Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение механизма действия и структуры активного центра NAD-зависимой формиатдегидрогеназы

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Изучение механизма действия и структуры активного центра NAD-зависимой формиатдегидрогеназы"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ,. - . ИНСТИТУТ БИОХИМИИ имени А.Н. БАХА

На правах рукописи

МЕЗЕНЦЕВ АЛЕКСАНДР ВИКТОРОВИЧ

УДК 157.158

"ИЗУЧЕНИЕ МЕХАНИЗМА ДЕЙСТВИЯ И СТРУКТУРЫ АКТИВНОГО ЦЕНТРА МП-ЗАВИСИМОЙ ФОРМИАТДЕГИДРОГЕНАЗЫ"

Специальность 03.00.04. - биологическая химия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКВА - 1996

Работа выполнена в лаборатории инженерной энзимолопш Института биохимии им. А.Н. Баха РАН

Научный руководитель -

доктор химических наук В.О. Попов

Официальные опоненты -

доктор биологических наук, профессор Н.К. Наградова доктор химических наук, профессор Б. И. Курганов

Ведущая организация -

Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН

Защита состоится 19 ноября 1996 г. на заседании Специализированного Совета (К 002.96.01) по присуждению ученой степени кандидата биологических наук в институте биохимии им. А.Н. Баха РАН (117071, Москва, Ленинский проспект, д. 33, корпус 2).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологической литературы РАН (Москва, Ленинский проспект, д. 33, корпус 1).

Автореферат разослан 19 октября 1996 г.

Ученый секретарь Специализированного Совета доктор биологических наук

М.И. Молчанов

Общая характеристика работы Актуальность проблемы

На протяжении ряда лет активно развиваются исследования семейства NAD-зависимых депшрогеназ 2-оксикислот. Для данной группы ферментов определены остатки активного центра, важные для катализа, установлены общие закономерности протекания каталитического процесса, вскрыты особенности, определяющие стереоспецифичность ферментов D- и L- ряда.

Формиатдегидрогеназа (FDH, формиат: NAD+ оксидоредуктаза, К.Ф. 1.2.1.2) является одним из наиболее хорошо изученных представителей семейства. На принадлежность FDH к дегидрогеназам 2-оксикислот указывают высокая степень соответствия аминокислотных последовательностей (Kochhar S. et al. 1992, Popov V.O. and Lamzin V.S., 1994, Vinals К et. al. 1993), а также глубокая гомология на уровне пространственных структур (Куценко A.C. и др. 1994, Popov V.O. and Lamzin V.S., 1994). Ранее в нашей лаборатории на основе изучения физико-химических и кинетических свойств FDH метилотрофных бактерий Pseudomonas 101, а также исследований кристаллических структур anoFDH, FDH-ADPR (аденозиндифосфорибоза) и FDH-NAD-азид, выполненных при высоком разрешении (< 2 А), установлены остатки активного центра, принимающие участие в связывании кск{>ермента и аниона азида, ближайшего структурного и изоэлектронного аналога продукта реакции, СО2, сформулирован гипотетический молекулярный механизм действия фермента.

Важной особенностью дегидрогеназ-2-оксикислот является присутствие на участке :вязывания субстрата трех консервативных остатков (рис. 1): аргинина, глутаминовой (у ферментов D - ряда) или аспарагиновой (у L- специфичных ферментов) кислоты и гистидина. Аргинин выполняет роль якорной группы для карбоксила субстрата. Гистидин и глутамат (аспартат) эбразуют цепь переноса протонов, способствуя достижению переходного состояния реакции.

Сравнение аминокислотных последовательностей и пространственных структур ;видетельствует о том, что FDH относится к ферментам D-ряда. Однако, сделанные ранее выводы з возможной роли консервативных остатков активного центра в молекулярном механизме действия 1егидрогеназ 2-оксикислот не могут быть автоматически перенесены на FDH. Так, при связывании <арбоксильной группы субстрата в активном центре дсгидрогеназ-2-оксикислот образуется сарактерное соединение "вилочного типа" (рис. 1). Образование аналогичного соединения между {юрмиатом и структурным аналогом консервативного аргинина (Arg2f!4 в соответствии с чумерацией FDH Pseudomonas, рис. 2) в случае FDH, согласно результатам структурных 1сследований, должно привести к формированию непродуктивного комплекса, который не >бладает ферментативной активностью.

- ?.

NAD

Asp (Glu)

His

Субстрат

С

О " о

н Arg

н

н

N

N

С

Н

о - О

NADH

His

н н

Asp (Glu)

I

С

о - О

Продукт R

HN^

NH

С =0

о н

hn^Nh

о н

Arg

Рис. 1. Связывание субстрата в активном центре дегцдрогеназ 2-окснкислот.

Отличительной чертой FDH является также присутствие в активном центре bmccti консервативного остатка глутаминопои кислоты остатка глутамина (G/«313, рис. 2). Даннь» остаток глутамина строго консервативен для всех исследованных FDH. Между амидной rpynnoi СУл313 и #«332, являющимся аналогом "консервативного гистидина" 2-оксикислот, образуете прочная водородная связь. Данное обстоятельство означает, что //«332 находится депротонированном состоянии и, следовательно, не может выполнять традиционную дл дегидрогеназ 2-оксикислот функцию переносчика протонов.

Таким образом, в связи с существующей нсобходимостю дальнейшей конкретизации рол отдельных остатков активного центра, исследование молекулярного механизма действия FDH пс прежнему является актуальной задачей.

Цели и задачи работы

Целью настоящего исследования является углубление представлений о молекулярно механизме действия FDH из метилотрофных бактерий Pseudomonas sp. 101 и родственных NAC зависимых формиатдегидрогеназ метилотрофных дрожжей Candida boidinii и Hansenula polymorph Для решения поставленной задачи проведено:

• выявление роли остатка Arg7M в молекулярном механизме действия FDH методам направленного мутагенеза;

• изучение pH-зависимостей кинетических параметров реакции и спектральнь характеристик белка с целью отнесения наблюдаемых рН-переходов к определенны функциональным группам активного центра;

• исследование влияния тиоформиата, ближайшего структурного аналога субстра реакции, а также пиридоксаля на кинетические свойства FDH из различных источнико!

определение типа кинетического механизма FDH метилотрофных дрожжей Hansenula polymorpha.

Научная новизна

Сформулированный ранее молекулярный механизм действия FDH Pseudomonas (Popov V.O., nd Lamzin V.S., 1994), является по сути научной гипотезой, которая требует дальнейшего развития а счет привлечения дополнительных экспериментальных данных. В настоящей работе проведена нтерпретация полученных кинетических результатов на основе представлений о строении вного центра FDH.

Исследована роль консервативного остатка аргинина (Arg284) в молекулярном механизме действия фермента: подтверждено непосредственное участие данного остатка в связывании субстрата, исследована его возможная каталитическая роль и участие в поддержании нативной структуры активного центра фермента. Подробно изучены pH-зависимости кинетических и спектральных параметров: определены аминокислотные остатки активного центра фермента, ответственные за появление pH-перехода в кислой области, сделаны предположения о возможных причинах инактивации FDH при щелочных значениях pH. Получены результаты, которые объясняют ингибирование фермента пиридоксалем и его структурными аналогами. Проведена систематизация FDH из различных источников на основе их структурных и кинетических свойств.

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 6 печатных работ.

Апробация работы

Материалы диссертации были представлены на международной конференции "Biocatalysis-951 (28.08.95-01.09.95, г. Суздаль), конференции "Автотрофные микроорганизмы" памяти акад. РАЬ E.H. Кондратьевой (23.04.96-25.04.96, г. Москва), на конкурсе научных работ Института биохимш им. А.Н. Баха РАН (декабрь 1995 г.).

Объем работы

Диссертация состоит из введения, обзора литературы (2 главы), экспериментальной части описывающей материалы и методы исследования, результатов и их обсуждения (4 главы), выводо] и списка цитируемой литературы. Работа изложена на Н5 страницах, содержит 4Q рисунков i таблиц. Список литературы включает i2JS ссылку.

Материалы и методы исследования Материалы

Штаммы микроорганизмов

Биомасса дикого штамма метилотрофных бактерий Pseudomonas sp. 101 получена и Всесоюзной коллекции микроорганизмов (ВК.М В-1545), штаммы метилотрофных дрожже Candida boidinii и Hansenula polymorpha были любезно предоставлены проф. М.-Р. Кула, (ун-т Дюссельдорфа им. Г. Гейне, ФРГ), и проф. И.И. Толсторуковым (ВНИИ генетика, г. Москва соответственно, штаммы Е. coli, содержавшие мутантные по Arg284 формы FDH, - д.х.н. B.I-Тишковым (Химический факльтет МГУ, г. Москва).

Получение белковых препаратов

Для получения препаратов FDH Pseudomonas, мутантных форм FDH из Е. coli, использовали стандартную методику (Lamzin V.S. et al. 1992). Для контроля за выходом каталитически неактивной формы Arg2S4Ala FDH на отдельных стадиях выделения применяли метод ELISA с использованием моноклональных антител, специфичных к FDH Pseudomonas. При выделении FDH метилотрофных дрожжей применяли модифицированную процедуру, центральным элементом которой является гидрофобная хроматография в нисходящем градиенте NaCl. Использованные в работе препараты белков были гомогенны при электрофорезе в присутствии додецилсульфата натрия.

Методы исследования

Для спектрофотометрических измерений использовали спектрофотометр Hitachi 557 (Hitachi, Япония). Концентрацию FDH Pseudomonas определяли по поглощению образца белка (7,7x10"6 Vl 'cM"1, X 280 нм). В остальных случаях использовали биуретовый метод. Активность {юрмиатдегидрогеназы определяли по образованию NADH (6220 М'см1, X 340 нм). Рлюориметрические исследования проводили с использованием флюориметра Hitachi 4FM Hitachi, Япония). Измерение констант связывания азида и кофермента и определение сонцентрации активных центров выполняли в соответствии с описанными в литературе жепериментальными процедурами (Попов В.О. и др., 1978). Спектры КД получали на :пектрополяриметре JASCO J-40AS (Jasco, Япония). В работе также использованы стандартные роматографические процедуры, подробно описанные в литературе. Качество белковых препаратов :онтролировали электрофоретическн.

Результаты и обсуждение

Изучение роли остатка Arg284 в активном центре FDH

Для изучения роли Arg2$4 в молекулярном механизме действия FDH нами были характеризованы две мутантные формы фермента: ArglMGln и Arg284A!a. При выборе варианта минокислотной замены мы учитывали размер боковой группы Х284, а также ее полярность и пособность к образованию водородных связей (боковая цепь глутамина на 2 Á короче, чем у ргинина, полярна и способна к образованию водородных связей; небольшая метальная группа ланина гидрофобна и водородных связей не образует). Непосредственное участие Arg2S4 в вязывании субстрата предполагает, согласно данным рентгеноструктурного анализа, заимодействие положительно заряженной гуанидиновой группы с одним из атомов кислорода убстрата. Таким образом, снижение заряда боковой группы и уменьшение ее линейных размеров элжно ослабить предполагаемое взаимодействие X2S4 с формиатом.

Таблица 1.

Кинетические свойства FDH дикого типа

и мутантных форм белка

Измерения выполняли при 37'С в 0,1 М катий-фосфат?гом буфере (рН 7,0), содержавшем 5 мМ ЭДТА

Объект Лея! ктФ°Рмиат К("ид KmNAD K/*ad

исследований (в % от "дикого типа") (мМ) (цМ) (мМ) (мМ), 18'С

"дикий тип" 100 15- 0.15 0.11 0.5

ArglMGln 3 150 26 0.18 0.5

ArgliAAla 0 - не связывает - 0.08

Согласно полученным результатам (табл. 1), кинетические параметры ИОН весьма чувствительны к замене остатка Аг%284. 33-кратное снижение максимальной скорости ферментативной реакции у белка А^284С1п, по сравнению с РБН дикого типа (ДС ~ 8,8 кДж/моль), сопровождается увеличением Кт БОН по формиату (10 раз, ДО ~ 5,8 кДж/моль) и К по азиду, который является ближайшим структурным и изоэлектроннным аналогом продукта реакции, СО} (170 раз, ДО ~ 13 кДж/моль). Изменение свободной энергии при переходе от А/%2&4 к бУл284 (5,8-8,8 кДж/моль) эквивалентно разрушению 1-2 водородных связей. Более значительные величины эффекта, наблюдаемые для азида, указывают на то, что мутация в большей степени влияет на переходное, чем на основное состояние реакции. Некоторые из взаимодействий предположительно обеспечивающие стабилизацию переходного состояния, в мутантном белке могут не реализовываться вообще или не в полной мере (рис. 3). Одним из такю стабилизирующих воздействий является взаимодействие субстрата (аналога субстрата) с подвижно; петлей, образованной остатками Не 122 и С/у 123, которые в свою .очередь образуют водородньк связи с /4/^284. В мутантных белках водородные связи /Л? 122, СУу123 с Л284 отсутствуют, что, по видимому, ограничивает это важное для связывания субстрата и катализа конформационнех изменение.

Замена /4/£'284 на аланин, неполярная группа которого не образует водородных связей фатальным образом сказывается на активности фермента. Мутантный белок также теряе способность связывать анион азида.

Таким образом, Аг{>284 РБН непосредственно, как и консервативный остаток аргинин; дегцдрогеназ 2-оксикислот, принимает участие в связывании субстрата реакции, образуя 1 или : водородные связи с одним из кислородных атомов аниона формиата.

(а) фермент "дикого типа" - на основании данных рентгеноструктурного анализа холоформы РОН-ИАО-азид,

(б) мутантная форма А^284С1п - результаты компьютерного моделирования. Конформация остатка С1п2В4 гипотетическая. Формиат в активном центре ИОН занимает участок связывания азида.

Согласно данным рентгеноструктурного анализа А^284, образующий 5 водородных связей: с Пе\22, С!у\23, Мр 125, Л/а283 и субстратом, является одним из основных структурообразующих элементов активного центра (фермента. Как показывают результаты проведенного моделирования (рис. 3), замена гуанидиновой группы аргинина на слабополярную амидную группу глутамина сопровождается разрушением или ослаблением ряда водородных связей, что должно сказаться на

локальной конформации белка, в частности, на структуре предполагаемой области протекания каталитического процесса.

Для исследования структурообразующей роли Л/у284 были изучены спектральные параметры, чувствительные к конформационным изменениям (КД, триптофановая флюоресценция). Кроме этого, для белков, обладающих ферментативной активностью, были определены значения термоинактивационных параметров. Полученные результаты (рис. 4 а,б) свидетельствуют о значительных изменениях конформации у мутантных форм белка, по сравнению с белком дикого типа: уменьшается амплитуда КД, снижается интенсивность флюоресценции. Причем при замене у4/2*284 на аланин наблюдаемые изменения приобретают драматический характер, о чем свидетельствует смещение максимума триптофановой флюоресценции в коротковолновую область примерно на 10 нм (табл. 2). Замена Л/%284 на глутамин приводит к значительному повышению

а) б) в)

80

320 340 360 380 400 2,90 2,95 3,00 3,05

X, нм 1Дх103, К"1

Рис. 4. Изменения спектральных параметров ГПН "дикого типа" и мутантных форм:

(а) Спектры КД. Концентрация ИОН 10"6 М. Измерения выполняли при 18'С в 0,1 М калий-фосфатном буфере (рН 7,0), содержавшем 5 мМ ЭДТА;

(б) Спектры триптофановой флюоресценции. Концентрация РОН 2 х 10~6 М. Измерения выполняли при 18°С в 0,1 М калий-фосфатном буфере (рН 7,0), содержавшем 5 мМ ЭДТА.

(в) Термостабильность. Концентрация РОН 2 х 10 7 М. Измерения активности выполняли при 37"С в 0,1 М калий-фосфатном буфере (рН 7,0), содержавшем 5 мМ ЭДТА после преинкубации (1-30 мин) при исследуемой температуре (40-70 "С).

1 - РОН "дикого типа"; 2 - А1к284С1л; 3 - А^84А1а.

термостабильности фермента (рис. 4в), что, по-видимому, связано с удалением нескомпенсированного (в апоРОН) положительного заряда гуанидиновой группы из активного центра.

Таким образом, на основания полученных результатов можно сделать вывод о том, что Аг£И<\ важен для поддежания каталитически активной конформации активного центра РОН.

Несмотря на значительность конформационных перестроек, происходящих в активном центре FDH при замене остатка A/g2R4, приводящих к ухудшению связывания субстрата, константа связывания кофермента (Kt,NAD) мутантных белков в ряду Arg->GI/i~>A!a, наоборот, несколько увеличивается (табл. 1). Для мутантного белка Arg284Ala она становится сопоставима со значением константы связывания нейтральной восстановленной формы кофермента для белка дикого типа {KbNAD,! ~ Ю'4 М), что соответствует изменению ДО ~ 3,3 кДж/моль.

Согласно центральной догме катализа, фермент должен дестабилизировать исходное состояние реактантов и/или стабилизировать переходное состояние реакции. Возможное участие Аг%284 в каталитическом процессе предполагает дестабилизацию исходного состояния положительно заряженной формы кофермента. Полученные результаты являются косвенным подтверждением данной гипотезы.

Таким образом, положительный заряд гуанидиновой группы Arg2S4 обеспечивает предпочтительное связывание с KDI1 электронейтралыюй восстановленной формы кофермента и может вносить вклад в катализ путем дестабилизации исходного состояния одного из реактантов (NAD).

Таблица 2

Характеристики спектров флюоресценции FDII дикого типа и мутантных форм белка

Измерения выполняли при 18'С в 0,1 M калий-фосфатном буфере (рН 7,0), содержавшем 5 мМ ЭДТА

Объект Отн. квантовый выход Полуширина Максимум

исследований (в % от FDH "дикого типа") спектра флюоресценции

FDH FDH-NADW (нм) (нм)

"дикий тип" 100 15 49 343

ArglMGIn 33 8 48 343

Arg2S4Ala 8 45 49 333

(а) отн. квантовый выход соответствующей апоформы принимали за 100 %

Исследование pH-зависимостей кинетических и спектральных параметров

Для всех описанных в литературе FDH характерен широкий pH-оптимум в области нейтральных значений pH. У FDH из Pseudomonas sp. 101 кинетические параметры остаются неизменными в интервале pH от б до 10. При pH менее 6 происходит снижение максимальной

а)

100

80 sS 60

40 20

- 10 -б) В)

56789 10 И 56789 10 И 56789 10 И

РН

Рис. 5. pH-зависимости KmNAD н Km*°iIM"am FDH Pseudomonas.

На рисунке представлены теоретические кривые после компьютерной обработки методом нелинейной регрессии.

(а) ^тах от pH: рК 5,35, п, число протонов, 1;

(б) KmNAD ох рН: рК 5,4, п=2 (кислая область), рК. 10,6, п=1 (щелочная область);

(в) Кщформиат от рН: рК 10,4, п=1.

Измерения проводили при температуре 37°С. Использовали следующие буферные системы: 0,1 М калий-фосфат (pH 5,4-8,5); 0,5 калий-фосфат (pH 7 - 8,5 и 10,4 - 11,2); 0,5 М ЭДТА (натриевая соль) - натрий-фосфат (pH 9,0 - 11,2). Все буферные растворы (за исключением последнего) содержали 5 мМ ЭДТА в качестве стабилизатора ферментативной активности.

скорости реакции и увеличивается значение KmNAD. В щелочной области снижается' сродство фермента как к NAD, так и к формиату на фоне сохранения постоянства Ктм.(рис. 5).

Линейный характер зависимости KmNAD от |Н]2 в кислой области (рис. 6) свидетельствует об одновременном протонировании двух функциональных групп с близкими значениями рК ионизации, расположенных на участке связывания кофермента (схема). Значения рК для бинарного (FDH-формиат) и тройного (FDH-NAD-формиат) комплексов составляют соответственно 6,0л0,1 и 5,4±0,1. Близость к нулю значения энтальпии ионизации процесса (ЛИ"0"—7,5±7,9 кДж/моль) говорит о том, что в данном случае происходит протонирование двух карбоксильных остатков, принадлежащих аспарагиновой и/или глугаминовой кислотам. Изменения Утлх в кислой области связаны с ионизацией единственной функционхтьной группы (/>АГ5,35±0,05) тройного комплекса FDH-NAD-формиат. Близость характеристических значений pH - переходов KmaJ( и KmNAD в центральном тройном комплексе (5,35±0,05 и 5,4±0,1) свидетельствует о том, что одна из существенных кабоксильных групп, принимающих участие в связывании кофермента, также важна для катализа.

Согласно данным рентгеноструктурного анализа, на участке связывания коферме1гга расположены две карбоксильные группы, принадлежащие остаткам Asp221 и AspZOS. Asp22l,

2Н

Е

Протонирование FDH Pseudomonas в кислой области pH.

Knad к

NAD

2Н

Кп

ен2

NAD

К

NAD

Е-NAD

К'п

ЕН2 -NAD

A'nia[, и A'nad - константы диссоциации NAD из фермент-субстратных комплексов E-NAD и EH2^+-NAD, соответственно, А'ц и А'н - их константы ионизации, Е - бинарный комплекс состава FDH-формиат.

связывает 2'-0Н группу никотинамидной рибозы молекулы NAD. Для Ау)308 наряду с функцией связывания предполагают каталитическую роль. Согласно результатам структурных исследований,карбоксильная группа /lsp308 взаимодействует с амидной группой NAD. Данное взаимодействие приводит не только к правильной координации никотинамидного фрагмента, но и к перераспределению заряда между атомами никотинамидного кольца, в результате чего происходит усиление электрофильных свойств в С4-положении, что облегчает перенос гидрид-иона от субстрата на молекулу ко(}>ермента.

с.к.о. 0.07

с.к.о. 2.51

0,4 0,8 1,2 1,6 2,0 0,8 1,6 2,4 3,2

[Н]3х101(?М3 [Н]2х 1011,М2

1 2 3 4 5 6

[Н] х 1 о6, м

Рис. 6. Линейная апроксимацня зависимостей К„мА0 от (а) [Н]3, (б) [Н]2 и (в) [Н] в кислой области.

с.к.о.-сумма квадратов отклонений. Ошибка - корень квадратный из несмещенной дисперсии (о2). Статистический вес точки принимали рапным I/п2-

Рис. 7. pH-зависимости спектральных параметров FDH Pseudomonas в щелочной области:

(а) триптофаноиой флюоресценции,

(б) КД.

Измерения выполняли при 18"С в 0,1 М калий-фосфатном буфере (pH 7,0), содержавшем 5 мМ ЭДТА. Концентрация фермента: 2 х 10 6 М иЮ"6 М, соответственно.

"Нг4

ю

(а)

(б)

Рис. 8. рН-зависимости К^0?"""" ГОН метилотрофных дрожжей С. ЬоШпН и II. в щелочной области.

С, ЬоШти\ Н. ро1утогрМа.

Концентрация ИОН 4 * 10"7 М и 10 6 М, соответственно. Измерения активности при 37°С в 0,1 М калий-фосфатном буфере (рН 7,0), содержавшем 5 мМ ЭДТА.

10 polymorpha

выполняли

8

9

Таким образом, наблюдаемые изменения Kmlx, по-видимому, связаны с протонироваишем Asp308, в то время как изменения K„NAD следует отнести за счет одновременного протопировапчия обоих остатков аспяртата: Л$р221 и А>р308.

Близкие значения рК на рН-зависимостях KmNAD , КтФ°Ртат и K¡ для линейных (аналога молекулы С02: цианат, азид и роданид), и планарных (аналога формиата: нитрат) анионных ингибиторов FDH свидетельствует о существовании универсального механизма, который определяет изменения этих параметров (рис 5-7, табл. 3). Поскольку рН-зависимости спектральных характеристик (спектры КД и собственная флюоресценция белка), чувствительных к изменениям конформации, аналогичны рН-зависимостям кинетических параметров, можно сделать заключение о конформационной природе наблюдаемого в щелочной области рН -перехода. Дополнительным

Таблица 3

Значения рК для Кт и K¡ субстратов и ингибиторов FDH в щелочной области

Измерения выполняли при 37°С в 0,1 М калий-фосфатном буфере (рН 7,0), содержавшем 5 мМ ЭДТА

Параметр Значение параметра (цМ) Pseudomonas sp. 101 рК Candida boidinii Ilansenula polymorphs

к NAD Ат 110 10,6±0,2 10,5±0,1 н.о.

£тформиат 15000 10,4±0,1 10,5+0,1 10,2+0,1

fcxumpam 1000 Ю,5±0,1 н.о. н.о.

](лшд 0,15 10,7±0,2 н.о. н.о.

^роданид 300 10,5±0,1 н.о. н.о.

К^ианст 0,20 10,5+0,1 н.о. н.о.

Флюоресценция КД (X 210 нм) - 10,6±0,1 10,2+0,2 но. н.о. н.о. н.о.

н.о. - не определяли

подтверждением конформационной природы наблюдаемых в щелочной области рН - зависимостей является кооперативный характер изменений кинетических параметров у ((юрмиатдегидрогеназ и: метилотрофных дрожжей: ктФ°р>"""« (С. boidmii и Я. polymorphá) и Кшх (С. boidinií) (ионизация сопровождается освобождением трех протонов и более, рис. 8).

Результаты структурных исследований свидетельствуют о том, что непосредственное участие в связывании субстрата могут принимать остатки Asnl46, Arg2&4 и Яи332 (Lamzin V.S. et al., 1994) Образование водородной связи между Arg284 и формиатом стабилизирует гуанидиновую группу i депротоннрованном состоянии, что должно привести к смещению рК в щелочную обласп (рА>11,6), Я/$332, как уже отмечалось выше, находится в активном центре FDH i депротоннрованном состоянии (Lamzin V.S. et al. 1994), что предполагает смещение рК сгс ионизации в кислую область (рК<5,5). Значение рК ионизации амидной группы Asn 146 составляет более 14,0. Таким образом, рН-переход, наблюдаемый в щелочной области, имеет, по-видимому, конформационную природу и не связан с ионизацией какой-либо из функциональных групп активногс центра FDH.

а)

i

Ö

Рис. 9. Влияние пиридоксаля на ферментативную активность FDH.

(а) Зависимость остаточной ферментативной активности FDH Pseudomonas от концентрат» пиридоксаля.

Концентрация FDH 2 х 10"7 М. Измерения активности выполняли при 37°С в 0,1 М калий фосфатном буфере (pH 7,0), содержавшем 5 мМ ЭДТА после предварительной инкубацш фермента (1-15 мин) в присутствии пиридоксаля.

(б) Изменение ферментативной активности FDH Pseudomonas (-) и FDP

Я. polymorha (----)в присутствии пиридоксаля.

Концентрация FDH 2 х Ю-7 М и 4 х 10 7 М, соответственно. Измерения активности выполняли при 37"С в 0,1 М калий-фосфатном буфере (pH 7,0), содержавшем 5 мМ ЭДТА.

2,0 3,0 2

[Пиридоксаль], мМ

6 8

4

Влияние пиридоксаля на ферментативную активность

Согласно данным рентгеноструктурного анализа, активный центр FDH расположен примерно в 15 А от поверхности белковой глобулы. Доставка реактантов в область активного центра происходит через специальные каналы: коферментсвязывающий и субстратный, постулированный ранее на основании структурных данных (Lamzin V.S, 1994). Размеры гипотетического субстратного канала FDH Pseudomonas (ширина ~6-8 А) позволяют разместить внутри него молекулу, значительно превышающую по своим размерам анион формиата.

Arg 284

г

Asn 146

Птфидоксаль

Gin 313

Рис. 10. Компьютерное моделирование связывания FDH пиридоксаля

Пиридоксаль является единственным известным на сегодняшний день конкурентным ингибитором FDH Pseudomonas по формиату, который может взаимодействовать как с апоформой, так и комплексом FDH-NAD. Все остальные конкурентные по формиату ингибиторы (линейные и планарные анионы типа азида или нитрата) взаимодействуют исключительно с холо-формой фермента.

Взаимодействие пиридоксаля с FDH включает две стадии. На первой стадии происходит образование нековалентного комплекса, проявляющееся в виде конкурентного по формиату ингибирования. На второй стадии в результате химической модификации белка происходит частичная инактивация фермента. В присутствии боргидрида натрия инактивация FDH пиридоксалем становится необратимой.

Процесс инактивации сопровождается изменениями спектров поглощения и флюоресценции фермента, которые характерны для образования основания Шиффа. Линейная зависимость

остаточной ферментативной активности от концентрации пиридоксаля (рис. 9а) свидетельствует о модификации единственною остатка лизина, существенного для (ферментативной активности.

Согласно данным рентгеноструктурного анализа, наиболее вероятным местом модификации FDH пиридоксалем является остаток ¿>'52 86. Данный остаток расположен у выхода из субстратного канала на поверхность. Согласно результатам структурных исследований, модификация Lys286 может быть причиной частичной инактивации FDH. Косвенным подтверждением этого предположения является устойчивость к пиридоксалю FDH метилотрофных дрожжей //. polymorpha, в аминокислотной последовательности которой Lys2%b заменен на остаток аланина (рис. 96).

Таблица 4

Сравнение аминокислотных последовательностей FDH, полученных из различных

источников

FDII-Hp FDII-Cm FDH-Nc FDU-An FDIl-St FDII-Ar Fl VI-Mo FDH-I'i

FDH-FIansenula - 79 64 73 52 58 44 48

polymorpha {Ир)

FDH-Candida 79 - 61 65 53 51 52 47

melhylica (Cm)

FDH-Neurospora 64 61 - 83 58 50 52 56

crassa (Nc)

FDH-Aspergillus 73 65 83 - 55 52 55 57

nidulans (An)

FDH-Solanum 52 53 58 55 - 80 46 56

tuberosum (Si)

FDII-Arabidopsis 58 51 50 52 80 - 53 51

toxophylla (Ar)

FDH-Moraxella 44 52 52 55 46 53 - 86

sp. C-l (Mo)

FDH Pseudomonas 48 47 56 57 56 51 86 -

sp. 101 (Ps)

Примечание: линии внутри таблицы соответствуют группам гомологичных белков, пункт объединяет группы РОН грибов и метилотрофных дрожжей, для которых степень соответстн аминокислотных последовательностей превышает 60 %.

Компьютерное моделирование процессов связывания пиридоксаля показало, что в си своих геометрических размеров пиридоксаль не может проникнуть в область активного цснт[ обеспечивающую связывание формиата. Однако, пиридоксаль способен блокировать субстратш канал, что и проявляется кинетически в конкурентном по формиату характере ингибироиан! Наиболее вероятным местом связывания пиридоксаля внутри канала является положение вбли

остатка И|к332 перед входом в субстратсвязывающий подцентр активного центра фермента (рис. 10).

Таким образом, проведенные кинетические исследования н эксперименты по моделированию подтверждают постулированное ранее на основании структурных исследований наличие специального субстратного канала, по которому происходит доставка в активный центр аниона формиага. Связывание пиридоксаля в субстратном канале РОН объясняет конкурентный характер мигрирования данным соединением по формиату.

Различия в кинетическом поведении дрожжевых и бактериальных формиатдегидрогеназ

ИОН, полученные из рахчичных источников: высших растений, грибов, летилотрофных бактерий и дрожжей характеризуются сходством основных физико-химических свойств (молекулярный вес, субъединичный состав, отсутствие простетических групп, близкие значения

Ктформ»от „ ксш)_

Тайлииа 5

Некоторые кинетические свойства РОН различного происхождения

Источник Тип кинетического Взаимодействие с Способность к с,'.исле-

выделсния механизма тиоэфирами нию тиоформиата

Pseudomonas sp. 101 неупорядоченный + -

Hansenula polymorpha упорядоченный - +

Candida boidinii упорядоченный +

Сравнение аминокислотных последовательностей по консервативным остаткам активного центра свидетельствует о их практически 100 % соответствии (Popov V.O. and Lamzin V.S., 1994). В результате сравнения полных аминокислотных последовательностей оказалось возможным выделить среди FDH несколько групп гомологичных белков, причем степень соответствия аминокислотных последовательностей внутри каждой из групп составляет 80 % и более (табл. 4), а гомология между группами ферментов находится в пределах 40-60%s У FDH грибов и метилотрофных дрожжей гомология превышает установленное среднее значение и составляет 6065%, что делает возможным объединение этих двух групп ферментов.

Таблица 6.

Ингибирование ГВН Н. ро1утогрЪа аналогами субстратов и продуктами реакции

Измерения выполняли при 37°С в 0,1 М калий-фосфатном буфере (рН 7.0), содержавшем 5 мМ ЭДТА

Игибитор Варьируемый Тип Ki

субстрат ингибирования мМ

NADH NAD К 0,020±0,005

формиат НК _______"_______

ADPR NAD К 0,060±0,005

формиат НК _______"_______

НСОз" NAD Кц 110±50

K,s 530±320

формиат НК® _______••_______

N3- NAD НК 0,17±0,04 |дМ

формиат к

При насыщении формиатом тип ингибирования меняется на конкурентный (К) Вторичные графики: 1/Кпах([11)11 А"т/Кта,(14) - не линейны

Классификация FDH на основе соответствия их аминокислотных последовательностей также учитывает особенности субстратной специфичности формиатдегидрогеназ (FDH бактериального происхождения в отличие от ферментов дрожжей способна использовать в качестве субстратен некоторые тиоэфиры), и типа кинетической схемы (табл. 5). Проведенные нами исследования кинетического механизма FDH из метилотрофных дрожжей Н. polymopha показали, что данный фермент, как и другие FDH высших растений и дрожжей, следует упорядоченному механизм) присоединения реактантов, (NAD-первый субстрат реакции, NADH-второй продукт) о чек свидетельствует характер ингибирования фермента аналогами субстратов и продуктами реакции (табл. 6). Кроме этого, полученные нами результаты говорят о различном отношении FDH дрожжевого и бактериального происхождения к тиоформиату - ближайшему структурному аналогу субстрата (табл. 5). Для FDH метилотрофных дрожжей Н. polymorpa и С. boidinii тиоформиат является субстратом, тогда как для FDH из метилотрофных бактерий Pseudomonas лр. 101 тиоформиат - конкурентный по формиату ингибитор.

Таким образом, на основании сравнения аминокислотных последовательностей среди FDÜ возможно выделение нескольких групп гомологичных белков: границы которых совпадают <

границами основных систематических таксонов (бактерии, дрожжи, грибы и высшие растения). При этом установлены различия кинетических свойств для ферментов из высших растктений, четилотрофных дрожжей и бактерий по типу кинетического механизма, субстратной специфичности, а также (в двух последних случаях) -по отношению к тиоформиату.

Выводы

1. Исследованы pH-зависимости кинетических параметров FDH Pseudomonas. Показано, что для связывания кофермента необходима одновременная ионизация двух карбоксильных групп в активном центре фермена {рК ~ 5.5 - 6.0). Полученные данные интерпретированы в соответствии с ранее установленной структурой активного центра FDH. Наблюдаемый рН-переход отнесен к ионизации карбоксильных групп остатков Asp22l и Аг/>308. Один из этих остатков (As/>308) важен для катализа (принимает участие в позиционировании и активации кофермента).

Наблюдаемый в щелочных средах рН-переход (рК 10.2-10.7) является общим для FDH из различных источников, имеет конформационную природу и не связан непосредственно с ионизацией какой-либо из функциональных групп активного центра.

2. Охарактеризованы мутантные формы фермента с единственной аминокислотной заменой остатка ArglM на Gin и Ala, соответственно. В результате проведенных исследований:

а) установлено непосредственное участие ArglM в связывании формиата, в качестве якорной группы для одного из атомов кислорода субстрата;

б) показано возможное участие данного остатка в катализе путем дестабилизации исходного состояния NAD;

в) показано, что данный аминокислотный остаток является важной для поддержания каталитически активной конформации структуробразующей единицей активного центра фермента.

3. Изучено нековалентное и ковалентное связывание пиридоксаля с FDH бактериального (Pseudomonas) и дрожжевого происхождения {Н. polymorpha). Проведено компьютерное моделирование связывания пиридоксаля с FDH из метилотрофных бактерий Pseudomonas sp. 101.

а) подтверждено постулированное ранее на основании структурных исследований предположение о существовании субстратного канала;

б) показано, что причиной конкурентного ингибирования FDH (Pseudomonas) по формиату является связывание пиридоксаля в субстратном канале;

в) установлено, что наиболее вероятным местом ковалентной модификации фермента пнридоксалем является Lys2%6.

4. Проведена классификация FDH из различных источников. Показано сущестиопани нескольких групп близкородственных белков - ферментов высших растении, грибоь мстилотрсх||НЫх дрожжей и бактерий с высокой степенью соответствия первичны последовательностей (-80 %). Для ферментов высших растений и FDH дрожсиого 1 бактериального происхождении показаны различия по типу кинетическое механизма, субстратной специфичности - способности к окислению тиоэфирок и iv отношению к тио<|юрмиату как субстрату/ингибито1)у (ферментативной активности.

Список публикаций

1. Mesentsev А. У.. Lamzin V. S., Tislikov V. I., Ustinnikova Т. В., Popov V. О. Effect of pH on kinetic parameters of NAD-dependent formate dehydrogenase. (1996) Biochem. J. (accepted).

2. Мезенцев А.В.. Устинникова Т.Е., Тихонова Т.В., Попов В.О. Выделение и кинетический механизм действия НАД - зависимой формиатдегидрогеназы метилотрофных дрожжей Hansenula poiymorpha. (1996) Прикладная биохимия и микробиология Том 32, N6.

3. Куценко А.С., Мезенцев А.В., Попов В.О. Пространственная симметрия доменов NAD - зависимой формиатдегидрогеназы метилотрофных бактерий Pseudomonas sp. 101. (1996) Тезисы конф. "Автотрофные микроорганизмы " М., МГУ, с.86.

4. Мезенцева Н. В., Кузнецов Д.А., Мезенцев А.В.. Куценко А.С., Попов В.О. Картирование активного центра NAD-зависимой формиатдегидрогеназы метилотрофных бактерий Pseudomonas sp. 101 соединениями пиридоксалевого ряда. (1996) Тезисы конф. "Автотрофные микроорганизмы " М., МГУ, с.89.

5. Tishkov V. I., Matorin A. D., Rojkova А. М., Fedorchuk V. V., Savitsky P. А., Dementieva L. A., Lamzin V. S., Mesentsev A. V.. Popov V. O., Site-directed mutagenesis of the formate dehydrogenase active centre role of the //«332-С/л313 pair in enzyme catalysis. (1996) FEBS Lett. Vol. 390, P. 104-108.

6. Tishkov V. I., Galkin A. G., Mesentsev A: V.. Ustinnikova T.B., Popov V. O., Shelukho D. V., Molecular mechanism of NAD-dependent formate dehydrogenase Site - directed mutagenesis of the enzyme active centre. (1996) Proceedings of the conference BIOCATALYSIS-95, Applied Biochemistry and Biotechnol. (in press).

Список цитированной литературы

1. Куценко А.С., Королев С.В., Ламзин B.C., Попов В.О. (1994) Исследование внутренней симметрии пространственной структуры NAD-зависимой формиатдегидрогеназы из Pseudomonas sp. 101. Мол. Биология Том 28, С. 626-632.

2. Попов В.О., Родионов Ю.В., Егоров A.M., Березин, И.В. (1978) Формиатдегидрогеназа из Bacterium sp. 1: Определение числа активных центров и константы связывания кофермента. Доклады АН СССР Том 239, С. 1482-1485.

3. Тишков В.И., Попов В.О., Егоров A.M. (¡984) Бактериальная формиатдегидрогеназа. Субстратная специфичность и кинетический механизм окисления S-формилглутатионэ. Биохимия Том 48, 1172-1180.

4. Kochhar S., Hunziker Р.Е., Leong-Morgenthaler P., Hottinger H. (1992) Evolutionary relationship of NAD+-dependent d-lactate dehydrogenase - Comparison of primary structurcof 2-hydroxy acid dehydrogenases. Biochem. Biophys. Res. Commun. Vol. 184, P. 60-66.

5. Lamzin V.S., Aleshin A.E., Strokopytov B.V., Yukhnevich M.G., Popov V.O., Harutyunyan E.H., Wilson K.S. (1992) Ciystal structure of NAD-de[>endent formate dehydrogenase. Eur. J. Biochem. Vol. 206, P. 441-452.

6. Lamzin V.S., Dauter Z., Popov V.O., Hamtyunyan E.H., Wilson, K.S. (1994) High resolution structures of holo and apo formate dehydrogenase. /. Mol. Biol. Vol. 236, P. 759785.

7. Popov V.O., Lamzin V.S. (1994) NAD ^-dependent fonnate dehydrogenase. Biochem. J. Vol. 301, P. 625-643.

8. Vinals K., Depiercux E., Feytmans E. (1993) Prediction of structurally conserved regions of D-spccific hydroxy acid dehydrogenases by multiple alignment with formate dehydrogenase, Biochem. Biophys. Res. Commun. Vol. 192, P. 182-188.