучшенными свойствами. Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

- изучение термостабильности используемых на практике рекомбинантных формиатдегидрогеназ микроорганизмов при различных pH и ионной силе;

- разработка высокочувствительной методики детекции формиатдегидрогеназ;

-анализ структуры и выбор положений для введения аминокислотных замен в

формиатдегидрогеназах из сои Glycine max и бактерии Pseudomonas sp.101;

- получение мутантных растительной и бактериальной формиатдегидрогеназ и изучение их каталитических свойств и термостабильности;

- разработка метода оценки химической стабильности формиатдегидрогеназ;

- исследование с помощью разработанного метода химической стабильности рекомбинантных ФДГ дикого типа и мутантных ферментов.

Научная новизна. Проведены систематические исследования по влиянию pH среды и ионной силы на термостабильность формиатдегидрогеназ. Получены новые данные по взаимосвязи структура-активность и структура-стабильность для двух формиатдегидрогеназ.

Показано важное влияние остатка Phe290 в БоуФДГ и остатка Cys145 в РэеФДГ на каталитическую активность и стабильность. Впервые проведено сравнительное исследование химической стабильности ФДГ из разных источников. Показано, что ФДГ, биосинтез которых индуцируется в условиях стресса, обладают повышенной стабильностью против инактивации пероксидом водорода.

Практическая значимость работы. Получены два типа новых биокатализаторов регенерации NADH на основе мутантных ФДГ из сои G. max и бактерии Pseudomonas sp.101. В случае мутантов БоуФДГ были повышены каталитическая активность и термостабильность без существенного изменения (а в ряде случаев и с улучшением) констант Михаэлиса как по NAD*, так и по формиату. Данный тип биокатализатора оптимален для использования в условиях низких концентраций субстрата. В случае новых мутантных РвеФДГ были улучшены температурная и химическая стабильность без ухудшения каталитических свойств. Лучший мутант РэеФДГ GASV имеет самую высокую термостабильность среди всех описанных в литературе формиатдегидрогеназ (как дикого типа, так и мутантных ферментов). Данный тип биокатализатора наиболее подходит для процесса регенерации NADH в реакторах периодического действия. Разработаны методы детекции микроколичеств формиатдегидрогеназ, а также оценки их химической стабильности.

Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы были представлены на следующих международных конференциях: 38th FEBS Congress (St.-Petersburg, 2013), 13th и 14th International Biotechnology Symposiums (Dalian, China, 2008 и Rimini, Italy, 2010), IV Съезд Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, 2008), XVIII и XIX Менделеевские съезды по общей и прикладной химии (Москва, 2007 и Волгоград, 2011), International Conferences of International Network of Protein Engineering Centres (INPEC) (INPEC-2009 - Ubatuba, State Sao Paolo, Brasil, 2009; INPEC-2010 - Sweden, Uppsala, 2010 и INPEC-2012 - Taipei, Taiwan, 2012), 7th, 8th и 9th International Conferences "Biocatalysis: Fundamentals & Applications" (Moscow-St.Petersburg, 2007; Arkhangelsk, 2009 и Moscow, 2013), 8th и 9th International Conferences on Protein Stabilization (ProStab-2009, Graz, Austria, 2009 и ProStab-2012, Lisbon, Portugal, 2012), IV, V, VI и Vll-ой Московские международные конгрессы "Биотехнология: состояние и перспективы развития" (Москва, 2007, 2009, 2011 и 2013), VIII, X, XI и XII Международные конференции молодых ученых «Леса Евразии» (Сочи, 2008; Москва, 2010; Брянск, 2011 и Браслав, Белоруссия и Игналина, Литва, 2012), ll-ая Международная конференция «Физико-химическая биология», посвященная 85-летию академика Д. Г. Кнорре (Новосибирск, 2011), V International Meeting "Early events in Human Pathologies" (Listvyanka, Baikal, Russia, 2012).

Публикации. По материалам диссертационной работы опубликовано 8 статей (все в журналах, индексируемых в Международных базах данных Web of Science, Pub Med и Scopus, входят в Перечень рецензируемых научных изданий ВАК РФ) и 27 тезисов докладов конференций, поданы две заявки на выдачу патента РФ на изобретение.

Стуктура и объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы. Диссертация изложена на 149 страницах и содержит 68 рисунков, 24 таблицы и 147 ссылок.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ

Изучение термостабильности СЬоФДГ и РэеФДГ GAV

Первый этапом было изучение термостабильности рекомбинантной ФДГ из дрожжей С. boidinii СЬоФДГ и мутантного фермента из бактерии Pseudomonas sp.101 РэеФДГ GAV.

Как уже отмечалось выше, именно эт практике, однако, до сих пор в литературе

Время, мин

Рис. 1. Зависимости остаточной активности РэеФДГ вАХ/ от времени в координатах 1п(А/Ао) - I, с при нескольких температурах. А - 0,1 М и Б -1,0 М №-фосфатный буфер, рН 8,0.

1,с

Рис. 2. Зависимость остаточной активности СЬоФДГ от времени в координатах 1п(А/Ао) - 1, при нескольких температурах, 0,1 М №-фосфатный буфер, рН 6,0.

формиатдегидрогеназы применяются на отсутствуют систематические данные по количественной характеристике термостабильности СЬоФДГ. Для РэеФДГСАУ/ есть данные по кинетике инактивации и дифференциальной сканирующей

калориметрии, однако, все они были получены только при рН 7,0.

Известно много методов по изучению термостабильности белков, однако, с точки зрения практического применения фермента наиболее правильным и полезным является исследование кинетики термоинактивации. Такие эксперименты проводятся при повышенных температурах, поскольку, обработав экспериментальные значения констант скорости инактивации в рамках теории активированного комплекса можно получить

количественные параметры уравнения и потом рассчитывать величины констант для любой температуры.

Кинетика термоинактивации

РвеФДГ СА\/ была исследована при рН 8,0 и 61-69°С и различных концентрациях фосфатного буфера (0,02-1,5М) На рис. 1 представлены зависимости величин остаточной ферментативной активности от времени при различных температурах и концентрациях буфера 0,1 и 1,0 М соответственно. Зависимости величин остаточной активности от времени полулогарифмических координатах 1п(А/Ао) - I (рис. 1) во всем изученном диапазоне температур и концентраций буфера представляли собой прямые, тангенс угла которых (константа скорости инактивации) не зависел от концентрации фермента, что однозначно свидетельствовало о мономолекулярном механизме процесса инактивации.

Аналогичные эксперименты были проведены для СЬоФДГ при трех значениях рН - 6,0, 7,0 и 8,0. Во всем диапазоне рН и концентраций буфера также наблюдался первый порядок инактивации

(рис. 2). Следует отметить, что в зависимости от температуры константы скорости инактивации для СЬоФДГ были от 50 до 100 раз выше по сравнению с таковыми для РэеФДГ GAV.

На рис. 3 и 4 представлены зависимости величины константы скорости инактивации от концентрации фосфатного буфера при рН 7,0 и 8,0 для РэеФДГ GAV и для СЬоФДГ соответственно. В обоих случаях наблюдается увеличение стабильности ферментов с увеличением ионной силы, однако эффект стабилизации разный. В случае РэеФДГ GAV при переходе от рН 7,0 к 8,0 наблюдается уменьшение стабильности примерно в три раза при концентрации буфера 0,1 М, однако при концентрациях буфера выше 0,2 М стабильность фермента при разных рН практически одинакова.

В случае СЬоФДГ эффект дестабилизации при повышении рН намного выше. Для того, чтобы время и степень инактивации при рН 8,0 сделать сопоставимыми с таковыми при рН 7,0 нами были выбраны разные температуры - 59 и 61 °С соответственно. Кроме того, эффект стабилизации при высокой концентрации буфера был при рН 8,0 был намного выше, чем при рН 7,0 (100 и 7 раз соответственно). Анализ четвертичной структуры СЬоФДГ позволяет объяснить эффект стабилизации фермента более чем в 3 раза при концентрации фосфатного буфера 0,1 М за счет мутации Arg178Ser (US Patent US 6 242 234). Дело в том, что в ферменте дикого типа (wt-СЬоФДГ) рядом с остатком Агд178 расположены еще два остатка Агд в положениях 174 и 182. Их положительно заряженные гуанидиновые группы расположены от таковой у Агд178 на расстоянии 4,05 и 4,78 А соответственно. Это достаточно большие расстояния, и в случае взаимодействия только двух остатков (положительных зарядов) сила отталкивания будет не очень велика, но таких остатков (и положительных зарядов) три, вследствие чего эффективность отталкивания сильно возрастает. Замена Arg178Ser приводит к полному удалению электростатического отталкивания положительных зарядов и, кроме того, образуется новая водородная связь между остатками Агд 182 и Ser178, что и обеспечивает стабилизацию за счет этой замены при концентрации буфера 0,1 М. При увеличении концентрации фосфатного буфера происходит экранирование положительных зарядов отрицательно заряженными ионами фосфата, вследствие чего возрастает и стабильность фермента дикого типа.

Константы скоростей инактивации при разных температурах были представлены в координатах линейной формы уравнения теории активированного комплекса, описывающего зависимость константы скорости от температуры для мономолекулярного процесса. Во всех случаях были получены прямые (рис. 5 и 6).

С(фосфат), М

0,00061

0,0005

| 0,0004 га

| 0,0003 &

I 0,0002

| 0,0001 &

0,0000-

0,0

0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 Концентрация фосфатного буфера, М

Рис. 3. Зависимости величины константы скорости инактивации РэеФДГ вАХ/ от концентрации фосфат-иона при рН 7,0 (А) и 8,0 (Б) соответственно (63°С).

0.8 1,0 С(фосфат). М

0,0 0,3 0.5 0,8 1,0 1.3 1.5 С{фосфат), М

Рис. 4. Зависимости величины константы скорости инактивации СЬоФДГ от концентрации фосфат-иона. А - 0,01 М - 1,5 М натрий-фосфатный буфер, рН 7,0, 61°С и Б - 0,1 - 1,5 М натрий-фосфатный буфер, рН 8,0, 59°С.

Из рис. 5 хорошо видно, что в

-12-

-13-

-14

-16-

0,00292 0,00294

0,00296 1/Т, К"1

0,00298 0,00300

Рис. 5. Зависимости констант скорости инактивации РэеФДГ вАХ/ от температуры в координатах 1п(^п/Т) - 1Я, К"1 при концентрациях фосфатного буфера 0,1 и 1,0 М.

3,00x10®

3,02x10 3,04x10 1Л\ К"1

3,06x10"1

Рис. 6. Зависимости констант скорости инактивации СЬоФДГ от температуры в координатах !п(кин/г) - 1/Т, при различных значениях рН. 0,1 М №-фосфатный буфер.

случае РэеФДГ вА\/ наблюдается одинаковый наклон прямых, что свидетельствует об одинаковом изменении константы скорости инактивации от температуры как при низкой, так и при высокой концентрации буфера, так и при рН 8,0 (рис. 5) и рН 7,0 (на рис. не показано).

В случае СЬоФДГ картина намного сложнее. Фермент наиболее стабилен при рН 7,0. При рН 6,0 и 8,0 стабильность более низкая, но из-за разного наклона прямых при температурах выше 56°С СЬоФДГ более стабильна при рН 8,0, чем при рН 6,0 и прямо противоположная ситуация наблюдается при температурах ниже 56°С.

Из тангенсов угла наклона и величин отсекаемых отрезков были рассчитаны значения активационных параметров АН* и А8* (табл. 1). Порядок величин АН* и АЭ* свидетельствует, что термоинактивация ферментов обусловлена денатурацией белковой глобулы. Из таблицы 1 также хорошо видно, что во всех случаях для РэеФДГ САУ наблюдаются гораздо большие значения АН* активации, чем в случае СЬоФДГ. Это означает, что с понижением температуры константа скорости

инактивации РэеФДГ вА\/ уменьшается быстрее, чем в случае СЬоФДГ и, чем меньше температура, тем больше будет разница в стабильности.

По-видимому, именно этим и объясняется огромная разница в стабильности ферментов при пониженных температурах. РэеФДГ вАУ при +4°С в 0,1 М фосфатном буфере может храниться в течение года и более без потери активности, в то время как для СЬоФДГ при длительном хранении используют 40% глицерин и -20°С.

Таким образом, нами было впервые проведено сравнительное исследование температурной стабильности двух формиатдегидрогеназ, используемых на практике. Полученные данные однозначно свидетельствуют, что РэеФДГ вА\/ намного превосходит по термостабильности СЬоФДГ. Более того, за счет практически одинаковой стабильности при разных рН (при одинаковой концентрации буфера) и характера изменения константы скорости инактивации от температуры РэеФДГ СА\/ обеспечивает гораздо большую простоту и удобство для расчета стабильности биокатализатора при различных условиях проведения процесса.

Детекция нанограммовых количеств ФДГ на мембранах

Характеристика ферментов и биокатализаторов, созданных на их основе, невозможна без соответствующей методики детекции активности. В настоящее время разработано большое количество методов определения белков, но для многих из них присущ один серьезный недостаток - эти методики позволяют детектировать фермент в условиях отсутствия примесей (как других ферментов, так и низкомолекулярных соединений). Поэтому для применения таких методик используется дополнительная процедура пробоподготовки, что существенно увеличивает время анализа и удорожает процесс. Одним из простых и эффективных способов решений может быть сорбция фермента на мембрану, затем следует промывка мембраны для удаления примесей с последующей детекцией фермента непосредственно на мембране. Такая процедура также позволяет проводить концентрирование фермента за счет нанесения образца на мембрану несколько раз. В случае ФДГ есть много ситуаций, когда этот фермент надо определять в очень сложных смесях (культуральные и физиологические жидкости, образцы реакционной среды различных процессов). В литературе описана система детекции активности дегидрогеназ с помощью тетранитротетразолия синего (ТНТ), который через медиатор восстанавливается продуктом дегидрогеназной реакции ЫАОН с образованием окрашенного нерастворимого продукта, однако, для ФДГ такая методика не была оптимизирована. Поэтому мы провели оптимизацию процесса по всем параметрам и добились чувствительности определения ФДГ в количестве до 15 нг в образце.

Фактически при таком способе детекции необходимо проведение трех реакций:

1. Собственно формиатдегидрогеназная реакция, в результате которой образуется

МОН.

Таблица 1

Значения активационных параметров для процесса термоинактивации для РэеФДГ йАУ и СЬоФДГ при различных рН и концентрациях буфера._

Условия ДА/, кДж/моль Дж/(Кмоль)

РэеФДГ вАУ, рН8,0, 1 М буфер 579±35 1390±100

РвеФДГ вА\/, рН8,0, 0,1 М буфер 569±15 1370±44

РэеФДГСАУ, рН7,0, 0,1 М буфер 579±27 1380±67

М-СЬоФДГ, рН6,0, 0,1 М буфер 280±9 500±30

иЛ-СЬоФДГ, рН7,0, 0,1 М буфер 500±30 1360±90

■М-СЬоФДГ, рН8,0, 0,1 М буфер 420±30 1240±80

2. Далее NADH неферментативно окисляется медиатором, в качестве которого могут выступать феназинметасульфат (ФМС) и его производные.

3. Восстановленный ФМС или его производные затем восстанавливают ТНТ в нерастворимый окрашенный продукт нерегулярного строения.

На первом этапе мы изучили зависимость активности ФДГ от концентрации фермента и показали, что такая зависимость линейна во всем изученном диапазоне концентраций, т. е в этом диапазоне не происходило изменения агрегационного состояния фермента. Потом были исследованы спектральные характеристики реакционной системы до и после проведения реакции. Было показано, что продукт восстановления ТНТ имеет широкий максимум поглощения в районе 560-620 нм. Затем были протестированы два медиатора -ФМС и его метильное производное - 5-метил-ФМС. Было показано, что 5-метил-ФМС является более эффективным медиатором, чем ФМС, поскольку время, за которое достигается одинаковая величина поглощения Авоо 0,5 в случае 5-метил-ФМС было в 1,5 раза меньше, чем в случае ФМС. Третьим этапом была оптимизация концентрации ТНТ. Оказалось, что при концентрации ТНТ больше 0,075 мг/мл скорость образования продукта практически одинакова, поэтому для проведения концентрации нами была выбрана концентрация 0,1 мг/мл.

На заключительном этапе было проверено 2 типа мембран, которые нашли наиболее широкое применение в молекулярной биологии, - на основе нитроцеллюлозы (от 3 производителей) и поливинилидендифторида. Оказалось, что нитроцеллюлозная мембрана фирмы BioRad дает высокую чувствительность при наименьшем фоне. На эту мембрану были нанесены образцы ФДГ с различной концентрацией. После проведения реакции была проведена количественная оценка интенсивности пятен с помощью программы ScanArray Express фирмы Perkin Elmer. Калибровочный график представлен на рис. 7. Как видно из этого рисунка, наблюдается линейная зависимость интенсивности окраски пятна от количества ФДГ в пробе в диапазоне 15-160 нг.

Количество фермента в пробе, нг Рис. 7. Зависимость интенсивности окраски пятна от количества формиатдегидрогеназы в пробе.

Таким образом, в результате оптимизации нами была разработана методика, позволяющая детектировать ФДГ в количестве до 15 нг в образце, что примерно в 100 раз меньше, чем в случае детекции фермента по окраске с красителями Кумасси. Данная методика в первую очередь может быть использована для скрининга библиотек клонов с мутантными ФДГ по активности.

Белковая инженерия формиатдегидрогеназы из сои

Как уже отмечалось выше, для создания на основе ЭоуФДГ биокатализатора регенерации NADH, эффективного при низких концентрациях субстрата, у данного фермента было необходимо повысить каталитическую константу и термостабильность. Для этого нами был использован подход, известный как "рациональный дизайн". Он основан на тщательном анализе структуры фермента, на основании которого выбираются наиболее перспективные замены. Дополнительно проводится моделирование мутантных ферментов для оценки возможных изменений структуры и вытекающих из этого изменений свойств. После завершения моделирования с помощью полимеразной цепной реакции в ген фермента вводили нукпеотидные замены, обеспечивающие необходимую аминокислотную замену. Плазмиды с генами мутантных ферментов секвенировали по двум цепям для подтверждения наличия в генах только требуемых мутаций. Плазмиды трансформировали в штамм Е. coli BL21(DE3) CodonPlus/pLysS. Затем проводили культивирование штаммов-продуцентов и из полученной биомассы выделяли целевые ферменты. Согласно данным аналитического электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия чистота полученных препаратов мутантных ЭоуФДГ составляла не менее 95%.

На рис. 7 представлена структура тройного комплекса ЭоуФДГ с коферментом NAD* и азид-ионом, который является конкурентным по формиату ингибитором фермента (окрашены темно-синим и розовым цветом соответственно). Анализ этой структуры показал, что в районе кофермент-связывающего домена активного центра на поверхности белковой глобулы находится гидрофобный остаток Phe290 (на рис. показан красным цветом). С точки зрения термодинамики наличие гидрофобного остатка на поверхности белковой глобулы очень не выгодно. Поэтому было решено произвести замену этого остатка на другие аминокислотные остатки.

Рис. 8. Структура тройного комплекса [Soy®flr-NAD+-N3"], разрешение 1,9 А.

Выравнивание аминокислотных последовательностей ФДГ из разных растений показало, что в положении 290 кроме остатка Phe могут находиться остатки Туг, Asp, Asn и Ser. Поэтому мы решили заменить остаток Phe290 на эти 4 остатка и дополнительно сделать еще 4 замены на остатки Ala, Glu, Gin и Thr. Для того, чтобы оценить возможное влияние наших замен, мы провели компьютерное моделирование структур этих мутантов. Для двух мутантов результаты моделирования представлены на рис. 9. Оказалось, что введение

новых аминокислотных остатков (кроме остатка Ala) может приводить к образованию дополнительных водородных связей (рис. 9Б). Очевидно, что в случае замены на остаток Ala новые водородные связи возникнуть не могут (рис. 9А). В остальных случаях образуется от двух до четырех новых водородных связей. Особо следует отметить, что во всех случаях (кроме замены на остаток Ala), всегда образуется водородная связь с остатком Gln292. Этот остаток находится в активном центре и контактирует с каталитически важным остатком His311. Таким образом, данные моделирования позволяют полагать, что у новых мутантных ЭоуФДГ с высокой долей вероятности будут изменяться каталитические свойства.

А Б

Рис. 9. Моделирование структур мутантных ЭоуФДГ с заменами Phe290Ala и Phe290Tyr.

Кроме того, при анализе структуры фермента наше внимание привлекли остатки Val 127 и Ala267. В первом случае за счет введения остатка Arg могла появиться ионная пара с остатком Glu169 из соседней субъединицы. Остаток Ala267 расположен рядом с полостью внутри белковой глобулы, в которой находится молекула воды. Замена Ala267Met позволяет заполнить эту внутреннюю полость и удалить из нее термодинамически невыгодную молекулу воды.

Таким образом, в результат компьютерного анализа и моделирования было предложено сделать 10 аминокислотных замен. Все полученные мутанты экспрессировались в виде активных ферментов и после выделения в высокоочищенном виде были изучены их каталитические свойства и термостабильность.

Кинетические свойства полученных мутантных ЭоуФДГ

Значения констант Михаэлиса определяли из зависимостей скорости реакции от концентрации одного субстрата (диапазон концентраций составлял 0,ЗКм - 6КМ) и фиксированной, насыщающей (>20КМ) концентрации второго субстрата. Концентрацию активных центров фермента определяли с помощью разработанной в нашей лаборатории методике по тушению собственной флуоресценции фермента (Романова Е. и соавт. Вестник МГУ, Серия 2: Химия, 2010, 51, 156-159) В таблице 2 приведены каталитические параметры для всех полученных мутантных ферментов и исходной ЭоуФДГ. Для сравнения также приведены соответствующие параметры ряда других ФДГ из растений, дрожжей и бактерий, которые являются лучшими для каждого из источников.

Как видно из таблицы 2, в 9 случаях из 10 в результате введения точечных замен увеличилась каталитическая константа кса, и это увеличение составило от 20% до 75%. В результате у ряда мутантов величина кса, стала существенно выше, чем у другой растительной ФДГ из A. thaliana и главного нашего конкурента - ФДГ из дрожжей С. boidinü.

Однако, следует признать, что величина каталитической константы у полученных мутантных ЭоуФДГ все еще меньше, чем у бактериальных ферментов.

Таблица 2

Сравнение кинетических параметров мутантных ФДГ и фермента дикого типа с другими формиатдегидрогеназами (0,1 М Ыа-фосфатный буфер, рН 7,0, 30°С).

Фермент kcati с'1 v NAD+ 1 MKM IS HCOO-■»M , MM ь. ЦТ NAD+ (MKM'C)'1 и ¡и нсоо- (мМ*с)'1'

wt-АгаФДГ, A. thaliana 3,8 50 2,8 0,08 1,36

иЛ-ЭоуФДГ, G.max 2,9±0,1 13,3±0,8 1,5±0,1 0,20 1,93

БоуФДГ F290A 3,8±0,1 8,6±0,6 1,1±0,1 0,44 3,45

БоуФДГ F290Y 3,5±0,1 10,9±0,3 0,9±0,1 0,32 3,89

БоуФДГ F290Q 3,5±0,2 11,7±0,6 1,2±0,1 0,29 2,92

БоуФДГ F290E 4,7±0,4 13,7±0,7 2,9±0,1 0,34 1,62

ЭоуФДГ F290T 4,0±0,4 14,3±0,9 1,3±0,1 0,28 3,08

SoyOflr F290N 2,8±0,1 14,0±1,0 4,5±0,3 0,20 0,62

ЭоуФДГ F290D 5,1±0,3 12,8±0,8 5,0±0,2 0,40 1,02

воуФДГ F290S 4,1 ±0,2 9,1±0,7 4,1 ±0,3 0,45 1,00

БоуФДГ V127R 3,6±0,7 9,5±0,5 3,4±0,2 0,38 1,06

БоуФДГ А267М 5,0±0,9 9,9±0,8 2,1±0,2 0,51 2,38

wt-МогФДГ, Moraxella sp. С-1, 7,3 80 7,5 0,09 0,97

wt-РзеФДГ, Pseudomonas sp.101 7,3 65 6,5 0,11 1,12

РвеФДГ GAV 7,3 35 6,0 0,21 1,22

wt-СЬоФДГ, С. boidinii 3,7 45 5,9 0,08 0,63

Вторым важным результатом является то, что замены Phe290 на остатки Gin, Glu, Thr, Asn, Asp практически не влияют на константу Михаэлиса по NAD*, а в случае замены Phe290 на остатки Ala, Туг, Ser и замен Val127Arg и Ala290Met она даже улучшается. В случае Км по формиату у половины мутантов она возросла, но незначительно, не более, чем в три раза, у трех мутантов не изменилась, а у двух мутантов - Phe290Ala и Phe290Tyr, даже улучшилась. Увеличение каталитической константы при неизменных или улучшенных значениях Км привело к тому, что у ряда полученных мутантных БоуФДГ каталитическая эффективность по коферменту возросла в 2 - 2,5 раза по сравнению не только с ЭоуФДГ дикого типа, но и наилучшего до этого момента мутантного фермента из бактерии РэеФДГ GAV (табл. 2). В случае Км по формиату превосходство отдельных мутантных БоуФДГ составило 2,5-3,4 раза. Таким образом, мы получили мутантные БоуФДГ с самой высокой каталитической эффективностью среди всех известных ФДГ.

Температурная стабильность полученных мутантных ЭоуФДГ

В зависимости от стабильности кинетику инактивации ЭоуФДГ дикого типа и полученных мутантных ферментов изучали в диапазоне температур от 46 до 64°С. На рис. 10 представлены зависимости остаточной активности от времени для 9 мутантных ЭоуФДГ и фермента дикого типа (wt-ЗоуФДГ). Данные для мутантной БоуФДГ Va!127Arg не показаны, так ее стабильность оказалась ниже таковой для wt-ЗоуФДГ в 2,5-5 раз, в то время

как все остальные мутанты при 56°С (единственная температура, при которой можно было измерить кинетику инактивации для всех ферментов) превосходили исходный фермент от 1,3 до 60 раз. Как видно из рис. 10, самый высокий эффект стабилизации наблюдался при замене остатка РЬе290 на остатки глутаминовой и аспарагиновой кислот.

Для всех изученных мутантов соблюдался

мономолекулярный механизм инактивации. Поэтому

полученные зависимости были представлены в координатах 1п(/с,>/Т) от 1/Т, которые используют для линеаризации уравнения зависимости константы

скорости от температуры в теории активированного комплекса (рис. 11). Как видно из рисунка 11, во всех случаях эти зависимости представляют собой прямые, которые имеют разный наклон. Из тангенса угла наклона и величины отсекаемого отрезка были получены значения йН* и йв?, которые позволили рассчитать значения констант скоростей инактивации при тех температурах, которые выходят за экспериментальный диапазон.

Разный наклон прямых на рис. 11 для мутантов и ЭоуФДГ дикого типа означает разный характер изменения величины константы скорости от температуры. Если угол наклона больше, то при снижении температуры константа скорости инактивации у мутанта будет уменьшаться быстрее и отношение констант кт^/кщ"1"' (т.е. стабилизационный эффект) будет увеличиваться и наоборот. В таблице 3 представлены величины стабилизационных эффектов для полученных мутантных ЭоуФДГ. Как видно из этой таблицы, в случае замены Р11е290А1а разница в стабильности с иЛ-ЭоуФДГ постоянная. В случае трех замен при снижении температуры эффект стабилизации падает, а в случае 7 замен - увеличивается.

400

Рис. 10. Зависимости констант остаточной активности мутантных ЭоуФДГ и фермента дикого типа от времени. 0,1 М Ыа-фосфатный буфер, рН 7,0, 56°С.

-11-

-12-

-13-|

ьГ

~ -14-1

-15-

-16-

иЛ-ЭоуФДГ

Р290А

Р290У

Р2900

Р290Е

Р290Т

0,00300

0,00305 1/Т, К"^

0,00310

Рис. 11. Зависимости констант скорости термоинактивации мутантных БоуФДГ и фермента дикого типа от температуры. 0,1 М Ыа-фосфатный буфер, рН 7,0.

Таблица 3.

Значения эффекта стабилизации* мутантных БоуФДГ по отношению к ферменту дикого типа при различных температурах(0,1 М Ыа- фосфатный буфер, рН 7,0)._

Т, Замены

«с F290A V127R F290Y F290Q А267М F290S F290T F290N F290E F290D

25 1,18 0,03 0,21 1,78 8,55 51,7 212 204 3030 10890

30 1,20 0,10 0,30 2,17 6,88 33,2 109 121 1440 4140

48 1,26 0,30 0,98 4,14 4,03 8,83 11,9 20,9 119 164

50 1,27 0,35 1,11 4,43 3,79 6,45 9,47 17,5 91,5 120

52 1,28 0,41 1,25 4,74 3,57 5,54 7,54 14,6 70,7 84,1

54 1,29 0,42 1,41 5,06 3,37 4,76 6,02 12,2 54,9 60,6

56 1,29 0,51 1,59 5,40 3,18 4,10 4,82 10,2 42,7 43,8

58 1,30 0,62 1,78 5,76 3,00 3,54 3,87 8,61 33,4 31,8

60 1,31 0,73 2,00 6,14 2,83 3,06 3,11 7,25 26,1 23,2

62 1,31 0,85 2,25 6,53 2,68 2,65 2,51 6,12 20,5 16,9

64 1,32 0,99 2,51 6,95 2,53 2,30 2,03 5,18 16,1 12,4

* эффект стабилизации рассчитывался как отношение констант скорости инактивации для ЭоуФДГ дикого типа и мутанта при одной температуре. Серым, красным и синим фоном выделены случаи, когда эффект стабилизации соответственно не зависит, уменьшается и увеличивается при снижении температуры.

Таким образом, с помощью рационального дизайна нами получены мутантные БоуФДГ, которые по каталитической эффективности с NAD* и формиатом соответственно в 2-2,5 и 2,1-3,5 раза выше по сравнению с известными ФДГ. Кроме того, была существенно повышена их термостабильность. С точки зрения применения на практике наиболее перспективными являются 4 мутантные ЭоуФДГ с заменами остатка Phe290 на остатки Asp, Glu, Ser и заменой Ala267Met. Кроме того, в будущем можно попытаться улучшить свойств мутантных ЭоуФДГ за счет объединения лучших точечных замен.

Рис. 12. Остатки Cys на поверхности глобулы РэеФДГ (структура 2NAC).

Повышение операционной (химической ) стабильности РвеФДГ

Анализ структуры РэеФДГ показывает, что на поверхности белковой глобулы находятся три остатка цистеина, доступные действию растворителя (рис. 12). Мутагенез по 255-му положению был проведен ранее и было показано, что лучшей является замена на остаток Ala. В данной работе были получены мутантные РэеФДГ с заменами остатков Cys145 и Cys354 на остатки Ala и Ser. Кроме того, на основе результатов сравнения аминокислотных последовательностей ФДГ было решено сделать замену Cys345Arg. Далее по результатам исследования свойств этих мутантов для каждого положения были отобраны лучшие замены и, взяв за основу РэеФДГ GAV, были получены два мутанта с двойными заменами по остаткам Cys - C145S/C255A и C255A/C354S. Все мутанты экспрессировались в активной форме и были получены в виде высокоочищенных препаратов.

Кинетические свойства мутантных по остаткам цистеина РвеФДГ

В таблице 4 представлены каталитические параметры мутантных РвеФДГ с заменами остатков Cys, а также для сравнения представлены данные для других ФДГ.

Таблица 4

Сравнение кинетических параметров мутантных по остаткам Суэ РэеФДГ и фермента дикого типа с другими формиатдегидрогеназами (0,1 М Ма-фосфатный буфер, рН 7,0, 30°С).

Фермент ксаи If NAD* Ли , и нсоо- •»м , I, iL, NAD* Яса("»м > J. /1, нсоо-

с1 мкМ мМ (мкМ*с)'1 (мМ*с)"1"

wt-АгаФДГ 3,8 50 2,8 0,08 1,36

wt-ЗоуФДГ 2,9±0,1 13,3±0,8 1,5±0,1 0,20 1,93

ЭоуФДГ F290A 3,8±0,1 8,6±0,6 1,1±0,1 0,44 3,45

воуФДГ А267М 5,0±0,9 9,9±0,8 2,1±0,2 0,51 2,38

БоуФДГ F290D 5,1 ±0,3 12,8±0,8 5,0±0,2 0,40 1,02

wt-МогФДГ 7,3 80 7,5 0,09 0,97

wt-РБеФДГ 7,3 65 6,5 0,11 1,12

РвеФДГ С354А 7,3 65±4 8,7±0,8 0,11 0,84

РвеФДГ C354S 7,3 60±7 7,0±0,8 0,12 1,06

РвеФДГ C354R 7,3 57±4 7,4±0,9 0,13 0,99

РвеФДГ С145А 7,3 57±6 6,2±0,2 0,13 1,18

Pse®flrC145S 7,3 47±4 7,2±0,2 0,15 1,01

РвеФДГ GAV (С255А) 7,3 35 6,0 0,21 1,22

РвеФДГ GAV C354S 7,3 60±3 6,9±0,8 0,12 1,06

РвеФДГ GAVC145S 7,3 41±4 3,2±0,2 0,18 2,28

wt-СЬоФДГ 3,7 45 5,9 0,08 0,63

Как видно из таблицы. 4, при замене остатка Cys354 на остатки Ala, Ser и Arg кинетические параметры мутантов сравнимы с таковыми для \М-РэеФДГ. В случае замен в 145 положении каталитические свойства также меняются слабо. Введение замены Cys354Ser в мутантную РэеФДГ GAV приводит к получению мутанта аналогичного по каталитическим свойствам РэеФДГ дикого типа. В случае двойной замены Cys145Ser/Cys255Ala в мутантной РэеФДГ GASV наблюдается двукратное улучшение Км по формиату при небольшом увеличении Км по NAD*.

< <

"с"

Термостабильность мутантных по остаткам цистеина РэеФДГ

На рис. 13 представлены данные по кинетике термоинактивации мутантных РэеФДГ с заменами Суз354А1а, Суз3548ег и Суэ354Агд. Как видно из этого рисунка, все замены

вызывают очень сильную дестабилизацию фермента

(особенно при замене Суз354Агд). Поскольку термостабильности РвеФДГ с заменами Суэ354А1а и Сув3543ег близки, а второй мутант имеет более высокие каталитические параметры, то именно последняя замена и была введена в РэеФДГ вАУ для изучения роли остатка Суэ354 в химической стабильности фермента. Полученный мутант РэеФДГ йАУ Суз354Бег по стабильности был немного хуже, чем чЛ-РэеФДГ (на рис. не показано).

Замена Суз145А1а не влияла на стабильность \М-РзеФДГ, а замена СуэИбБег увеличивала таковую почти в два раза. Поэтому эта замена была сделана и в РэеФДГ САУ. Эффект стабилизации оказался аддитивным (рис. 14) и в результате была получена РэеФДГ вАБУ - одна из самых термостабильных ФДГ, описанных в литературе и одновременно обладающая самыми лучшими каталитическими параметрами среди известных ФДГ из бактерий и дрожжей.

Таким образом, в результате выполнения данной части работы были получены мутантные РэеФДГ с двойными

100 150 200 250 1, мин

Рис. 13. Термоинактивация М-РэеФДГ и ее мутантов с заменами Суз354А1а, Суэ3548ег, Суэ354Агд. 0,1 М Ма- фосфатный буфер, рН 7,0, 62°С.

-0,5-

РвеФДГ вАУ С145Э

| с

-2,0-

-2,5-

200

Рис. 14. Термоинакгивация «Л-РэеФДГ и мутантов РэеФДГ САУ и РвеФДГ бАУ Сув145Эег (РэеФДГ вАБУ). 0,1 М Ма-фосфатный буфер, рН 7,0, 64°С.

заменами по остаткам цистеина - С1458/С255А и С255А/С3548. Первый мутант РэеФДГ САБУ обладал улучшенными кинетическими свойствами и повышенной термостабильностью. В случае второго мутанта снижение термостабильности не является критическим и он также может быть использован на практике в случае увеличения его операционной (химической) стабильности по сравнению с исходным мутантом РэеФДГ вАУ. Поэтому следующим этапом было изучение химической стабильности полученных мутантов, а также других формиатдегидрогеназ.

Разработка метода оценки химической стабильности ФДГ

Остатки Суэ являются одними из наиболее реакционноспособных и, как правило, их модификация или окисление приводят к потере активности ферментов. Ранее при модификации остатков Суэ в ФДГ д применяли ионы меди Си2* и

специфические реагенты на сульфгидрильные группы остатков цистеина, такие как 5,5'-дитио-бис(2-нитробензоат) (ДТНБ) и л-хлормеркурибензоат (ПХМБ). Недостатком таких реагентов является их достаточно большой размер. Поэтому нами было решено использовать другой реагент - пероксид водорода. Это было сделано по следующим причинам:

1) Пероксид водорода имеет небольшие размеры и способен окислять сульфгидрильные группы не только на поверхности, но и в глубине белковой глобулы, чего не могут ПХМБ и ДТНБ, которые имеют достаточно большие размеры.

2) Пероксид водорода активно образуется в живой клетке, т.е. он является природным инактивирующим агентом. Высокие концентрации пероксида водорода в клетке возникают при стрессовых воздействиях. В силу природного происхождения и малого размера молекулы пероксид водорода является хорошим химическим агентом для оценки стабильности ФДГ не

GWFDH, Н202 all concentr.

-Linear Fit of Data1_H202all

Linear Regression for Data1_H202all: Y = A + B*X

Parameter Value Error

-1.09437E-4 0,19005

0,00215 0,00816

0,99633

N P

6 <0.0001

0,4

0,5 [H-0J, M

Рис. 15. Кинетика инактивации РэеФДГ GAV (А) и зависимость наблюдаемой константы скорости инактивации фермента (Б) от концентрации пероксида водорода. 0,1 М Na-фосфэтный буфер, рН 7,0, 25°С.

только in vitro, но и in vivo.

На примере РвеФДГ GAV была исследована кинетика инактивации при различных концентрациях пероксида водорода. Зависимости остаточной активности фермента от времени при всех изученных концентрациях пероксида водорода описываются простой экспонентой (рис. 15А). Из тангенса угла наклона прямой можно рассчитать эффективную константу скорости инактивации к^щ. Величина этой константы не зависела от концентрации фермента. Зависимость эффективной константы скорости инактивации от концентрации Н202 представляет собой прямую (рис. 15Б). Это означает, что взаимодействие фермента с пероксидом водорода происходит по би-молекулярному механизму:

ФДГакт + Н202

ФДГ«,

+ Н20

PseFDH C145S/C255A

PseFDH C255A/C354S

Таким образом, если инактивацию формиатдегидрогеназ из разных источников (или различных мутантных форм) изучать при одной и той же постоянной концентрации пероксида водорода, то величина эффективной константы скорости инактивации первого порядка /с3*■„ может быть использована в качестве количественной характеристики стабильности данной ФДГ. В дальнейшем для проведения экспериментов была выбрана концентрация пероксида водорода 0,15 М.

Химическая стабильность мутантных РвеФДГ и фермента дикого типа

На рис. 16 представлены результаты изучения кинетики инактивации пероксидом водорода РэеФДГ дикого типа и трех мутантных ферментов, в которых были заменены различные остатки цистеина.

Как и следовало ожидать, самая низкая стабильность наблюдается в случае РэеФДГ дикого типа (рис. 14, нижняя прямая). Замена Cys255Ala приводит к тому, что константа скорости инактивации снижается почти в два раза (Л3*», 9,13*10"4 и 4,69*10"4 с"1 соответственно). В следующей мутантной форме в РэеФДГ GAV в дополнение к замене Cys255Ala была введена мутация Cys354Ser. Как видно, введение такой замены очень слабо влияет на стабильность фермента против инактивации Н202, что свидетельствует о том, что остаток Cys354 не является существенным для химической стабильности РэеФДГ. Наиболее высокая стабильность против инактивации пероксидом водорода наблюдается в случае замены двух остатков цистеина, расположенных в активном центре фермента - Cys145Ser и Cys255Ala.

Сравнение величин эффективных констант скоростей инактивации к?ф!п для РэеФДГ дикого типа и ее мутантов РэеФДГ GV Cys255Ala (РэеФДГ GAV) и РэеФДГ GV C145S/C255A (РэеФДГ GASV) свидетельствует, что вклад остатков Cys145 и Cys255 в величину к составляет 4,17*10"5 и 4,40*10"5 с"1 соответственно, т.е. оба остатка практически одинаково взаимодействуют с пероксидом водорода, несмотря на то, что в случае использования в качестве модифицирующего агента ДТНБ разница в реакционной способности между остатками Cys145 и Cys255 составляет минимум 2-3 порядка.

Сравнение химической стабильности ФДГ бактерий и растений

На последнем этапе мы изучили устойчивость против инактивации пероксидом водорода ФДГ из разных источников. Для исследования были взяты 3 формиат-дегидрогеназы, чей биосинтез резко возрастает в условиях стресса - бактериальная из Stapylococcus aureus - БаиФДГ и две растительные АгаФДГ и БоуФДГ) (рис. 17). В качестве сравнения использовали РэеФДГ дикого типа и ее наиболее химически устойчивый мутант РэеФДГ GASV. РэеФДГ не является белком стресса. Ее биосинтез индуцируется при росте бактерии Pseudomonas sp.101 на метаноле.

Рис. 16. Инактивация пероксидом водорода РэеФДГ дикого типа («Л-РэеРОН) и ее мутантов с различными заменами остатков Суэ. 0,15 М Н202, 0,1 М Ыа-фосфатный буфер, рН 7,0, 25°С.

Как видно из рис. 17, "стрессовые" ФДГ, как растительные, так и бактериальная, обладают высокой стабильностью против инактивации пероксидом водорода. Они намного

стабильнее, чем РвеФДГ дикого типа, и только самый лучший мутант РэеФДГ GASV может сравниться по стабильности с ФДГ растений. Также отметим, что растительные ФДГ, демонстрируя практически одинаковую стабильность против инактивации пероксидом водорода, отличаются по термостабильности более чем в 5000 раз. Самой высокой стабильностью при инактивации пероксидом водорода обладала ФДГ из патогенных бактерий S. aureus. БаиФДГ также характеризуется высокой термостабильностью. По этому параметру среди известных формиатдегидрогеназ она уступает только РэеФДГ.

Более высокая стабильность БаиФДГ при инактивации пероксидом водорода по сравнению с ФДГ растений очень хорошо согласуется с требованиями по стабильности этих

wt-SauFDH PseFDH С2 wt-SoyFDH wt-AraFDH wt-PseFDH

Рис. 17. Инактивации пероксидом водорода ФДГ из различных источников. wt-SauFDH, wt-PseFDH, wt-SoyFDH и wt-AraFDH - рекомбинантные ФДГ дикого типа из бактерий S. aureus и Pseudomonas sp.101, сои G.max и растений А. thaliana соответственно. PseFDH С2 - мутантная РэеФДГ GASV с заменами C145S/C255A. 0,15 М пероксид водорода, 0,1 М Ыа-фосфатный буфер, pH 7,0, 25°С.

ферментов при стрессовых воздействиях на организм in vivo. В случае растений величина и длительность таких воздействий, при которых клетка погибает, намного меньше по сравнению с теми стрессовыми условиями, при которых могут существовать биопленки S. aureus. Очевидно, что более высокая сопротивляемость стафилококков к стрессу должна быть обеспечена высокой стабильностью всех компонентов клетки (в том числе и формиатдегидрогеназы), отвечающих за выживание в стрессовых условиях.

ВЫВОДЫ

1. Проведено сравнительное исследование термостабильности формиатдегидрогеназы дикого типа из дрожжей Candida boidinii СЬоФДГ и мутантного фермента РэеФДГ GAV из бактерии Pseudomonas sp.101 при различных pH, концентрации буфера и температурах. Определены константы скорости инактивации и активационные параметры для процессов термоинактивации обоих ферментов Показано, что РэеФДГ GAV превосходит по стабильности СЬоФДГ во всем исследованном диапазоне pH и концентраций буфера.

2. Разработана высокочувствительная методика детекции нанограммовых количеств ФДГ на мембранах. Данная методика может быть использована для скрининга библиотек мутантных формиатдегидрогеназ.

3. В результате анализа структуры ФДГ из сои Glycine max ЭоуФДГ предложено провести замены по положениям 127, 267 и 290. Проведено компьютерное моделирование возможных замен, отобраны наиболее перспективные варианты и получено 10 мутантных БоуФДГ. Показано, что введенные аминокислотные замены приводят к увеличению термостабильности и(или) улучшению кинетических параметров. Достигнуты величины каталитической эффективности, которые минимум в два раза превосходят таковые для других известных формиатдегидрогеназ.

4. Проведен анализ структуры ФДГ из бактерии Pseudomonas sp.101 и получены мутантные РэеФДГ с заменами Cys145Ala и Cys145Ser и заменами остатка Cys354 на остатки Ala, Ser и Arg. Показано, что замены в 354-м положении не оказывают существенного влияния на каталитические свойства, но приводят к сильной дестабилизации фермента. Замена в 145 положении привела к улучшению константы Михаэлиса по формиату в два раза. Мутация Cys145Ala не влияет, а замена Cys145Ser увеличивает в два раза термостабильность фермента.

5. Разработан метод оценки химической стабильности формиатдегидрогеназ на основе изучения кинетики инактивации фермента пероксидом водорода. С помощью данного метода установлено, что остаток Cys354 не играет важной роли в химической стабильности РэеФДГ, в то время как двойная замена Cys145Ser/Cys255Ala повышает таковую по сравнению с ферментом дикого типа в 18 раз.

6. Изучена химическая стабильность рекомбинантных ФДГ дикого типа из растений A. thaliana, сои 6. max и бактерий S. aureus, синтез которых индуцируется при стрессовых воздействиях. Показано, что такие ферменты демонстрируют высокую устойчивость к инактивации пероксидом водорода, который образуется в клетке в условиях стресса.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи в журналах, индексируемых в международных базах данных Web of Science, PubMed и Scopus (входят в Перечень рецензируемых научных изданий ВАК РФ):

1. Alekseeva А.А., Serenko А.А., Kargov I.S., Savin S.S., Kleymenov S.Vu. and Tishkov V.I. Engineering catalytic properties and thermal stability of plant formate dehydrogenase by single-point mutations. Protein Engineering, Design and Selection, 2012, v.25, N11, p.781-788.

2. Алексеева A.A., Савин C.C., Клейменов С.Ю., Упоров И.В., Пометун Е.В., Тишков В.И. Стабилизация рекомбинантной формиатдегидрогеназы из сои Glycine max методом рационального дизайна. Биохимия, 2012, т.77, №10, с.1443-1456.

3. Алексеева А.А., Савин С.С., Тишков В.И. ЫАО*-зависимая формиатдегидрогеназа растений. Acta Naturae, 2011, т.З, №4(11), с.14-30.

4. Тишков В.И., Угланова С.В., Федорчук В. В., Савин С.С. Влияние ионной силы и рН среды на термостабильность дрожжевой формиатдегидрогеназы. Acta Naturae, 2010, т.2, №2(5), с.86-92.

5. Гончаренко К.В., Савин С.С., Тишков В.И. Определение нанограммовых количеств формиатдегидрогеназы на мембране. Вестник Московского Университета, Серия 2: Химия, 2010, т.51,№3, с.160-163.

6. Савин С.С., Тишков В.И. Инактивация пероксидом водорода как метод оценки стрессовой стабильности формиатдегидрогеназы in vivo. Acta Naturae, 2010, т.2, №1(4), c.80-84.

7. Тишков В.И., Савин С.С., Хороненкова С.В. Получение биокатализаторов с заданными свойствами. Известия Академии Наук. Серия Химическая, 2008, т.57, №5, с. 1014-1022.

8. Воинова Н.С., Савин С.С., Алексеева А.А., Скиргелло О.Е., Тишков В.И. Инактивация формиатдегидрогеназ при рН 8. Вестник Московского Университета, Серия 2: Химия, 2008, т.49, №2, с.77-80.

Другие публикации в журналах, индексируемых в базах данных Web of Science, PubMed и Scopus (входят в Перечень рецензируемых научных изданий ВАК РФ):

1. Tishkov, V.I., Savin, S.S. New generation of biocatalysts for NAD(P)H regeneration based on engineered bacterial formate dehydrogenase. Abstracts of 13th International Biotechnology Symposium. Journal of Biotechnology, 2008, V.136S, p.S358.

2. Tishkov V.I., Alekseeva A.A., Serov A.E., Kargov I.S., Skirgello O.E., Zarubina S.A., Kuranova I.P., Polyakov K.M., Popov V.O., Shabalin I.G., Savin S.S. Plant formate dehydrogenase: structure -function studies. Abstracts of 38th FEBS Congress. St.Petersburg, Russia, July 6-11, 2013. FEBS Journal, 2013, v.280, N S1, p.172.

3. Alekseeva A.A, Kargov I.S., Zarubina S.A., Savin S.S., Pometun E.V., Kleimenov S.Y., Tishkov V.I. Management of properties and stability of recombinant formate dehydrogenase from soya Glycine max by single-point mutation. Abstracts of 38th FEBS Congress. St.Petersburg, Russia, July 6-11, 2013. FEBS Journal, 2013, v.280, N SI, p.172-173.

Тезисы конференций:

1. Uglanova S.V., Savin S.S., Tishkov V.I. Characterisation of thermal stability of bacterial and yeast formate dehydrogenases at different pH and phosphate concentration. Congress Proceedings of the IV Moscow International Congress "Biotechnology: State of the Art and Prospects Development". Moscow, March 12-16, 2007, vol. 2, p.300.

2. Voinova N.S., Uglanova S.V., Savin S.S., Alexeeva A.A., Serov A.E., Sadykhov E.G. and Tishkov V.I. Media influence on thermal inactivation of formate dehydrogenases from bacteria, yeasts and plants. Abstracts of International Conference "Biocatalysis-2007. Fundamentals & Applications". Moscow-St.Petersburg, June 17-22, 2007, p.159.

3. Тишков В.И., Савин C.C. Синтез хиральных соединений с помощью оксидоредуктаз. Труды XVIII Менделеевского съезда, Москва, сентябрь 2007г., т.4, с.487.

4. Тишков В.И., Упоров И.В., Войнова Н.С., Савин С.С., Полозников А.А., Хушпульян Д.М., Хороненкова С. В. Инженерная энзимология оксидоредуктаз. Сборник трудов IV Съезда Российского общества биохимиков и молекулярных биологов. Новосибирск, май 2008г., с. 44.

5. Савин С.С., Войнова Н.С., Алексеева А.А., Тишков В.И. Экспрессия в E.coli и свойства формиатдегидрогеназ растений. Материалы VIII Международной конференции молодых ученых "Леса Евразии - Северный Кавказ", Москва-Сочи, октябрь 6-12, 2008, с.97-98.

6. Alexeeva А.А., Voinova N.S., Savin S.S., Shabalin I.G., Skirgello O.E., Polakov K.M., Popov V.O., Tishkov V.I. Plant recombinant formate dehydrogenases: preparation, stability and structure. Congress Proceedings of the Fifth Moscow International Congress "Biotechnology: State of the Art and Prospects Development". Moscow, March 16-20, 2009, vol. 2, p.311.

7. Tishkov V.I., Savin S.S. Protein Engineering of Oxidoreductases. Abstracts of International Conference "Biocatalysis-2009. Fundamentals & Applications", Arkhangelsk, June 19-24, 2009, p.14.

8. Tishkov V.I., Fedorchuk V.V., Savin S.S. Increase of formate dehydrogenase stability by rational design. Program and Abstract Book of the 8th International Conference on Protein Stabilisation (ProStab2009). Graz, Austria, April 14-17, 2009, p.72, P. 40.

9. Tishkov V.I., Savin S.S., Khoronenkova S.V. Universal platform for protein egineering. D-amino acid oxidase, formate dehydrogenase and peroxidase as examples. Abstracts of XIII International Conference "INPEC-2009" (International Network of Protein Engineering Centres). Ubatuba, State Sao Paolo, Brasil, October 25-28, 2009, p. 19.

10. Savin S.S., Fedorchuk V.V., Tishkov V.I. Input of different interactions in thermal stability of formate dehydrogenase. Program and Abstracts of International Conference "Thermostable Enzymes. Biodiversity, Molecular Biology and Biogeochemistry of Thermophiles". Petropavlovsk-Kamchatsky, Russia, August 12-18, 2010, p.38.

11. Савин C.C., Тишков В.И. Инактивация пероксидом водорода как метод оценки стабильности формиатдегидрогеназ in vivo при стрессе. Материалы X Международной конференции молодых ученых «Леса Евразии - Подмосковные вечера», Москва, 19-25 сентября, 2010г., с.220-221.

12. Savin S., Alekseeva A., Romanova Е., Goncharenko К. Tishkov V. Plant formate dehydrogenase: expression in E.coli, kinetic properties, stability and structural studies. Abstracts of XIV International Conference "INPEC-2010" (International Network of Protein Engineering Centres). Uppsala, Sweden, October 6-9, 2010. P.17.

13.Тишков В.И., Хороненкова С.В., Алексеева А.А., Гончаренко К.В., Серенко А.А., Комарова Н.В., Голубев И.В., Рыженкова К.В., Газарян И.Г., Хушпульян Д.М., Березин А.И., Степашкина А.В., Федорчук В.В., Федорчук Е.А., Чубарь Т.А., Савина Л.И., Савин С.С. Генно-инженерные ферменты для медицинской диагностики и фармацевтики. Материалы Шестого Московского международного конгресса "Биотехнология: состояние и перспективы развития", Москва, 21-25 марта 2011г., ч.1, с.37-38.

14. Тишков В.И., Савин С.С. Белковая инженерия ферментов. Тезисы ll-ой Международонй конференции «Физико-химическая биология», посвященной 85-летию академика Д.Г. Кнорре. Новосибирск, 25-29 июля 2011г., с.35.

15.Алексеева А.А., Серенко А.А., Савин С.С. Рекомбинантная растительная формиатдеги-дрогеназа: получение, свойства и практическое применение. XI Международная конференция молодых ученых «Леса Евразии - Брянский лес», Брянск, Россия, 12-18 сентября, 2011г., с.255-256.

16.Тишков, В., Савин С. Белковая инженерия ферментов для медицинской диагностики и фармацевтики. 2-я Международная школа «Наноматериалы и нанотехнологии в живых системах. Безопасность и наномедицина»: материалы конференции, Моск. обл., Россия, 19-24 сентября 2011 г. - М., 2011, с. 25-26.

17.Тишков В.И., Алексеева А.А., Серенко А.А., Гончаренко К.В., Серов А.Е., Федорчук В.В., Савина Л.И., Савин С.С. Синтез хиральных соединений с помощью оксидоредуктаз. Материалы XIX Менделеевского съезда по общей и прикладной химии. Волгоград, Россия, 25-30 сентября 2011г., т.1, с. 83.

18.Tishkov V., Alekseeva N., Komarova V., Savin S. Biocatalysis as solution of ecological problems in synthesis of chiral compounds. Abstract book of the V International Conference-Symposium "Ecological Chemistry ".Chishinau, Republic of Moldova, March 2-3, 2012, p. 138.

19. Alekseeva A., Goncharenko K., Kargov I., Savina L., Savin S., Tishkov V. Formate dehydrogenase from soya Glicine max: structure - function relationship and protein design. Abstracts of the 20th INPEC Conference "Engineering Protein - Systems, Functions and Applications", April 18-20, 2012, Taipei, Taiwan, p. 29.

20.Alekseeva A.A., Goncharenko K.V., Kargov I.S., Savin S.S., Kleimenov S.Yu., Pometun E.V. and Tishkov V.I. Rational design of thermal stability of plant formate dehydrogenase. Book of Abstracts of The 9th International Conference on Protein Stabilization - ProStab2012 "From Molecular Level to Market Applications". Lisbon, Portugal, May 2-4, 2012, P.16.

21. Savin S.S., Goncharenko K.V., Elovik N.A., Alekseeva A.A., Tishkov V.I. Formate dehydrogenase as target for drug and coenzyme regeneration. Programme & Abstracts of V International Meeting "Early events in Human Pathologies". Listvyanka, Baikal, Russia, July 9-12, 2012, p.32.

22. Stepashkina A.V., Alekseeva A.A., Savin S.S., Tishkov V.I. Improving of catalytic properties of plant formate dehydrogenase by rational design. Materials of the XII International conference of young scientists "Forests of Eurasia - Belarusian lake district (Belorusskoye Poozerie)" dedicated to 145th anniversary from the date of Prof. G.F. Morozov's birth. Braslav (Belorussia) and Ignalina (Lithuania), September, 30 - October, 6, 2012. - M.: MSFU, 2012, p. 348.

23.Тишков В.И., Алексеева А.А., Зарубина С.А., Каргов И.С., Степашкина А.В. Федорчук В.В., Федорчук Е.А., Захарова Г.С., Упоров И.В., Комарова Н.В., Полозников А.А., Савин С.С. Белковая инженерия ферментов для тонкого органического синтеза, фармацевтики и медицинской диагностики. Тезисы докладов VII Московского международного конгресса «Биотехнология: состояние и перспективы развития», Москва, 19-22 марта 2013 г., М: ЗАО "Экспо-биохим-технологии", РХТУ им. Д.И. Менделеева, ISSN 5-7237-0372-2, 2013, ч. II, с.139.

24.Alekseeva А.А., Savin S.S., Kargov I.S., Zarubina S.A., Kleimenov S.Yu., Pometun E.V., Tishkov V.I. Protein engineering of formate dehydrogenase: from bacteria to plants. Abstracts of 9th International Conference "Biocatalysis - 2013: Fundamentals & Applications". Moscow, July 2-5, 2013, p. 28.

Заявки на выдачу патента РФ на изобретение

1. Тишков В.И., Алексеева А.А., Савин С.С., Савина Л.И, Пометун Е.В., Труфманова Е.П. Мутантная растительная формиатдегидрогеназа (варианты). Заявка 2012141254 от 27.09.2012 на выдачу патента РФ на изобретение.

2. Тишков В.И., Алексеева А.А., Савин С.С., Савина Л.И., Каргов И.С. Мутантная формиатдегидрогеназа (варианты). Заявка 2012142250 от 05.10.2012 на выдачу патента РФ на изобретение.

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Савин, Святослав Сергеевич, Москва

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ НАУКИ ИНСТИТУТ БИОХИМИИ им. А.Н. БАХА РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК

На правах рукописи

04201360936

САВИН Святослав Сергеевич

НОВЫЕ БИОКАТАЛИЗАТОРЫ РЕГЕНЕРАЦИИ ^БН НА ОСНОВЕ ФОРМИАТДЕГИДРОГЕНАЗЫ

03.01.06 - биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: доктор химических наук, профессор В.И. Тишков

Москва-2013

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ................................................................................................................6

I. ВВЕДЕНИЕ.....................................................................................................................................7

II. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ...............................................................................................................10

2.1. Синтез оптически активных соединений с помощью

NAD(P)+-3aBHCHMbix дегидрогеназ....................................................................................10

2.1.1. Общие основы регенерации NAD(P)H.........................................................................10

2.1.2. Особенности ферментативной регенерации NAD(P)H..............................................18

2.1.3. Формиатдегидрогеназы, используемые для регенерации NAD(P)H.........................20

2.2. Общие сведения о формиатдегидрогеназе........................................................................22

2.2.1. Локализация, физиологическая роль и клонирование генов ФДГ............................22

2.2.1.1. Микроорганизмы.......................................................................................................22

2.2.1.2. Высшие растения.......................................................................................................30

2.2.1.1. Высшие эукариоты....................................................................................................33

2.2.2. Сравнительный анализ аминокислотных

последовательностей формиатдегидрогеназ...........................................................33

2.2.3. Пространственная структура формиатдегидрогеназ..................................................35

2.2.4. Кинетические свойства формиатдегидрогеназ............................................................38

2.2.5. Изучение и инженерия термостабильности формиатдегидрогеназ..........................38

2.2.5.1. Увеличение термостабильности РБеФДГ................................................................41

2.2.5.2. Увеличение термостабильности СЬоФДГ..............................................................42

2.2.6. Химическая стабильность формиатдегидрогеназ.......................................................44

2.2.6.1. Увеличение химической стабильности ФДГ из Pseudomonas sp. 101 и Mycobacterium vaccae N10.........................................................................................46

2.2.6.2. Увеличение химической стабильности ФДГ из C.boidinii......................................47

2.2.6.3. Методы оценки химической стабильности формиатдегидрогеназ........................48

III. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ....................................................................52

3.1. Материалы............................................................................................................................52

3.2. Методы исследования.........................................................................................................53

3.2.1. Электрофорез ДНК в агарозном геле...........................................................................53

3.2.2. Рестрикция фрагментов ДНК........................................................................................53

3.2.3. Выделение ДНК-фрагментов из агарозного геля........................................................53

3.2.4. Лигирование....................................................................................................................54

3.2.5. Трансформация клеток E.coli........................................................................................54

3.2.6. Выделение плазмидной ДНК........................................................................................55

3.2.7. Направленный мутагенез формиатдегидрогеназ с помощью ПЦР...........................55

3.2.8. Направленный мутагенез формиатдегидрогеназ методом Кункеля.........................57

3.2.9. Секвенирование ДНК.....................................................................................................57

3.2.10. Получение фазмидной ДНК в одноцепочечной форме для

проведения реакции направленного мутагенеза методом Кункеля......................57

3.2.11. Выделение фага-помощника М13К07.......................................................................58

3.2.12. Определение количества бляшкообразующих единиц фага....................................58

3.2.13. Экспрессия SoyFDH и ее мутантов в клетках E.coli.................................................59

3.2.14. Выделение и очистка SoyFDH....................................................................................60

3.2.15. Экспрессия PseFDH и ее мутантов в клетках E.coli..................................................61

3.2.16. Выделение и очистка РБеФДГ.....................................................................................62

3.2.17. Экспрессия СЬоФДГ в клетках Е.coli.........................................................................62

3.2.18. Выделение и очистка СЬоФДГ....................................................................................63

3.2.19. Белковый электрофорез в денатурирующих условиях.............................................63

3.2.20. Определение активности фермента............................................................................64

3.2.21. Определение констант Михаэлиса.............................................................................64

3.2.22. Титрование активных центров и расчет каталитических констант.........................64

3.2.23. Изучение термостабильности по кинетике инактивации.........................................65

3.2.24. Сравнение эффективность феназинметасульфата и

5-метилфеназинметасульфата...................................................................................65

3.2.25. Влияние концентрации тетранитротетразолия синего.............................................66

3.2.26. Проведение формиатдегидрогеназной реакции на мембранах................................66

3.2.27. Количественное определение фермента на мембранах............................................66

3.2.28. Анализ кристаллической структуры ФДГ и моделирование

трехмерной структуры мутантных ферментов........................................................66

3.2.29. Исследование инактивации рекомбинантных ФДГ

пероксидом водорода.................................................................................................67

IV. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.....................................................................................68

4.1. Исследование термостабильности формиатдегидрогеназ

СЬоФДГ и РэеФДГ GAV, применяемых на практике.....................................................68

4.1.1. Определение механизма термоинактивации

СЬоФДГ и РэеФДГ GAV............................................................................................68

4.1.2. Анализ температурной зависимости констант скорости инактиваци.......................72

4.1.1. Зависимость термостабильности РэеФДГ GAV и СЬоФДГ

от концентрации фосфат-иона..................................................................................76

4.1.4. Влияние формиат-иона на термостабильность СЬоФДГ...........................................82

4.2. Разработка методики определения нанограммовых количеств

формиатдегидрогеназы......................................................................................................86

4.2.1. Зависимость скорости реакции от концентрации субстратов....................................86

4.2.2. Спектральные характеристики системы детекции ФДГ............................................87

4.2.3. Сравнение эффективности медиаторов ФМС и 5-метил-ФМС.................................88

4.2.4. Определение оптимальной концентрации ТНТ..........................................................90

4.3.1. Количественное определение ФДГ на мембранах......................................................90

4.3. Белковая инженерия формиатдегидрогеназы сои.........................................................95

4.3.1. Выбор положений для направленного мутагенеза.....................................................95

4.3.2.Введение других замен для стабилизации БоуФДГ....................................................99

4.3.3. Получение мутантных БоуФДГ..................................................................................101

4.3.3.1. Введение мутаций в ген soyfdh..............................................................................101

4.3.3.2. Экспрессия мутантных ферментов........................................................................103

4.3.3.3. Очистка мутантных БоуФДГ..................................................................................103

4.3.4. Изучение кинетических свойств мутантных БоуФДГ..............................................106

4.3.4.1. Определение максимальной скорости и констант Михаэлиса...........................106

4.3.4.2. Определение каталитической константы..............................................................107

4.3.5. Температурная стабильность мутантных БоуФДГ...................................................110

4.4. Белковая инженерия формиатдегидрогеназы

бактерии Pseudomonas sp. 101.......................................................................................... 116

4.4.1. Компьютерный анализ структуры РзеФДГ...............................................................116

4.4.2. Введение мутаций в ген psefdh...................................................................................117

4.4.3. Получение мутантных РзеФДГ с заменами

по остаткам Cysl45 и Cys354..................................................................................118

4.4.4. Кинетические свойства мутантных по остаткам

цистеина РэеФДГ......................................................................................................119

4.4.4.1. Определение максимальной скорости и

констант Михаэлиса.................................................................................................119

4.4.4.2. Определение каталитической константы..............................................................119

4.4.5. Термостабильность мутантных по остаткам цистеина РзеФДГ..............................122

4.5. Исследование химической стабильности формиатдегидрогеназ...............................124

4.5.1. Разработка методики исследования химической

стабильности ФДГ по кинетике инактивации

пероксидом водорода...............................................................................................126

4.5.2. Инактивация пероксидом водорода мутантных

РэеФДГ с заменами остатков СуБ...........................................................................128

4.5.3. Сравнение химической стабильности ФДГ бактерий и растений...........................130

V. ВЫВОДЫ...................................................................................................................................133

VI. СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ................................................................135

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ФДГ - формиатдегидрогеназа

РэеФДГ - формиатдегидрогеназа из бактерий Pseudomonas sp. 101

БоуФДГ - формиатдегидрогеназа из сои Glycine max

АШФДГ - формиатдегидрогеназа из растения Arabidopsis thaliana

8аиФДГ - формиатдегидрогеназа из бактерий Staphylococcus aureus

NAD+ - никотинамидадениндинуклеотид, окисленный

NADH - никотинамидадениндинуклеотид, восстановленный

NADP+ - никотинамидадениндинуклеотидфосфат, окисленный

NADPH - никотинамидадениндинуклеотидфосфат, восстановленный

NaPB - натрий-фосфатный буфер

AS - сульфат аммония

АТФ - аденозинтрифосфорная кислота

БСА - бычий сывороточный альбумин

ДСК - дифференциальная сканирующая калориметрия

ИПТГ - изопропил-Р-Б-тиогалактопиранозид

ПЦР - полимеразная цепная реакция

РСА - рентгеноструктурный анализ

ТАК - теория активированного комплекса

ТЕМЕД - тетраметилэтилендиамин

Трис - трис(оксиметил)аминометан

DDS-Na - додецилсульфат натрия

ЭДТА - этилендиаминотетраацетат

I. ВВЕДЕНИЕ

Многие органические соединения содержат от одного до нескольких оптически активных (хиральных) центров, т.е. они могут существовать в виде двух и более энантиомеров. Как правило, полезной биологической активностью обладает только один из возможных энантиомеров, в то время как остальные могут оказывать сильный негативный эффект. Поэтому синтез оптически активных (хиральных) соединений является одним из наиболее активно развивающихся направлений современного органического синтеза. По данным ВСС Research LLC (http://www.bccresearch.com/report/chiral-products-technology-global-markets-bio012f.html) рынок хирального синтеза в 2011 году составлял 3,9 млрд., а в 2016 году составит 5,7 млрд. долларов США. Очень немногие процессы классического химического ассиметрического синтеза позволяют получать оптически активные соединения такой степени чистоты. Поэтому безусловным выбором при разработке новых процессов хирального синтеза является использование ферментов. По сравнению с классическими процессами химического ассиметрического синтеза биокаталитические процессы помимо высокой стереоселективности характеризуются более высокой региоселективностью и общей специфичностью, в результате чего практически не образуются побочные продукты. Кроме того, биокаталитические процессы, как правило, проводятся в водных растворах при нормальных условиях, в то время как химические процессы требуют органических растворителей, повышенной температуры и др.

Существует два принципиальных подхода биокаталитического получения оптически активных соединений - разделение рацемата на энантиомеры и ассиметрический синтез. В случае первого процесса выход целевого продукта не может быть больше 50%, а при ассиметрическом синтезе выход составляет до 100%. Поэтому доля последнего подхода в общем объеме синтеза хиральных соединений неуклонно растет из года в год.

формиатдегидрогеназа (ФДГ, КФ 1.2.1.2). В настоящее время самый крупнотоннажный процесс хирального синтеза с использованием индивидуальных ферментов - получение tert-L-лейцина, включает регенерацию восстановленного кофермента с помощью ФДГ из дрожжей Candida boidinii (реализован фирмой Degussa в конце 90-х годов прошлого века) [1].

Формиатдегидрогеназы, используемые для регенерации NADH, состоят из двух идентичных субъединиц и не содержат кофакторов или простетических групп. Они широко распространены в природе. В метанолутилизирующих микроорганизмах синтез ФДГ индуцируется при росте на метаноле [2], в патогенах - при росте в виде биопленок [3;4]. В растениях ФДГ находится не в цитоплазме, а в митохондриях. При стрессовых воздействиях содержание этого фермента достигает 9% от всех митохондриальных белков [5;6]. Кроме важной физиологической роли ФДГ также представляет большой интерес в плане изучения действия этого фермента. ФДГ принадлежит к суперсемейству D-специфичных дегидрогеназ 2-оксикислот [7]. Субстрат формиатдегидрогеназы -формиат-ион, является одним из самых простых по структуре среди ферментов данного суперсемейства. Кроме того, в каталитическом цикле ФДГ отсутствуют стадии кислотно-основного катализа. Именно поэтому формиатдегидрогеназа рассматривается как модельный фермент для всего суперсемейства D-специфичных дегидрогеназ 2-оксикислот. широко распространены в природе и играют важную физиологическую роль в различных организмах, включая патогены, вызывающие туляремию, легионеллез и др. [8].

является величина каталитической константы кш. В случае использования низких концентраций субстрата главную роль играет не величина kcah а каталитическая эффективность - отношение каталитической константы к константе Михаэлиса кса, / Км. Поскольку самая высокая величина кса, у бактериальных ФДГ, то для биокатализатора регенерации NADH первого типа несомненным лидером является РзеФДГ GAV, которая также превосходит все известные ФДГ по термостабильности [22]]. Однако у этого фермента можно дополнительно повысить операционную (химическую) стабильность за счет замен остатков цистеина [24;25]. В случае биокатализатора второго типа наиболее перспективной является рекомбинантная ФДГ из сои Glycine max (БоуФДГ), которая имеет самые низкие значения Км среди всех описанных в литературе ФДГ [26].

Данная работа посвящена решению важных и актуальных проблем современной биотехнологии - созданию новых биокатализаторов регенерации NADH для применения в процессах хирального синтеза. Целью данной работы было проведение систематических исследований формиатдегидрогеназ из различных источников и создание на основе полученных данных новых биокатализаторов регенерации NADH с улучшенными свойствами.

II. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

2.1. Синтез оптически активных соединений с помощью NAD(P)+-зaвиcимыx дегидрогеназ

2.1.1. Общие основы регенерации NAD(P)H

Характерной особенностью нашего мира является возможность существования органических соединений в виде двух стереоизомеров, являющихся зеркальными отражениями друг друга (рис. 2.1). Наличие стереоизомеров обусловлено тем, что атом углерода имеет четыре валентности и при наличии четырех разных заместителей и возникает возможность существования двух стабильных альтернативных пространственных конфигураций. Такой атом углерода называют хиральным и, в зависимости от количества таких

Информация о работе

Савин, Святослав Сергеевич
кандидата биологических наук
Москва, 2013
ВАК 03.01.06

Диссертация

Новые биокатализаторы регенерации NADH на основе формиатдегидрогеназы - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы