Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Получение, термостабильность и структурные исследования формиатдегидрогеназ из различных источников

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Получение, термостабильность и структурные исследования формиатдегидрогеназ из различных источников"

На правах рукописи

ч

САДЫХОВ Эльчин Гусейнгулу оглы

ПОЛУЧЕНИЕ, ТЕРМОСТАБИЛЬНОСТЬ И СТРУКТУРНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ ФОРМИАТДЕГИДРОГЕНАЗ ИЗ РАЗЛИЧНЫХ ИСТОЧНИКОВ

Специальность 03 00 04 - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва 2007

003071293

Работа выполнена в лаборатории инженерной энзимологии Института биохимии им А Н Баха РАН

Научные руководители

Официальные оппоненты

Ведущая организация

доктор химических наук, профессор В О Попов

доктор химических наук, профессор В И Тишков

доктор химических наук, член-корреспондент РАН

А Г Габибов доктор химических наук, профессор А П Савицкий

Институт молекулярной биологии им В А Энгельгардта РАН

Защита диссертации состоится «29» мая 2007 г в «11 00» часов на заседании диссертационного совета К 002 247 01 по присуждению ученой степени кандидата наук в Институте биохимии им А Н Баха РАН по адресу 119071, Москва, Ленинский проспект, 33, корп 2

С диссертацией можно ознакомиться в Библиотеке биологической литературы по адресу 119071, Москва, Ленинский проспект, 33, корп 1

Автореферат разослан «28» апреля 2007 г

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

А Ф Орловский

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы NAD^-зависимые формиатдегидрогеназы (КФ 12 12), окисляющие формиат-ион до углекислого газа, представляют собой несколько групп ферментов, отличающихся как по четвертичной структуре, так и по наличию (или отсутствию) простетических групп и кофакторов Среди большого разнообразия формиатдегидрогеназ наиболее простым по структуре и составу является фермент, состоящий из двух идентичных субъединиц и не содержащий в активном центре ни ионов металлов, ни простетических групп (ФДГ)

Формиатдегидрогеназа данного типа представляет большой интерес с точки зрения фундаментальной науки, поскольку этот фермент принадлежит к большому суперсемейству D-специфичных дегидрогеназ 2-гидроксикислот Субстрат ФДГ -формиат-ион является самым простым по структуре среди субстратов для всех ферментов данного суперсемейства, и в механизме действия ФДГ отсутствуют стадии кислотно-основного катализа переноса протона Сравнение структуры ФДГ со структурами дегидрогеназ из семейства D-специфичных дегидрогеназ 2-гидроксикислот показало исключительно высокую пространственную гомологию (в среднем около 80-90%) при очень низком значении степени гомологии на уровне аминокислотных последовательностей (менее 30%) Поэтому формиатдегидрогеназа данного типа рассматривается как модельный фермент для выяснения механизма переноса гидрид-иона в активном центре дегидрогеназ

Этот фермент широко распространен в метанол-утилизирующих микроорганизмах и играет важную роль в снабжении клетки энергией при окислении метанола до С02 с помощью полиферментной системы - метанолдегидрогеназа, формальдегиддегидрогеназа и формиатдегидрогеназа Наиболее изученными у метилотрофных микроорганизмов являются ФДГ из бактерий Pseudomonas sp 101 (РзеФДГ) и дрожжей Candida boidinn (СЬоФДГ) Эти ферменты используются в качестве универсального биокатализатора регенерации NAD(P)H в процессах синтеза оптически активных соединений с помощью дегидрогеназ В нашей лаборатории для обоих ферментов были созданы рекомбинантные штаммы Е coli, обеспечивающие выход до 3-5 граммов целевого продукта с литра среды Несмотря на получение различных мутантов РэеФДГ и СЬоФДГ с улучшенными свойствами, проблема получения новых мутантов и их физико-химическая характеристика (в первую очередь изучение стабильности и механизма инактивации в различных условиях) является одним из основных условий успешного применения биокатализаторов на практике До наших исследований в литературе отсутствовали систематические данные по химической, операционной и температурной стабильности ФДГ в зависимости от различных факторов

Формиатдегидрогеназы также ранее были найдены в семенах фасоли, гороха и сои Секвенирование геномов различных растений, выполненное в последнее десятилетие, показало, что этот фермент присутствует во всех высших растениях и

мхах На примере картофеля (а позднее для ячменя и Arabidopsis thahana), было показано, что ФДГ расположена в митохондриях и является белком стресса В условиях стрессовых воздействий содержание ФДГ достигает до 9% от общего количества митохондриальных белков' Основным сдерживающим фактором изучения растительных ФДГ был низкий выход фермента, кроме того, его свойства сильно зависели от метода выделения Несмотря на то, что были получены трансгенные растения А thaliana, тем не менее, так и не удалось наладить получение ФДГ в больших количествах Все описанные в литературе попытки экспрессии растительных ФДГ в клетках Е coli были неудачными, поскольку фермент синтезировался в нерастворимой и неактивной форме в виде телец включения Получение ФДГ из растений в больших количествах (десятки и сотни миллиграмм) также очень важно для получения кристаллов этих ферментов К моменту начала нашей работы в банке трехмерных структур белков PDB имелось только две структуры для апо- и холо-форм РэеФДГ Поэтому получение, изучение свойств и определение трехмерной структуры растительных ФДГ является исключительно актуальной научной задачей

В работе в качестве объектов исследования были использованы реком-бинантные ФДГ из бактерий Pseudomonas sp 101 (РэеФДГ) и Moraxella sp С-1 (МогФДГ), метилотрофных дрожжей С boidinn (СЬоФДГ) и пекарских дрожжей Saccharomyces cerevisiae (ЗсеФДГ) и растений А thaliana (АгаФДГ) и сои Glycine тах (в1уФДГ) Гены РэеФДГ, СЬоФДГ и ЭсеФДГ были клонированы в нашей лаборатории, ген МогФДГ был клонирован нами совместно с профессором К Асано из Университета префектуры Тояма и проф Н Есаки из Университета Киото (Япония) Плазмиды с полноразмерными генами АгаФДГ и С1уФДГ (включая сигнальные последовательности для транспорта в митохондрии) были любезно предоставлены проф Марквелом из Университета штата Небраска (Линкольн, США) и проф Н Лабру из Сельскохозяйственного Университета Афин (Греция) соответственно

Цель работы Целью данной работы являлось получение рекомбинантных растительных формиатдегидрогеназ и комплексное изучение структуры и термостабильности ФДГ из бактерий (РэеФДГ, МогФДГ), дрожжей (СЬоФДГ, ЭсеФДГ) и растений (АгаФДГ, С!уФДГ) Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи

1) Разработка метода экспрессии растительных ФДГ в клетках Е coli с целью получения активных растворимых ферментов в препаративных количествах для дальнейшей кристаллизации и изучения термостабильности,

2) Изучение кинетических свойств рекомбинантных растительных ФДГ,

3) Комплексное изучение термостабильности исследуемых ферментов с помощью дифференциальной сканирующей калориметрии (ДСК), анализа изменения спектров кругового дихроизма (КД), кинетики термоинактивации Выявление факторов, влияющих на термостабильность ФДГ,

4) Наработка больших количеств ферментов для кристаллизации Анализ полученных трехмерных кристаллических структур

Научная новизна

1) Впервые произведена успешная экспрессия растительных ФДГ из A thaliana и G max в клетках Е coli в активной растворимой форме,

2) Произведено систематическое исследование термостабильности ФДГ из 6 различных источников при разных значениях pH и состава среды с помощью различных подходов 1) изучение кинетики термоинактивации, 2) исследование спектров кругового дихроизма и 3) анализ кривых плавления с помощью дифференциальной сканирующей калориметрии Все три подхода дали аналогичные результаты Показано, что термостабильность каждого из 6 изученных ферментов имеет сугубо индивидуальный характер и в зависимости от температуры, pH и состава среды различия в стабильности могут составлять два и более порядков

3) С использованием высокоэффективной системы экспрессии отлажена методика получения больших количеств ФДГ для последующей кристаллизации Получены новые трехмерные кристаллические структуры различных форм ФДГ из Pseudomonas sp 101, Moraxella sp C-1 и A thaliana

Практическая значимость работы

1) Данные, полученные при комплексном изучении термостабильности ФДГ из различных источников, позволяют оптимизировать промышленное применение этих ферментов путем подбора подходящего фермента для использования в конкретных условиях,

2) Более низкие по сравнению с другими ФДГ значения констант Михаэлиса ФДГ из G max по NAD* и формиату делают этот фермент очень перспективным для регенерации NAD(P)H в процессах тонкого органического синтеза хиральных соединений

Апробация работы Результаты работы были представлены на III Moscow International Congress «Biotechnology State of the Art and Prospects Development», (Moscow, Russian Federation, 2005), Международной конференции «Biocatalysis -2005 fundamentals and applications» (St Petersburg, Russian Federation, 2005), Международной конференции молодых ученых по фундаментальным наукам «ЛОМОНОСОВ-2005» (Москва, 2005), 7th International Symposium on Biocatalysis and Biotransformations (Delft, The Netherlands, 2005)

Публикации По материалам работы опубликовано 4 статьи и 6 тезисов докладов

Структура диссертационной работы Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы Работа изложена на 112 страницах Список цитируемой литературы включает наименовании

Иллюстративный материал содержит ЗЙ рисунков и 1 В таблиц

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Экспрессия формиатдегидрогеназ из Arabidopsis thaliana и Glycine max в клетках Е coli

Одной из причин неудач предыдущих экспериментов по экспрессии генов растительных формиатдегидрогеназ могло быть наличие на N-конце сигнального пептида Эти сигнальные пептиды отщепляются после транспорта ФДГ в митохондрии Чтобы получить ферменты, имеющие такие же свойства, что и природные, нами в последовательностях генов АгаФДГ и Gly<t>flr были удалены участки, кодирующие сигнальные пептиды На рисунке 1 представлены N-концевые участки аминокислотных последовательностей полноразмерных и укороченных генов АгаФДГ и в1уФДГ Для сравнения приведены N-концевые участки полноразмерных последовательностей ФДГ из картофеля (PotFDH) и бактериальной

РэеФДГ

РоЬФДГ ............SRVASTAARAITSPSSLVFTRELQASPG-PKK1VGVFYKANEYA

АгаФДГ .......MAMRQAAKATIRACSSSSSSGYFARRQFNASSGDSKKIVGVFYKAMEYA

г АгаФДГ ................................MQFNASSGDSKKIVGVFYKANEYA

С1уФДГ . MSDPTLAQQHLVKVHTTTHETWTTHNHMQTPSINAS - GEKKKXVGVFYKGNEYA

гС1уФДГ ................................MSINAS-GEKKKIVGVFYKGNEYA

РэеФДГ .........................................MAKVLCVLYDDPVDG

Рис 1 N-концевые последовательности полноразмерных и укороченных генов АгаФДГ и GlyOflr, ФДГ из картофеля (РоЮДГ) и бактерий Pseudomonas sp 101 (РзеФДГ) В последовательности РйФДГ курсивом выделен отщепляемый сигнальный пептид

Удаление сигнальных последовательностей проводили с помощью полимеразной цепной реакции и специально сконструированных праймеров При этом в прямой праймер был введен сайт рестрикции Ndel, а в обратный - EcoRI, которые были использованы для клонирования полученных фрагментов ПЦР в вектор рЕТ23а, в котором из полилинкера дополнительно был удален ряд сайтов рестрикции Эти новые плазмиды для экспрессии АгаФДГ и в!уФДГ получили название plAraFDH и pIGlyFDH Клонирование генов ФДГ было выполнено в нашей лаборатории к х н А Е Серовым, все дальнейшие эксперименты по оптимизации экспрессии и выделению ферментов проводились лично диссертантом Для экспрессии был выбран штамм Е coli BL21(DE3) CodonPlus Характерной особенностью этого штамма является дополнительная экспрессия тРНК для редких в прокариотах кодонов AGA, AGG и ССС, которые имеются в обоих генах зкспрессируемых эукариотических ФДГ

Нами была проведена оптимизация условий культивирования обоих штаммов - продуцентов АгаФДГ и С1уФДГ (температура, состав среды, время и тип индуктора, аэрация и т д) При оптимальных условиях в случае АгаФДГ доля целевого фермента от общего количества растворимых белков Е coli составляла 20-25%, а для С1уФДГ - 7-10% При завершении культивирования активность ферментов составляла 5000 и 1000 Ед/л культуральной среды для АгаФДГ и С1уФДГ

соответственно В пересчете на удельную активность ферментов выход АгаФДГ и GlyOflr составил 850 и 170 мг с литра среды соответственно Очистку растительных ФДГ проводили по методике, ранее разработанной для фермента из Pseudomonas sp 101 Выход целевого фермента в случае АгаФДГ составил 62%, а в случае GlyOflr - 43% По данным аналитического электрофореза в присутствии додецилсульфата натрия чистота образцов ферментов составляла не менее 95%

Экспрессия формиатдегидрогеназ из Pseudomonas sp 101, Moraxella sp C-1, Candida boidinu и Saccharomyces cerevisiae в клетках E coli

Для экспрессии формиатдегидрогеназ из других источников (Pseudomonas sp 101, Moraxella spC-1, Cboidinn, S cerevisiae), изученных в этой работе, были использованы созданные ранее в нашей лаборатории генно-инженерные конструкции Методика экспрессии использовалась та же, что и в случае растительных ФДГ Единственным отличием являлась температура - более стабильные бактериальные РзеФДГ и МогФДГ были экспрессированы при 30 °С, а дрожжевые ферменты СЬоФДГ, БсеФДГ - при 25 °С Все выделенные препараты ферментов имели чистоту не менее 95% Выход ферментов по активности после очистки составлял не менее 60%

Изучение кинетических свойств рекомбинантных формиатдегидрогеназ из Arabidopsis thaliana и Glycine max

В таблице 1 приведены кинетические параметры выделенных нами растительных ферментов в сравнении с бактериальной РэеФДГ Из полученных данных можно сделать несколько выводов 1) pH среды в диапазоне 6,0 - 8,0 не влияет на значения Кт ферментов по обоим субстратам для в1уФДГ и РэеФДГ В случае АгаФДГ зависимость Кт по обоим субстратам имеет небольшой минимум при pH 7,0 Ферментативная активность в данном диапазоне pH также практически не изменяется, 2) АгаФДГ при pH 7,0 близка по своим кинетическим характеристикам к РвеФДГ значения Km по NAD+ у этих ферментов совпадают (65 мкМ), а Кт по формиату (3,7 мМ) меньше в 2 раза для фермента из А thaliana, 3) из сравнения данных, полученных для фермента из G max со значениями кинетических параметров АгаФДГ и РэеФДГ, следует, что С1уФДГ имеет гораздо более низкие значения Кт по коферменту и формиату значения по NAD+ - 17,4 мкМ и по формиату - 1,26 мМ, что меньше в 4 и 6 раз аналогичных значений для РэеФДГ Такие низкие значения Кт С1уФДГ по обоим субстратам, и особенно по NAD+, делают этот фермент весьма перспективным для регенерации NAD(P)H в процессах синтеза оптически активных соединений с помощью дегидрогеназ В настоящий момент практическому применению в1уФДГ препятствуют ее более низкая удельная активность по сравнению с РэеФДГ и низкая стабильность (см ниже)

Таблица 1

Кинетические свойства рекомбинантных формиатдегидрогеназ из бактерий Pseudomonas sp 101 и растений А thaliana и сои Glycine тах при различных pH (0,1 М НФБ, pH 7,0, 30 °С)

Параметр pH 6,0 pH 7,0 pH 8,0

ФДГ из Glycine max

Уд активность, Ед/мг 6,4 ± 0,3 6,2 ±0,3 6,1 ±0,2

Ктт°\ мкМ 15,4 + 0,7 17,4 ± 1,6 18,8 ±0,7

Ктнсо° , мМ 1,37 ±0,07 1,26 ±0,10 1,57 ±0,07

ФДГ из Arabidopsis thaliana

Уд активность, Ед/мг 6,8 ±0,3 6,5 ±0,3 7,8 ± 0,4

Ктт°\ мкМ 95 ±6 65 ±3 81 ±4

Ктнсо°, мМ 4,2 ± 0,2 3,7 ±0,2 4,5 ±0,2

ФДГ из Pseudomonas sp 101

Уд активность, Ед/мг 10,3±0,9 10,0±0,7 9,8±0,7

/C,NAD\ мкМ 68 ±3 65 ±2 72 ±4

Ктисо°, мМ 6,3 ± 0,2 8,0 ±0,4 9,1 ±0,4

Таблица 2

Коферментная специфичность формиатдегидрогеназ из бактерий Pseudomonas sp 101 и растений A thaliana и сои Glycine max (0,1 М НФБ, pH 7,0, 30 °С)

Фермент Удельная активность с NAD*, Ед/мг и- NAD+ > мкМ Удельная активность с NADP\ Ед/мг „ NADP+ "m 1 мМ ¡.тОР* / i,NAD* "с at / cat IfNADP* / и-NAD*

РэеФДГ 10,0 + 0,7 60 ±5 н/д >200 4,2x10"

АгаФДГ 6,5 ±0,3 65 ±3 0,05 ± 0,002 10 ± 2 5,0x105

ауФДГ 6,2 ±0,3 17,4 ±1,6 0,31 ± 0,02 1,00 ±0,05 8,7x104

В таблице 2 представлены данные по коферментной специфичности бактериальной и растительных ФДГ Все три фермента гораздо более эффективно (как минимум в 1000 раз) катализируют реакцию с участием NAD* по сравнению с NADP+ Из таблицы 2 также видно, что эффективность С!уФДГ с NADP+ существенно выше, чем таковая у РэеФДГ и тем более у АгаФДГ Например, константа Михаэлиса по NADP+ у С1уФДГ более, чем в 200 раз меньше, чем у РэеФДГ Такие кинетические свойства С1уФДГ позволяют предположить, что при изменении коферментной специфичности этого фермента с NAD+ на NADP+ удастся получить биокатализатор с гораздо с более высокими кинетическими параметрами, чем в случае РэеФДГ

Зависимость активности фермента от температуры описывается уравнением теории активированного комплекса (см ниже), что свидетельствует о том, что в диапазоне температур 16 - 46 "С в кинетическом механизме не происходит смены лимитирующей стадии Величины Alf для АгаФДГ и С1уФДГ составили (54,5 ± 0,6) и (43,2 ± 0,6) кДж/моль соответственно, что меньше таковой для РвеФДГ (59,8 ± 0,5)

Это означает, что наибольшее увеличение активности при росте температуры наблюдается в случае РэеФДГ, а наименьшее - 01уФДГ

Изучение кинетики термоинактивации формиатдегидрогеназ из различных источников

Термостабильность фермента является одним из важнейших параметров, определяющих возможность его практического применения В литературе имеется большое количество способов представления данных о стабильности, но наиболее объективным является исследование кинетики термоинактивации, поскольку только такие данные позволяют точно прогнозировать стабильность фермента через любой промежуток времени Вторым важным моментом при исследовании термостабильности является проведение таких экспериментов в широком диапазоне условий (рН среды, состав среды, присутствие субстратов и продуктов реакции) До проведения настоящих исследований такие систематические исследования были выполнены только для РэеФДГ и БсеФДГ В данной работе была подробно изучена кинетика термоинактивации еще трех ферментов АгаФДГ, 01уФДГ и СЬоФДГ Все эксперименты проводились однотипно Поэтому мы их продемонстрируем на примере АгаФДГ

Рис 2 а) Зависимость остаточной активности АгаФДГ от времени (1) 53°С, (2) 55°С, (3) 57°С, (4) 59°С, (5) 61 °С (0,1 М НФБ, рН 7,0), б) Зависимость натурального логарифма остаточной активности АгаФДГ от времени (1) 53°С, (2) 55°С, (3) 57°С, (4) 59°С, (5) 6ГС

Зависимости остаточной активности АгаФДГ от времени при температурах 5161 °С представляют собой экспоненты (рис 2а), которые линеаризуются в полулогарифмических координатах (рис 26), причем тангенс угла наклона прямых (т е величина константы скорости инактивации первого порядка) не зависит от концентрации фермента Полученные данные свидетельствуют, что инактивация АгаФДГ является необратимым мономолекулярным процессом Для описания такого процесса может быть использовано уравнение теории активированного комплекса

i h П RT

AS* AH*

к T

--2-е R e RT

h 6

где kB и h - постоянные Больцмана и Планка, соответственно, R - универсальная газовая постоянная Это уравнение можно привести к линейному виду

, { к Л , ( к„ Л Д S* АН* АН* \ 1п —— = ]п -2- +---= const -

,Т J \ h ) R RT R Т

Из тангенса угла наклона определяется величина Alf, а величину AS* находят из зависимости

AG* = АН* -TAS*

Таблица 3

Термодинамические активационные параметры процесса термоинактивации ФДГ из различных источников (0,1 М НФБ, рН 7,0)

Источник ФДГ Alf, кДж/моль AS\ Дж/моль*К

Pseudomonas sp 101 (Рожкова А М, 1999) 540 ± 20 1320 ±40

Saccharomyces cerevisiae (Серов А Е, 2002) 420 ± 40 н/д

Candida boidmii 480 ± 30 1250+ 80

Arabidopsis thaliana 490 ± 30 1200 ±70

Glycine max 310 ± 20 680 ± 55

Данные таблицы 3 свидетельствуют, что термостабильность ферментов коррелирует с величинами активационных параметров - чем выше их значения, тем выше термостабильность

Следующим этапом нашей работы было изучение влияния на

Рис 3 а) Зависимость константы скорости инактивации (к,) АгаФДГ от концентрации фосфатного буфера (1)рН6,0, (2) рН 8,0, (3) рН 7,0, б) Зависимость натурального логарифма константы скорости инактивации (1п(к,)) АгаФДГ от концентрации фосфатного буфера (1) рН 6,0, (2) рН 8,0, (3) рН 7,0

качестве примера приведем результаты по определению констант скорости инактивации АгаФДГ в растворах фосфатного буфера с различной концентрацией при рН 6,0, 7,0 и 8,0 Полученные данные представлены на рисунке 3

Поскольку при разных значениях рН наблюдается сильное изменение величин к,, для удобства были построены графики этих зависимостей в координатах 1п(/<,)-[фосфат] (рис 36)

Анализ зависимостей на рисунке 3 свидетельствует, что термостабильность фермента сильно зависит от концентрации буфера и имеет колоколообразный вид Сначала при увеличении концентрации буфера константа скорости инактивации увеличивается Это может быть связано с разрушением электростатических взаимодействий на поверхности белковой глобулы при увеличении ионной силы Дальнейшее повышение ионной силы приводит к усилению гидрофобных взаимодействий и, как следствие, к повышению термостабильности Из рисунка 3 также следует, что стабильности АгаФДГ при рН 7,0 и 8,0 очень близки, в то время как снижение рН до 6,0 вызывает увеличение константы скорости термоинактивации более, чем в 10 раз В случае С1уФДГ стабильность фермента при рН 6,0 выше, чем, при рН 7,0 (не показано)

Для более детального исследования механизма инактивации АгаФДГ были изучены температурные зависимости константы скорости инактивации при тех значениях концентраций фосфатного буфера, когда величина константы скорости инактивации имеет максимальное, промежуточное и минимальное значение, которые для каждого значения рН были немного разными (рис 4) Из полученных зависимостей были рассчитаны АН' и дУ для всех значений рН и концентраций фосфатного буфера (табл 4)

2 985 3 000 3 015 3 030 3 045 1/Т, Ю^К'

Рис 4 Зависимость констант скорости инактивации АгаФДГ от температуры в координатах 1п(/с, /Т) — 1 /Т при различных концентрациях буфера и значениях рН а) рН 6,0 -[фосфат] (1) 0,3 М, (2) 0,7 М, (3) 1,2 М, б) рН 7,0 — [фосфат] (1)0,04М, (2) 0,4 М, (3) 0,8 М, в) рН 8,0-[фосфат] (1)0,1 М, (2) 0,4 М, (3)0,8 М

Таблица 4

Значения активационных параметров процесса термоинактивации ФДГ из А ¡ЬаЬапа при различных значениях рН и концентрациях фосфатного буфера

рН [фосфат], М АН\ кДж/моль А?*, Дж/моль*К

6,0 0,3 340 ± 50 820 + 100

0,7 360 ± 20 780 ± 60

1,2 273 ± 40 840±120

7,0 0,04 490 ± 30 1200 ±70

0,4 610 ±30 1500± 100

0,8 660 ± 60 1600±100

8,0 0,1 450 ±40 1050±120

0,4 490 ± 50 1150 ±150

0,8 670 ± 60 1700±170

Данные таблицы 4 подтверждают сложную природу регулирования стабильности белковой глобулы В зависимости от условий наблюдается разный ход температурных зависимостей константы скорости инактивации и разный характер изменения активационных параметров Полученные данные также подтверждают необходимость систематического исследования термостабильности фермента для его эффективного применения на практике

Изучение термостабильности формиатдегидрогеназ из различных источников с помощью дифференциальной сканирующей калориметрии

Температурная стабильность ферментов также может быть охарактеризована с помощью метода дифференциальной сканирующей калориметрии (ДСК) Этот метод позволяет количественно определить термодинамические параметры теплового перехода между нативным и денатурированным состояниями белковой глобулы, а также выявить существование в процессе тепловой денатурации различных промежуточных форм ферментов

В литературе нет данных по изучению термостабильности формиатдегидрогеназ с применением дифференциальной сканирующей калориметрии Поэтому, чтобы максимально расширить область исследования, мы выбрали в качестве объектов - ФДГ из различных типов организмов, в которых были обнаружены эти ферменты С помощью ДСК нами была изучена тепловая денатурация бактериальных РэеФДГ и МогФДГ, дрожжевых СЬоФДГ и БсеФДГ, растительных АгаФДГ и С1уФДГ Кроме того, нами также была изучена термоденатурация мутантных РэеФДГСАУ и РзеФДГТ7, содержащих соответственно три и семь аминокислотных замен и обладающих повышенной термостабильностью по отношению к ферменту дикого типа

Рассмотрим на примере РэеФДГ GAV общую стратегию по изучению термостабильности с помощью ДСК Типичный набор экспериментов включал в себя изучение характера кривых плавления ФДГ в зависимости от 1) концентрации фермента, 2) скорости прогрева, 3) ионной силы раствора, 4) концентрации кофактора NAD+ и ингибитора N3 После первого полного прогрева препарата фермента для контроля обратимости процесса денатурации проводился повторный прогрев образца Во всех случаях кривая повторного отжига не содержала пика поглощения теплоты, соответствующего фазовому переходу фермента в денатурированное состояние (рис 5а)

Рис 5 а) Кривые плавления РвеФДГ СА\/ (1) первый прогрев, (2) повторный прогрев после охлаждения, б) Кривые плавления РэеФДГСАХ/ (1) полный прогрев,(2) первый неполный прогрев до 65,8°С, (3) второй полный прогрев после неполного первого (СфеРМ 1 мг/мл, скорость прогрева 1°С/мин, 0,1 М НФБ, 5 мМ ЭДТА, рН 7,0)

Был проведен дополнительный эксперимент, в котором препарат фермента прогрели до температуры, соответствующей 40% высоты пика теплового перехода, (рис 56, кривая 2) и после охлаждения был проведен повторный прогрев (рис 56, кривая 3) При сравнении со стандартной кривой плавления, полученной в тех же условиях для другого препарата этого фермента (рис 56, кривая 1), видно, что высота и площадь пика после повторного прогрева уменьшились, что соответствует снижению концентрации фермента вследствие денатурации Эти экспериментальные данные свидетельствуют о том, что тепловая денатурация является необратимой Такой характер кривых плавления наблюдался для всех исследуемых ферментов, кроме ФДГ из Э сегечмае

На рисунке 6а изображены кривые плавления РэеФДГСА\/ при различных концентрациях этого фермента Видно, что температура теплового перехода не зависит от концентрации, а при нормировке кривых плавления на концентрацию фермента (рис 66), получается, что энтальпия теплового перехода также остается

Т =68,8°С

- / \ «б» X

п.-ж

- а> .-{¿У I ^(1)

........ I

55

400

60

65

70

75

75 80

Г, "С т,°с

Рис 6 Кривые плавления РзеФДГ ЭА\/ при различных концентрациях фермента а) ненормализованные (1) 0,25 мг/мл, (2) 0,5 мг/мл, (3)1,0мг/мл, (4)1,5мг/мл, (5) 2,0 мг/мл, (6) 2,5 мг/мл, (7) 3,0 мг/мл, б) нормализованные (1) 0,25 мг/мл, (2) 0,5 мг/мл, (3)1,0 мг/мл, (4) 1,5 мг/мл, (5) 2,0 мг/мл, (6)2,5 мг/мл, (7) 3,0 мг/мл (скорость прогрева 1°С/мин, 0,1 М НФБ, 5 мМ ЭДТА, рН 7,0)

1 | 1 | 1 | (5) / I ' а) :

V

(4) / \

(3),/ \ \ -

\ ',

(2) Л - , \ \ -

о) X'-. \ \

I...... I I

400

о 300

с о

£ 200

100

/)ч б) ^

(2) \>(3)

Ч/ & ' 1 ' I \ \--(4)

(1) .; ■ м \

' 1 / / ,"■1 ■ \ у__(5) » \ *

'V ' /' /Л// >' Л \

1 1 . 1 . 1 1. 1 . 1 1

о80

55 60 65 70 75 80 50 55 60 65 70 75

т, °с т,'

Рис 7 Кривые плавления РэеФДГ вА\/ при различных скоростях прогрева а) ненормализованные (1) 0,125 град/мин, (2) 0,25 град/мин, (3) 0,5 град/мин, (4) 1,0 град/мин, (5)2,0 град/мин, б) нормализованные (1) 0,125 град/мин, (2) 0,25 град/мин, (3) 0,5 град/мин, (4) 1,0 град/мин, (5) 2,0 град/мин (Сферм 1 мг/мл, 0,1 М НФБ, 5 мМ ЭДТА, рН 7,0)

постоянной Такой характер кривых плавления свидетельствует о том, что процесс тепловой денатурации фермента является истинно мономолекулярным

На рисунке 7а представлены кривые плавления РвеФДГ СА\/ с различными скоростями прогрева Полученные данные говорят о том, что при увеличении скорости прогрева, происходит увеличение температуры теплового перехода Тт Такой характер зависимости указывает на то, что тепловая денатурация этого фермента является кинетически контролируемым процессом Тем не менее, значения энтальпии теплового перехода, полученные при нормировке кривых

плавления (рис 76), также как и в предыдущем эксперименте, не изменяются в зависимости от скорости прогрева

Пики тепловых переходов характеризуются высокой симметричностью и малой полушириной, что свидетельствует о том, что процесс тепловой денатурации является высококооперативным и на промежуточных стадиях не происходит диссоциации молекулы фермента на отдельные субъединицы

Следующим этапом работы было изучение влияния на характер кривых плавления ФДГ кофермента NAD+ и ингибитора азид-иона N3, который является аналогом формиата Оказалось, что присутствие в растворе различных концентраций NAD* приводит лишь к незначительному увеличению стабильности фермента, при этом максимальное увеличение температуры теплового перехода составляет всего 2 °С, а величина энтальпии термоденатурации остается практически постоянной (рис 8а) В то же время при образовании тройного комплекса [0flr+NAD++N3] в присутствии различных концентраций NAD* и N3 наблюдается значительное повышение термостабильности ФДГ температура плавления увеличивается на 6 °С, а теплота - на 25% (рис 86)

400

350 300

0

Ц

1 200

S 150

-¿00 о

50 0 -50

■ 1 1 1 1 1 , . 1 1 550

- АЛ — <1> " 500

— (2) . 450

/'// L - - (3) О 400

- /</ (4) " *л 350

In ' ы « Ц

_ О 300

,"' \? i 2

1 v\ — 250

- /" Ь' £ _

/'' / W ' /'/ ' 1 ^200

-J50

_ /У Ь. а). "100

50

0

, 1 , I и , 1 .J----- 1 1 -50

55

60

65

70

75

80 °С

т, с

Рис 8 а) Кривые плавления РвеФДГ GAV при различных концентрациях NAD* (1) свободный фермент, (2)1,5мкМ, (3) 4,5 мкМ, (4)13,5мкМ, б) Кривые плавления РэеФДГСАУ в присутствии NAD* и N3 (1) свободный фермент, (2)4,5 мкМ NAD* и 60 мМ N3, (3) 1,5 мкМ NAD* и 180 мМ N3, (4) 4,5 мкМ NAD* и 180 мМ N3, (5)13,5мкМ NAD* и 540 мМ N3 (скорость прогрева 1°С/мин, Сфер„ 1мг/мл, 0,1 М НФБ, 5 мМ ЭДТА, рН 7,0)

Полученные экспериментальные данные позволяют сделать вывод о значительных конформационных изменениях, приводящих к стабилизации фермента, при образовании таких комплексов Это хорошо согласуется с результатами, полученными при анализе кристаллической структуры ало- и холо-форм РэеФДГ, который показал, что при переходе молекулы фермента в тройной комплекс происходит компактизация белковой глобулы, что и приводит к увеличению стабильности

Увеличение компактности молекулы фермента также может происходить при увеличении ионной силы раствора, за счет усиления гидрофобных взаимодействий внутри глобулы Изучение характера кривых плавления в зависимости от концентрации фосфатного буфера показало, что увеличение концентрации фосфат-иона от 0,1 М до 1,0 М приводит к росту температуры теплового перехода РэеФДГ GAV на 5 °С, однако теплота плавления при этом увеличивается

Рис. 9 Кривые плавления PseOflr GAV при незначительно (рис 9) Т е в растворах с

различных концентрациях фосфатного высокой ионной силой происходит буфера (1)0,1М, (2) 0,22 М, (3) 0,32 М, н

(4) 0,52 М, (5) 1,0 М (скорость прогрева стабилизация ФДГ, что согласуется с

1°С/мин, Сфер», 1 мг/мл, 5 мМ ЭДТА, pH 7,0) данными, полученными при изучении

кинетики инактивации РэеФДГ GAV в

аналогичных условиях

На рисунке 10 приведены кривые плавления всех исследуемых ФДГ в апо-форме в стандартных условиях Рассчитанные параметры тепловых переходов представлены в таблице 5 Из этой таблицы видно, что наиболее стабильны бактериальные ФДГ из Pseudomonas sp 101 и ее мутантные термостабильные формы Далее по уменьшению термостабильности довольно плотно располагаются ферменты из

450 400

Рис 10 Кривые плавления ФДГ из различных источников (1) Pseudomonas sp 101 (дикий тип), (2) Pseudomonas sp 101 (GAV), (3) Pseudomonas sp 101 (T7), (4) Moraxella sp C-1, (5) Candida boidmu, (6) Saccharomyces cerevisiae, (7) Arabidopsis thaliana, (8) Glycine max (скорость прогрева ГС/мин, Сфвр„ 1 мг/мл, 0,1 М НФБ, 5 мМ ЭДТА, pH 7,0)

A thahana, Moraxella sp C-1 и С boidinu И наименее стабильными оказались ФДГ из сои G тах и пекарских дрожжей S cerevisiae

Таблица 5

Параметры тепловых переходов ФДГ из различных источников (скорость прогрева 1°С/мин, Сферм 1 мг/мл, 0,1 М НФБ, 5 мМ ЭДТА, рН 7,0)

Источник ФДГ ДНщ,*, кДж/моль T ** °P Im j *-» T-l/2, °c

Pseudomonas sp 101 2060 67,6 5,4

Pseudomonas sp 101 (GAV) 1980 68,8 5,6

Pseudomonas sp 101 (T7) 2330 74,0 5,5

Moraxella sp C-1 1830 63,4 4,9

Candida boidmn 1730 64,4 5,3

Saccharomyces cerevisiae 820 46,4 3,2

Arabidopsis thahana 1330 64,9 5,9

Glycine max 820 57,1 7,5

* - относительная погрешность при расчете ЛН„„ - 5-8% ** - абсолютная погрешность при измерении Тт-0,2 °С

Исключением из общей закономерности по механизму тепловой денатурации оказалась БсеФДГ Согласно данным кинетических экспериментов (Серов А Е , 2002) термоинактивация этого фермента происходит в две стадии, одна из которых обратима, а вторая необратима Предполагаемый механизм этого процесса приведен на следующей схеме

МА< 43'7°с 46'4°с )£>,

где ЫА - активный фермент, Л^ - частично обратимо инактивированный фермент, Б

- необратимо инактивированный фермент При рассмотрении кривой плавления БсеФДГ в стандартных условиях (рис 11а), можно заметить, что пик теплового перехода несимметричен и в области 41-44 "С наблюдается плечо, которое возможно и соответствует стадии обратимой денатурации Для проверки этой гипотезы был проведен эксперимент, в котором образец БсеФДГ прогревали до 44 °С, а затем, после охлаждения, проводили отжиг в полном диапазоне температур При сравнении со стандартной кривой плавления, полученной в тех же условиях для другого препарата этого фермента, видно, что обе кривые совпадают с погрешностью, допустимой для данного эксперимента Таким образом, можно утверждать, что тепловая денатурация ФДГ из пекарских дрожжей происходит по двухстадийному механизму, в котором первая стадия является обратимой, а вторая

- необратимой

Рис 11а) Кривые плавления БсеФДГ (1) стандартный прогрев, (2) второй прогрев после отжига до 44 °С и охлаждения (скорость прогрева 1 °С/мин, Сферм 1мг/мл, 0,05 М НФБ, 5 мМ ЭДТА, рН 7,0), б) Кривые плавления БсеФДГ при различных концентрациях NAD* и N3 (1) свободный фермент, (2)4,5мкМ NAD*, (3) 0,75мкМ NAD* и ЮмМ N3, (4) 2,25мкМ NAD* и ЗОмМ N3", (5) 4,5 мкМ NAD* и бОмМ N3, (6) 11,25 мкМ NAD* и 2 ЮмМ N3 (скорость прогрева 1 °С/мин, Сферм 1мг/мл, 0,05 М НФБ, 5 мМ ЭДТА, рН 7,0)

Также интересные результаты были получены при изучении влияния NAD* и азида на стабильность БсеФДГ Оказалось, что их добавление приводит к очень сильной стабилизации фермента, гораздо большей, чем наблюдалась в предыдущих случаях (рис 116) Из рисунка хорошо видно, что при увеличении концентрации NAD* и N3 фермент из зло-формы переходит в двойной, а затем и в тройной комплекс При образовании тройного комплекса наблюдается увеличение температуры теплового перехода на 16 °С Величина же энтальпии процесса термоденатурации увеличивается почти в два раза Полученные данные свидетельствуют о гораздо более значительных конформационных изменениях, чем у бактериальных и растительных ферментов, происходящих при связывании ФДГ из S cerevisiae в тройной комплекс

Изучение термостабильности формиатдегидрогеназ из различных источников с помощью спектроскопии кругового дихроизма

С целью проверки данных, полученных с помощью изучения кинетики инактивации и с применением ДСК, а также для получения дополнительной информации о механизме процесса термоденатурации, исследуемые формиатдегидрогеназы были охарактеризованы с помощью спектров кругового дихроизма (КД) Для всех исследуемых ФДГ были сняты при комнатной температуре спектры КД в диапазоне от 200 до 250 нм (рис 12) За денатурацией ферментов при повышении температуры следили на длине волны 222 нм, которая является одним из характеристических максимумов интенсивности сигнала КД для а-спирали

¡5 20000

о

Ж

и

q 10000

re

Q.

L.

J

Ic s с с

£ -10000 re x a.

к ц

a

S -20000

200 210 220 230 240 250

Длина волны, нм

Рис 12 Спектры КД для ФДГ из (1) Pseudomonas sp 101, (2) Moraxella sp C-1, (3) С boidmii, (4) S cerevisiae, (5) A thahana, (6) G max (Сферм 0,1 мг/мл, 0,1 M НФБ, 5 мМ ЭДТА, pH 7,0)

Форма спектров КД, полученных для ФДГ, является типичной для большинства белков, имеющих в структуре молекулы значительную долю а-спиралей Это подтверждается данными рентгеноструктурного анализа формиатдегидрогеназ (РэеФДГ, СЬоФДГ, МогФДГ, АгаФДГ), согласно которым доля а-спиралей в структуре ферментов составляет 28-34% Также отметим присутствие в спектрах КД минимумов в районе 215-216 нм, что указывает на наличие в белковой глобуле /5-структур Из значения молярной эллиптичности на длине волны 222 нм по методу, предложенному Ченом и др , были рассчитаны доли альфа-спиральности для всех исследуемых ферментов (табл 6) Для сравнения в таблице приведены аналогичные величины, полученные с помощью рентгеноструктурного анализа (РСА)

Таблица 6

Доля а-спиралей в структуре ФДГ из различных источников

Источник ФДГ КД а*, % РСА а, %

Pseudomonas sp 101 31 30

Moraxella sp C-1 28 28

Candida boidmii 34 34

Saccharomyces cerevisiae 33 н/д

Arabidopsis thaliana 30 29

Glycine max 32 н/д

* - относительная погрешность при расчете доли а-спиралей - 5%

Из данных таблицы 6 видно, что значения, полученные с использованием двух методов, демонстрируют высокую корреляцию При этом следует отметить, что доля

а-спиралей в структуре исследуемых формиатдегидрогеназ приблизительно одинакова

На рисунке 13а приведены температурные зависимости интенсивности сигнала КД при длине волны 222 нм для исследуемых ФДГ Каждый препарат фермента подвергался первичному прогреву, а затем после охлаждения, прогревался второй раз Для всех ферментов спектр повторного плавления не отображал каких-либо изменений эллиптичности, что подтверждает необратимость процесса тепловой денатурации ФДГ Условия экспериментов были подобраны такие же, как в случае ДСК - скорость прогрева 1 °С/мин, 0,1 М НФБ, 5 мМ ЭДТА, рН 7,0 Использовались препараты ферментов с концентрацией -0,1 мг/мл

Рис 13 а) Температурные зависимости интенсивности сигнала КД при длине волны 222 нм для ФДГ из (1) Pseudomonas sp 101, (2) Moraxella sp C-1, (3) С boidinn, (4) S cerevisiae, (5) A thaliana, (6) G max (скорость прогрева 1 °С/мин, Сферм 0,1 мг/мл, 0,1 М НФБ, 5 мМ ЭДТА, pH 7,0), б) Дифференцированные температурные зависимости интенсивности сигнала КД при длине волны 222 нм для ФДГ из (1) Pseudomonas sp 101, (2) Moraxella spC-1, (3) С boidinn, (4) S cerevisiae, (5) A thaliana, (6) G max

Характер зависимостей для всех исследуемых ферментов, кроме БсеФДГ, оказался схожим Для большей наглядности эти зависимости были продифференцированы (рис 136) Пики тепловых переходов, также как и в случае экспериментов с применением ДСК, являлись высокосимметричными и характеризовались малой полушириной Рассчитанные характеристики тепловых переходов (табл 7) хорошо согласуются с аналогичными данными из ДСК Температурные зависимости интенсивности сигнала КД показывают динамику изменения состояния а-спиралей в структуре фермента, в то время как кривые плавления ДСК отображают характер плавления всей белковой глобулы Таким образом, из вышесказанного можно сделать вывод о том, что тепловая денатурация ФДГ является высококооперативным процессом, в котором происходит одновременное разрушение всех элементов структуры фермента

Таблица 7

Характеристики тепловых переходов, полученные с помощью ДСК и из спектров КД

Источник ФДГ ДСК КД

Tm>°c T1/2, °C Tm,°c Tl/2> °C

Pseudomonas sp 101 67,6 5,4 67,8 5,5

Pseudomonas sp 101 (GAV) 68,8 5,6 69,0 6,1

Pseudomonas sp 101 (T7) 74,0 5,5 74,1 5,6

Moraxella sp C-1 63,4 4,9 62,4 5,2

Candida boidinu 64,4 5,3 65,1 4,8

Saccharomyces cerevisiae 46,4 3,2 48,1 2,8

Arabidopsis thaliana 64,9 5,9 65,0 7,0

Glycine max 57,1 7,5 57,5 7,4

Для проверки гипотезы о наличии в механизме термоденатурации ЭсеФДГ обратимой стадии был проведен эксперимент, аналогичный описанному в прошлом разделе, с отжигом препарата фермента до 44 °С и повторным прогревом после охлаждения (на рисунке не показано) Также как и в случае ДСК, кривая повторного плавления совпала с таковой для другого препарата этого фермента в аналогичных условиях, что доказывает наличие обратимой стадии в процессе тепловой денатурации ЭсеФДГ

Исследование структуры формиатдегидрогеназ из различных источников с помощью РСА

Последним этапом работы было получение препаративных количеств исследуемых ферментов для дальнейшей кристаллизации и анализа полученных структур Кристаллизация препаратов ферментов и решение полученных структур проводились в группе под руководством К М Полякова В таблице 8 приведены все полученные кристаллические формы ФДГ

Можно выделить следующие наиболее интересные результаты, полученные в этой части работы

1 Оказалось, что лучше всех кристаллизуется рекомбинантная ФДГ из бактерий Moraxella sp С-1 Именно для нее были получены кристаллы с высоким разрешением до 1,1 ангстрема В структурах ФДГ из Moraxella sp С-1 были локализованы все 400 аминокислотных остатков, в то время как в случае апо- и холо-форм РэеФДГ видны только 373 и 390 остатков из 400 соответственно,

2 Амидные группы никотинамидной части NAD* в тройных комплексах [Р5еФДГ+ЫАО++Ы3 ] и [МогФДГ+ЫАй*+Ы3 ] развернуты на 180° по отношению друг к ДРУГУ,

3 В одной из структур РэеФДГ было показано, что атом серы остатка Суэ384, (консервативного для всех ФДГ) находится в виде - БО или - БОз, т е со временем этот остаток окисляется, с чем, по-видимому, и связано образование различных изоформ фермента при длительном хранении в растворе,

4 Впервые получены кристаллы растительной АгаФДГ Данные для тройного комплекса [АгаФДГ+ЫАО++Мз ] свидетельствуют о возможном образовании не только димерных, но и других олигомерных форм более сложного состава

Таблица 8

Полученные кристаллические структуры ФДГ из разных источников

Фермент Разрешение, А Конформация Состояние

ФДГ из Рзеивотопав эр 101

ало-форма 1,8 открытая решена

зло-форма 2,1 открытая решена

[ФДГ+МАО++Ыз ] 2,05 закрытая решена

[ФДГ+АОРР] 1,5 открытая решена

[ФДГ+формиат] 2,19 открытая решена

[ФДГ+формиат] 2,28 открытая решена

ФДГ из Рвеис/отопаБ эр 101 (СА\/)

зло-форма 2,3 открытая решена

[ФДГ+ЫАЭН+формиат] 2,3 открытая решена

ФДГ из РзвиЬотопав ер 101 (Т7)

ало-форма 2,3 открытая решена

ФДГ из АгаЬ/Лэрв/з Макана

ало-форма н/д н/д получены кристаллы

[ФДГ+ЫАР++Ыз] 2,1 закрытая в процессе уточнения

ФДГ из МогахеПа эр С-1

ало-форма 2,3 открытая решена

[ФДГ+МО++М3'] 1,95 закрытая решена

[ФДГ+МАй'+Мз"] 1,1 закрытая в процессе уточнения

[ФДГ+ЫАО++Ыз ] 1,37 закрытая в процессе уточнения

[ФДГ+ЫАО*] 1,4 закрытая в процессе уточнения

[ФДГ+ЫАЭ*] 1,75 закрытая в процессе уточнения

[ФДГ+ЫАйН] 1,9 закрытая в процессе уточнения

выводы

1 Впервые проведена экспрессия растительных ФДГ в клетках Е coli в виде активных растворимых ферментов Получены высокоочищенные препараты рекомбинантных ФДГ из Arabidopsis thaliana и Glycine max, изучены их кинетические свойства Показано, что фермент из сои имеет наиболее низкие значения Кт по обоим субстратам,

2 Проведено исследование стабильности формиатдегидрогеназ из 6 источников с помощью ДСК, КД-спектроскопии и изучения кинетики инактивации Показано, что тепловая денатурация исследованных ФДГ (кроме ЭсеФДГ) протекает в одну стадию и является необратимым процессом В случае ФДГ из S cerevisiae процесс термоденатурации состоит из двух стадий, причем первая стадия является обратимой, а вторая - необратимой,

3 Различными методами определены количественные характеристики процесса теплового перехода при денатурации белковой глобулы формиатдегидрогеназ,

4 Изучено влияние ионной силы и присутствия кофермента (NAD+) и ингибитора (N3) на процесс денатурации Показано, что повышение ионной силы, а также связывание ФДГ в двойной комплекс с [ФДГ+NAD*] и, особенно, тройной комплекс [ФДГ+МАО*+Мз ] приводит к значительной стабилизации фермента,

5 Получены и решены кристаллические структуры различных форм исследуемых формиатдегидрогеназ

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Статьи

1 Садыхов Э Г , Серов А Е , Ясный И Е , Войнова Н С , Алексеева А А , Петров А С, Тишков В И МАО+-зависимые формиатдегидрогеназы из Arabidopsis thaliana и сои экспрессия в клетках £ coli и кинетические свойства рекомбинантных ферментов Вестник Московского Университета, Серия 2 Химия, 2006, т 47, N1, с 31-34

2 Садыхов Э Г , Серов А Е , Войнова Н С , Угланова С В , Петров А С , Алексеева А А , Клейменов С Ю , Попов В О , Тишков В И Сравнительное исследование термостабильности формиатдегидрогеназ из микроорганизмов и растений Прикладная биохимия и микробиология 2006, т 42 , № 3, с 269-273

3 Тишков В И , Ясный И Е , Садыхов Э Г , Маторин А Д , Серов А Е Исследование термостабильности мутантных ЫАОР+-зависимых формиатдегидрогеназ из Pseudomonas sp 101 Доклады Академии Наук 2006, т 409, №2, с 271-273

4 Филиппова Е В , Поляков К М , Тихонова Т В, Стеханова Т Н, Бойко К М , Садыхов Э Г , Тишков В И , Попов В О Кристаллическая структура комплексов ЫАй*-зависимой формиатдегидрогеназы из метилотрофных бактерий Pseudomonas sp 101 с формиатом Кристаллография 2006, т 51 №4, с 663-667

Тезисы

1 Sadykhov Е G , Serov A E , Kleymenov S Yu , Labrou N E , Popov V О , Tishkov V I Study of thermal stability of formate dehydrogenases from bacterium and yeasts using differential scanning microcalorimetry Congress Proceedings of the III Moscow International Congress «Biotechnology State of the Art and Prospects Development», Moscow, March 14-18, 2005, Part 2, p 208

2 Садыхов Э Г . Серов A H, Левицкий Д И , Попов В О и Тишков В И Изучение термостабильности формиатдегидрогеназы из Saccharomyces cerevisiae методом дифференциальной сканирующей калориметрии Материалы Международной конференции студентов и аспирантов «Ломоносов 2004», т 1, с 104

3 Sadykhov E G . Serov А E , Yasny I E , Voynova N S , Alekseeva А А , Petrov A S , Tishkov VI NAD*-dependent formate dehydrogenases from Arabidopsis thaliana and soya Glycine max expression in E coll cells and kinetic properties Abstracts of International Conference «Biocatalysis 2005 Fundamentals and Applications», St Petersburg, Russian Federation, June 19-23, 2005, p 107

4 Sadykhov E G . Serov A E , Levitsky D I, Popov V О , Tishkov V I Study of thermal stability of recombinant formate dehydrogenases from Pseudomonas sp 101 and Arabidopsis thaliana using differential scanning microcalorimetry Abstracts of International Conference «Biocatalysis 2005 Fundamentals and Applications», St Petersburg, Russian Federation, June 19-23, 2005, p 106

5 Filippova E V , Polyakov К M , Tikhonova T V , Sadykhov E G , Stehanova T N , Boiko К M , Tishkov V I, Lamzin V S , Popov V О Crystal structure of formate dehydrogenase from Pseudomonas sp 101 in complex with formate Abstracts of International Conference «Biocatalysis 2005 Fundamentals and Applications», St Petersburg, Russian Federation, June 19-23, 2005, p 78

6 Tishkov V I , Sadykhov E G . Serov A E , Kleymenov S Yu , Popov V О Characterization of stability of wild-type and mutant formate dehydrogenases by differential scanning calorimetry Materials of Intern Simposium «Biotrans 2005 The Key to Industrial Biotechnology», Delft, July 3-8, The Netherlands, p 319

Структуры, депонированные в банке трехмерных структур белков PDB

1 Filippova EV, Polyakov KM, Tikhonova TV, Shabalin IG, Sadykhov E G , Tishkov VI, Popov V О NAD-dependent formate dehydrogenase from bacterium Moraxella sp C-1 in complex with NAD and azide (код - 2GSD) -http //www pdb org/pdb/explore/explore do?structureld=2GSD

РАБОТА БЫЛА ВЫПОЛНЕНА ПРИ ФИНАНСОВОЙ ПОДДЕРЖКЕ

• Российского Фонда Фундаментальных Исследований (проект № а-05-04-49073),

• NATO (грант LST CLG 979818),

• Федерального агентства по науке и инновациям (государственный контракт №02 467 11 3004),

• Программы Президиума РАН "Молекулярная и клеточная биология"

Заказ № 24/05/07 Подписано в печать 27 04 2007 Тираж 110 зкз Усп пл 1,5

ООО "Цифровичок", тел (495) 797-75-76, (495) 778-22-20 [I ^ мпу-и" с/г ги , е-тай т/о@с/г ги

Содержание диссертации, кандидата химических наук, Садыхов, Эльчин Гусейнгулу оглы

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

I. ВВЕДЕНИЕ.

II. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР.

2.1. Локализация, основные свойства, структура и механизм действия NAD+-зависимых формиатдегидрогеназ.

2.1.1. Локализация ФДГ.

2.1.2. Сравнительный анализ аминокислотных последовательностей ФДГ.

2.1.3. Молекулярный механизм ФДГ.

2.1.4. Трехмерная структура ЫАВ+-зависимой формиатдегидрогеназы из Pseudomonas sp.101.

2.1.5. Экспрессия ФДГ в клетках E.coli.

2.1.6. Кинетические параметры и взаимодействие активных центров ФДГ.

2.1.7. Субстратная специфичность ФДГ.

2.1.8. Коферментная специфичность ФДГ.

2.2. Термостабильность формиатдегидрогеназ из различных источников.

2.2.1. Механизмы инактивации ФДГ.

2.2.2. Сравнение термостабильности ФДГ из различных источников.

2.2.3 Увеличение термостабильности ФДГ из Pseudomonas sp.101.

2.3. Дифференциальная сканирующая калориметрия как метод изучения структуры белков.

2.3.1. Техника сканирующей калориметрии.

2.3.2. Калориметрические измерения.

2.3.3. Анализ результатов ДСК.

III. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

3.1. Материалы.

3.2. Методы исследований.

3.2.1. Трансформация клеток E.coli.

3.2.2. Выделение плазмидной ДНК.

3.2.3. Электрофорез ДНК в агарозном геле.

3.2.4. Наработка биомассы.

3.2.5. Выделение формиатдегидрогеназы.

3.2.6. Электрофорез в полиакриламидном геле.

3.2.7. Определение концентрации ФДГ.

3.2.8. Измерение активности ФДГ.

3.2.9. Исследование термоинактивации ФДГ.

3.2.10. Анализ кинетических данных и расчет кинтеических констант.

3.2.11. Анализ трехмерных структур ФДГ.

3.2.12. Дифференциальная сканирующая калориметрия (ДСК).

3.2.13. Анализ кривых плавления.

3.2.14. Круговой дихроизм (КД).

IV. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

4.1. Экспрессия формиатдегидрогеназ в клетках E.coli.

4.1.1. Экспрессия формиатдегидрогеназ из Arabidopsis thaliana и Glycine max в клетках E.coli.

4.1.2. Экспрессия формиатдегидрогеназ из Pseudomonas sp.101, Candida boidinii, Moraxella sp.C-1, Saccharomyces cerevisiae в клетках E.coli.

4.2. Изучение кинетических свойств рекомбинантных растительных формиатдегидрогеназ.

4.3. Изучение кинетики термоинактивации рекомбинантных растительных формиатдегидрогеназ.

4.4. Изучение термостабильности формиатдегидрогеназ из различных источников с помощью дифференциальной сканирующей калориметрии.

4.5. Изучение термостабильности формиатдегидрогеназ из различных источников с помощью спектров кругового дихроизма.

4.6. Исследование структуры формиатдегидрогеназ из различных источников с помощью рентгеноструктурного анализа.

V. ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Получение, термостабильность и структурные исследования формиатдегидрогеназ из различных источников"

NAD+-3aBHCHMbie формиатдегидрогеназы (КФ 1.2.1.2), окисляющие формиат-ион до углекислого газа, представляют собой несколько групп ферментов, отличающихся как по четвертичной структуре, так и по наличию (или отсутствию) простетических групп и кофакторов. Среди большого разнообразия формиатдегидрогеназ наиболее простым по структуре и составу является фермент, состоящий из двух идентичных субъединиц и не содержащий в активном центре ни ионов металлов, ни простетических групп (ФДГ).

Формиатдегидрогеназа данного типа представляет большой интерес с точки зрения фундаментальной науки, поскольку этот фермент принадлежит к большому суперсемейству D-специфичных дегидрогеназ 2-гидроксикислот. Субстрат ФДГ -формиат-ион является самым простым по структуре среди субстратов для всех ферментов данного суперсемейства, и в механизме его действия отсутствуют стадии кислотно-основного катализа переноса протона. Сравнение структуры ФДГ со структурами дегидрогеназ из семейства D-специфичных дегидрогеназ 2-гидроксикислот показало исключительно высокую пространственную гомологию (в среднем около 80-90%) при очень низком значении степени гомологии на уровне аминокислотных последовательностей (менее 30%). Поэтому формиатдегидрогеназа данного типа рассматривается как модельный фермент для выяснения механизма переноса гидрид-иона в активном центре дегидрогеназ.

Этот фермент широко распространен в метанол-утилизирующих микроорганизмах и играет важную роль в снабжении клетки энергией при окислении метанола до С02 с помощью полиферментной системы -метанолдегидрогеназа, формальдегиддегидрогеназа и формиатдегидрогеназа. Наиболее изученными у метилотрофных микроорганизмов являются ФДГ из бактерий Pseudomonas sp.101 (РэеФДГ) и дрожжей Candida boidinii (СЬоФДГ). Эти ферменты используются в качестве универсального биокатализатора регенерации NAD(P)H в процессах синтеза оптически активных соединений с помощью дегидрогеназ. В нашей лаборатории для обоих ферментов были созданы рекомбинантные штаммы E.coli, обеспечивающие выход до 3-5 граммов целевого продукта с литра среды. Несмотря на получение различных мутантов РэеФДГ и СЬоФДГ с улучшенными свойствами, проблема получения новых мутантов и их физико-химическая характеристика (в первую очередь изучение стабильности и механизма инактивации в различных условиях) является одним из основных условий успешного применения биокатализаторов на практике. До наших исследований в литературе отсутствовали систематические данные по химической, операционной и температурной стабильности ФДГ в зависимости от различных факторов.

Формиатдегидрогеназы также ранее были найдены в семенах фасоли, гороха и сои. Секвенирование геномов различных растений, выполненное в последнее десятилетие, показало, что этот фермент присутствует во всех высших растениях и мхах. На примере картофеля (а позднее для ячменя и Arabidopsis thaliana) было показано, что ФДГ расположена в митохондриях и является белком стресса. В условиях стрессовых воздействий содержание ФДГ достигает до 9% от общего количества митохондриальных белков! Основным сдерживающим фактором изучения растительных ФДГ был низкий выход фермента, кроме того, его свойства сильно зависели от метода выделения. Несмотря на то, что были получены трансгенные растения A. thaliana, тем не менее, так и не удалось наладить получение ФДГ в больших количествах. Все описанные в литературе попытки экспрессии растительных ФДГ в клетках E.coli были неудачными, поскольку фермент синтезировался в нерастворимой и неактивной форме в виде телец включения. Получение ФДГ из растений в больших количествах (десятки и сотни миллиграмм) также очень важно для получения кристаллов этих ферментов. К моменту начала нашей работы в банке трехмерных структур белков PDB имелось только две структуры для ano- и холо-форм РэеФДГ. Поэтому получение, изучение свойств и определение трехмерной структуры растительных ФДГ является исключительно актуальной научной задачей.

В работе в качестве объектов исследования были использованы реком-бинантные ФДГ из бактерий Pseudomonas sp.101 (РэеФДГ) и Moraxella sp.C-1 (МогФДГ), метилотрофных дрожжей C.boidinii (СЬоФДГ) и пекарских дрожжей Saccharomyces cerevisiae (БсеФДГ) и растений A.thaliana (АгаФДГ) и сои Glycine тах (в1уФДГ). Гены РзеФДГ, СЬоФДГ и ЗсеФДГ были клонированы в нашей лаборатории, ген МогФДГ был клонирован нами совместно с проф. К. Асано из Университета префектуры Тояма и проф. Н. Есаки из Университета Киото (Япония). Плазмиды с полноразмерными генами АгаФДГ и в1уФДГ (включая сигнальные последовательности для транспорта в митохондрии) были любезно предоставлены проф. Марквелом из Университета штата Небраска (Линкольн, США) и проф. Н. Лабру из Сельскохозяйственного Университета Афин (Греция) соответственно.

Целью данной работы являлось получение рекомбинантных растительных формиатдегидрогеназ и комплексное изучение структуры и термостабильности ФДГ из бактерий (РзеФДГ, МогФДГ), дрожжей (СЬоФДГ, ЗсеФДГ) и растений (АгаФДГ, в1уФДГ).

II. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Садыхов, Эльчин Гусейнгулу оглы

V. выводы

1. Впервые проведена экспрессия растительных ФДГ в клетках E.coli в виде активных растворимых ферментов. Получены высокоочищенные препараты рекомбинантных ФДГ из Arabidopsis thaliana и Glycine max, изучены их кинетические свойства. Показано, что фермент из сои имеет наиболее низкие значения Кт по обоим субстратам;

2. Проведено исследование стабильности формиатдегидрогеназ из 6 источников с помощью ДСК, КД-спектроскопии и изучения кинетики инактивации. Показано, что тепловая денатурация исследованных ФДГ (кроме ЗсеФДГ) протекает в одну стадию и является необратимым процессом. В случае ФДГ из Saccharomyces cerevisiae процесс термоденатурации состоит из двух стадий, причем первая стадия является обратимой, а вторая - необратимой;

3. Различными методами определены количественные характеристики процесса теплового перехода при денатурации белковой глобулы формиатдегидрогеназ;

4. Изучено влияние ионной силы и присутствия кофермента (NAD+) и ингибитора (N3) на процесс денатурации. Показано, что повышение ионной силы, а также связывание ФДГ в двойной комплекс с [ФДГ+NAD"1"] и, особенно, тройной комплекс [ФДГ+ЫАО++Ыз ] приводят к значительной стабилизации фермента;

5. Получены и решены кристаллические структуры различных форм исследуемых формиатдегидрогеназ.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата химических наук, Садыхов, Эльчин Гусейнгулу оглы, Москва

1. Popov V.O. and Lamzin V.S. (1994) NAD+-dependent formate dehydrogenase. Biochem. J., v.301, p.625-643

2. Родионов Ю.В. (1981) Метаболизм формиата у микроорганизмов. Успехи микробиологии, вып. 16, с. 104-138.

3. Khangulov S.V., Gladyshev V.N., Dismukes G.C. and Stadtman T.C. (1998) Selenium-containing formate dehydrogenase H from Escherichia coli: a molybdopterin enzyme that catalyzes formate oxidation without oxygen transfer. Biochemistry, v.37, p.3518-3528

4. Hollenberg C. P. and Janowicz Z. (1989) DNA-molecules coding for FMDH control regions and structured gene for a protein having FMDH-activity and their uses. Европейский патент ЕР 1987000110417, Bulletin 89/03

5. Тишков В.И., Галкин А.Г., Егоров A.M. (1991). NAD+-3aBHCHMafl формиатдегидрогеназа метилотрофных бактерий Pseudomonas sp.101: клонирование, экспрессия и изучение структуры гена. Докл. Акад. Наук СССР, т.317, с.345-348.

6. Galkin A., Kulakova L., Tishkov V., Esaki N. and Soda К. (1995) Cloning of formate dehydrogenase gene from a methanol-utilizing bacterium Mycobacterium vaccae N10 Appl. Microbiol. Biotechnol., v.44, p.479-483

7. Mitsunaga Т., Tanaka Y., Yoshida T. and Watanabe K. (2000) New Hyphomicrobium sp. formate dehydrogenase gene for producing formate dehydrogenase of high specific activity, high temperature stability and high pH stability. Патент Японии JP245471A2

8. Nanba H., Takaoka Y., Hasegawa J. (2003) Purification and characterization of formate dehydrogenase from Ancylobacter aquaticus strain KNK607M, and cloning of the gene. Biosci. Biotechnol. Biochem., v.67, p.720-728

9. Nanba H., Takaoka Y. and Hasegawa, J. (2003). Purification and characterization of an alpha-haloketone-resistant formate dehydrogenase from Thiobacillus sp. strain KNK65MA, and cloning of the gene Biosci. Biotechnol. Biochem., v.67, p.2145-2153

10. Allen S.J. and Holbrook J.J. (1995) Isolation, sequence and overexpression of the gene encoding NAD+-dependent formate dehydrogenase from the methylotrophic yeast Candida methylica. Gene, v. 162, p.99-104

11. Slusarczyk H., Felber S., Kula M.R. and Pohl M. (2000). Stabilization of NAD+-dependent formate dehydrogenase from Candida boidinii by site-directed mutagenesis of cysteine residues. Eur. J. Biochem., v.267, p.1280-1289

12. Labrou N.E. and Rigden D.J. (2001) Active-site characterization of Candida boidinii formate dehydrogenase. Biochem. J., v.354, p.455-463

13. Goldberg S.L., Cino P.M., Patel R.N., Nanduri V.B., Johnston R.M. and Johnston R. (2004) Pichia pastoris formate dehydrogenase and uses therefor. Патент США US 2004/0038237A1

14. De la Torre J.R, Christiansen L.M., Beja O., Suzuki M.T., Karl D.M., Heidelberg J. and De Long E.F. (2003) Proteorhodopsin genes are distributed among divergent marine bacterial taxa. Proc. Natl. Acad. Sei. USA, v.100, p.12830-12835

15. Overkamp K.M., Kotter P., van Der H.R., Schoondermark-Stolk S., Luttik M.A.H., van Dijken J.P. and Pronk J.T. (2002) Functional analysis of structural genes for NAD+-dependent formate dehydrogenase in Saccharomyces cerevisiae. Yeast, v.19, p.509-520

16. Серов A.E. (2002) Взаимосвязь структуры и свойств рекомбинантных формиатдегидрогеназ из пекарских дрожжей и метилотрофных бактерий. Диссертация кандидата химических наук, МГУ, Москва

17. Серов А.Е., Попова А.С. и Тишков В.И. (2002) Кинетический механизм формиатдегидрогеназы пекарских дрожжей. Докл. Акад. Наук, т.382, с.401-405

18. Saleeba J.A., Cobbett C.S. and Hynes M.J. (1992) Characterization of the amdA-regulated aciA gene of Aspergillus nidulans. Mol. Gen. Genet., v.235, p.349-358

19. Chow C.M. and Raj Bhandary U.L. (1993) Developmental regulation of the gene for formate dehydrogenase in Neurospora crassa. J. Bacteriol., v. 175, p.3703-3709

20. Davison D.C. (1951) Plant formic dehydrogenase. Biochem. J., v.49, p.520-526

21. Kanamori T. and Suzuki Y. (1968) Formate dehydrogenase from the pea seedling. Enzymologia, v.35, p. 185-197

22. Colas des Francs-Small C., Ambard-Bretteville F., Small I.D. and Remy R. (1993) Identification of a major soluble protein in mitochondria from nonphotosynthetic tissues as NAD+-dependent formate dehydrogenase. Plant Physiol., v. 102, p.l 171-1177

23. Jansch L., Kruft V., Schmitz U.K. and Braun H.P. (1996) New insights into the composition, molecular mass and stoichiometry of the protein complexes of plant mitochondria. Plant J., v.9, p.357-368

24. Hourton-Cabassa C., Ambard-Bretteville F., Moreau F., de Virville J.D., Remy R., Colas des Francs-Small C. (1998) Stress induction of mitochondrial formate dehydrogenase in potato leaves. Plant Physiol., v.l 16, p.627-635

25. Suzuki K., Itai R., Suzuki K., Nakanishi H., Nishizawa N.K., Yoshimura E. and Mori S. (1998) Formate dehydrogenase, an enzyme of anaerobic metabolism, is induced by iron deficiency in barley roots. Plant Physiol., v.l 16, p.725-732

26. Thompson P., Bowsher C.G. and Tobin A.K. (1998) Heterogeneity of mitochondrial protein biogenesis during primary leaf development in barley. Plant Physiol., v.l 18, p.1089-1099

27. Hanson A.D., Gage D.A. and Shachar-Hill Y. (2000) Plant one-carbon metabolism and its engineering .Trends Plant Sci., v.5, p.206-213

28. Kreuzwieser J., Schnitzler J.P. and Steinbrecher R. (1999) Biosynthesis of organic compounds emitted by plants Plant Biol., v.l, p. 149-159

29. Li R., Ziola B. and King J. (2000) Purification and characterization of formate dehydrogenase from Arabidopsis thaliana. J. Plant Physiol., v. 157, p. 161-167

30. Olson B.J., Skavdahl M., Ramberg H., Osterman J.C., and Markwell J. (2000) Formate dehydrogenase in Arabidopsis thaliana: characterization and possible targeting to the chloroplast. Plant Sci., v.159, p.205-212

31. Shiraishi T., Fukusaki E. and Kobayashi A. (2000) Formate dehydrogenase in rice plant: Growth stimulation effect of formate in rice plant. J. Biosci. Bioeng., v.89, p.241-246

32. LiR., Bonham-Smith P.C. and King J. (2001) Molecular characterization and regulation of formate dehydrogenase in Arabidopsis thaliana. Canad. J. Botany-Revue Canadienne de Botanique, v.79, p.796-804

33. Herman P.L., Ramberg H., Baack R.D., Markwell J. and Osterman J.C. (2002) Formate dehydrogenase in Arabidopsis thaliana: overexpression and subcellular localization in leaves. Plant Sci., v.163, p.1137-1145

34. LiR., Moore M. and King J. (2003) Investigating the regulation of one-carbon metabolism in Arabidopsis thaliana. Plant Cell Physiol., v.44, p.233-241

35. Emanuelsson O., Nielsen H. and von Heijne G. (1999) ChloroP, a neural network-based method for predicting chloroplast transit peptides and their cleavage sites Protein Sci. v.8, p.978-984

36. Baack R.D., Markwell J., Herman P.L. and Osterman J.C. (2003) Kinetic behavior of the Arabidopsis thaliana leaf formate dehydrogenase is thermally sensitive. J. Plant Physiol, v.160, p.445-450

37. Weerasinghe P.A., Weerasekera M.L.M.C. and Van Holm, L.H.J. (1999) Use of isoenzymes to differentiate growth categories of Pericopsis mooniana trees. Biologia Plantarum, v.42, p.541-547

38. Bykova N.V., Egsgaard H., and Moller I.M. (2003) Identification of 14 new phosphoproteins involved in important plant mitochondrial processes. FEBS Lett., v.540, p.141-146

39. Bykova N.V., Stensballe A., Egsgaard H., Jensen O.N. and Moller I.M. (2003) Phosphorylation of formate dehydrogenase in potato tuber mitochondria. J. Biol. Chem., v.278, p.26021-26030

40. Федорчук B.B., Галкин А.Г., Ясный И.Е., Кулакова Л.Б., Рожкова A.M., Филиппова А.А., Тишков В.И. (2002) Влияние взаимодействий между аминокислотными остатками 43 и 61 на термостабильность бактериальных формиатдегидрогеназ. Биохимия, v.67, p.l385-1393

41. Gul-Karaguler N., Sessions R.B., Clarke A.R. and Holbrook J. (2001) A single mutation in the NAD+-specific formate dehydrogenase from Candida methylica allows the enzyme to use NADP+. Biotechnol. Lett., v.23, p.283-287

42. Serov A.E., Popova A.S., Fedorchuk V.V. and Tishkov V.I. (2002) Engineering of coenzyme specificity of formate dehydrogenase from Saccharomyces cerevisiae Biochem. J., v.367, p.841-847

43. Lamzin V.S., Dauter Z., Popov V.O., Harutyunyan E.H. and Wilson K.S. (1994) High resolution structures of holo- and apo-formate dehydrogenase. J. Mol. Biol., v.236, p.759-785

44. Sander C. and Schneider R. (1991) Database of homology-derived protein structures and the structural meaning of sequence alignment. Proteins, v.9, p.56-68

45. Blanchard J.S. and Cleland W.W. (1980) Kinetic and chemical mechanisms of yeast formate dehydrogenase. Biochemistry, v.19, p.3543-3550

46. Hermes J.D., Morrical S.W., O'Leary M.H. and Cleland,W.W. (1984) Variation of transition-state structure as a function of the nucleotide in reactions catalyzed by dehydrogenases. 2. Formate dehydrogenase. Biochemistry, v.23, p.5479-5488

47. Тишков В.И., Галкин А.Г. и Егоров A.M. (1989) НАД-зависимая формиатдегидрогеназа метилотрофных дрожжей выделение и физико-химические свойства. Биохимия, т.54, с.231-236

48. Tishkov V.I., Galkin A.G. and Egorov A.M. (1989) Kinetic isotope effect and the presteady-state kinetics of the reaction catalyzed by the bacterial formate dehydrogenase. Biochimie, v.71, p.551-557

49. Taguchi H., Ohta Т. and Matsuzawa H. (1997) Involvement of Glu-264 and Arg-235 in the essential interaction between the catalytic imidazole and substrate for the D-lactate dehydrogenase catalysis. J. Biochem. (Tokyo), v. 122, p.802-809

50. Clarke A.R., Wigley D.B., Chia W.N., Barstow D., Atkinson T. and Holbrook J.J. (1986) Site-directed mutagenesis reveals role of mobile arginine residue in lactate dehydrogenase catalysis. Nature, v.324, p.699-702

51. Маторин А.Д. (2000) Механизм субстратной и коферментативной специфичности бактериальной формиатдегидрогеназы. Диссертация кандидата химических наук, Москва, МГУ

52. Клячко H.JI., Вакула С.В., Гладышев В.Н., Тишков В.И. и Левашов А.В. (1997) Формиатдегидрогеназа в системе обращенных мицелл: регуляция каталитической активности и олигомерного состава фермента. Биохимия, т.62, с.1691-1695

53. Wilmot С.М. and Thornton J.M. (1990) Beta-turns and their distortions: a proposed new nomenclature. Protein Eng., v.3, p.479-493

54. Тишков В.И. (1993) Структура, механизм действия и белковая инженерия NAE^-зависимой формиатдегидрогеназы. Диссертация доктора химических наук, Москва, МГУ

55. Vinals С., Depiereux Е. and Feytmans Е. (1993) Prediction of structurally conserved regions of D-specific hydroxy acid dehydrogenases by multiple alignment with formate dehydrogenase. Biochem. Biophys. Res. Commun., v. 192, p.182-188

56. Labrou N.E., Rigden D.J. and Clonis Y.D. (2000) Characterization of the NAD+ binding site of Candida boidinii formate dehydrogenase by affinity labelling and site-directed mutagenesis. Eur. J. Biochem., v.267, p.6657-6664

57. Tishkov V.l. and Popov V.O. (2006) Protein engineering of formate dehydrogenase. Biomol. Eng., v.23, p.89-110

58. Tishkov V.l., Galkin A.G., Fedorchuk V.V., Savitsky P.A., Rojkova A.M., Gieren H. and Kula M.R. (1999) Pilot scale production and isolation of recombinant NAD+- and NADP+-specific formate dehydrogenases. Biotechnol. Bioeng., v.64, p. 187-193

59. Yamamoto H., Mitsuhashi K., Kimoto N., Kobayashi Y. and Esaki N. (2005) Robust NADH-regenerator: improved alpha-haloketone-resistant formate dehydrogenase. Appl. Microbiol. Biotechnol. v.67, p.33-39

60. FelberS. (2001) Optimierung der NAD-abhängigen Formiatdehydrogenase aus Candida boidinii für den Einsatz in der Biokatalyse. PhD Thesis, Heinrich-Heine University of Duesseldorf, URL: http://diss.ub.uni-duesseldorf.de/ebib/diss/ ßle?dissid=78

61. Rozzell J.D., Hua L., Mayhew M. and Novick S. (2004) Mutants of enzymes and methods for their use. Патент США US2004115691

62. Мезенцев A.B., Устинникова Т.Б., Тихонова Т.В., Попов В.О. (1996) Выделение и кинетический механизм действия НАД зависимой формиатдегидрогеназы метилотрофных дрожжей Hansenula polymorpha. Прикл. биохим. микробиол. т.32, с.589-595

63. Shutte Н., Flossdorf J., Sahm Н. and Kula M.R. (1976) Purification and properties of formaldehyde dehydrogenase and formate dehydrogenase from Candida boidinii. Eur. J. Biochem., v.62, p. 151-160

64. Попов B.O., Родионов Ю.В., Егоров A.M., Березин И.В. (1978) ЫАО+-зависимая формиатдегидрогеназа из метилотрофных бактерий. Изучение кинетической схемы действия. Биоорган, химия, т.4, с. 117-129

65. Тишков В.И., Галкин А.Г., Гладышев В.Н., Карзанов В.В., Егоров A.M. (1992) Анализ структуры гена, оптимизация экспрессии в E.coli и свойства рекомбинантной формиатдегидрогеназы бактерий Pseudomonas sp.101. Биотехнология, т.5, с.52-59

66. Попов В.О., Шумилин И.А., Устинникова Т.Б., Ламзин B.C., Егоров Ц.А. (1990) ЫАО+-зависимая формиатдегидрогеназа метилотрофных бактерий Pseudomonas sp.101.1. Аминокислотная последовательность. Биоорган, химия, т. 16, с.324-335

67. Slusarczyk Н., FelberS., KulaM.R. and PohlM. (2003) Mutanten der Formiat hehydrogenase aus Candida boidinii. Европейский патент EP1295937-A2N

68. Тишков В.И. (2002) Регенерация кофакторов в биосинтезе хиральных соединений с помощью дегидрогеназ. Вестн. Моск. Ун-та. Сер.2 Химия, т.43, 380-387

69. Тишков В.И., Галкин А.Г. и Егоров A.M. (1989) ЫАО+-зависимая формиатдегидрогеназа метилотрофных дрожжей: выделение и физико-химические свойства. Биохимия, т.54, с.299-305

70. Попов В.О., Егоров A.M. и БерезинИ.В. (1978) Изотопный эффект кинетических параметров реакции, катализируемой формиатдегидрогеназой. Докл. АН СССР, т.240,217-220

71. Bocanegra J.A., Scrutton N.S. and Perham R.N. (1993) Creation of an NADP+-dependent pyruvate dehydrogenase multienzyme complex by protein engineering. Biochemistry, v.32, p.2737-2740

72. Chen Z., Lee W.R. and Chang S.H. (1991) Role of aspartic acid 38 in the cofactor specificity of Drosophila alcohol dehydrogenase. Eur. J. Biochem., v.202, p.263-267

73. Chen Z„ Tsigelny I., Lee W.R., Baker M.E. and Chang S.H. (1994) Adding a positive charge at residue 46 of Drosophila alcohol dehydrogenase increases cofactor specificity for NADP+. FEBSLett., v.356, p.81-85

74. Chen R., Greer A. and Dean A.M. (1996) Redesigning secondary structure to invert coenzyme specificity in isopropylmalate dehydrogenase. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, v.93, p.12171-12176

75. Tishkov V.I., Galkin A.G. and Egorov A.M. (1993) Recombinant NAD+-dependent formate dehydrogenase: new properties for biotechnology application. Materials of Intern.Conference "Enzyme Engineering XII", Deu Ville, France, p.54

76. Диков M.M., Карулин А., Осипов А.П. и Егоров A.M. (1979) Изучение методом аналитического изотахофореза изменений структуры формиатдегидрогеназы при ее инактивации. Биоорган, химия, т.5, с.1217-1221

77. Egorov A.M., Avilova T.V., Dikov M.M., Popov V.O., Rodionov Y.V. and Berezin I.V. (1979) NAD+-dependent formate dehydrogenase from methylotrophic bacterium, strain 1. Purification and characterization. Eur. J. Biochem., v.99, p.569-576

78. Avilova T.V., Egorova O.A., Ioanesyan L.S. and Egorov A.M. (1985) Biosynthesis, isolation and properties of NAD+-dependent formate dehydrogenase from the yeast Candida methylica. Eur. J. Biochem., v. 152, p.657-662

79. Allais J. J., Louktibi A. and Barati J. (1983) Oxidation of methanol by the yeast Pichia pastoris. Purification and properties of the formate dehydrogenase. Agric.Biol.Chem. v.47, p.2547-2554

80. Patel R.N., Hou C.T. and Derelanko P. (1983) Microbial oxidation of methanol: purification and properties of formaldehyde dehydrogenase from a Pichia sp. NRRL-Y-l 1328. Arch. Biochem. Biophys., v.221, p.135-142

81. Rojkova A.M., Galkin A.G., Kulakova L.B., Serov A.E., Savitsky P.A., Fedorchuk V.V. and Tishkov V.I. (1999) Bacterial formate dehydrogenase. Increasing the enzyme thermal stability by hydrophobization of alpha helices. FEBS Letters, v.445, p.183-188

82. Serov A.E. and Tishkov V.I. (2002) Role of Pro residues in stability of prokaiyotic and euacaryotic formate dehydrogenases. Bulletin of Moscow University, Ser.2 Chemistry, v.43, p.345-349

83. Serov A.E., Odintzeva E.R., Uporov I.V. and Tishkov V.I. (2005) Use of Ramachandran plot for increasing thermal stability of bacterial formate dehydrogenase. Biochemistry (Mosc.), v.70, p.804-808

84. Privalov P.L. (1985) Energy characteristics of the structure of protein molecules. Biofizika, v.30, p.722-733

85. Privalov P.L. and Potekhin S.A. (1986) Scanning microcalorimetry in studying temperature-induced changes in proteins. Methods Enzymol., v.131, p.4-51

86. Орлов B.H. (2000) Изучение белков и надмолекулярных комплексов методом дифференциальной сканирующей калориметрии. Диссертация кандидата биологических наук, Москва, МГУ

87. Ptitsyn О.В. (1995) Molten globule and protein folding. Adv. Prot. Chem., v.47, p.83-229

88. Privalov P.L. (1979) Stability of proteins: small globular proteins. Adv. Prot. Chem., v.33, p.167-241

89. Sturtevant J.M. (1977) Heat capacity and entropy changes in processes involving proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, v.74, p.2236-2240

90. Velicelebi G. and Sturtevant J.M. (1979) Thermodynamics of the denaturation of lysozyme in alcohol water mixtures. Biochemistry, v. 18, p.l 180-1186

91. Privalov P.L. and Khechinashvili N.N. (1974) A thermodynamic approach to the problem of stabilization of globular protein structure: a calorimetric study. J. Mol. Biol., v.86, p.665-684

92. Sanchez-Ruiz J.M. (1995) Differential scanning calorimetry of proteins. Subcellular Biochemistry, v.24, p. 133-176

93. Murphy K.P. and Gill S.J. (1990) Group additivity thermodynamics for dissolution of solid cyclic dipeptides in wrater. Termochim. Acta., v. 172, p. 11-20

94. Murphy K.P. and Gill S.J. (1991) Solid model compounds and the thermodynamics of protein unfolding. J. Mol. Biol., v.222, p.699-709

95. Brandts J.F. and Hunt L. (1967) The thermodynamics of protein denaturation. The denaturation of ribonuclease in water and in aqueous urea and aqueous ethanol mixtures. J. Am. Chem. Soc., v.89, p.4826-4838

96. Dinner A.R., Abkevich V., Shakhovich E.S. and Karplus M. (1999) Factors that affect the folding ability of proteins. Proteins: Structure, function and genetics, v.35, p.34-40

97. Privalov P.L. (1982) Stability of proteins. Proteins which do not present a single cooperative system. Adv. Protein Chem., v.35, p.1-104

98. Ahern T.J. and Klibanov A.M. (1985) The mechanisms of irreversible enzyme inactivation at 100°C. Science, v.228, p. 1280-1284

99. Zale S.E. and Klibanov A.M. (1986) Why does ribonuclease irreversibly inactivate at high temperatures? Biochemistry, v.25, p.5432-5444

100. Потехин С.А. и Ковригин ЕЛ. (1998) Влияние кинетических факторов на тепловую денатурацию и ренатурацию биополимеров. Биофизика, т.43, с.223-232

101. Manniatis Т., Fritch E.F. and Sambrook J. (1982) Molecular cloning: a laboratory manual. Cold Spring Harbor N. Y.

102. Tishkov V.I., Galkin A.G., Marchenko G.N., Tsygankov Y.D. and Egorov A.M. (1993) Formate dehydrogenase from methylotrophic bacterium Pseudomonas sp. 101:gene cloning and expression in Escherichia coli. Biotechnol. Appl. Biochem., v. 18, p.201-207

103. Laemmli U.K. (1970) Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature, v.227, p.680-685

104. Родионов Ю.В., Авилова T.B., Захарова E., Платоненкова Jl.C., Егоров A.M. и Березин И.В. (1977) ЫАБ+-зависимая формиатдегидрогеназа из метилотрофных бактерий. Очистка и основные свойства. Биохимия, т.42, с.1896-1904

105. Расе C.N., Vajdos F., Fee L., Grimsley G. and Gray T. (1995) How to measure and predict the molar absorption coefficient of a protein. Protein Sci., v.4, p.2411-2423

106. Schippers P.H. and Dekkers J.M. (1981) Direct determination of absolute circular dichroism data and calibration of commercial instruments. Anal. Chem., v.53, p.778-788

107. Takakuwa T., Konno T. and Meguro H.A. (1985) A new standard substance for calibration of circular dichroism: Ammonium d-10-camphorsulfonate. Anal. Sci., v.l, p.215-225

108. Chen Y.H., Yang J.T., and Martinez H.M (1972) Determination of the secondary structures of proteins by circular dichroism and optical rotatory dispersion Biochemistry, v.l 1, p.4120-4131

109. Farinelli M.P., Fry D.W. and Richardson K.E. (1983) Isolation, purification and partial characterization of formate dehydrogenase from soybean seed. Plant. Physiol., v.73, p.858-859

110. Рожкова A.M. (1999) Стабилизация бактериальной фомиатдегидрогеназы гидрофобизацией белковой глобулы методом направленного мутагенеза. Диссертация кандидата химических наук, Москва, МГУ1. БЛАГОДАРНОСТИ